CN109312358A

CN109312358A - 具有改进的抗回生稳定性和改进的冻融稳定性的支链马铃薯淀粉

Info

Publication number: CN109312358A
Application number: CN201780036789.8A
Authority: CN
Inventors: 佩尔·霍万德; 玛丽特·安德森; 马蒂亚斯·萨缪尔森; 阿克·斯托尔
Original assignee: Mitsubishi Electric Corp
Current assignee: Swedish starch Producers Association
Priority date: 2016-05-03
Filing date: 2017-05-03
Publication date: 2019-02-05
Also published as: WO2017192095A1; EP3452602A1; SE1650598A1; US11905343B2; US20190135946A1; EP3452602A4

Abstract

公开了具有改进的抗回生稳定性和改进的冻融稳定性的支链马铃薯淀粉，其中其包含多于99％的支链淀粉，优选地100％的支链淀粉；及产生包含所述支链马铃薯淀粉的马铃薯(Solanum tuberosum)的方法，其中所述方法涉及使用CRISPR/核酸酶技术的同源定向诱变，并包括以下步骤：a)提供马铃薯细胞或包含马铃薯细胞的马铃薯组织，b)将一种或更多种CRISPR/核酸酶复合物引入所述马铃薯细胞的细胞核中，每种CRISPR/核酸酶复合物包含特异性靶向核糖核苷酸序列，所述特异性靶向核糖核苷酸序列与位于编码GBSS酶的基因以及任选地还有编码SSII酶的基因和/或编码SSIII酶的基因中紧邻PAM(5′‑NGG‑3′原间隔区相邻基序)上游的DNA序列中的靶核苷酸序列完全或基本同源，其中所述诱变发生在马铃薯基因组的一个或更多个等位基因中，其中当所述靶向核糖核苷酸序列识别靶核酸序列的互补连时，所述一种或更多种CRISPR/核酸酶复合物切割所述DNA序列，导致马铃薯随后完全缺乏产生功能性GBSSI酶、还有任选地功能性SSII和/或SSIII酶的能力，c)其中任选地重复步骤b)，直到马铃薯缺乏在所有等位基因中产生所述功能性GBSSI酶、还有任选地功能性SSII和/或SSIII酶的能力，优选3次；通过所述方法获得的马铃薯；由所述马铃薯产生所述支链马铃薯淀粉的方法；及所述支链马铃薯淀粉的不同用途。

Description

具有改进的抗回生稳定性和改进的冻融稳定性的支链马铃薯淀粉

本发明的技术领域

本发明涉及具有改进的抗回生稳定性和改进的冻融(freeze and thaw)稳定性的支链马铃薯淀粉、用于产生包含所述支链淀粉的马铃薯的方法、包含所述支链淀粉的马铃薯、用于产生所述支链马铃薯淀粉的方法以及所述支链马铃薯淀粉的用途。

背景技术

淀粉是世界上最常用的食品成分之一。淀粉主要用作增稠剂，并且因此赋予食品产品如汤、酱、乳制品、水果制品等粘度和质地。淀粉还在多种食品应用中用于脂肪替代物，并用于许多其他目的，例如坚果、油炸(deep fried)食品的涂层，以及作为甜点制品中的明胶替代物，作为液体乳液和喷雾干燥的功能油的水包油乳液的稳定剂。淀粉以其天然状态或改性的形式存在于多种食品中，以提供所要求的性能。淀粉从不同的植物来源，例如玉米、马铃薯、木薯、小麦、大麦、稻等提取，并且淀粉的性能取决于许多物理和化学性质。淀粉的主要特征之一是直链淀粉和支链淀粉的比率。多糖淀粉是由化学上均匀的单体葡萄糖分子构成的聚合物。然而，多糖淀粉是在其聚合度和葡萄糖链的支化的出现方面存在差异的不同形式的分子的非常复杂的混合物。因此，淀粉不是一种均匀的原料。特别地对直链淀粉和支链淀粉做出了区分，直链淀粉是α-1,4-糖苷连接的葡萄糖分子的基本未支化的聚合物，支链淀粉本身是不同地支化的葡萄糖链的复杂混合物。在用于淀粉产生的典型植物，诸如玉米、马铃薯、小麦、大麦、稻和木薯中，合成的淀粉由约20％-30％的直链淀粉和70％-80％的支链淀粉组成。

在相当长的一段时间内，直链淀粉被认为是一种线性聚合物，由α-1,4-糖苷连接的α-D-葡萄糖单体组成。然而，研究证明，在支化点处存在具有短链的α-1,6-糖苷支化点，称为根桩(stub)。根桩的链长被定义为小于20DP(STARCH Metabolism and Structure，Nakamura Yasunori，Springer 2015)，但其他研究也表明了稍长的根桩(Curá等人，Amylose is not Strictly Linear，Biosynthesis，Nutrition and Biomedical，第47卷，1995，207-209)。

支链淀粉由可变地支化的葡萄糖链的复杂混合物组成，其可以被区分为具有不同长度的A链、B链和C链。与直链淀粉不同，支链淀粉被更加高度地支化。侧链与主链(C链，由α-1,4-糖苷连接的α-D-葡萄糖单体组成)经由α-1,6-糖苷键连接。根据教科书信息(Voet和Voet，Biochemistry，John Wiley&Sons，1990)，α-1,6分支平均每24个至30个葡萄糖单位出现一次。这对应于约3％-4％的支化度。关于支化度的实际情况在淀粉的不同植物来源中不相同并且取决于各自的淀粉来源，其给出淀粉的支链淀粉部分的3％-6％之间的不同支化度。直链淀粉和支链淀粉之间的另一个根本区别在于分子量。根据淀粉的来源，直链淀粉具有约3×10⁴-10⁶Da的分子量(M_W)，并且在支链淀粉的情况下，分子量(M_W)为在10⁸Da和10⁹Da之间。这两种大分子可以基于它们的分子量和它们不同的物理化学性质来区分。除了直链淀粉/支链淀粉比率之外，淀粉的功能特征还受分子量、侧链分布模式和侧链长度、离子含量、脂质和蛋白含量以及平均淀粉颗粒尺寸及其分布曲线强烈影响。重要的功能特征的实例是溶解度、糊化行为、颗粒溶胀行为、水结合能力、粘度和质构性质、回生性质、成膜性质和冻/融稳定性等。

其中淀粉已经糊化的水系统经历了以一般性术语被称为回生的过程。在回生过程中，淀粉-水系统重新组织，并且该过程导致脱水收缩。淀粉分子重新形成为新的晶体复合物，并且释放与淀粉结合的水。作为结果，减少的水结合能力导致水从淀粉-水系统中释放，这是一种称为脱水收缩的过程。在低浓度，这种现象会导致淀粉晶体复合物沉淀，并且在较高浓度，这种现象会导致凝胶形成。这种行为可见于市场上常见的来自玉米、马铃薯、木薯、小麦、大麦等的淀粉中。这是本领域技术人员所熟知的，并且取决于淀粉性质，其在本质上取决于淀粉来源于哪种天然植物来源。(参见Jacobson R.等人，Cereal Chemistry,(1997)，第74卷，第5期,第511-518页；Wang等人，Food Science and Food Safety(2015)，第14卷，第568–585页，Hizukuri S.Carbohydrate research 141，1985，295-306；Roulet PStarch 42，3，1990 99-100)。还已经表明，支链淀粉分子的链长影响这种现象(HizukuriS，1985，Kalichevsky M等人，Carbohydrate research 198，1990，49-55和Jane.J等人Cereal Chemistry，(1999)，第76卷，第5期，第629-637页)还有以及直链淀粉-支链淀粉比率(Fetches P等人Carbohydrate research 340，(2205)，2563-2568；Miles,M.等人Carbohydrate research 135，1985，271-281；Miles J.Carbohydrate Research，第135卷，(1985)第271–281页)。

在大多数常见淀粉中，直链淀粉含量为20％-30％，而在所谓的蜡质型中量较低，并且通常被定义为小于10％。由于淀粉中存在直链淀粉，它强烈影响糊化后的稳定性，较低量的直链淀粉将对回生行为具有高度影响。

淀粉回生过程是当区分淀粉及其在食品应用中以及在其他非食品应用中的用途时最重要因素之一。大多数天然淀粉必需经过一些种类的化学改性以抑制回生过程，并且这种抑制可以通过经由共价键合将官能基团与淀粉分子偶联的淀粉的化学改性来实现。淀粉工业中最常用的化学改性是酯化和醚化。这些化学改性防止淀粉的回生过程。醚化在食品使用中具有最高的影响，因为取代基的尺寸更大，并且可以达到更高的取代水平，并且仍然被归类为食品级的改性淀粉。因此，醚化被用于使淀粉在水浆中变得冻/融稳定。不同化学改性的功能是熟知的，并且用于食品使用的大多数化学改性可以见于JECFA，Modifiedstarches；第五十七届JECFA(2001年)，并且发表在FNP 52 Add 9(2001)，FDA §172.892和欧盟食品添加剂指令(EU food additive directive)中。抗回生稳定也可以通过通常称为非化学改性方法的可选方法来实现。通过酶促改性可以防止淀粉溶液的回生。将淀粉分子用α-淀粉酶降解已经显示出增加了抗回生稳定性，并且用β-淀粉酶的降解已经显示出稳定性的显著增加。如果允许β-淀粉酶完全降解直链淀粉分子，并且部分降解支链淀粉分子，形成β-极限糊精，所得的淀粉溶液将会对回生极其稳定。用β-淀粉酶降解后稳定性极大改进的原因是剩余支链淀粉分子将具有减小的链长尺寸，并且已经证明这增加了回生稳定性以及冻/融稳定性。然而，酶促稳定仅可针对非颗粒淀粉实现，并且因此这种稳定不可能用于颗粒淀粉。在颗粒淀粉中，淀粉质构由水合的且溶胀的但仍然完整的颗粒(通常被称为糊化的但分散的淀粉颗粒)构成，并且是淀粉在食品应用中的常见方式。酶促稳定还是耗时的，并且意味着额外的生产成本使得淀粉产品更贵。除了酶促改性之外，还已知焦糊精化(pyrodextrinization)和碱性焙烧可以部分地用于防止回生现象以及将直链淀粉分子与单甘油二酯络合。

还存在天然的淀粉品种，由于它们的化学结构，对回生现象具有显著的稳健性。在自然界中可以发现具有较少量直链淀粉的淀粉，通常称为蜡质淀粉，具有少于10％或甚至低至少于2％的直链淀粉含量，并且这些淀粉对回生过程具有天然的稳健性，但仅至有限的水平。与具有较高直链淀粉含量的淀粉相比，这种淀粉的回生将延迟。因此，在直链淀粉含量和回生之间存在明确的相关性。(Sasaki T.Cereal Chemistry，(2000)，第77卷，第1期，第58-63页)。此外，熟知的是，具有极低直链淀粉含量(即少于0.5％)和具有短链结构的支链淀粉分子的天然存在的淀粉对回生极其稳定。(Fredriksson H，等人，(1998)，Carbohydrate polymers 35，119-134；Jane J.L，等人，(1999)，Cereal chemistry 76，(5)，629-637)。可以在商业基础上发现的具有极低直链淀粉含量和短链结构的支链淀粉的淀粉的一个实例是蜡质大麦淀粉，从大麦的0-直链淀粉突变体株系例如品种肉桂(Cinnamon)、李森(Lisen)和HB 340杂交繁育的。

