CN102146472B - 鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的四引物标记方法 - Google Patents
鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的四引物标记方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的四引物PCR分子标记方法，属于生物技术领域。设计四条标记引物，加入同一PCR反应体系对不同水稻DNA扩增，如果有439bp和292bp两条特征条带即为暗胚乳突变基因Wx-mq纯合体；如果有439bp和200bp两条带即为不含暗胚乳突变基因Wx-mq的纯合体；如果同时存在439bp、292bp和200bp的三条带，则为暗胚乳突变基因Wx-mq的杂合体。本发明不仅能快速、准确地鉴定水稻种质资源或其育种群体中是否含有暗胚乳突变基因Wx-mq，提高对暗胚乳突变基因Wx-mq的选择效率，加速暗胚乳、低直链淀粉含量水稻品种的选育进程。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的四引物PCR分子标记方法，属于农业生物技术工程领域，专用于含暗胚乳突变基因Wx-mq水稻资源的鉴定和品种选育。
二、背景技术
随着我国国民经济的发展和生活质量的提高，优良食味稻米开始展现出广阔的市场前景，受到越来越多消费者的青睐。以日本优质大米“越光”和“一见钟情”为例，其价格为普通大米的数倍，但市场仍供不应求（巩迎军等, 中国农学通报, 2008, 24(12): 96-101）。研究表明，直链淀粉是决定米饭质地和食味品质的重要因素。直链淀粉含量高，米饭质地硬，粘性小，蓬松干燥，光泽差；直链淀粉含量低，则米饭表面光泽透亮，综合了糯米的柔性和粳米的弹性，适口性好，食味品质佳，具有较高的商品性。因此，培育食味品质优良的低直链淀粉含量水稻品种来满足日益增长的市场需求，已成为当前水稻品质育种一个重要的研究方向（朱昌兰等, 中国农业科学, 2004, 3(2): 81-88）。
低直链淀粉含量基因是进行低直链淀粉水稻品种选育的重要遗传资源，目前已知水稻中可供育种利用低直链淀粉含量突变基因有14个，它们大多由一对隐性基因控制，且主要分布于水稻第6、9、10和12染色体上（Wang et al., 分子植物育种, 2009, 7(6): 1070-1076）。其中Wx-mq是通过化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）处理日本水稻品种越光，而获得的低直链淀粉含量变异基因。该基因在腊质基因（Wx）编码区发生了两个碱基的替换，进而影响Wx蛋白的活性，造成其直链淀粉含量的降低，随着直链淀粉含量的降低，携带该基因变异位点的水稻品种其胚乳外观呈现云雾状、乳白色，透明度略差等暗胚乳的特性，故称为暗胚乳突变基因（Sato H, et al. Breeding Sci, 2002, 52(2):131-135）。
利用含该基因变异位点的水稻资源Milky Queen（Kazuo I et al., Bulletin of the National Institute of Crop Science, 2001, 3: 39-61），各国育种家培育了大量直链淀粉含量较低，食味品质优良的水稻品种，如“New-hikari”、“Joiku 436”和“南粳46”等（Tomit K, et al., Bull Fukui Agr Exp Sta Series, 2007, 44: 1-20; Sato H, et al., Breeding Sci, 2002, 52(2): 131-135; 王才林等, 中国水稻科学，2009，23(1)：25-30）。其中“南粳46”是江苏省第一个通过审定的低直链淀粉水稻品种，该品种米饭晶莹剔透，口感柔软润滑，富有弹性，冷而不硬，食味品质极佳，先后获得江苏省粳稻优质米食味品评第一名、全国优质粳稻优良食味品评优秀奖、全国“优质食味粳米” 以及第九届中国优质稻米交易博览会“金奖大米”的称号，其食味品质已接近日本优质稻米“越光”，被誉为“江苏最好吃大米”（王才林等, 中国水稻科学, 2009, 23(1): 25-30）。由此可见，Wx-mq作为水稻少数且效应较大的优质基因，在稻米食味品质改良中起着非常关键的作用。
随着分子生物学的发展，基于DNA变异的分子标记在水稻遗传改良中发挥了非常重要的作用。为提高暗胚乳突变基因Wx-mq水稻资源的鉴定和品种选育的效率，许多研究者进行了大量的尝试。Sato等利用Wx-mq基因第497位单核苷酸变异设计了能区分Wx-mq基因型的显性PCR分子标记，该标记能准确鉴定水稻中是否含有暗胚乳突变基因Wx-mq，但不能有效区别Wx-mq的纯合和杂合基因型（Sato H, et al., Breeding Sci, 2002, 52(2): 131-135）；Chen等根据该突变位点重新设计了能准确区分三种基因型的CAPS分子标记，但由于涉及限制性内切酶的使用而存在操作烦琐，费用昂贵等一系列弊端（Chen et al., Rice Sci，2009, 16(2): 106-110）。因此，建立一种新的基于PCR技术的基因分型法来快捷、准确地鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq的基因型已成为育种应用中亟待解决的技术难题。
