CN101223860A - 一种抗条纹叶枯病水稻的育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗条纹叶枯病水稻的育种方法，属水稻遗传改良与生物技术应用领域。它是一种通过遗传改良途径，用杂交和分子标记辅助选择方法将一个亲本的条纹叶枯病抗性基因Stvb－i转育到另一个优质高产亲本中去，获得抗病优质高产新品种的育种技术。这种技术的优点是，可以快速鉴定出带抗性基因Stvb－i的单株，大大提高选择效率，缩短育种年限。这种水稻新品种不仅对条纹叶枯病表现稳定抗性，可比感病品种少用1～2次农药，降低生产成本，减少环境污染；而且聚合了杂交亲本双方的抗条纹叶枯病、优质、高产等特性，在江苏、上海、浙江等近年来条纹叶枯病猖獗发生的地区具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗条纹叶枯病水稻的培育方法，属水稻遗传改良与生物技术应用领域。
背景技术
水稻条纹叶枯病(rice stripe disease)是由灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen.)传播的条纹叶枯病毒(rice stripe virus，RSV)引起的水稻病毒病，它广泛分布于亚洲和欧洲，特别是在日本、中国、朝鲜、乌克兰等地区时而暴发成灾。1897年最早发生在日本关东的枥木、群马等县。1963年水稻条纹叶枯病在中国江苏苏南地区始发，1964年即在江、浙、沪普遍发生，其后从华南、长江流域到华北、京津、辽宁等18个省(市)的水稻种植区均有发生。20世纪70年代在北京郊区、80年代在山东南部和云南地区数度流行，造成严重损失。在江苏，水稻条纹叶枯病自1963年首次发生以后一直存在，个别年份危害较重。1998年以来，条纹叶枯病在江苏省的发生呈猛烈上升的趋势，2000年首次在苏北地区爆发，发病面积超过1000万亩，2001～2003年均达1500万亩左右，2004年达到2357万亩，占水稻总面积的79％，至2007年已连续8年在江苏省范围内流行。据实地调查，2000～2004年条纹叶枯病平均病株率5～30％，重病田病株率高达50～60％，严重田块达80％以上，造成严重的产量损失，成为影响江苏省粳稻产量的重大病害之一。近年来，该病在上海、浙江、安徽、山东、河南等省(市)也呈流行趋势。
水稻条纹叶枯病之所以在江苏省大范围暴发，有气候变化特别是连续多年的暖冬造成病毒传播媒介害虫灰飞虱越冬虫量的增加，以及水稻早播早栽、麦田套播等耕作制度改变造成越冬灰飞虱迁入秧稻田基数的增加等原因。然而，缺乏抗病品种也是造成水稻条纹叶枯病暴发的主要原因之一。国内外抗病育种的经验表明，选育抗病品种是控制水稻病害最经济有效的方法。20世纪60年代，日本就是通过育成“中国31”等第一代抗病品种控制了水稻条纹叶枯病在日本全国范围的大发生，1980年琦玉县农业试验场育成对条纹叶枯病表现很强抗性的“Musashikogane”，迅速控制了条纹叶枯病在琦玉、群马县的危害。以后选育的品种多数抗条纹叶枯病。然而，条纹叶枯病抗性育种涉及到抗源亲本的选用、抗性基因的转育、鉴定、筛选等。同时，江苏是水稻高产省，全省水稻单产全国第一，近年来优质育种步伐也很快。因此，发明一种高效的抗性基因的转育与选择鉴定方法，聚合抗病、优质、高产基因于一体，是本发明的宗旨。
发明内容
技术问题本发明的一种高效的抗性基因的转育与选择鉴定方法，聚合抗病、优质、高产基因于一体，是本发明的宗旨。
技术方案本发明的内容是一种抗条纹叶枯病水稻的培育方法，其特征在于：
1)选用条纹叶枯病抗性基因型为stvb-istvb-i的江苏高产粳稻品种武粳13为母本(♀)与基因型为Stvb-iStvb-i的抗条纹叶枯病、优质粳稻品种关东194为父本
杂交配组；
2)种植F1、F2、F3，成熟后全部单株混收；
3)F4开始选择株高95～105cm、每株8～10穗、每穗140～160粒的单株；
4)种植F5～F7各世代株系，以感条纹叶枯病品种武育粳3号为对照；
5)田间抗性筛选：利用条纹叶枯病大发生的自然条件(感病对照武运粳3号最高自然发病株率达50％以上)进行抗性筛选，发病单株病级参照Washio等(1968)制定的抗性鉴定标准计算小区中感病植株的比例为发病率。将发病率分成一级(＜4.9％)、二级(5％～9.9％)、三级(10％～19.9％)、四级(20％～39.9％)和五级(≥40％)5个等级。选择抗性级别达到一级或二级、农艺性状稳定的小区；
