CN1301328C - 转基因提高玉米籽粒淀粉中直链淀粉比例和籽粒总淀粉含量的方法 - Google Patents
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Abstract
转基因提高玉米籽粒淀粉中直链淀粉比例和籽粒总淀粉含量的方法，其特征是分别构建淀粉分支酶基因和参与作物糖酵解及TCA循环的代谢酶的基因RNA干涉表达载体，通过农杆菌介导或者基因枪转化把目的干涉片段整合到作物基因组中，特异性地抑制作物淀粉分支酶和参与作物糖酵解及TCA循环的代谢酶的基因活性，从而提高作物籽粒淀粉中直链淀粉的比例和籽粒总淀粉的含量。采用本方法可以方便、有效地改良禾谷类作物籽粒淀粉品质。
Description
技术领域：
本发明涉及改良禾谷类作物籽粒淀粉品质的方法，更具体地说是通过RNA干涉转基因技术改良禾谷类作物籽粒淀粉品质的方法。
背景技术：
禾谷类作物如玉米作为工业原料最主要的成份就是淀粉，由于玉米淀粉加工不受季节限制，淀粉质量较好，籽粒中淀粉含量达64％-78％，且具有综合利用效益高和较薯类淀粉易于回收等特点，所以世界淀粉市场的81.8％为玉米淀粉，美国淀粉加工业95％的淀粉为玉米淀粉。通常所说的玉米淀粉是直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)的混合物。目前，国内外玉米品种淀粉的含量多为籽粒干重的60％左右，其中直链淀粉为22％左右，支链淀粉为78％左右。而在工业上得到广泛应用的是直链淀粉，涉及食品、医疗、纺织、造纸、环保等30多个领域。直链淀粉，尤其是经过理化修饰后的直链淀粉功能进一步加强，如将直链淀粉进行溶解，与氢键结合，可形成刚性不透明胶体，这一特性用于糖果业，可以使糖果保持固定的形状和完整的造型；直链淀粉还用于食品业的增厚剂、固定剂、炸薯条中阻止过度吸油分的包衣剂；利用直链淀粉取代聚苯乙烯生产可降解塑料，这种塑料具有大量应用于包装工业、农用薄膜加工业和从根本上解决白色污染问题的潜能。
在禾谷类作物研究上，获得高水平的直链淀粉同时并不明显减少淀粉总含量的突破是1952年Vineyard和Bear发现了位于玉米第5条染色体上的ae(amylose extender)基因。遗传研究表明高直链淀粉主要是由ae基因控制的，ae基因及其修饰基因的协同作用可使玉米淀粉中直链淀粉的含量提高到50-80％。位于第五连锁群上的ae基因目前已被SSR连锁标记，已从高淀粉玉米中克隆了ae基因，该基因共有23449bp，其在Genebank中的接受号为AF072725。这些为该性状的转移和利用提供了重要的种质资源和基因资源，但由于该基因较大，不易操作，同时该基因表达伴随其它农艺性状变劣、籽粒产量低，应用受到限制。另外，由于高直链淀粉的遗传十分复杂，采用常规杂交、回交转育和轮回选择等育种方法，所需群体要足够大，且周期长、分析样品多，因此投入也较多。
基因工程改变淀粉质量集中于GBSS，SSS和SBE三种酶的操作上，主要使用技术：
1、正义和反义RNA转基因技术，即是通过导入某个酶基因的正义结构或反义结构，影响细胞内酶的含量或活性，引起目的基因的过量表达或使其表达受抑制，从而达到对淀粉结构的控制。Visser等人(1991)利用反义RNA技术，向马铃薯中导入反向连接的GBSS基因，导致GBSS基因含量和活性下降，进而导致马铃薯块茎中直链淀粉含量锐减(减少70％-100％)。同样地利用反义RNA技术，在木薯(Salehuzzman，1993)、水稻等植物中，也获得了低(或无)直链淀粉的转化体。国际专利WO9722703A2报道了应用反义RNA技术将玉米sbe2b基因的全长cDNA转化玉米的研究，结果获得了籽粒淀粉中直链淀粉含量较高的转基因玉米。然而反义技术的应用存在一定的局限性，其对内源性基因表达的抑制较弱，往往产生过渡性的表型，会妨碍对目的基因功能的准确判断。其抑制效应遗传稳定性较差，不能稳定可靠地降低目的基因的表达。
2、基因敲除技术和DNA/RNA嵌合分子介导的基因转变技术，但该方法一次只能研究一个基因，不能有效地对多基因家族进行敲除。一些在动植物发育过程中有关键作用的基因，如果在DNA水平采用基因敲除或突变进行可遗传的修饰，则会过早地基因沉默，产生致死表型，因而无法深入研究。
