MX2008008731A - Metodo de identificacion sistematica para seleccionar plantas que muestran decoloracion de la superficiereducida inducida por una herida - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para detección sistemática de una población de plantas o partes de planta para la presencia en ellas de individuos que muestran una decoloración reducida en comparación con una planta de control o una parte de la planta, el método comprende proporcionar una población de plantas o partes de las plantas de la población;crear opcionalmente una superficie herida en las plantas o partes de planta;incubar la planta o partes de planta o las superficies heridas creadas en ella para permitir que se presente la decoloración en estáo sobreésta;observar la decoración en o sobre las plantas o partes de planta;comparar la decoloración observada con la decoloración que se observa en la planta de control o una parte de la planta para identificar plantas o partes de planta que no muestren decoloración o una decoloración que es reducida en comparación con la planta de control o una parte de la planta. De forma apropiada, la decoloración es decoloración inducida por heridas.

Description

MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN SISTEMÁTICA PARA SELECCIONAR PLANTAS QUE MUESTRAN DECOLORACIÓN DE LA SUPERFICIE REDUCIDA INDUCIDA POR UNA HERIDA Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para detectar sistemáticamente una población de plantas o partes de plantas para la presencia en ellas de individuos que muestran una decoloración de la superficie reducida inducida por heridas comparada con una planta de control o parte de planta.

Antecedentes de la Invención Debido al incremento de la demanda, el procesamiento del producto perecedero fresco, tal como lechuga, radiquio, endibia, y otros vegetales, se expande significativamente durante los recientes años. La cosecha y procesamiento de hortalizas de hojas involucra cortes extensivos de las hojas, la cual induce una respuesta de herida fuerte. Esta respuesta de herida conduce a un deterioro rápido del producto procesado. Este deterioro se manifiesta por decoloración debido a la formación enzimática de tono pardo o formación de tono rosa en y alrededor de la superficie de la herida, respiración y desecación debido a la transpiración. Especialmente la formación enzimática de tono pardo o REF. : 194545 formación de tono rosa se considera de importancia significante, determinando directamente o indirectamente la calidad total de las hortalizas de hojas empaquetadas, cortadas frescas, como lechuga y radiquio. Por lo tanto, como una consecuencia del deterioro, los microorganismos pueden incrementarse significativamente en número, lo cual puede comprometer la seguridad de los alimentos. La naturaleza altamente perecedera del procesamiento de la lechuga conduce a una fuerte percepción sin color, sin olor y sin textura por el consumidor lo cual está obstaculizando un crecimiento más rápido que el actual del llamado mercado de conveniencia. Otros vegetales, como papas, hongos, apio, alcachofa y berenjena, pero también frutas y flores pueden estar sujetos a decoloración no deseable. Por ejemplo, frutas como plátano, manzana, pera, aguacate, mango, durazno y albaricoque, etc., se tornan rápidamente a color café cuando se rebanan o descascaran. Las medidas tienen que ser tomadas cuando se ofrecen estas frutas en la forma procesada, tal como rebanada, cortados en cubos, descascarada o en ensaladas de frutas . Los tallos de flores de corte, por ejemplo de gerbera o crisantemos, también pueden ser propensos a la decoloración la cual no es deseada desde un punto de vista comercial por que las decoloraciones se consideran que no son atractivas para el consumidor así reduciendo la comercialización del producto . Con objeto de inhibir el proceso de deterioro en hortalizas tales como la lechuga, muchos tratamientos físicos y químicos después de la cosecha se han desarrollado los cuales pueden aplicarse para desacelerar el deterioro de la lechuga procesada. Entre estos están el empacado de hortalizas de hojas cortadas frescas bajo una atmósfera modificada, la aplicación de recubrimientos comestibles, tratamiento de choque de calor y adición de químicos, los cuales inhiben la formación del tono pardo enzimático. Cuando la lechuga se corta fresca se empaca bajo una atmósfera de oxígeno reducida a temperaturas bajas, la formación de tono pardo enzimático puede reducirse substancialmente. Sin embargo tal entorno bajo en oxígeno modificado conduce a respiración anaeróbica, la cual crea un producto sin sabor y sin olor el cual se percibe como muy poco atractivo. Los recubrimientos comestibles son capas delgadas de materiales, los cuales actúan como barrera de aislamiento física y la cual protege efectivamente el producto de formas diferentes del deterioro tal como evaporación y formación de tono pardo. Estos recubrimientos pueden por ejemplo ser hechos de resinas, polisacáridos o proteína.

Además se ha demostrado que la formación de tono pardo de lechuga cortada fresca puede prevenirse por aplicar un breve choque de calor de 90 segundos a 45°C, inmediatamente después del procesamiento. Posiblemente, el choque de calor desvía la biosíntesis de la proteína de las enzimas involucradas en la decoloración hacia el choque de calor de proteínas así reduciendo la capacidad de formación de tono pardo. Alternativamente, el efecto del tratamiento de choque de calor en formación de tono pardo puede explicarse por termosensibilidad de enzimas involucradas en las trayectorias de decoloración. Los productos químicos, los cuales pueden aplicarse pueden por ejemplo ser agentes reductores como vitamina C, agentes quelantes como EDTA, agentes de complejidad como ciclodextrina e inhibidores enzimáticos como L-cisteína. La aplicación de químicos en alimentos frescos obviamente involucra cuestiones de seguridad de los alimentos y requiere la aprobación reglamentaria. Las combinaciones de las tecnologías después de la cosecha descritas anteriormente pueden pensarse de y últimamente el proceso aplicado es una compensación entre eficacia de tecnología, costo y seguridad de los alimentos. Independientemente de la tecnología aplicada, la mejora de la calidad después de la cosecha de vegetales procesados, frutas y flores vendrá en un costo y por lo tanto una necesidad clara en la técnica existe para proporcionar alternativas, que eliminen o reduzcan la necesidad para aplicar tecnologías químicas y físicas después de la cosecha.

