CN113207682B - 一种强化高产优质耐生物和非生物胁迫多基因聚合及遗传背景稳定性的水稻育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种强化高产优质耐生物和非生物胁迫多基因聚合及遗传背景稳定性的水稻育种方法，属于作物遗传育种技术领域。该方法以大粒型恢复系桂451为母本，以籼稻恢复系蜀恢527为父本进行杂交，利用分子标记引物对6个目标基因(Pi5、Pita、Pid2、Pid3、bph2和Wx)基因型快速纯合稳定进行选择以及对主要目标性状进行表型鉴定选择，确保目标基因及性状的遗传稳定性；同时利用40K(分布于水稻12条染色体上的32887个SNP位点)基因芯片对高世代苗头品系进行全基因组遗传背景稳定性比较分析，确保遗传背景100％纯合稳定，最终培育高产优质耐生物和非生物胁迫水稻恢复系桂恢5501。

Description

一种强化高产优质耐生物和非生物胁迫多基因聚合及遗传背 景稳定性的水稻育种方法
技术领域
本发明属于作物遗传育种技术领域，尤其涉及一种强化高产优质耐生物和非生物胁迫多基因聚合及遗传背景稳定性的水稻育种方法。
背景技术
水稻(Oryzasativa L.)是我国最主要的粮食作物，其产量占到了全国粮食总产量的40％左右，对保障我国粮食安全做出了重要贡献。面对不断增长的人口，在现有耕地不变的情况下，保持水稻产量稳定并不断增加非常重要。杂交水稻比常规品种具有10-20％的产量优势(Chen etal；2007)，但一个杂交水稻品种能否广泛推广取决于许多因素。其中，高产、优质及抗逆性起着非常重要的作用。因此如何在保持高产的同时优化稻米的品质和抗逆性是当前研究的热点和难点。
稻瘟病是一种世界性的水稻病害，严重影响水稻的产量和品质。我国南北稻区每年均受到不同程度的危害，在流行年份的重病地区一般减产10％～20％，严重的达40％～50％，局部田块甚至颗粒无收。如2014年安徽曾出现杂交水稻“两优0293”因感染稻瘟病而出现大面积减产、绝收的情况。广西是稻瘟病的重灾区，近年来稻瘟病年发生面积约53.3万公顷，约占水稻种植面积的1/4。迄今为止，已经鉴定了110多个抗稻瘟病基因并克隆了其中的36个基因，为稻瘟病抗性育种提供了丰富的基因资源。
水稻产量性状是由多基因控制的复杂数量性状，主要由每株有效分蘖数、每穗粒数和粒重三个因素决定。其中千粒重遗传力为40％～60％，遗传稳定，受外界环境因素影响较小。提高粒重来确保水稻产量是一条有效途径(程琴等，2021)。水稻千粒重与粒型密切相关，水稻粒型性状由粒长、粒宽和粒厚共同构成。因此，培育长重粒水稻品种有助于保证水稻产量。
不同的消费者群体对稻米好品质的定义方式不同，低直链淀粉含量的水稻品种更受华南地区消费者的欢迎。水稻胚乳直链淀粉含量(AC)是稻米重要的品质性状之一，长期以来是衡量稻米食用和烹饪质量(ECQ)的关键指标。AC过高，米饭较硬，食味变差。AC过低会使米饭太粘，且会影响稻米的外观品质。因此，AC含量适中的“软米”类型兼具了所需的优点。稻米胚乳中直链淀粉主要通过蜡质基因(Wx)编码颗粒结合淀粉合酶I(GBSSI)负责合成，Wx等位基因多样性是稻米AC变化的主要原因之一。
一直以来生产上都会有些水稻品种由于遗传背景不稳定而导致分离产生变异株，育种家也会利用这些变异株选育出新品种。如不育系株选63-8S由广占63S自然变异株选育而成(夏加发等，杂交水稻，2016，31(1):15-17)；辐恢838-1由辐恢838长粒变异株系选育而成(周萌等，种子，2017，36(10)：116-118)、恢复系H66-5由扬稻6号变异株选育而成(姚传根等，农业科技通讯，2015:189-190)、恢复系R837由蜀恢527变异株选育而成(杨经良等，广西农业科学，2010，41(7)：663-664)。但目前植物新品种权保护已经越来越受到育种家的重视，由遗传背景不稳定变异株选育出的新品种容易引起知识产权纠纷；同时品种遗传背景不稳定也是导致品种退化的原因之一。因此，加强品种遗传背景稳定性检测有利于保护植物新品种权及延长品种推广应用的时间。
随着基因组重测序技术的快速发展，越来越多的水稻品种进行了重测序，产生了海量的SNP标记，为水稻全基因组选择育种奠定了基础。基因芯片是检测SNP的重要手段，通过开发水稻高密度基因芯片，实现了对水稻全基因组重要性状功能基因的快速准确检测，加快了大批量优异性状基因的聚合及品种遗传背景的分析，显著提高了育种效率(喻辉辉等，2016；邱树青等，2018)。
