CN102766625A

CN102766625A - 抗稻褐飞虱主效基因bph22(t)的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN102766625A
Application number: CN2012102609392A
Authority: CN
Inventors: 李容柏; 陈保善; 黄大辉; 邱永福; 黄凤宽; 张月雄; 韦燕萍; 刘芳
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2032-07-20
Also published as: CN102766625B

Abstract

本发明提供了水稻抗褐飞虱主效基因bph22(t)的分子标记及其应用。通过将水稻抗虫品系W2183

Description

抗稻褐飞虱主效基因bph22(t)的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及水稻抗褐飞虱主效基因bph22(t)的分子标记，本发明还涉及该分子标记在选育水稻抗褐飞虱品种中的应用。

背景技术

水稻是我国的主要粮食作物之一，它的生产直接关系到我国的粮食安全、农民增收和农村稳定。水稻种植过程中面临着种类繁多的病虫害危害，严重时对其产量构成严重的威胁。其中，褐飞虱就是一种爆发力强、危害性大的水稻害虫。上世纪60年代以前，褐飞虱仅在我国局部稻区时有发生。其后，随着气候、环境、种植结构、耕作制度和栽培方式等的变化，褐飞虱为害地域由南向北扩展，发生频次增加，危害程度加重。据中国农业年鉴记载，目前我国每年水稻稻飞虱（主要是褐飞虱）发生面积为2000万公顷以上，每年因稻飞虱危害造成的直接产量损失达280万吨以上。一直以来，褐飞虱的防治主要是依靠施用化学杀虫剂。杀虫剂的大量施用，在一定程度上和一定时间段内控制了褐飞虱的危害，但也消灭了稻田中的褐飞虱天敌。如此循环，极易诱发褐飞虱的“再猖獗”（resurgence），给防治带来更大的困难。

褐飞虱连年持续爆发的主要原因是我国推广种植的绝大部分水稻品种不抗虫，加上杂交稻品种株型高大，中后期田间群体大，茎叶茂密，田间郁蔽度高，营养适宜，非常有利于褐飞虱快速繁殖，对褐飞虱等虫害表现为“超感虫性”，在虫源基数大、气候条件适宜时，极易形成爆发流行之势，造成严重危害。实践证明利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是褐飞虱综合防治中最为经济、有效、安全、生态的方法。

水稻抗褐飞虱基因的研究始于上世纪70年代初，迄今已至少命名26个来自野生稻种和栽培稻农家品种资源的主效抗褐飞虱基因（http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase_submission/gene_nomenclature/）。大部分鉴定的抗褐飞虱基因均已经用分子标记定位到水稻染色体上。早期研究的抗褐飞虱基因如Bph1、bph2和Bph3，以及后来鉴定的Bph14和Bph15已培育成抗虫品种（品系）并在一些水稻种植区推广种植。然而，由于褐飞虱新生物型的产生，抗褐飞虱品种逐渐丧失抗性或面临抗性丧失的危险。例如，带有Bph1的抗虫品种，经过几年推广种植后很快就失去抗性，而携带Bph1和bph2两个基因的品种抗性表现更强并更持久。因此，水稻生产中迫切需要携带新的和多个抗性基因的抗虫品种，由于抗虫性鉴定的复杂性和不稳定性，利用常规育种手段往往难以有效地导入和聚合不同的抗虫基因。筛选、寻找更多有用的抗性基因，应用于今后的基因聚合，培育出更有效、具有持久广谱抗性的优良品种（系）具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻抗褐飞虱主效基因位点bph22(t)的分子标记，通过检测与这些抗褐飞虱主效基因位点连锁的分子标记，可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，加快抗褐飞虱水稻品种的选择进度。