在部分糊化后或完全糊化为淀粉溶液后，在淀粉糊中具有改进的稳定性的淀粉在非食品应用中也很受关注，因为它开辟了多种产品的新的可能性，例如作为粘合剂生产中的功能性成分，作为纸工业中的功能性成分，既作为湿部淀粉，也用于纸的表面施胶和涂覆，作为用于纸工业和涂料工业的乳液中的功能性成分，作为建筑产品中的功能性成分，以及作为药物生产中的功能性成分。

淀粉回生可以通过范围广泛的分析方法来确定，包括在宏观水平和分子水平分析淀粉凝胶的性质。在Karim A.等人；Food chemistry 71,(2000),9-36中总结了许多分析方法。用于确定淀粉稳定性的一种简单方法是使淀粉部分糊化，因此作为糊化和溶胀颗粒的淀粉悬浮液保持在颗粒条件，或者完全断裂为淀粉溶液，其中系统中不存在完整的淀粉颗粒。在影响回生行为的不同条件下储存后，连续分析淀粉悬浮液或溶液的粘度和质构性质。为了分析和确定冻/融稳定性，淀粉糊或溶液被冻融，并且然后进行离心以快速挤压出释放的液体。作为由于强制的淀粉分子回生的脱水收缩的结果而释放的水，被虹吸出并称重。系统地重复该程序，并且每个冻/融循环后累积的水释放的总量被测量，并且对应于淀粉的稳定性性质，并且因此等于其抗回生稳健性。

糊化的淀粉在冷却和储存时的行为，通常被称为回生行为，是食品科学家和技术人员非常感兴趣的，因为它强烈影响含淀粉食品的质量、可接受性和保质期。已知，食品糊或凝胶中的淀粉分子在老化时会缔合，导致回生，其导致诸如沉淀、糊化的影响，以及由于淀粉回生导致的不希望的质构改变。基于关于淀粉糊回生及其在食品工业中的重要性的这些事实，开发对回生现象更稳定的淀粉是最感兴趣的。对开发下述淀粉存在强烈需求，所述淀粉对回生稳健而不需要结构的化学改性且因此能够满足用于在食品应用中用于在冰箱或冰柜中储存的淀粉糊的这些淀粉的稳定性的要求而不需要进行淀粉的化学改性。

已知，植物可以以这样的方式进行基因修饰，即，基因修饰后的植物产生可以与它们基于物理化学参数从其被制造的对应的非基因修饰的植物中的淀粉区分开的淀粉。Kossmann和Lloyd[1,2](2000,Critical Reviews in Plant Sciences 19(3),171-126)以及后来的Zeeman等人(2010,Annual Review of Plant Biology 61,209-234)已经描述了表现出参与淀粉生物合成的酶的减少的各种植物物种的综述。

先前已经公开了其中淀粉颗粒结合淀粉合成酶I(GBSSI；“颗粒结合淀粉合成酶I(Granule-Bound Starch Synthase I)”)被减少的马铃薯植物(Hovenkamp-Hermelink等人，1987,Theoretical and Applied Genetics 75,217-221；Visser等人，1991,Mol.Gen.Genet.225,289-296；Hergersberg,1988,Dissertation,WO92/11376)。GBBSI参与直链淀粉的形成。GBSSI活性的抑制导致几乎完全包含支链淀粉的淀粉的合成。玉米植物中对应的GBSSI基因被称为术语“蜡质”，并且这就是为什么具有较低直链淀粉含量的淀粉以一般性术语被称为蜡质淀粉的原因，例如蜡质玉米(corn)/玉米(maize)、蜡质马铃薯、蜡质小麦、蜡质木薯、蜡质大麦、蜡质稻等。

在美国专利申请20120216316 A1中公开了一种用于减少GBSSI活性的方法。描述了所产生的马铃薯中的支链淀粉含量为至少为98％，并且磷酸含量高于0.09％。在美国专利6,940,001 B1中，公开了一种用于减少GBSSI和BE(支化酶(Branching Enzyme))活性的方法，该方法将产生具有低于10％的直链淀粉含量且具有增加的磷酸含量的淀粉。

尽管如此，根据这些专利文献中公开的方法，GBSSI和BE的活性未被完全消除，这是在所产生的淀粉中仍然具有显著水平的直链淀粉的原因。此外，所使用的用于实现降低的活性的技术是基于一种将产生具有残留的外源物质的马铃薯的方法。

此外，已经描述了其中可溶性淀粉合成酶III和II(SSIII和SSII)的活性被减少的马铃薯植物(Abel等人，1996，The Plant Journal 10(6),981-991；Lloyd等人，1999,Biochemical Journal 338,515-521；WO 00/08184；WO 96/15248；EP-A 0779363)。与从对应的野生型植物中分离的淀粉相比，来自这样的植物的淀粉表现出在支链淀粉的侧链中从较长链到较短链的转变(Lloyd等人，1999,Biochemical Journal 338,515-521)、直链淀粉含量无改变(Abel等人，1996，The Plant Journal 10(6)，9891-9991)以及经由RVA(Rapid-Visco-Analyzer)分析的减少的最终粘度(Abel,1995,Dissertation,FreieBerlin)。

还发现，马铃薯中SSIII和SSII组合的减少对淀粉结构和行为具有比通过个体酶同种型的减少所预测的影响大得多的影响(WO 99/66050，Edwards等人，Plant Journal17，251-261，1999)。WO 01/19975公开了其中GBSSI和SSII和/或SSIII活性两者都减少的植物。与来自野生型马铃薯植物的淀粉相比，来自具有减少的GBSSI、SSII和SSIII活性的基因修饰的马铃薯植物的淀粉表现出更低的直链淀粉含量、改变的淀粉颗粒的糊化和溶胀性质以及改进的冻/融稳定性。在WO 01/19975中公开的发明中使用的基因修饰技术依赖于稳定引入一个或几个基因装置，用于将基因功能连续抑制至更大或更小的程度。这最通常不会导致GBSSI、SSIII和SSII的酶促活性的完全抑制，并且因此所获得的淀粉性质在某种程度上将仍会受到这些淀粉合成酶的影响。

在美国专利0080667670 B2中，公开了一种用于减少GBSSI、SSIII和BEI的活性的方法，该方法产生被定义为具有低于10％的直链淀粉含量并且在C6位置处30-100nmol/mg淀粉的磷酸含量(淀粉DM的0.09％-0.31％磷含量)的淀粉。此外，该专利描述了如具有至少60％的冻融稳定性的淀粉性质。根据该专利中公开的方法，GBSSI、SSII和BEI的活性未被完全消除，这是淀粉仍然具有显著水平的直链淀粉的原因，并且冻融稳定性仅部分地受到所实现的特定酶活性降低的影响。因此，可以得出结论，该专利基于一种仅会部分降低特定酶GBSSI、SSIII和BEI的活性的技术。此外，可以得出结论，该专利中公开的相关技术将产生具有残留的外源物质的马铃薯。

部分抑制GBSSI、SSII和SSIII的生物合成活性的作用可以见于，除其他以外，Jobling等人2002中，其中已经证明，通过GBSSI、SSIII和SSII的部分基因抑制改性的淀粉将产生具有改进的冻/融稳定性的淀粉。因此，该淀粉具有改进的稳定性性质，以及因此具有对回生现象的稳健性。

WO 2015/193858公开了一种来自茄属(Solanum)植物的淀粉产品，该淀粉产品在所述植物内源的每个GBSS等位基因中包含突变。

Kossmann J等人“Understanding and influencing starch biochemistry”，Critical Reviews in Plant Sciences，2000,第19卷，第3期，第171-226页，公开了在马铃薯中缺乏GBSS的突变体合成不含直链淀粉的淀粉。

US 6,600,093(B1)公开了基因工程化的马铃薯植物，其产生基本不含直链淀粉的淀粉，并且没有可检测到的GBSS活性。

以上提及的WO 01/19975和Jobling等人2002中使用的方法是基于马铃薯中基因沉默构建体的稳定整合。作为该技术的结果，例如GBSSI和/或SSII等的酶活性，并未被完全消除或抑制，并且因此提出的改变的作用不会反映对淀粉性质100％抑制的作用。这意味着，如果例如GBSSI被阻断或抑制，少量直链淀粉仍将存在于淀粉组分中。在通过马铃薯的基因修饰阻断SSIII和SSII的情况下，这将不会导致由这些酶合成的链长度的完全抑制，并且因此少量的SSIII和SSII的活性仍然存在，并且在来自这样的基因修饰的植物的淀粉物质中将会发现少量较长的链。

已知技术的另一个缺点例如在相关专利中是在物种中实现的改变是基于稳定引入基因装置用于连续抑制基因功能。因此，引入的基因抑制装置的连续稳定功能可以有效地受到各种外部因素，诸如生物或非生物因素的影响，其中修饰的植物细胞物质将包含残留的外源物质。

总之，对于提供具有改进的抗回生稳定性和改进的冻-融稳定性的马铃薯淀粉的存在明显需求，以及对于用于产生具有表达和产生这样的马铃薯淀粉而不具有任何残留的外源基因物质的能力的马铃薯的方法存在明显需求。

发明概述

本发明的一个目的是满足以上提及的需求。该目的通过具有在权利要求1中定义的特征的支链马铃薯淀粉来实现。该目的还通过用于产生包含所述支链淀粉的马铃薯的方法、通过包含所述支链淀粉的马铃薯、通过用于产生所述支链马铃薯淀粉的方法以及通过所述支链马铃薯淀粉的用途来实现。

更确切地，在一个方面，本发明涉及具有改进的抗回生稳定性和改进的冻融稳定性的支链马铃薯淀粉，其中所述支链马铃薯淀粉包含多于99％的支链淀粉，优选地100％的支链淀粉。

在另一个方面，本发明涉及一种用于产生包含根据权利要求1-3所述的支链马铃薯淀粉的马铃薯(Solanum tuberosum)的方法，其中所述方法涉及使用CRISPR/核酸酶技术的同源定向诱变，并且所述方法包括以下步骤：

a)提供马铃薯细胞或包含马铃薯细胞的马铃薯组织，

b)将一种或更多种CRISPR/核酸酶复合物引入所述马铃薯细胞的细胞核中，每种CRISPR/核酸酶复合物包含特异性靶向核糖核苷酸序列，该特异性靶向核糖核苷酸序列与位于编码GBSS酶的基因以及任选地还有编码SSII酶的基因和/或编码SSIII酶的基因中紧邻PAM(5′-NGG-3′原间隔区相邻基序(protospacer adjacent motif))上游的DNA序列中的靶核苷酸序列完全或基本同源，其中所述诱变发生在马铃薯基因组的一个或更多个等位基因中，其中当所述靶向核苷酸序列识别所述靶核酸序列的互补连时，所述一种或更多种CRISPR/核酸酶复合物切割所述DNA序列，导致马铃薯随后完全缺乏产生功能性GBSSI酶、还有任选地功能性SSII和/或SSIII酶的能力，

c)其中任选地重复步骤b)，直到马铃薯缺乏在所有等位基因中产生所述功能性GBSSI酶、还有任选地功能性SSII和/或SSIII酶的能力。

在另外的方面，本发明涉及通过本发明的方法获得的马铃薯。

在又另一个方面，本发明涉及一种用于通过从所述的本发明的马铃薯提取来产生支链马铃薯淀粉的方法。

在又另一个方面，本发明涉及所述马铃薯的所述支链马铃薯淀粉的不同用途。

本发明的不同方面也出现在独立权利要求中，并且在随附的从属权利要求中公开了另外的实施方案。

附图简述

图1示意性地示出了马铃薯(Solanum tuberosum)的基因，更确切地，A)GBSSI基因、B)SSII基因、和C)SSIII基因。

图2示意性地示出了Kuras的等位基因变异的确定结果，更确切地，A)GBSSI基因的外显子8、B)SSII基因的外显子1和C)SSIII基因的外显子3。

图3示出了设计用于CRISPR/Cas9介导的GBSSI、SSII和SSIII基因中的突变诱导的构建体。

图4示出了CRISPR/Cas9介导的GBSSI基因的突变诱导的高分辨率片段分析的结果的图，更确切地，A)具有一个bp缺失的具有至少一个突变的等位基因的株系，B)具有一个和六个bp缺失的具有至少两个突变的等位基因的株系，C)具有2个和8个bp缺失的具有所有四个突变的等位基因的株系，以及D)亲本株系。