相较于不育系，水稻恢复系更容易选育。因此，加强高产优质抗病虫强优势恢复系选育，进而配制高产优质抗病虫杂交稻新组合，是提高杂交水稻稻米品质和减轻病虫危害的主要途径之一。蜀恢527是我国继明恢63以后的一个突破性恢复系，具有恢复力强、配合力高、株叶形态好、米质优、低直链淀粉含量(16.9％)抗性好等突出特点，其所配组合在生产上具有广泛的适应性和强大的增产作用(王玉平等，2004)，是目前我国配制出杂交水稻组合最多的恢复系之一(https://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。该恢复系正作为优良的遗传资源为水稻育种所利用。高利军等通过重穗长粒型恢复系蜀恢527的抗稻瘟病基因分析，发现其有2个稻瘟病抗性基因Pi5和Pita(参考文献：高利军，高汉亮，颜群，周萌，周维永，张晋，邓国富.4个抗稻瘟病基因分子标记的建立及在水稻亲本中的分布杂交水稻.杂交水稻，2010，(S1)：294-298)。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种强化高产优质耐生物和非生物胁迫多基因聚合及遗传背景稳定性的育种方法。
为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种强化高产优质耐生物和非生物胁迫多基因聚合及遗传背景稳定性的育种方法，包括以下步骤：
(1)以籼型恢复系桂451作母本，蜀恢527作为父本进行杂交，获得F1代种子；种植F1代，成熟后全部单株混收获得F2代种子；
(2)在稻瘟病自然诱发鉴定圃种植F2代遗传分离大群体，分单株提取DNA，利用分子标记引物分别对直链淀粉含量基因Wx进行检测，以恢复系蜀恢527为对照，筛选基因型纯合WxWx的单株，根据穗瘟抗性鉴定结果，从这些单株中选择穗瘟达到抗和高抗，且主要农艺性状优良的单株作为目标单株，分单株收获种子形成F3株系；
(3)分株系种植F3代种子，利用对应的分子标记引物分别对稻瘟病抗性基因Pi5、Pita、Pid2、Pid3进行检测，选择目标基因型为三纯一杂以及双纯双杂且主要农艺性状优良的单株做为目标单株，以上单株均分单株收获种子，形成F4株系；
(4)按株系播种进行自然耐冷性鉴定，选择无烂秧、叶片绿色无白化的耐冷株系分单株种植，对照选育系谱，继续对目标基因型为三纯一杂及双纯双杂的株系进行分子标记检测，选择四个目标稻瘟病基因型均纯合Pi5Pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3Pid3且主要农艺性状优良的单株，以上单株均分单株收获种子，形成F5株系；
(5)分株系种植F5代种子，利用分子标记引物对褐飞虱抗性基因bph2进行检测，以恢复系桂451为对照，筛选基因型纯合bph2 bph2且选择农艺性状优良的单株，分单株收获种子，形成F6株系；至此世代，所有入选单株均携带有6个目标基因且基因型均全部纯合Pi5Pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3Pid3bph2bph2；
(6)分株系种植F6代种子，选择农艺性状优良的单株与三系不育系天丰A(利用不育系跟已选出的候选株系测配，观察杂种优势情况，其他不育系也可以)进行测交，收获测交种以及对应测交单株形成F6株系；
(7)种植测交种以及对应测交单株形成F7代种子，选取杂种优势强、结实率和产量高以及植株株叶型整齐一致的对应单株，分单株收获种子形成F8株系；
(8)利用稻瘟菌菌株分别对每个F8代株系进行室内苗期抗性鉴定和田间穗瘟稻瘟病抗性鉴定，根据抗性鉴定结果，选取抗谱广、无抗感分离的株系中高抗的单株移栽至网室，分单株收获种子，形成F9株系；
(9)对F9株系进行水稻苗期褐飞虱抗性鉴定；
(10)将褐飞虱抗性株系分单株全部种植，混合收获所有单株种子，根据NY/T 593-2013《食用稻品种品质标准》对候选株系的米质按标准进行分级，选择米质指标达二级米质以上的株系形成F10株系；
(11)分株系种植F10代种子，每个株系25-35个单株叶片混合提取DNA，利用水稻高密度基因芯片对其全基因组遗传背景以及多个功能基因和抗性基因单倍型进行分析，最终选择遗传背景100％纯合稳定的株系作为目标候选株系。
进一步的，所述步骤(2)中分子标记引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述步骤(2)中主要农艺性状优良的单株包括以下特征：千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm。
