CN105613255B - 一种优良食味、抗稻瘟病水稻品种的聚合育种方法 - Google Patents

一种优良食味、抗稻瘟病水稻品种的聚合育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种优良食味、抗稻瘟病水稻品种的聚合育种方法，选用武粳13与关东194杂交配组；再利用F1与武粳15复交，F2和F3代单株混收，并对其进行暗胚乳突变基因和抗稻瘟病基因的分子标记辅助选择，获得暗胚乳突变基因型为Wx‑mqWx‑mq、稻瘟病抗性基因型为Pi‑taPi‑ta 和Pi‑bPi‑b的三基因纯合体；后续世代经产量与农艺性状选择，至F7代选育出农艺性状稳定一致、优良食味、抗稻瘟病的高产水稻。该水稻不仅产量高，抗水稻稻瘟病、条纹叶枯病，综合了糯米的柔性和粳米的弹性，食味品质极佳，在江苏省淮北和苏中地区中上等肥力条件下种植，具有广阔的应用前景。

Description

一种优良食味、抗稻瘟病水稻品种的聚合育种方法
技术领域
本发明属水稻遗传改良与生物技术应用领域，涉及一种优良食味、抗稻瘟病水稻品种的聚合育种方法。
背景技术
20世纪末，我国开始重视发展优质稻，优质成为全国粳稻育种的首要目标(王才林等，江苏农业学报，2008，24(2):199-203)。但当时育种工作者主要重视外观品质的改良，而在食味品质改良方面的进展不大。以江苏水稻品种为例，2001-2009年，共培育国标三级以上的优质粳稻新品种(组合)89个。但多数品种的食味品质不能满足消费者的需求，缺乏在国内外市场上具有竞争力的优质品种。随着我国国民经济的发展和生活质量的提高，优良食味稻米开始展现出广阔的市场前景，受到越来越多消费者的青睐。以日本优质大米“越光”和“一见钟情”为例，其价格为普通大米的数倍，但市场仍供不应求(巩迎军等，中国农学通报，2008，24(12):96-101)。因此，培育食味品质优良的水稻品种来满足日益增长的市场需求，已成为当前水稻品质育种一个重要的研究方向(朱昌兰等，中国农业科学，2004，3(2):81-88)。
已有研究表明，淀粉中直链淀粉的相对含量是决定米饭质地和食味的重要因素之一。直链淀粉含量低，米饭粘软，外观油润，有光泽，冷不回生，适口性好；反之，则米饭质地硬，粘性小，蓬松干燥，光泽差(松尾孝嶺,稲学大成:第三巻遺伝篇,東京:農山漁村文化協会,1990:351-354；櫛渕欽也,日本の稲育種―スーパーライスへの挑戦,東京,農業技術協会,1992:125-135)。低直链淀粉含量基因是进行低直链淀粉水稻品种选育的重要遗传资源，目前已知水稻中可供育种利用低直链淀粉含量突变基因有14个，它们大多由一对隐性基因控制，且主要分布于水稻第6、9、10和12染色体上(Wang et al.,分子植物育种,2009,7(6):1070-1076)。其中Wx-mq暗胚乳突变基因是水稻低直链淀粉突变基因一个重要类型，它是通过化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)处理日本水稻品种越光，而获得的低直链淀粉含量变异基因。该基因在腊质基因(Wx)编码区发生了两个碱基的替换，进而影响Wx蛋白的活性，造成其直链淀粉含量的降低，随着直链淀粉含量的降低，携带该基因变异位点的水稻品种其胚乳外观呈现云雾状、乳白色，透明度略差等暗胚乳的特性，故称为暗胚乳突变基因(Sato H,et al.Breeding Sci,2002,52(2):131-135)。含有该基因的水稻品种其直链淀粉含量介于黏稻和糯稻之间，俗称为半糯突变体。其胚乳外观呈半透明、云雾状，米饭质地粘软，表面光泽透亮，综合了糯米的柔性和粳米的弹性，冷饭不硬，食味品质极佳，具有较高的商品性(王才林等，中国水稻科学，2009，3(1):25-30)。
利用含该基因变异位点的水稻资源，各国育种家培育了大量直链淀粉含量较低，食味品质优良的水稻品种，如“New-hikari”、“Joiku 436”和“南粳46”等(Tomit K,et al.,Bull Fukui Agr Exp Sta Series,2007,44:1-20；Sato H,et al.,Breeding Sci,2002,52(2):131-135；王才林等,中国水稻科学，2009，23(1)：25-30)。其中“南粳46”是江苏省第一个通过审定的暗胚乳、低直链淀粉水稻品种，该品种米饭晶莹剔透，口感柔软润滑，富有弹性，冷而不硬，食味品质极佳，先后获得江苏省粳稻优质米食味品评第一名、全国优质粳稻优良食味品评优秀奖、全国“优质食味粳米”及第九届中国优质稻米交易博览会“金奖大米”称号，其食味品质已接近或超过日本优质稻米“越光”，被誉为“江苏最好吃大米”(王才林等，中国水稻科学，2009，23(1):25-30)。