图5示出了在GT1、GT2、GT3、GT4、S2T1、S2T2、S3T1、S3T2和S3T3靶区域中具有诱导突变的个体等位基因的基因分型的结果。

图6-9示出了通过使用HPSEC系统分析从许多个体突变株系中分离的淀粉组合物的结果。

优选实施方案的详细描述

在一个方面，本发明涉及一种通过使用用于连续抑制基因功能的同源定向诱变来改变马铃薯物种中淀粉生物合成过程的方法，其中没有整合的残留外源物质被维持在衍生的马铃薯植物的基因组中。在本发明的方法中，马铃薯植物细胞中的马铃薯淀粉的合成过程被改变，这导致具有先前未知性质即新型的结构、组成和支化模式的支链淀粉的合成。这通过破坏编码参与直链淀粉的合成和支链淀粉分子中侧链的合成的酶的基因的物理基因背景(gene context)来实现。基因的特异性破坏实现了参与特定淀粉合成的特定酶的活性的完全消除，藉以获得了优于现有技术水平的淀粉性质和功能。通过本发明的方法，实现了酶GBSSI、SSIII、SSII的活性形式的一种或更多种的产生的完全阻断，这导致了一种具有先前文献或相关专利中从未公开的性质和功能的新型淀粉。

下面呈现了贯穿本申请文本中使用的一些术语和表述(expressions)的一些定义。

术语“GBSSI”应理解为意指属于同种型I的淀粉颗粒结合淀粉合成酶类别的任何酶。因此术语“GBSSI基因”应理解为意指编码GBSSI的核酸分子或多核苷酸(DNA、cDNA)。

术语“SSIII”和“SSII”应理解为意指一类可溶性淀粉合成酶。可溶性淀粉合成酶催化糖基化反应，其中ADP-葡萄糖底物的葡萄糖部分转移到α-1,4-连接的葡聚糖链上，形成新的α-1,4-连接，其中不同类别合成不同长度的链。例如，SSIII由Marshall等人(1996,The Plant Cell 8,1121-1135)、Li等人(2000,Plant Physiology 123,613-624)、Abel等人(1996,The Plant Journal 10(6),981-991)以及在WO 00/66745中描述。SSII由EdwardsA.等人(Plant Journal 8,283-294)所描述。

术语“SSIII基因”和“SSII基因”应理解为意指分别编码SSIII和SSII的核酸分子或多核苷酸(DNA、cDNA)。已经描述了编码多种植物物种的可溶性淀粉合成酶的多核苷酸。对于马铃薯，它由Abel等人(1996,The Plant Journal 10(6),981-991)公开。术语“SSIII基因”优选地意指在马铃薯植物中编码SSIII的核酸分子或多核苷酸(cDNA、DNA)，并且术语“SSII基因”优选地意指在马铃薯植物中编码SSII的核酸分子或多核苷酸(cDNA、DNA)。

表述“同源定向诱变”应理解为意指通过核糖核酸序列发现基因组中待突变的靶序列并进行标记以诱变。

术语“马铃薯(potato)”被理解为是意指属于马铃薯(Solanum tuberosum)物种的任何马铃薯植物。

表述“马铃薯组织”被理解为意指在马铃薯植物的发育的任何阶段期间的包含易受本发明的方法影响的马铃薯植物细胞的马铃薯植物的任何部分。马铃薯组织的实例是块茎、芽、叶、茎和花。

表述“原生质体”被理解为意指来自任何马铃薯组织的细胞。

表述“CRISPR/核酸酶技术”意指几种核酸酶变体可以与CRISPR一起用于产生根据本发明的支链马铃薯淀粉。核酸酶的实例是Cas，诸如Cas9和Cpf1。

Cas9用于下面公开的实施方案中。

表述“靶核苷酸序列”被理解为意指位于待通过本发明的方法鉴定的马铃薯基因组DNA中的特定核苷酸序列。在使用Cas9作为核酸酶的情况下，在CRISPR/Cas复合物中，靶核苷酸序列由细胞基因组中紧邻5′-NGG-3′原间隔区相邻基序(PAM)上游的20bp组成。

表述“靶向核糖核苷酸序列”被理解为意指与基因中的待通过根据本发明的方法突变的序列(所谓的靶核苷酸序列)完全或基本同源的RNA序列。如果使用II型Cas9，靶向核糖核苷酸序列优选地为20bp。靶向核糖核苷酸序列与靶序列完全或基本同源，这应理解为靶向核糖核苷酸序列与靶序列多于75％同源、优选地多于85％同源、更优选地多于95％同源。换句话说，靶向核糖核苷酸序列能够与靶序列的互补链杂交，并以这种方式定位Cas以在DNA链中引入双链断裂(DSB)。

表述“基本同源”应理解为意指所述靶向核糖核苷酸序列可以在序列长度和碱基身份方面不同于完全同源的序列，但仅以仍然获得所期望的突变的方式。

用于定义“支链马铃薯淀粉”的表述“完全缺乏直链淀粉”被理解为意指由于GBSSI酶活性的完全消除，马铃薯植物中根本未产生直链淀粉。

表述“100％支链淀粉”和“0％直链淀粉”被理解为意指相同含义。然而，由于痕量的直链淀粉至少在理论上可能偶然包含在支链马铃薯淀粉中，例如由于来自周围环境的污染，提供了表述“多于99％支链淀粉”和“多于99.5％支链淀粉”以覆盖这种情况。尽管如此，包含99％或更多支链淀粉的支链马铃薯淀粉先前是未知的。用于实现酶GBSSI、SSIII和SSII中期望的酶的阻断的本发明的方法使用了用于靶向的同源定向诱变的方法。因此，根据本发明的方法提供了植物基因组的靶向编辑，而不会在所得的植物中留下任何残留的外源基因物质。这种技术更精确地定向以破坏基因背景，而早期的方法依赖于分别意图调节基因表达或翻译的基因装置的物理插入。如以上定义的，同源定向诱变意指通过识别靶核苷酸序列的互补链的靶向核糖核苷酸序列在细胞核中发现待突变的靶区域并进行标记以诱变。在本发明的方法中，所讨论的淀粉合成酶的阻断通过序列特异性RNA/核酸酶蛋白复合物的作用来实现，该序列特异性RNA/核酸酶蛋白复合物被易位到细胞核中，并且起作用以精确地切割马铃薯植物细胞中的染色体的预定位点处的DNA。切割的易错修复允许引入突变和基因功能的损失，并且因此实现突变而无需引入任何外源基因物质。以这种方式，所公开的技术可以用于修饰植物细胞物质，而不具有任何残留的外源物质整合或留在细胞中。在根据本发明的用于在植物细胞中实现同源定向突变的所述引入的方法的一个实施方案中，通过使用技术CRISPR/Cas9(成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9)由序列特异性RNA/核酸酶蛋白复合物获得基因物质。(Doubna和Charpentier，2014；Mahfouz等人，2014)。最广泛使用的CRISPR/Cas来源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)[3]，在酿脓链球菌中CRISPR/Cas作为这种细菌适应性免疫系统的一部分发挥作用，处理入侵的病毒或其他核酸。本质上，CRISPR由被来自靶基因组的原间隔区分隔的一组序列重复组成。然后将所得的相当长的转录物加工为短的非编码RNA，其可以与II型Cas9蛋白形成复合物。复合物结合与入侵的核酸中的原间隔区区域互补的对应区域，并在靶区进行双链消化，从而灭活入侵的RNA或DNA。用于定向基因突变的改变的方法使用短的单指导RNA(sgRNA)(其包含20bp指导序列，即本发明方法中使用的靶向核糖核苷酸序列)、启动子和sgRNA支架，它们与Cas9的组合[3]可以在差不多任何选择的靶中诱导突变。对于II型Cas9，基因中的靶序列为20bp，并且必需位于细胞基因组中紧邻5′-NGG-3′原间隔区相邻基序(PAM)的上游。根据本发明被靶向的基因包含位于内含子和外显子两者中的几种PAM。因此，所公开的发明可以预期几种不同的靶向核糖核苷酸序列。

此外，本发明不限于为20bp的靶向核糖核苷酸序列。在一些情况下，靶向核糖核苷酸序列可以短于或长于20bp，这除了别的因素以外(i.a.)取决于特定的靶序列。此外，如果使用另一种类型的Cas，靶向核糖核苷酸序列可以短于或长于20bp。所得的双链断裂(DSB)通过细胞自身的修复机制经由非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)修复。修复机制易于出错，并且通常导致插入或缺失(插入/缺失(indel))，这可以通过将终止密码子引入到基因中引起基因敲除，导致截短的非功能性酶的产生。尽管小的插入/缺失似乎是最常见的，插入/缺失的尺寸是随机的。修复机制也可能导致读框移位(frame shift)，这可能导致截短的酶或具有降低或消失的酶活性的缺陷酶的产生。修复机制也可能导致改变的密码子数目，这可能导致具有降低或消失的酶活性的缺陷酶。根据本发明，在所得的马铃薯中未产生活性或功能性酶。这可以通过由本领域熟知的方法测量酶活性来验证，本领域熟知的方法诸如酶动力学、组织化学研究或不同的生物化学研究(例如酶谱、ELISA和PAGE)。突变的存在可以通过常规技术诸如PCR来验证。此外，功能性酶的不存在可以通过分析产生的淀粉组合物来验证，例如通过下面实施例6中描述的染色方法来验证。

如果需要，碱基移位或插入可以通过引入修复模板进行定制[4,5]，这将应用从仅仅产生基因敲除增加到也包括基因增强。酿脓链球菌Cas9编码序列可以照原样使用，或者可以针对植物进行密码子改变或者针对其他生物体类别或物种进行密码子改变[6][7]。

驱动sgRNA的启动子的选择已经被证明影响产生突变的效率。在Sun等人，2014，对大豆的研究中，将来自大豆(Glycine max L.)的U6启动子与更通常使用的来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的U6启动子[8]进行了比较，并且发现当使用内源启动子时，突变效率增加[9]。然而，也已经证明了启动子的强度可能对脱靶具有影响，并且高浓度的SgRNA-Cas9转录物可能增加脱靶突变[10，11]，即不期望的突变。

根据本发明的方法(其中在一个实施方案中使用CRISPR/Cas，优选地CRISPR/Cas9)包括特异性靶向核糖核苷酸序列作为指导序列，将导致所讨论的被靶向的酶活性的100％消除或抑制。因此，在特定物种中，结果将是被靶向的生物合成过程被完全阻断。这意味着，如果马铃薯中的GBSSI基因通过使用的技术被阻断，则马铃薯中将不存在合成的任何直链淀粉，并且因此，根据以上定义，淀粉组合物将由至少99％的支链淀粉，优选地100％的支链淀粉构成。如以上提出的，就诸如稳定性和改进的冻融稳定性的性质来说，100％支链淀粉和包含例如2％或1％直链淀粉的淀粉之间的差异是实质性的。此外，消除可溶性淀粉合成酶活性SSIII和/或SSII的影响也将导致迄今未知的具有独特性质的支链淀粉。已知减少SSIII和/或SSII酶活性的结果导致较短链的支链淀粉分子。

