BRPI0706433A2 - método para triar uma população de plantas ou partes de plantas quanto à presença de indivìduos apresentando uma descoloração reduzida em comparação a uma planta de controle ou parte de planta - Google Patents

Abstract

METODO PARA TRIAR UMA POPULAçãO DE PLANTAS OU PARTES DE PLANTAS QUANTO à PRESENçA DE INDIVìDUOS APRESENTANDO UMA DESCOLORAçãO REDUZIDA EM COMPARAçãO A UMA PLANTA DE CONTROLE OU PARTE DE PLANTA A presente invenção refere-se a um método para triar uma população de plantas ou partes de plantas pela presença de indivíduos que apresentam uma descoloração reduzida em comparação a uma planta ou parte de planta de controle, cujo método compreende prover uma população de plantas ou partes de plantas da população; opcionalmente, criar uma superficie de ferimento sobre as plantas ou partes de plantas; incubar a planta ou partes de plantas ou superficies de ferimento criadas sobre as mesmas para permitir que ocorra descoloração nas, ou, sobre as mesmas; observar a descoloração na, ou, sobre as plantas ou partes de plantas; comparar a descoloração observada com aquela observada na planta ou parte de planta de controle para identificar plantas ou partes de plantas que não apresentam descoloração ou descoloração reduzida em comparação com a planta ou parte de planta de controle. Adequadamente, a descoloração é descoloração induzida por ferimento.

Description

"MÉTODO PAEA TRIAR UMA POPULAÇÃO DE PLANTAS OUPARTES DE PLANTAS QUANTO À PRESENÇA DE INDIVÍDUOSAPRESENTANDO UMA DESCOLORAÇÃO REDUZIDA EMCOMPARAÇÃO A UMA PLANTA DE CONTROLE OU PARTE DEPLANTA"

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a um método para triar umapopulação de plantas ou de partes de planta quanto à presença de indivíduosapresentando descoloração superficial reduzida induzida por ferimento emcomparação a uma planta ou parte de planta de controle.

Fundamento da invenção

Devido à demanda crescente, o processamento de produtofresco, tal como alface, chicória, endívia, e outras hortaliças, expandiu-sesignificativamente nos anos recentes. A colheita e o processamento dehortaliças com folhas envolvem o corte extensivo das folhas, o que induz umaforte resposta às lesões. Esta resposta ao ferimento leva a uma deterioraçãorápida do produto processado. Esta deterioração é manifestada peladescoloração devido ao acastanhamento ou rosado enzimático na, e em tornoda superfície de ferimento, respiração e dessecação devido à transpiração.

Especialmente o acastanhamento ou rosado enzimático é considerado deimportância significativa, determinando direta ou indiretamente a qualidadeglobal de hortaliças com folhas recém-colhidas, embaladas, como a alface e achicória.

Além disto, como uma conseqüência da deterioração, micro-organismos podem aumentar significativamente em número, o que podecomprometer a segurança alimentar. A natureza altamente perecível da alfaceprocessada leva a uma forte percepção pelo consumidor da falta de cor, cheiroe textura, o que está atrasando um crescimento mais rápido do que o atual do,assim chamado, mercado de conveniência.Outras vegetais, como batatas, cogumelos, aipo, alcachofra eberinjela, bem como frutas e flores podem estar sujeitos à descoloraçãoindesejável. Por exemplo, frutas como banana, maçã, pêra, abacate, manga,pêssego e damasco, etc. tornam-se rapidamente acastanhados quando cortadosou descascados. Medidas têm que ser tomadas ao se oferecer estas frutas naforma processada, tais como cortadas, cortadas em cubos, descascadas ou emsaladas da fruta.

Caules cortados de flores, por exemplo, da gérbera oucrisântemos, podem igualmente tender à descoloração o que é indesejável sobum ponto de vista comercial porque as descolorações são consideradas nãoatrativas pelo consumidor reduzindo assim a comerciabilidade do produto.

A fim de inibir o processo de deterioração em hortaliças taiscomo a alface, muitos tratamentos químicos ou físicos pós-colheita foramdesenvolvidos e podem ser aplicados para retardar a deterioração da alfaceprocessada.

Entre estes estão a embalagem de hortaliças com folhas,recém-colhidas, sob uma atmosfera modificada, a aplicação de tegumentoscomestíveis, tratamento de choque termal e adição de produtos químicos, queinibem o acastanhamento enzimático.

Quando alface recém-colhida é embalada sob uma atmosferade oxigênio reduzido a baixas temperaturas, o acastanhamento enzimáticopode ser substancialmente reduzido. Porém, este ambiente modificado, compouco oxigênio, leva à respiração anaeróbica, que cria um produto sem gostoe sem cheiro que é percebido como muito desinteressante.

Tegumentos comestíveis são camadas finas de materiais, queatuam como barreira de isolação física e que protegem eficazmente o produtode diferentes formas de deterioração tais, como evaporação e acastanhamento.Estes tegumentos podem ser feitos de resinas, de polissacarídeos ou deproteína.Além disto, demonstrou-se que o acastanhamento da alfacerecém-colhida pode ser impedido aplicando-se um breve choque termal de 90segundos a 45°C, imediatamente depois do processamento. Possivelmente, ochoque termal desvia a biosíntese da proteína das enzimas envolvidas nadescoloração para as proteínas do choque termal reduzindo deste modo acapacidade de acastanhamento enzimático. Alternativamente, o efeito dotratamento de choque termal no acastanhamento pode ser explicado pelatermo-sensibilidade das enzimas envolvidas no caminho da descoloração.

Produtos químicos, que podem ser aplicados podem, porexemplo, ser agentes redutores como a vitamina C, agentes de quelação comoo EDTA, agentes complexos como a ciclodextrina e inibidores enzimáticoscomo a L-cisteína. A aplicação de produtos químicos no alimento frescoenvolve obviamente itens da segurança alimentar e exigem aprovaçãoreguladora. As combinações de tecnologias pós-colheita descritas acimapodem ser lembradas e, ao final das contas, o procedimento aplicado é umapermuta entre a eficácia tecnológica, custo e segurança alimentar.

Independentemente da tecnologia aplicada, a melhoria daqualidade pós-colheita de hortaliças processadas, frutas e flores virá há umcusto e conseqüentemente na técnica existe uma necessidade clara de sefornecer alternativas, que eliminem ou reduzam a necessidade de aplicartecnologias físicas ou químicas pós-colheita

Sumário da invenção

E objetivo da presente invenção prover um método de triagempara selecionar plantas que apresentem uma resposta reduzida dedescoloração induzida por ferimento, para prover plantas e progênie delasderivadas que sejam resistentes às lesões do processamento pós-colheita, taiscomo, o acastanhamento ou rosado enzimático. Descoloração por ferimentopode igualmente ser visível em partes de plantas, tais como caules, sementes,frutas, folhas, flores, tubérculos, brotos, etc. É, assim, um objetivo adicionalda invenção prover um método de triagem para selecionar plantas, queapresentam uma resposta reduzida à descoloração induzida por ferimento emsuas partes de planta.

A invenção provê, deste modo, um método para triar umapopulação de plantas ou de partes de planta quanto à presença de indivíduosque apresentam uma descoloração reduzida em comparação a uma planta decontrole, o método compreendendo:

a) prover uma população de plantas ou partes de plantas dapopulação;

b) opcionalmente, criar uma superfície de ferimento sobre asplantas ou partes de planta;

c) incubar a planta ou partes de plantas ou superfícies deferimento criadas sobre as mesmas para permitir que ocorra descoloração nas,ou, sobre as mesmas;

d) observar a descoloração na, ou sobre as plantas ou partes deplantas;

e) comparar a descoloração observada com aquela observadana planta ou parte de planta de controle para identificar plantas ou partes deplantas que não apresentam descoloração ou descoloração reduzida emcomparação com a planta ou parte de planta de controle.

O método da presente invenção tem dois modos de realizaçãoprincipais. No primeiro modo de realização a descoloração é o resultado daconversão de um substrato endógeno. Tal descoloração surgiráespontaneamente com a incubação da planta ou de parte de planta em umdeterminado ambiente por uma quantidade determinada de tempo. Adescoloração é, neste caso, auto-induzida. A invenção refere-separticularmente às reações de acastanhamento e rosado enzimático queocorrem naturalmente. O método de triagem da invenção pretende identificarplantas que não apresentam esta reação ou apresentam uma reação reduzidaem comparação a um controle.

No segundo modo de realização a descoloração é causada pelaconversão de um substrato exogenamente adicionado que pode ser convertidoem um substrato colorido que se torne visível quando ocorre a reação naplanta. Esta reação de cor pode ser, ou não, induzida por ferimento. Ela ocorreigualmente, por exemplo, nos tegumentos de sementes de sementes intatas. Ométodo de triagem da invenção pretende identificar plantas que nãoapresentam esta reação ou apresentam uma reação reduzida em comparação aum controle.

