CN100569958C - 水稻条纹叶枯病抗性基因Stvb-i的分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻条纹叶枯病抗性基因Stvb-i的分子标记方法，属于农业生物工程技术领域。依据前人对条纹叶枯病抗性基因Stvb-i的定位结果，利用分子生物学和生物信息学的方法设计了13对与水稻条纹叶枯病抗性基因Stvb-i紧密连锁的SSR标记，其中1对标记RM11-8在抗、感育种亲本关东194(携带Stvb-i基因)和武粳13之间呈现多态性。利用已知抗、感基因型的该组合高世代小区对该标记进行了抗性选择效果的评价，其吻合率为90.74%。因此，RM11-8可作为该组合抗水稻条纹叶枯病辅助选择的分子标记，预测其抗性基因型，大大提高水稻条纹叶枯病抗性品种的选择效率和鉴定效率。

Description

水稻条纹叶枯病抗性基因Stvb-i的分子标记方法

一、技术领域

本发明涉及水稻条纹叶枯病抗性基因Stvb-i的分子标记方法，属于农业生物工程技术领域，专用于水稻条纹叶枯病抗性品种的选育和纯度鉴定。

二、背景技术

水稻条纹叶枯病是由条纹叶枯病毒(Rice Stripe Virus，RSV)引起的病毒病，其传毒介体主要是灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen.)。该病于1897年最早发生在日本关东的群马、枥木等地区，而我国最早发生该病是在1964年。近几年，随着气候环境和种植结构调整，水稻条纹叶枯病发病规模有着不断扩大的趋势。江苏自1964～1965年首次发生以来，就一直在苏南地区存在，个别年份危害较重。1998年以后，条纹叶枯病在江苏省的发生呈猛烈上升趋势，2000年首次在苏北地区暴发，至2007年已连续8年在江苏省范围内流行且受灾面积均在千万亩以上，成为影响江苏粳稻生产的头号杀手(王才林，江苏农业科学，2006，(3)：1-5)。

尽管早在本世纪60年代，日本水稻遗传学家就对水稻条纹叶枯病抗性资源进行了大量筛选、鉴定以及遗传分析工作，但迄今仍只有两种主要的病毒抗性基因的遗传机制被阐明。一种以日本陆稻品种为代表，抗性由两对显性互补基因Stva(Stv1)和Stvb(Stv2)共同控制；另一种以一些非日本籼稻品种为代表，抗性由一对不完全显性基因Stvb-i(Stv3)控制(陈涛等，江苏农业科学，2006，(2)：1-4)。随着分子标记技术的发展，对由主基因和微效多基因结合控制的遗传以及微效多基因控制的遗传进行分析已经成为可能。到目前为止，利用不同的遗传群体已初步定位了27个QTLs(孙黛珍等，中国农学通报，2006，22(12)：318-321)，但这些QTLs中如果除去上述主要的三个位点外，其它位点的效应值均不太大，很难在实际生产中得到应用。

分析国内外目前育成的抗条纹叶枯病栽培粳稻系谱，发现其抗性基因最初来源于两个籼稻品种Modan和Mudgo，进一步研究证实这两个抗性品种的抗性基因均为Stvb-i，所以选育含Stvb-i抗性基因的水稻品种是控制水稻条纹叶枯病危害最经济、有效的方法。对已研究清楚的抗性基因加以有效利用，可以缩短育种周期，满足国内目前对抗条纹叶枯病优质水稻品种的迫切需要。然而，利用传统的田间或室内接虫鉴定的方法对Stvb-i基因进行后代追踪不仅耗时耗力，而且存在诸多不确定因素，利用分子标记辅助选择方法可以有效的解决这一难题。Hayano-Saito Y(Hayano-Saito Y，et al.Theor Appl Genet.2000，101(1)：59-63)利用RFLP或CAPs标记已将Stvb-i抗性基因限定在第11染色体两个克隆序列重叠的约286Kb的区域内。然而，这些标记的信息尚未公开，难以用于辅助选择育种，因此筛选与Stvb-i紧密连锁的SSR标记，无疑可以加速标记辅助选择技术在条纹叶枯病抗性品种选育过程中的利用。

三、发明内容

技术问题：本发明是针对上述情况，利用分子生物学和生物信息学的方法以含Stvb-i基因的日本水稻品种关东194为材料，筛选和寻找稳定存在的与水稻条纹叶枯病抗性基因Stvb-i紧密连锁的SSR分子标记，并用于辅助育种。

