CN102172216B - 一种培育优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种的育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种培育优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种的育种方法，属水稻遗传改良与生物技术应用领域。选用武粳13与关东194杂交配组；F₂和F₃代单株混收，F₄代和F₅代进行暗胚乳突变基因和抗条纹叶枯病基因的分子标记辅助选择，获得暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq、条纹叶枯病抗性基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 的双基因纯合体；后续世代经产量与农艺性状选择，至F₇代选育出农艺性状稳定一致、优良食味、抗条纹叶枯病的高产水稻新品种南粳5055。该品种不仅产量高，抗水稻条纹叶枯病，综合了糯米的柔性和粳米的弹性，食味品质极佳，在江苏沿江和苏南适宜种植区具有广阔的应用前景。

Description

一种培育优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种的育种方法

一、技术领域

本发明涉及一种培育优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种的育种方法，属水稻遗传改良与生物技术应用领域。

二、背景技术

20世纪末，我国开始重视发展优质稻，优质成为全国粳稻育种的首要目标（王才林等，江苏农业学报, 2008, 24(2):199-203）。但当时育种工作者主要重视外观品质的改良，而在食味品质改良方面的进展不大。以江苏水稻品种为例，2001-2009年，共培育国标三级以上的优质粳稻新品种（组合）89个。但多数品种的食味品质不能满足消费者的需求，缺乏在国内外市场上具有竞争力的优质品种。随着我国国民经济的发展和生活质量的提高，优良食味稻米开始展现出广阔的市场前景，受到越来越多消费者的青睐。以日本优质大米“越光”和“一见钟情”为例，其价格为普通大米的数倍，但市场仍供不应求（巩迎军等, 中国农学通报, 2008, 24(12): 96-101）。因此，培育食味品质优良的水稻品种来满足日益增长的市场需求，已成为当前水稻品质育种一个重要的研究方向（朱昌兰等, 中国农业科学, 2004, 3(2): 81-88）。

已有研究表明，淀粉中直链淀粉的相对含量是决定米饭质地和食味的重要因素之一。直链淀粉含量低，米饭粘软，外观油润，有光泽，冷不回生，适口性好；反之，则米饭质地硬，粘性小，蓬松干燥，光泽差（松尾孝嶺, 稲学大成: 第三巻　遺伝篇, 東京: 農山漁村文化協会, 1990: 351-354; 櫛渕欽也, 日本の稲育種―スーパーライスへの挑戦, 東京, 農業技術協会, 1992: 125-135）。低直链淀粉含量基因是进行低直链淀粉水稻品种选育的重要遗传资源，目前已知水稻中可供育种利用低直链淀粉含量突变基因有14个，它们大多由一对隐性基因控制，且主要分布于水稻第6、9、10和12染色体上（Wang et al., 分子植物育种, 2009, 7(6): 1070-1076）。其中Wx-mq暗胚乳突变基因是水稻低直链淀粉突变基因一个重要类型，它是通过化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）处理日本水稻品种越光，而获得的低直链淀粉含量变异基因。该基因在腊质基因（Wx）编码区发生了两个碱基的替换，进而影响Wx蛋白的活性，造成其直链淀粉含量的降低，随着直链淀粉含量的降低，携带该基因变异位点的水稻品种其胚乳外观呈现云雾状、乳白色，透明度略差等暗胚乳的特性，故称为暗胚乳突变基因（Sato H, et al. Breeding Sci, 2002, 52(2):131-135）。含有该基因的水稻品种其直链淀粉含量介于黏稻和糯稻之间，俗称为半糯突变体。其胚乳外观呈半透明、云雾状，米饭质地粘软，表面光泽透亮，综合了糯米的柔性和粳米的弹性，冷饭不硬，食味品质极佳，具有较高的商品性（王才林等, 中国水稻科学, 2009, 23(1): 25-30）。

利用含该基因变异位点的水稻资源，各国育种家培育了大量直链淀粉含量较低，食味品质优良的水稻品种，如“New-hikari”、“Joiku 436”和“南粳46”等（Tomit K, et al., Bull Fukui Agr Exp Sta Series, 2007, 44: 1-20; Sato H, et al., Breeding Sci, 2002, 52(2): 131-135; 王才林等, 中国水稻科学，2009，23(1)：25-30）。其中“南粳46”是江苏省第一个通过审定的暗胚乳、低直链淀粉水稻品种，该品种米饭晶莹剔透，口感柔软润滑，富有弹性，冷而不硬，食味品质极佳，先后获得江苏省粳稻优质米食味品评第一名、全国优质粳稻优良食味品评优秀奖、全国“优质食味粳米” 以及第九届中国优质稻米交易博览会“金奖大米”的称号，其食味品质已接近日本优质稻米“越光”，被誉为“江苏最好吃大米”（王才林等, 中国水稻科学, 2009, 23(1): 25-30）。