O último modo de realização refere-se mais em particular a ummétodo para triar uma população de plantas ou de partes de planta quanto àpresença de indivíduos que apresentam uma descoloração reduzida emcomparação à planta ou parte de planta de controle, o métodocompreendendo:

a) prover uma população de plantas ou partes de plantas dapopulação;

b) incubar a planta ou partes de plantas com um substrato quepode ser convertido em um pigmento colorido para permitir que ocorradescoloração nas, ou, sobre as mesmas;

c) observar a descoloração na, ou, sobre as plantas ou partes deplantas;

d) comparar a descoloração observada com aquela observadana planta ou parte de planta de controle para identificar plantas ou partes deplantas que não apresentam descoloração ou descoloração reduzida emcomparação com a planta ou parte de planta de controle.

O método da invenção pode ser usado para qualquer plantaque possa estar sujeita à descoloração, mas é, em particular, útil para produzir,em particular hortaliças ou frutas, ou flores. O método é, entre outras coisas,apropriado para hortaliças com folhas, tais como alface, chicória ou endívia,para tubérculos, como batata ou batata doce, para raízes, tal como o aipo, parabrotos, tais como a chicória-endívia, ou para cogumelos. O método pode,além disto, ser usado para frutas, tais como maçã, banana, abacate, pêssego,pêra, damasco, manga, berinjela e para flores ou caules de flores, tais comocaules da gérbera, flores de crisântemo, fundos de alcachofra etc.

O método de triagem da invenção pretende identificar plantasque têm uma pequena superfície de descoloração induzida por ferimento emuma ou mais de suas partes ou tecidos. Para a triagem, é conseqüentementemuito prático usar a parte ou tecido que tem tendência à descoloração. Naalface, esta pode ser a folha ou uma parte dela, como um furo de folha, podeser apropriadamente usada em fatias de banana da fruta descascada e, fatiasde caule de flores, são um veículo de teste muito prático.

Entretanto, descobriu-se que a descoloração pode ser testadaigualmente em tecidos que não estão lesionados. Nos Exemplos mostra-se quetambém tegumentos intatos de semente e pontas de raiz são capazes deinduzir uma reação de cor na presença de um substrato exogenamenteadicionado que possa ser convertido em um pigmento colorido sem serlesionado. A redução ou a ausência desta reação de cor pode ser usada natriagem de plantas que têm uma descoloração reduzida.

Em um modo de realização específico o método é emparticular útil para triar as plantas que pertencem à família Asteraceae, emparticular do gênero Lactuca e mais em particular às espécies Lactuca sativaou às plantas que pertencem ao gênero Cichorium e em particular às espéciesdo Cichorium intybus e Cichorium endívia que apresentam uma ausência ouredução de superfície de descoloração induzida por ferimento.

A população de planta que é tríada com o método da invençãopode ser qualquer população de planta, mas é preferivelmente uma populaçãode planta variável que tenha muitos membros diferentes para aumentar aspossibilidades de se encontrar uma planta que apresente uma descoloraçãoinduzida por ferimento reduzida. Uma população tão variável pode ser criadapor meio de um tratamento mutagênico usando-se, por exemplo, produtosquímicos e/ou irradiação e é chamada então, aqui, uma população de plantamutante. Populações alternativas são as coleções de germoplasma, que sãocoleções de plantas apresentando variação natural. Além disto, umapopulação de plantas transgênicas pode ser usada.

O método da invenção é executado apropriadamente compartes de planta que têm uma superfície de ferimento. Amostras-teste muitoúteis são os discos que são perfurados de uma folha, os assim chamadosdiscos de folha. Alternativamente, o tecido da nervura central de hortaliçascom folhas venadas pode ser usado. Apropriadamente, os discos são cortadosdestas nervuras. Nas frutas as superfícies cortadas de meias frutas podem seravaliadas ou alternativamente fatiadas ou cortadas em cubo. Para flores, fatiasdo caule são uma amostra-teste muito prática.

A incubação ocorre, apropriadamente, em um ambienteaquoso. O método da invenção pode ser muito bem praticado com discos defolha que sejam incubados sobre, ou, entre papel de filtro umedecido. Aresposta de cor é então muito bem visível em torno das bordas do ferimentosobre o papel.

Alternativamente, o ambiente aquoso compreende água ouuma solução. Em um modo de realização específico que será ilustrado maisabaixo a solução contém um substrato, tal como L-3,4-dihidroxifenilalanina.

Este composto é convertido para a produção do pigmento preto melanina pelaoxidase de enzima de polifenol. Os compostos da alternativa que podem serusados para a triagem das plantas da alface em relação a isto incluem mas nãoestão limitados ao ácido clorogênico, ácido isoclorogênico, L-tirosina ecatecol.

A invenção pode, além disto, ser executada com a progênie deuma planta-mãe que apresente ausência ou redução da descoloração da folhainduzida por ferimento para demonstrar que a progênie ainda tem a mesmaausência ou redução da descoloração da folha induzida por ferimentoencontrada na planta-mãe.

A invenção pode igualmente ser executada em partes deplantas. Partes de plantas como cabeças ou folhas da alface e de endívia são,geralmente, as partes que têm uma superfície de corte que pode ser sujeita àdescoloração. Outras partes são frutas, brotos, raízes, sementes, tubérculos,flores, caules, etc.

Em um modo de realização adicional da invenção, sementesou sementes germinadas podem ser usadas como o veículo em que o métodode triagem é executado na presença de um substrato exogenamenteadicionado. No caso de sementes germinadas, as pontas da raiz jovem sãoenvolvidas na reação de cor.

A invenção é, comercialmente, muito interessante poridentificar plantas mutantes que podem ser usadas no mercado de hortaliçasprocessadas. Como explicado acima, a descoloração do produto, em particularfrutas e verduras frescas, é considerada indesejável, uma vez que o produtodescolorido é rejeitado pelo consumidor.

Descrição detalhada da invenção

Quando a alface é colhida e processada por corte, são geradasmuitas superfícies de folhas lesionadas o que leva a uma resposta significativada planta ou de partes de planta, manifestada por uma descoloraçãoacastanhada ou rosada na, ou, junto à superfície de ferimento. O rosado podeser igualmente observado em locais distantes da superfície de ferimento, nanervura central da folha, assim como, na extremidade. As vezes, o rosadopode ser igualmente observado em estágios logo antes da colheita, o que éconsiderado ser devido ao dano abiótico ou sobrematuridade da safra.

Outras plantas, em particular outras hortaliças, frutas e florespodem, igualmente, ter tendência à descoloração. O método da invenção éassim, igualmente, uma triagem muito conveniente para identificar outrasplantas, em particular outras hortaliças, ou frutas ou flores que apresentamresposta reduzida à descoloração induzida por ferimento

As diferentes formas de descoloração são afetadas pelaatividade enzimática, que é fortemente realçada como uma conseqüência doferimento e que gera diversas formas de polifenóis e produtos de reaçãoderivados dos mesmos.

Uma atividade enzimática importante envolvida na reação deacastanhamento é PPO. Atividade de PPO com relação ao acastanhamentoenzimático não está restrito à alface, e foi descrita para muitas outras espéciesde plantas envolvidas na deterioração pós-colheita como maçã, banana e abatata. De fato, PPO é reconhecida extensamente por ser uma das enzimasmais importantes envolvida na deterioração pós-colheita de muitas frutas everduras frescas processadas.

Por este motivo a PPO tem sido alvo de muitas tecnologias,visando a redução ou a prevenção destas atividades a fim de aumentar aqualidade pós-colheita de produtos de alimentação. A PPO catalisa umareação na qual polifenóis que residem no tecido da planta são oxidados,provocando a formação de o-quinonas. Subseqüentemente, as reaçõesenzimáticas e não-enzimáticas levam à formação de pigmentos marrons oupretos.

Em muitas espécies de plantas, a PPO é codificada por umapequena família de gene cujos membros individuais podem ter padrões deexpressões temporais e espaciais diferentes, indicativos de divergênciafuncional. Por exemplo, mostrou-se que a alface contém isoformas de PPOdiferentes nos tecidos fotossintético e vascular da folha.

O substrato natural da PPO pode diferir entre as diferentesespécies. A tabela 1 lista os substratos da PPO para várias hortaliças e frutasque estão sujeitas à descoloração por ferimento. Estes e outros substratospodem ser usados em um método de triagem baseado no substrato exógeno,da invenção.

Fontes

Tabela 1

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Em muitas plantas, o nível da enzima PPO não é induzidoespecificamente pelo ferimento de tecidos da planta e reside, inertemente, nocloroplasto. Com o ferimento, a PPO é ativada, o que é manifestado devido aofato do substrato fenólico que reside nos vacúolos ser posto em contato com aPPO devido ao rompimento do tecido.

Na alface, a produção de polifenóis, que são o substrato daPPO, é induzida pelo ferimento. Conseqüentemente, o potencial deacastanhamento do tecido da alface parece não estar limitado pela quantidadeda PPO no tecido da folha, mas um pouco pela taxa de bio-síntese dopolifenol pelo ferimento.

A este respeito, a situação pode diferir entre colheitas. Porexemplo, na maçã a quantidade de polifenóis é suficiente para gerar umaresposta de acastanhamento das frutas dentro de uma hora após o ferimentoenquanto que na alface a reação de acastanhamento pode levar alguns diasdevido ao fato de que, na alface, a associação de polifenol exige muito sersintetizada de novo com o ferimento.