发明内容：
本发明是为避免上述现有技术所存在不足，提供一种简便高效、遗传稳定性好、特异性和可操作性强的转基因提高玉米籽粒淀粉中直链淀粉比例和籽粒总淀粉含量的方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
构建淀粉分支酶基因RNA干涉表达载体，所述淀粉分支酶基因的特异性RNA干涉序列为：ttcat gacatctgat caccagtata tttcccggaa acatgaggag gataaggtga ttgtgttcga aaagggagatttggtatttg tgttcaactt ccactgcaac aacagctatt ttgactaccg tattggttgt cgaaagcctg gggtgtataa，通过农杆菌介导或者基因枪转化把目的干涉片段整合到作物基因组中，特异性地抑制作物淀粉分支酶的基因活性；
构建参与作物糖酵解及TCA循环的代谢酶基因RNA干涉表达载体，所述参与作物糖酵解和TCA循环的代谢酶基因的特异性RNA干涉序列为：tcaatgtgg ccgtcatggt tggtggattccccaggaagg agggaatgga aaggaaagat gttatgtcga aaaatgtttc aatctacaaa tcccaagcat ctgcccttgaagcccatgca gctcccaact gcaaggttct ggtggttgcc aacccagcaa acaccaatgc tcttatcttg aaagaatttgctccatctat tccagag，通过农杆菌介导或者基因枪转化把目的干涉片段整合到作物基因组中，特异性地抑制参与作物糖酵解及TCA循环的代谢酶的基因活性。
与已有技术相比，本发明的优点体现在：
1、本发明是利用RNA干涉技术进行禾谷类作物淀粉品质改良。这是RNA干涉技术首次在该领域进行研究与运用，也是本发明的独创之处。RNA干涉技术具有高效性、特异性、可遗传性、操作简单等特点，这是传统的基因敲除技术和反义RNA技术所无法比拟的。
2、在受体选择上，传统的基因敲除技术和反义RNA技术所要研究的受体一般是完整的基因序列，对于基因序列不明确的受体，具有明显的局限性。而利用RNA干涉技术，只需要知道与受体同源的基因片段，就可对受体进行研究，因此，研究范围较为广泛。
3、在操作方法上，反义RNA技术一般要构建的是含数千个碱基对的大片段，操作起来较为困难，而RNA干涉技术中所要构建的载体仅仅是含有几十到几百个碱基对的小片段，操作简单、方便，易于运用。另外，一个基因可选择一到多个干涉片段，可对这些片段或组合进行干涉效果的分析、优化，以获得最有效的片段。
4、在遗传稳定性上，利用传统的反义RNA技术，因全基因转化对受体影响大，通常会导致受体产生较大变异，且遗传稳定性较差，难以得到优良的转基因作物，但采用该技术转化的RNA干涉片段小，对受体其它农艺性状影响小，遗传稳定性高，便于获得对目的基因干涉而其它农艺性状优良的转基因植株。
附图说明：
图1为PCR扩增片段电泳检测图谱。
图中，M：DNA标准分子量；1-6分别为从玉米品种鲁原92、52106、昌72、郑58、543、联87的基因组DNA中扩增的特异片段。
图2为pUCCRNAi质粒Pst I酶切验证和BamH I、Sal I双酶切后纯化图。
图中，M：DNA标准分子量；1-2：pUCCRNAi质粒Pst I酶切验证；3-4：PCR产物BamHI、Sal I双酶切纯化的片段；5-6：pUCCRNAi质粒BamH I、Sal I双酶切纯化的片段。
图3为RNAi+1F质粒Pst I酶切验证电泳图谱。
图中，M1：Marker(λDNA/Hind III)、M2：DL2000 DNA Marker，泳道1为对照pUCCRNAi/pstI产物；2、3、4、5、6和7为(RNAi+1F)/pstI产物，其中1F为纯化后的鲁原92、52106、昌72、郑58、543、联87的基因组DNA中扩增的特异片段
图4为.RNAi+2F质粒Pst I酶切验证电泳图谱。
具体实施方案：
操作步骤：
