CN102613069B - 一种改良bt型粳稻恢复系条纹叶枯病抗性的育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改良BT型粳稻恢复系条纹叶枯病抗性的育种方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。选用条纹叶枯病感病粳稻恢复系宁恢8号为受体亲本，含Stv-b ⁱ 基因的条纹叶枯病抗病品种关东194为供体亲本，通过连续回交、自交，同时利用分子标记进行辅助选择，将条纹叶枯病的抗性基因转育到优良恢复系宁恢8号中。这种选育抗病粳稻恢复系的方法，既避免了实际育种中对大量单株恢复力的测交鉴定，又减少了条纹叶枯病田间抗性筛选的工作量，提高了育种效率，降低了劳动强度，缩短了育种年限。同时，利用该方法育成的宁恢8号抗病改良系在生产中也具有重要的应用价值。

Description

一种改良BT型粳稻恢复系条纹叶枯病抗性的育种方法

一、技术领域

本发明涉及一种改良BT型粳稻恢复系条纹叶枯病抗性的育种方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。

二、背景技术

水稻是我国第一大粮食作物，常年种植面积在3000万公顷以上。其中杂交籼稻的种植面积达1,733万公顷，约占籼稻面积的80%，水稻总面积的50%以上；而粳稻种植面积约为828万公顷，主要以常规粳稻为主，杂交粳稻比例不足4%。与杂交籼稻相比，杂交粳稻的发展非常滞后（邓华风等，杂交水稻，2006，21（1）：1-6；汤述翥等，杂交水稻，2008，23（1）：1-5；王才林，西南农业学报，2009，22（4）：1165-1169）。近年来，随着人民生活水平的提高以及粳米消费需求的不断增长，为具有增产潜力杂交粳稻的发展开拓了广阔的空间。据资料显示，如果杂交粳稻的年种植面积从占粳稻面积的3% 扩大到50%，就有希望每年增产35亿公斤优质稻谷（邓华风，杂交粳稻理论与实践，2006，北京：中国农业出版社）。因此，加强杂交粳稻（特别是三系杂交粳稻）的品种选育，对保障我国粮食安全，促进农业增效、农民增收具有重要意义。

雄性不育系和恢复系是选配三系杂交粳稻优势组合的基础。在不育系选育方面，大多以BT 型（来自印度春籼品种，Chinsurah BoroⅡ）雄性不育细胞质材料为受体，优良常规粳稻品种（品系）为供体，通过连续的回交转育而成，其产量、品质和抗性等综合形状较好，其重点在于对开花、异交习性的选择（袁隆平等，杂交水稻育种栽培学，1988，83-84；）；相比之，粳稻恢复系的选育周期长、难度大、过程相对繁琐，其主要原因在于恢复系必须具有恢复基因，否则不能使后代杂交种具有自交结实的能力，而一般粳稻中没有相应的恢复源，很难从已有的粳稻品种直接获得恢复系，必须通过人工杂交、基因重组的方法将恢复基因从籼稻导入到粳稻中再进行单株测交鉴定。后来为简化育种程序，就借助于不育细胞质来选育同质恢，但由于细胞质遗传背景相同必定导致组合杂种优势的降低（李建红等，作物学报，2005，31（7）：851-857）。因此，杂交粳稻品种培育的重点在于恢复系的选育，而提高优良恢复系的选择效率必须首先实现对恢复基因快速、准确的鉴定。

已有研究表明，粳稻BT型细胞质雄性不育系的育性恢复是由第10染色体长臂的Rf-1基因控制，它由两个相关的育性恢复基因Rf1a 和Rf1b组成，编码定向线粒体的PPR蛋白，其中Rf1a编码的蛋白RF1A以内切方式切断B-atp6/orf79 mRNA来阻止ORF79蛋白的产生使育性恢复，而Rf1b编码的蛋白RF1B则通过降解B-atp6/orf79 mRNA 使育性恢复，在RF1A 和RF1B 同时存在时，RF1A 具有优先作用。与可以恢复胞质雄性不育的近等基因系（Rf-1Rf-1）相比，不能恢复胞质雄性不育的近等基因系（rf-1rf-1）在Rf1a位点上存在1 bp和574 bp两处缺失（Komori et al., Euphytica, 2003, 129(2): 241-247；Wang et al., The Plant cell, 2006, 18(3): 676-687）。这些研究为进一步开发分子标记辅助选育粳稻恢复系奠定了重要基础。