A síntese dos polifenóis ocorre através de um caminhobioquímico bem-caracterizado, chamado o caminho do fenilpropanóide.Primeiramente, a etapa executada deste caminho é catalisação pela enzima defenilalanina amônia liase (PAL, Hahlbrock, K e Scheel, D (1989) Annu. Rev.Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 347-369). A PAL converte a fenilalaninado aminoácido sintetizado através de via shiquímica em ácido cinâmico.

Na alface, o ferimento das folhas leva a uma indução forte daexpressão de gene da PAL e da atividade da PAL. A formação de polifenóis écorrelacionada com esta atividade enzimática, que sugere que a atividade daPAL induzida pelo ferimento da alface é um fator importante responsávelpelo acastanhamento (Campos, R. e outros (2004) Physiologica Plantarum121, 429-438 e referências da mesma). Entretanto, é atualmente obscuro queoutros fatores determinam o resultado final da reação de descoloraçãoinduzida por ferimento. Por exemplo, a atividade das peroxidases (POD) foisugerida como sendo também importante para estabelecer o nível final dedescoloração (Fukumoto, L.R. e outros (2002) J. Agric. Food Chem. 540,4503-4511; Martin-Diana A. e outros (2005) Biosci. Biotechnol. Biochem.69, 1677-1685).

Uma vez que a atividade da enzima depende dadisponibilidade de água oxigenada interna, a contribuição da POD àdescoloração pode ser limitada.

É, além disto, evidente que o ferimento é percebido de algummodo pela planta e, por isto, um sinal é gerado através de uma ondulação, queatualmente é mal definida para a alface. Parece óbvio que estas atividadesserão direcionadas primariamente para a cicatrização do ferimento e para adefesa contra micróbios patógenos. Conseqüentemente, é provável que muitosfatores genéticos estejam envolvidos na criação da resposta da descoloraçãode tecido lesionado da alface e cada um destes são alvos potenciais paramodificação genética para reduzir ou eliminar a descoloração induzida porferimento.

A maioria destes fatores genéticos é atualmente desconhecidae para aqueles conhecidos por seu envolvimento não é claro qual a extensãodo papel específico que estes fatores desempenham na reação dedescoloração, ou se talvez tenham uma função mais geral em relação àfisiologia do ferimento da planta.

Por exemplo, embora a atividade da PAL induzida porferimento seja considerada para determinar o nível de acastanhamento daalface, sabe-se que produtos do caminho fenil propanóide estão envolvidosinter alia na biosíntese ou, também, na resposta de defesa. Conseqüentementereduzindo-se a atividade da PAL induzida por ferimento a fim de reduzir opotencial de acastanhamento pode comprometer outras funções além doacastanhamento induzido por ferimento o que pode ser menos desejável emrelação a outros aspectos do cultivo da alface.

Do mesmo modo, a atividade da PPO tem sido inferida comoenvolvida na resposta de defesa e conseqüentemente a redução do potencialde acastanhamento reduzindo-se níveis da PPO pode aumentar asusceptibilidade aos patógenos (Thipyapong, P. e outros (2004) Planta 220,105-117). Conseqüentemente, os inventores raciocinaram que umaabordagem mais imparcial poderia ser mais bem sucedida a este respeito. Estaabordagem compreende as seguintes etapas:

1. Geração de uma população mutável de plantas, emparticular, uma população mutante. Esta população mutante pode ser geradapelo tratamento de sementes ou tecidos da planta com agentes mutagênicos,como o sulfonato etil metano (ems) ou raios-x.

2. Estabelecimento de uma triagem fenotípica eficiente, naqual a triagem é baseada em uma descoloração da planta, em particular, emuma descoloração induzida por resposta ao ferimento da planta, que écanalizada através da PAL e/ou da PPO.

3. Caracterização dos mutantes modificados por sua respostaao ferimento no que diz respeito ao potencial de descoloração pós-colheita e àausência de efeitos pleiotrópicos da modificação, que comprometem o cultivoe o processamento da planta de acordo com a prática comum.

A invenção refere-se, assim, a um método de triagem paraidentificar, selecionar e obter uma planta apresentando uma descoloraçãoinduzida por ferimento reduzida e desordens de processamento pós-colheitatais como o acastanhamento ou rosado enzimático. No método de triagem, adescoloração pode ser observada em uma superfície de ferimento mas,igualmente, descobriu-se que os tecidos intatos também apresentam umareação de cor pela adição de um substrato.

Uma população de planta mutante para uso no método dainvenção pode, por exemplo, ser preparada como segue:

a) tratar sementes MO de uma espécie da planta a sermodificada com um agente mutagênico para obter sementes Ml;

b) cultivar plantas das sementes Ml assim obtidas para obterplantas Ml;

c) opcionalmente repetir as etapas b) e c) η vezes para obterMl+ η sementes;

d) germinar as Ml+n sementes assim obtidas e cultivar asplantas destas sementes.

De acordo com a invenção, estas plantas sãosubseqüentemente analisadas para resposta à descoloração induzida porferimento. Plantas que não apresentam ou apresentam uma resposta reduzidaà descoloração pelo ferimento são selecionadas. Deste modo, a progênie dasplantas selecionadas é cultivada e a resposta da descoloração induzida porferimento é medida.

Para a criação de variabilidade genética pode ser feito uso damutagênese. Diversos produtos químicos ou tratamentos físicos sãoconhecidos dos peritos na técnica e podem ser usados para induzir mutaçõesgenéticas em espécies de plantas. Por exemplo, alguém pode tratar sementesem uma solução contendo diferentes concentrações de um mutageno como oems. Alquilatos de ems, primariamente resíduos G de uma trança de ADNque, durante a duplicação do ADN, provocam o casamento com T em vez deC. Conseqüentemente, os pares-base GC mudam para pares-base AT a umafreqüência que é determinada pela dose efetiva de ems e pela atividade dosistema de reparação de má combinação da planta.

A dose efetiva de ems depende da concentração usada, dotamanho da semente e de outras propriedades físicas, e do momento daincubação das sementes na solução de ems. Sementes que foram tratadas comum agente mutagênico são chamadas, tipicamente, de sementes M1. Comouma conseqüência do tratamento, os tecidos das sementes M1 contêmmutações de pontos aleatórios nos genomas de suas células, e aquelespresentes na subpopulação das células, que formam o tecido da linhagerminativa (células germinais), serão transferidos para a geração seguinte,que é chamada M2. Mutações ou combinações que são haplo-insuficientes,provocando, deste modo, esterilidade ou que induzam à mortalidade doembrião, não são transferidas para a geração M2.

Um procedimento similar ao descrito acima para o uso de emsse aplica, igualmente, a outros agentes mutagênicos. Agentes mutagênicosapropriados são bem conhecidos na técnica. Particularmente úteis são osagentes mutagênicos alquilantes, como o sulfato dietil (DES), etileneimina(ei), propano sultona, N-metil-N-nitrosouretano (mnu), N-nitroso-Nmetilureia (NMU), N-etil-N-nitrosoureia (enu), azida de sódio.

Alternativamente, as mutações são induzidas por meio deirradiação, que, por exemplo, é selecionada de raios X, nêutrons rápidos,irradiação UV.

Em outro modo de realização da invenção, as mutações sãoinduzidas por meio da engenharia genética, como por meio do uso deoligonucleotídeos quiméricos, recombinação homóloga introdução de genes-alvo modificados que competem com o produto endógeno, regulaçãodecrescente através de interferência de RNA, etc.

A população do M2 de um tratamento de mutagênese pode serusada nos procedimentos de triagem dirigidos à resposta do ferimento que écanalizada através da PAL e da PPO. E óbvio ao artesão experiente quequalquer população de plantas, que porte variação genética pode ser tomadacomo material inicial para esta triagem fenotípica, tal como as coleções degermoplasma, que são coleções de plantas apresentando variação natural oupopulações de plantas transgênicas.

A produção de sementes Ml e Ml+n é efetuadaapropriadamente por meio autopolinização.

A fim realizar a triagem fenotípica da invenção, umasuperfície de ferimento deve ser gerada uma vez que a reação de descoloraçãoenzimática é induzida pelo ferimento. Este ferimento pode ser conseguidocortando, perfurando, fatiando, por abrasão, espremeção, quebra,descascando, esmagando, pressionando, reduzindo, moendo, por injeçãofluida, choque osmótico, removendo, segando, rasgando.

Descobriu-se que o método da invenção no qual substratoadicionado exogenamente é usado pode, igualmente, ser praticado em tecidose em partes de planta intatos, tais como sementes, nas situações onde a PPOestá dentro do alcance do substrato, por exemplo, quando a PPO é segregadaou localizada fora da célula. A enzima que induz a reação de cor está, então,igualmente disponível sem ferimento prévio.

Após o ferimento ou quando nenhum ferimento é necessário,deve se manifestar uma característica fenotípica que é diagnostica para ocaminho que leva à descoloração do tecido e que pode ser usada muitoeficientemente em uma triagem da população mutante.

Descobriu-se, surpreendentemente, que estas característicasfenotípicas poderiam ser obtidas coletando-se parte da planta e incubando-assob circunstâncias muito específicas que favoreceriam a ocorrência de formasdiferentes de descoloração, em particular descoloração de superfície deferimento. Subseqüentemente, estas análises puderam ser aplicadas a umgrande número de plantas ou partes de planta, tais como as plantas mutantes,de modo a triar aquelas plantas que apresentassem uma redução à resposta dadescoloração induzida por ferimento.