三、发明内容
技术问题： 本发明针对利用普通分子生物学技术（如普通双引物PCR、DNA测序、PCR酶切等）来区分暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型（特别是杂合基因型），其试验流程较为烦琐，费用昂贵的情况，根据Wx-mq基因在Wx位点上的单核苷酸变异，设计四条基因特异性引物并采用一步PCR的方法来快速、准确地检测水稻暗胚乳突变基因Wx-mq的不同基因型，以达到资源鉴定和标记辅助育种的目的。
技术方案：
一种鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的四引物PCR分子标记方法，其特征在于：
用Wx-mq基因特异性引物
正向外引物（Wx-mq-O-F）序列为 5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'
反向外引物（Wx-mq-O-R）序列为 5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'
正向内引物（Wx-mq-I-F）序列为 5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'
反向内引物（Wx-mq-I-R）序列为 5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'
利用上述引物快速区分水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的PCR分子标记方法为：
（1） 水稻植株基因组DNA的提取（SDS法），参照Dellaporta S L, et al., Plant Mol B iol Rep, 1983 , 1 (1): 19221.）；
（2） 将所述的四条分子标记引物Wx-mq-O-F、Wx-mq-O-R、Wx-mq-I-F和Wx-mq-I-R加入同一PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；
20 μL PCR反应体系包括：10 ng/μL的 DNA 2.0 μL，4 pmol/ μL的引物2.0 μL ，其中引物Wx-mq-O-F、Wx-mq-O-R、Wx-mq-I-F和Wx-mq-I-R各0.5 μL，含25 mmol/L MgCl2的10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L的dNTP 0.4 μL，5 U/μL 的Taq0.5 μL和ddH2O 13.1 μL；
PCR反应程序包括：95 ℃预变性5 min；然后95℃变性30s、65℃复性30s、72℃延伸1min，循环35次；然后72℃延伸7min，10℃冷却10min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。
（3） 反应产物在质量比浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，记载。如果有439 bp和292 bp两条特征条带，则为暗胚乳突变基因Wx-mq的纯合体；如果有439 bp和200 bp两条特征条带，则为不含暗胚乳突变基因Wx-mq的纯合体；如果同时存在439 bp、292 bp和200 bp的三条特征条带，则说明该植株是暗胚乳突变基因Wx-mq的杂合体。
有益效果
本发明提供的一种鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的四引物PCR分子标记方法，具有以下优点：
（1） 本发明提供的分子标记不是与Wx-mq基因连锁的分子标记，而是根据基因的变异位点设计的功能性标记，能直接反映植株的表型，不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定；
（2） 本发明提供的分子标记方法能实现对暗胚乳突变基因Wx-mq水稻资源的快速鉴定。由于水稻暗胚乳突变基因资源相对较多，很难根据其表型进行有效区分，通过本发明提供的分子标记方法能够对大量暗胚乳突变水稻资源进行检测，直接判定暗胚乳突变基因是否为Wx-mq，而不需要通过大量、复杂的遗传试验设计来对其基因来源进行分析；
（3） 本发明提供的分子标记方法能有效用于暗胚乳突变基因引起的低直链淀粉含量水稻品种的辅助育种。传统育种的做法，首先是利用含Wx-mq基因的水稻品种与生产上推广的主栽品种进行一系列杂交，然后在分离群体中测定各成熟单株的直链淀粉含量和进行外观形态的观察，并最终选择含暗胚乳突变基因Wx-mq纯合基因型的低直链淀粉含量单株，这样的选育方法不仅受植株生长发育阶段的影响，而且耗时、耗力、耗成本。而利用与Wx-mq基因直接相关的四引物PCR分子标记对植株DNA进行检测，可以在苗期鉴定出暗胚乳突变基因Wx-mq纯合基因型的单株，淘汰其它单株，这样不仅节约育种成本，而且大大提高了暗胚乳、低直链淀粉水稻品种的选择效率；