6)分子标记辅助选择：在农艺性状稳定的小区移栽后30天采取单株叶片，用SDS法提取DNA(Dellaporta SL，Wood J，Hicks JB.A plant DNA minipreparation：Version II.PlantMol Biol Rep，1983，1(1)：19～21)，用引物RM11-8序列进行PCR扩增。正向序列为TAGCCATGCTCATGCGTCAT，反向序列为CGCGGTTTGCAGTAGTTGC。扩增体系10μl，DNA模板1μl，94℃预变性5min，94℃变性0.5min，59℃复性0.5min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃再延伸7min。反应产物在3.5％琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，获得157bp条带的确定为抗性基因型Stvb-iStvb-i的抗病株系；
7)结合条纹叶枯病自然发病情况田间抗性筛选结果，F4开始只在基因型为Stvb-iStvb-i、抗性级别达到一、二级的小区选择株高95～105cm、每株8～10穗、每穗140～160粒的单株，获得条纹叶枯病抗性稳定、农艺性状一致的优质、高产新品系“宁5055”，其株高98～102cm，每株8～10穗，穗长16cm，穗型偏直立，每穗总粒数140～150粒，结实率90％～92％，千粒重26～27g。
有益效果本发明的优点和效果是，通过以上方法可快速鉴定出带抗性基因Stvb-i的单株，大大提高选择效率，缩短育种年限，由此育成的水稻新品种对条纹叶枯病表现稳定抗性，可比感病品种少用1～2次农药，降低生产成本，减少环境污染。
本发明方法育成的新品种聚合了杂交亲本双方的抗条纹叶枯病、优质、高产等特性，在江苏、上海、浙江等近年来条纹叶枯病猖獗发生的地区具有广阔的应用前景。
附图说明
图1分蘖期抗条纹叶枯病品种宁5055(左)与感病品种武育粳3号(右)的比较
图2成熟期抗条纹叶枯病品种宁5055(左)与感病品种武育粳3号(右)的比较
图3“宁5055”选育系谱图
图4 SSR引物RM11-8对田间抗(a)、感(b)小区的筛选结果
PR：关东194，PS：武粳13，F1：武粳13/关东194
(a)RM11-8对田间抗病小区的筛选(1～8：抗病株9～10：交换株)
(b)RM11-8对田间感病小区的筛选(1～9：感病株10：交换株)
具体实施方式
选择亲本武粳13，江苏高产粳稻品种，江苏省武进区稻麦育种场育成，2003年审定定名。条纹叶枯病抗性基因型为stvb-istvb-i。该品种全生育期156天，株高97～102cm，每株有效穗8～10个，每穗实粒数115～125粒，结实率92％～93％，千粒重27～28g。
关东194，抗条纹叶枯病的优质粳稻品种(日本引进)，日本茨城县育成，2003年农林水产省登录，登录名为农林387号。抗条纹叶枯病，基因型为Stvb-iStvb-i，该品种全生育期130～135天，株高85～95cm，每株有效穗6～8个，每穗实粒数95～105粒，结实率93％～95％，千粒重24～25g。
品种选育1999年在海南选用江苏高产粳稻品种武粳13(武育5021)(感病亲本，条纹叶枯病抗性基因型为stvb-istvb-i)为母本(♀)与引进的抗条纹叶枯病的优质粳稻品种关东194(抗性亲本，基因型为Stvb-iStvb-i)为父本杂交配组。2000年在南京种植F1组合，同年冬在海南种植F2，成熟后全部单株混收，2001年在南京种植F3，成熟后全部单株混收种成小区。2002年(F4)开始选择单株，此后(2003～2005年)每年在南京种植各世代(F5～F7)株系。单株选择材料每年正季种植于江苏省农业科学院粮食作物研究所试验田(南京)，5月15～18日播种，秧田设置在灰飞虱虫源丰富的小麦田边。6月15～18日移栽。每个株系种植40～50株，2行或4行区，行株距17cm×17cm，小区间空1行。田间管理按常规方法进行，秧田期和移栽后30天内不防治灰飞虱。
田间抗性筛选移栽30天后调查条纹叶枯病的自然发病情况，以感条纹叶枯病品种武育粳3号为对照，利用条纹叶枯病大发生的自然条件进行抗性筛选，发病单株病级参照Washio等(1968)制定的抗性鉴定标准，即A级：长势很差，病叶整片或部分萎蔫，叶片卷曲、枯死；B级：长势很差，但病叶不萎蔫，下部黄叶病斑连续，上部叶有褪绿症状；Bt级：症状与B相似，但长势较差；Cr级：长势较弱，病叶略卷曲，病部略黄，呈零星点状或条纹状，病健部交界明显；C级：长势略弱，零星点状略黄，病健部有间隔；D级：长势很好，初期可见的很小病斑随苗的生长被掩饰。将A、B和Bt作为感病，Cr、C、D和未出现症状的作为抗病，计算小区中感病植株的比例为发病率。将发病率分成一级(＜4.9％)、二级(5％～9.9％)、三级(10％～19.9％)、四级(20％～39.9％)和五级(≥40％)5个等级。根据系谱关系统计不同发病率等级单株后代出现各级单株的比例，评价抗性筛选的效果。
分子标记辅助选择根据Hayano-Saito等(1998)对水稻条纹叶枯病抗病基因Stvb-i的定位结果，结合日本水稻基因组网站(www.rpg.dna.affrc.go.jp/IRGSP)已公布的第11染色体整合图谱的数据，设计并合成SSR引物，利用这些引物在抗性亲本关东194和感病亲本武粳13间进行多态性筛选，获得在抗病亲本和感病亲本间呈现多态性的一对引物RM11-8(引物正向序列为TAGCCATGCTCATGCGTCAT，反向序列为CGCGGTTTGCAGTAGTTGC)。RM11-8的带型(157bp)为显性，其F1的带型与感病亲本一致(图4)。