Um modo de realização desta invenção está baseado nadescoberta surpreendente de que, quando os discos de folhas, tais como asfolhas da alface ou folhas da endívia ou da escarola, são coletados eincubados entre papéis de filtro umedecidos a 5°C, após, aproximadamente, 4dias a formação de uma pigmentação rosada nas bordas dos discos de folhatorna-se aparente. O papel de filtro apropriado é o papel tipo 1450 CV defiltro, Refi no. 10 313 281 de Schleier & Schuell, Microscience GmbH,Dassel, Alemanha. Com incubação adicional, o sinal se intensifica e apósaproximadamente uma semana a intensidade máxima foi atingida. Aformação da pigmentação rosada ocorre, especificamente, nas superfícies deferimento.

A descoloração pode ser medida marcando-se sobre umaescala visual a partir de 0, que significa nenhum acastanhamento ou rosado,até 10, que significa acastanhamento ou rosado igual a uma variedade padrãoda planta a ser selecionada (por exemplo, L. sativa para a triagem da alface).Nos Exemplos relativos à alface, a variedade "Troubadour" da L. sativa éusada como um padrão para 10.

Se desejado, fotos podem ser usadas para comparação comresultados de classes intermediárias entre 0 e 10. Além disto, fotos digitaispodem ser tiradas do papel de filtro com a pigmentação rosada ouacastanhada, seguido da contagem por posição do disco de folha do númerode pixéis com uma cor rosada ou acastanhada intensa. Usando-se uma destasmedidas, análises estatísticas simples como o teste-t, bastante conhecido dosperitos na técnica, podem ser executadas para determinar se uma planta ougrupo de plantas é significativamente menos rosado ou acastanhado do que opadrão. O nível de significância aplicado de um teste unilateral é 0,001.

Para mutantes, a comparação estatística pode ser feita entre ascontagens rosadas da variedade original, que é o melhor padrão disponível, eas contagens rosadas do mutante individual e/ou sua descendência.

Para encontrar a feição da invenção em plantas existentes,amostras representativas de variedades, linhas de reprodução e/ou acessos abancos de genes podem ser usados. A comparação estatística pode, então, serfeita entre as contagens rosadas do acesso individual sob investigação e orestante da população. Quando testando estatisticamente indivíduos parasignificativamente menos rosado, testes de comparação múltiplos podem sernecessários para manter os níveis de significância total apropriados, porexemplo, o teste de comparação múltipla de Dunnett com um padrão (DunnettCW, J. Amer. Statist. Assoc. 50:1096 - 1121 (1955)).

Além disto, mostrou-se que esta resposta pode ser obtidausando-se muitos tipos diferentes de tecido de folhas de diferentes estágios dedesenvolvimento. Por exemplo, na alface, o tecido da nervura central pode,igualmente, ser induzido para dar esta resposta pelo ferimento. Quandoaplicada aos diferentes tipos de alfaces, tais como, de cabeça-gigante,crocante, romana, da Batávia ou serrilhada, nenhum acesso individual foiencontrado que apresentasse significativamente menos rosado do que orestante da população investigada. Conclui-se conseqüentemente que dentrodos tipos de alface cultivados não há, ou, há apenas uma variação genéticamuito limitada para a descoloração rosada induzida por ferimento.

Demonstrou-se, ainda que, de acordo com invenção, uminibidor específico da PPO, L-cisteína, quando aplicado durante a reação,reprimiu fortemente a formação da pigmentação rosada. Além disto,descobriu-se que a formação da pigmentação rosada foi inibida pelocinamaldeído, que é um inibidor da atividade da PAL e do acastanhamento daalface recém-colhida (Fujita, N. e outros (2006) Biosci. Biotechnol. Biochem.70, 672-676). Estes resultados mostraram que a resposta rosada dadescoloração da alface é dependente da PAL e da PPO.

Sabe-se que o acastanhamento enzimático da alface recém-colhida pode ser impedido muito eficazmente pela aplicação de um rápidochoque termal. O efeito observado pode ser explicado supondo-seredistribuição da biosíntese da proteína do caminho fenil propanóide para asproteínas do choque termal reduzindo, deste modo, o fluxo metabólico para aformação de polifenóis.

Alternativamente, o efeito pode ser explicado supondo-se queas enzimas envolvidas na oxidação do polifenol, tais como a PPO e a POD,são inativadas pelo tratamento de choque termal. Quando o choque termal foiaplicado à alface, que foi analisada subseqüentemente para a resposta rosada,foi mostrado que esta resposta, bem como o acastanhamento enzimático,foram inibidos eficazmente. Isto demonstra que a resposta rosada da alface,que é parte desta invenção é fisiologicamente muito similar aoacastanhamento enzimático bastante conhecido.

Esta descoberta foi consubstanciada posteriormente,aplicando-se L-cisteína como um agente redutor. A L-cisteína além de ser uminibidor da PPO, é conhecida igualmente por reagir com o-quinonas coloridase por convertê-las de volta em difenóis incolores em uma reação química deredução. Quando a pigmentação rosada formada por discos de folha da alfaceé tratada com a L-cisteína, demonstrou-se que o composto rosado foiconvertido em um composto incolor. Parece, conseqüentemente, que sejaprovável que a pigmentação rosada seja uma o-quinona formada pela PPO.

Isto foi corroborado pela descoberta de que agentes redutores,como o ácido ascórbico ou a glutationa, igualmente convertem a pigmentaçãorosada em um composto incolor.

Além disto, quando plantas que foram colhidas no campoapresentando rosado são tratadas com L-cisteína, a descoloração rosada éigualmente eliminada. Isto demonstra que a resposta rosada do disco de folharepresenta o fenômeno de rosado natural, que pode algumas vezes ser vistonas plantas cultivadas sob condições de campo.

Um modo de realização adicional desta invenção é baseado naexperiência a seguir. Partes de uma folha de uma cabeça da alface sãoproduzidas por corte e incubadas a 16°C no ar. Como uma resposta, asuperfície de ferimento torna-se castanha após, aproximadamente, 4 dias.

Especialmente na superfície de ferimento da nervura principal, oacastanhamento pode claramente ser observado. Além disso, a reação deacastanhamento pode igualmente ser observada, a nível de toda a planta,sobre folhas danificadas pelo corte ou pela abrasão.

Todas estas reações de acastanhamento podem sercompletamente inibidas pela L-cisteína, um inibidor da PPO, que demonstraque estes fenótipos são manifestados através da atividade da PPO e podem,conseqüentemente, ser considerados diagnósticos para o acastanhamento pós-colheita, como observado durante o processamento e embalagem da alface.

Estas reações de acastanhamento induzidas por ferimentopodem ser geradas de uma maneira eficiente que pode ser explorada em umprocedimento de triagem fenotípica para identificar plantas mutantes quetenham potencial de acastanhamento induzido por ferimento reduzido.Um modo de realização adicional desta invenção é baseado nadescoloração em superfícies de ferimento de tecidos da alface, ou na reaçãode cor observada no, sobre, ou próximo de tecidos intatos da alface, taiscomo, tegumentos de semente da alface, induzidos pela aplicação desubstratos que podem ser convertidos pelas enzimas de oxidação do fenol emcompostos coloridos.

Por exemplo, quando os discos de folha da alface sãoincubados com um substrato da PPO L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA),uma descoloração castanho escuro a preto é observada na superfície deferimento que é a manifestação da formação de melanina através da PPO.Quando a L-cisteína foi aplicada simultaneamente, a descoloração preta foitotalmente inibida o que confirma a suposição de que esta descoloração émediada pela PPO.

Embora L-DOPA não seja considerada um substrato naturalpara a PPO da alface, ela pode ser útil nas análises direcionadas para aidentificação de mutantes que apresentam descoloração induzida porferimento reduzida.

De maneira similar à descrita para L-DOPA, outros substratospodem ser aplicados a fim de provocar uma resposta de descoloração. Estesincluem, mas não de modo limitativo, o ácido clorogênico, ácidoisoclorogênico, L-tirosina, e catecol.

Tomada em conjunto, a formação de pigmentações diferentesnas superfícies geradas nas plantas monitora modificações em um caminhoque começa pela indução de um sinal de ferimento, canalizado através daPAL e da PPO, e levando à descoloração. Como descritas, estas reações dedescoloração induzida por ferimento podem ser prontamente avaliadas porinspeção visual, o que permite um procedimento de triagem muito eficiente damutante. A lógica em que se baseia o método descrito por esta invenção estáilustrada na Figura 1.De acordo com esta invenção, descobriu-se, assim, que ocaminho da descoloração induzida por ferimento de discos de folha, in vitro,justapõe-se amplamente com a descoloração induzida por ferimento da alfaceprocessada em escala industrial e pode, conseqüentemente, ser consideradodiagnóstico para este processo. Isto é corroborado pela noção que osinibidores da PAL ou da PPO inibem o acastanhamento enzimático da alfaceprocessada e embalada sob condições práticas, industriais. Significativamente,uma vez que o procedimento compreende a etapa de indução isto é, ferimentoe uma das conversões metabólicas finais mediadas pela PPO, o procedimentopermite capturar todos os fatores genéticos direta ou indiretamente envolvidosneste processo fisiológico. Além disso, como esta resposta pode ser geradausando-se uma gama inteira de tecidos de folha das folhas de estágios dedesenvolvimento diferentes, triagens de mutantes podem ser direcionadaspara estes estágios ou tecidos diferentes quando considerado relevante.