水稻抗褐飞虱主效基因bph22(t)的分子标记由下述之一的引物对经PCR扩增获得：

1）标记引物，RM16846

左端引物序列，CTACAAGCAACACAGTATCACAGC

右端引物序列，GGTAACTGGTGCTTATTTAGCC；

2）标记引物，RM16852

左端引物序列，GTAGCCTTGCACTCGACCGTACC

右端引物序列，ACCAACTCTGGCAATGCATCC；

3）标记引物，RM16853

左端引物序列，CTCCCATCCTTCATTTCATCTCG

右端引物序列，CTTTCTGCAAGACACTGCAAACG；

4）标记引物，RM16858

左端引物序列，ACGATAACGGCTCTGTTTCTTCG

右端引物序列，CGTATCTCGTGGTTGCAGATCG；

5）标记引物，RM16874

左端引物序列，TAGCAAGCTTGGAGAAGTGATGG

右端引物序列，CAGAAGAAGTCAGCTCTATGCTTGG；或，

6）标记引物，RM16888

左端引物序列，AGGGAATTCCAGCAAAGGAACC

右端引物序列，GTTGCATTGCATAGCGACTCAGG。

本发明还提供水稻抗褐飞虱主效基因bph22(t)的分子标记方法，其是用上述之一的引物对扩增待检水稻基因组DNA，如果用引物RM16846能够扩增出256bp的扩增片段，或者用引物RM16852能够扩增出97bp的扩增片段，或者用引物RM16853能够扩增出170bp的扩增片段，或者用引物RM16858能够扩增出122bp的扩增片段，或者用引物RM16874能够扩增出157bp的扩增片段，或者用引物RM16888能够扩增出98bp的扩增片段，则标志着该待检水稻存在抗褐飞虱主效基因bph22(t)。

该基因位点位于水稻基因组第4染色体长臂的分子标记RM6846和RM16853之间的区域内。本发明用抗性鉴定和遗传分析将bph22(t)初步定位在分子标记RM6846和RM16888之间。接着用6010个BC₁F₂单株进行抗虫鉴定和极端抗性单株的分子标记基因型分析，根据这些单株的基因型和抗虫级别，分子标记RM6846和RM16853与抗褐飞虱主效基因bph22(t)最靠近，其中RM16852与抗性基因完全连锁，同时分子标记RM16858、RM16874和RM16888均能用于筛选含bph22(t)基因的抗褐飞虱水稻品种。

筛选上述标记引物的过程如下：

（1）最初，Li et al.（Li RB,Li LS,Wei SM et al,2006,The evaluation andutilization of new genes for brown planthopper resistance in common wild rice(Oryza rufipogon Griff.).Mol Plant Breeding4(3):365-371）从广西普通野生稻的转育后代中进行抗褐飞虱鉴定并筛选出对稻褐飞虱生物型1和2、孟加拉、湄公河（越南）、九龙江（越南）、潘特纳加（印度）等6种生物型均具有广谱高抗性的抗源W2183。用该抗源与感性品种TN1（由广西农科院植保所提供）杂交、回交及自交构建的BC₂F₂群体进行抗性基因的定位，初步定位在分子标记RM6506和RM273之间。后来分别利用感性品种白毛和白R54重新构建BC₁F₂群体对抗性基因进行精细定位。因此，本发明筛选并开发了基于PCR技术的SSR分子标记。一方面，根据gramene网站（http://www.gramene.org/）公布的标记按照比较均匀的遗传距离选择一定数目分子标记。另一方面，基于该基因最后的定位区段，参考并比较已测序的水稻品系9311及日本晴相应的基因组序列，利用SSR搜索工具SSRIT（http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool）来寻找SSR基序，并根据其侧翼序列设计引物，为备选标记。其中，SSRIT设置参数为：最大基序长度为4聚体，最小重复数为5，搜索所有的SSR基序。选择所有大于15个碱基（基序长度×重复数）的SSR基序。

（2）以感褐飞虱粳稻品种白毛（日本引进品种，由华南农业大学刘耀光教授提供）或白R54（由湖南杂交水稻工程研究中心白德朗研究员提供）为母本，抗褐飞虱品系W2183（广西普通野生稻，由本实验室保存材料）为父本，配制杂种、自交、回交、自交，分别构建了白毛/W2183和白R54/W2183的BC₁F₂分离群体，用于抗虫鉴定筛选极端抗虫单株并用于基因型分析。

（3）用CTAB法（Murray & Thompson，1980 Rapid isolation ofhigh-molecular-weight plant DNA.Nucleic Acids Res8:4321-4325）提取亲本W2183、白毛、白R54及BC₁F₂群体单株的DNA。用方法（1）获得的备选标记对亲本进行多态性筛选，PCR反应在Bioer扩增仪上进行，扩增产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，记录并选择在亲本间具有多态性的SSR标记用于后续分析。

（4）采用苗期接虫进行抗虫性鉴定，褐飞虱为南宁周边水稻田捕捉并饲养在感虫品种TN1上的群体（生物型1和生物型2混合群体）。三叶期按10-12头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，当对照感虫品种TN1全部死亡时，参照IRRI（1998）的方法对每个单株进行0、1、3、5、7、9级的抗性评价，对亲本材料和群体单株评价其抗性级别。

