CN103060320B - 用于鉴定小麦籽粒发芽性状的引物对以及相关分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定小麦籽粒发芽性状的引物对以及相关分子标记。本发明提供的特异引物对，由序列表的序列3所示的单链DNA片段和序列表的序列4所示的单链DNA片段组成。本发明公开了普通小麦TaSdr基因及其等位变异序列TaSdr-B1a和TaSdr-B1b，并提供了鉴定TaSdr-B1a和TaSdr-B1b等位变异的功能标记Sdr2B及其与小麦发芽性状的相关关系。将本发明中的功能标记运用于分子标记辅助选择，能快速筛选出具有较高籽粒休眠性的小麦品种（材料），从而加速抗穗发芽小麦新品种的育成步伐。本发明对于利用分子标记辅助选择抗穗发芽的小麦品种具有重要的理论意义和经济价值。

Description

用于鉴定小麦籽粒发芽性状的引物对以及相关分子标记

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定小麦籽粒发芽性状的引物对以及相关分子标记。

背景技术

成熟期穗发芽（Pre-harvest sprouting，PHS）是指小麦在收获前遇到阴雨或在潮湿环境下的穗上发芽。穗发芽导致小麦产量和容重急剧下降，发生可见穗发芽的麦田一般减产10%左右。穗发芽不仅影响产量，还严重影响小麦的加工品质。即使是表观上穗发芽不十分严重的小麦，其加工品质也会受到较大的影响。小麦穗发芽致使面粉干、湿面筋含量、沉降值及面团流变学特性显著降低，使面包或馒头发粘而缺乏弹性。在小麦穗发芽过程中，支链淀粉的含量下降，RVA参数降低，使面条韧性和弹性均下降。

小麦穗发芽在世界上很多国家和地区都有发生。我国穗发芽主要出现在长江流域、西南麦区、东北春麦区和黄淮麦区。2008年河北、北京等地发生了较为严重的小麦穗发芽，受灾面积达几十万亩，严重的已经丧失食用价值。2009年湖北、江苏等地小麦出现严重穗发芽现象。据农业部统计数据显示，湖北省襄樊市308万亩小麦穗发芽，占播种面积的80%，荆门市有59.1万亩小麦穗发芽，占播种面积的37.67%。

小麦穗发芽是受多基因控制的性状，品种的形态特征及生理生化性状（如种子休眠特性、种皮颜色、α-淀粉酶活性、颖壳抑制物、穗部结构等）都会对小麦穗发芽产生不同程度的影响，而籽粒休眠特性是影响穗发芽抗性的最主要因素。

小麦穗发芽因受环境等因素等的影响，同一品种在不同年份，不同生长地点所表现出的表型值可能会有较大的差异。分子标记辅助选择（marker assisted selectionMAS）是基于基因型的选择，不受外界环境因素的影响，被越来越广泛地应用于育种实践中。常用的分子标记类型有RFLP、AFLP、SSR等，但这些标记类型不能与目标基因共分离。功能标记（Functional marker）是一类基于基因特征序列开发的标记，与目标基因共分离，大大提高了选择的准确性，在MAS中有着广泛应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定小麦籽粒发芽性状的引物对以及相关分子标记。

本发明提供的特异引物对，由序列表的序列3所示的单链DNA片段和序列表的序列4所示的单链DNA片段组成。

本发明还提供了一种组合物，包括所述特异引物对和限制性内切酶PmlⅠ。所述组合物还可包括用于PCR扩增的常规试剂、用于限制性内切酶酶切的常规试剂和用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的常规试剂。

所述组合物的用途为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或（6）或（7）：（1）鉴定待测小麦携带等位基因TaSdr-B1a还是等位基因TaSdr-B1b；所述等位基因TaSdr-B1a如序列表的序列1所示；所述等位基因TaSdr-B1b如序列表的序列2所示；（2）辅助筛选携带所述等位基因TaSdr-B1a的小麦品种；（3）辅助筛选携带所述等位基因TaSdr-B1b的小麦品种；（4）辅助鉴定待测小麦的发芽指数；（5）辅助筛选具有低发芽指数的小麦品种；（6）辅助筛选具有高发芽指数的小麦品种；（7）辅助比较不同待测小麦品种的发芽指数