Plantas mutantes, que foram identificadas como tendo sidomodificadas no que diz respeito ao processo fisiológico levando de umadescoloração por ferimento a uma dependente da PAL e da PPO baseada emum ou mais das análises fenotípicas descritas acima, podem seradicionalmente caracterizadas. Esta caracterização pode ser feita a níveisdiferentes, por exemplo, a nível molecular, bioquímico, fisiológico e fenotípico.

E óbvio àqueles peritos na técnica que níveis variáveis dedescoloração podem ser observados, o que pode refletir a presença de lócusmutantes diferentes ou formas alélicas diferentes de lócus idênticos afetando afeição da descoloração na população original.

Em caso das mutações recessivas, estas duas possibilidadespodem ser facilmente distinguidas pela execução de testes de alelismo, quecompreende o cruzamento de duas plantas mutantes e a determinação dofenótipo do híbrido. No caso de alelismo das mutações, a feição reduzida dadescoloração será aparente em Fl enquanto que, no caso do fenótipo nosmutantes, é determinada por lócus recessivo diferente, o que não seria o caso.

Uma vez que, em um modo de realização da invenção,mutagênese aleatória é aplicada para gerar a população inicial, mutações nofundo genético podem, igualmente, contribuir para a variação do fenótipo sobcondições experimentais. A fim de discriminar entre mutações exclusivas deresistências diferentes e um efeito combinado de mutações no fundo genético,retrocruzamentos deveriam ser executados para criar fundos genéticosuniformes para eventos diferentes de descoloração reduzida.

Este procedimento é adicionalmente relevante para determinarse mutações em lócus específicos, envolvidos em descoloração induzida porferimento, apresentam efeitos pleiotrópicos.

As plantas M2 assim selecionadas com base em uma respostareduzida da descoloração são usadas para cultivar as sementes M3.Subseqüentemente, as linhas endogâmicas descendentes de eventos dedescoloração reduzida são reavaliadas para sua resposta reduzida aoferimento. Além disto, o acastanhamento ou rosado reduzido pode seravaliado em fundos genéticos diferentes e sob condições diferentes de cultivoda colheita e do processamento. Os métodos de triagem da invenção podemser usados para todas estas avaliações.

Estudos bioquímicos podem ser executados para tratar dequestões relacionadas aos caminhos afetados pela modificação genética.Estudos moleculares podem ser executados para determinar se os genes decandidatos putativamente envolvidos na resposta de acastanhamentoenzimático ou rosado como genes codificando a PAL, PPO ou peroxidases,foram modificados. Análise genética pode, além disto, ser realizada parademonstrar se a modificação encontrada em um gene de candidato é causaiem relação ao fenótipo alterado.

Embora mutagênese induzida seja o método preferido deprover uma população de planta a ser usada no método de triagem destainvenção, uma pessoa experiente na técnica sabe que existe tecnologia quepermite modificar genes-alvo residentes no genoma de uma planta de umamaneira específica. Por exemplo, tem sido demonstrado queoligonucleotídeos quiméricos são agentes mutagênicos eficazes com ummodo específico de ação.

Outra abordagem é modificar genes-alvo via recombinaçãohomóloga ou alvejamento do gene. Usando-se esta abordagem, um fragmentode um gene é trocado por um fragmento introduzido do ADN contendo umamodificação desejada. Abordagens transgênicas são igualmente praticáveis,pelas quais os genes modificados do alvo são introduzidos para competir como produto endógeno. Isto pode levar a efeitos negativos dominantes. Alémdisso, a regulação decrescente específica da expressão dos genes é praticávelcom a interferência do RNA.

No caso dos oligonucleotídeos mutagênicos, o alvejamento dogene ou abordagens transgênicas são usados para modificar um fator genéticoenvolvido na resposta da descoloração induzida por ferimento, obviamente, aestrutura primária dos genes relevantes deveria ser conhecida.

Quando plantas da progênie de mutantes particulares,cultivadas de sementes obtidas via autofertilização, são analisadas pelorosado, uma redução similar à encontrada para o mutante originalmenteidentificado é observada. Isto demonstra que uma resposta da descoloraçãorosada reduzida pode ser hereditária e provocada por uma modificação dogenoma.

Uma descoberta ainda mais surpreendente foi o fato de quequando as plantas da progênie de mutantes, identificadas como apresentandouma descoloração reduzida induzida por ferimento, são cultivadas àmaturidade e testadas para acastanhamento enzimático de tecido lesionado danervura central, esta resposta é também fortemente inibida. Isto mostra que aanálise do rosado do disco de folha está causalmente relacionada aoacastanhamento enzimático na alface e que a análise do rosado pode ser usadapara prognosticar o nível de acastanhamento enzimático de uma planta de alface madura.

Conseqüentemente, a análise do rosado do disco de folha podeser usada como uma ferramenta da triagem para identificar plantas da alfacecom um potencial de acastanhamento enzimático reduzido. Esta ferramentapode ser usada para identificar plantas da alface com potencial deacastanhamento enzimático reduzido de qualquer tipo de população de plantaindependentemente da causa da variação genética, que reside nesta população.Por exemplo, além das populações de ems, alguém pode usar acessos naturaisou populações de cultivos.

O método de triagem também pode ser usado para triar outrasplantas que apresentem descoloração induzida por ferimento.

Um ou mais dos métodos de triagem providos por estainvenção pode, por exemplo, ser aplicado a qualquer espécie da planta para aqual a qualidade de processamento pós-colheita precisar de melhoria. Alémda alface cultivada esta invenção pode igualmente ser aplicada a outrasespécies de planta, por exemplo, pertencentes às Asteraceae, bem como àespécie selvagem do gênero Lactuca ou às espécies de plantas pertencentes aogênero de planta Cichorium ao qual espécies como endívia (Cichoriumendívia), chicória e escarola (Cichorium intybus) pertencem. Além disso,outras plantas de cultivo tais como maçã, chicória, batata, batata doce, aipo,cogumelos, banana, abacate, pêssego, pêra, damasco, manga, berinjela, e paraflores ou caules de flor, tais como caules de gérbera, flores de crisântemo,fundos de alcachofra etc. podem ser tríadas com os métodos da invenção.

A presente invenção refere-se a um método para detectar umacaracterística fenotípica em uma planta pela execução dos métodos de triagemque são aqui apresentados. A presença da característica é determinada pormeio de um ou mais de três testes de descoloração, a saber, a ocorrência derosado ou do acastanhamento ou a capacidade de converter um substrato emum pigmento colorido, como L-DOPA em melanina.

O "controle" como usado aqui é qualquer planta que se sabeque apresenta uma ou mais das reações de descoloração rosada, deacastanhamento, e conversão de L-DOPA em melanina, cujas reações podemser inibidas pela L-cisteína ou pelo cinamaldeído. Apropriadamente, umaplanta é usada, da qual um disco de folha ou outra parte de planta quandoincubado entre papel de filtro umedecido a 5°C por 7 dias apresentadescoloração rosada em torno das bordas do disco ou da parte.

A presente invenção será adicionalmente ilustrada pelosExemplos a seguir e que não pretendem limitá-la de nenhuma maneira. OsExemplos referem-se a discos de folha da alface e sementes, Cichorium eberinjela, mas, em vez de alface, outras plantas ou partes delas, em particularfrutas e verduras frescas, podem ser usadas. Nos Exemplos, referência é feitaàs figuras a seguir.

Figura 1: Esboço esquemático da lógica por trás do projeto doprocedimento de triagem do mutante das populações de alface paradescoloração enzimática reduzida pós-colheita. O sinal de entrada da triagemé o ferimento do tecido da folha, que é detectada pela planta e que gera umaresposta de sinalização divergente que leva a vários processos fisiológicosincluindo senescência, respiração e descoloração do tecido. Este sinal deentrada pode ser combinado com a aplicação de compostos fenólicos comosubstratos da PPO.

O sinal de saída da triagem é uma descoloração acastanhadaou rosada, dependendo das condições aplicadas, do diagnóstico da superfíciede ferimento para acastanhamento e rosado pós-colheita. Isto é pressupostopelo fato do sinal de saída estar completamente inibido por cinamaldeído e L-cisteína, que são inibidores específicos da PAL e da PPO, respectivamente.Figura 2: Imagem representativa do fenótipo de saída datriagem baseada na descoloração rosada de discos de folha. Os discos de folhadas plantas da alface (1 disco por planta) são arranjados entre papéis de filtroumedecidos e incubados a 5°C por 7 dias. Uma descoloração rosada pode serclaramente observada em torno de cada disco de folha na superfície deferimento.

Figura 3: Análise do rosado do disco de folha (4 discos porprato) realizada na presença de concentrações diferentes de cinamaldeídoinibidor da PAL. O número acima de cada um dos pratos mostra os % decinamaldeído usados.

Figura 4: Efeito inibitório da L-cisteína, inibidor a PPO nadescoloração rosada dos discos de folha da alface (4 discos por prato)incubados entre papéis de filtro umedecidos. O número acima de cada pratomostra os % de L-cisteína usados.