Breve Descripción de la Invención El objeto de la presente invención es proporcionar un método de detección sistemática para seleccionar plantas, que muestran una herida reducida inducida por respuesta de decoloración para proporcionar plantas y progenie derivada de este que son resistentes a trastornos de procesamiento después de la cosecha tal como formación enzimática de tono pardo o de tono rosa. La decoloración sobre la herida también puede ser visible en partes de las plantas, tal como tallos, semillas, frutas, hojas, flores, tubérculos, brotes, etc. Así un objeto adicional de la invención proporciona un método de detección sistemática para seleccionar plantas, que muestran una herida reducida inducida por respuesta de decoloración en sus partes de plantas . La invención así proporciona un método para detectar sistemáticamente una población de plantas o partes de plantas para la presencia en ella de individuos que muestran una decoloración reducida comparada a una planta de control, en el cual el método comprende a) proporcionar una población de plantas o partes de las plantas de la población; b) crear opcionalmente una superficie de la herida en las plantas o partes de plantas; c) incubar la planta o partes de plantas o las superficies con heridas creadas en éstas para permitir que se presente la decoloración en ellas o sobre ellas; d) observar la decoloración en o encima de las plantas o partes de plantas; e) comparar la decoloración observada con la decoloración que se observa en la planta de control o parte de planta para identificar plantas o partes de plantas que no muestren decoloración o una decoloración que se reduce comparado a la planta de control o parte de planta. El método de la presente invención tiene dos modalidades principales. En la primera modalidad la decoloración es el resultado de la conversión de un substrato endógeno. Tal decoloración surgirá espontáneamente sobre incubación de la planta o parte de planta en un cierto entorno para una cierta cantidad de tiempo. La decoloración en este caso es inducida por heridas. La invención se refiere particularmente a las reacciones de formación de tono rosa y formación de tono pardo enzimática que se presenta naturalmente. El método de detección sistemática de la invención se involucra para identificar plantas que no muestran esta reacción o muestra una reacción reducida comparada a un control. En la segunda modalidad la decoloración es causada por la conversión de un substrato agregado exógenamente que puede convertirse en un substrato de color rojo que se hace visible cuando la reacción ocurre en la planta. Tal reacción de color puede o no puede ser inducida por herida. Se presenta, por ejemplo, también en semillas cubiertas de semillas intactas. El método de detección sistemática de la invención se involucra para identificar plantas que no muestran esta reacción o muestra una reacción reducida comparada a un control . La última modalidad se refiere más en particular a un método para la detección sistemática de una población de plantas o partes de plantas para la presencia en ella de individuos que muestran una decoloración reducida comparada a una planta de control o parte de planta, en la cual el método comprende a) proporcionar una población de plantas o partes de las plantas de la población; b) incubar las plantas o partes de plantas con un substrato que puede convertirse en un pigmento de color rojo para permitir la decoloración para cuando se presenta en ellas o sobre ellas; c) observar la decoloración en o sobre las plantas o partes de plantas; d) comparar la decoloración observada con la decoloración que se observa en la planta de control o parte de planta para identificar plantas o partes de plantas que no muestren decoloración o una decoloración que se reduzca comparada a la planta de control o parte de planta . El método de la invención puede usarse para cualquier planta que puede someterse a decoloración, pero es en particular útil para productos perecederos, en vegetales particulares o frutas, o para flores. El método es ínter alia adecuado para hortalizas de hojas, tal como lechuga, radiquio o endibia, para tubérculos, como papa o camote, para raíces, tal como apio, para brotes, tal como achicoria, o para hongos. El método puede adicionalmente usarse para frutas, tales como manzana, plátano, aguacate, durazno, pera, albaricoque, mango, berenjena y para flores o tallos de flores, tal como tallos de gerbera, flores de crisantemo, botones de alcachofa etc. El método de detección sistemática de la invención se pretende para identificar plantas que tienen una decoloración de superficie inducida por herida reducida en una o más de sus partes o tejidos. Para la detección sistemática, por lo tanto, es muy práctico usar la parte o tejido que es propenso a la decoloración. En lechugas, esta puede ser la hoja o una parte del mismo, tal como un trozo de hoja, en rebanadas de plátanos de la fruta pelada puede usarse apropiadamente y en flores rebanadas del tallo son un vehículo de prueba muy práctico. Sin embargo, se ha encontrado que la decoloración puede también probarse en tejidos que no están heridos. En los Ejemplos se muestra que también cubiertas de semilla intactas y puntas de raíces son capaces de inducir una reacción de color en presencia de un substrato exógenamente agregado que puede convertirse en un pigmento de color sin herirse. La reducción o ausencia de esta reacción de color puede usarse en la detección sistemática para plantas que tienen una decoloración reducida. En una modalidad específica el método es en particular útil para seleccionar plantas que pertenecen a la familia Asteraceae, en particular plantas del género Lactuca y más en particular a la especie Lactuca sativa o plantas que pertenecen al género Cichorium y en particular a la especie Ci chori um intybus y Ci chorium endivia que muestran una ausencia o reducción de decoloración de superficie inducida por herida. La población de plantas que se detecta sistemáticamente con el método de la invención puede ser cualquier población de plantas, pero preferiblemente es una población de planta variable que tiene muchos miembros diferentes para incrementar las oportunidades de encontrar una planta que muestre una decoloración inducida por herida reducida. Tal población variable puede hacerse por medio de un tratamiento mutagénico usando por ejemplo químicos y/o radiación y se llaman entonces en la presente una población de planta mutante. Poblaciones alternativas son colecciones de plasmas germinales, que son colecciones de plantas que muestran variación natural. También, una población de plantas transgénicas puede usarse. El método de la invención se realiza apropiadamente con partes de planta que tienen una superficie herida. Las muestras de prueba muy útiles son discos que se cortan de la hoja, los llamados discos de hoja. Alternativamente, el tejido de costilla media de hortalizas de hojas enervadas puede usarse. Apropiadamente, los discos se cortan de tales costillas. En frutas las superficies cortadas de frutas en mitades puede evaluarse o alternativamente rebanadas o cortes. Para flores, las rebanadas del tallo son una muestra de prueba muy útil. La incubación toma lugar de forma apropiada en un ambiente acuoso. El método de la invención puede ser bien practicado con discos de hojas que se incuban en o entre papel filtro humedecido. La respuesta de color es entonces muy visible alrededor de los bordes de la envoltura en el papel . Alternativamente, el ambiente acuoso comprende agua o una solución. En una modalidad específica que se ilustra además enseguida, la solución contiene un substrato, tal como L-3 , 4-dihidroxifenilalanina. Este compuesto se convierte a la producción de la melanina de pigmento negro por la oxidasa de enzima de polifenol. Los compuestos alternativos que pueden usarse para la detección sistemática de plantas de lechuga en este aspecto incluyen, pero no se limitan a ácido clorogénico, ácido isoclorogénico, L-tirosina y catecol. La invención puede además realizarse con progenie de una planta precursora que muestra la ausencia o reducción de decoloración de hoja inducida por herida para demostrar que la progenie todavía tiene la misma ausencia o reducción de decoloración de hoja inducida por herida como se encuentra en la planta precursora. La invención también puede realizarse en partes de las plantas. Las partes de las plantas tipo cabezas u hojas de lechuga o endibia son usualmente las partes que tienen una superficie cortada que puede someterse a decoloración. Otras partes son frutas, retoños, raíces, semillas, tubérculos, flores, tallos, etc. En una modalidad adicional de la invención las semillas o semillas germinadas pueden usarse como el vehículo en el cual el método de detección sistemática se realiza en presencia de un substrato exógenamente agregado. En el caso de semillas germinadas, las puntas de raíz jóvenes están involucradas en la reacción de color. La invención es comercialmente muy interesante para identificar plantas mutantes que pueden usarse en el mercado de vegetales procesados. Como se explica arriba, la decoloración del producto, en particular frutas y vegetales frescos, se considera indeseable ya que el producto decolorado se rechaza por el consumidor .

Breve Descripción de la Invención La presente invención se ilustrará además en los Ejemplos que siguen y que no se intenta que limiten la invención de cualquier manera. Los Ejemplos se refieren a discos de hoja de lechuga y semillas, Ci chori um y berenjena, pero en lugar de lechuga otras plantas o partes del mismo, en particular frutas frescas y vegetales, se pueden usar. En los Ejemplos se hace referencia a las siguientes figuras. Figura 1: Perfil esquemático de la razón detrás del diseño de el procedimiento de detección sistemática mutante de poblaciones de lechugas para reducir la decoloración enzimática posterior a la cosecha. La señal de entrada de la detección sistemática está herida del tejido de hoja, que se reconoce por la planta y que genera una respuesta de señalización divergente lleva a un número de procesos fisiológicos que incluyen senescencia, respiración y decoloración de tejido. Esta señal de entrada se puede combinar con la aplicación de compuestos fenólicos como substratos PPO. La señal de salida de la detección sistemática es una decoloración café o rosa, dependiendo de las condiciones aplicadas, del diagnóstico de superficie herida por color pardo posterior a la cosecha y formación de tono rosa. Esto se infiere del hecho de que la señal de salida se inhibe completamente por cinamaldehído y L-cisteína, que son inhibidores específicos de PAL y PPO, respectivamente. Figura 2: Imagen representativa del fenotipo de salida de la detección sistemática basada en la decoloración rosa de discos de hoja. Los discos de hoja de plantas de lechuga (1 disco por planta) se configuran entre papeles de filtro húmedos e incuban a 5°C durante 7 días. Una decoloración rosa puede claramente observarse alrededor de cada disco de hoja en la superficie de la herida. Figura 3 : El ensayo de formación de tono rosa de disco de hoja (4 discos por plato) se lleva a cabo en la presencia de diferentes concentraciones del inhibidor PAL cinamaldehído. El número anterior de cada plato muestra el % de cinamaldehído usado. Figura 4: El efecto inhibidor del inhibidor PPO L-cisteína en la decoloración rosa de discos de hoja de lechuga (4 discos por plato) incubado entre papeles de filtro húmedos. El número anterior de cada plato muestra el % de L-cisteína usado. Figura 5: Efecto inhibidor del inhibidor PPO L-cisteína en la decoloración negra de discos de hoja de lechuga (4 discos por plato) incubados entre papeles de filtro húmedos en la presencia de 1.5 mM L-DOPA. El número anterior de cada plato muestra la concentración mM de L-cisteína usado. Figura 6: El efecto de pre-tratamiento de choque de calor en formación de tono rosa de disco de hoja de lechuga. El choque de calor se aplicó durante 90 segundos en las hojas intactas a la temperatura indicada en cada disco. Figura 7: Conversión del pigmento rosa formado por la respuesta de herida de la lechuga para un compuesto incoloro por L-cisteína. La hilera superior de los platos muestra el ensayo L-DOPA mientras que la hilera inferior de los platos muestra el ensayo de formación de tono rosa. La parte inferior de los dos discos en cada plato se trató con L-cisteína después de que la respuesta de herida se ha completado. La concentración de L-cisteína usados son 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 y 10 mM, que se indica arriba. Figura 8: Reducción de formación de tono rosa en lechuga que crece en fila por L-cisteína. El panel superior muestra síntomas de formación de tono rosa típicos de una hoja de lechuga tomada de una planta, que fue extremadamente sobrecargada por transporte de agua. Las venas principales muestran la presencia de un pigmento rosa. El panel derecho inferior muestra un disco tomado de la hoja que muestra los síntomas de formación de tono rosa después del tratamiento con L-cisteína 1 mM durante 30 minutos a temperatura ambiente. El panel izquierdo inferior muestra un disco de hoja similar después del tratamiento con agua durante 30 minutos a temperatura ambiente. Figura 9A-9B: Fig. 9A: Análisis fenotípico de plantas M2 de lechuga individual (agrupados en grupos) para decoloración del disco de la hoja de acuerdo al método descrito por esta invención. Un total de 138 muestras de 12000 se muestran en este panel de los cuales uno indicado por una flecha muestra una decoloración de formación de tono rosa fuertemente reducida. Fig. 9B: Probado de nuevo del individuo seleccionado indicado en el Panel A confirma la casi ausencia de la formación de la decoloración en tono rosa (muestra en la posición media) como se compara con las muestras de control que muestran una respuesta de decoloración transparente. Figura 10: Fenotipos de plantas de lechuga M2. Las plantas etiquetadas 1, 2, 4, 5, 7, 10 y 12 muestran decoloración de disco de hoja en tono rosa reducida usando el ensayo de acuerdo a esta invención. Las plantas 3, 6, 8, 9, y 11 son plantas, que muestran un nivel de decoloración de disco de hoja rosa comparable con el control de tipo silvestre. La planta 1 solamente es el ejemplo de un mutante que muestra una reducción fuerte en la decoloración en tono rosa y un hábito de crecimiento normal. Las plantas 2, 4, 5, 7, 10 y 12 muestran decoloración en tono rosa reducido y un fenotipo que impide el crecimiento, blanqueado. Figura 11: Prueba de progenie de un mutante de lechuga que muestra una decoloración reducida. En la izquierda, 25 muestras de control se muestran que muestran una respuesta de decoloración inducida por herida normal. En la parte derecha, un grupo de muestras se muestra que se toman de una serie de 35 plantas de progenie derivadas de un mutante sencillo, que se reduce severamente en su respuesta de decoloración inducida por herida. Figura 12: Imagen representativa del fenotipo de salida de la detección sistemática con base en la decoloración café de las partes de la nervadura central de la hoja tomada de las plantas de lechuga madura. La pintura muestra la lechuga exterior de los discos de tejido de la nervadura central de la hoja después de la incubación durante 3 días a 16°C. La decoloración café típica puede claramente observarse en la superficie de la herida. Cada disco contiene 3 discos tomados de diferentes posiciones de la nervadura central (verde, verde ligero y blanco) . El número anterior del disco indica la concentración mM de L-cisteína que se agregó al filtro.