技术方案：水稻条纹叶枯病抗性基因Stvb-i的分子标记方法，其特征在于：

用显性SSR标记RM11-8引物

正向序列为TAGCCATGCTCATGCGTCAT

反向序列为CGCGGTTTGCAGTAGTTGC

扩增水稻条纹叶枯病抗性品种或育种材料DNA，如果能够扩增出157bp的单一条带，则表明抗条纹叶枯病基因Stvb-i存在，该基因位于水稻第11染色体上。

有益效果水稻条纹叶枯病是影响粳稻生产的一种严重病毒病害。本发明利用分子生物学和生物信息学的方法筛选到一个与水稻条纹叶枯病抗性基因Stvb-i紧密连锁的SSR标记，该标记的应用可以加速条纹叶枯病抗性品种选育。其优点具体归纳如下：

(1)与一些效应较小且受环境影响较大的水稻条纹叶枯病抗性位点(QTLs)相比，Stvb-i以其稳定、过硬的抗性以及主效、简单的遗传方式而被广泛应用传统育种。对Stvb-i基因进行分子标记辅助选择，可以快速培育出大量抗性稳定的水稻品系或品种。

(2)传统育种是利用含抗性基因的亲本与生产上常用的品种进行一系列杂交，然后对条纹叶枯病抗性进行单株选择。由于该病的抗性受环境条件的影响很大，表型鉴定结果的可靠性偏低，因此通过田间抗性鉴定或室内接虫鉴定来判断条纹叶枯病抗性基因型，不仅费时费力，而且难度大，成本高。通过对其抗性基因紧密连锁标记的带型检测，可预测其抗性基因型，进而在苗期即可鉴定高抗单株，这样不仅节约鉴定费用，而且大大提高抗条纹叶枯病水稻品种的选择效率。

(3)本发明获得的与条纹叶枯病抗性基因Stvb-i紧密连锁的SSR标记，其检测快速、简单，结果稳定、可靠，适合在短时间内的对大量育种材料进行标记基因型的检测，以判断其是否具有水稻条纹叶枯病抗性，并进行筛选。

四、附图说明

图1水稻条纹叶枯病抗性品种“关东194”的系谱

图2开发水稻条纹叶枯病抗性辅助选择标记所涉及的染色体片段

图3SSR引物RM11-8对田间抗、感小区的筛选电泳图谱

(a)RM11-8对田间抗病小区的筛选(PR：关东194；PS：武粳13；F₁：武粳13/关东194；1～8：田间抗性和分子鉴定一致单株；9～10：田间抗性和分子鉴定不一致单株)

(b)RM11-8对田间感病小区的筛选(PR：关东194；PS：武粳13；F₁：武粳13/关东194；1～9：田间抗性和分子鉴定一致单株；10：田间抗性和分子鉴定不一致单株)

图4SSR标记RM11-8对39个条纹叶枯病抗性品系的电泳筛选图谱

(PR：关东194；PS：武粳13；F₁：武粳13/关东194；1～8：田间抗性和分子鉴定一致的品系；9～10：田间抗性和分子鉴定不一致的品系)

五、具体实施方式

(结合附图具体说明)

(1)材料：

抗病品种关东194：抗条纹叶枯病的优质粳稻品种(日本引进，含“Modan”的Stvb-i抗性基因，图1)，日本茨城县育成，2003年农林水产省登录，登录名为农林387号。抗条纹叶枯病，基因型为Stvb-iStvb-i，该品种全生育期130～135天，株高85～95cm，每株有效穗6～8个，每穗实粒数95～105粒，结实率93％～95％，千粒重24～25g。

感病品种武粳13：江苏高产粳稻品种，江苏省武进区稻麦育种场育成，2003年审定定名。条纹叶枯病抗性基因型为stvb-istvb-i。该品种全生育期156天，株高97～102cm，每株有效穗8～10个，每穗实粒数115～125粒，结实率92％～93％，千粒重27～28g。

由抗、感组合武粳13/关东194产生的高世代抗病和感病小区。

1999年在海南选用江苏高产粳稻品种武粳13(武育5021)(感病亲本，条纹叶枯病抗性基因型为stvb-istvb-i)为母本(♀)与引进的抗条纹叶枯病的优质粳稻品种关东194(抗性亲本，基因型为Stvb-iStvb-i)为父本