（4） 与现有的鉴定暗胚乳突变基因Wx-mq的分子标记相比，本发明提供的分子标记方法采用四引物一步PCR扩增的方法对Wx-mq不同基因型进行鉴定，不仅能有效区别Wx-mq的纯合和杂合基因型，而且由于不涉及限制性内切酶的使用，因此不存在操作烦琐，费用昂贵等弊端，更为高效、快捷。
四、附图说明
图1 含暗胚乳突变基因Wx-mq水稻品种与普通优质水稻品种胚乳外观形态的比较
（A：含低直链淀粉基因Wx-mq纯合基因型的水稻品种-南粳5055；B：不含低直链淀粉基因Wx-mq的水稻品种-南粳44）
图2 设计用于检测水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型四引物PCR分子标记的策略
（黑色实心框表示外显子，连接实心框的线条表示内含子；箭头线表示引物位置和扩增方向；阴影表示单核苷酸的变异位点。）
图3 四引物PCR分子标记对不同水稻品种Wx-mq基因型的检测
（M：DNA分子量标准，100-2,000 bp；1~4：含Wx-mq纯合基因型水稻品种，Milky queen、关东194、南粳46和南粳5055；5-10：不含Wx-mq基因型水稻品种，镇稻88、武育粳3号、武粳13号、南粳44、巨丰占和南京11）
图4 四引物PCR分子标记对武粳13/关东194 F2群体Wx-mq基因型的检测
（M：DNA分子量标准，100-2,000 bp；1：关东194；2：武粳13；3：武粳13/关东194 F1杂种个体；4-24：部分F2分离单株，其中7、9、17、19、22为含暗胚乳突变基因Wx-mq纯合基因型的单株，11、13、14、20、24为不含暗胚乳突变基因Wx-mq的单株，4、5、6、8、10、12、15、16、18、21、23为含暗胚乳突变基因Wx-mq杂合基因型的单株。）
生物保藏：
南粳5055，该品种于2011年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号:CGMCC NO.4578，分类命名：水稻（Oryza sativa）。
五、具体实施方式
通过对江苏省农业种质资源中期库低温保藏的2000余份水稻种质资源进行直链淀粉含量的测定，从中筛选到1份直链淀粉含量显著降低的粳稻材料-关东194。遗传分析和等位性测验表明，关东194的低直链淀粉含量性状由Wx位点等位的暗胚乳突变基因Wx-mq控制。根据水稻Wx位点的基因组信息，设计引物对该位点部分序列进行PCR扩增并直接测序。结果表明，关东194在Wx位点编码区第497位核苷酸（第4外显子）由G突变为A，使第158位密码子由CGT变为CAT，并最终导致精氨酸突变为组氨酸。根据这一单核苷酸差异设计了四引物PCR分子标记，利用该标记方法不仅可以有效鉴定水稻种质资源是否含有Wx-mq基因，同时还可以对Wx-mq的不同基因型进行检测，提高对暗胚乳、低直链淀粉含量水稻品种的选择效率。
“鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的分子标记方法”其具体实施步骤如下：
（一）试验材料
糯稻品种：苏御糯（江苏太湖稻区地方品种）；
含Wx-mq纯合基因型的暗胚乳、低直链淀粉含量水稻品种：Milky queen（粳稻品种，日本关东地区茨城县作物研究所），关东194（粳稻品种，日本关东地区茨城县作物研究所），南粳46（武香粳14/关东194后代，中熟晚粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所），南粳5055（武粳13/关东194后代，早熟晚粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所）
不含Wx-mq基因型正常直链淀粉含量的水稻品种镇稻88（中熟中粳品种，江苏省镇江市丘陵地区农业科学研究所），武育粳3号（迟熟中粳品种，江苏省常州市武进稻麦育种场），武粳13（早熟晚粳品种，江苏常州市武进稻麦育种场），南粳44（早熟晚粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所），巨丰占（常规晚籼品种，广东省农业科学院水稻研究所），南京11（常规中籼品种, 江苏省农业科学院粮食作物研究所）。
Wx-mq基因型分离群体：由关东194为父本，武粳13为母本进行杂交、自交获得的484个单株组成F2群体。