（5）根据BC₁F₂单株的抗虫级别，分别选择20个极端抗虫单株和20个极端感虫单株的DNA混合构建抗感池。同时，利用在亲本间有多态性的引物分别筛选抗感池并获得在抗感池之间有多态性的分子标记，该类多态性标记表明与抗性性状是连锁的。然后，根据连锁标记所在的染色体，选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选BC₁F₂分离群体的获得的极端抗性单株的基因型，PCR程序同上，获得极端群体基因型资料。根据连锁交换规律，参照Luo et al.（Luo JJ,Hao W，Jin J,Gao JP，Lin HX,2008,Fine mappingof Spr3,a locus for spreading panicle from African cultivated rice(Oryzaglaberrima Steud.).Mol Plant1:830-838）方法将群体基因型资料构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合BC₁F₂群体筛选的极端抗性单株的分子标记基因型资料和相应的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别，确定抗性基因所在标记间的位置。

（6）根据初次QTL鉴定的结果，本发明用感性品种白毛和白R54重新构建BC₁F₂群体对抗性基因进行精细定位，DNA提取及SSR的PCR电泳分析同上述步骤（2），获得与抗褐飞虱主效基因bph22(t)共分离的分子标记。

本发明提供了一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，是利用本发明提供的上述8个引物对之一进行PCR扩增待检水稻基因组DNA，如果用引物RM16846能够扩增出256bp的扩增片段，或者用引物RM16852能够扩增出97bp的扩增片段，或者用引物RM16853能够扩增出170bp的扩增片段，或者用引物RM16858能够扩增出122bp的扩增片段，或者用引物RM16874能够扩增出157bp的扩增片段，或者用引物RM16888能够扩增出98bp的扩增片段，则标志着该待检水稻存在抗褐飞虱主效基因bph22(t)。

本发明是在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）技术则可以有目的地进行抗虫基因的导入和聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。本发明的有益效果表现在：

1．通过本发明首次用SSR标记精细定位了水稻品系W2183中的抗褐飞虱主效基因bph22(t)。

2.通过本发明分子标记定位的主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与该基因位点连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有褐飞虱抗性，进而快速筛选抗虫品种或品系用于水稻育种。其检测方便快速，不受环境影响。

3.辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗虫基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对水稻品种进行抗褐飞虱性状的鉴定并进行选择，操作非常复杂，同时还受环境的影响。此外，在进行抗虫鉴定之前，首先要获得虫源并饲养繁殖褐飞虱群体，同时还要求接种虫源与水稻秧苗苗龄较同步，这同样给育种工作带来麻烦，若不能有效地处理好虫源、秧苗以及环境之间的关系，抗褐飞虱的表型鉴定结果可靠性就很低。因此，抗虫育种不仅费时，而且难度大，成本高。然而，通过检测抗褐飞虱主效基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗褐飞虱的单株，淘汰其他植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率，极大地缩短水稻品种的育种周期。

附图说明

图1．水稻材料W2183抗褐飞虱主效基因bph22(t)在第4染色体的定位。A，bph22(t)初步定位。垂直线表示水稻第四染色体，水平短线表示染色体上的分子标记，括号内的数值表示标记间的遗传距离（cM），n为群体的单株数目；B，bph22(t)精细定位。bph22(t)定位于RM16846和RM16853之间86.3kb的区域，RM16852与抗性基因完全连锁。n表示筛选的BC₁F₂极抗单株总数。

图2.分子标记RM16853在亲本及后代单株中的扩增带型。1白毛，2白R54，3特青，4W2183，11DNA marker标记，其余数字标示的点样孔均为后代单株。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

（一）白毛/W2183BC₁F₂群体构建及表型鉴定

（1）Li et al.(2006)从广西普通野生稻的转育后代中进行抗褐飞虱鉴定并筛选出对稻褐飞虱生物型1和2、孟加拉、湄公河（越南）、九龙江（越南）、潘特纳加（印度）6种生物型均具有广谱高抗性的抗源W2183。用该抗源与感性品种TN1杂交、回交及自交构建的BC₂F₂群体进行抗性基因的定位，初步定位在分子标记RM6506和RM273之间。利用感性品种白毛重新构建BC₁F₂群体对抗性基因进行精细定位。因此，本发明筛选并开发了基于PCR技术的SSR分子标记。为了寻找简单有效且与bph22(t)紧密连锁的分子标记，本发明以感虫品种白毛为母本，以抗褐飞虱水稻品系W2183为父本杂交，得到的F₁再自交，经过抗虫鉴定筛选获得极端抗性单株，再与感性亲本回交获得BC₁F₁再自交，从而构建了BC₁F₂分离群体并用于抗虫鉴定。