然而，在注重水稻食味品质提高的同时，还必须兼顾地区性重大病害的抗性改良。稻瘟病由子囊真菌(Magnaporthe grisea)引起，是影响水稻高产稳产最为严重的病害之一，发病严重时甚至颗粒无收。其危害面积和危害程度较大已成为水稻高产稳产的严重阻碍。据研究统计，稻瘟病使全球每年水稻产量损失大概占总产量的10％-15％，造成经济损失达数10亿美元(徐未未等，江苏农业学报，2013，29(4)：898-906)。稻瘟病在水稻的各生育期均能发生，但以穗颈瘟对水稻产量影响最大。稻瘟病广泛分布于全世界各稻区(时克等，植物遗传资源学报，2009,10(1):21-26)，我国是稻瘟病的重灾区，20世纪90年代以来，稻瘟病在我国西南、长江中游和东北等稻区持续大流行，年均发生面积在330～570万公顷，大爆发年份可达800万公顷左右，直接威胁到国家粮食安全(柳武革等，作物学报，2008，34(7)：1128-1136)。江苏是我国水稻主产省，水稻种植面积3400万亩左右，其中粳稻的种植面积占全省水稻种植面积的90％。稻瘟病特别是穗颈瘟是江苏粳稻的主要病害之一。2014年，受极端气候、品种抗性、栽培措施和防控效果等因素影响，稻瘟病在我国局部稻区突发流行。据统计，全国发病面积513.6万hm2，造成实际损失55.8万t，是2006年以来发生程度最重的1年。其中，在长江中下游稻区是近20年发病最重的1年。发生面积超过40万hm2且实际损失超过5.5万t的省份集中在我国长江中下游稻区，包括江苏、安徽、湖北3省。这3个省份稻瘟病发病面积总计220.9万hm2，占全国发病面积的43.0％，比常年均值高88.1％；造成的实际损失总计24万t，占全国实际损失的43.0％，是常年均值的4.1倍，发生面积之大、发生程度之重均为历年罕见(陆明红等，中国植保导刊，2014，6：35-39)。
长期以来，化学药剂是防治水稻稻瘟病的一项重要措施，一旦错过最佳防治时间，植株染病后就没有十分有效的防治措施，所以其效果是有限的；而且化学药剂的使用不可避免的对环境造成严重的污染和破坏。利用水稻品种抗性被认为是防治稻瘟病最经济、有效的手段。
随着分子生物学技术的迅速发展，迄今已有50多个主效抗稻瘟病基因被精细定位，其中24个基因被克隆(Chun Zhai,et al.New Phytologist,2010：1-14；Hayashi N,etal.Plant J,2010,64(3):498-510；Okuyama Y,et al.Plant J,2011,66:467-479；Yuan B,et al.Theor Appl Genet,20l1,122:1017-1028；T akahashi A,et al.BMC Plant Biol,2010，10:175)。Pi-ta和Pi-b是最早被克隆的2个主效抗稻瘟病基因(Wang Z X,etal.Plant J,1999,19:55-64；Bryan G T,et al.The Plant Cell,2000,12:2033-2045)。近期，源于这2个基因及其等位感病位点的功能标记也已被开发出来，可以快速、准确地从水稻种质资源中鉴定出抗性基因Pi-ta和Pi-b(Wang Z,et al.Plant Breeding,2007,126:36-42；刘洋等，中国农业科学，2008,41(1):9-l4)。李进斌等利用抗性基因Pi-ta和Pi-b特异性分子标记分析了云南地方稻种的2个基因的分布(李进斌等，中国水稻科学，2012,26(5):593-599)；刘华招等和时克等同样利用这2个特异性分子标记分别对黑龙江省主推的水稻品种和我国水稻主栽品种进行抗性基因Pi-ta和Pi-b鉴定分析(刘华招等，东北农业大学学报，2011,42(41):27-31；时克等，植物遗传资源学报，Journal of Plant GeneticResources)。
综上所述，培育适应我国长江中下游适宜地区种植的优良食味、抗稻瘟病水稻品种，对满足城乡居民对优质稻米日益增长的消费需求以及解决稻瘟病对该地区水稻生产的严重威胁具有重要意义。优良食味、抗稻瘟病水稻品种的选育，传统做法是利用含优良食味和抗稻瘟基因的水稻与高产品种进行一系列的杂交，并根据目标性状的表型进行选择，最终获得既具有优良食味特性，又抗稻瘟病的水稻品种。然而，这种方法在后代选育过程中不仅会受到植株生长发育阶段、环境条件等因素的影响，而且在多个优良性状的基因聚合方面也存在诸多问题，费时费力，所需要的育种年限较长。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种优良食味、抗稻瘟病水稻品种的聚合育种方法，采用高效转育和选择鉴定暗胚乳突变基因和稻瘟病抗性基因，选育出优质、抗病、高产基因于一体的水稻品种。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种优良食味、抗稻瘟病病水稻品种的聚合育种方法，包括以下步骤：