南粳5055保藏号为CGMCC NO.4578，以上其他材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为：姚月明等，太湖特种稻-苏御糯的栽培技术，江苏农业科学，1986，3：11-12； Kazuo I et al., "Milky Queen", A new high-quality rice cultivar with low amylase content in endosperm，Bulletin of the National Institute of Crop Science，2001，3：39-61；http://ineweb.narcc.affrc.go.jp/；王才林等，抗条纹叶枯病优良食味晚粳稻新品种-南粳46，江苏农业科学，2008，1：43；http://cnpvp.cn/（品种权号：CNA20070694.2）；胡春明等，中粳稻镇稻88育种实践的分析与启示，江西农业学报，2008，20（11）：47-49；江祺祥等，中粳稻新品种武育粳3号的选育及其利用，江苏农业科学，1993，3：8-10；钱金敖等，优质水稻新品种——武粳13，江苏农业科学，2005，4：305；王才林等，抗条纹叶枯病水稻新品种南粳44 的选育与应用，中国稻米，2007，2：33-34；周少川等，广东优质稻品种系谱分析，中国稻米，1998，1：6-9；林世成，闵绍楷主编：中国水稻品种及其系谱，上海科学技术出版社，1991，56-58。）
（二）分子标记开发
（1） 水稻低直链淀粉含量品种资源的筛选
采用农业部部颁标准NY147-88对江苏省农业种质资源中期库低温保藏的2000余份水稻种质资源进行了直链淀粉含量的测定，从中筛选到1份直链淀粉含量显著降低的粳稻材料-关东194，其直链淀粉含量在10%以下（注：普通籼稻品种的直链淀粉含量在20%以上，而普通粳稻品种的直链淀粉含量在15%-20%之间）。
（2） 关东194中控制暗胚乳突变基因的遗传分析和等位性测定
首先，利用低直链淀粉含量水稻品种关东194与正常直链淀粉含量水稻品种巨丰占进行杂交配组，遗传分析证实：关东194的低直链淀粉含量性状是受1对隐性核基因控制。其次，为确定该基因与Wx位点的关系，继续利用关东194与糯稻品种苏御糯进行杂交配组，遗传分析表明：关东194的暗胚乳、低直链淀粉基因与水稻第6染色体上的Wx位点等位。最后，为进一步明确该基因与目前已报道的暗胚乳、低直链淀粉突变基因的关系，将上述材料关东194与第6染色体上含有暗胚乳、低直链淀粉含量基因的水稻材料Milky Queen（含暗胚乳突变基因Wx-mq）进行杂交配组，并通过遗传数据分析，发现关东194中具有暗胚乳突变基因Wx-mq。
（3） 变异位点的核苷酸序列分析
根据水稻Wx位点的基因组信息，设计引物对该位点部分序列进行PCR扩增并直接测序，获得Wx位点约548 bp的基因组序列。序列分析证实，关东194所含的暗胚乳突变基因Wx-mq与Milky Queen中所含的暗胚乳突变基因Wx-mq的变异位点并不完全一致。关东194和Milky Queen中Wx位点第497位核苷酸（第4外显子）都存在G到A的单碱基变异，使第158位密码子由CGT变为CAT，并导致精氨酸突变为组氨酸；而Milky Queen中Wx位点第595位核苷酸（第5外显子）存在的导致第191位的酪氨酸突变为组氨酸的T到C的单碱基变异在关东194中并不存在。
（4）引物设计
根据关东194和Milky Queen在Wx位点第497位核苷酸（第4外显子）共有的G到A单碱基差异，设计了四引物PCR分子标记（图2），其引物序列为：
正向外引物（Wx-mq-O-F）序列为 5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'
反向外引物（Wx-mq-O-R）序列为 5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'
正向内引物（Wx-mq-I-F）序列为 5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'
反向内引物（Wx-mq-I-R）序列为 5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'
（三）分子标记验证
（1）水稻品种基因组DNA的提取
水稻品种基因组DNA的提取（SDS法），参照Dellaporta S L, et al., Plant Mol B iol Rep, 1983 , 1 (1): 19221.。具体步骤为：取水稻苗期叶片，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入1.5 ml 离心管；加入600 ul提取液（20% SDS，1M Tris-HCl，0.5M EDTA，5M NaCl，65℃预热），摇匀，65℃温浴30 min，中间振荡3~4次；加入1/4体积5M KAC, 摇匀后置冰上30 min；加入氯仿-异戊醇（24:1）300~400 ul，在摇床上充分振荡，120 rpm，30 min；8000~10000 rpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清（400 ul左右）至另一离心管；加入等体积氯仿-异戊醇（24:1），摇床上充分振荡，80~90 rpm，30 min；8000 rpm离心15分钟，转移上清（400 ul左右）至新的离心管；加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12000 rpm离心6 min；弃无水乙醇，加入4℃70%乙醇，放置10 min，弃上清，超净工作台上风干1 h；加入100~200 ul TE，-20℃保存。