杂交配组。2000年在南京种植F₁组合，同年冬在海南种植F₂，成熟后全部单株混收，2001年在南京种植F₃，成熟后全部单株混收。F₂代选单株衍生F₃小区，以后每个小区继续收获一个单株加代衍生成相应小区。2002年(F₄)开始选择单株，此后(2003～2005年)每年在南京种植各世代(F₅～F₇)株系。单株选择材料每年正季种植于江苏省农业科学院粮食作物研究所试验田(南京)，5月15～18日播种，秧田设置在灰飞虱虫源丰富的小麦田边。6月15～18日移栽。每个株系种植40～50株，2行或4行区，行株距17cm×17cm，小区间空1行。田间管理按常规方法进行，秧田期和移栽后30天内不防治灰飞虱。

(2)与Stvb-i紧密连锁SSR标记的选取、开发及多态性筛选

利用Hayano-Saito Y(Hayano-Saito Y，et al.Theor Appl Genet.1998，96(8)：1044-1049)对水稻条纹叶枯病抗性基因Stvb-i的定位结果，并结合日本水稻基因组网站(www.rpg.dna.affrc.go.jp/IRGSP)已公布的第11染色体整合图谱的数据，发现在目标基因上方3.0cM处的一个RFLP标记C1172(第11染色体-80.2cM)在整合图谱中同样存在，从该标记向下到另一个RFLP标记E1126S(第11染色体-84.3cM)共4.1cM的区段内查找到10个克隆序列(图2)。利用已公布的微卫星标记并用SSR搜索软件-SSR HUNTER 2.0对10个克隆序列中可能存在的SSR位点进行查询、筛选，并设计、合成了13对SSR引物。利用上述13对引物在抗性亲本关东194和感病亲本武粳13间进行多态性筛选，结果只有一对引物RM11-8(表1)在抗性亲本和感病亲本组合中呈现多态性，多态频率极小(7.69％)，这可能是抗、感亲本均为粳稻，遗传差异较小的缘故。RM11-8的带型为显性，其F₁的带型与感病亲本一致。

表1  在两个亲本间表现多态的SSR标记RM11-8

(3)田间鉴定

从2004年正季农艺性状基本稳定时开始对这些小区的水稻条纹叶枯病抗性进行大田鉴定。移栽30天后调查条纹叶枯病的自然发病情况，以感条纹叶枯病品种武育粳3号为对照，利用条纹叶枯病大发生的自然条件进行抗性筛选，发病单株病级参照Washio等(1968)制定的抗性鉴定标准，即A级：长势很差，病叶整片或部分萎蔫，叶片卷曲、枯死；B级：长势很差，但病叶不萎蔫，下部黄叶病斑连续，上部叶有褪绿症状；Bt级：症状与B相似，但长势较差；Cr级：长势较弱，病叶略卷曲，病部略黄，呈零星点状或条纹状，病健部交界明显；C级：长势略弱，零星点状略黄，病健部有间隔；D级：长势很好，初期可见的很小病斑随苗的生长被掩饰。将A、B和Bt作为感病，Cr、C、D和未出现症状的作为抗病，计算小区中感病植株的比例为发病率。将发病率分成一级(＜4.9％)、二级(5％～9.9％)、三级(10％～19.9％)、四级(20％～39.9％)和五级(≥40％)5个等级。根据系谱关系统计不同发病率等级单株后代出现各级单株的比例，评价抗性筛选的效果。

为了确保鉴定结果的可靠性，小区育秧均选择在江苏省农业科学院粮食作物研究所试验田(南京)小麦田周围，且对这些小区不喷洒任何杀虫剂，以保证充足虫量的迁入，每年单株接虫量均保证在5头以上。水稻病情调查分3次，前两次在水稻条纹叶枯病发病高峰期进行，后一次在水稻分蘖盛期进行，发病程度用小区发病率(感病单株占小区48个单株的百分比)表示。连续三年鉴定为高抗的108个小区(无典型发病株)，视其抗性基因型为Stvb-i Stvb-i，对三年连续鉴定为高感的68个小区(发病率≥感病亲本)，视其感病基因型为stvb-i stvb-i。2006年正季病情调查结束后，采用SDS法提取抗感亲本、F₁及代表高世代纯合抗性小区基因型的一个抗性单株和代表高世代纯合感病小区基因型的一个感病单株的叶片提取DNA。PCR扩增反应根据Chen(Chen X et al.Theor Appl Genet，1997，95(4)：553-567.)报道，反应产物在4％琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，记载。