与本发明特别相关的一些靶区域和对应的靶核苷酸序列如下，其也在实施例2中更详细地公开。

在本发明的一个实施方案中，GBSSI酶的产生被消除或抑制，这导致产生多于99％，优选地100％的支链淀粉的马铃薯。

在本发明的另一个实施方案中，GBSSI和SSIII的酶活性被消除，这导致产生多于99％，优选地100％的支链淀粉的马铃薯，其中这样的支链淀粉分子的结构先前是未知的。在本发明的一个优选的实施方案中，GBSSI、SSIII和SSII的全部的酶活性被消除，这导致产生多于99％、优选地100％的支链淀粉的马铃薯，并且其中支链淀粉结构在几个方面完全不同于可以在常规种植的马铃薯中发现的马铃薯支链淀粉结构。更确切地说，这样的支链淀粉链的结构可以被定义为短链、高度支化的支链淀粉，并且这些特征从除马铃薯以外的其他作物中已知给予改进的稳定性和抗回生稳健性。

为了完全消除马铃薯中活性酶的产生，必须以不产生具有酶活性的蛋白的方式、产生不具有酶活性的截短的酶的方式、或者产生不具有酶活性的突变的酶的方式突变所有等位基因中的相应基因。重要地，根据本发明，突变在所有等位基因中可以相同，或者可以不相同。因此，可以在不同的等位基因中突变基因的不同部分。也可以在不同的等位基因中以不同的方式突变基因的相同部分。具有2个或更多个等位基因、最常见地4个等位基因的马铃薯基因型是已知的。

因此，通过根据本发明的方法，可以产生四种不同的马铃薯品种，其中也可以合成四种不同的淀粉品质，即“gbssI-马铃薯淀粉”、“gbssI/ssIII-马铃薯淀粉”、“gbssI/ssII-马铃薯淀粉”和“gbssI/ssII/ssIII-马铃薯淀粉”，所有这些在直链淀粉和支链淀粉比率构成方面并且在支链淀粉结构方面都具有单独特征。作为其结果，其在食品和非食品应用中的功能与来自改变的淀粉组合物的溶液稳定性相关。

因此，在一个方面，本发明涉及支链马铃薯淀粉，在一个实施方案中所述支链马铃薯淀粉包含至少99％的支链淀粉，优选地100％的支链淀粉，并且在另一个实施方案中，与天然马铃薯支链淀粉相比，所述支链马铃薯淀粉另外提供支链淀粉分子中较短的链和较高的支化度。

更确切地，根据本发明的支链马铃薯淀粉中的支链淀粉链平均比马铃薯支链淀粉的链短的事实意味着，根据本发明的支链马铃薯淀粉中的支链淀粉链平均也自然具有比天然马铃薯支链淀粉中的链更高的支化度。更确切地，支化度多于5％，优选地多于6％。

根据本发明的支链马铃薯淀粉在其最优选的实施方案(消除了两种或三种酶)中可以通过冻/融稳定性测试进行定义并且与常规支链马铃薯淀粉相比进行区分(其中在2-4次、优选地2次重复的冻/融循环后获得少于30％的脱水收缩，可选地，在4次重复的冻/融循环后获得少于15％的脱水收缩)。这项测试在1996年7月30日至8月6日在加拿大萨斯卡通省萨斯卡彻温大学(University of Saskatchewan,Saskatoon,Canada)举行的第五届国际燕麦会议和第七届国际大麦基因学研讨会由G.Persson, 和H.Johansson以“Breeding barley for functional food-starch”的海报在海报中展示。

如以上公开的，在本发明的方法中，马铃薯植物中的淀粉生物合成过程通过使用CRISPR/Cas方法，优选地CRISPR/Cas9方法的靶向诱变而改变，该方法在编码GBSSI、SSIII和SSII酶的基因位点中引入突变。所实现的一个或更多个突变(mutation/mutations)导致马铃薯植物细胞中GBSSI、SSIII和SSII酶的活性的完全破坏，这导致一种新的马铃薯基因型，该新的马铃薯基因型合成一种由多于99％、优选地100％的支链淀粉类型分子组成的淀粉，所述新的马铃薯基因型与该新的马铃薯基因型来源于其的亲本马铃薯相比具有独特的性质。

为了产生CRISPR/Cas9复合物，sgRNA和编码Cas9的转录单元可以位于相同或独立的物理DNA上。基因构建体不限于以上公开的sgRNA和Cas9。在Cas的其他变体的情况下，靶核苷酸序列可以短于或长于20bp。

在本发明方法的一个实施方案中，编码sgRNA和Cas9核酸酶的基因构建体被转染到马铃薯原生质体。编码sgRNA和Cas9的DNA在细胞中瞬时表达，并且未转移至后代，因此在所得的马铃薯中未留下任何残留的外源DNA。

在第二个实施方案中，sgRNA和Cas9蛋白在马铃薯细胞的外部产生，并通过例如显微注射引入。根据该实施方案，外源DNA未被引入到细胞中，并且因此在所得的马铃薯中不存在残留的外源DNA。

在第三个实施方案中，编码sgRNA和Cas9的T-DNA通过粒子轰击或使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的农杆菌(Agrobacterium)介导的转化被稳定引入。T-DNA的农杆菌引入可以通过本领域熟知的转化方法例如叶盘转化法或茎转化法或通过农杆菌渗入法(agroinfiltration)进行。在优选的实施方案中，编码sgRNA和Cas9核酸酶的DNA可以在马铃薯细胞中瞬时操作或者稳定引入马铃薯基因组中。稳定引入的DNA随后可以通过杂交从引入的突变中分离出来，导致不具有残留的外源DNA的马铃薯。重要地，引入的突变在代之间稳定转移，因此产生一种新的马铃薯，其中GBSSI和SSII和/或SSIII未显示任何酶活性。

栽培的马铃薯通常是四倍体，并且这样的马铃薯优选地用于引入突变。然而，本文公开的方法和手段也适用于更高或更低倍性水平的马铃薯基因型，例如二倍体基因型。现有技术中存在改变马铃薯细胞的倍性水平的几种熟知的方法。

靶向同一基因中一个或几个位置的sgRNA，即靶向核糖核苷酸序列，以及靶向几个不同基因和任选地这些基因的不同位置的sgRNA，可以应用于突变构建体或组装体的同一个引入中。因此，可以在同一步骤中靶向同一基因中的一个或更多个位置，和/或可以在同一步骤中靶向一个或更多个基因。

不同的方法可以被用于鉴定成功突变的基因。突变的鉴定可以优选地通过PCR和用于经由高分辨率毛细管电泳鉴定插入/缺失的片段分析来进行。

用于鉴定特定位点中的突变的几种方法在本领域中是已知的，诸如PCR结合应用的探针的解链点(melting point)分析、PCR和跨越突变的靶向区域的扩增片段的测序或使用CAPS检测，CAPS是一种基于位于靶区域中预测切割位点中的限制性位点的功能损失的方法。

所公开的方法可以应用于多轮应用中，以在一个基因的所有等位基因中引入突变，或者在多于一个基因中引入突变，或者在已经发生靶向几个基因的应用的另外基因中引入另外的突变。更具体地，已经突变的基因型可以被稳定转化或通过农杆菌渗入(agroinfiltrated)，或者被用于原生质体的生产，并被转染或显微注射以引入另外的突变。

在本发明的一个实施方案中，在CRISPR/Cas9复合物的一个应用中，一个基因的至少一个等位基因被突变。在更优选的实施方案中，在CRISPR/Cas9复合物的一个应用中，突变被引入到一个或几个基因的几个等位基因中。在本发明的甚至更优选的实施方案中，在突变方法的一个应用中，一个或几个基因的所有等位基因被突变。重要地，为了在基因的所有等位基因中实现突变，可能还需要另外轮的CRISPR/Cas9复合物的应用。

来自其中GBSSI和/或SSIII、和/或SSII的酶活性已经根据以上描述被消除的马铃薯的淀粉通过在旋转洗涤滚桶中在室温用水洗涤马铃薯来提取和纯化。用细胞粉碎机磨碎/锉磨马铃薯，以从细胞中释放淀粉颗粒。获得的包含颗粒淀粉、纤维和蛋白的马铃薯泥使用在60-160μm的范围内的筛孔尺寸的筛网进一步筛选，使得纤维物质与淀粉颗粒和溶解的蛋白级分分离。淀粉悬浮液使用筛选设备进一步处理，其中将由溶解的马铃薯蛋白和其他营养组分组成的马铃薯果汁与淀粉分离。将淀粉与新鲜的水混合，并使用水力旋流器设备、倾析器或洗涤离心机洗涤干净，其中替换水，并且从而洗涤淀粉，直到精制淀粉中的蛋白水平低于0.2％，通过凯氏氮含量法(Kjeldahl nitrogen content method)测量，具有6.25的换算系数(conversion factor)。淀粉浆料在旋转真空过滤器上脱水至55％-65％的干物质(DM)。淀粉悬浮液在快速干燥器中干燥至约78％-82％w/w DM。收集纯化的淀粉并在室温储存。所公开的发明不限于所描述的提取和纯化方法，尽管如何从马铃薯块茎中产生淀粉被认为是对于本领域技术人员的基本知识。

干燥前，淀粉可以被分离为不同的颗粒尺寸，得到一个具有小于25μm的小颗粒的级分，一个具有大颗粒即25-60μm的级分，或者多于60μm的非常大的颗粒。可选地，淀粉可以被分级干燥为不同的颗粒尺寸。本发明不限于从马铃薯中提取淀粉的工艺，因为这被认为是淀粉制造中的常识。

纯化的本发明的淀粉可以通过碱性焙烧或与氧化剂的漂白反应来抑制。它也可以被预糊化，并通过喷雾干燥或滚筒干燥被进一步干燥至多于80％w/w DM，优选地多于85％w/w DM，甚至更优选地多于90％w/w DM的干内容物(dry content)。它也可以通过酶促改性或酸处理或焦糊精化或氧化降解或其组合被降解至100 000–1 000 000Da、优选地300000–800 000Da、甚至更优选地500 000–700 000Da的分子量。

因此，基于GBSSI和/或SSIII和/或SSII酶的产生的阻断获得的淀粉是冻/融稳定的，并且在液体悬浮液中部分或全部糊化后，具有极大增强的稳定性，即抗回生稳健性，并且优选地但非排他地被用于食品应用使用。

在本发明的另一个方面，本发明的支链马铃薯淀粉可以用于几种不同的应用。在一个实施方案中，纯化的新型支链马铃薯淀粉可以以其天然状态用于食品应用。淀粉也可以可选择地以改性状态使用，其中淀粉已经被本领域技术人员已知的任何改性方法改性。最常见的改性方法是交联、磷酸化、乙酰化、羟丙基化、以钠盐和铝盐两者的形式的2-辛烯基琥珀酰化、琥珀酰化、阳离子化、氧化、酶促改性、淀粉的酸处理、淀粉的焦糊精化和碱性焙烧以及其组合。本发明不限于所公开的改性方法，因为化学或非化学改性被认为是基本技术知识。因此，在文献和出版物中描述的所有种类的改性可以应用于本发明的支链马铃薯淀粉产品。