然而，在注重水稻食味品质提高的同时，还必须兼顾地区性重大病害的抗性改良。水稻条纹叶枯病（Rice stripe disease）是由灰飞虱传播的条纹叶枯病毒（Rice stripe virus，RSV）引起的水稻病毒病。条纹叶枯病株心叶沿叶脉呈现断续的黄绿色或黄白色短条斑，以后常连成宽的褪绿条斑，严时呈现“假枯心”或“假白穗”，造成畸形不实而减产（陈涛等, 2006, 2: 1-2）。1998年以来，条纹叶枯病在江苏省的发生呈猛烈上升的趋势，2000 年水稻条纹叶枯病首次在江苏省苏北地区暴发，至2010 年已连续11年在江苏省内流行，造成严重的产量损失（王才林, 江苏农业科学, 2006, 3: 1-5）。近年来，该病逐渐向周边省市蔓延。据初步统计，苏、浙、沪、皖等地水稻条纹叶枯病的年受害面积在3000万亩以上，其中轻度感病（病株率<5%）的面积约占60~70%，偏重发病（病株率为10-30%）的面积占15-20%，重发成灾（病株率>30%）的面积为3~5%，严重田块甚至颗粒无收。据估计每年水稻条纹叶枯病造成的经济损失超过100亿元，已成为危害长江中下游地区粳稻的主要病害。

长期以来，化学药剂是防治水稻条纹叶枯病的一项重要措施，但目前生产上广泛使用的农药只针对介体昆虫，植株一旦染病就没有十分有效的防治措施，所以其效果是有限的；而且化学药剂的使用不可避免的对环境造成严重的污染和破坏。利用水稻品种抗性被认为是防治条纹叶枯病最经济、有效的手段。据Washio等的研究，水稻对条纹叶枯病的抗性主要受两对显性互补基因Stv-a、Stv-b或一对显性基因Stv-b ⁱ 控制（孙黛珍等, 中国农学通报, 2006, 22(12): 318-322）。其中来自巴基斯坦陆稻品种Modan的显性基因Stv-b ⁱ 是目前对条纹叶枯病最为有效的抗性基因。它不仅能直接提供对病害而不是对传毒昆虫的抗性，而且在生产上应用了40多年尚未有抗性丧失的报道（潘学彪等, 江苏农业科学, 2005, 5: 22-23）。Hayano-Saito等将Stv-b ⁱ 抗性基因定位在水稻第11染色体两个BAC重叠的约286Kb的区域内，研究还发现它与其中一个RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）标记ST10完全连锁（Hayano-Saito et al., Theor. Appl. Genet., 1998, 96(8): 1044-1049）。

综上所述，培育适应我国长江中下游适宜地区种植的优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种，对满足城乡居民对优质稻米日益增长的消费需求以及解决条纹叶枯病对该地区水稻生产的严重威胁具有重要意义。优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种的选育，传统做法是利用含优良食味和抗条纹叶枯病基因的水稻与高产品种进行一系列的杂交，并根据目标性状的表型进行选择，最终获得既具有优良食味特性，又抗条纹叶枯病的水稻品种。然而，这种方法在后代选育过程中不仅会受到植株生长发育阶段、环境条件等因素的影响，而且在多个优良性状的基因聚合方面也存在诸多问题，费时费力，所需要的育种年限较长。因此，在优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种选育的过程中发明一种高效转育和选择鉴定暗胚乳突变基因和条纹叶枯病抗性基因的育种方法，聚合优质、抗病、高产基因于一体，是本发明的宗旨。

三、发明内容

技术问题： 本发明涉及一种培育优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种的育种方法，采用高效转育和选择鉴定暗胚乳突变基因和条纹叶枯病抗性基因的选育方法，聚合优质、抗病、高产基因于一体，是本发明的宗旨。