a、根据作物淀粉分支酶基因或参与作物糖酵解和TCA循环的代谢酶基因的序列，通过序列比对，确定作物中淀粉分支酶基因的特异性RNA干涉序列为：ttcat gacatctgatcaccagtata tttcccggaa acatgaggag gataaggtga ttgtgttcga aaagggagat ttggtatttg tgttcaactt ccactgcaacaacagctatt ttgactaccg tattggttgt cgaaagcctg gggtgtataa和参与作物糖酵解和TCA循环的代谢酶基因的特异性RNA干涉序列为：tcaatgtgg ccgtcatggt tggtggattc cccaggaagg agggaatggaaaggaaagat gttatgtcga aaaatgtttc aatctacaaa tcccaagcat ctgcccttga agcccatgca gctcccaactgcaaggttct ggtggttgcc aacccagcaa acaccaatgc tcttatcttg aaagaatttg ctccatctat tccagag；
b、根据选定目的基因的RNA干涉序列设计引物，进行目的干涉片段的特异性扩增；
c、构建RNA干涉表达载体，包括目的干涉片段正反向连接于作物内含子两端，其上游连接胚乳特异性启动子，下游连接终止子；
d、转化含有目的干涉片段的载体，使目的干涉片段整合到作物基因组中；
e、通过选择标记或报告基因筛选，再进行分子检测，获得改善籽粒淀粉品质的转基因植株。
在步骤a中，通过同源性搜索和序列比对，确定玉米淀粉分支酶基因的特异性RNA序列为玉米sbe2b基因的第13个外显子序列，即全长sbe2b基因的第2086-2240片段，共155bp。
具体实施中的代谢酶的基因为NAD-苹果酸酶基因。
具体操作实例：
1、根据作物淀粉分支酶基因和参与作物糖酵解及TCA循环的代谢酶NAD-苹果酸酶基因的序列，通过Clustal W软件进行序列比对，确定作物中淀粉分支酶基因和NAD-苹果酸酶基因的特异性RNA干涉序列。
例如：通过同源性搜索和序列比对，确定特异性RNA干涉序列为sbe2b基因的第13个外显子序列，即全长sbe2b基因(Genebank Accession Number：AF072725)的第2086-2240片段，共155bp，其序列如下：
ttcat gacatctgat caccagtata tttcccggaa acatgaggag gataaggtga
ttgtgttcga aaagggagat ttggtatttg tgttcaactt ccactgcaac
aacagctatt ttgactaccg tattggttgt cgaaagcctg gggtgtataa
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seq2 GAGCAATAGCTATTTTGACTATCGCGTTGGTTGTTTCAAGCCTGGGAAGTACAAGATCGT 2280
* *** ************** ** ******** ********* *** **
seq1：sbe2b gene DNA sequence 2086-2240 fragment(155bp)
seq2：sbe2a mRNA，partial cds.ACCESSION NUMBER：U65948
seq1 --------------TTCATGACATC-TGATCACCAGTATATTTCCCGGAAACATGAGGAG 45
seq3 GAAGCTCCAAGGATCCTGAGCCTCAACAACAACCCATACTTCTCCGGACCATACGGGGAG 660
* * * ** * *** ** * *** * * * * ****
seq1 GATAAGGTGATTGTGTTCGAAAAGGGAGATTTGGTATTTGTGTTCAACTTCCACTGCAAC 105
seq3 GACGTCGTGTTCGTCTGCAACGACTGGCACACCGGCCCTCTCTCGTGCTACCTCAAGAGC 720