然而，粳稻恢复系的选育不仅在于恢复性的保留、农艺性状的提高，同时在育种目标中还必须兼顾一些地区性重大病害的抗性。条纹叶枯病（Rice stripe disease）是由灰飞虱传播条纹叶枯病毒（Rice stripe virus，RSV）引起的一种水稻病害。1998年以来，该病在江苏省的发生呈猛烈上升的趋势，2000年首次在苏北地区暴发，至2009年已连续10年在江苏省内流行，并向周边上海、浙江、安徽等省（市）蔓延，成为影响长江中下游地区粳稻生产的重要病害。据初步统计，苏、浙、沪、皖等地条纹叶枯病的年受害面积都在3000万亩以上，其中轻度感病（病株率<5%）的面积约占60~70%，偏重发病（病株率为10-30%）的面积占15-20%，重发成灾（病株率>30%）的面积为3~5%，严重田块甚至颗粒无收，给农户造成惨重的经济损失（王才林等，江苏农业科学，2006，3：1-5）。

条纹叶枯病对水稻生产的严重危害，促使抗病育种工作迅速开展，通过近十年的努力，取得了部分阶段性成果。在抗性资源筛选的基础上，通过杂交选育获得了一批不同熟期类型的抗病、优质常规粳稻品种如徐稻3号、扬辐粳8号、南粳44、南粳46等，并在生产上迅速推广，有效控制了条纹叶枯病对水稻生产的严重危害（刘超等，江苏农业科学，2003，6：42-43；何震天等，江苏农业科学，2006，3：61；王才林等，江苏农业科学，2007，2：43-44；王才林等，江苏农业科学，2008，2：91-92）。与常规粳稻抗病育种水平相比，杂交粳稻面临着非常尴尬的局面。一方面，一些综合性状优异、配合力较好的优良粳稻恢复系如湘晴、R161、申恢254等受条纹叶枯病的影响，其配组利用受到限制；另一方面，曾经推广的一些优质、高产杂交粳稻组合如常优1号、常优2号、86优8号等由于高感条纹叶枯病，正逐渐退出生产，而一些新育成的杂交组合其抗性水平还不过硬，很难达到高抗水平（端木银熙等，浙江农业科学，2002，2：73-75；端木银熙等，江苏农业科学，4：25；谷福林等，杂交水稻，2001，16（2）：59-60；）。因此，在杂交粳稻尤其是恢复系选育过程中，要充分借鉴常规粳稻抗条育种的成功经验，利用已知抗性基因的品种与现有感病恢复系进行杂交，并通过性状选择来改良其条纹叶枯病抗性，然后再进行广泛测配，加快抗病杂交粳稻新品种的选育。

水稻条纹叶枯病的抗性遗传研究表明，其品种抗性主要受两对显性互补基因Stv-a、Stv-b或一对显性基因Stv-b ⁱ 控制（Washio et al., Jpn. J. Breeding, 1968, 18 (2): 96-101；Washio et al., Jpn. J. Breeding,1968，18(3)：167-172；孙黛珍等，中国农学通报，2006，22（12）：318-322）。在这些基因中，来自巴基斯坦陆稻品种Modan的不完全显性基因Stv-b ⁱ 是目前对条纹叶枯病最为有效、遗传方式最为简单的抗性基因。它不仅能直接提供对病害的抗性，而且在生产上应用了40多年未有抗性丧失的报道（潘学彪等, 江苏农业科学, 2005, 5: 22-23）。Hayano-Saito等将Stv-b ⁱ 抗性基因定位在水稻第11染色体，标记XNpb220和XNpb257/XNpb254之间两个BAC重叠的约286Kb的区域，并与其中一个RFLP标记ST10完全连锁。这些标记能有效用于水稻条纹叶枯病的分子标记辅助育种研究（Hayano-Saito et al., Theor. Appl. Genet., 1998, 96(8): 1044-1049）。