本发明还保护所述特异引物对或所述组合物的应用，为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或（6）或（7）：

（1）鉴定待测小麦携带所述等位基因TaSdr-B1a还是所述等位基因TaSdr-B1b；

（2）辅助筛选携带所述等位基因TaSdr-B1a的小麦品种；

（3）辅助筛选携带所述等位基因TaSdr-B1b的小麦品种；

（4）辅助鉴定待测小麦的发芽指数；

（5）辅助筛选具有低发芽指数的小麦品种；

（6）辅助筛选具有高发芽指数的小麦品种；

（7）辅助比较不同待测小麦品种的发芽指数。

应用所述组合物鉴定待测小麦携带等位基因TaSdr-B1a还是等位基因TaSdr-B1b的方法如下：以待测小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶PmlⅠ酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有650bp特征条带待测小麦携带所述等位基因TaSdr-B1a，如果酶切产物中具有766bp特征条带待测小麦携带所述等位基因TaSdr-B1b。

应用所述组合物辅助筛选携带等位基因TaSdr-B1a的小麦品种的方法如下：以待测小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶PmlⅠ酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有650bp特征条带待测小麦为候选的携带所述等位基因TaSdr-B1a的小麦品种，如果酶切产物中不具有650bp特征条带待测小麦为候选的不携带所述等位基因TaSdr-B1a的小麦品种。

应用所述组合物辅助筛选携带等位基因TaSdr-B1b的小麦品种的方法如下：以待测小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶PmlⅠ酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有766bp特征条带待测小麦为候选的携带所述等位基因TaSdr-B1b的小麦品种，如果酶切产物中不具有766bp特征条带待测小麦为候选的不携带所述等位基因TaSdr-B1b的小麦品种。

应用所述组合物辅助鉴定待测小麦的发芽指数的方法如下：以待测小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶PmlⅠ酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有650bp特征条带待测小麦的发芽指数疑似为38%以下，如果酶切产物中具有766bp特征条带待测小麦的发芽指数疑似为40%以上。

应用所述组合物辅助筛选具有低发芽指数的小麦品种的方法如下：以待测小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶PmlⅠ酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有650bp特征条带待测小麦为候选的具有低发芽指数的小麦品种，如果酶切产物中不具有650bp特征条带待测小麦为候选的不具有低发芽指数的小麦品种。

应用所述组合物辅助筛选具有高发芽指数的小麦品种的方法如下：以待测小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶PmlⅠ酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有766bp特征条带待测小麦为候选的具有高发芽指数的小麦品种，如果酶切产物中不具有766bp特征条带待测小麦为候选的不具有高发芽指数的小麦品种。

应用所述组合物辅助比较不同小麦品种的发芽指数的方法如下：分别以不同小麦品种的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶PmlⅠ酶切PCR扩增产物，酶切产物中具有650bp特征条带的小麦品种的发芽指数低于酶切产物中具有766bp特征条带的小麦品种的发芽指数。

本发明还保护一种与小麦发芽指数相关的分子标记，为以待测小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对扩增得到的DNA片段。所述分子标记具体可为分子标记甲或分子标记乙。所述分子标记甲如序列表的序列1自5’末端第71-896位核苷酸所示。所述分子标记乙如序列表的序列2自5’末端第71-896位核苷酸所示。

本发明还保护所述分子标记的应用，为如下（a）或（b）或（c）或（d）：

（a）辅助鉴定待测小麦的发芽指数；

（b）辅助筛选具有低发芽指数的小麦品种；

（c）辅助筛选具有高发芽指数的小麦品种；

（d）辅助比较不同待测小麦品种的发芽指数。

应用所述分子标记辅助鉴定待测小麦的发芽指数的方法如下：如果所述待测小麦基因组中具有所述分子标记甲，待测小麦的发芽指数疑似为38%以下，如果所述待测小麦基因组中具有所述分子标记乙，待测小麦的发芽指数疑似为40%以上。