可以使用纯化的本发明的支链马铃薯淀粉的应用是通常使用淀粉和改性淀粉的常见食品应用，并且可以见于文献中。常见的应用是，但不限于：水果制品、汤和酱、甜点制品、乳制品如酸奶、鲜奶油(crème fraiche)、加工的奶酪，作为在液体产品和涂物(spread)和/或喷雾干燥为粉末的乳液(例如喷雾干燥的功能性油如DHA、ARA、维生素E等)中水包油(O/W)乳液以及油包水(W/O)乳液的稳定剂。此外，产品还可用于涂覆应用如在油炸马铃薯、蔬菜、鸡肉、牛肉等外面裹上面糊(batters)和面包屑。

总之，纯化的支链淀粉可以在以下食品应用中使用：

-作为液体制剂中的调质剂，其中淀粉浓度为0.05％-15％w/w，优选地0.5-％10％w/w，更优选地1.5％-6％w/w，

-作为制剂中的调质剂，其中食品产品被另外冷冻，

-优选地在涂覆应用中使用，其中植物或动物来源的食品用淀粉和/或淀粉与其他成分的制剂涂覆，随后是另外的油炸。

-作为液体产品和涂物中油包水(W/O)乳液的稳定剂，或

-作为呈液体状态的以及在水包油(O/W)乳液另外被喷雾干燥为粉末的应用中的水包油乳液的乳液稳定剂，其中所述支链马铃薯淀粉首先通过辛烯基琥珀酸钠或辛烯基琥珀酸铝改性。

此外，纯化的支链淀粉也可以用于纸的应用，优选地用于纸的表面施胶和涂覆，或者作为纸的生产中的湿部淀粉。

在另外的方面，本发明还涵盖包含所述支链马铃薯淀粉的产品，其中所述产品的性质与以上提及的用途中的任何一种相关。

实验

实施例1-靶基因的测序

关于GBSSI、SSII和SSIII基因的信息示出在图1中，其中A代表马铃薯(Solanumtuberosum)GBSSI基因(GenBank登录号A23741.1)，其中13个外显子用箭头标记。覆盖外显子8和剪接区的508bp的测序引物用StGBSSExf和StGBSSExr标记。靶区域用GT1、GT2、GT3和GT4标记。图1B代表马铃薯SSII基因(GenBank登录号NW_006238930.1)，其中8个外显子用箭头标记。覆盖外显子1和剪接区的1352bp的测序引物用StSSExon f和StSS2Exon r标记。靶区域用S2T1、S2T2和S2T3标记。图1C代表马铃薯SSIII基因(GenBank登录号NW_006239023.1)，其中15个外显子用箭头标记。覆盖外显子3和剪接区的966bp的测序引物用StSS3Exf和StSS3Exr标记。靶区域用S3T1、S3T2和S3T3标记。

四倍体马铃薯品种Kuras中的GBSS、SSII和SSIII基因的部分的等位基因变异如下文描述来确定。靶基因的单个外显子的确定结果示出在图2A-2C中。

GBSS基因

将来自马铃薯品种Kuras的基因组DNA用于扩增GBSS基因的508bp片段，覆盖外显子8以及相邻的内含子(StGBSSExf和StGbSSExr，参见图1A)。使用Gene Jet Plant GenomicDNA纯化迷你试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham USA)从Kuras的叶组织中提取基因组DNA。根据供应商的说明，在PCR反应物中使用250ng DNA作为模板，所述PCR反应物具有0.5μmol的引物StGBSSExf和StGBSSExr(Sigma-Aldrich，Saint Louis，USA)、Phusion HF聚合酶、dNTP和HF缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltman，USA)。

使用的引物是：

使用以下循环条件进行扩增：

1.98°1min

2.98°10s

3.64°10s

4.72°15s

5.步骤2-4，30个循环

6.72°持续10分钟。

使用CloneJET PCR克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA)将PCR产物连接到pJET1.2/平端，随后转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen，Carlsbad，USA)。在包含100μg/mL氨苄青霉素的LB板上在37℃孵育1夜后，对随机挑取的菌落进行DNA分离，并通过Sanger测序(GATC Biotech,Konstanz,Germany)测序。

将GBSS基因中的外显子8(标记为StG1-StG4)的测序的等位基因彼此比较，并且结果显示所有等位基因高度同源(参见图2)，并且仅一个等位基因在外显子8中具有在一个位置处的腺嘌呤(A)→鸟嘌呤(G)改变的序列变异(在图2A中用方框标记，示出508bp片段的244bp)。结果还显示了，3个相同的等位基因(StG1-StG3)与公开的GBSS基因(GenBank登录号A23741.1)具有100％的同源性。

SSII基因

将来自马铃薯品种Kuras的基因组DNA用于扩增SSII基因的1352bp片段，覆盖外显子1以及相邻的内含子(StSS2Exon f和StSS2Exon r)。使用Gene Jet Plant Genomic DNA纯化迷你试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham USA)从Kuras的叶组织中提取基因组DNA。根据供应商的说明，在PCR反应物中使用250ng DNA作为模板，所述PCR反应物具有0.5μmol的引物(Sigma-Aldrich，Saint Louis，USA)、Phusion HF聚合酶、dNTP和HF缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltman，USA)。

使用的引物是：

使用以下循环条件进行扩增：

1.98°1min

2.98°20s

3.63°30s

4.72°30s

5.步骤2-4，30个循环

6.72°持续10分钟。

使用CloneJET PCR克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA)将PCR产物连接到pJET1.2/平端，随后转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen，Carlsbad，USA)。在包含100μg/mL氨苄青霉素的LB板上在37℃孵育1夜后，对随机挑取的菌落进行DNA分离，并测序(GATC Biotech,Konstanz,Germany)。将在SSII基因的外显子1(标记为StS2_外显子1-StS2_外显子4)的测序的等位基因彼此比较。在两个位置处发现碱基改变的变异(图2B)，一个位置具有腺嘌呤(A)→胞嘧啶(C)改变，并且另一个位置具有鸟嘌呤(G)→胸腺嘧啶(T)改变(在图2B中用方框标记，示出1352bp片段的252bp)。

SSIII基因

使用Gene Jet Plant Genomic DNA纯化迷你试剂盒(Thermo FisherScientific，Waltham USA)从Kuras的叶组织中提取基因组DNA。250ng DNA被用于分离覆盖SSIII的外显子3以及相邻内含子的966bp基因片段(StSS3Exf和StSS3Exr，参见图1C)。根据供应商的说明，使用0.5μmol的引物StSSExf和StSSExr(Sigma-Aldrich，Saint Louis，USA)、Phusion HF聚合酶、dNTP和HF缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltman，USA)进行PCR反应。

使用的引物是：

使用以下循环条件进行扩增：

1.98°1min

2.98°10s

3.64°10s

4.72°15s

5.步骤2-4，30个循环

6.72°持续10分钟。

使用CloneJET PCR克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA)将PCR产物连接到pJET1.2/平端，随后转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen，Carlsbad，USA)。在包含100μg/mL氨苄青霉素的LB板上在37℃孵育1夜后，对随机挑取的菌落进行DNA分离，并测序(GATC Biotech,Konstanz,Germany)。

将外显子3(标记为StS1-StS4)的测序的SSIII等位基因相互比较。发现四个测序的SSIII等位基因中的两个在外显子3中具有碱基改变的变异(图2C)，一个等位基因中具有腺嘌呤(A)→鸟嘌呤(G)改变，两个等位基因中具有胞嘧啶(C)→胸腺嘧啶(T)(图2C中用方框标记，示出966bp片段的271bp)。

实施例2-靶向GBSSI、SSII和SSIII基因的构建体

GBSSI、SSII和SSIII基因中不同的靶区域在图1中示出。

图3是设计用于CRISPR/Cas9介导的GBSS、SSII和SSIII基因中的突变诱导的构建体的示意图。从左到右；终止子(聚-T)、sgRNA支架、靶区域(GT1、GT2、GT3、GT4、S2T1、S2T2、S2T3、S3T1、S3T2或S3T3中的任一个)、拟南芥或马铃薯来源的U6启动子、花椰菜花叶病毒来源的35S启动子(CaMV)、核定位序列(NLS)、植物密码子优化的Cas9(Cas9)基因、NLS和终止子(NOS)。

靶向GBSSI基因的构建体

选择了四个用于在GBSS基因中诱导突变的靶区域，并且命名为GT1、GT2、GT3和GT4(参见图1A)，每个靶区域由直接位于5′-NGG-3′PAM位点上游的20bp组成，并且，除GT2外，在5’末端中具有核苷酸G。靶区域是使用CRISPR设计的基于网络的工具(http:// crispr.mit.edu/)来识别和选择的。GT1和GT2位于外显子8内，GT1跨越具有等位基因变异的区域，而GT3位于外显子1中并且GT4位于外显子9中(GenBank登录号A23741.1)。这四个靶序列都位于GBSS基因中的正链(positive strand)上。

靶序列：

对于四种指导RNA中的每一种合成产生包含启动子、指导序列(即与靶序列同源的靶向核糖核苷酸序列)和sgRNA支架的片段，并将其标准克隆到pEx-A2载体中(EurofinsGenomics，Ebersberg，Germany)。选择拟南芥来源的U6启动子(GenBank登录号X52527.1)或马铃薯来源的U6启动子(GenBank登录号Z17290.1)用于驱动指导序列和sgRNA支架的表达(参见图3)。片段具有在该片段的5’末端合成的一个另外的XhoI位点。由于U6启动子依赖于在指导序列5’末端的G核苷酸来启动转录，因此在GT2靶向核苷酸序列的位置1合成添加了G。使用3片段克隆将合成的片段与由35S启动子驱动的Cas9基因一起克隆于标准入门载体pENTR11(Invitrogen,Carlsbad,USA)中(参见图3)。所有构建体都被转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen,Carlsbad,USA)。另外，在它们的原始载体中的Cas 9和靶向指导GT1表达盒被转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen,Carlsbad,USA)用于共表达。

靶向SSII基因的构建体

选择了三个SSII靶区域，并且命名为S2T1、S2T2和S2T3(参见图1B)，均直接位于5’-NGG-3’PAM位点的上游，并且在与PAM位点相邻的20bp片段的5’末端中具有核苷酸G。靶区域是使用CRISPR设计的基于网络的工具(http://crispr.mit.edu/)来识别的。S2T1位于外显子1内的负链上并且S2T3位于外显子1内的正链上，并且S2T2位于外显子2中的负链上(GenBank登录号NW_006238930.1)。

靶序列：

对于三种指导RNA合成产生包含启动子、指导序列(即与靶序列同源的靶向核糖核苷酸序列)和sgRNA支架的片段(Eurofins Genomics，Ebersberg，Germany)。拟南芥来源的U6启动子(X52527.1)被用于驱动指导序列和sgRNA的表达(参见图3)。片段具有在5’末端合成的一个另外的XhoI位点。使用3片段克隆将合成的片段与由35S启动子驱动的Cas9基因一起克隆于标准入门载体pENTR11(Invitrogen,Carlsbad,USA)中(图3)。所有构建体都被转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen,Carlsbad,USA)。

靶向SSIII基因的构建体

选择了三个SSIII靶区域，并且命名为S3T1、S3T2和S3T3(参见图1C)，每一个都直接位于5’-NGG-3’PAM位点的上游，并且在与PAM位点相邻的20bp片段的5’末端中具有核苷酸G。靶区域是使用CRISPR设计的基于网络的工具(http://crispr.mit.edu/)来识别的。S3T1位于外显子4内的负链上并且S3T2位于外显子4内的正链上，并且S3T3位于外显子1中的正链上(GenBank登录号NW_006239023.1)。