Figura 5: Efeito inibitório da L-cisteína, inibidor da PPO nadescoloração preta dos discos de folha da alface (4 discos por rato) incubadosentre papéis de filtro umedecidos na presença de L-DOPA 1,5 mM. O númeroacima de cada prato mostra a concentração usada de mM de L-cisteína.

Figura 6: Efeito do pré-tratamento por choque termal emrosado do disco de folha da alface. O choque termal foi aplicado por 90segundos nas folhas intatas na temperatura indicada em cada prato.

Figura 7: Conversão da pigmentação rosada formada pelaresposta ao ferimento da alface em um composto incolor pela L-cisteína. Afileira superior dos pratos mostra a análise de L-DOPA enquanto que a fileirainferior dos pratos mostra a análise do rosado Os mais baixos de dois discosem cada prato foram tratados com L-cisteína depois que a resposta aoferimento terminou. A concentração de L-cisteína usada foi O, 0,001, 0,01,0,1, 1 e 10 mM, que está indicada acima.

Figura 8: Redução do rosado na alface cultivada carregadacom L-cisteína. O painel superior mostra sintomas típicos do rosado de umafolha da alface colhida de uma planta, que foi extremamente estressada porsaturação com água As nervuras principais mostram a presença de umapigmentação rosada. O painel inferior direito mostra um disco coletado dafolha que mostra sintomas de rosado após o tratamento com L-cisteína 1 mMpor 30 minutos na temperatura ambiente. O painel inferior esquerdo mostraum disco de folha similar após o tratamento com água por 30 minutos natemperatura ambiente.

Figura 9: Painel A: Análise fenotípica das plantas M2individuais da alface (agrupadas em lotes) para descoloração do disco defolha de acordo com o método descrito por esta invenção. Um total de 138amostras de 12000 é mostrado neste painel das quais a indicada por uma setaapresentou descoloração rosada fortemente reduzida. Painel B: Novo teste doindivíduo selecionado indicado no painel A confirmou a quase ausência deformação da descoloração rosada (amostra na posição média) em comparaçãoàs amostras de controle que apresentaram uma resposta da descoloração clara.

Figura 10: Fenótipos de plantas M2 da alface. As plantasetiquetadas 1, 2, 4, 5, 7, 10 e 12 apresentaram descoloração rosada reduzidado disco de folha usando-se a análise de acordo com esta invenção. As plantas3, 6, 8, 9, e 11 sãos plantas, que apresentaram um nível de descoloraçãorosada do disco de folha comparável ao controle do tipo selvagem. A planta 1é o único exemplo de um mutante que apresentou uma redução forte nadescoloração rosada e em um habitus normal de cultivo. As plantas 2, 4, 5, 7,e 12 apresentaram descoloração rosada reduzida e um fenótipoapequenado, descorado.

Figura 11: Teste da progênie de um mutante da alfacemostrando uma descoloração reduzida. A esquerda, 25 amostras de controlesão mostradas apresentando uma resposta normal da descoloração induzidapor ferimento. A direita, um grupo de amostra é mostrado coletadas de umasérie de 35 plantas da progênie derivada de um único mutante, que tiveramsuas respostas da descoloração induzida por ferimento reduzidas severamente.

Figura 12: Imagem representativa do fenótipo de saída datriagem baseado na descoloração acastanhada de partes da nervura central dafolha coletadas de plantas maduras da alface. A foto mostra discos do tecidoexterno da nervura central da folha da alface após incubação por 3 dias a16°C. A descoloração acastanhada típica pode claramente ser observada nasuperfície de ferimento. Cada prato contém 3 discos coletados em posiçõesdiferentes da nervura central (verde, verde claro e branco). O número acimado prato indica a concentração em mM de L-cisteína que foi adicionada aofiltro.

Figura 13: Conversão de L-DOPA na superfície da folha daalface em melanina. O painel A mostra a análise em uma solução de L-DOPA1,5 mM. O tubo superior é o controle negativo, os outros 3 tubos sãoidênticos. O painel B mostra o resultado da incubação de discos de folha entrepapéis de filtro umedecidos contendo L-DOPA 1,5 mM.

Figura 14: Teste da progênie de um mutante da alface queapresenta uma descoloração rosada reduzida induzida por ferimento noacastanhamento da nervura central. O painel A mostra os discos da nervuracentral de 8 plantas da progênie, numerados 1 a 8 (3 discos por planta) domutante com rosado reduzido. O painel B mostra os discos da nervura centralde 8 plantas de controle numerados de 9 a 16 (3 discos por planta) queapresentaram uma resposta normal de acastanhamento.

Figura 15: Avaliação de um mutante da alface que apresentauma resposta reduzida de descoloração rosada induzida por ferimento ouacastanhamento após o corte e embalagem sob atmosfera ambiente. Partes defolha da cabeça de uma planta de controle são mostradas à esquerda e partesda folha do mutante com descoloração reduzida são mostradas à direita. Omaterial da folha recém-colhida foi armazenado por 6 dias a 4°C. Adescoloração acastanhada pôde ser claramente observada nas amostras decontrole enquanto que as amostras do mutante permaneceram imutáveis.

Figura 16: Análise do rosado na Cichorium endívia (painelesquerdo) e na Cichorium intybus (painel direito).

Figura 17: Análise com ácido clorogênico em discos de folhada alface.

Figura 18: Resposta do acastanhado na berinjela cortada.

Figura 19: Análise de L-DOPA em sementes da alface (fileirasuperior) e berinjela (fileira inferior).

Figura 20: Análise de L-DOPA em sementes germinadas daalface.

Figura 21: Análise do catecol em sementes germinadas daalface.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Modificação genética da alface usando-se ems

Aproximadamente 2000 sementes das variedades da alfaceTroubadour, Apache, Yorvik.e Roderick foram incubadas em uma soluçãoventilada de 0.05% (w/v) ou 0.07% (w/v) ems durante 24 horas natemperatura ambiente. Após o tratamento do ems as sementes Ml foramenxaguadaS; com água e plantadas em uma estufa a 20°C por em regime de 16horas com luz, 8 horas no escuro para cultivar as plantas maduras e caule efloração induzidos para produzir sementes M2. Após a maturação, assementes M2 foram colhidas, inchadas e armazenadas até uso posterior. Afreqüência da mutação foi estimada com base no número relativo de plantasindividuais com um fenótipo descorado que foram perturbadas na biosínteseda clorofila.

EXEMPLO 2

Desenvolvimento de um diagnóstico de triagem fenotípica para adescoloração induzida por ferimento da alface baseada na formação depigmento rosado

Uma análise fenotípica foi desenvolvida na qual adescoloração induzida por ferimento da folha da alface pôde ser prontamenteavaliada. Esta abordagem permite a triagem da planta nova para descoloração.Discos de folha com diâmetro de 5mm foram coletados de plantas jovens, oumaduras e colocados entre papéis de filtro umedecidos em uma bandeja. Osistema foi incubado a 5°C por 7 dias. Durante a incubação uma pigmentaçãorosada desenvolveu-se no local lesionado do disco de folha e tornou-seclaramente visível como um círculo impresso no papel de filtro (Figura 2).

A fim de demonstrar que a produção da pigmentação rosadaexige um caminho fenilpropanóide ativo, os efeitos dos inibidores da PAL(cinamaldeído, Figura 3) e da PPO (L-cisteína, Figura 4) foram testados nesteanálise. Quando o cinamaldeído foi aplicado durante a análise, a descoloraçãorosada foi completamente inibida em uma concentração de 0,01% ou maisalta.

Um resultado semelhante foi obtido usando-se L-cisteína emuma concentração de 0,001% e mais alta, enquanto outros aminoácidos comoa L-Ieucina ou L-alanina não apresentaram nenhum efeito. Isto demonstra quea L-cisteína pode inibir a resposta rosada dos discos da folha da alface e que oefeito inibitório da L-cisteína é específico.

A fim de demonstrar que a L-cisteína está atuandoverdadeiramente como um inibidor da atividade da PPO neste sistema, osdiscos de folha da alface foram incubados com substrato da PPO L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). Embora L-DOPA não seja considerada, umsubstrato natural para a PPO da alface, uma descoloração castanho escuro apreto foi observada na superfície de ferimento que é a manifestação daformação de melanina via PPO. Quando 1 mM ou uma concentração mais altade L-cisteína foi aplicada simultaneamente, a descoloração foi inibidacompletamente segundo as indicações da Figura 5.

A resposta rosada do disco de folha da alface foiadicionalmente caracterizada pela aplicação de um choque termal antes deinduzir a resposta ao ferimento. Folhas destacadas foram incubadas durante90 segundos a 21, 40, 50 e 60°C. Após este tratamento, discos de folha foramcoletados e analisados para o rosado. A resposta rosada foi inibidacompletamente quando o choque termal foi realizado à temperatura de 5 0°Cou mais alta. Este resultado é mostrado na Figura 6.

Como a L-cisteína é conhecida por reagir com as o-quinonas,que são produtos da PPO, convertendo-os de novo em difenóis incolores, osefeitos da L-cisteína na pigmentação rosada que vem dos discos da folha daalface foram determinados. Paralelamente, o efeito da L-cisteína foideterminado na formação da melanina pela incubação com L-DOPA.