应用所述分子标记辅助筛选具有低发芽指数的小麦品种的方法如下：如果所述待测小麦基因组中具有所述分子标记甲，待测小麦为候选的具有低发芽指数的小麦品种，如果所述待测小麦基因组中不具有所述分子标记甲，待测小麦为候选的不具有低发芽指数的小麦品种。

应用所述分子标记辅助筛选具有高发芽指数的小麦品种的方法如下：如果所述待测小麦基因组中具有所述分子标记乙，待测小麦为候选的具有高发芽指数的小麦品种，如果所述待测小麦基因组中不具有所述分子标记乙，待测小麦为候选的不具有高发芽指数的小麦品种。

应用所述分子标记辅助比较不同小麦品种的发芽指数的方法如下：如果所述待测小麦基因组中具有所述分子标记甲，将其命名为小麦品种甲；如果所述待测小麦基因组中具有所述分子标记乙，将其命名为小麦品种乙；小麦品种甲的发芽指数疑似小于所述小麦品种乙的发芽指数。

本发明还保护序列表的序列1所示的DNA分子（与小麦发芽指数相关的等位基因TaSdr-B1a）。

本发明还保护序列表的序列2所示的DNA分子（与小麦发芽指数相关的等位基因TaSdr-B1b）。

本发明还保护所述等位基因TaSdr-B1a和/或所述等位基因TaSdr-B1b的应用，为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）辅助鉴定待测小麦的发芽指数；（b）辅助筛选具有低发芽指数的小麦品种；（c）辅助筛选具有高发芽指数的小麦品种；（d）辅助比较不同待测小麦品种的发芽指数。

本发明还保护一种检测待测小麦携带所述等位基因TaSdr-B1a还是所述等位基因TaSdr-B1b的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶PmlⅠ酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有650bp特征条带待测小麦携带等位基因TaSdr-B1a，如果酶切产物中具有766bp特征条带待测小麦携带等位基因TaSdr-B1b。

本发明还保护所述方法的应用，为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）辅助鉴定待测小麦的发芽指数；（b）辅助筛选具有低发芽指数的小麦品种；（c）辅助筛选具有高发芽指数的小麦品种；（d）辅助比较不同待测小麦品种的发芽指数。

所述应用中，携带所述等位基因TaSdr-B1a的待测小麦为候选的具有低发芽指数的小麦品种。所述应用中，携带所述等位基因TaSdr-B1b的待测小麦为候选的具有高发芽指数的小麦品种。所述应用中，携带所述等位基因TaSdr-B1a的待测小麦品种的发芽指数小于携带所述等位基因TaSdr-B1b的待测小麦品种。

以上任一所述低发芽指数的含义为发芽指数为38%以下。

以上任一所述高发芽指数的含义为发芽指数为40%以上。

以上任一所述发芽指数为穗发芽指数或籽粒发芽指数。

本发明公开了普通小麦TaSdr基因及其等位变异序列TaSdr-B1a和TaSdr-B1b，并提供了鉴定TaSdr-B1a和TaSdr-B1b等位变异的功能标记Sdr2B及其与小麦发芽性状的相关关系。携带等位变异TaSdr-B1a的品种的发芽指数较低、穗发芽抗性较好，携带TaSdr-B1b的品种发芽指数较高、穗发芽抗性较差。将本发明中的功能标记运用于分子标记辅助选择，能快速筛选出具有较高籽粒休眠性的小麦品种（材料），从而加速抗穗发芽小麦新品种的育成步伐。本发明对于利用分子标记辅助选择抗穗发芽的小麦品种具有重要的理论意义和经济价值。

附图说明

图1为TaSdr-B1基因的两种等位变异形式的比对谱图。

图2为部分样本的PCR扩增产物的电泳图。

图3为部分样本的酶切产物的电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均可以从常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、等位基因的发现及引物对的开发

在对大量小麦品种进行序列分析的基础上，发现小麦TaSdr-B1基因，在小麦中TaSdr-B1基因存在的两种等位变异形式，一种如序列表的序列1所示（命名为等位基因TaSdr-B1a），另一种如序列表的序列2所示（命名为TaSdr-B1b）。TaSdr-B1基因的两种等位变异形式的比对谱图见图1，起始密码子和终止密码子以方框示出，加下滑线部分为编码区，阴影部分为序列多态位点。