进一步的，所述步骤(3)中抗性基因Pi5对应的分子标记引物如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。
进一步的，所述步骤(3)中抗性基因Pita对应的分子标记引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
进一步的，所述步骤(3)中抗性基因Pid2对应的分子标记引物如SEQ ID NO.7-10所示。
进一步的，所述步骤(3)中抗性基因Pid3对应的分子标记引物如SEQ ID NO.11-14所示。
进一步的，所述步骤(3)中三纯一杂基因型为：
Pi5Pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3pid3、Pi5Pi5PitaPitaPid2pid2Pid3Pid3、
Pi5Pi5PitapitaPid2Pid2Pid3Pid3、Pi5pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3Pid3。
进一步的，所述步骤(3)中双纯双杂基因型为：
Pi5pi5PitapitaPid2Pid2Pid3Pid3、Pi5pi5PitaPitaPid2pid2Pid3Pid3、
Pi5pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3pid3、Pi5Pi5PitapitaPid2pid2Pid3Pid3、
Pi5Pi5PitapitaPid2Pid2Pid3pid3、Pi5Pi5PitaPitaPid2pid2Pid3pid3。
进一步的，所述步骤(5)中褐飞虱抗性基因bph2对应的分子标记引物如SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明以综合农艺性状优良、粗矮秆、抗稻瘟病(Pid2、Pid3)、中抗褐飞虱(bph2)、直链淀粉含量偏高的大粒型恢复系桂451(桂451是由辐恢838//(ASD7×地谷)BC1F7育成的抗病虫大粒型恢复系中间材料)为母本，以长重粒、低直链淀粉含量(Wx)、抗稻瘟病(Pi5、Pita)、优势强、配合力好的籼稻恢复系蜀恢527父本进行杂交，利用分子标记引物对杂交分离后代进行选择快速聚合6个基因型纯合稳定的目标基因Pi5、Pita、Pid2、Pid3、bph2和Wx，综合稻瘟病、褐飞虱及自然耐冷抗性鉴定结果、外观品质鉴定结果和农艺性状选择，同时利用40K(分布于水稻12条染色体上的32887个SNP位点)基因芯片对高世代苗头品系进行全基因遗传背景稳定性比较分析，最终培育高产优质耐生物和非生物胁迫水稻系桂恢5501，为杂交稻品种选育提供高产、优质和抗逆性亲本资源。
附图说明
图1为实施例1中分子育种流程图。
图2为实施例1中桂451/蜀恢527F2分离群体在稻瘟病自然诱发鉴定圃穗颈瘟抗性鉴定结果图。
图3为实施例1中F4株系苗期自然耐冷鉴定结果图。
图4为实施例1中F9株系苗期褐飞虱抗性鉴定结果图。
图5为实施例1中目标候选株系全基因组遗传背景比较分析结果图。
图6为实施例1中Z2株系的植物品种特异性、一致性和稳定性审查报告图。
具体实施方式
以下实施例中籼型恢复系桂451是由辐恢838//(ASD7×地谷)BC1F7育成的抗病虫大粒型恢复系中间材料；水稻高密度基因芯片GSR40K为武汉双绿源公司产品。
实施例1
一种强化高产优质耐生物和非生物胁迫多基因聚合及遗传背景稳定性的水稻育种方法，包括以下步骤：
(1)以籼型恢复系桂451作母本，蜀恢527作为父本进行杂交，获得F1代种子；种植F1代，成熟后全部单株混收获得F2代种子；
(2)在稻瘟病自然诱发鉴定圃种植F2代遗传分离大群体，参见图2，分单株提取DNA，利用分子标记引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2分别对直链淀粉含量基因Wx进行检测，以恢复系蜀恢527为对照，筛选基因型纯合WxWx的单株，根据穗瘟抗性鉴定结果，从这些单株中选择穗瘟达到抗和高抗(穗瘟分级标准按中国农业部行业标准《水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程》(NY/T2426-2014)进行抗性评价)且主要农艺性状优良的单株(千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm，以及株叶形态、剑叶、株高、分蘖力、穗粒数、结实率和生育期等)作为目标单株，分单株收获种子形成F3株系；