(4)标记选择效率评价：在优良组合武粳13/关东194的高世代小区中，选择三年连续鉴定为高抗小区的抗性单株(抗病基因型为Stvb-i Stvb-i)和高感小区的感病单株(感病基因型为stvb-i stvb-i)进行标记RM11-8的筛选(图3)。结果显示：对田间鉴定为纯合抗病基因型的小区进行RM11-8的筛选时，纯合抗性亲本带型的小区数与田间鉴定为纯合抗病的小区数其吻合率为90.74％；对田间鉴定为纯合感病的小区进行RM11-8的筛选时，由于RM11-8为显性标记无法区分纯合感病亲本带型和抗感杂合带型，故无法对其感病小区的吻合率做准确判别(表2)。因此，对抗性基因型小区进行SSR标记RM11-8的筛选所产生的吻合率90.74％更适合作为本试验对水稻条纹叶枯病抗性基因辅助选择效果的评价指标。

表2  田间鉴定和RM11-8标记筛选结果对比

(5)SSR标记RM11-8在实际育种中的应用

移栽后30天在农艺性状稳定的小区采取单株叶片，用SDS法提取DNA(DellaportaSL，Wood J，Hicks JB.A plant DNA minipreparation：Version II.Plant Mol Biol Rep，1983，1(1)：19～21)。根据引物RM11-8序列进行PCR扩增。正向序列为TAGCCATGCTCATGCGTCAT，反向序列为CGCGGTTTGCAGTAGTTGC。扩增体系10μl，DNA模板1μl，94℃预变性5min，94℃变性0.5min，59℃复性0.5min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃再延伸7min。反应产物在3.5％琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，根据带型判断各单株的抗性基因型，获得157bp单一条带的确定为抗性基因型Stvb-iStvb-i的抗病株系。根据分子标记辅助选择的上下世代的抗性表现，评价标记辅助选择的效果。我们利用标记RM11-8对武粳13/关东194的后代选种单株进行大量筛选，淘汰纯合感病亲本或F₁带型的单株(极个别农艺性状优良株予以保留)，保留纯合抗性亲本带型的单株。至2007年，对该组合进入课题组品比试验的39个高产、优质、抗条品系(其中4个品系已进入江苏省各类中间试验)再次进行了标记检测和田间发病情况调查(均为高抗，发病率低于2％)。结果显示除JD7033和JD7301的带型为纯合感病亲本或F₁带型而表现高抗外，其它37个品系的分子检测结果均为纯合抗性亲本带型且大田鉴定结果亦表现为高抗(图4)。因此，通过上述SSR分子标记来鉴定Stvb-i基因型并筛选抗病水稻植株，可以迅速提高我国水稻条纹叶枯病抗性品种的育种进程。结合条纹叶枯病自然发病情况调查结果，只在基因型为Stvb-iStvb-i、抗性级别达到一、二级的小区选择单株。2006年获得条纹叶枯病抗性稳定、农艺性状一致的优质、高产新品系“宁5055”，其株高98～102cm，每株8～10穗，穗长16cm，穗型偏直立，每穗总粒数140～150粒，结实率90％～92％，千粒重26～27g。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>水稻条纹叶枯病抗性基因Stvb-i的分子标记方法

<130>说明书

<140>00

<141>2008-01-03

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>RM11-8引物正向序列

<222>(1)..(20)

<223>

<400>1

tagccatgct catgcgtcat                                    20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>RM11-8引物反向序列

<222>(1)..(19)

<223>

<400>2

cgcggtttgc agtagttgc                                     19

Claims (1)

1、水稻条纹叶枯病抗性基因Stvb-i的分子标记方法，其特征在于：

用显性SSR标记RM11-8引物

正向序列为TAGCCATGCTCATGCGTCAT

反向序列为CGCGGTTTGCAGTAGTTGC

扩增水稻条纹叶枯病抗性品种DNA，如果能够扩增出157bp的单一条带，则表明抗条纹叶枯病基因Stvb-i存在，该基因位于水稻第11染色体上。

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