基于TaSdr-B1基因的两种等位变异形式设计特异引物对如下：

上游引物（序列表的序列3）：5’-CGCCTACGTGTCGGCCC-3’；

下游引物（序列表的序列4）：5’-TCCGTGACGACCGCCGGG-3’。

实施例2、等位基因和引物对的应用

实验材料为对若干份中国冬小麦主推品种，具体见表1。

将各个实验材料分别进行如下步骤：

1、提取基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用实施例1设计的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增的反应体系：模板DNA约100ng，ExTaq酶（Takara，code：DRR100B）0.3μl，GC bufferⅠ25μl（Takara，code：DRR20GC I），dNTP（Takara，code：D4030RA，2.5mM each）4μl，上游引物和下游引物各6pmol，用无菌超纯水补充反应体系至50μl。

PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min、复性30s（第一次的复性温度为66℃，每个循环降温0.3℃）、72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min；10℃保温。

3、将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。各个小麦品种均显示约826bp的条带。部分样本的电泳图见图2。

4、回收步骤3中约826bp的目的条带，用限制性内切酶PmlⅠ(NEB，code：R0532S)酶切。

酶切反应条件：37℃酶切3h。

5、将步骤4的酶切产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，部分结果见图3。根据限制性内切酶PmlⅠ的酶切结果，步骤3的PCR扩增产物可以分为两种，第一种PCR扩增产物酶切得到60bp、116bp和650bp的酶切产物，第二种PCR扩增产物酶切得到60bp和766bp的酶切产物。

6、将步骤3的PCR扩增产物进行测序。测序结果表明，在步骤5中显示第一种酶切结果的PCR扩增产物均如序列表的序列1自5’末端第71-896位核苷酸所示，在步骤5中显示第二种酶切结果的PCR扩增产物均如序列表的序列2自5’末端第71-896位核苷酸所示。

实际应用中，为了便于观察，只根据酶切产物具有650bp的特异条带还是766bp的特异条带即可判断待测小麦携带等位基因TaSdr-B1a还是等位基因TaSdr-B1b。

根据以上结果，可以得出如下结论：以待测小麦的基因组DNA为模板，用实施例1设计的特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶PmlⅠ酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有650bp的片段，待测小麦携带等位基因TaSdr-B1a，如果酶切产物中具有766bp的片段，待测小麦携带等位基因TaSdr-B1b。

7、在河南安阳种植59个小麦品种，收获籽粒后检测籽粒的发芽指数（GerminationIndex）。检测籽粒的发芽指数的方法如下：培养皿中放置滤纸，将滤纸用无菌水浸润，然后将籽粒放到滤纸上，室温培养，每天调查发芽的籽粒数，连续调查7天，计算籽粒的发芽指数。通过籽粒的发芽指数表征穗发芽指数。

式中，n₁、n₂、…、n₇依次表示种子在第1d、第2d、…、第7d，每日当天的发芽粒数。total grains表示调查的籽粒总数。

进行三次重复实验，结果取平均值。结果见表1。

表1各个小麦品种的PCR扩增产物的酶切检测结果和发芽指数检测结果

表1中的各个小麦品种均可从中国农业科学院作物科学研究所种质资源库获得。

59个中国冬小麦品种中：27个品种携带等位基因TaSdr-B1a，发芽指数平均值为25.44%；32个品种携带等位基因TaSdr-B1b，发芽指数平均值为51.41%；携带等位基因TaSdr-B1a的小麦品种的发芽指数低于携带等位基因TaSdr-B1b的小麦品种的发芽指数，两者具有显著差异（P<0.01）。采用发芽指数≤38%作为低发芽指数标准，27个携带等位基因TaSdr-B1a的小麦品种中，22个为低发芽指数品种，即通过是否携带等位基因TaSdr-B1a辅助鉴定低发芽指数小麦的准确率为81%。采用发芽指数≥40%作为高发芽指数标准，32个携带等位基因TaSdr-B1b的小麦品种中，26个为高发芽指数品种，即通过是否携带等位基因TaSdr-B1b辅助鉴定高发芽指数小麦的准确率为81%。