(3)分株系种植F3代种子，利用SEQ ID NO.3-14中相应的分子标记引物分别对稻瘟病抗性基因Pi5、Pita(以恢复系蜀恢527为对照)；Pid2、Pid3(以恢复系桂451为对照)，选择目标基因型为三纯一杂Pi5Pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3pid3、Pi5Pi5PitaPitaPid2pid2Pid3Pid3、Pi5Pi5PitapitaPid2Pid2Pid3Pid3和Pi5pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3Pid3以及目标基因型双纯双杂Pi5pi5PitapitaPid2Pid2Pid3Pid3、Pi5pi5PitaPitaPid2pid2Pid3Pid3、Pi5pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3pid3、Pi5Pi5PitapitaPid2pid2Pid3Pid3、Pi5Pi5PitapitaPid2Pid2Pid3pid3、Pi5Pi5PitaPitaPid2pid2Pid3pid3、且主要农艺性状优良(千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm，以及株叶形态、剑叶、株高、分蘖力、穗粒数、结实率和生育期等)的单株做为目标单株，以上单株均分单株收获种子，形成F4株系；
(4)比早造正常播种时间提前15天按株系播种进行自然耐冷性鉴定(参照韩龙植等2004，水稻耐冷性鉴定评价方法稍作修改，即种子催芽播种到大田后，昼夜平均气温连续15天低于15℃)，参见图3，选择无烂秧、叶片绿色无白化的耐冷株系分单株种植，对照选育系谱，继续对目标基因型为三纯一杂及双纯双杂的株系进行分子标记检测，筛选四个目标稻瘟病基因型均纯合Pi5Pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3Pid3且主要农艺性状优良(千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm，以及株叶形态、剑叶、株高、分蘖力、穗粒数、结实率和生育期等)的单株，以上单株均分单株收获种子，形成F5株系；
(5)分株系种植F5代种子，利用分子标记引物SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16对褐飞虱抗性基因bph2进行检测，以恢复系桂451为对照，筛选基因型纯合bph2 bph2且选择农艺性状优良(千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm，以及株叶形态、剑叶、株高、分蘖力、穗粒数、结实率和生育期等)的单株，分单株收获种子，形成F6株系。至此世代，所有入选单株均携带有6个目标基因且基因型均全部纯合Pi5Pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3Pid3bph2bph2；
(6)分株系种植F6代种子，选择农艺性状优良(千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm，以及株叶形态、剑叶、株高、分蘖力、穗粒数、结实率和生育期等)的单株与三系不育系天丰A进行测交，收获测交种以及对应测交单株形成F6株系；
(7)种植测交种以及对应测交单株形成F7代种子，选取杂种优势强、结实率和产量高以及小区植株株叶型整齐一致的对应单株，分单株收获种子形成F8株系；
(8)利用稻瘟菌菌株分别对每个F8代株系进行室内苗期抗性鉴定和田间穗瘟稻瘟病抗性鉴定，根据抗性鉴定结果，选取抗谱广、无抗感分离的株系中高抗的单株，分单株收获种子，形成F9株系；
(9)参照标准苗期集团法(Standard Seedbox Screening Technique，SSST)对F9株系进行水稻苗期褐飞虱抗性鉴定，参见图4。将F9株系、抗感虫对照等材料的种子催芽后条播于搪瓷盘内，每个材料一行，每行播20-25粒，重复3次。待幼苗长到3叶期时，拔掉死苗弱苗，平均每苗约接入2-3龄褐飞虱若虫10头。当TN1死亡率达到90％时，开始考察各家系单株幼苗的受害情况，采用国际上使用的统一标准进行逐株定级，最后计算各家系的抗性平均值作为该家系的抗性表型。水稻对褐飞虱抗性的定级标准：0级无明显受害状，1级第一片叶部分黄化，3级第一、二叶变黄，5级第一至三叶变黄或植株呈现矮化，7级植株开始凋萎，9级植株死亡；