综上所述，培育抗条纹叶枯病粳稻恢复系，不仅为抗病杂交粳稻组合的选育奠定了重要的材料基础，同时也对解决条纹叶枯病对该地区水稻生产的严重威胁以及满足城乡居民对优质粳米日益增长的消费需求具有重要意义。粳稻恢复系的抗性改良，传统育种的做法是利用农艺性状优异、配合力好的感病恢复系与含条纹叶枯病基因的抗性粳稻品种进行一系列杂交，并根据抗性和其它农艺性状的田间表现进行单株选择，同时在下一代对这些中选单株进行测交并根据后代结实情况，判断恢复基因是否存在，最终获得具有条纹叶枯病抗性、恢复基因纯合的材料。然而，这种方法不仅会受到植株生长发育阶段、环境条件等因素的影响，而且在多个优良性状的基因聚合方面也存在诸多问题，既费时费力，又特别容易造成目的基因的丢失。因此，在粳稻恢复系条纹叶枯病抗性的改良过程中发明一种高效鉴定、选择和聚合条纹叶枯病恢复基因、抗性基因的育种方法，对提高抗病优良粳稻恢复系的选择效率，加速杂交粳稻的跨越式发展具有至关重要的作用。

三、发明内容

技术问题：本发明针对BT型抗条纹叶枯病粳稻恢复系选育过程中恢复基因、抗性基因难以有效鉴定、选择和聚合的技术难题，采用高效转育和分子标记辅助选择来提高育种效率，在恢复系中实现抗病、恢复基因的有效聚合，是本发明的宗旨。

技术方案：

本发明的内容是一种改良BT型粳稻恢复系条纹叶枯病抗性的育种方法，其特征在于：

1）选用恢复基因位点基因型为Rf1aRf1a，条纹叶枯病基因型为stv-b ⁱ stv-b ⁱ 的江苏感病优良恢复系宁恢8号为母本♀与恢复基因位点基因型为rf1arf1a，条纹叶枯病基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 的日本抗病优质常规粳稻品种关东194为父本♂杂交获得F₁；

2）以宁恢8 号为母本，F₁代植株为父本进行第1次回交，获得BC₁F₁杂种。对BC₁F₁单株进行恢复基因和条纹叶枯病抗性基因的分子标记检测，苗期各单株DNA的提取采用SDS法；

BT型粳稻恢复基因Rf1a的分子检测，利用InDel标记引物InDel-Rf1a： 

正向引物（InDel-Rf1a-F）序列为 5'-CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3'

反向引物（InDel-Rf1a-R）序列为 5'- TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3'

扩增水稻品种的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，选择具有1,145 bp特征条带的Rf1a纯合基因型单株；PCR反应程序包括：95 ℃预变性5 min；然后95℃变性30 s、55℃复性30 s、72℃延伸1 min，循环35次；然后72℃延伸7 min，10℃冷却10 min。

条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测，利用SCAR标记引物ST-10：

正向引物（ST-10-F）序列5`-CGAAAGATGGTTTCTCCACC-3`，

反向引物（ST-10-R）序列5`-GACCAAGCAACTAATGACGC-3`，

扩增水稻品种的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，选择具有727 bp特征条带的含Stv-b ⁱ 纯合或杂合基因型单株；PCR反应程序包括：95 ℃预变性5 min；然后95℃变性30 s、63℃复性30 s、72℃延伸1 min，循环35次；然后72℃延伸7 min，10℃冷却10 min；