Figura 13A-13B: Conversión de L-DOPA en la superficie de la hoja de lechuga en melanina. La figura 13A muestra el ensayo en una solución L-DOPA 1.5 mM. El tubo superior es el control negativo, los otros 3 tubos son idénticos. La figura 13B muestra el resultado de la incubación de los discos de la hoja entre los papeles de filtro húmedos que contienen L-DOPA 1.5 mM. Figura 14: Prueba de progenie de un mutante de lechuga muestra una decoloración en tono rosa inducida por la herida reducida en la formación de tono pardo en la nervadura central. El panel A muestra los discos de la nervadura central de 8 plantas de progenie, enumeradas 1 hasta 8 (3 discos por planta) del mutante de formación de tono rosa reducido. El Panel B muestra los discos de la nervadura central de 8 plantas de control enumeradas de 9 hasta 16 (3 discos por planta) que muestra una respuesta pardo normal. Figura 15: Evaluación de un mutante de lechuga que muestra una decoloración de tono rosa inducida por herida reducida o respuesta en tono pardo después de cortar y empacar bajo atmósfera ambiente. Las piezas de la hoja de la cabeza de una planta de control se muestran en la parte izquierda y las piezas de la hoja del mutante de decoloración reducido se muestra en la parte derecha. El material de la hoja cortada fresca se almacenó durante 6 días a 4SC. La decoloración café puede observarse claramente en las muestras de control mientras que las muestras de mutante restantes no se cambian.

Figura 16: Ensayo de formación de tono rosa en Cichori um endivia (panel izquierdo) y Cichorium intybus (panel derecho) . Figura 17: Ensayo de ácido clorogénico en discos de hoja de lechuga. Figura 18: Respuesta pardo en berenjena cortada. Figura 19: Ensayo L-DOPA en semillas de lechuga (hilera superior) y berenjena (hilera del fondo) . Figura 20: Ensayo L-DOPA en semillas germinadas de lechuga. Figura 21: Ensayo con catecol en semillas germinadas de lechuga.

Descripción Detallada de la Invención Cuando la lechuga se cosecha y procesa por cortado, se generan muchas superficies heridas de hoja que llevan a una respuesta importante de la planta o partes de la planta, manifestada por una decoloración de tono pardo o rosado en o cerca de la superficie herida. La formación de tono rosado también puede observarse en sitios distantes de la superficie herida en la costilla media de la hoja así como la parte trasera. Algunas veces la formación de tono rosado puede también observarse en etapas apenas antes de cosechar que se considera que se debe a la tensión abiótica o sobre-madurado del cultivo.

Otras plantas, en particular otros vegetales, frutas y flores también pueden ser propensos a la decoloración. El método de la invención también es así una detección sistemática conveniente para identificar otras plantas, en particular otros vegetales, o frutas o flores que muestran una respuesta a la decoloración inducida por herida reducida.

Las diferentes formas de decoloración se efectuaran por la actividad enzimática, la cual se refuerza fuertemente como una consecuencia de las heridas y las cuales generan formas diversas de polifenoles y productos de reacción derivados de los mismos.

Una actividad importante enzimática que se involucra en la reacción de tono pardo es PPO. La actividad PPO en la relación a la formación del tono pardo enzimático no se restringe a la lechuga sino se describe para cualquier otra especie de plantas a involucrarse en el tipo de deterioro después de la cosecha en la manzana, plátano y papa. En realidad, el PPO se reconoce ampliamente por ser una de las enzimas más importantes involucradas en el deterioro después de la cosecha de muchos procesos de frutas y vegetales frescos. Por esta razón el PPO es objetivo de cualquier tecnología, el cual se dirige a la reducción o prevención de su actividad con objeto de incrementar la calidad después de la cosecha de los productos alimenticios. El PPO cataliza una reacción en la cual los polifenoles residen en el tejido de la planta se oxidan para dar lugar a la formación de o-quinonas . Posteriormente, las reacciones enzimáticas y no enzimáticas llevan a la formación de pigmentos café o negros.

En muchas especies de plantas el PPO se codifica por una familia de genes pequeña de la cual los miembros individuales pueden tener diferentes patrones de expresión temporales y espaciales indicativos de la divergencia funcional . Se ha demostrado por ejemplo, que la lechuga contiene diferentes isoformas PPO en el tejido fotosintético y vascular de la hoja. El substrato natural de PPO puede ser diferente entre las especies diferentes. La tabla 1 enlista los substratos PPO para diversos vegetales y frutas que se sometan a decoloración durante la herida. Estos y otras substratos puede usarse en un método de detección sistemática basado en el substrato exógeno de la invención.

Tabla 1 Fuente Substratos fenólicos Manzana ácido clorogénico (carne), catecol, . catequina (pelada) , ácido cafeico, flavonol glicósidos, 3,4- dihidroxifenilalanina (DOPA) , ácido 3 , 4-dihidroxi benzoico, p-cresol, 4-metil catecol, leucocianidina, ácido p- cumapco. Albaricoque ácido isoclorogénico, ácido cafeico, 4-metil catecol, ácido clorogénico, catequina, epicatequina, pirogalol, catecol, flavonoles, derivados de ácido p-cumárico. Aguacate 4-metil catecol, dopamina, pirogalol, catecol, ácido clorogénico, ácido cafeico, DOPA. Plátano 3 , 4-dihidroxifeniletalamina (Dopamina) , leucodelfinidina, leucocianidina . Berenjena ácido clorogénico, ácido cafeico, ácido cumárico, derivados de ácido cinámico, Lechuga tirosina, ácido cafeico, derivados de ácido clorogénico. Mango dopamina-HC1 , 4-metil catecol, ácido cafeico, catecol, catequiza, ácido clorogénico, tirosina, DOPA, p-cresol Champiñón tirosina, catecol, DOPA, dopamina, adrenalina, noradrenalina . Durazno ácido clorogénico, pirogallol, 4-metil catecol, catecol, ácido cafeico, ácido gálico, catequina, dopamina. Pera ácido clorogénico, catecol, catequina, ácido cafeico, DOPA, ácido 3 , 4-dihidroxi benzoico, p-cresol . Papa ácido clorogénico, ácido cafeico, catecol, DOPA, p- cresol, p-hidroxifenilo, ácido pripiónico, ácido p- hidroxifenil pirúvico, m- cresol. Camote ácido clorogénico, ácido cafeico, cafeilamida. En muchas plantas, el nivel de la enzima PPO no se induce específicamente durante la formación de heridas de los tejidos de la planta sino reside inactivamente en el cloroplasto. Durante la formación de las heridas el PPO se activa lo cual se manifiesta debido al hecho de que el substrato fenólico que reside en las vacuolas se pone en contacto con el PPO debido a la ruptura del tejido. En la lechuga, la producción de los polifenoles, en la cual son el substrato de PPO, se induce durante la formación de heridas. Por lo tanto, el potencial de la formación de tono pardo del tejido de la lechuga no parece limitarse por la cantidad de PPO en el tejido de la hoja sino más bien por el rango de la biosíntesis de polifenilo durante la formación de heridas . En este respecto la situación puede diferir entre los cultivos. Por ejemplo, en la manzana la cantidad de los polifenoles es suficiente para generar una respuesta a la formación de tono pardo de las frutas dentro de una hora después de la formación de heridas mientras en la lechuga la reacción de formación de tono pardo puede tomar algunos días para el hecho que en la lechuga el agrupamiento del polifenol necesita grandemente sintetizarse de novo durante la formación de heridas. La síntesis de los polifenoles se presenta a través de una trayectoria bioquímica bien caracterizada llamada la trayectoria del fenilpropanoide. El primer paso comprometido de esta trayectoria se cataliza por la enzima de fenilalanina amoniaco liasa (PAL, -Hahlbrock, K and Scheel, D (1989) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, 347-369). El PAL convierte el aminoácido de fenilalanina por la trayectoria de shikimate (aromática) en ácido cinámico. En la lechuga, la formación de heridas en las hojas lleva a una inducción fuerte de la expresión del gen PAL y actividad PAL. La formación de polifenoles se correlaciona con esta actividad enzimática, la cual sugiere que la actividad PAL se induce por la formación de heridas de la lechuga es un factor importante en la respuesta para la formación de tono pardo (Campos, R. et al. (2004) Physiological Plantarum 121, 429-438 y referencias en la presente) . Sin embargo, esto no está actualmente claro para otros factores que determinan el resultado final de la reacción de decoloración inducida por las heridas. Por ejemplo, la actividad de las peroxidasas (POD) se sugiere que es importante así como en el establecimiento en el nivel final de la decoloración (Fukumoto, L. R. et al. (2002) J. Agrie. Food Chem. 540, 4503-4511; Martin-Diana A. et al (2005) Biosci. Biotechnol. Biochem. 69, 1677-1685). Como la actividad de la enzima depende de la disponibilidad del peróxido de hidrógeno interno, la contribución del POD para la decoloración puede limitarse. Es además evidente que la formación de heridas se percibe en cierto modo por la planta y subsiguientemente una señal se genera a través de una cascada, la cual se define pobremente actualmente por la lechuga. Parece que es obvio que estas actividades deberán primariamente estar dirigidas a la cicatrización de heridas y defensa contra agentes patógenos. Por lo tanto, es probable que muchos factores genéticos se involucren en el montaje de la respuesta de la decoloración de las heridas del tejido de la lechuga y cada una de estas son los objetivos potenciales para la modificación genética para reducir o eliminar la decoloración inducida por la heridas . La mayoría de estos factores genéticos son actualmente desconocidos y para aquellos conocidos que se involucran, no está claro en que medida estos factores juegan un papel específico en la reacción de decoloración o tal vez tienen una función más general en relación a la fisiología de las heridas de la planta. Por ejemplo, aunque la actividad PAL que induce las heridas se considera para determinar el nivel de formación de tono pardo de la lechuga, los productos de la trayectoria propanoide de fenilo son conocidos por involucrarse en la biosíntesis de la pared celular inter alia o así como la respuesta de defensa. Por lo tanto se reduce la actividad PAL inducida por las heridas con objeto de reducir el potencial de formación de tono pardo que puede comprender otras funciones además de inducir formación de tono pardo inducida por las heridas lo cual puede ser menos deseable en relación con otros aspectos del cultivo de la lechuga. Similarmente, la actividad PPO que se ha implicado para involucrarse en la respuesta de defensa y por lo tanto reducir el potencial de formación de tono pardo al reducir los niveles PPO puede incrementar la susceptibilidad a los patógenos (Thipyapong, P. et al. (2004) Planta 220, 105-117).