** *** * ** * * * * * * * * * * ** ** * * *
seq1 AACAGCTATTTTGACTACCGTATTGGTTGTCCAAAGCCTGGGGTGTATAA---------- 155
seq3 AACTACCAGTCCCACGGCATCTACAGGGACGCAAAGACCGCTTTCTGCATCCACAACATC 780
*** * * * ** * * **** * * * * *
seq1：sbe2b gene DNA sequence 2086-2240 fragment(155bp)
seq3：Waxy(maize)mRNA；ACCESSION NUMBER：M24258
2、根据选定目的基因RNA干涉片段的序列，运用Primer Premier 5.0软件设计引物，进行目的干涉片段的特异性扩增。
采用primer design引物设计程序对引物的Tm值、可能形成的发夹结构、二聚体及引物错配等各项参数进行评估和优化。
例如：要特异地扩增分离玉米sbe2b基因的第13个外显子序列，即全长sbe2b基因的第2086-2240片段，确定有严格的扩增条件，使引物设计要忠实于原有序列，同时要兼顾后续试验的进行，以保证该155bp序列在扩增过程中不发生变化。在设计引物时，我们在引物的5’端分别添加了BamH I和Sal I位点，采用手工设计，并利用引物设计程序进行辅助分析。设计的引物序列如下：
5’PRIMER Sequence：5′-GCGGATCCTTCATGACATCTGATCACC-3′
3’PRIMER Sequence：5′-GCGTCGACTTATACACCCCAGGCTTTC-3′
由于目的DNA片断GC含量较高，且引物的Tm值也较高，待扩增的目的片段较短，所以扩增过程采用两步法PCR，其反应条件优化后如下：(1)94℃预变性，5分钟，(2)35个循环，每个循环两步反应：94℃ 1分钟，62℃ 1分钟，(3)72℃延伸5分钟，(4)4℃保温。
3、构建RNA干涉表达载体，包括目的干涉片段正反向连接于作物内含子两端，其上游连接胚乳特异性启动子，下游连接终止子。
例如：不同品种玉米淀粉分支酶SBEIIb基因RNA干涉表达载体HMW+2F的构建。
(1)目的片段的获得
为了更特异性地获得每个供试品种的目的RNA干涉片段，分别以每个供试品种基因组DNA为模板，按优化后的反应程序进行PCR扩增。PCR扩增结束后，进行1.4％琼脂糖凝胶电泳并拍照，结果得到一条150bp左右的特异性片段，主带明显，与预期片段大小相同，如图1所示。
(2)目的片段与干涉载体的连接
a、双酶切pUCCRNAi质粒和PCR产物
pUCCRNAi质粒用PstI酶切验证后，将其和PCR产物分别用BamHI、SalI双酶切，然后切胶回收、纯化，电泳检测，拍照如图2所示。
b、RNAi+1F的构建及其验证
如图3所示，从酶切产物电泳结果看，用PstI切对照质粒pUCCRNAi，产生一条250bp亮带，用PstI切重组子RNAi+1F质粒，却产生了一条约400bp的亮带，表明目的片断(约155bp)已正确连接在质粒pUCCRNAi中。
c、RNAi+2F的构建及其验证
如图4所示，从酶切产物电泳结果看，用PstI切对照质粒pUCCRNAi，产生一条250bp亮带，用PstI切重组子RNAi+1F质粒，却产生了一条约550bp的亮带，表明正反向目的片断(约155bp)已正确连接在质粒pUCCRNAi中。表明已成功地把正反向目的片段连接在pUCCRNAi载体上，为以后表达载体的构建打下了基础。(其中泳道1-6中2F分别为纯化后的鲁原92、52106、昌72、郑58、543、联87的目的序列的正反向片段。)
(3)HMW+2F干涉表达载体的构建
分析HMW.GUS载体和已构建好的RNAi+2F载体酶切位点图谱，分别进行PstI、SalI双酶切，并以其SalI单酶切作为对照，然后电泳、切胶、纯化回收目标片段HMW(去GUS后)和2F片段，接着进行二者的连接反应、转化、筛选和重组子的酶切鉴定。
4、通过农杆菌介导原位转化或基因枪等方法将含有目的干涉片段的已构建好的质粒转化到作物基因组中。