3）选择BC₁F₁代中同时含有Rf1a基因纯合基因型（1,145 bp特征条带）和Stv-b ⁱ 杂合基因型（727 bp特征条带）的单株作父本与宁恢8号进行第2次回交获得BC₂F₁杂种，对BC₂F₁植株进行条纹叶枯病抗性基因的分子标记检测，选择含Stv-b ⁱ 杂合基因型（727 bp特征条带）的单株作父本与宁恢8号进行第3次回交获得BC₃F₁杂种，对BC₃F₁植株继续进行条纹叶枯病抗性基因的分子标记检测，选择收获含Stv-b ⁱ 杂合基因型（727 bp特征条带）的单株；

4）将BC₃F₁单株自交加代种植成BC₃F₂株系，并对其进行条纹叶枯病抗性基因的分子标记检测，选择Stv-b ⁱ 基因纯合或基因型（727 bp特征条带）的单株继续自交，获得BC₃F₃株系。利用恢复基因和条纹叶枯病抗性基因分子标记对条纹叶枯病免疫的小区继续进行检测，选择所有单株均具有恢复基因（1,145 bp特征条带）和条纹叶枯病抗性基因（727 bp特征条带）的稳定小区即为同时含有Rf1a和Stv-b ⁱ 基因纯合体的小区，即为本发明所获得的具有条纹叶枯病抗性的改良BT型粳稻恢复系材料。

5）对上述双基因纯合的小区进行农艺性状考查的同时与不育系进行测配，选择农艺性状和组合优势水平与原始受体恢复系宁恢8号基本一致的品系，即为宁恢8号条纹叶枯病的抗性改良品系，其恢复基因型为Rf1aRf1a，条纹叶枯病基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 。 

有益效果

本发明提供的一种改良BT型粳稻恢复系条纹叶枯病抗性的育种方法，具有以下优点：

（1）        本发明方法中涉及辅助选择的分子标记均为PCR标记，由于不涉及DNA测序、限制性内切酶等的使用，因此不存在操作烦琐，费用昂贵等弊端，更为高效、快捷，同时在各育种世代苗期可以快速、准确实现对恢复基因Rf1a和条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 不同基因型的筛选，极大的提高了育种工作的预见性；

（2）        本发明方法，不仅在抗病粳稻恢复系选育过程中避免了对恢复基因的测交鉴定，同时也大幅度减少了条纹叶枯病田间抗性筛选的工作量，提高了育种效率，简化了育种程序，降低了劳动强度，缩短了育种年限；

（3）        本发明方法针对性强，新育成的宁恢8号抗病改良系与原始粳稻恢复系宁恢8号相比，在农艺性状、配合力等方面基本一致，仅在条纹叶枯病抗性方面得到显著改善。利用其不仅可以与已审定组合不育系（863A）直接配组应用，也可以与新的不育系进行测交、筛选强优势抗病组合，同时作为优良亲本还能进一步杂交选育新的抗病恢复系。

四、附图说明

图1  宁恢8号//宁恢8号/关东194 BC₁F₁植株恢复基因Rf1a和条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测（A：恢复基因Rf1a检测；B：条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 检测）

（M：DNA分子量标准，100-2,000 bp；1：宁恢8号；2：关东194；3：F₁；4-24：宁恢8号//宁恢8号/关东194 BC₁F₁部分单株）

图2  宁恢8号//宁恢8号/关东194 BC₂F₁植株条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测

（M：DNA分子量标准，100-2,000 bp；1：宁恢8号；2：关东194；3：F₁；4-24：宁恢8号//宁恢8号/关东194 BC₂F₁部分单株）

图3  宁恢8号//宁恢8号/关东194 BC₃F₁植株条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测

（M：DNA分子量标准，100-2,000 bp；1：宁恢8号；2：关东194；3：F₁；4-24：宁恢8号//宁恢8号/关东194 BC₃F₁部分单株）

图4  宁恢8号//宁恢8号/关东194 BC₃F₂植株条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测

（M：DNA分子量标准，100-2,000 bp；1：宁恢8号；2：关东194；3：F₁；4-24：宁恢8号//宁恢8号/关东194 BC₃F₂部分单株）

图5  宁恢8号//宁恢8号/关东194 BC₃F₃双基因纯合小区恢复基因Rf1a和条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测（A：恢复基因Rf1a检测；B：条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 检测）