Por lo tanto, fue razonable por los inventores que un enfoque más imparcial puede ser más exitoso en este respecto. Tal enfoque comprende las siguientes etapas: 1. La generación de una población variante de las plantas, en particular una población mutante. Tal población mutante puede generarse por el tratamiento de las semillas o tejidos de plantas con los agentes mutagénicos tipo etil metano sulfonato (ems) o rayos X. 2. El establecimiento de una detección sistemática fenotípica eficiente en la cual la selección se basa en una decoloración de la planta, en particular una decoloración inducida por la respuesta de la herida de la planta, la cual se canaliza a través de PAL y/o PPO. 3. La caracterización de los mutantes modificados en su respuesta a las heridas con respecto a la decoloración potencial después de la cosecha y ausencia de los efectos pleiotropicos de la modificación, la cual compromete el color pardo y procesamiento de la planta de conformidad a la práctica común. La invención así se refiere a un método de detección sistemática para identificar, seleccionar y obtener una planta que muestra una decoloración inducida por las heridas reducidas y trastornos de procesado después de la cosecha tal como formación de tono pardo enzimático o formación de tonalidad rosa. En el método de detección sistemática, la decoloración puede observarse en una superficie de heridas pero también deberá encontrarse en los tejidos intactos también muestran una reacción de color durante la adición de un substrato. Una población de la planta muta?te para uso en el método de la invención puede por ejemplo, preparase como sigue: a) tratar las semillas MO de una especie de planta a ser modificada con un agente mutagénico para obtener las semillas Ml; b) hacer crecer las plantas de las semillas Ml así obtenidas para obtener las plantas Ml; c) opcionalmente repetir la etapa b) y e) n veces para obtener las semillas Ml+n; d) germinar las semillas Ml+n así obtenidas y hacer crecer las plantas de aquellas semillas. De conformidad a la invención estas plantas se prueban subsecuentemente para su respuesta a la decoloración inducida por las heridas. Las plantas no muestran o muestran una reducción de la respuesta de la decoloración a las heridas se seleccionan. Luego, la progenie de las plantas seleccionadas se hace crecer y la respuesta a la decoloración inducida por las heridas se mide. Con objeto de crear la variabilidad genética el uso puede hacerse de la mutagénesis. Diversos tratamientos químicos o físicos son conocidos por las personas de habilidad en el arte los cuales pueden usar para inducir las mutaciones genéticas en las especies de las plantas. Por ejemplo, una puede tratar semillas en una solución que contiene diferentes concentraciones de un mutageno tipo ems. Los ems alquilatos primariamente los residuos G de una hebra de ADN, los cuales durante la replicación del ADN causan emparejamiento con T en lugar de C. Por lo tanto, los pares base GC cambian a pares base AT en una frecuencia, la cual se determina por la dosis efectiva de ems y la actividad del sistema de reparación de errores de la planta. La dosis efectiva de los ems depende en la concentración usada, el tamaño de la semilla y otras propiedades físicas y el tiempo de la incubación de las semillas en la solución ems. Las semillas, las cuales se tratan con un agente mutagénico se llaman típicamente semillas Ml . Como una consecuencia del tratamiento, los tejidos de las semillas MI contienen las mutaciones de punto al azar en los genomas de sus células y aquellos presentes en la subpoblación de las células, las cuales deberán formar el tejido germinal (células germinales) el cual deberá transformarse a la siguiente generación, la cual se llama M2. Las mutaciones o combinaciones de los mismos son insuficientemente haplo por ello causando la esterilidad o los cuales inducen la letalidad embrionaria no se transferirá a la generación M2. Un procedimiento similar como se describe arriba para el uso de los ems se aplica para otros agentes mutagénicos bien conocidos . Los agentes mutagénicos adecuados son bien conocidos en el arte. Particularmente útiles son los agentes mutagénicos alquilantes, tales como sulfato de dietilo (des) , etilenimina (ei) , sultona de propano, N-metil-N-ntrisouretano (mnu) , N-nitroso-N-metilurea (NMU) , N-etil-N-nitrosourea (enu) , azida de sodio. Alternativamente, las mutaciones se inducen por medio de irradiación, los cuales es por ejemplo se seleccionan de los rayos X, neutrones rápidos, irradiación UV. En otra modalidad de la invención las mutaciones se inducen por medio de ingeniería genética, tal como por medios de uso de los oligonucleótidos quiméricos, recombinación homologa, gen objetivo, introducción de los genes objetivos modificados los cuales competen con el producto endógeno, subregulación a través de la interferencia de ARN, etc. La población M2 de un tratamiento de mutagénesis puede usarse en los procedimientos de detección sistemática encaminados a la respuesta de las heridas, la cual se canaliza a través de PAL y PPO. Esto es obvio por alguien habilidad en el arte que cualquier población de las plantas, la cual porta la variación genética que puede tomarse como material de partida para tal detección sistemática fenotípica, tal como colecciones de germoplasma, las cuales son colecciones de plantas que muestran la variación natural o poblaciones de las plantas transgénicas. La producción de las semillas Ml y Ml+n se efectúa adecuadamente por medio de auto-polinización. Con objeto de llevar a cabo la detección sistemática fenotípica de la invención, una superficie de la herida puede generarse como la reacción de decoloración enzimática se induce durante la herida. Tal herida puede llevarse a cabo por cortar, picar, rebanar, erosión, aplastamiento, fractura, pelado, aplastamiento, apretado, cuchillada, molido, inyección de fluido, choque osmótico, separación, segado, desgarrado . Se encontró que el método de la invención en el cual un substrato exógenamente agregado se usa, puede también practicar en los tejidos intactos y partes de plantas, tales como semillas, en situaciones donde el PPO esta dentro del alcance del substrato, por ejemplo, cuando el PPO se secreta o localiza en el exterior de la célula. La enzima que induce la reacción de color luego también está disponible sin la herida previa. Después de la herida o cuando no hay heridas es necesaria una característica fenotípica que manifiesta cual es el diagnóstico para la trayectoria principal para la decoloración del tejido y la cual puede usarse muy eficientemente en una detección sistemática de la población mutante.