1)选用Wx位点上基因型为Wx-bWx-b，稻瘟病感病基因型为Pi-bPi-b的江苏高产粳稻品种武粳13为母本♀与具有暗胚乳突变基因，暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，稻瘟病感病基因型为pi-tapi-ta和pi-bpi-b的日本优质粳稻品种关东194为父本♂杂交配组，获得第一代种子；
2)利用第一代种子与高抗稻瘟病品种武粳15复交，种植F1、F2、F3，成熟后全部单株混收；武粳15的稻瘟病感病基因型为Pi-taPi-ta和Pi-bPi-b，其中Wx-mq、pi-ta、pi-b相对于Wx-b、Pi-ta、Pi-b为隐性遗传；
3)F2代开始进行水稻暗胚乳突变基因和稻瘟病抗性基因的分子标记辅助选择，苗期各单株DNA的提取采用SDS法，扩增水稻品种的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，选择具有439bp和292bp两条特征条带的Wx-mq基因纯合体单株备用，分别选择具有1024bp和365bp特征条带的含Pi-ta、Pi-b基因纯合体单株备用；
4)将F2代中同时含有Wx-mq基因纯合体和Pi-ta、Pi-b基因的纯合体和杂合体单株分别种成F3小区，利用分子标记对稻瘟病免疫或高抗的小区继续进行检测，选择所有单株均同时具有439bp、292bp、1024bp和365bp特征条带的小区，于F7获得优良食味、抗稻瘟病水稻品种。
步骤3)中，水稻暗胚乳突变基因Wx-mq的分子检测，采用的四引物PCR标记引物为：正向外引物Wx-mq-O-F序列为5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'，反向外引物Wx-mq-O-R序列为5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'，正向内引物Wx-mq-I-F序列为5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'，反向内引物Wx-mq-I-R序列为5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'。
步骤3)中，水稻暗胚乳突变基因Wx-mq具有439bp和292bp两条特征条带。
步骤3)中，稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b的分子检测，采用多重PCR分子标记引物；对抗病基因Pi-ta进行检测所采用的引物包括：正向引物：5'-AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3'和反向引物：5'-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3'；对抗病基因Pi-b进行检测所采用的引物包括：正向引物：5'-GAACAATGCCCAAACTTGAG-3'和反向引物：5'-GGGTCCACATGTCAGTGAGC-3'。
步骤4)中，在同时含有Wx-mq和Pi-ta、Pi-b基因的纯合体的小区内选择株高90～100cm、每株8～10穗、每穗140～150粒的单株加代稳定，于F7代获得农艺性状稳定一致的优良食味、抗稻瘟病水稻新品。
步骤4)中，所述稻瘟病免疫或高抗的小区指的是稻瘟病感病率低于5％的小区。
有益效果：与现有技术相比，本发明的聚合育种方法，具有以下优点：
1)本发明方法中涉及辅助选择的分子标记均为PCR标记，由于不涉及DNA测序、限制性内切酶等的使用，因此不存在操作烦琐，费用昂贵等弊端，更为高效、快捷，不仅可以在育种世代中快速鉴定出含暗胚乳突变基因Wx-mq和稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b纯合体的水稻植株，而且准确度高，极大的提高了选择效率，简化育种程序，缩短育种年限。
2)本发明所获得的优良食味、抗稻瘟病水稻新品，其暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，稻瘟病抗性基因型为Pi-taPi-ta和Pi-bPi-b；与亲本之一关东194相比，农艺性状有了显著改善。株高95～100cm，基部节间粗短，叶片厚直，叶色较深，茎秆坚韧有弹性，耐肥抗倒；分蘖性好，每株8～10穗；穗层整齐；半直立穗且穗型较大，平均穗长15～16cm，每穗总粒数140～150粒，结实率90％～94％，千粒重24～26g。其胚乳呈暗胚乳特性，外观云雾状、乳白色，米饭质地粘软，表面光泽透亮，综合了糯米的柔性和粳米的弹性，冷饭不硬，食味品质极佳。