（2）分子标记的扩增和电泳检测
利用四引物PCR分子标记，其引物序列为：
正向外引物（Wx-mq-O-F）序列为 5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'
反向外引物（Wx-mq-O-R）序列为 5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'
正向内引物（Wx-mq-I-F）序列为 5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'
反向内引物（Wx-mq-I-R）序列为 5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'
对不同水稻品种以及Wx-mq基因型分离群体进行PCR扩增和电泳检测。
20 μL PCR反应体系包括：10 ng/μL的 DNA 2.0 μL，4 pmol/ μL的引物2.0 μL ，其中引物Wx-mq-O-F、Wx-mq-O-R、Wx-mq-I-F和Wx-mq-I-R各0.5 μL，含25 mmol/L MgCl2的10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L的dNTP 0.4 μL，5 U/μL 的Taq0.5 μL和ddH2O 13.1 μL；
PCR反应程序包括：95 ℃预变性5 min；然后95℃变性30 s、65℃复性30 s、72℃延伸1 min，循环35次；然后72℃延伸7 min，10℃冷却10 min后，将扩增产物加缓冲液终止反应。产物在质量比浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察，记载。
（3）结果分析
对10个不同水稻品种（Milky queen、关东194、南粳46、南粳5055、镇稻88，武育粳3号，武粳13，南粳44，巨丰占和南京11）的DNA进行四引物PCR扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳可显示两种类型的条带。其中被外引物Wx-mq-O-F和Wx-mq-O-R扩增的439 bp的条带在每个DNA样品中均出现，它不仅起阳性对照的作用（检测DNA能否得到有效扩增），同时也可以有效降低非特异PCR产物的扩增以及引物二聚体的形成。除439 bp的共有条带外，4个含Wx-mq纯合基因型的暗胚乳、低直链淀粉含量水稻品种Milky queen、关东194、南粳46和南粳5055还能扩增出一条约292 bp的条带，该条带是由正向外引物Wx-mq-O-F和反向内引物Wx-mq-I-R扩增产生的，它特异扩增的是Wx位点第497位核苷酸为A的等位位点（Wx-mq基因型）；6个不含Wx-mq基因型的正常直链淀粉含量水稻品种镇稻88，武育粳3号，武粳13，南粳44，巨丰占和南京11不能扩增出292 bp条带，但能扩增出一条约200 bp的特异条带，该条带是由正向内引物Wx-mq-I-F和反向外引物Wx-mq-O-R扩增产生的，它扩增的是Wx位点第497位核苷酸为G的等位位点（非Wx-mq基因型）（图3）。为验证四引物PCR分子标记对单碱基变异位点检测地准确性，成熟后对上述材料进行了直链淀粉含量的测定以及胚乳外观形态的观察，结果表明：PCR扩增结果与表型鉴定完全一致。因此，四引物PCR分子标记能准确地鉴定水稻种质资源中是否含有暗胚乳、低直链淀粉含量基因Wx-mq（见表1）。
为进一步验证四引物PCR分子标记对暗胚乳突变基因Wx-mq杂合基因型的检测效果，在分蘖盛期对武粳13/关东194 F2群体484个单株的DNA进行扩增，其电泳产物呈现3种类型的条带，即低直链淀粉亲本关东194的特征带型（439 bp和292 bp）、正常亲本武粳13的特征带型（439 bp和200 bp）以及同时具有双亲带型的杂合带型（439 bp、292 bp和200 bp）（图4）。经统计，在F2群体中共检测到具有关东194条带的单株114个，具有武粳13带型的单株111个，而具有杂合带型的单株259株，3种基因型符合1:2:1（χ2=2.43，0.25 <P<0.50），同时这与成熟后对胚乳外观特性鉴定的结果完全一致。因此，四引物PCR分子标记可以有效区分水稻暗胚乳突变基因Wx-mq三种不同基因型，提高对其基因的选择效率，加速暗胚乳、低直链淀粉含量水稻品种的选育进程
（四）本发明分子标记方法用于辅助选育暗胚乳、低直链淀粉含量水稻品种南粳5055的选育过程为：