技术方案：

本发明的内容是一种培育优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种的育种方法，其特征在于：

1）选用Wx位点上基因型为Wx-bWx-b，条纹叶枯病感病基因型为stv-b ⁱ stv-b ⁱ 的江苏高产粳稻品种武粳13为母本♀与具有暗胚乳突变基因和条纹叶枯病抗性基因，暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，条纹叶枯病抗病基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 的日本优质粳稻品种关东194为父本♂杂交配组，其中Wx-mq、stv-b ⁱ 相对于Wx-b、Stv-b ⁱ 为隐性遗传；

2）种植F₁、F₂ 、F₃，成熟后全部单株混收；

3）F₄代开始进行水稻暗胚乳突变基因和条纹叶枯病抗性基因的分子标记辅助选择，苗期各单株DNA的提取采用SDS法；

暗胚乳突变基因Wx-mq的分子检测，利用四引物PCR标记引物：

正向外引物（Wx-mq-O-F）序列为 5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'

反向外引物（Wx-mq-O-R）序列为 5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'

正向内引物（Wx-mq-I-F）序列为 5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'

反向内引物（Wx-mq-I-R）序列为 5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'

扩增水稻品种的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，选择具有439bp和292bp两条特征条带的Wx-mq基因纯合体单株；

条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测，利用SCAR标记引物：

正向引物（ST-F）序列5`-CGAAAGATGGTTTCTCCACC-3`，

反向引物（ST-R）序列5`-GACCAAGCAACTAATGACGC-3`，

扩增水稻品种的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，选择具有727 bp特征条带的含Stv-b ⁱ 的杂合或纯合体单株；

4）将F₄代中同时含有Wx-mq基因纯合体（439 bp和292 bp两条特征条带）和Stv-b ⁱ 基因的纯合体或杂合体（727 bp特征条带）的单株分别种成F₅小区，利用上述分子标记对条纹叶枯病免疫或高抗的小区继续进行检测（条纹叶枯病发病率低于5%），选择所有单株均具有暗胚乳突变基因（439 bp和292 bp特征条带）以及条纹叶枯病抗性基因（727 bp特征条带）的小区即同时含有Wx-mq和Stv-b ⁱ  基因的纯合体的小区，即为获得的培育优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种。

5）在上述双基因纯合的小区内选择株高90~100cm、每株8~10穗、每穗140~150粒的单株加代稳定，于F₇代获得农艺性状稳定一致的优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种南粳5055，其暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，条纹叶枯病抗性基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ ，株高95~100cm，每株8~10穗，平均穗长15~16cm，半直立穗型，每穗总粒数140~150粒，结实率90%~94%，千粒重24~26g。

有益效果

本发明提供的一种培育优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种的育种方法，具有以下优点：

（1）    本发明方法中涉及辅助选择的分子标记均为PCR标记，由于不涉及DNA测序、限制性内切酶等的使用，因此不存在操作烦琐，费用昂贵等弊端，更为高效、快捷，不仅可以在育种世代中快速鉴定出含暗胚乳突变基因Wx-mq和条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 纯合体的水稻植株，而且准确度高，极大的提高了选择效率，简化育种程序，缩短育种年限。

（2）    本发明方法育成的优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种南粳5055，其暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，条纹叶枯病抗性基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ ；与亲本之一关东194相比，南粳5055的农艺性状有了显著改善。株高95~100cm，基部节间粗短，叶片厚直，叶色较深，茎秆坚韧有弹性，耐肥抗倒；分蘖性好，每株8~10穗；穗层整齐；半直立穗且穗型较大，平均穗长15~16cm，每穗总粒数140~150粒，结实率90%~94%，千粒重24~26g。其胚乳呈暗胚乳特性，外观云雾状、乳白色，米饭质地粘软，表面光泽透亮，综合了糯米的柔性和粳米的弹性，冷饭不硬，食味品质极佳。2009年8月在天津组织召开的全国优质粳稻优良食味品评会上，南粳5055获得三等奖。在2010年1月举办的江苏省优质粳稻新品种（系）食味品尝会上获得第一名。

（3）    本发明方法育成的品种南粳5055聚合了杂交亲本双方的优良食味、抗条纹叶枯病、高产等特性，在江苏沿江和苏南适宜种植区具有广阔的应用前景。

四、附图说明

图1  武粳13/关东194 F₄群体单株暗胚乳突变基因Wx-mq的分子检测

（M：DL2000；1：关东194；2：武粳13；3：F₁；4：F₄群体的部分单株）

图2  武粳13/关东194 F₄群体单株条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测

（M：DL2000；1：关东194；2：武粳13；3：F₁；4：F₄群体的部分单株）

图3  武粳13/关东194 F₅双基因纯合小区暗胚乳突变基因Wx-mq的分子检测

（M：DL2000；1：关东194；2：武粳13；3：F₁；4：双基因纯合小区的部分单株）

图4  武粳13/关东194 F₅双基因纯合小区条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测

（M：DL2000；1：关东194；2：武粳13；3：F₁；4：双基因纯合小区的部分单株）

图5  优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种“南粳5055”选育系谱图

图6  优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种南粳5055与亲本关东194和武粳13在植株形态与外观胚乳的比较