（2）对亲本、BC₁F₂群体的苗期进行抗虫性鉴定。为确保亲本和BC₁F₂群体中的种子生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。将种子播种于一个长52cm、宽37cm、高6cm，且盛有4cm厚营养土的面包盒中。每盒播种12行，每行播30粒，另外随机播种亲本和TN1（感性对照）各1行。播种7天后间苗，淘汰病弱苗。待苗长到三叶期时，按10-12头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上鉴定笼（46×30×42cm）。当感虫品种TN1全部死亡时，参照IRRI（1998）的方法对每个单株进行0、1、3、5、7或9级的抗性评价（表1），对亲本材料和群体的每个单株评价抗性级别。

表1水稻抗褐飞虱性能鉴定的分级标准

（二）参照上述（一）介绍的方法，构建白R54/W2183 BC₁F₂群体及表型鉴定

（1）Li et al.(2006)从广西普通野生稻的转育后代中进行抗褐飞虱鉴定并筛选出对稻褐飞虱生物型1和2、孟加拉、湄公河（越南）、九龙江（越南）、潘特纳加（印度）6种生物型均具有广谱高抗性的抗源W2183。用该抗源与感性品种TN1杂交、回交及自交构建的BC₂F₂群体进行抗性基因的定位，初步定位在分子标记RM6506和RM273之间。利用感性品种白R54重新构建BC₁F₂群体对抗性基因进行精细定位。因此，本发明筛选并开发了基于PCR技术的SSR分子标记。为了寻找简单有效且与bph22(t)紧密连锁的分子标记，本发明以感虫品种白R54为母本，以抗褐飞虱水稻品系W2183为父本杂交，得到的F₁再自交，经过抗虫鉴定筛选获得极端抗性单株，再与感性亲本回交获得BC₁F₁再自交，从而构建了BC₁F₂分离群体并用于抗虫鉴定。

（2）对亲本、BC₁F₂群体的苗期进行抗虫性鉴定。为确保亲本和BC₁F₂群体中的种子生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。将种子播种于一个长52cm、宽37cm、高6cm，且盛有4cm厚营养土的面包盒中。每盒播种12行，每行播30粒，另外随机播种亲本和TN1（感性对照）各1行。播种7天后间苗，淘汰病弱苗。待苗长到三叶期时，按10-12头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上鉴定笼（46×30×42cm）。当感虫品种TN1全部死亡时，参照IRRI（1998）的方法对每个单株进行0、1、3、5、7或9级的抗性评价，对亲本材料和群体的每个单株评价抗性级别。

（三）构建的BC₁F₂群体的分子标记分析

（1）用CTAB法（Murray & Thompson，1980 Rapid isolation ofhigh-molecular-weight plant DNA.Nucleic Acids Res8:4321-4325）提取亲本及BC₁F₂群体中筛选的极端抗性单株的基因组DNA。

（2）根据gramene网站（http://www.gramene.org/）公布的标记按照较均匀的遗传距离选择一定数目分子标记。另外，基于该基因最后的定位区段，比较已测序的参考水稻品系9311及日本晴相应的基因组序列，利用SSR搜索工具SSRIT（http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool）来寻找SSR基序，并根据其侧翼序列设计引物，为备选标记。其中，SSRIT设置参数为：最大基序长度为4聚体，最小重复数为5，搜索所有的SSR基序。选择所有大于15个碱基（基序长度×重复数）的SSR基序。

（3）SSR标记的分析采用10μl体系。10μl反应体系包括：10×PCR缓冲液，1.0μl；10mM dNTPs，0.1μl；10μM引物，0.4μl；5U/μl Taq DNA聚合酶，0.2μl和50ng DNA模板。扩增反应在Bioer PCR仪上进行：94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃40sec，32个循环；72℃5min。扩增产物用8%的非变性PAGE胶分离，通过银染显色。扩增的DNA条带利用装有荧光灯的灯箱进行观察。记录结果，亲本间有多态的引物在F₂群体中进行分析，获取群体基因型资料。