（M：DNA分子量标准，100-2,000 bp；1：宁恢8号；2：关东194；3：F₁；4-24：宁恢8号//宁恢8号/关东194 BC₃F₃双基因纯合小区部分单株）

图6  宁恢8号条纹叶枯病抗性改良系选育系谱图

图7  恢复系宁恢8号、抗性改良系以及与BT型不育系90167A组合后代的植株形态

（A：宁恢8号；B：宁恢8号抗性改良系；C：90167A/宁恢8号；D：90167A/宁恢8号抗性改良系）

生物保藏：

粳稻恢复系宁恢8号条纹叶枯病抗性改良系，该品种于2012年2月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.5792 ，分类命名：水稻（Oryza sativa）。 

五、具体实施方式

为充分公开本发明一种改良BT型粳稻恢复系条纹叶枯病抗性的育种方法，以下结合方法验证和实施实例加以说明。其具体实施步骤如下：

（1）亲本选择  

宁恢8号，晚粳稻恢复系，江苏省农业科学院粮食作物所育成，该恢复系穗大粒多，恢复力强，花粉量足，稻米品质优，配组优势明显。利用宁恢8 号与三系BT型不育系863A 配组而成的早熟晚粳类型杂交组合86 优8 号于2000 年4月通过江苏省农作物品种审定委员会审定，同时宁恢8 号与其它不育系配组也具有明显的杂种优势，但由于高感水稻条纹叶枯病，限制了其在生产上的进一步利用。恢复基因位点基因型为Rf1aRf1a，条纹叶枯病基因型stv-b ⁱ stv-b ⁱ 。

关东194，抗条纹叶枯病优质常规粳稻品种（日本引进），日本茨城县育成，2003年农林水产省登录，登录名为农林387号。恢复基因位点基因型为Rf1aRf1a，条纹叶枯病基因型Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 。

以上两个品种（系）均为公知公用材料，江苏省农业科学院可免费提供。具体参考文献为：（谷福林等，优质杂交粳稻新组合86优8号，杂交水稻，2001，16（2）：59-60；http://ineweb.narcc.affrc.go.jp/。）

（2）分子标记的开发

1）粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因Rf1a InDel标记的开发

根据Wang（The Plant cell, 2006, 18(3): 676-687）等的研究结果，利用水稻恢复基因位点Rf1a的基因组信息，设计引物对该位点序列进行PCR扩增并直接测序，获得Rf1a位点的基因组序列。通过序列分析证实，已测序的多个粳稻BT型细胞质雄性不育恢复系和不育系（同核异质保持系）在Rf1a位点都存在的574 bp的碱基差异。利用Rf1a基因的核苷酸序列在水稻基因组网站（Gene Bank, www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载其位于水稻第10染色体长臂所在PAC克隆（P1-derived artificial chromosome，PAC）的核酸序列（OSJNBa0017E08，AC068923），并对相关序列进行分析；然后，利用Primer Premier 5.0（http://www.premierbiosoft.com）在574bp碱基插入缺失区域的附近，设计、合成相应的插入/缺失标记，并命名为InDel-Rf1a。其正向引物序列为5'-CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3'，反向引物序列为5'- TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3'，退火温度为55℃。

2）粳稻条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ  SCAR标记的开发

根据Hayano-Saito（Theor. Appl. Genet., 1998, 96(8): 1044-1049）等的研究结果，利用与Stv-b ⁱ 完全连锁的RFLP标记ST10的序列信息，通过测序，利用Primer Premier 5.0（http://www.premierbiosoft.com）设计、合成获得相应的SCAR标记，并命名为ST-10。其正向引物序列为5`-CGAAAGATGGTTTCTCCACC-3`，反向引物序列为5`-GACCAAGCAACTAATGACGC-3`，退火温度63℃。