3)本发明获得的水稻新品杂交亲本双方的优良食味、抗稻瘟病、抗条纹叶枯病、高产等特性，在江苏省淮北和苏中地区中上等肥力条件下种植，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是武粳13/关东194//武粳15F2群体单株暗胚乳突变基因Wx-mq的分子检测结果图，图中，M：DL2000；1：关东194；2：武粳15；3-24：F2群体的部分单株；
图2是武粳13/关东194//武粳15F2群体单株稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的分子检测结果图，图中，M：DL2000；1：关东194；2：武粳15；3-24：F2群体的部分单株；
图3是武粳13/关东194//武粳15F6三基因纯合小区暗胚乳突变基因Wx-mq的分子检测结果图，图中，M：DL2000；1：关东194；2：武粳15；3-24：三基因纯合小区的部分单株；
图4是武粳13/关东194//武粳15F6三基因纯合小区稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的分子检测结果图，图中，M：DL2000；1：关东194；2：武粳15；3-24：三基因纯合小区的部分单株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种优良食味、稻瘟病水稻品种的聚合育种方法，包括以下步骤：
1)选择亲本：关东194，优良食味、抗条纹叶枯病优质粳稻品种(日本引进)，日本茨城县育成，2003年农林水产省登录，登录名为农林387号。优良食味，暗胚乳基因型为Wx-mqWx-mq，稻瘟病基因型pi-tapi-ta、pi-bpi-b。该品种全生育期130～135天，株高85～95cm，每株有效穗6～8个，每穗实粒数100～110粒，结实率93％～95％，千粒重24～25g。
武粳13(原名武育5021)，江苏高产粳稻品种，江苏省常州市武进区稻麦育种场育成，2003年审定定名。Wx位点上基因型为wx-bwx-b，稻瘟病基因型Pi-bPi-b。该品种全生育期156天，株高97～102cm，每株有效穗8～10个，每穗实粒数115～125粒，结实率92％～93％，千粒重27～28g。
武粳15(原名武育5356)，江苏高抗稻瘟病粳稻品种，江苏省常州市武进区稻麦育种场育成，2004年审定定名。Wx位点上基因型为wx-bwx-b，稻瘟病基因型Pi-taPi-ta和Pi-bPi-b。生育期157天左右，株高约100cm，每穗实粒数128～130，结实率94％，千粒重27～28g。
以上三个品种均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为：(钱金敖等，优质水稻新品种——武粳13，江苏农业科学，2005，4：305；http://ineweb.narcc.affrc.go.jp/；严彩明，上海农业科技，2006，6：43)。
2)品种选育：2008年选用Wx位点上基因型为Wx-bWx-b，稻瘟病抗性基因型为Pi-bPi-b的江苏高产粳稻品种武粳13为母本♀与具有暗胚乳突变基因和稻瘟病感病基因，暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，稻瘟病感病基因型为pi-tapi-ta和pi-bpi-b的日本优质粳稻品种关东194为父本♂杂交配组，其中Wx-mq、pi-ta和pi-b相对于Wx-b、Pi-ta和Pi-b为隐性遗传，2008年在海南种植第一代种子，并利用第一代种子与高抗稻瘟病品种武粳15杂交，2009年在南京种植F1，同年冬季在海南种植F2，成熟后混收种子，根据分子标记辅助育种的结果选择目的单株。2011年在南京种植F4，根据分子标记辅助育种的结果以及农艺性状的表现在个别小区内继续选择单株。选单株2013年在南京种成小区(F6)，表现稳定一致、抗稻瘟病、综合丰产性好，成熟后混收，进行食味品质筛选。2014年分别在南京和张家港进行大区鉴定(F7)，其中小区JD2728的品质、抗病性、产量等综合性状表现优良，折合产量620kg/667m2，特别是食味品质优良，抗稻瘟病。