（A：关东194；B：南粳5055；C：武粳13）

生物保藏：

南粳5055，该品种于2011年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号:CGMCC NO.4578，分类命名：水稻（Oryza sativa）。

五、具体实施方式

选择亲本  武粳13（原名武育5021），江苏高产粳稻品种，江苏省常州市武进区稻麦育种场育成，2003年审定定名。Wx位点上基因型为wx-bwx-b，条纹叶枯病基因型stv-b ⁱ stv-b ⁱ 。该品种全生育期156天，株高97~102cm，每株有效穗8~10个，每穗实粒数115~125粒，结实率92%~93%，千粒重27~28g。

关东194，优良食味、抗条纹叶枯病优质粳稻品种（日本引进），日本茨城县育成，2003年农林水产省登录，登录名为农林387号。优良食味，暗胚乳基因型为Wx-mqWx-mq，条纹叶枯病基因型Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 。该品种全生育期130~135天，株高85~95cm，每株有效穗6~8个，每穗实粒数100~110粒，结实率93%~95%，千粒重24~25g。

以上两个品种均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为：（钱金敖等，优质水稻新品种——武粳13，江苏农业科学，2005，4：305；http://ineweb.narcc.affrc.go.jp/。）

品种选育  1999年选用Wx位点上基因型为Wx-bWx-b，条纹叶枯病感病基因型为stv-b ⁱ stv-b ⁱ 的江苏高产粳稻品种武粳13为母本♀与具有暗胚乳突变基因和条纹叶枯病抗性基因，暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，条纹叶枯病抗病基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 的日本优质粳稻品种关东194为父本♂杂交配组，其中Wx-mq、stv-b ⁱ 相对于Wx-b、Stv-b ⁱ 为隐性遗传，2000年在南京种植F₁，同年冬季到海南加代混收F₂代种子，2001年在南京种植F₃，成熟后混收种子。2002年在南京种植F₄，根据分子标记辅助育种的结果选择目的单株，种植F₅小区，根据分子标记辅助育种的结果以及农艺性状的表现在个别小区内继续选择单株。中选单株2004年在南京种成小区（F₆），表现稳定一致、抗条纹叶枯病、综合丰产性好，成熟后混收，进行食味品质筛选。2005年分别在南京和张家港进行大区鉴定（F₇），其中小区JD5055的品质、抗病性、产量等综合性状表现优良，折合产量620 kg/667m²，特别是食味品质优良，抗条纹叶枯病，暂定名为“宁5055”。2006年在南京、常州和张家港进行多点鉴定的同时，推荐参加江苏省早熟晚粳组预备试验， 2007年参加江苏省早熟晚粳组区域试验，2008年继续参加早熟晚粳组区域试验，由于供种错误，导致试验终止。2009年更名为“南粳5055”，重新参加江苏省早熟晚粳组区域试验，2010年在参加区域试验的同时参加生产试验，表现优质、高产、抗条纹叶枯病。

分子标记辅助选择  F₄代开始进行水稻暗胚乳突变基因和条纹叶枯病抗性基因的分子标记辅助选择，苗期各单株DNA的提取采用SDS法，参照Dellaporta S L, et al., Plant Mol B iol Rep, 1983 , 1 (1): 19221。具体步骤为：取水稻苗期叶片，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入1.5 ml 离心管；加入600 ul提取液（20% SDS，1M Tris-HCl，0.5M EDTA，5M NaCl，65℃预热），摇匀，65℃温浴30 min，中间振荡3~4次；加入1/4体积5M KAC, 摇匀后置冰上30 min；加入氯仿-异戊醇（24:1）300~400 ul，在摇床上充分振荡，120 rpm，30 min；8000~10000 rpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清（400 ul左右）至另一离心管；加入等体积氯仿-异戊醇（24:1），摇床上充分振荡，80~90 rpm，30 min；8000 rpm离心15分钟，转移上清（400 ul左右）至新的离心管；加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12000 rpm离心6 min；弃无水乙醇，加入4℃ 70%乙醇，放置10 min，弃上清，超净工作台上风干1 h；加入100~200 ulTE，-20℃保存。