3）水稻植株基因组DNA的提取

水稻植株基因组DNA的提取参照SDS法（Dellaporta S L, et al., Plant Mol B iol Rep, 1983 , 1 (1): 19221.）。具体步骤为：取水稻苗期叶片，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入1.5 mL 离心管；加入600 uL提取液（20%SDS，1M Tris-HCl，0.5M EDTA，5M NaCl，65℃预热），摇匀，65℃温浴30 min，中间振荡3~4次；加入1/4体积5M KAC, 摇匀后置冰上30 min；加入氯仿-异戊醇（24:1）300~400 uL，在摇床上充分振荡，120 rpm，30 min；8,000~10,000rpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清（400 uL左右）至另一离心管；加入等体积氯仿-异戊醇（24:1），摇床上充分振荡，80~90 rpm，30 min；8,000 rpm离心15分钟，转移上清（400 uL左右）至新的离心管；加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12,000 rpm离心6min；弃无水乙醇，加入4℃70%乙醇，放置10 min，弃上清，超净工作台上风干1h；加入100~200 uL TE，-20℃保存。

4）PCR扩增和电泳检测

20 μL PCR反应体系包括：10 ng/μL的 DNA 2.0 μL，4 pmol/ μL的引物2.0 μL ，其中基因正、反向引物各1.0 μL，10×PCR 含有25 mmol/L MgCl₂ 的Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L的dNTP 0.4 μL，5 U/μL 的Taq 0.5 μL和ddH₂O 13.1 μL；

PCR反应程序包括：PCR反应程序包括：95 ℃预变性5 min；然后95℃变性30 s、（55℃，Rf1a基因；63℃，Stv-b ⁱ 基因）复性30 s、72℃延伸1 min，循环35次；然后72℃延伸7 min，10℃冷却10 min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。

反应产物在质量比浓度为1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，记载。

（3）水稻条纹叶枯病田间抗性发病调查

水稻育秧选择在重发地区灰飞虱虫源丰富的小麦田旁，秧田期和移栽后均不对灰飞虱进行防治。条纹叶枯病发病调查参照Washio等（Bull Chugoku Agr. Exp. Sta. Series., 1968, 16：39-197）制定的抗性分级别标准进行（0级，无症状；1级，有轻微黄绿色斑驳症状，病叶不卷曲，植株生长正常；2级，病叶上褪绿扩展相连成不规则黄白色或黄绿色条斑，病叶不卷曲或略有卷曲，生长基本正常；3级，病叶严重褪绿，病叶卷曲呈捻转状，少数病叶出现黄化枯萎症状；4级，大部分病叶卷曲呈捻转状，叶片黄化枯死，植株呈假枯心状或整株枯死）。其中，0、1级记为不发病，2～4级直接记为发病，1级在7天后再次调查确认，并按周彤（植物保护学报, 2007, 34(5): 475-479）等制定的方法进行抗性评价，计算平均发病率，并根据平均发病率进行抗性评价（免疫，发病率为0；高抗，发病率低于5%；抗病，发病率介于5.1%～15%；中感，发病率介于15.1%～30%；感病，发病率介于30.1%～50%；高感，发病率高于50.1%）。

（4） 粳稻恢复系宁恢8号条纹叶枯病抗性改良系的选育

1）2008年夏，选用恢复基因位点基因型为Rf1aRf1a，条纹叶枯病基因型为stv-b ⁱ stv-b ⁱ 的江苏感病优良恢复系宁恢8号为母本♀与恢复基因位点基因型为rf1arf1a，条纹叶枯病基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 的日本抗病优质常规粳稻品种关东194为父本♂杂交获得F₁；

2）2008年冬，以宁恢8 号为母本，F₁代植株为父本进行第1次回交，获得BC₁F₁杂种；

3）2009年夏，对31个BC₁F₁单株进行恢复基因Rf1a和条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子标记检测（图1），在同时含有Rf1a基因纯合基因型（1,145 bp特征条带）和Stv-b ⁱ 杂合基因型（727 bp特征条带）的8个BC₁F₁单株中选择4个单株作父本分别与宁恢8号进行第2次回交，获得4个株系的BC₂F₁杂种；