（4）根据BC₁F₂单株的抗虫级别，分别选择20个极端抗虫单株和20个极端感虫单株的DNA混合构建抗感池。同时，利用在亲本间有多态性的引物分别筛选抗感池并获得在抗感池之间有多态性的分子标记，该类多态性标记表明与抗性是连锁的。然后，根据连锁标记所在的染色体，选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选BC1F₂分离群体的获得的极端抗性单株的基因型，PCR程序同上，获得极端群体基因型资料。根据连锁交换规律，参照Luo et al（Luo JJ,Hao W，Jin J,Gao JP，Lin HX,2008,Fine mapping ofSpr3,a locus for spreading panicle from African cultivated rice(Oryzaglaberrima Steud.).Mol Plant1:830-838）方法将群体基因型资料构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合BC₁F₂群体筛选的极端抗性单株的分子标记基因型资料和相应的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别，确定抗性基因所在标记间的位置。

（四）利用分子标记筛选构建的BC₁F₂群体精细定位bph22(t)基因。

利用构建的BC₁F₂群体，共6010个BC₁F₂单株用来进行抗虫鉴定，筛选出极端抗性的单株346株用于精细定位。同时，利用初步定位区间开发的分子标记检测他们在极端抗性单株中的基因型，根据基因型和表现分析标记间的顺序以及抗性基因所在标记间的位置。

（五）结果与分析

苗期集团抗虫鉴定显示W2183的平均抗虫级别为2.9，其它2个感性亲本白毛和白R54的抗虫级别分别为9级，这表明W2183高抗褐飞虱而白毛和白R54高感褐飞虱。接着对构建的两个BC₁F₂群体进行抗虫鉴定，在鉴定的6010个单株中，抗虫级别为1、3、5、7、9的单株分别有46、300、150、584、4,930株。一般地，我们将抗虫级别≤7的单株确定为抗性单株，＞7的单株为感性单株。结果有1,080株抗性单株和4,930株感性单株，它们的比值均不符合1:3(χ_c ²=158>χ_c ²=3.84和1:15(χ_c ²=1407.1>χ_c ²=3.84)的遗传规律。可见，除了鉴定的抗性主效基因bph22(t)以外，可能还存在多个微效的抗性基因控制该群体的抗性遗传。对抗性基因进行初步定位后，根据对BC₁F₂群体进行抗褐飞虱鉴定，筛选出极抗单株。

根据gramene网站（http://www.gramene.org/）公布的标记按照比较均匀的遗传距离选择合成一定数目的分子标记。另外，基于该基因最后的定位区段，比较已测序的参考水稻品系9311及日本晴相应的基因组序列，利用SSR搜索工具SSRIT（http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool）来寻找SSR基序，并根据其侧翼序列设计引物，为备选标记。

用亲本间有多态性的SSR标记分析极端抗性单株的基因型，同时结合各单株的抗性值进行分析。结果表明抗性基因应该位于第4染色体长臂RM16846和RM16888间，两个标记间的遗传距离为1.2cM。

由于RM16846和RM16888之间的物理距离仍较大，在已测序的粳稻品种日本晴基因组中相距约452kb，为了寻找与bph22(t)连锁更紧密的标记，本发明在RM16846和RM16888之间开发了4个有效的分子标记（RM16852、RM16853、RM16858和RM16874）筛选了346个极端抗性单株。结果显示，4个标记检测到10个重组单株，其中RM16888检测到10个重组单株，RM16874和RM16858分别检测到6株和3株，RM16853检测到1株，RM16852与bph22(t)共分离，未检测到重组单株（表2）。通过连锁分析，我们将bph22(t)定位于RM16846和RM16853之间（图1）。在测序的日本晴品种中，RM16846和RM16853之间的物理距离有86.3kb，位于OSJNB005B21 BAC克隆上。因此，利用上述分子标记来鉴定bph22(t)抗性基因的存在具有非常高的效率，这样也大大提高我国水稻抗褐飞虱品种的育种进度。

表2分子标记筛选的BC₁F₂部分重组单株的基因型及表现型

表中所列单株是部分重组单株，通过分析重组单株基因型和抗虫级别，最终将bph22(t)基因定位于RM16846和RM16853之间。

实施例2分子标记的验证

1、材料和方法

1.1阴性品种：20份，感虫品种白毛、白R54、特青（由本实验室保存材料）、9311、日本晴、TN1、白毛×W2183杂交组合中的不抗虫材料14份。

阳性品种：抗性品系W2183，白毛×W2183，白R54×W2183杂交后代的抗虫材料19份。

分子标记引物：RM16846、RM16852、RM16853、RM16858、RM16874和RM16888，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-12所示。