暗胚乳突变基因Wx-mq的分子检测，利用四引物PCR标记引物：

正向外引物（Wx-mq-O-F）序列为 5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'

反向外引物（Wx-mq-O-R）序列为 5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'

正向内引物（Wx-mq-I-F）序列为 5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'

反向内引物（Wx-mq-I-R）序列为 5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'

扩增水稻品种的基因组DNA， 20 μL PCR反应体系包括：10 ng/μL的 DNA 2.0 μL，4 pmol/ μL的引物2.0 μL ，其中引物Wx-mq-O-F、Wx-mq-O-R、Wx-mq-I-F和Wx-mq-I-R各0.5 μL，含25 mmol/L MgCl₂的10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L的dNTP 0.4 μL，5 U/μL 的Taq0.5 μL和ddH₂O 13.1 μL；PCR反应程序包括：95 ℃预变性5 min；然后95℃变性30 s、65℃复性30 s、72℃延伸1 min，循环35次；然后72℃延伸7 min，10℃冷却10 min后，将扩增产物加缓冲液终止反应。产物在质量比浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察，选择具有439 bp和292 bp两条特征条带的Wx-mq基因纯合体单株。

条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测，利用SCAR标记引物：

正向引物（ST-F）序列5`-CGAAAGATGGTTTCTCCACC-3`，

反向引物（ST-R）序列5`-GACCAAGCAACTAATGACGC-3`，

扩增水稻品种的基因组DNA，20 μL PCR反应体系包括：10 ng/ μL的 DNA 2.0 μL，4 pmol/ μL的引物2.0 μL 其中引物ST-F和ST-R各1.0 μL，含25 mmol/L MgCl₂的10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L的 dNTP 0.4 μL，5 U/μL 的Taq 0.5 μL和ddH₂O 13.1 μL；PCR反应程序包括：95 ℃预变性5 min；然后95℃变性30 s、63℃复性1 min、72℃延伸1 min，循环35次；然后72℃延伸7 min，10℃冷却10 min后，将扩增产物加缓冲液终止反应。产物在质量比浓度为1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察，选择具有727 bp特征条带的含Stv-b ⁱ 的杂合或纯合体单株；

将F₄代中同时含有Wx-mq基因纯合体（439 bp和292 bp两条特征条带）和Stv-b ⁱ 基因的纯合体或杂合体（727 bp特征条带）的单株分别种成F₅小区（小区育秧选择在灰飞虱虫源丰富的小麦田边，每个小区种植48株，4行区，行株距17 cm×17 cm，小区间空1行，田间管理按常规方法进行，秧田期和移栽后30天内不防治灰飞虱），分蘖盛期，参照Washio等（Washio et al., Bull Chugoku Agr. Exp. Sta. Series., 1968, 16：39~197）制定的抗性鉴定标准，并稍做修改，0级，无症状；1级，有轻微黄绿色斑驳症状，病叶不卷曲，植株生长正常；2级，病叶上褪绿扩展相连成不规则黄白色或黄绿色条斑，病叶不卷曲或略有卷曲，生长基本正常；3级，病叶严重褪绿，病叶卷曲呈捻转状，少数病叶出现黄化枯萎症状；4级，大部分病叶卷曲呈捻转状，叶片黄化枯死，植株呈假枯心状或整株枯死。其中，2～4级直接记为发病，0、1级记为不发病，1级在7天后再次调查确认，并按周彤等（周彤等, 植物保护学报, 2007, 34(5): 475-479）的方法进行抗性评价，计算平均发病率，并根据平均发病率进行抗性评价：免疫，发病率为0；高抗，发病率低于5%；抗病，发病率介于5.1%～15%；中感，发病率介于15.1%～30%；感病，发病率介于30.1%～50%；高感，发病率高于50.1%。选择对条纹叶枯病免疫或高抗的小区（条纹叶枯病发病率低于5%），利用上述分子标记继续进行检测，选择所有单株均具有暗胚乳突变基因（439 bp和292 bp特征条带）以及条纹叶枯病抗性基因（727 bp特征条带）的小区即为同时含有Stv-b ⁱ 和Wx-mq基因的纯合体；