Se encontró sorprendentemente que tales características fenotípicas puede obtenerse por tomar las partes de las plantas e incubarlas bajo condiciones muy específicas las cuales favorecen diferentes formas de decoloración, en particular decoloración en la superficie de las heridas, que se presenta. Posteriormente, tales ensayos pueden aplicarse a los números grandes de las plantas o partes de las plantas, tales como plantas mutantes, con objeto de seleccionar aquellas plantas las cuales muestran una reducción de la respuesta de decoloración inducida por las heridas. Una modalidad de esta invención se basa en el hallazgo sorprendente que cuando los discos de las hojas, tales como hojas de la lechuga o hojas de endibia o achicoria, se toman y se incuban entre los papeles filtro mojados a 5°C, después de aproximadamente 4 días la formación de una pigmento rosa en los bordes de los discos de las hojas llegan a ser aparentes. El papel filtro adecuado es el tipo de papel filtro 1450 CV, Ref. No. 10 313 281 de Schleier & Schuell, Microscience GMBH, Dassel, Alemania. Durante después de la incubación, la intensidad de señal y después de aproximadamente una semana la intensidad máxima se alcanza. La formación del pigmento rosa se presenta específicamente en las superficies de las heridas. La decoloración puede medirse por el registro en una escala visual de 0 , la cual significa sin formación de tono pardo o formación de tonalidad rosa, hasta 10, la cual significa formación de tono pardo y formación de tonalidad rosa tipo en una variedad estándar de la planta para la detección sistemática (por ejemplo, L. sativa para la lechuga de detección sistemática) . En los ejemplos con respecto a la lechuga la variedad L. sativa "Troubadour" se usa como un estándar para 10. Si se desea, las imágenes pueden usarse para la comparación para el registro de las clases de intermediarios entre 0 y 10. Además, las imágenes digitales pueden hacerse del papel filtro con el pigmento rosa y café, seguido por el conteo por la posición del disco de la hoja, el número de los pixeles con una intensidad de color rosa o café. Usando una de estas mediciones, el análisis estadístico simple tipo una prueba t, bien conocido por la persona de habilidad en el arte, puede llevarse a cabo para establecer si una planta o grupo de plantas es significativamente menos rosa o café que el estándar. El nivel de importante aplicado de una prueba unilateral es 0.001.

Para los mutantes, la comparación estadística puede hacerse entre los registros de formación de tonalidad rosa de la variedad original, la cual es el mejor estándar disponible y los registros de formación de tonalidad rosa de los individuos mutantes y/o su descendencia. Para encontrar el rasgo de la invención en plantas existentes, las muestras representativas de las variedades, líneas de cruza y/o acceso al banco de genes pueden usarse. La comparación estadística puede luego hacerse entre los registros de formación de tonalidad rosa del acceso individual bajo la investigación y el resto de la población. Cuando los individuos se prueban estadísticamente para las pruebas de comparación múltiples de formación de tonalidad rosa significativamente menor puede ser necesaria para mantener los niveles significantes generales apropiados, por ejemplo, la prueba de comparación múltiple Dunnett's con un estándar (Dunnett CW, J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121 (1955)) . Además, se muestra que esta respuesta se puede obtener usando muchos tipos diferentes de tejido de hojas de diferentes estados de desarrollo. Por ejemplo, en tejido de nervadura central de lechuga se puede también inducir para dar esta respuesta sobre heridas. Cuando se aplica a diferentes tipos de lechugas, tal como lechuga Boston, lechuga iceberg, lechuga romana, batavia o lechuga sangría (oakleaf ) , adhesiones no individuales se encontraron que mostraron significativamente menos formación de tono rosa que el resto de la población investigada. Por lo tanto se concluye que dentro de los tipos de lechugas cultivadas no hay ninguna o muy limitada variación genética para la decoloración rosa inducida por la herida. Se demostró además de acuerdo con la invención que un inhibidor específico de PPO, L-cisteína, cuando se aplica durante la reacción, fuertemente suprimido la formación del tinte rosa. Además, se encontró que la formación del tinte rosa se inhibió por cinamaldehído, que es un inhibidor de actividad PAL y color pardo de lechuga cortada fresca (Fujita, N. et al (2006) Biosci . Biotechnol. Biochem. 70, 672-676). Estos hallazgos muestran que la respuesta de decoloración rosa de lechuga es dependiente de PAL y PPO. La formación de tono pardo enzimático de lechuga cortada fresca se conoce que se previene muy eficazmente por la aplicación de un breve choque de calor. El efecto observado se puede explicar al asumir re-enrutamiento de biosíntesis de proteína de la trayectoria de fenil propanoide hacia las proteínas de choque de calor reduciendo con ello el flujo metabólico hacia la formación de polifenoles. Alternativamente, el efecto se puede explicar al asumir que las enzimas implicadas en la oxidación de polifenol, tales como PPO y POD, se inactivan por el tratamiento de choque de calor. Cuando el choque de calor se aplica a la lechuga, que se ensayaron posteriormente para la respuesta de formación de tono rosa, se muestra que esta respuesta, como la formación de tono pardo enzimático, se inhibió efectivamente. Esto demuestra que la respuesta de formación de tono rosa de la lechuga, que es parte de esta invención es fisiológicamente muy similar a la respuesta de formación de tono pardo enzimático bien conocida. Este hallazgo se sustentó además al aplicar L cisteína como un agente reductor. L cisteína, además de ser un inhibidor de PPO, es también conocido para reaccionar con o-quinonas de color y convertir nuevamente en difenoles incoloros en una reacción de reducción química. Cuando el tinte rosa formado por discos de hoja de lechuga se trata con L cisteína, se demuestra que el compuesto rosa se convierte en un compuesto incoloro. Parece por lo tanto probable que el tinte rosa es una o-quinona formado por PPO. Esto se corroboró por el hallazgo de agentes reductores tipo ácido ascórbico o glutatión también convierte el tinte rosa en un compuesto incoloro. Además, cuando las plantas, que se toman desde el campo, que muestran formación de tono rosa, se tratan con L-cisteína, la decoloración rosa se elimina también. Esto demuestra que la respuesta de formación de tono rosa de disco de hoja representa el fenómeno de formación de tono rosa que se presenta naturalmente, que puede algunas veces ser visto en plantas que crecen bajo condiciones del campo. Una modalidad adicional de esta invención se basa en el siguiente experimento. Las partes de una hoja de lechuga de una cabeza se producen al cortar e incubar a 16°C en el aire. Como una respuesta la superficie de la herida se vuelve café después de aproximadamente 4 días . Especialmente en la superficie de la herida de la vena principal la formación de tono pardo puede claramente observarse. Además, la reacción de formación de tono pardo se puede también observar en el nivel de planta completo sobre las hojas dañadas al cortar o abrasión. Todas estas reacciones de formación de tono pardo se pueden completamente inhibir por L cisteína, un inhibidor de PPO, que demuestra que estos fenotipos se manifiestan a través de actividad PPO y por lo tanto se puede considerar diagnostico por color pardo posterior a la cosecha como se observa durante el procesamiento y empaque de lechuga. Estas reacciones de formación de tono pardo inducido por herida se pueden generar en una manera eficiente que se puede explotar en un procedimiento de detección sistemática fenotípica para identificar plantas mutantes que se reducen en potencial formación de tono pardo inducido por herida. Una modalidad adicional de esta invención se basa en la decoloración en las superficies heridas de tejidos de lechuga o la reacción de color observada en, en o cerca de tejidos de lechuga intactos, tal como cubierta de semillas de lechuga, inducido al aplicar substratos que se pueden convertir por las enzimas oxidantes de fenol en compuestos de color. Por ejemplo, cuando discos de hoja de lechuga se incuban con el substrato PPO L-3 , 4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), un café oscuro para decoloración negra se observa en la superficie de la herida que es la manifestación de la formación de melanina a través de PPO. Cuando L cisteína se aplicó simultáneamente, la decoloración negra se inhibió completamente que confirma la hipótesis de que esta decoloración está mediada por PPO. Aunque la L-DOPA no se considera para ser un substrato natural para lechuga PPO esto puede ser útil en ensayos destinados a la identificación de mutantes, que muestra decoloración inducida por herida reducida. En una manera similar como se describe para L-DOPA otros substratos se pueden aplicar con objeto de elevar una respuesta de decoloración. Esto incluye pero no se limita a ácido clorogénico, ácido isoclorogénico, L-tirosina, y catecol. Tomados juntos, la formación de los diferentes tintes en superficies de heridas generadas en modificaciones de monitores de plantas en una trayectoria de inicio por la inducción de una señal de herida, canalizados a través de PAL y PPO y que llevan a decoloración. Como se describe, estas reacciones de decoloración inducidas por heridas pueden fácilmente evaluarse por inspección visual que permite un procedimiento de detección sistemática mutante muy eficiente. La justificación subyacente en el método descrito por esta invención se ilustra en la Figura 1.