移栽后30天在农艺性状稳定的小区采取单株叶片，用SDS法提取DNA(Dellaporta SL，Wood J，Hicks JB. A plant DNA minipreparation：Version II.Plant Mol Biol Rep，1983，1(1)：19～21)。根据引物RM11-8序列进行PCR扩增。扩增体系10μl，DNA模板1μl，94℃预变性5min，94℃变性0.5min，59℃复性0.5min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃再延伸7min。反应产物在3.5％琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，根据带型判断各单株的抗性基因型，获得157bp单一条带的确定为抗性基因型Stvb-iStvb-i的抗病株系。根据分子标记辅助选择的上下世代的抗性表现，评价标记辅助选择的效果。
通过引物RM11-8分子标记辅助选择，确认抗病株系的抗性基因型Stvb-iStvb-i。成熟后结合条纹叶枯病自然发病情况调查结果，F4开始只在基因型为Stvb-iStvb-i、抗性级别达到一、二级的小区选择株高95～105cm、每株8～10穗、每穗140～160粒的单株。2006年获得条纹叶枯病抗性稳定、农艺性状一致的优质、高产新品系“宁5055”，其株高98～102cm，每株8～10穗，穗长16cm，穗型偏直立，每穗总粒数140～150粒，结实率90％～92％，千粒重26～27g。
序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>一种抗条纹叶枯病水稻的育种方法
<130>说明书
<140>00
<141>2008-01-03
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>RM11-8引物正向序列
<222>(1)..(20)
<223>
<400>1
tagccatgct catgcgtcat 20
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>RM11-8引物反向序列
<222>(1)..(19)
<223>
<400>2
cgcggtttgc agtagttgc 19
Claims (1)
1.一种抗条纹叶枯病水稻的育种方法，其特征在于：
1)选用条纹叶枯病抗性基因型为stvb-istvb-i的江苏高产粳稻品种武粳13为母本(♀)与条纹叶枯病抗性基因型为Stvb-iStvb-i的优质粳稻品种关东194为父本
杂交配组；
2)种植F1、F2、F3，成熟后全部单株混收；
3)F4开始选择株高95～105em、每株8～10穗、每穗140～160粒的单株；
4)种植F5～F7各世代株系，以感条纹叶枯病品种武育粳3号为对照；
5)田间抗性筛选：利用条纹叶枯病大发生的自然条件，即感病对照武运粳3号最高自然发病株率达50％以上的条件对株系进行抗性筛选，发病单株病级参照Washio等1968年制定的抗性鉴定标准计算小区中感病植株的比例为发病率，将发病率分成5个等级：发病率＜4.9％分为一级、发病率5％～9.9％分为二级、发病率10％～19.9％分为三级、发病率20％～39.9％分为四级和发病率≥40％分为五级；选择抗性级别达到一级或二级、农艺性状稳定的小区；
6)分子标记辅助选择：在农艺性状稳定的小区移栽后30天采取单株叶片2～3片，用SDS法提取DNA，用引物RM11-8序列进行PCR扩增：
正向序列为TAGCCATGCTCATGCGTCAT，
反向序列为CGCGGTTTGCAGTAGTTGC；
扩增体系10μl，DNA模板1μl，94℃预变性5min，94℃变性0.5min，59℃复性0.5min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃再延伸7min，反应产物在3.5％琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，获得157bp单一条带的确定为抗性基因型Stvb-iStvb-i的抗病株系；
7)结合条纹叶枯病自然发病田间抗性筛选结果，F4开始只在基因型为Stvb-iStvb-i、抗性级别达到一、二级的小区选择株高95～105cm、每株8～10穗、每穗140～160粒的单株，获得新品系“宁5055”，其株高98～102cm，每株8～10穗，穗长16 cm，穗型偏直立，每穗总粒数140～150粒，结实率90％～92％，千粒重26～27g。
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