选用江苏高产粳稻品种武粳13（2003年审定）为母本（♀）与含暗胚乳突变基因Wx-mq纯合基因型优质粳稻品种关东194为父本（♂）杂交配组；种植F1、F2 、F3，成熟后全部单株混收；F4开始利用本发明方法进行分子标记辅助选择，收获具有439 bp和292 bp两条特征条带的Wx-mq 基因纯合体单株继续种植，F5获得Wx-mq基因纯合的小区并在这些小区内选择株高90~100cm、每株8~10穗、每穗140~150粒的单株加代稳定，于F7代获得农艺性状稳定一致的优良食味、抗条纹叶枯病水稻品种南粳5055，其暗胚乳、低直链淀粉基因型为Wx-mqWx-mq，株高95~100cm，每株8~10穗，平均穗长15~16cm，半直立穗型，每穗总粒数140~150粒，结实率90%~94%，千粒重24~26g。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的四引物标记方法
<130> 说明书
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 正向外引物Wx-mq-O-F
<222> (1)..(28)
<223>
<400> 1
atgttgtgtt cttgtgttct ttgcaggc 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 反向外引物Wx-mq-O-R
<222> (1)..(28)
<223>
<400> 2
gtagatcttc tcaccggtct ttccccaa 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 正向内引物Wx-mq-I-F
<222> (1)..(23)
<223>
<400> 3
gggtgaggtt tttccattgc tacaatcg 28
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 反向内引物Wx-mq-I-R
<222> (1)..(26)
<223>
<400> 4
gtcgatgaac acacggtcga ctcaat 26
Claims (2)
1. 一种鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的四引物PCR分子标记方法，其特征在于：
用Wx-mq基因特异性引物
正向外引物Wx-mq-O-F序列为 5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'
反向外引物Wx-mq-O-R序列为 5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'
正向内引物Wx-mq-I-F序列为 5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'
反向内引物Wx-mq-I-R序列为 5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'
扩增水稻品种的基因组DNA，如果同时有439 bp和292 bp两条特征条带，则为暗胚乳突变基因Wx-mq的纯合体；如果同时有439 bp和200 bp两条特征条带，则为不含暗胚乳突变基因Wx-mq的纯合体；如果同时存在439 bp、292 bp和200 bp的三条特征条带，则说明该植株是暗胚乳突变基因Wx-mq的杂合体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
（1） 水稻植株基因组DNA的提取；
（2） 将权利要求1所述的四条分子标记引物Wx-mq-O-F、Wx-mq-O-R、Wx-mq-I-F和Wx-mq-I-R加入同一PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；20 μL PCR反应体系包括：10 ng/μL的 DNA 2.0 μL，4 pmol/ μL的引物2.0 μL ，其中引物Wx-mq-O-F、Wx-mq-O-R、Wx-mq-I-F和Wx-mq-I-R各0.5 μL，含25 mmol/L MgCl2的10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L的dNTP 0.4 μL，5 U/μL 的Taq 0.5 μL和ddH2O 13.1 μL；
PCR反应程序包括：95 ℃预变性5 min；然后95℃变性30s、65℃复性30s、72℃延伸1min，循环35次；然后72℃延伸7min，10℃冷却10min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应；
（3） 反应产物在质量比浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，记载：
如果同时有439 bp和292 bp两条特征条带，则为暗胚乳突变基因Wx-mq的纯合体；如果同时有439 bp和200 bp两条特征条带，则为不含暗胚乳突变基因Wx-mq的纯合体；如果同时存在439 bp、292 bp和200 bp的三条特征条带，则说明该植株是暗胚乳突变基因Wx-mq的杂合体。
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