3)分子标记辅助选择：F2代开始进行水稻暗胚乳突变基因和稻瘟病抗性基因的分子标记辅助选择，苗期各单株DNA的提取采用SDS法，具体步骤为：取水稻苗期叶片，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入1.5mL离心管；加入600μL提取液(20％SDS，1M Tris-HCl，0.5M EDTA，5M NaCl，65℃预热)，摇匀，65℃温浴30min，中间振荡3～4次；加入1/4体积5MKAC，摇匀后置冰上30min；加入氯仿-异戊醇(24:1)300～400μL，在摇床上充分振荡，120rpm，30min；8000～10000rpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清(400μL左右)至另一离心管；加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，摇床上充分振荡，80～90rpm，30min；8000rpm离心15分钟，转移上清(400μL左右)至新的离心管；加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12000rpm离心6min；弃无水乙醇，加入4℃70％乙醇，放置10min，弃上清，超净工作台上风干1h；加入100～200μL TE，-20℃保存。
暗胚乳突变基因Wx-mq的分子检测，利用四引物PCR标记引物：正向外引物(Wx-mq-O-F)序列为：5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'；反向外引物(Wx-mq-O-R)序列为：5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'；正向内引物(Wx-mq-I-F)序列为：5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'；反向内引物(Wx-mq-I-R)序列为：5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'。
扩增水稻品种的基因组DNA，20μL PCR反应体系包括：10ng/μL的DNA 2.0μL，4pmol/μL的引物2.0μL，其中引物Wx-mq-O-F、Wx-mq-O-R、Wx-mq-I-F和Wx-mq-I-R各0.5μL，含25mmol/L MgCl2的10×PCR Buffer 2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 0.4μL，5U/μL的Taq 0.5μL和ddH2O 13.1μL；PCR反应程序包括：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、65℃复性30s、72℃延伸1min，循环35次；然后72℃延伸7min，10℃冷却10min后，将扩增产物加缓冲液终止反应。产物在质量比浓度为1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察，选择具有439bp和292bp两条特征条带的Wx-mq基因纯合体单株。
稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b的分子检测，利用多重PCR分子标记引物：对抗病基因Pi-ta(扩增产物大小为1024bp)进行检测所采用的引物：正向引物：5'-AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3'，反向引物：5'-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3'。对抗病基因Pi-b(扩增产物大小为365bp)进行检测所采用的引物：正向引物：5'-GAACAATGCCCAAACTTGAG-3'，反向引物：5'-GGGTCCACATGTCAGTGAGC-3'。
扩增水稻品种的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，分别选择具有1024bp和365bp特征条带的含Pi-ta、Pi-b基因纯合体或杂合体单株；抗病20μL PCR反应体系包括：10ng/μL的DNA 2.0μL，4pmol/μL的引物2.0μL，其中引物Pi-ta-F、Pi-ta-R、Pi-b-F和Pi-b-R各0.5μL，含25mmol/L MgCl2的10×PCR Buffer 2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 0.4μL，5U/μL的Taq 0.5μL和ddH2O 13.1μL；PCR反应程序包括：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、63℃复性1min、72℃延伸1min，循环35次；然后72℃延伸7min，10℃冷却10min后，将扩增产物加缓冲液终止反应。产物在质量比浓度为1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察，选择同时具有1024bp和365bp特征条带的含的含Pi-ta、Pi-b基因纯合体或杂合体单株。