在上述双基因纯合的小区内选择株高90~100cm、每株8~10穗、每穗140~150粒的单株加代稳定，于F₇代获得农艺性状稳定一致的优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种南粳5055，其暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，条纹叶枯病抗性基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ ，株高95~100cm，每株8~10穗，平均穗长15~16cm，半直立穗型，每穗总粒数140~150粒，结实率90%~94%，千粒重24~26g。该品种不仅抗水稻条纹叶枯病，而且胚乳呈暗胚乳特性，外观云雾状、乳白色，米饭质地粘软，表面光泽透亮，综合了糯米的柔性和粳米的弹性，冷饭不硬，食味品质极佳。

                         SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  一种培育优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种的育种方法

 

 

<130>  说明书

 

 

<160>  6    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  正向外引物Wx-mq-O-F

<222>  (1)..(28)

<223> 

 

 

 

<400>  1

atgttgtgtt cttgtgttct ttgcaggc                                        28

 

 

<210>  2

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  反向外引物Wx-mq-O-R

<222>  (1)..(28)

<223> 

 

 

 

<400>  2

gtagatcttc tcaccggtct ttccccaa                                        28

 

 

<210>  3

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  正向内引物Wx-mq-I-F

<222>  (1)..(23)

<223> 

 

 

 

<400>  3

gggtgaggtt tttccattgc tacaatcg                                        28

 

 

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  反向内引物Wx-mq-I-R

<222>  (1)..(26)

<223> 

 

 

 

<400>  4

gtcgatgaac acacggtcga ctcaat                                          26

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  正向引物ST-F

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  5

cgaaagatgg tttctccacc                                                 20

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  反向引物ST-R

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  6

gaccaagcaa ctaatgacgc                                                 20

Claims (3)

1.一种培育优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种的育种方法，其特征在于：

1）选用Wx位点上基因型为Wx-bWx-b，条纹叶枯病感病基因型为stv-b ⁱ stv-b ⁱ 的江苏高产粳稻品种武粳13为母本♀与具有暗胚乳突变基因和条纹叶枯病抗性基因，暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，条纹叶枯病抗病基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 的日本优质粳稻品种关东194为父本♂杂交配组，其中Wx-mq、stv-b ⁱ 相对于Wx-b、Stv-b ⁱ 为隐性遗传；

2）种植F₁、F₂ 、F₃，成熟后全部单株混收；

3）F₄代开始进行水稻暗胚乳突变基因和条纹叶枯病抗性基因的分子标记辅助选择，苗期各单株DNA的提取采用SDS法；

暗胚乳突变基因Wx-mq的分子检测，利用四引物PCR标记引物：

正向外引物Wx-mq-O-F序列为 5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'

反向外引物Wx-mq-O-R序列为 5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'

正向内引物Wx-mq-I-F序列为 5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'

反向内引物Wx-mq-I-R序列为 5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'

扩增水稻品种的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，选择具有439 bp和292 bp两条特征条带的Wx-mq基因纯合体单株；

条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测，利用SCAR标记引物：

正向引物ST-F序列5'-CGAAAGATGGTTTCTCCACC-3'，

反向引物ST-R序列5'-GACCAAGCAACTAATGACGC-3'，

扩增水稻品种的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，选择具有727 bp特征条带的含Stv-b ⁱ 的杂合或纯合体单株；

4）将F₄代中同时含有Wx-mq基因纯合体和Stv-b ⁱ 基因的纯合体、或同时含有Wx-mq基因纯合体和Stv-b ⁱ 基因杂合体的单株分别种成F₅小区，利用上述分子标记对条纹叶枯病免疫或高抗的小区继续进行检测，选择所有单株均同时具有暗胚乳突变基因，即具有439 bp和292 bp特征条带以及条纹叶枯病抗性基因，即727 bp特征条带的小区即同时含有Wx-mq和Stv-b ⁱ  基因的纯合体，其暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，条纹叶枯病抗性基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ^i， ，即为获得的培育优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种。

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于：

在上述同时含有Wx-mq和Stv-b ⁱ  基因的纯合体的小区内选择株高90~100cm、每株8~10穗、每穗140~150粒的单株加代稳定，于F₇代获得农艺性状稳定一致的优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种南粳5055，其暗胚乳突变基因型为Wx-mqWx-mq，条纹叶枯病抗性基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ ，株高95~100cm，每株8~10穗，平均穗长15~16cm，半直立穗型，每穗总粒数140~150粒，结实率90%~94%，千粒重24~26g。

3.根据权利要求1或2所述的育种方法，其特征在于：所述条纹叶枯病免疫或高抗的小区指的是条纹叶枯病发病率低于5%的小区。

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