靶序列：

对于每一种指导RNA合成产生包含启动子、指导序列(即与靶序列同源的靶向核糖核苷酸序列)和sgRNA支架的片段(Eurofins Genomics，Ebersberg，Germany)。拟南芥来源的U6启动子(X525)被用于驱动指导序列和sgRNA的表达(参见图3)。片段具有在5’末端合成的一个另外的XhoI位点。使用3片段克隆将合成的片段与由35S启动子驱动的Cas9基因一起克隆于标准入门载体pENTR11(Invitrogen,Carlsbad,USA)中(参见图3)。所有构建体都被转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen,Carlsbad,USA)。

实施例3-RNA-蛋白复合物(RNP)的gRNA合成和设计

根据供应商的说明，在GBSS(GT4)、SSII(S2T3)和SSIII(S3T2)中各选择一个靶区域用于诱导突变以使用GeneArt^TM Precision gRNA合成试剂盒(Thermo FisherScientific,Waltham,USA)产生gRNA。

引物：

各个gRNA包含U6启动子、指导序列和RNA支架/示踪RNA。将各个gRNA在室温与GeneArt^TM Platinum^TM Cas9核酸酶(Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)一起孵育持续10分钟，然后转染到纯化的原生质体中。

实施例4-PEG介导的原生质体转染和再生

以下表1示出了原生质体转染实验设置的结果。实验被编号为P1000-P21000。对于每个实验，靶向核苷酸序列、PEG(％)、DNA(μg)、转染时间(min)和使用的原生质体数不同并被定义。使用高分辨率片段分析，基于分析的再生株系总数中检测到的突变株系，计算每个实验的突变频率(％)。使用高分辨率片段分析和Sanger测序，基于在实验中发现的所有突变的株系中检测到的多于一个(multiple)突变的等位基因，计算具有多于1个突变的等位基因的株系的频率(％)。

将马铃薯栽培品种Kuras在包含维生素的1×Murashige和Skoog(MS)培养基(pH5.8)中在控制的环境室中在24℃在光照下持续16h并且在20℃在黑暗下持续8h繁殖，该培养基包含3％蔗糖、8μM硫代硫酸银(STS)和0.7％植物琼脂(Duchefa,Haarlem,TheNetherlands)。

通过在从五至六周龄的马铃薯小植株(plantlet)的顶叶组织分离的原生质体中转染一种、两种或三种以上描述的构建体或RNP，在1)GBSSI、2)GBSSI+SSIII、3)GBSSI+SSII和4)GBSSI+SSII+SSII中进行突变的同源定向诱导。瞬时表达优于传统转化，以避免DNA在基因组中的稳定整合。然而，在杂交和插入的基因物质分离后，还使用了稳定转化，目的在于诱导所述基因中的靶向突变。根据制造商的说明，用Qiagen质粒迷你试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化从以上描述的构建体分离的转染质量DNA。

通过PEG介导的转染方法，进行具有与靶区域GT1、GT2、GT3、GT4、S2T1、S2T2、S2T3、S3T1、S3T2和S3T3同源的靶向核糖核苷酸序列的sgRNA-Cas9构建体的瞬时表达，以及来自单独载体的靶向核糖核苷酸复合物和Cas9的表达。此外，使用相同的PEG介导的转染方法将GT4、GT4+S3T2和GT4+S3T2+S2T2的RNP递送至原生质体。原生质体分离和转染方法基于由Nicolia等人2014[12]描述的方法，被修改用于CRISPR/Cas9方法。在室温如下进行转染：在100μl中，使用1.0×10⁵个或1.6×10⁵个原生质体，12.5％、25％或40％PEG4000(Sigma-Aldrich,Saint Louis,USA)和5μg、10μg或15μg纯化的DNA，期间孵育时间为3min或30min(表1)。转染后，原生质体被包埋在藻酸盐中(Sigma-Aldrich，Saint Louis,USA)，并且在25℃在黑暗中孵育，直到第一次细胞分裂发生。在随后的2周内，光线逐步增加，并且当形成肉眼可见的愈伤组织时，光线达到全光(Memmert,Schwarbach,Germany)。转染后约四周，每一个愈伤组织被释放，并在液体培养基中培养另外的二到四周，用于进一步的愈伤组织发育和芽诱导。然后将扩大的愈伤组织转移到固体培养基中用于芽形成。

在使用的所有不同实验设置中都发现了再生，即从扩大的愈伤组织形成芽(参见下面的实施例5中的表1)。在转染后约3个月出现第一个芽，并且多达25％的所有愈伤组织在6个月后形成芽。

实施例5-使用高分辨率片段分析的突变筛选

使用基于96格式的(96-format)DNA提取、PCR扩增和毛细管电泳的高分辨率片段分析，对大量汇集的愈伤组织或再生的植物筛选诱导的突变。基于实验，将个体株系连续编号，例如P1001、P1002等(同样参见图5)。将愈伤组织或来自每个再生的芽的2-4周龄小植株的直径约5×5mm的叶样品在Retsch混合机Mill MM400(Retsch,Haan,Germany)中，在500μl裂解缓冲液(100 mM Tris,50 mM EDTA和1％SDS,pH 9.0)中，以30 Hz均质化持续30 s。利用由供应商(Qiagen,Hilden,Germany)提供的标准DNA提取方案使用QIAamp 96 DNAQIAcube HT试剂盒并添加RNA酶A在Qiacube HT提取机器人中从200μl澄清的裂解物中提取DNA至在洗脱缓冲液中0.1 mg/ml的最终浓度。根据制造商的说明，使用Phusion HF聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,USA)对0.5μl分离的DNA进行PCR扩增。取决于靶基因，用荧光染料FAM、NED或PET(Thermo Fisher Scientific,Waltham USA)在5’末端处标记正向引物。

引物：

GT1和GT2

GT3

GT4

S2T1

S2T2

S3T1和S3T2

S3T3

使用以下循环条件进行扩增：

1.98°1min

2.98°10s

3.64°10s

4.72°15s

5.步骤2-4，30个循环

6.72°持续10分钟。

将0.5μl的PCR产物(1:20稀释)与0.5μl野生型对照PCR片段(1:20稀释)和9.0μlHi-Di ^TM甲酰胺(Thermo Fisher Scientific,Waltham USA)混合，在95℃孵育持续3分钟并在冰上冷却。将在相同PCR条件下但使用分叉(diverging)的标记的引物(VIC标记的)扩增的野生型对照片段添加到每个样品中，以区分具有插入/缺失的等位基因与未突变的等位基因(参见图4)。根据制造商的说明，在3500Genetic分析仪(Thermo Fisher Scientific,Waltham USA)上进行高分辨率片段分离。数据通过3500系列数据收集软件3(3500SeriesData Collection Software 3)处理。突变的等位基因通过在获得的原始数据中多于一个峰的存在来鉴定(参见图4)。

图4示出了GBSSI基因的CRISPR/Cas9介导的突变的高分辨率片段分析的结果，由GT1靶区域中突变的株系例示。A代表具有检测到的1个突变的等位基因的株系P1003，B代表具有检测到的2个突变的等位基因的株系P1004，C代表具有检测到的4个突变的等位基因的株系P10084，且D代表野生型GBSS基因片段。

结果显示，使用所使用的所有转染条件均诱导了突变。结果还显示，使用所描述的任何靶区域均诱导了突变(参见下表1)。通过所描述的方法检测到低至1bp的插入和缺失(插入/缺失)。具有尺寸不同的诱导的插入/缺失的多于一个等位基因通过可视化的多于一个峰区分开(参见图4)。

表1

表2显示了对愈伤组织汇集物进行GBSSI基因、SSII基因和SSIII基因的RNPCRISPR/Cas9介导的突变的高分辨率片段分析的结果。

RPN	愈伤组织数	检测到的插入/缺失
			GT4	4	-4，-2，0
GT4	3	-9，-6，-4，0，1
			S3T2	3	-4，-2，-1
GT4	10	-5，-4，-2，0
			S3T2	10	-2，0
GT4	10	-15，-6，-5，-3，-2，0
			S3T2	10	-6，-3，-2，0，1

实施例6-突变分析

图5示出了在GT1、GT2、GT3、GT4、S2T1、S2T2、S3T1和S3T3靶区域中具有诱导突变的个体等位基因的基因分型的结果。P1000-P21000是个体株系。缺失的核苷酸用连字符示出，并且插入的核苷酸以粗体示出。PAM位点在每个野生型(WT)片段中被加下划线。

使通过高分辨率片段分析方法鉴定的突变的株系经受基因分型，以确定突变的精确尺寸和位置。将个体株系中覆盖各自的靶区域的PCR扩增物进行克隆并通过DNA测序分析(Eurofins Genomics,Ebersberg,Germany)。根据制造商的说明，跨越预测的Cas9切割位点的片段使用0.5μl分离的DNA(根据实施例4描述的)、0.25μM各正向和反向引物以及用Phusion聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,USA)来扩增。

引物：

GT1和GT2

GT3

GT4

S2T1

S2T2

S3T1和S3T2

S3T3

使用以下循环条件进行扩增：

1.98°1min

2.98°10s

3.64°10s

4.72°15s

5.步骤2-4，30个循环

6.72°持续10分钟。

使用CloneJET PCR克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA)将PCR产物连接到pJET1.2/平端，随后转化到OneTOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen，Carlsbad，USA)。在包含100μg/mL氨苄青霉素的LB板上在37℃孵育1夜后，对随机挑取的菌落进行测序(GATC Biotech,Konstanz,Germany)。

结果确认了在GBSSI、SSII和SSIII基因中诱导了突变。结果还显示，当靶向两个或三个基因的构建体被共转染时，在多于一个基因中诱导突变(表1、图5)。结果还确认了使用所使用的任何实验条件均诱导了突变。此外，除了GT1侧翼的等位基因变异，在一个或多于一个等位基因中诱导了突变，这不依赖于所使用的实验条件和靶向核苷酸序列(表1)。取决于实验设置，发现突变频率多达37％。发现多于一个突变的等位基因的频率通常非常高，并且在一些实验设置中，检测到高达100％的突变株系(参见表1)。为了获得酶活性的完全破坏，使用的四倍体马铃薯基因型的每个基因的所有4个等位基因被靶向。为了在基因的所有4个等位基因中实现突变，在需要时应用另外轮的原生质体分离和转染。

实施例7-体外微型薯(microtuber)产生

将芽在由4.4g/L MS-培养基、2.5mg/L激动素、0.5mg/L脱落酸(ABA)、8％蔗糖和200mg/L头孢噻肟组成的微型薯诱导培养基上在25℃在黑暗中生长。2-5周后，微型薯已经发育并被收获。将微型薯压碎并用混合有甘油(1:1)的卢戈氏(Lugol′s)溶液(6.7g/L KI+3.3g/L I₂)染色。将淀粉组合物在光学显微镜下可视化，其中具有>92％支链淀粉含量的微型薯被染成红棕色，而包含>9％直链淀粉含量的淀粉被染成蓝色。通过在2ml 70％EtOH中研磨微型薯，随后通过具有小网孔尺寸的尼龙过滤器过滤来提取淀粉。将8ml 70％乙醇添加到样品中，随后以1000×g离心持续10min。去除乙醇，并且将淀粉在室温放置风干过夜。分离的淀粉进一步用于分析，如根据实施例8-10描述的。