结果如图1-图4所示。
将F2代中同时含有Wx-mq基因纯合体(439bp和292bp两条特征条带)和Pi-ta、Pi-b基因的纯合体或杂合体(1024bp和365bp特征条带)的单株分别种成F3小区，每个小区种植48株，4行区，行株距17cm×17cm，小区间空1行，田间管理按常规方法进行。稻瘟病采用人工接种法，每个小区每个小种接种5个穗子，并作好相应标记，每穗不能重复接种不同的生理小种。接种后40～50天，黄熟初期，分小区和小种收获接种的穗子，调查总穗数以及病穗数，按照发病百分率记载病情。调查穗颈瘟评价标准参照江苏省农科院植保所稻瘟病鉴定标准(罗楚平等，江苏农业科学，2009，(6)：178-179)。统计分类时，按Hayashi等(2009)的标准稍加调整，将0～2级定为抗病(R)，3～4级定为感病(S)。详见表1。将抗病品系占接种水稻品系的百分数定义为抗病率，反之，感病品系占接种水稻品系的百分数称为感病率。即：
抗病率(％)＝(抗性级别为0～2的水稻品系数/接种的水稻品系数)×100％；
感病率(％)＝(抗性级别为3～4的水稻品系数/接种的水稻品系数)×100％。
表1.稻瘟病穗颈瘟分级标准
根据鉴定结果，选择对稻瘟病免疫或高抗的小区(稻瘟病感病率低于5％)，利用上述分子标记继续进行检测，选择所有单株均具有暗胚乳突变基因(439bp和292bp特征条带)以及稻瘟病抗性基因(1024bp和365bp特征条带)的小区即为同时含有Pi-ta、Pi-b和Wx-mq基因的纯合体或杂合体；
在上述三基因纯合的小区内选择株高90～100cm、每株8～10穗、每穗140～150粒的单株加代稳定，于F7代获得农艺性状稳定一致的优良食味、抗稻瘟病水稻，其暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，稻瘟病抗性基因型为Pi-taPi-ta和Pi-bPi-b，株高95～100cm，每株8～10穗，平均穗长15～16cm，半直立穗型，每穗总粒数140～150粒，结实率90％～94％，千粒重24～26g。该品种不仅抗水稻稻瘟病，而且胚乳呈暗胚乳特性，外观云雾状、乳白色，米饭质地粘软，表面光泽透亮，综合了糯米的柔性和粳米的弹性，冷饭不硬，食味品质极佳。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种优良食味、抗稻瘟病水稻品种的聚合育种方法
<130> 100
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向外引物（Wx-mq-O-F）序列
<400> 1
atgttgtgtt cttgtgttct ttgcaggc 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向外引物（Wx-mq-O-R）序列
<400> 2
gtagatcttc tcaccggtct ttccccaa 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向内引物（Wx-mq-I-F）序列
<400> 3
gggtgaggtt tttccattgc tacaatcg 28
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向内引物（Wx-mq-I-R）序列
<400> 4
gtcgatgaac acacggtcga ctcaat 26
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物
<400> 5
agcaggttat aagctaggcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向引物
<400> 6
ctaccaacaa gttcatcaaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物
<400> 7
gaacaatgcc caaacttgag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向引物
<400> 8
gggtccacat gtcagtgagc 20

Claims (4)

1.一种优良食味、抗稻瘟病病水稻品种的聚合育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)选用Wx位点上基因型为Wx-bWx-b，稻瘟病感病基因型为Pi-bPi-b的江苏高产粳稻品种武粳13为母本♀与具有暗胚乳突变基因，暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，稻瘟病感病基因型为pi-tapi-ta和pi-bpi-b的日本优质粳稻品种关东194为父本♂杂交配组，获得第一代种子；