De acuerdo a esta invención se encontró así que la trayectoria de decoloración inducida por heridas de discos de hoja in vitro en gran medida se sobrepone con la decoloración inducida por heridas de lechuga procesada a escala industrial y puede por lo tanto considerarse diagnostico para este proceso. Esto se corrobora por la noción de que los inhibidores de PAL o PPO inhiben el color pardo enzimático de lechuga procesada y empaquetada bajo condiciones industriales, prácticas. Importantemente, como el procedimiento comprende la etapa inducida esto es heridas y una de las conversiones metabólicas finales mediadas por PPO, el procedimiento permite la captura de todos los factores genéticos directamente o indirectamente implicados en este proceso fisiológico. Además, como esta respuesta se puede generar usando un rango completo de tejidos de hoja de hojas de diferentes estados de desarrollo, detección sistemática mutante se puede dirigir hacia estas diferentes etapas o tejidos cuando se considera importante. Las plantas mutantes, que se han identificado como ser modificados con respecto al proceso fisiológico que conducen desde heridas a una decoloración dependiente de PAL y PPO con base en uno o más de los ensayos fenotípicos descritos anteriormente se pueden además caracterizar. Tal caracterización puede hacerse a diferentes niveles por ejemplo, en el nivel molecular, bioquímico, fisiológico y fenotípico . Esto es obvio para aquellos expertos en la técnica que niveles variables de decoloración se pueden observar que puede reflejar ya sea la presencia de diferentes lugares mutantes o diferentes formas alélicas de lugares idénticas que afectan el rasgo de decoloración en la población original . En el caso de mutaciones recesivas estas dos posibilidades se pueden fácilmente distinguir al llevar a cabo pruebas de alelismo, que comprenden el cruce de las dos plantas mutantes y determinar el fenotipo del híbrido. En el caso de alelismo de las mutaciones, los rasgos de decoloración reducidos serán aparentes en el Fl mientras que en el caso del fenotipo en los mutantes se determina por diferentes lugares recesivos este no será el caso. Como en una modalidad de la invención la mutagénesis aleatoria se aplica para generar la población inicial, mutaciones en los antecedentes genéticos pueden también contribuir a la variación del fenotipo bajo las condiciones experimentales. Con objeto de discriminar entre mutaciones sencillas de diferentes puntos fuertes y un efecto combinado de mutaciones en los antecedentes genéticos, retrocruzamiento se deben realizar para crear antecedentes genéticos uniformes para los diferentes eventos de decoloración reducidos. Tal procedimiento es relevante además con objeto de determinar si las mutaciones en lugares específicos implicadas en decoloración inducida por heridas exhiben efectos pleiotrópicos . Las plantas M2 así seleccionadas en la base de una respuesta de decoloración reducida se usan para crecer semillas M3. Posteriormente, las descendentes líneas puras de los eventos de decoloración reducidos se re-evaluan para sus heridas de respuesta reducida. Además, el color pardo reducido o formación de tono rosa se pueden evaluar en diferentes antecedentes genéticos y bajo diferentes condiciones de cultivos y procesamiento. Los métodos de detección sistemática de la invención se pueden usar para todas estas evaluaciones. Estudios bioquímicos se pueden realizar para abordar cuestiones relacionadas a las trayectorias afectadas por la modificación genética. Los estudios moleculares se pueden realizar para determinar si supuestamente genes candidato implicados en el color pardo enzimático o respuesta de formación de tono rosa tipo genes que codifican PAL, PPO o peroxidasas se han modificado. El análisis genético se puede además llevar a cabo para demostrar si la modificación encontrada en un gen candidato es causada con respecto al fenotipo alterado. A través de mutagénesis inducida es el método preferido para proporcionar una población de planta para usarse en el método de detección sistemática de esta invención, se conoce por la persona experta en la técnica que existe tecnología que permite modificar objetivos de gen que residen en el genoma de una planta en una manera específica. Por ejemplo, oligonucleótidos quiméricos se han demostrado ser mutágenos efectivos con un modo específico de acción. Otro enfoque es modificar objetivos de gen a través de recombinación homologa o dirección de gen. Usando tal enfoque, un fragmento de un gen se intercambia por un fragmento de ADN introducido que contiene una modificación deseada. Enfoques transgénicos también son factibles en que genes objetivo modificados se introducen para competir con el producto endógeno. Esto puede dar lugar a efectos negativos dominantes. Por otra parte, baja regulación específica de la expresión de genes es factible a través de interfase ARN. En el caso de oligonucleótidos mutagénicos, el direccionamiento de genes o enfoques transgénicos se usan para modificar un factor genético implicado en la respuesta de decoloración inducida por heridas, obviamente, la estructura primaria de los genes relevantes debe ser conocid . Cuando las plantas de progenie de crecimiento de mutantes particulares de semillas obtenidas a través de auto-fertilización se prueban por formación de tono rosa, una reducción similar como por ejemplo el mutante identificado originalmente se observa. Esto demuestra que una respuesta de decoloración rosa reducida puede ser hereditaria y causada por una modificación del genoma. Otro hallazgo sorprendente fue el hecho de que cuando las plantas progenie de mutantes identificados como que muestran una decoloración inducida por herida reducida se crecen para madurar y prueban por color pardo enzimático de tejidos de nervadura central heridos, esta respuesta también se inhibe fuertemente. Esto muestra que el ensayo de formación de tono rosa de disco de hoja se relaciona casualmente a formación de tono pardo enzimático en lechuga y que el ensayo de formación de tono rosa se puede usar para predecir el nivel de color pardo enzimático de una planta de lechuga madura. Por lo tanto, el ensayo de formación de tono rosa de disco de hoja se puede usar como una herramienta de selección para identificar plantas de lechuga con un potencial de color pardo enzimático reducido. Tal herramienta se puede usar para identificar plantas de lechuga con potencial de formación de tono pardo enzimático reducido de cualquier tipo de población de planta independientemente de la causa de la variación genética, que reside en tal población. Por ejemplo, además a poblaciones ems, se pueden usar accesos naturales o poblaciones reproductoras . El método de detección sistemática se puede también usar por detección sistemática otras plantas que muestra decoloración inducida por heridas. Uno o más de los métodos de detección sistemática proporcionados por esta invención puede por ejemplo aplicarse a cualquier especie de planta para que posterior a la cosecha la calidad de procesamiento necesite mejorar. Además de la lechuga cultivada esta invención se puede también aplicar a otras especies de plantas, por ejemplo pertenecientes a la Asteraceae, tal como especies silvestres del género Lactuca o especies de planta pertenecientes al género de planta Cichorium a cuya especie tipo endibia ( Cichorium' endivia ) , achicoria y achicoria endibia ( Cichorium intybus) pertenecen. Además, otras plantas de cultivo tal como manzana, radiquio, papa, camote, apio, hongos, plátanos, aguacate, durazno, pera, albaricoque, mango, berenjena, y para flores o tallos de flores, tal como tallos de gerbera, flores de crisantemo, fondos de alcachofa etc. pueden ser de detección sistemática con los métodos de la invención. La presente invención se refiere a un método para detectar una característica fenotípica en una planta al realizar uno de los métodos de detección sistemática que se describen en la presente. La presencia de la característica se determina por medio de uno o más de tres pruebas de decoloración, es decir la presencia de formación de tono rosa o color pardo o la capacidad para convertir un sustrato en un pigmento de color, tal L-DOPA en melanina. El "control" como se usa en la presente es cualquier planta de la cual se conoce que muestra una o más de las reacciones de decoloración de formación de tono rosa, color pardo y conversión de L-DOPA a melanina, cuyas reacciones se pueden inhibir por L-cisteína o cinamaldehído. Adecuadamente una planta se usa de que un disco de hoja u otra parte de la planta cuando se incuba entre papel de filtro húmedo a 5°C durante 7 días muestra decoloración rosa alrededor de los bordes del disco o la parte.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Modificación genética de lechuga usando ems Aproximadamente 2000 semillas de las variedades de lechuga Troubadour, Apache, Yorvik y Roderick se incubaron en una solución colocada al aire de ya sea 0.05% (p/v) o 0.07% (p/v) ems durante 24 horas a temperatura ambiente. Después el tratamiento de ems, las semillas Ml se enjuagaron con agua y se plantaron en un invernadero a 20SC a un régimen de 16 horas a la luz, 8 horas en la oscuridad para hacer crecer las plantas maduras y para inducir la formación de botones y floración con objeto de producir semillas M2. Después de la maduración, las semillas M2 se cosecharon, se les dio volumen y se almacenaron hasta su uso adicional. La frecuencia de mutación se estimó en base del número relativo de plantas individuales con un fenotipo blanqueado los cuales se perturbaron en la biosíntesis de clorofila.

EJEMPLO 2 Desarrollo de un diagnóstico de detección sistemática fenotípica para la decoloración inducida por herida de lechuga con base en la formación de pigmento de tono rosa Un ensayo fenotípico se desarrolló en el cual la decoloración de la hoja de lechuga inducida por heridas puede fácilmente evaluarse. Este enfoque permite la detección sistemática de planta joven para la decoloración. Los discos de la hoja de 5 mm de diámetro se tomaron de plantas jóvenes y maduras y se colocaron entre los papeles de filtro húmedos en una bandeja. El sistema se incubó a 5°C durante 7 días. Durante la incubación un pigmento rosa desarrollado en el sitio de la herida del disco de la hoja que se volvió claramente visible como un círculo impreso en el papel de filtro (Figura 2) . Con objeto de demostrar que la producción del pigmento rosa requiere una trayectoria de fenilpropanoide activo, el efecto de los inhibidores de PAL (cinamaldehído, Figura 3) y PPO (L-cisteína, Figura 4) se probó en este ensayo. Cuando el cinamaldehído se aplicó durante el ensayo, la decoloración rosa se inhibió completamente a una concentración de 0.01% o mayor . Un resultado similar se obtuvo usando L-cisteína a una concentración de 0.001% y mayor, mientras que otros aminoácidos tipo L-leucina o L-alanina no muestran ningún efecto. Esto demuestra que L-cisteína puede inhibir la respuesta de formación de tono rosa de los discos de la hoja de lechuga y que el efecto inhibidor de L-cisteína es específico. Con objeto de demostrar que la L-cisteína se considera que actúa como un inhibidor de la actividad PPO en este sistema, los discos de la hoja de lechuga se incubaron con el substrato PPO L-3 , 4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). Aunque L-DOPA no se considera para ser un substrato natural para PPO de lechuga, un café oscuro hasta decoloración de blanco se observó en la superficie de la herida que es la manifestación de la formación de melanina a través de PPO. Cuando 1 mM o una concentración mayor de L-cisteína se aplicó simultáneamente, la decoloración se inhibió completamente como se muestra en la Figura 5. La respuesta de formación de tono rosa de disco de hoja de lechuga se caracterizó además al aplicar un choque caliente antes de inducir la respuesta de herida. Las hojas separadas se incubaron durante 90 segundos a 21, 40, 50 y 60aC. Después estos discos de hoja de tratamiento se tomaron y se procesaron por ensayo para formación de tono rosa. La respuesta de formación de tono rosa se inhibió completamente cuando el choque de calor se llevo a cabo a una temperatura de 50 SC o mayor. Este resultado se muestra en la Figura 6. Como la L-cisteína se conoce para hacerse reaccionar con o-quinonas, que son productos PPO, al convertir de vuelta en difenoles incoloros, los efectos de L-cisteína en el pigmento de tono rosa que vienen de los discos de hoja de lechuga se determinó. En paralelo el efecto de L-cisteína se determinó en la formación de melanina durante la incubación con L-DOPA.