(10)将褐飞虱抗性株系分单株全部种植，混合收获所有单株种子后送农业农村部稻米及制品质量监督检验测试中心，利用EQ-221全自动流动注射分析仪对糙米率、整精米率、垩白度、透明度、碱消值、胶稠度、直链淀粉含量、粒长、长宽比、精米率、垩白粒率和蛋白质等12项指标进行米质分析，根据NY/T 593-2013《食用稻品种品质标准》对候选株系的米质按标准进行分级，选择主要米质指标达二级米质以上(糙米率、整精米率、垩白度、透明度、胶稠度、直链淀粉含量)的株系形成F10株系；
(11)分株系种植F10代种子，每个株系30个单株叶片混合提取DNA，利用水稻高密度基因芯片GSR40K(水稻基因组约400Mb，分布于水稻12条染色体上的32887个SNP位点，相当于平均每130bp一个SNP位点)对其全基因组遗传背景进行分析，参见图5(其中黑色标记为基因型杂合位点)，最终选择遗传背景100％纯合稳定的Z2株系作为目标候选株系。同时利用82个功能基因和抗性基因单倍型进行分析，结果表明：该株系具有产量较高；耐盐、耐寒、氮吸收能力强，对铜、铝和硼不敏感；对黄色斑驳病毒病、水稻条叶枯病毒病及稻瘟病具有一定抗性；对褐飞虱具有一定抗性，米粒呈白色，粒型偏长，较大；高蛋白，支链淀粉的含量较高，糊化温度较高。
上述分子标记引物的具体序列如表1所示。
表1
Figure BDA0003097170390000071
本发明育种得到的Z2株系的植物品种特异性、一致性和稳定性审查报告如图6所示，可知，Z2株系具有极好的遗传稳定性以及一致性和特异性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所
<120> 一种强化高产优质耐生物和非生物胁迫多基因聚合及遗传背景稳定性的水稻育种方法
<130> 2021.5.25
<141> 2021-06-02
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ctttgtctat ctcaagacac 20
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<213> 人工序列()
<400> 5
ttgagagcgt ttttaggatg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
tcggtttact tggttactcg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
ggctcgatct agaaaatccg 20
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
ttgcacaggt tgcgatagag 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
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acactgtagc ggccactg 18
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<211> 20
<212> DNA
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cctccactgc tccacatctt 20
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<211> 20
<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 16
tgttctcctc agtcactgcg 20

Claims (4)

1.一种强化高产优质耐生物和非生物胁迫多基因聚合及遗传背景稳定性的水稻育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以籼型恢复系桂451作母本，蜀恢527作为父本进行杂交，获得F1代种子；种植F1代，成熟后全部单株混收获得F2代种子；
（2）在稻瘟病自然诱发鉴定圃种植F2代遗传分离大群体，分单株提取DNA，利用分子标记引物分别对直链淀粉含量基因Wx进行检测，以恢复系蜀恢527为对照，筛选基因型纯合WxWx的单株，根据穗瘟抗性鉴定结果，从这些单株中选择穗瘟达到抗和高抗，且主要农艺性状优良的单株作为目标单株，分单株收获种子形成F3株系；