5、通过选择标记或报告基因筛选以及分子检测，获得改善籽粒淀粉品质的转基因植株。利用农杆菌介导的原位转化将上述构建的RNA干涉表达载体转化鲁原92玉米自交系，利用潮霉素(55mg/L)对当代(T1代)15000粒种子进行抗性筛选，其抗性率为8.6‰。胚乳细胞和胚细胞PCR阳性率分别为5.3‰和3.6‰。
6、转基因籽粒的RNA干涉效果分析。通过对胚乳细胞PCR阳性的籽粒直链淀粉含量分析，其直链淀粉含量占总淀粉含量的比例在35.26％～50.60％之间，平均值为41.54％，而对照直链淀粉含量的比例为22.46％。这表明该方法可显著提高玉米籽粒直链淀粉含量，改良了玉米淀粉品质。
本实施例中，参与作物糖酵解及TCA循环的NAD-苹果酸酶基因RNA干涉表达载体的构建(包括特异性RNA干涉序列的比对，设计引物及目的干涉片段的特异性扩增)、含有目的干涉片段的质粒向作物基因组中整合、特异性地抑制参与作物糖酵解及TCA循环的NAD-苹果酸酶基因活性、通过选择标记或报告基因筛选以及分子检测，获得改良籽粒淀粉品质的转基因植株等一系列过程的具体步骤均与淀粉分支酶基因的RNA干涉步骤相同，主要区别仅仅在于两者的干涉序列存在差异。通过对转基因籽粒的RNA干涉效果分析，结果表明，转基因株籽粒总淀粉含量可较对照(受体)提高6.2％，因此，该方法可以显著提高作物籽粒总淀粉的含量。
Claims (4)
1、转基因提高玉米籽粒淀粉中直链淀粉比例和籽粒总淀粉含量的方法，其特征是：
构建淀粉分支酶基因RNA干涉表达载体，所述淀粉分支酶基因的特异性RNA干涉序列为：ttcat gacatctgat caccagtata tttcccggaa acatgaggag gataaggtga ttgtgttcga aaagggagatttggtatttg tgttcaactt ccactgcaac aacagctatt ttgactaccg tattggttgt cgaaagcctg gggtgtataa，通过农杆菌介导或者基因枪转化把目的干涉片段整合到作物基因组中，特异性地抑制作物淀粉分支酶的基因活性；
构建参与作物糖酵解及TCA循环的代谢酶基因RNA干涉表达载体，所述参与作物糖酵解和TCA循环的代谢酶基因的特异性RNA干涉序列为：tcaatgtgg ccgtcatggt tggtggattccccaggaagg agggaatgga aaggaaagat gttatgtcga aaaatgtttc aatctacaaa tcccaagcat ctgcccttgaagcccatgca gctcccaact gcaaggttct ggtggttgcc aacccagcaa acaccaatgc tcttatcttg aaagaatttgctccatctat tccagag，通过农杆菌介导或者基因枪转化把目的干涉片段整合到作物基因组中，特异性地抑制参与作物糖酵解及TCA循环的代谢酶的基因活性。
2、根据权利要求1所述方法，其特征是按如下步骤操作：
a、根据作物淀粉分支酶基因或参与作物糖酵解和TCA循环的代谢酶基因的序列，通过序列比对，确定作物中淀粉分支酶基因的特异性RNA干涉序列和参与作物糖酵解和TCA循环的代谢酶基因的特异性RNA干涉序列；
b、根据选定目的基因的RNA干涉序列设计引物，进行目的干涉片段的特异性扩增；
c、构建RNA干涉表达载体，包括目的干涉片段正反向连接于作物内含子两端，其上游连接胚乳特异性启动子，下游连接终止子；
d、转化含有目的干涉片段的载体，使目的干涉片段整合到作物基因组中；
e、通过选择标记或报告基因筛选，再进行分子检测，获得转基因植株。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征是在所述步骤a中，通过同源性搜索和序列比对，确定玉米淀粉分支酶基因的特异性RNA干涉序列为玉米sbe2b基因的第13个外显子序列，即全长sbe2b基因的第2086-2240片段，共155bp。
4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征是所述代谢酶基因为NAD-苹果酸酶基因。
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