Los discos de la hoja se tomaron e incubaron de acuerdo a los procedimientos descritos arriba. Después la respuesta de herida se completó, una concentración en serie de L-cisteína se agregó al disco de hoja y el cambio en color se monitoreó. El resultado se muestra en la Figura 7. El experimento claramente demuestra que L-cisteína se volvió a convertir en el pigmento rosa en un compuesto incoloro mientras que la melanina blanca formada en el ensayo L-DOPA no se afectó por la L-cisteína. Esto demuestra que el pigmento rosa es muy probable en o-quinona que se forma por el sistema de oxidación de polifenol de lechuga. Para demostrar que la respuesta in vitro observada refleja una respuesta que es fisiológicamente relevante de la L-cisteína con base en la decoloración se aplicó para el material de planta que crece en el campo. Esto se lleva a cabo al cosechar una hoja de una planta de lechuga que crece en el campo que muestra síntomas de formación de tono rosa severos junto con las venas. Esto se observa típicamente cuando las plantas se han sobrecargado, por ejemplo por condiciones de transporte de agua severo. La hoja se usó para preparar los discos de hoja que se incubaron inmediatamente por L-cisteína 1 mM. Después de aproximadamente 30 minutos la incubación a temperatura ambiente, la decoloración rosa desaparece como se muestra en la Figura 8. Tomados juntos, estos datos experimentales muestran que los discos de la hoja de lechuga se pueden inducir por heridas para producir decoloración rosa que es dependiente de PAL y PPO. Este fenotipo permite un procedimiento de detección sistemática eficiente y efectiva para mutantes de lechuga que tienen una respuesta de herida modificada inducida por decoloración canalizada a través de PAL, PPO o ambos .

EJEMPLO 3 Detección sistemática para mutantes con una decoloración inducida por herida reducida Con objeto de identificar los mutantes de lechuga con potencial de formación de tono rosa o pardo enzimático inducido por herida inferior, el ensayo de disco de hoja descrito en el Ejemplo 2 se aplicó a plantas de una población mutante de lechuga. 12000 plantas se hicieron crecer en un invernadero (Ubicación: De Lier, sembradas el 28 de marzo, plantadas el 18 de abril; se hicieron crecer bajo condiciones de crecimiento de lechuga regular) y de cada planta individual un disco de hoja se tomó (muestra del 15 de mayo en adelante) y se incubaron como grupos de (en promedio) 25 muestras entres papeles de filtro húmedos a 5S durante 7 días. Un registro visual se dio a cada disco de hoja dependiendo de la intensidad de la decoloración rosa. Con base en esta evaluación, las plantas se seleccionaron de las cuales los discos de hoja no mostraron o mostraron un grado relativamente inferior de decoloración de superficie de herida. La planta con rastros fuertemente visibles de decoloración se enumeró 06D.210202. De las 12000 plantas, 1 planta se seleccionó finalmente la cual muestra solamente rastros de decoloración que son fuertemente visibles y 11 que muestran un nivel relativamente inferior de decoloración. El resultado de uno de estos ensayos se muestra en las Figuras 9A-9B. El ensayo de decoloración se repitió para los 12 individuos seleccionados inicialmente y para más casos individuales se confirmó el resultado original. Solamente los individuos confirmados se seleccionaron para análisis adicional y producción de semilla. EJEMPLO 4 Detección sistemática para mutantes con una decoloración inducida por herida reducida Con objeto de identificar los mutantes de lechuga con potencial pardo enzimático inducido por herida inferior el ensayo de disco de hoja descrito en el Ejemplo 2 se aplicó a plantas de una población mutante de lechuga. 8500 plantas se hicieron crecer en un invernadero hasta 3 semanas de edad (6-8 etapa de hoja) y de cada planta individual un disco de hoja se tomó e incubó entre los papeles de filtro húmedos a 5°C durante 7 días . Un registro visual se dio a cada disco de hoja dependiendo de la intensidad de la decoloración rosa. Con base en esta evaluación, las plantas se seleccionaron de las cuales los discos de hoja no muestran o muestran un grado relativamente inferior de decoloración de superficie de herida, de las 8500 plantas 8 plantas se seleccionaron las cuales no muestran ninguna decoloración visible y 10 muestran una decoloración relativamente inferior. El ensayo de decoloración se repitió para los 18 individuos que se seleccionaron inicialmente y para más casos individuales el resultado original se confirmó. Doce individuos se muestran en la Figura 10. Solamente los individuos confirmados se seleccionaron para análisis adicional y producción de semilla. Una planta mutante sin efectos colaterales pleiotrópicos (por ejemplo, blanqueado, que impide el crecimiento) fue el número dado 05D.202539. La semilla producida al someter a polinización de esta planta se enumeró 05D.810596. La semilla producida al someter a polinización de tres plantas que crecen de semillas de 05D.810596 se enumeró 07G.9979 y depositó en NCIMB. El número NCIMB es 41441 (depositado el 10 de octubre de 2006) .

EJEMPLO 5 Análisis fenotípico de los mutantes seleccionados que muestran decoloración inducida por herida reducida De los 12 imitantes seleccionados de la detección sistemática presentados en el Ejemplo 3, 6 muestran un fenotipo y blanqueado de crecimiento reducido grande. Otros mutantes se desarrollan normalmente esto es de acuerdo al tipo de la población de partida del experimento de mutagénesis. Los mutantes que impiden el crecimiento y blanqueados se perturbaron probablemente en función de cloroplasto. Como PPO reside en estos organelos celulares esto puede explicar la respuesta relativamente inferior en los ensayos de disco de hoja. Como tales mutaciones pleiotrópicas son indeseables, estos mutantes se consideran para ser menos relevantes. La planta mutante 06D.210202 que muestra la reducción más grande de decoloración de disco de hoja muestra un fenotipo normal y la mutación es por lo tanto considerado específico para la decoloración sin efectos pleiotrópicos grandes.

EJEMPLO 6 Confirmación de la casi ausencia de fenotipo de decoloración en progenie Para demostrar que la decoloración reducida de los mutantes de lechuga tipo planta 06D.210202 de los Ejemplos 3 y 5 se provoca por un efecto genético generado por el tratamiento de mutagénesis descrito en la presente, la semilla se produjo al someter a polinización de la planta 06D.210202 se enumeró 06D.819784. Las semillas se germinaron en el suelo y las plantas se probaron para decoloración usando el ensayo de formación de tono rosa de disco de hoja.

Este experimento claramente muestra que el fenotipo alterado tiene una base genética como todas las plantas de progenie que muestran un fenotipo similar esto es una reducción grande en decoloración rosa, tipo el mutante que se usó para producir las semillas. Este resultado se ilustra en la Figura 11. La semilla producida al someter a polinización de tres plantas que crecen de las semillas de 06D.819784 se enumeró 06D.863B2 y depositó en NCIMB. El número NCIMB es 41454 (depositado el 3 de enero de 2007) . EJEMPLO 7 Desarrollo de un diagnóstico de detección sistemática fenotípica para la decoloración inducida por herida de lechuga con base en la formación de pigmento café Las plantas de lechuga se hicieron crecer para madurar y las partes de las hojas exteriores se tomaron al cortar los discos del tejido de la costilla. Los discos se incubaron en papel de filtro húmedo a 16°C. Después aproximadamente 72 horas, la superficie de herida se vuelve café. En la presente de L-cisteína 10 mM la respuesta de tono pardo se inhibió indicando que la decoloración observada es mediada por PPO.

Un resultado representativo de tal experimento se muestra en la Figura 12. Como la respuesta como se exhibe en la Figura 12 es una respuesta de mancha parda mediada por PPO, el procedimiento de detección sistemática como se describe en este ejemplo puede considerarse que es efectivo e imparcial con objeto de detectar en forma sistémica mutantes que muestran decoloración parda reducida que se presenta durante el procesamiento de la lechuga.