2)利用第一代种子与高抗稻瘟病品种武粳15复交，种植F1、F2、F3，成熟后全部单株混收；武粳15的稻瘟病感病基因型为Pi-taPi-ta和Pi-bPi-b，其中Wx-mq、pi-ta、pi-b相对于Wx-b、Pi-ta、Pi-b为隐性遗传；
3)F2代开始进行水稻暗胚乳突变基因和稻瘟病抗性基因的分子标记辅助选择，苗期各单株DNA的提取采用SDS法，扩增水稻品种的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，选择具有439bp和292bp两条特征条带的Wx-mq基因纯合体单株备用，分别选择具有1024bp和365bp特征条带的含Pi-ta、Pi-b基因纯合体单株备用；
4)将F2代中同时含有Wx-mq基因纯合体和Pi-ta、Pi-b基因的纯合体和杂合体单株分别种成F3小区，利用分子标记对稻瘟病免疫或高抗的小区继续进行检测，选择所有单株均同时具有439bp、292bp、1024bp和365bp特征条带的小区，于F7获得优良食味、抗稻瘟病水稻品种；
步骤3)中，水稻暗胚乳突变基因Wx-mq的分子检测，采用的四引物PCR标记引物为：正向外引物Wx-mq-O-F序列为5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'，反向外引物Wx-mq-O-R序列为5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'，正向内引物Wx-mq-I-F序列为5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'，反向内引物Wx-mq-I-R序列为5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'；
步骤3)中，稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b的分子检测，采用多重PCR分子标记引物；对抗病基因Pi-ta进行检测所采用的引物包括：正向引物：5'-AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3'和反向引物：5'-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3'；对抗病基因Pi-b进行检测所采用的引物包括：正向引物：5'-GAACAATGCCCAAACTTGAG-3'和反向引物：5'-GGGTCCACATGTCAGTGAGC-3'。
2.根据权利要求1所述的优良食味、抗稻瘟病病水稻品种的聚合育种方法，其特征在于：步骤3)中，水稻暗胚乳突变基因Wx-mq具有439bp和292bp两条特征条带。
3.根据权利要求1所述的优良食味、抗稻瘟病病水稻品种的聚合育种方法，其特征在于：步骤4)中，在同时含有Wx-mq和Pi-ta、Pi-b基因的纯合体的小区内选择株高90～100cm、每株8～10穗、每穗140～150粒的单株加代稳定，于F7代获得农艺性状稳定一致的优良食味、抗稻瘟病水稻新品。
4.根据权利要求1所述的优良食味、抗稻瘟病病水稻品种的聚合育种方法，其特征在于：步骤4)中，所述稻瘟病免疫或高抗的小区指的是稻瘟病感病率低于5％的小区。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

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Assignee: JIANGSU DAFENG HUAFENG SEED Co.,Ltd.

Assignor: JIANGSU ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2020980000753

Denomination of invention: Pyramiding breeding method for rice blast resisting rice variety with excellent taste

Granted publication date: 20171226

License type: Exclusive License

Record date: 20200316

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