4）2009年冬，对4个BC₂F₁株系（每个株系40株）共160个单株进行条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测（图2），在其中1个株系中选择3个含Stv-b ⁱ 杂合基因型的单株（727 bp特征条带）作父本分别与宁恢8号进行第3次回交，获得3个株系的BC₃F₁杂种；

5）2010年夏，对3个BC₃F₁株系（每个株系40株）的120个单株进行条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测（图3），在3个BC₃F₁小区中选择含Stv-b ⁱ 杂合基因型（727 bp特征条带）的11个单株带海南加代；

6）2010年冬，对11个BC₃F₂株系（每个株系40株）的440个单株进行条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测（图4），在9个类似宁恢8号的小区内选择含Stv-b ⁱ 基因纯合或杂合基因型（727 bp特征条带）的单株112个；

7）2011 年夏，对112个BC₃F₃株系（每个株系44株）进行条纹叶枯病抗性的田间鉴定，对其中抗性免疫，农艺性状优良、稳定的株系进行恢复基因Rf1a和条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测，这些小区每个单株均具有恢复基因（1,145 bp特征条带）和条纹叶枯病抗性基因（727 bp特征条带）（图5），这说明这些株系均为Rf1a和Stv-b ⁱ  基因的纯合体，即为本发明所获得的具有条纹叶枯病抗性的改良BT型粳稻恢复系材料。

8）对上述双基因纯合的小区进行农艺性状考查的同时与不育系进行测配（表1，表2），其中农艺性状和组合优势水平与原始受体恢复系宁恢8号基本一致的株系，即为具有条纹叶枯病抗性的宁恢8号改良品系，其恢复基因型为Rf1aRf1a，条纹叶枯病基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 。（如保藏编号为CGMCC NO.5792的宁恢8号改良系）（图6，图7）。

表1  BT型粳稻恢复系宁恢8号和条纹叶枯病抗性改良系主要农艺性状和发病率的比较

材料名称

抽穗期

株高

穗数

穗长

穗颈长

一次枝梗数

二次枝梗数

实粒数

总粒数

结实率（%）

千粒重（g）

条纹叶枯病发病率（%）

宁恢8号

8/18

106.0a

7.3a

24.5a

7.5a

16.5a

67.9a

229.0a

250.1a

91.8a

22.16a

24.6a

抗性改良系

8/18

106.8a

7.6a

24.6a

9.8a

16.7a

68.7a

229.8a

249.1a

92.3a

22.12a

0b

注：Duncan新复极差检测，表中数据后的字母相同表示差异不显著，小写字母表示在0.05水平时差异显著性。

表2  BT型粳稻恢复系宁恢8号和条纹叶枯病抗性改良系与不育系测交后代F₁

主要农艺性状和发病率的比较

材料名称

抽穗期

株高

穗数

穗长

穗颈长

一次枝梗数

二次枝梗数

实粒数

总粒数

结实率（%）

千粒重（g）

条纹叶枯病发病率（%）

90167A/宁恢8号

8/24

103.1a

7.8a

20.9b

4.7a

15.3a

61.9a

211.1a

235.9a

89.5a

26.18a

17.2

90167A/抗性改良系

8/24

102.1a

8.2a

21.7a

4.9a

15.2a

65.4a

217.2a

242.7a

89.6a

26.67a

0 b

注：Duncan新复极差检测，表中数据后的字母相同表示差异不显著，小写字母表示在0.05水平时差异显著性。

SEQUENCE LISTING

 

 

<110>  江苏省农业科学院

 

 

<120>  一种改良BT型粳稻恢复系条纹叶枯病抗性的育种方法

 

 

<130>  0

 

 

<160>  4    

 

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  正向引物InDel-Rf1a-F

<222>  (1)..(21)

<223> 

 

 

 

<400>  1

ctgatgatcg aggaggaggt a                                               21

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  反向引物InDel-Rf1a-R

<222>  (1)..(21)

<223> 

 