实施例8-温室微型薯产生

将突变的株系在18/15℃昼/夜温度、约200μmol s^-1m²光子的补充光强和60％相对湿度在温室的土壤中生长16小时。将每个株系在7.5L盆中以生物学重复以体内插条(cutting)种植。通过在水果榨汁机中均质化从发育的微型薯中分离淀粉。将Tris-HCl(pH7.5，50mM)、连二亚硫酸钠(Na-dithionite)(30mM)、和EDTA(10mM)添加到液体级分中。允许淀粉颗粒沉淀。将颗粒用相同的缓冲液洗涤四次，并且用丙酮洗涤三次，然后在室温干燥过夜。分离的淀粉进一步用于分析，如根据实施例9-11描述的。

实施例9-淀粉稳定性评价

通过将15g DM纯化的gbssI-PS(马铃薯淀粉)、gbssI/ssIII-PS和gbssI/ssII-PS以及gbssI/ssIII/ssII-PS淀粉分别与500g水混合来制备3％w/w的淀粉水悬浮液。将淀粉悬浮液在水浴中加热至95℃，并保持在95℃持续30分钟，持续搅拌。将淀粉溶液放入冰箱中冷却至20℃，并随后保持在室温。溶液达到20℃后，直接用Brookfield LV在室温测量溶液的粘度，并且持续7天每天系统地测量一次。作为参考，对商业化可得的支链淀粉，即具有少于1％直链淀粉的蜡质玉米淀粉(WMS)、具有少于2％直链淀粉的商业化蜡质马铃薯淀粉(WPS)、具有少于4％直链淀粉的商业化可得的蜡质稻淀粉(WRS)和具有少于0.5％直链淀粉的商业化可的的蜡质大麦淀粉(WBS)进行了类似的程序。

实验显示，通过根据本发明的方法获得的淀粉溶液比商购可得的蜡质马铃薯淀粉更稳定。同样清楚的是，基于gbssI/ssIII/ssII-PS的淀粉溶液不仅与可得的蜡质马铃薯淀粉相比显著更稳定且因此抗回生更稳健，而且与商业化可得的蜡质玉米淀粉相比显著更稳定且因此抗回生更稳健。结果进一步证明，通过根据本发明的方法获得的淀粉是先前未知的，并且来自马铃薯淀粉的抗回生稳健性可以被确定为WPS<(gbssI-PS)<(gbssI/ssII-PS)<(gbssI/ssIII-PS)<(gbssI/ssIII/ssII-PS)。

实施例10-淀粉回生评价

通过将22.5g DM纯化的gbssI-PS、gbssI/ssII-PS、gbssI/ssIII-PS以及gbssI/ssIII/ssII-PS淀粉分别与蒸馏水混合至450g的总重量来制备5％(w/w)的淀粉水悬浮液。使用700cmg扭簧将淀粉悬浮液放入到Brabender淀粉粘度计(Amyloviscograph)模型E中。在Brabender淀粉粘度计中，将淀粉悬浮液加热到95℃，并在保持15min时间后冷却到25℃。粘度在冷却阶段被连续测量和打印。将淀粉糊在室温储存，并且用稳定的微系统质构分析仪(Stable Micro System Texture Analyzer)进一步测量持续7天。作为参考，对商购可得的支链淀粉，即具有少于1％直链淀粉的蜡质玉米淀粉(WMS)、具有少于2％直链淀粉的商购可得的蜡质马铃薯淀粉(WPS)、具有少于4％直链淀粉的商购可得的蜡质稻淀粉(WRS)和具有少于0.5％直链淀粉的商购可得的蜡质大麦淀粉(WBS)进行了类似的程序。

该实验表明，在Brabender运行期间的消减值(setback viscosity)不如在储存期间的淀粉糊表现的大，并且在这方面，它们与蜡质淀粉相比完全不同。可以得出结论，蜡质淀粉在冷却期间不具有给出强的粘度增加的任何趋势，如可以从具有较高直链淀粉含量的淀粉预期的：由于与直链淀粉含量相关的回生现象，具有较高直链淀粉含量的淀粉将导致凝胶形成。根据使用质构分析仪的实验，可以得出结论，与商购可得的蜡质马铃薯淀粉相比，所提出的新型支链马铃薯淀粉的凝胶形成更少，这清楚地显示淀粉的稳定性得到了改进。当在7天后根据淀粉的凝胶强度划分淀粉时，这将给出以下顺序：WPS/gbssI-PS/gbssI/ssII-PS/WMS/gbssI/ssIII-PS/WRS/gbssI/ssIII/ssII–PS/WBS。因此，实验表明，通过根据本发明的方法获得的淀粉是先前未知的，并且表现出与商购可得的马铃薯淀粉相比显著不同的稳定性质。

实施例11-冻融评价

将实施例10中制备的淀粉溶液在冷却至室温后放入50ml离心管中，并以1500×g另外离心10分钟。此后，将离心管中的水虹吸出并称重。将管中剩余的浓缩淀粉在-18℃的冰柜中冷冻约24h。将淀粉糊解冻，并且将溶液以1500×g另外离心10分钟。重复该程序，并且在每次冻/融循环后的虹吸水(被定义为脱水收缩)被计算为累积水损失。通过将每次冻/融循环后的累积水损失的量除以溶液中水的起始重量，可以定义每种淀粉产品的脱水收缩百分比。

结果表明，蜡质玉米淀粉在一次冻/融循环后表现出30％的脱水收缩，蜡质马铃薯淀粉在一次冻/融解冻循环后表现出55％的脱水收缩，蜡质稻淀粉在一次冻/融循环后表现出0％的脱水收缩、但在两次冻/融循环后表现出14％的脱水收缩，并且蜡质大麦淀粉在前三次冻/融循环后表现出0％的脱水收缩且在第四次冻/融循环后表现出7％的脱水收缩。通过所述方法获得的淀粉表现更好，gbssI-PS比WPS表现更好，但不如WRS和WMS，gbssI/ssIII-PS比WRS表现更好，但不如WBS，并且gbssIII/ssII-PS比WRS表现更好并且与WBS相当。清楚的是，与商业可得的蜡质马铃薯淀粉相比，通过根据本发明的方法获得的淀粉的冻/融稳定性被显著改进。同样清楚的是，基于gbssI/ssIII/ssII-PS的溶液与可得的蜡质马铃薯淀粉相比显著冻/融更稳定，并且与商购可得的蜡质玉米淀粉和蜡质稻淀粉相比显著冻/融更稳定，并且与蜡质大麦淀粉相当。结果进一步证明，通过根据本发明的方法获得的淀粉是新型的，并且冻/融稳定性程度可以排序为(gbssI-PS)<(gbssI/ssII-PS)<(gbssI/ssIII-PS)<(gbssI/ssIII/ssII-PS)。

实施例12-突变株系中的淀粉组合物

淀粉组合物的分析基本根据Sargeant和Wycombe(1982)和Klucinec,J.D.,D.B.Thompson(1998)“Method for determination of amylose content andamylopectin chain distribution”的改良方法进行。将淀粉分散在氢氧化钾中，中和并用乙醇沉淀。将沉淀物在100℃分散并溶解在DMSO中，与乙酸钠缓冲液混合，并再次加热。冷却至45℃后，添加异淀粉酶(isoamylase)。将样品孵育过夜，然后将酶在100℃灭活。将溶液通过0.45μm过滤并注入HPSEC系统中。

高效尺寸排阻色谱(High Performance Size Exclusion Chromatography)(HPSEC)系统由以下部分组成：高压泵、具有500μl环的自动进样器、RI(折射指数)检测器、加热至70℃的柱烘箱、磁力搅拌器和色谱数据系统。三个PL-凝胶10μm Mixed-B 300×7.5mm聚苯乙烯二乙烯基苯分析柱和一个PL-凝胶10 10μm Mixed-B 100×7.5mm保护柱用于分离。洗脱液是在100％DMSO中的50mM溴化锂，并且流速为0.5ml/min。

由于淀粉脱支，直链淀粉级分具有最高的分子量并且通过SEC柱洗脱最快，而支链淀粉已经被降解为单链，并且在直链淀粉之后洗脱。

在对应于DP 200(M_W～34 000g/mol)的保留时间的色谱图被分开，这是在脱支马铃薯淀粉中直链淀粉向支链淀粉的转变。

淀粉中支链淀粉和直链淀粉的测定在高效尺寸排阻色谱系统上进行。在样品被注入到分离系统之前，将样品溶解在NaOH中并用异淀粉酶脱支。在将支链淀粉消化后，直链淀粉级分具有最大的分子，并且首先通过分离系统洗脱。直链淀粉和支链淀粉的保留时间都基于脱支的天然马铃薯淀粉(在Lyckeby Starch AB,Sweden全规模生产)的色谱图(图6)。在第一个峰(在图6中的1.)中洗脱的物质被认为是直链淀粉，并且然后在色谱中随后洗脱的物质是支链淀粉(在图6中的2+3.)。支链淀粉级分被分开为长链支链淀粉(在图6中的2.)和短链支链淀粉(在图6中的3.)。

淀粉从来自通过以下株系例示的许多个体突变株系的马铃薯块茎提取：23178(gbssI-PS)、18039(gbssI/ssIII-PS)和27031(gbssI/ssIII-PS)。在所有情况下，整体的(bulked)淀粉显示出多于99％或99.5％的支链淀粉。表3和图7显示了株系27031(gbssI/ssIII-PS)和株系23178(gbssI-PS)的结果，并且在图8中显示了株系18039(gbssI/ssIII-PS)以及传统的天然马铃薯淀粉的结果。为了研究是否可以发现块茎之间的任何变化性，对从株系23178(gbssI-PS)的五个个体块茎中分离的淀粉进行了评价。五个个体块茎的分离的淀粉都显示出多于99.5％的支链淀粉。结果示于表3和图9中，其中株系23178#1(gbssI-PS#1)、23178#2(gbssI-PS#2)、23178#3(gbssI-PS#3)、23178#4(gbssI-PS#4)和23178#5(gbssI-PS#5)的结果与整体(所有马铃薯的剩余部分)23178#整体(gbssI-PS#整体)一起示出。这些结果显示，本发明产生接近100％的支链淀粉含量，如任何方法所能测定的。另外，结果显示，本发明在来自同一株系的所有个体块茎之间产生接近100％的稳定的支链淀粉含量，如任何方法所能测定的。

表3

参考文献

1.Zeeman，S.C.，J.Kossmann，and A.M.Smith，Starch：Its Metabolism，Evolution，and Biotechnological Modification in Plants.Annual Review of PlantBiology，Vol 61，2010.61：p.209-234.

2.Kossmann，J.and J.Lloyd，Understanding and influencing starchbiochemistry.Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology，2000.35(3)：p.141-196.

3.Jinek，M.，et al.，A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease inAdaptive Bacterial Immunity.Science，2012.337(6096)：p.816-821.

4.Chen，C.，L.A.Fenk，and M.de Bono，Efficient genome editing inCaenorhabditis elegans by CRISPR-targeted homologous recombination.NucleicAcids Research，2013.41(20).

5.Auer，T.O.，et al.，Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in inzebrafish by homology-independent DNA repair.Genome Research，2014.24(1)：p.142-153.

6.Li，J.-F.，et al.，Multiplex and homologous recombination-mediatedgenome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA andCas9.Nature Biotechnology，2013.31(8)：p.688-691.

7.Xie，K.and Y.Yang，RNA-Guided Genome Editing in Plants Using aCRISPRCas System.Molecular Plant，2013.6(6)：p.1975-1983.