1.2方法

CTAB抽提法提取水稻样品基因组DNA（方法同实施例1）。分别用引物RM16846、RM16852、RM16853、RM16858、RM16874和RM16888扩增样品DNA。10μl体系。10μl反应体系包括：10×PCR缓冲液，1.0μl；10mMdNTPs，0.1μl；10μM引物，0.4μl；5U/μl Taq DNA聚合酶，0.2μl和50ng DNA模板。扩增反应在Bioer PCR仪上进行：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，32个循环；72℃5min。扩增产物用8%的非变性PAGE胶分离，电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析。

2、结果：

用上述方法，分别对水稻品系W2183等40份不同样本进行扩增。结果表明，在阳性样本中均能分别扩增出相应的256bp片段、97bp片段、170bp片段、122bp片段、157bp片段和98bp片段，而在阴性样本中均不能扩增出这些片段。

由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗褐飞虱的主效基因bph22(t)，从而大大提高育种效率。

Claims

1.水稻抗褐飞虱主效基因bph22(t)的分子标记，其由下述之一的引物对经PCR扩增获得：

1）标记引物，RM16846

左端引物序列，CTACAAGCAACACAGTATCACAGC

右端引物序列，GGTAACTGGTGCTTATTTAGCC；

2）标记引物，RM16852

左端引物序列，GTAGCCTTGCACTCGACCGTACC

右端引物序列，ACCAACTCTGGCAATGCATCC；

3）标记引物，RM16853

左端引物序列，CTCCCATCCTTCATTTCATCTCG

右端引物序列，CTTTCTGCAAGACACTGCAAACG；

4）标记引物，RM16858

左端引物序列，ACGATAACGGCTCTGTTTCTTCG

右端引物序列，CGTATCTCGTGGTTGCAGATCG；

5）标记引物，RM16874

左端引物序列，TAGCAAGCTTGGAGAAGTGATGG

右端引物序列，CAGAAGAAGTCAGCTCTATGCTTGG；或，

6）标记引物，RM16888

左端引物序列，AGGGAATTCCAGCAAAGGAACC

右端引物序列，GTTGCATTGCATAGCGACTCAGG。

2.权利要求1所述分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。

3.水稻抗褐飞虱主效基因bph22(t)的分子标记方法，其通过下述之一的引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：

1）标记引物，RM16846

左端引物序列，CTACAAGCAACACAGTATCACAGC

右端引物序列，GGTAACTGGTGCTTATTTAGCC；

2）标记引物，RM16852

左端引物序列，GTAGCCTTGCACTCGACCGTACC

右端引物序列，ACCAACTCTGGCAATGCATCC；

3）标记引物，RM16853

左端引物序列，CTCCCATCCTTCATTTCATCTCG

右端引物序列，CTTTCTGCAAGACACTGCAAACG；

4）标记引物，RM16858

左端引物序列，ACGATAACGGCTCTGTTTCTTCG

右端引物序列，CGTATCTCGTGGTTGCAGATCG；

5）标记引物，RM16874

左端引物序列，TAGCAAGCTTGGAGAAGTGATGG

右端引物序列，CAGAAGAAGTCAGCTCTATGCTTGG；或，

6）标记引物，RM16888

左端引物序列，AGGGAATTCCAGCAAAGGAACC

右端引物序列，GTTGCATTGCATAGCGACTCAGG，

如果用引物RM16846能够扩增出256bp的扩增片段，或者用引物RM16852能够扩增出97bp的扩增片段，或者用引物RM16853能够扩增出170bp的扩增片段，或者用引物RM16858能够扩增出122bp的扩增片段，或者用引物RM16874能够扩增出157bp的扩增片段，或者用引物RM16888能够扩增出98bp的扩增片段，则标志着该待检水稻存在抗褐飞虱主效基因bph22(t)。

4.一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，其用权利要求1中所述的引物对之一PCR方法扩增待检水稻基因组DNA，如果用引物RM16846能够扩增出256bp的扩增片段，或者用引物RM16852能够扩增出97bp的扩增片段，或者用引物RM16853能够扩增出170bp的扩增片段，或者用引物RM16858能够扩增出122bp的扩增片段，或者用引物RM16874能够扩增出157bp的扩增片段，或者用引物RM16888能够扩增出98bp的扩增片段，则标志着该待检水稻存在抗褐飞虱主效基因bph22(t)。