 

 

<400>  2

taacgcgtct tccatcctac t                                               21

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  正向引物ST-10-F

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  3

cgaaagatgg tttctccacc                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工

 

 

<220>

<221>  反向引物ST-10-R

<222>  (1)..(20)

<223> 

 

 

 

<400>  4

gaccaagcaa ctaatgacgc                                                 20

 

 

Claims (2)

1.一种改良BT型粳稻恢复系条纹叶枯病抗性的育种方法，其特征在于：

1）选用恢复基因位点基因型为Rf1aRf1a，条纹叶枯病基因型为stv-b ⁱ stv-b ⁱ 的江苏感病优良粳稻恢复系宁恢8号为母本♀与恢复基因位点基因型为rf1arf1a，条纹叶枯病基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 的日本抗病优质常规粳稻品种关东194为父本♂杂交获得F₁；

2）以宁恢8 号为母本，F₁代植株为父本进行第1次回交，获得BC₁F₁杂种，对BC₁F₁植株进行恢复基因和条纹叶枯病抗性基因的分子标记检测，选择BC₁F₁代中同时含有Rf1a纯合基因型特征条带和Stv-b ⁱ 杂合基因型特征条带的单株作父本与宁恢8号进行第2次回交获得BC₂F₁杂种，对BC₂F₁植株进行条纹叶枯病抗性基因的分子标记检测，选择含Stv-b ⁱ 杂合基因型特征条带的单株作父本与宁恢8号进行第3次回交获得BC₃F₁杂种，对BC₃F₁植株继续进行条纹叶枯病抗性基因的分子标记检测，选择收获含Stv-b ⁱ 杂合基因型特征条带的单株；其中，

BT型粳稻恢复基因Rf1a的分子检测，利用InDel标记引物InDel-Rf1a：

正向引物InDel-Rf1a-F序列为 5'-CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3'

反向引物InDel-Rf1a-R序列为 5'- TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3'

扩增水稻植株的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，选择具有1,145 bp特征条带的即为含Rf1a纯合基因型的单株；

条纹叶枯病抗性基因Stv-b ⁱ 的分子检测，利用SCAR标记引物ST-10：

正向引物ST-10-F序列5'-CGAAAGATGGTTTCTCCACC-3'，

反向引物ST-10-R序列5'-GACCAAGCAACTAATGACGC-3'，

扩增水稻品种的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，选择具有727 bp特征条带的含Stv-b ⁱ 纯合或杂合基因型单株；

PCR反应程序包括：95 ℃预变性5 min；然后95℃变性30 s、Rf1a基因在55℃或Stv-b ⁱ 基因在63℃复性30 s、72℃延伸1 min，循环35次；然后72℃延伸7 min，10℃冷却10 min；

3）将BC₃F₁单株自交加代种植成BC₃F₂株系，并对其条纹叶枯病抗性基因进行分子检测，选择Stv-b ⁱ 纯合或杂合基因型的单株继续自交，获得BC₃F₃株系；

4）种植BC₃F₃株系，利用恢复基因和条纹叶枯病抗性基因分子标记对条纹叶枯病免疫的小区继续进行检测，选择所有单株均具有恢复基因特征条带和条纹叶枯病抗性基因特征条带的稳定小区为同时含有Rf1a和Stv-b ⁱ  基因纯合体的小区，即为所获得的具有条纹叶枯病抗性的改良BT型粳稻恢复系材料。

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于：

对所述含有Rf1a和Stv-b ⁱ  基因纯合体的小区进行农艺性状考查的同时与不育系进行测配，选择农艺性状和组合优势水平与原始受体恢复系宁恢8号基本一致的品系，即为具有条纹叶枯病抗性的宁恢8号改良品系，其恢复基因型为Rf1aRf1a，条纹叶枯病基因型为Stv-b ⁱ Stv-b ⁱ 。

3、根据权利要求1或2所述的育种方法，其特征在于：所述条纹叶枯病免疫的小区指的是条纹叶枯病发病率为0%的小区。

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