8.Belhaj，K.，et al.，Plant genome editing made easy：targetedmutagenesis in model and crop plantS using the CRISPR/Cas system.PlantMethods，2013.9.

9.Sun，X.，et al.，Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9system.Scientific Reports，2015.5.

10.Pattanayak，V.，et al.，High-throughput profiling of off-target DNAcleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity.NatureBiotechnology，2013.31(9)：p.839-+.

11.Hsu，P.D.，et al.，DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9nucleases.Nature Biotechnology，2013.31(9)：p.827-+.

12.Nicolia，A.，et al.，Targeted gene mutation in tetraploid potatothrough transient TALEN expression in protoplasts.Journal of Biotechnology，(0).

序列表

<110> 莱克拜斯塔奇公司

<120> 具有改进的抗回生稳定性和改进的冻融稳定性的支链马铃薯淀粉

<130> 21090211

<150> SE1650598-4

<151> 2016-05-03

<160> 44

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 1

gatattagaa tcacataggg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 2

tgttgacaag ggtgttgaat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 3

gctaccattg tttgtggaaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 4

gacaagaaga tccctttgat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 5

gtgctaaaag gggtaagttg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 6

ggggtgccct ttcatcggcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 7

gctccagtag agagcaaatg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 8

gaacatctga accaaatttc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 9

gaggtggcaa tggacccagg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 10

ggaaactaat gccagtagca 20

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 11

cctcttctca atcttcctga tgaattcag 29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 12

agagcctcct ttagtaaagg ttttgcgtc 29

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 13

tgcttcacaa tccctaattc tc 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 14

atccaaaagt gtctcttgac tg 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 15

gcttagagaa gcggctatgc gtg 23

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 16

tccatcatat atgcatccaa tggaacc 27

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 17

actggatgaa ggctgggata 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 18

atttgtcagt cgctgggttc 20

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 19

aggaaccata ctctgactca c 21

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 20

ttttgctcca aggaccaac 19

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 21

tctctataca ggtcatggac g 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 22

gcagcaacaa gaatatctga ac 22

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 23

tggaaatcag ttccacccc 19

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 24

catggctaaa acctttttgc tc 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 25

cgataaaaat acaccgcctg c 21

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 26

tctggaggga cattcaacg 19

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 27

atccaagctg gaagcagtgt 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 28

gacatgggtg ccattttcag 20

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 29

tgatgacaag gatgctgtaa ag 22

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 30

tcaacatcca cctgcaatat c 21

<210> 31

<211> 38

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 31

gggatattag aatcacatag ggtggttaca gtgagccc 38

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 32

ttgtctctgc tgttgacaag ggtgttgaat tggacagtgt cc 42

<210> 33

<211> 44

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 33

ctggatgctc agctaccatt gtttgtaaag ggaatgaact tgat 44

<210> 34

<211> 38

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 34

cctgttgaca agaagatccc tttgattggc ttcatcgg 38

<210> 35

<211> 38

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 35

ttttgggcct aagtgctaaa aggggtaagt tggggtgg 38

<210> 36

<211> 32

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 36

gggggtgccc tttcatcggc caggtccctt tt 32

<210> 37

<211> 38

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 37

cagcgattaa atgaacatct gaaccaaatt tcaggttt 38

<210> 38

<211> 38

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 38

ggcaacattt tctgaggtgg caatggaccc aggcggtg 38

<210> 39

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 39

taatacgact cactatagac aagaagatcc ctttgat 37

<210> 40

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 40

ttctagctct aaaacatcaa agggatcttc ttgt 34

<210> 41

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 41

taatacgact cactatagag gtggcaatgg acccagg 37

<210> 42

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 42

ttctagctct aaaaccctgg gtccattgcc acct 34

<210> 43

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 43

taatacgact cactatagct ccagtagaga gcaaatg 37

<210> 44

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 引物

<400> 44

ttctagctct aaaaccattt gctctctact ggag 34

Claims

1.支链马铃薯淀粉，所述支链马铃薯淀粉具有改进的抗回生稳定性和改进的冻融稳定性，其中所述支链马铃薯淀粉包含多于99％的支链淀粉，优选地100％的支链淀粉。

2.根据权利要求1所述的支链马铃薯淀粉，其中所述支链马铃薯淀粉从选自下组的马铃薯(Solanum tuberosum)中提取：

i)其中GBSSI酶的表达和/或活性已经被完全消除的马铃薯，

ii)其中GBSSI酶和SSIII酶两者的表达和/或活性已经被完全消除的马铃薯，

iii)其中GBSSI酶和SSII酶两者的表达和/或活性已经被完全消除的马铃薯，以及

iv)其中GBSSI酶、SSIII酶和SSII酶的表达和/或活性已经被完全消除的马铃薯；

优选地从属于iv)组的马铃薯中提取。

3.根据权利要求1所述的支链马铃薯淀粉，其中当所述支链马铃薯淀粉从属于所述ii)-iv)组的马铃薯中提取时，所述支链马铃薯淀粉还具有与天然支链马铃薯淀粉的支链淀粉链长度相比更短的支链淀粉链长度和与天然支链马铃薯淀粉的支化度相比更高的支化度，其中所述支化度多于4％，优选地多于5％。

4.根据前述权利要求中任一项所述的支链马铃薯淀粉，其中按照根据标准化的冻/融稳定性测试的定义，所述支链马铃薯淀粉在2-4次、优选地2次重复冻/融循环后显示出少于30％的脱水收缩。

5.根据前述权利要求中任一项所述的支链淀粉，其中所述支链马铃薯淀粉在从所述马铃薯中提取后通过酸稀化、氧化、乙酰化、羟丙基化、交联、钠-辛烯基琥珀酰化、铝-辛烯基琥珀酰化、琥珀酰化、焦糊精化、酶促改性、碱性焙烧或阳离子改性已经被纯化。

6.根据前述权利要求中任一项所述的支链马铃薯淀粉，其中所述支链马铃薯淀粉已经被糊化并进一步干燥至多于80％w/w DM、优选地多于85％w/w DM、并且更优选地多于90％w/w DM的干内容物。

7.根据前述权利要求中任一项所述的支链马铃薯淀粉，其中所述支链马铃薯淀粉通过酶促改性或酸处理、焦糊精化、氧化降解或其组合已经被降解为100 000-1 000 000Da、优选地300 000-800 000Da、更优选地500000-700 000Da的分子量，或者其中所述支链马铃薯淀粉通过碱性焙烧或与氧化剂的漂白反应已经被抑制。

8.一种用于产生马铃薯(Solanum tuberosum)的方法，所述马铃薯(Solanumtuberosum)包含根据权利要求1-4所述的支链马铃薯淀粉，其中所述方法涉及使用CRISPR/核酸酶技术的同源定向诱变，并且包括以下步骤：

a)提供马铃薯细胞或包含马铃薯细胞的马铃薯组织，

b)将一种或更多种CRISPR/核酸酶复合物引入所述马铃薯细胞的细胞核中，每种CRISPR/核酸酶复合物包含特异性靶向核糖核苷酸序列，所述特异性靶向核糖核苷酸序列与位于编码GBSS酶的基因以及任选地还有编码SSII酶的基因和/或编码SSIII酶的基因中紧邻PAM(5′-NGG-3′原间隔区相邻基序)上游的DNA序列中的靶核苷酸序列完全或基本同源，其中所述诱变发生在马铃薯基因组的一个或更多个等位基因中，其中当所述靶向核糖核苷酸序列识别所述靶核酸序列的互补连时，所述一种或更多种CRISPR/核酸酶复合物切割所述DNA序列，导致马铃薯随后完全缺乏产生功能性GBSSI酶、还有任选地功能性SSII和/或SSIII酶的能力，

c)其中任选地重复步骤b)，直到所述马铃薯缺乏在所有等位基因中产生所述功能性GBSSI酶、还有任选地功能性SSII和/或SSIII酶的能力。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述同源定向诱变导致所述马铃薯的基因组完全缺乏产生功能性GBSSI酶、SSII酶和SSIII酶的能力。

10.根据权利要求8和9中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/核酸酶技术是CRISPR/Cas技术、优选地CRISPR/Cas9技术或CRISPR/Cpf1技术，并且其中CRISPR/Cas9复合物的靶核苷酸序列由20bp组成。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述靶向核糖核苷酸序列与来自以下组的靶核苷酸序列的一个或更多个完全或基本同源：

GT1：5’-GATATTAGAATCACATAGGG-3’ SEQ.ID.NO.1

GT2：5’-TGTTGACAAGGGTGTTGAAT-3’ SEQ.ID.NO.2

GT3：5’-GCTACCATTGTTTGTGGAAA-3’ SEQ.ID.NO.3

GT4：5’-GACAAGAAGATCCCTTTGAT-3′ SEQ.ID.NO.4

S2T1：5’-GTGCTAAAAGGGGTAAGTTG-3’ SEQ.ID.NO.5

S2T2：5’-GGGGTGCCCTTTCATCGGCC-3’ SEQ.ID.NO.6

S2T3：5’-GCTCCAGTAGAGAGCAAATG-3’ SEQ.ID.NO.7

S3T1：5’-GAACATCTGAACCAAATTTC-3’ SEQ.ID.NO.8

S3T2：5’-GAGGTGGCAATGGACCCAGG-3’ SEQ.ID.NO.9

S3T3：5’-GGAAACTAATGCCAGTAGCA-3’ SEQ.ID.NO.10

其中，在所述靶向核糖核苷酸序列与靶核苷酸序列基本同源的情况下，所述靶向核糖核苷酸序列可以在序列长度和碱基身份方面不同于完全同源的序列，但仅以仍然获得所期望的突变的方式。

12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述马铃薯是块茎、叶、芽、茎、花、细胞或原生质体。

13.根据权利要求8-12中任一项所述的方法，其中所述方法在马铃薯基因组的4个等位基因中进行。

14.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述酶活性的成功突变和消除通过PCR方法确认。

15.马铃薯，所述马铃薯选自下组：

i)其中GBSSI酶的表达和/或活性已经被完全消除的马铃薯，

优选地来自属于iv)组的马铃薯，其中所述马铃薯优选地通过根据权利要求7-13中任一项所述的方法获得。

16.一种用于产生根据权利要求1所述的支链马铃薯淀粉的方法，其中所述支链马铃薯淀粉从根据权利要求14所述的马铃薯中提取，其中所述马铃薯根据权利要求7-13中任一项所述的方法产生。

17.纯化的根据权利要求1-7中任一项所述的淀粉在食品应用中

-作为液体制剂中的调质剂的用途，其中淀粉浓度为0.05％-15％w/w、优选地0.5％-10％w/w、更优选地1.5％-6％w/w，

-作为制剂中的调质剂的用途，其中食品产品被另外冷冻，

-优选地在涂覆应用中的用途，其中植物或动物来源的食品产品用淀粉和/或淀粉与其他成分的制剂涂覆，并且随后进行另外的油炸，

-作为液体产品和涂物中油包水(W/O)乳液的稳定剂的用途，或者

-作为呈液体状态的以及在水包油(O/W)乳液另外被喷雾干燥为粉末的应用中的水包油乳液的乳液稳定剂的用途，其中所述支链马铃薯淀粉首先通过辛烯基琥珀酸钠或辛烯基琥珀酸铝改性。

18.纯化的根据权利要求1-7中任一项所述的淀粉在纸的应用中的用途，优选地用于纸的表面施胶和涂覆，或者作为纸的生产中的湿部淀粉。