（3）分株系种植F3代种子，利用对应的分子标记引物分别对稻瘟病抗性基因Pi5、Pita、Pid2、Pid3进行检测，选择目标基因型为三纯一杂以及双纯双杂，且主要农艺性状优良的单株做为目标单株，以上单株均分单株收获种子，形成F4株系；
（4）按株系播种进行自然耐冷性鉴定，选择无烂秧、叶片绿色无白化的耐冷株系分单株种植，对照选育系谱，继续对目标基因型为三纯一杂及双纯双杂的株系进行分子标记检测，选择四个目标稻瘟病基因型均纯合Pi5Pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3Pid3,且主要农艺性状优良的单株，以上单株均分单株收获种子，形成F5株系；
（5）分株系种植F5代种子，利用分子标记引物对褐飞虱抗性基因bph2进行检测，以恢复系桂451为对照，筛选基因型纯合bph2 bph2且选择农艺性状优良的单株，分单株收获种子，形成F6株系；至此世代，所有入选单株均携带有6个目标基因且基因型均全部纯合Pi5Pi5P itaPitaPid2Pid2Pid3Pid3bph2bph2；
（6）分株系种植F6代种子，选择农艺性状优良的单株与三系不育系水稻进行测交，收获测交种以及对应测交单株形成F6株系；
（7）种植测交种以及对应测交单株形成F7代种子，选取杂种优势强、结实率和产量高以及植株株叶型整齐一致的对应单株，分单株收获种子形成F8株系；
（8）利用稻瘟菌菌株分别对每个F8代株系进行室内苗期抗性鉴定和田间穗瘟稻瘟病抗性鉴定，根据抗性鉴定结果，选取抗谱广、无抗感分离的株系中高抗的单株，分单株收获种子，形成 F9株系；
（9）对F9株系进行水稻苗期褐飞虱抗性鉴定；
（10）将褐飞虱抗性株系分单株全部种植，混合收获所有单株种子，根据NY/T 593-2013《食用稻品种品质标准》对候选株系的米质按标准进行分级，选择米质指标达二级米质以上的株系形成F10株系；
（11）分株系种植F10代种子，每个株系25-35个单株叶片混合提取DNA，利用水稻高密度基因芯片对其全基因组遗传背景进行分析，最终选择遗传背景100%纯合稳定的株系作为目标候选株系；
所述步骤（2）中分子标记引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述步骤（3）中抗性基因Pi5对应的分子标记引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
所述步骤（3）中抗性基因Pita对应的分子标记引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
所述步骤（3）中抗性基因Pid2对应的分子标记引物如SEQ ID NO.7-10所示；
所述步骤（3）中抗性基因Pid3对应的分子标记引物如SEQ ID NO.11-14所示；
所述步骤（5）中褐飞虱抗性基因bph2对应的分子标记引物如SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16所示。
2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤（2）中主要农艺性状优良的单株包括以下特征：千粒重≥32.0g，谷粒长≥10.5mm。
3.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤（3）中三纯一杂基因型为：Pi5Pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3pid3、Pi5Pi5PitaPitaPid2pid2Pid3Pid3、Pi5Pi5PitapitaPid2Pid2Pid3Pid3、Pi5pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3Pid3。
4.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤（3）中双纯双杂基因型为：Pi5pi5PitapitaPid2Pid2Pid3Pid3、Pi5pi5PitaPitaPid2pid2Pid3Pid3、Pi5pi5PitaPitaPid2Pid2Pid3pid3、Pi5Pi5PitapitaPid2pid2Pid3Pid3、Pi5Pi5PitapitaPid2Pid2Pid3pid3、Pi5Pi5PitaPitaPid2pid2Pid3pid3。
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