Discos de folha foram coletados e incubados de acordo com osprocedimentos descritos acima. Depois que a resposta do ferimento foicompletada, uma série da concentração de L-cisteína foi adicionada ao discode folha e a mudança na cor foi monitorada. O resultado é mostrado na Figura7. A experiência demonstrou claramente que a L-cisteína estava convertendoa pigmentação rosada de novo em um composto incolor, enquanto que amelanina preta formada na análise de L-DOPA não foi afetada pela L-cisteína. Isto demonstra que a pigmentação rosada é, muito provavelmente,uma o-quinona formada pelo sistema de oxidação do polifenol da alface.

Para demonstrar que a resposta in vitro observada reflete umaresposta que é fisiologicamente relevante, a descoloração baseada em L-cisteína foi aplicada no material de planta cultivada no campo. Isto foirealizado colhendo-se uma folha de uma planta da alface cultivada no campoapresentando severos sintomas de rosado ao longo das nervuras. Isto éobservado, tipicamente, quando as plantas foram forçadas, por exemplo, emcondições de saturação severa com água. A folha foi usada para preparar osdiscos de folha que foram incubados imediatamente com L-cisteína ImM.Após uma incubação de, aproximadamente, 30 minutos à temperaturaambiente, a descoloração rosada desapareceu, segundo as indicações daFigura 8.

Considerados em conjunto, estes dados experimentais mostramque discos de folha da alface podem ser induzidos por ferimento para produzirdescoloração rosada que é dependente da PAL e da PPO. Este fenótipopermite um procedimento de triagem eficiente e eficaz para os mutantes daalface que têm uma resposta de descoloração induzida por ferimentomodificada canalizada via PAL, PPO ou ambos.

EXEMPLO 3

Triagem para mutantes com descoloração reduzida induzida porferimento

A fim de identificar mutantes da alface com baixo potencial deacastanhamento enzimático ou rosado induzido por ferimento, a análise dodisco de folha descrito no Exemplo 2 foi aplicada às plantas de umapopulação de alface mutante.

Doze mil plantas foram cultivadas em uma estufa(Localização: De Lier, semeadura em 28 de março, plantio em 18 de abril;crescimento sob condições de cultivo regular da alface) e, de cada plantaindividual, foi coletado um disco de folha (amostragem de 15 de maio emdiante) e incubadas como grupos de (em média) 25 amostras entre papéis defiltro umedecidos a 50C por 7 dias. Um escore visual foi atribuído a cadadisco de folha dependendo da intensidade da descoloração rosada. Com basenesta avaliação, as plantas foram tríadas naquelas cujos discos de folha ou nãoapresentaram, ou apresentaram um grau relativamente baixo de descoloraçãoda superfície de ferimento. A planta com traços mal visíveis de descoloraçãofoi numerada como 06D.210202.

Das 12000 plantas, 1 planta foi finalmente selecionada, a queapresentou apenas traços de descoloração dificilmente visíveis e 11 queapresentaram um nível relativamente de baixo de descoloração. O resultadode uma destas análises é mostrado na Figura 9.

A análise da descoloração foi repetida para os 12 indivíduosinicialmente selecionados e para a maioria dos casos individuais o resultadooriginal foi, confirmado. Somente indivíduos confirmados foram selecionadospara uma análise posterior e produção de semente.

EXEMPLO 4

Triagem para mutantes com uma descoloração reduzida induzida porferimento

A fim de identificar mutantes da alface com baixo potencial deacastanhamento enzimático induzido por ferimento a análise do disco da folhadescrito no Exemplo 2 foi aplicado às plantas de uma população da alfacemutante. 8500 plantas foram cultivadas em uma estufa até 3 semanas de idade(estágio de folha 6-8) e de cada planta individual um disco de folha foicoletado e incubado entre papéis de filtro umedecidos a 50C por 7 dias.

Foi atribuído um placar visual para cada disco de folha,dependendo da intensidade da descoloração rosada. Com base nestaavaliação, as plantas foram triadas naquelas cujos discos de folha nãoapresentaram, ou apresentaram, um grau relativamente baixo de descoloraçãoda superfície de ferimento. Das 8.500 plantas, 8 plantas que não apresentaramnenhuma descoloração visível foram triadas, bem como, 10 que apresentaramdescoloração relativamente baixa. A análise da descoloração foi repetida paraos 18 indivíduos que foram inicialmente selecionados e para a maioria doscasos individuais o resultado original foi confirmado. Doze indivíduos sãomostrados na Figura 10. Somente os indivíduos confirmados foramselecionados para uma análise posterior e produção de semente. Uma plantamutante sem efeitos pleiotrópicos colaterais (por exemplo, descoramento,encolhimento de tamanho) foi numerada como 05D.202539. A sementeproduzida por autopolinização desta planta foi numerada como 050.810596.A semente produzida por autopolinização de três plantas cultivadas desementes da 05D.810596 foram numeradas como 07G.9979 e depositadas emNCIMB. O número NCIMB é 41441 (depositado aos 10 de outubro de 2006).

EXEMPLO 5

Análise fenotípica de mutantes triados apresentando, descoloraçãoreduzida induzida por ferimento

Dos 12 mutantes selecionados pela triagem apresentada noExemplo 3, 6 apresentaram um fenótipo de crescimento e descoramentofortemente reduzidos. Outros mutantes desenvolveram-se normalmente, istoé, de acordo com o tipo da população inicial da experiência de mutagênese.

Os mutantes apequenados e descorados são provavelmenteperturbados em função do cloroplasto. Uma vez que a PPO reside nestasorganelas celulares isto pode explicar a resposta relativamente baixa nasanálises do disco de folha. Porque estas mutações pleiotrópicas sãoindesejáveis, estes mutantes foram considerados como menos relevantes.

A planta mutante 06D.210202, que apresentou a redução maisforte da descoloração do disco de folha, apresentou fenótipo normal e amutação é considerada, deste modo, específica para a descoloração semefeitos pleiotrópicos fortes.

EXEMPLO 6

Confirmação da quase ausência de fenótipo de descoloração nadescendência

Para demonstrar que a descoloração reduzida de mutantes daalface como a planta. 06D.210202 dos Exemplos 3 e 5 foi produzida por umefeito genético gerado pelo tratamento de mutagênese aqui descrito, sementefoi produzida por autopolinização. A semente produzida por autopolinizaçãoda planta 06D.210202 foi numerada como 06D.819784. As sementes foramgerminadas no solo e as plantas foram testadas para a descoloração usando-sea análise do rosado do disco de folha.

Esta experiência mostrou claramente que o fenótipo alteradotinha uma base genética, uma vez que todas as plantas da progênieapresentaram um fenótipo similar, isto é, uma redução forte na descoloraçãorosada, como o mutante que foi usado para produzir as sementes. Esteresultado está ilustrado na Figura 11.

A semente produzida por autopolinização de três plantascultivadas das sementes da 06D.819784 foi numerada como 06D.863B2 edepositada em NCIMB. O número NCIMB é 41454 (depositado aos 3 de janeiro de 2007).

EXEMPLO 7

Desenvolvimento de um diagnóstico de triagem de fenotípico para adescoloração induzida por ferimento da alface baseada na formação dopigmento acastanhado

As plantas da alface foram cultivadas à maturidade e partes defolhas externas foram coletadas cortando-se discos do tecido da nervura. Osdiscos foram incubados em papel de filtro umedecido a 16°C. Apósaproximadamente 72 horas, a superfície de ferimento tornou-se acastanhada.Na presença de L-cisteína 10 mM a resposta de acastanhamento foi inibidaindicando que a descoloração observada foi mediada pela PPO. Um resultadorepresentativo desta experiência está mostrado na Figura 12. Uma vez que aresposta como indicada na Figura 12 é uma resposta de acastanhamentomediada da PPO, o procedimento de triagem como descrito neste exemplopode ser considerado como eficaz e imparcial para triar mutantesapresentando descoloração acastanhada reduzida que ocorra durante oprocessamento da alface.

EXEMPLO 8

Desenvolvimento de um diagnóstico de triagem fenotípica para adescoloração induzida por ferimento da alface baseada na conversão deL-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) em um pigmento preto chamadomelanina

Além das análises que tratam a descoloração induzida porferimento de maneira ampla, o método, de acordo com esta invenção,igualmente permite triar de maneira mais específica mutantes que têm umaatividade reduzida da PPO. Uma análise fenotípica que seja indicativa daatividade da PPO foi desenvolvida usando-se discos de folha que foramincubados na presença de L-DOPA 1,5 mM. Uma vez a descoloração pretatornada aparente pôde-se concluir que L-DOPA pode prontamente serconvertida pelo sistema de oxidação de polifenol na superfície de ferimentodas folhas da alface em um pigmento preto chamado melanina. L-DOPA éconvertida pela PPO em L-DOPA-quinona reativa que é convertida não-enzimaticamente via dopacromo e indol quinona em melanina preta.

Além disso, mostrou-se, que a reação pode ser inibidaadicionando-se L-cisteína 1 mM durante a reação (Figura 5).Conseqüentemente, esta análise permite a identificação de mutantes que sãomodificados pela capacidade de criar uma atividade da PPO em umasuperfície de ferimento de uma folha. A resposta de discos de folha da alfaceà presença de L-DOPA pode ser observada tanto na solução quanto entrepapéis de filtro umedecidos como mostrado na Figura 13.