8、在北京种植76个品种的小麦，收获籽粒后检测籽粒的发芽指数（GerminationIndex）。检测籽粒的发芽指数的方法同步骤7。

进行三次重复实验，结果取平均值。结果见表2。

表2各个小麦品种的PCR扩增产物的酶切检测结果和发芽指数检测结果

表2中的各个小麦品种均可从中国农业科学院作物科学研究所的国家种质资源库获得。

75个中国冬小麦品种中：31个品种携带等位基因TaSdr-B1a，发芽指数平均值为19.77%；44个品种携带等位基因TaSdr-B1b，发芽指数平均值为60.70%；携带等位基因TaSdr-B1a的小麦品种的发芽指数低于携带等位基因TaSdr-B1b的小麦品种的发芽指数，两者具有显著差异（P<0.01）。采用发芽指数≤38%作为低发芽指数标准，31个携带等位基因TaSdr-B1a的小麦品种中，25个为低发芽指数品种，即通过是否携带等位基因TaSdr-B1a辅助鉴定低发芽指数小麦的准确率为81%。采用发芽指数≥40%作为高发芽指数标准，44个携带等位基因TaSdr-B1b的小麦品种中，31个为高发芽指数品种，即通过是否携带等位基因TaSdr-B1b辅助鉴定高发芽指数小麦的准确率为70.45%。

Claims (8)

1.特异引物对，由序列表的序列3所示的单链DNA片段和序列表的序列4所示的单链DNA片段组成。

2.一种组合物，包括权利要求1所述特异引物对和限制性内切酶PmlⅠ。

3.权利要求1所述特异引物对或权利要求2所述组合物的应用，为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或（6）或（7）：

（1）鉴定待测小麦携带等位基因TaSdr-B1a还是等位基因TaSdr-B1b；所述等位基因TaSdr-B1a如序列表的序列1所示；所述等位基因TaSdr-B1b如序列表的序列2所示；

（2）辅助筛选携带等位基因TaSdr-B1a的小麦品种；所述等位基因TaSdr-B1a如序列表的序列1所示；

（3）辅助筛选携带等位基因TaSdr-B1b的小麦品种；所述等位基因TaSdr-B1b如序列表的序列2所示；

（4）辅助鉴定待测小麦的发芽指数；

（5）辅助筛选具有低发芽指数的小麦品种；所述低发芽指数的含义为发芽指数为38%以下；

（6）辅助筛选具有高发芽指数的小麦品种；所述高发芽指数的含义为发芽指数为40%以上；

（7）辅助比较不同待测小麦品种的发芽指数。

4.序列表的序列1所示的DNA分子。

5.序列表的序列2所示的DNA分子。

6.等位基因TaSdr-B1a和/或等位基因TaSdr-B1b的应用，为如下（a）或（b）或（c）或（d）：

（a）辅助鉴定待测小麦的发芽指数；

（b）辅助筛选具有低发芽指数的小麦品种；所述低发芽指数的含义为发芽指数为38%以下；

（c）辅助筛选具有高发芽指数的小麦品种；所述高发芽指数的含义为发芽指数为40%以上；

（d）辅助比较不同待测小麦品种的发芽指数；

所述等位基因TaSdr-B1a如序列表的序列1所示；所述等位基因TaSdr-B1b如序列表的序列2所示。

7.一种检测待测小麦携带等位基因TaSdr-B1a还是等位基因TaSdr-B1b的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶PmlⅠ酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有650bp特征条带待测小麦携带等位基因TaSdr-B1a，如果酶切产物中具有766bp特征条带待测小麦携带等位基因TaSdr-B1b；

所述等位基因TaSdr-B1a如序列表的序列1所示；所述等位基因TaSdr-B1b如序列表的序列2所示。

8.权利要求7所述方法的应用，为如下（a）或（b）或（c）或（d）：

（a）辅助鉴定待测小麦的发芽指数；

（b）辅助筛选具有低发芽指数的小麦品种；所述低发芽指数的含义为发芽指数为38%以下；

（c）辅助筛选具有高发芽指数的小麦品种；所述高发芽指数的含义为发芽指数为40%以上；

（d）辅助比较不同待测小麦品种的发芽指数。