EJEMPLO 8 Desarrollo de un diagnóstico de detección sistemática fenotípica para la decoloración inducida por herida de lechuga con base en la conversión de L-3, 4-dihidroxi fenilalanina (L-DOPA) en un pigmento negro llamado melanina Además de los ensayos que dirigen la decoloración inducida por herida en un sentido amplio, el método de acuerdo con esta invención también permite la detección sistema en una manera más específica para mutantes que tienen una actividad PPO reducida. Un ensayo fenotípico que es indicativo para actividad PPO se desarrolló al usar discos de hojas que se incubaron en presencia de L-DOPA 1.5 mM. Ya que la decoloración negra se vuelve aparente puede concluirse que L-DOPA puede convertirse rápidamente por el sistema que oxida el polifenol en la superficie de herida de las hojas de lechuga en un pigmento negro llamado melanina. La L-DOPA se convierte por PPO en la L-DOPA-quinona reactiva que se convierte no enzimáticamente por medio de dopacromo e indol quinona en la melanina negra. Adicionalmente, se mostró que la reacción puede inhibirse al agregar L-cisteína 1 mM durante la reacción (Figura 5) . Por lo tanto, este ensayo permite la identificación de mutantes que se modifican en su capacidad para montar una actividad PPO en una superficie de herida de una hoja. La respuesta de los discos de hojas de lechuga a la presencia de L-DOPA puede observarse tanto en la solución así como entre los papeles filtro humedecidos como se muestra en las Figuras 13A-13B-. EJEMPLO 9 Evaluación de la progenie de un mutante que muestra una casi ausencia de decoloración para respuesta de formación de tono pardo reducida usando el ensayo de formación de tono pardo de disco de costilla Para demostrar que la decoloración reducida de mutantes de lechuga tipo planta número 06D.210202 de los Ejemplos 3, 5 y 6 que se reduce significativamente en la decoloración rosa de superficies heridas de discos de hojas también se reduce efectivamente en la respuesta a la formación de tono pardo inducida por herida, un número de plantas de progenie se hicieron crecer hasta la madurez. En esta etapa de desarrollo, se toman discos de 3 la costilla media de las hojas exteriores de un número de plantas de progenie. Estos discos de costilla se incubaron de acuerdo al procedimiento descrito en el Ejemplo 7. Se muestra que las plantas de progenie del mutante que se mostraron previamente para estar fuertemente reducidas en decoloración rosa inducida por herida también están fuertemente reducidas en formación de tono pardo de costilla media inducida por la herida. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 14.

EJEMPLO 10 Evaluación de la progenie de un mutante que muestra casi ausencia de decoloración para respuesta a la formación de tono pardo reducida usando cabezas de lechuga recién cortadas empacadas en bolsas de plástico Cabezas maduras de las plantas de lechuga que crecen de la semilla número 06D.819784 del Ejemplo 6, que está significativamente reducido en decoloración rosada de superficies heridas de discos de hoja, se cortaron en piezas usando un cuchillo y se empacan en una bolsa de plástico que contiene una atmósfera ambiente. Las plantas de control que muestran una respuesta a la decoloración rosada de disco de hoja normal se trataron de manera idéntica. Las bolsas se almacenaron a 4°C durante 6 días después de lo cual el material de hojas se evaluó para su respuesta a la formación de tono café. Se muestra por este experimento que las plantas de progenie del mutante que se mostraron previamente para ser fuertemente reducidas en decoloración rosada inducida por herida también están fuertemente reducidas en formación de tono café de la cortilla media inducida por herida cuando se procesan y almacenan en bolsas de plástico usando una atmósfera ambiente. El resultado de este experimento se muestra en la Figura 15.

EJEMPLO 11 Formación de tono rosado en Cichori um Con objeto de identificar mutantes con potencial de formación de tono rosado enzimático inducido por herida bajo, el ensayo de disco de hoja descrito en el Ejemplo 2 se aplicó a plantas de una población de Cichori um . Los resultados se muestran en la Figura 16. Se deduce que también en Cichorium está presente la reacción de formación de tono rosado. El método de detección sistemática de la invención es de esta manera una herramienta poderosa para seleccionar plantas de Cichori um que muestran una decoloración inducida por herida reducida. Hasta ahora la evaluación de la respuesta a la formación de tono café en endibia y endibia de Bruselas sólo podría evaluarse al observar plantas maduras . El método de la invención que puede practicarse en material de planta joven es muy eficiente y rápido.

EJEMPLO 12 Decoloración en berenjena Se cortaron berenjenas a la mitad y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. De la Figura 18 se deduce que la respuesta a la decoloración se causa principalmente por las semillas. De esta manera, las semillas son un candidato apropiado para un ensayo de decoloración basado en substrato, por ejemplo con L-DOPA. EJEMPLO 13 Diagnóstico de detección sistemática fenotípica para la decoloración inducida por herida de lechuga con base en la conversión de ácido clorogénico Discos de hojas de lechuga se incubaron con ácido clorogénico 10 mM en papel filtro. La Figura 17 muestra la formación de tono café de los discos. Durante la adición de L-cisteína el color desaparece de nuevo lo que muestra que la decoloración depende de PPO. Este ejemplo demuestra que el ácido clorogénico es un substrato apropiado para un ensayo de detección sistema basado en substrato.

EJEMPLO 14 Diagnóstico de detección sistemática basado en substrato para la decoloración inducida por herida de semillas Las semillas de lechuga y berenjena se incubaron con L-DOPA 0, 2.5 y 5 mM. La Figura 19 muestra que la reacción de color observada en las semillas depende de la concentración.

La respuesta depende de PPO debido a que puede inhibirse con L-cisteína . Las semillas germinadas de lechuga se incubaron con L-DOPA. La Figura 20 muestra que la cubierta de la semilla y la zona de raíz justo detrás de la punta de la raíz muestran una reacción de color. Esta reacción de color puede usarse para semillas para detección sistemática que muestra una decoloración reducida. Las semillas de lechuga se incubaron con 0, 100, 250, 500, 750 y 1000 mg/L de catecol. La Figura 21 muestra que las semillas muestran una respuesta al color dependiente de la concentración. La respuesta es dependiente de PPO debido a que se encontró que se inhibe por L-cisteína. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para detección sistemática de una población de plantas o partes de planta para la presencia en ellas de individuos que muestran una decoloración reducida en comparación con una planta de control o una parte de la planta, caracterizado porque comprende a) proporcionar una población de plantas o partes de las plantas de la población; b) crear opcionalmente una superficie herida en las plantas o partes de planta; c) incubar la planta o partes de planta o las superficies heridas creadas en ésta para permitir que la decoloración se presente en ésta o sobre ésta; d) observar la decoloración en o sobre las plantas o partes de planta; e) comparar la decoloración observada con la decoloración que se observa en la planta de control o parte de planta para identificar plantas o partes de planta que no muestran decoloración o una decoloración que está reducida en comparación con la planta o una parte de la planta de control .
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la decoloración es decoloración inducida por heridas .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque las plantas son plantas vegetales, plantas que traen fruta o plantas de flores.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque las plantas son plantas vegetales seleccionadas de lechuga, endibia, endibia de Bruselas, papa, camote, apio, champiñones, alcachofa y berenjena.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque las plantas son plantas que traen fruta seleccionadas de manzana, plátano, aguacate, durazno, pera, albaricoque o chabacano y mango.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizado porque las plantas son plantas de flores seleccionadas de gerbera y crisantemos.
7. 7. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque las plantas pertenecen a la familia Asteraceae, en particular al género Lactuca , más en particular a la especie Lactuca sativa .
8. 8. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque las plantas pertenecen al género Cichorium y en particular a la especie Cichorium intybus y Cichorium endivia .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque las partes de planta son seleccionadas de hojas, cabezas, retoños, raíces, tubérculos, tallos, flores, frutas, semillas, semillas germinadas, o piezas de los mismos y células.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 7 ó 8, caracterizado porque las partes de planta son discos de hojas .
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 7 ó 8, caracterizado porque las partes de planta son discos de tejido de costilla media.
12. 12. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque la población de plantas es una población de plantas mutantes, una colección de plasma germinal o una población de plantas transgénicas .
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la población de plantas mutantes se obtiene por un tratamiento de mutagénesis usando químicos y/o radiación.
14. 14. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque la incubación toma lugar en un ambiente acuoso.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ambiente acuoso comprende papel filtro humedecido.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ambiente acuoso comprende agua o una solución.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque el ambiente acuoso contiene un compuesto seleccionado de L-3 , 4-dihidroxifenilalanina, ácido clorogénico, ácido isoclorogénico, L-tirosina y catecol.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque el ambiente acuoso contiene un compuesto seleccionado de los compuestos enlistados en la Tabla 1.
19. 19. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque la planta de control es una planta de la cual un disco de hoja cuando se incuba entre dos hojas de papel filtro humedecidas por 7 días a 5°C muestra decoloración rosada alrededor de los extremos.
20. 20. Un método para detección sistemática de una población de plantas o partes de planta para la presencia en ésta de individuos que muestran una decoloración reducida en comparación con una planta de control o una parte de la planta, caracterizado porque comprende: a) proporcionar una población de plantas o partes de las plantas de la población; b) incubar las plantas o partes de plantas con un substrato que puede convertirse en un pigmento de color para permitir que se presente la decoloración en ésta o sobre ésta; c) observar la decoloración en o sobre las plantas o partes de planta; d) comparar la decoloración observada con la decoloración que se observa en la planta de control o una parte de la planta, para identificar plantas o partes de planta que no muestren decoloración o una decoloración que es reducida en comparación con la planta de control o una parte de la planta.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el substrato se selecciona de los compuestos enlistados en la Tabla 1.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el compuesto es L-DOPA.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 20, 21 ó 22, caracterizado porque la planta o una parte de la planta se daña antes de incubar con el substrato y se observa la decoloración de la herida o cerca de la herida.
24. 24. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 20-23, caracterizado porque la parte de la planta es una semilla, semilla germinada o disco de hoja.
25. 25. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizado porque la decoloración puede inhibirse o invertirse por L-cisteína.