EXEMPLO 9

Avaliando a descendência de um mutante apresentando uma quaseausência de descoloração por resposta reduzida de acastanhamentousando-se análise do acastanhamento do disco de nervura

Para demonstrar que a descoloração reduzida de mutantes daalface como a planta número 06D.210202 dos exemplos 3, 5 e 6 que temdescoloração rosada de superfícies de ferimento de discos de folhasignificativamente reduzida é, também, efetivamente reduzida na resposta deacastanhamento induzida por ferimento, uma progênie de várias plantas foicultivada à maturidade.

Nesta etapa do desenvolvimento, 3 discos da nervura centralforam coletados das folhas externas de várias plantas da progênie. Estesdiscos da nervura foram incubados de acordo com o procedimento descrito noExemplo 7. Foi mostrado que as plantas da progênie do mutante queinicialmente foram apresentadas como fortemente reduzidas na descoloraçãorosada induzida por ferimento foram, também, fortemente reduzidas noacastanhamento da nervura central induzido por ferimento. O resultado destaexperiência está mostrado na Figura 14.

EXEMPLO 10

Avaliando a descendência de um mutante apresentando quase ausênciade descoloração por resposta reduzida do acastanhamento usando-secabeças de alfaces recém-colhidas embaladas em sacos de plástico

Cabeças maduras das plantas da alface cultivadas da sementenúmero 06D.819784 do Exemplo 6, que tem descoloração rosada desuperfícies de ferimento de discos de folha significativamente reduzida, foramcortadas em partes usando-se uma faca e embaladas em um saco de plásticocontendo atmosfera ambiente. Plantas de controle que apresentaram umaresposta normal da descoloração rosada do disco de folha foram tratadas demaneira idêntica. Os sacos foram armazenados a 4°C durante 6 dias, depoisdo que o material da folha foi avaliado para sua resposta de acastanhamento.

Foi mostrado, nesta experiência, que as plantas da progênie domutante, que inicialmente foram apresentadas como fortemente reduzidas nadescoloração rosada induzida por ferimento, foram também fortementereduzidas no acastanhamento da nervura central induzido por ferimentoquando processadas e armazenadas em sacos de plástico usando-se atmosferaambiente. O resultado desta experiência está mostrado na figura 15.

EXEMPLO 11

Rosado na CichoriumDe modo a identificar mutantes com baixo potencial de rosadoenzimático induzido por ferimento, a análise do disco de folha descrito noExemplo 2 foi aplicada às plantas de uma população mutante de Cichorium.Os resultados são mostrados na Figura 16. Depreende-se que igualmente naCichorium a reação rosada está presente. O método de triagem da invenção éassim uma ferramenta poderosa para triar as plantas da Cichorium queapresentam uma descoloração reduzida induzida por ferimento. Até aqui, aavaliação da resposta de acastanhamento na endívia e na endívia chicóriaapenas podia ser avaliada observando-se plantas maduras. O método dainvenção que pode ser praticado em material de planta nova é muito eficientee rápido.

EXEMPLO 12

Descoloração na berinjela

Berinjelas foram cortadas em metades e incubadas durante anoite na temperatura ambiente. Da Figura 18 depreende-se que a resposta dadescoloração é causada principalmente pelas sementes. Assim, as sementessão um candidato apropriado para uma análise da descoloração baseada emum substrato, por exemplo, com L-DOPA.

EXEMPLO 13

Diagnóstico de triagem fenotípica para a descoloração induzida porferimento da alface baseada na conversão do ácido clorogênico

Os discos de folha da alface foram incubados com ácidoclorogênico 10 mM no papel de filtro. A Figura 17 mostra o acastanhamentodos discos. Com adição de L-cisteína a cor desapareceu mostrando novamenteque a descoloração é dependente da PPO.

Este exemplo demonstra que o ácido clorogênico é umsubstrato apropriado para uma análise de triagem baseada em substrato.

EXEMPLO 14

Diagnóstico da triagem fenotípica baseada em substrato para adescoloração induzida por ferimento para sementes

Sementes da alface e da berinjela foram incubadas com L-DOPA O, 2,5 e 5 mM. A Figura 19 mostra que a reação de cor observada nassementes é dependente da concentração. A resposta é dependente da PPOporque pode ser inibida com L-cisteína.

Sementes germinadas da alface foram incubadas com L-DOPA. A Figura 20 mostra que o tegumento da semente e a zona da raiz logoatrás da ponta da raiz apresentaram uma reação de cor. Esta reação de corpode ser usada para triar sementes que apresentem uma descoloraçãoreduzida.

Sementes da alface foram incubadas com O, 100, 250, 500, 750e 1000 mg/l de catecol. A Figura 21 mostra que as sementes apresentaramuma resposta de cor dependente da concentração. A resposta é dependente daPPO porque mostrou ser inibida pela L-cisteína.

Claims (25)

1. Método para triar uma população de plantas ou partes deplantas quanto à presença de indivíduos apresentando uma descoloraçãoreduzida em comparação a uma planta, ou parte de planta, de controle,caracterizado pelo fato de compreender:a) prover uma população de plantas ou partes de plantas dapopulação;b) opcionalmente, criar uma superfície de ferimento sobre asplantas ou partes de planta;c) incubar a planta ou partes de plantas ou superfícies deferimento criadas sobre as mesmas para permitir que ocorra descoloração nas,ou, sobre as mesmas;d) observar a descoloração na, ou, sobre as plantas ou partes deplantas;e) comparar a descoloração observada com aquela observadana planta ou parte de planta de controle para identificar plantas ou partes deplantas que não apresentam descoloração ou descoloração reduzida emcomparação com a planta ou parte de planta de controle.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato da descoloração ser descoloração induzida por ferimento.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato das plantas serem hortaliças, plantas frutíferas ou plantasflorescentes.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato das plantas serem plantas de hortaliças selecionadas dentre alface,endívia, chicória endívia, batata, batata doce, aipo, cogumelos, alcachofra eberinjela.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato das plantas serem plantas frutíferas selecionadas dentre macieira,bananeira, abacateiro, pessegueiro, pereira, damasqueiro e mangueira.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato das plantas serem plantas florescentes selecionadas dentre gérbera ecrisântemo.

7. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-4,caracterizado pelo fato das plantas pertencerem à família de Asteraceae, emparticular ao gênero Lactuca, mais em particular às espécies Lactuca sativa.

8. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-4,caracterizado pelo fato das plantas pertencerem ao gênero Cichorium e, emparticular, às espécies Cichorium intybus e Cichorium endivia.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3,caracterizado pelo fato das partes de plantas serem selecionadas de folhas,cabeças, brotos, raízes, tubérculos, caules, flores, frutas, sementes, sementesgerminadas, ou pedaços e células dos mesmos.

10. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8,caracterizado pelo fato das partes de plantas serem discos de folha.

11. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8,caracterizado pelo fato das partes de plantas serem discos de tecido de nervuracentral.

12. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-11,caracterizado pelo fato da população de plantas ser uma população de plantasmutantes, uma coleção de germoplasma ou uma população de plantastransgênicas.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato da população de plantas mutantes ser obtida por um tratamento demutagênese usando produtos químicos e/ou irradiação.

14. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-13,caracterizado pelo fato da incubação ocorrer em um ambiente aquoso.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato do ambiente aquoso compreender papel de filtro umedecido.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato do ambiente aquoso compreender água ou uma solução.

17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16,caracterizado pelo fato do ambiente aquoso conter um composto selecionadode L-3,4-dihidroxifenilalanina, ácido clorogênico, ácido isoclorogênico, L-tirosina e catecol.

18. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16,caracterizado pelo fato do ambiente aquoso conter um composto selecionadode compostos relacionados na Tabela 1.

19. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-18,caracterizado pelo fato da planta de controle ser uma planta da qual um discode folha, quando incubado entre duas lâminas de papel de filtro umedecidopor 7 dias a 50C apresentar uma descoloração rósea ao redor das bordas.

20. Método para triar uma população de plantas ou partes deplantas quanto à presença de indivíduos apresentando uma descoloraçãoreduzida em comparação a uma planta de controle ou parte de planta,caracterizado pelo fato de compreender:a) prover uma população de plantas ou partes de plantas dapopulação;b) incubar as plantas ou partes de plantas com um substratoque pode ser convertido em um pigmento colorido para permitir que adescoloração ocorra na, ou, sobre as mesmas.c) observar a descoloração na, ou, sobre as plantas ou partes deplantas;d) comparar a descoloração observada com aquela observadana planta ou parte de planta de controle para identificar plantas ou partes deplantas que não apresentam descoloração ou descoloração reduzida emcomparação com a planta ou parte de planta de controle.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato do substrato ser selecionado dos compostos relacionados na Tabela 1.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato do composto ser L-DOPA.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, 21 ou 22,caracterizado pelo fato da planta ou parte de planta ser ferida antes daincubação com o substrato e a descoloração do ferimento ou próximo aoferimento ser observada.

24. Método de acordo com qualquer das reivindicações 20-23,caracterizado pelo fato da parte da planta ser uma semente, sementegerminada ou disco de folha.

25. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1-24,caracterizado pelo fato da descoloração poder ser inibida ou revertida por L-cisteína.