WO2022075335A1 - イネ科植物及びその作製方法 - Google Patents

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WO2022075335A1
WO2022075335A1 PCT/JP2021/036891 JP2021036891W WO2022075335A1 WO 2022075335 A1 WO2022075335 A1 WO 2022075335A1 JP 2021036891 W JP2021036891 W JP 2021036891W WO 2022075335 A1 WO2022075335 A1 WO 2022075335A1
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plant
mutation
plants
seq
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PCT/JP2021/036891
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良 松島
裕 久野
和広 佐藤
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国立大学法人 岡山大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Definitions

  • the present invention relates to a gramineous plant suitable for the production of various sugars and a method for producing the same.
  • Gramineae plants such as barley (Hordeum vulgare) and wheat (Triticum aestivum) are cultivated all over the world and used for food, brewing and livestock feed. Therefore, research and development have been carried out for the purpose of improving the yield and functionality of the grains of gramineous plants, and various traits that affect the sugar content of the grains are known. For example, as a barley showing a high amylose content, a barley (Patent Document 1) in which an exogenous polynucleotide is introduced to reduce the level of sbeIIa activity, which is a debranching enzyme, has been reported.
  • the present inventors targeted gramineous plants that are in high demand as food and feed. Then, to provide a novel grass family plant in which the content of various sugars (polysaccharides, oligosaccharides, monosaccharides, etc.), dietary fiber, etc. in the seed is increased or decreased as compared with the wild type plant.
  • various sugars polysaccharides, oligosaccharides, monosaccharides, etc.
  • dietary fiber, etc. in the seed is increased or decreased as compared with the wild type plant.
  • starch content may be simply abbreviated as “starch amount” which occupies most of the grains. That is, the second object of the present invention is to produce a novel gramineous plant in which the amount of starch in the seed is reduced as compared with the wild-type plant.
  • the present inventors have increased or decreased the content of various sugars in gramineous plants containing any two or more of the following three types of genetic factors A to C as compared with wild-type plants. I found that.
  • Genetic Factor A A mutation in the isoamylase 1 gene, a mutation in the promoter region of the gene, or an exogenous polynucleotide or a combination thereof that causes a decrease or deletion in the activity or expression of the isoamylase 1 polypeptide.
  • Genetic Factor B A mutation in the sbeIIa gene, a mutation in the promoter region of the gene, or an exogenous polynucleotide or a combination thereof that causes a decrease or deletion in the activity or expression of the sbeIIa polypeptide.
  • Genetic Factor C A mutation in the fla gene, a mutation in the promoter region of the gene, or an exogenous polynucleotide or a combination thereof that causes a decrease or deletion in the activity or expression of the fla polypeptide.
  • the present inventors thereof in the gramineous plants containing the genetic factor A and the genetic factor C but not containing the genetic factor B, the present inventors thereof. It was found that the amount of starch in the seeds was significantly reduced as compared with the wild type plants.
  • the present inventors have (A) plants containing double-grained starch granules in seeds, (B) plants containing elongated starch granules in seeds, and (C) fine starch particles aggregated in seeds. From gramineous plants obtained by mating any two plants selected from plants containing starch granules and giant starch granules as parent plants, the content of various sugars in the seeds is a wild type plant. It has been found that plants that have increased or decreased in comparison with the above can be easily obtained.
  • the present inventors have completed the present invention based on the above findings.
  • a gramineous plant or a portion thereof which comprises at least two selected from the following (a) to (c): (A) A mutation in the isoamylase 1 gene, a mutation in the promoter region of the gene, or an exogenous polynucleotide or a combination thereof that causes a decrease or deficiency in the activity or expression of the isoamylase 1 polypeptide; (B) Mutations in the sbeIIa gene, mutations in the promoter region of the gene, or exogenous polynucleotides or combinations thereof that cause a decrease or deletion in the activity or expression of the sbeIIa polypeptide; (C) A mutation in the fla gene, a mutation in the promoter region of the gene, an exogenous polynucleotide, or a combination thereof that causes a decrease or deletion in the activity or expression of the fla poly
  • [5] The grass family plant or a portion thereof according to any one of [1] to [4], further comprising at least one selected from the following (e) to (g): (E) Mutations in at least one other carbohydrate metabolism gene or mutations in the promoter region of that gene; (F) An exogenous polynucleotide containing at least one other wild-type or mutant carbohydrate metabolism gene; (G) An exogenous polynucleotide that reduces or results in the expression or function of at least one other carbohydrate metabolism gene.
  • [7] A grain or a processed product thereof obtained from the gramineous plant according to any one of [1] to [6].
  • the present invention also provides the following methods for producing gramineous plants.
  • [8] (I) The gramineous plant according to any one of [1] to [6] is transformed with at least one parent plant by self-fertilization, mating with a second plant, or with an exogenous polynucleotide. By doing so, you get offspring; and (Ii) (1) From the progeny plants, a plant in which the abundance of a specific sugar in a seed or a grain is increased or decreased with respect to a wild-type plant is selected, or (2) Select plants in which at least two mutations or exogenous polynucleotides selected from the above (a) to (c) are detected; A method for producing a gramineous plant, including.
  • a primer pair consisting of a first oligonucleotide primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 8 at the 3'end and a second oligonucleotide primer containing a part of the base sequence consisting of bases 1 to 3386 of SEQ ID NO: 1;
  • Primer pair (III) A primer pair consisting of a fifth oligonucleotide primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 at the 3'end and a sixth oligonucleotide primer containing a part of the complementary sequence of the base sequence consisting of bases 829 to 5687 of SEQ ID NO: 3. And a primer pair consisting of a 7th oligonucleotide primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 13 at the 3'end and an 8th oligonucleotide primer containing a part of the complementary sequence of the base sequence consisting of the bases 829 to 5687 of SEQ ID NO: 3. Combination of; Here, a primer set in which the sixth oligonucleotide primer and the eighth oligonucleotide primer are the same or different oligonucleotide primers.
  • the present invention provides the following gramineous plants or parts thereof.
  • (B) A gramineous plant or a portion thereof, which comprises a mutation in the sbeIIa gene, a mutation in the gene promoter region, or a combination thereof, which causes a decrease or deletion in the activity or expression of the sbeIIa polypeptide.
  • the present invention provides the following method for producing a gramineous plant.
  • How to make gramineous plants (I) Mating any two plants selected from the following (A) to (C) as parent plants; (A) Plants containing double-grained starch grains in seeds; (B) Plants containing elongated starch granules in seeds; (C) Plants containing starch granules in the form of aggregated fine starch particles in seeds and giant starch granules: and (Ii) From the plants obtained by the mating, select plants in which the abundance of specific sugars in seeds or grains is increased or decreased with respect to wild-type plants: A method for producing a gramineous plant, including.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the mutation of the isoamylase 1 gene in (a) is a mutation in which the codon corresponding to at least one residue selected from 1 to 490 of the isoamylase 1 polypeptide of SEQ ID NO: 4 is a stop codon, and is preferable.
  • the mutation of the fra gene in (c) is a mutation in which the codon corresponding to at least one residue of the 1st to 217th residues of the fra polypeptide of SEQ ID NO: 6 is a stop codon, and the fra of SEQ ID NO: 6 is preferable.
  • the gramineous plant according to any one of [1] to [6] and [12] to [16] is used as at least one parent plant by self-fertilization, mating with a second plant, or. , Progeny plants are obtained by transformation with exotic polynucleotides; (Ii) (1) From the progeny plants, a plant in which the abundance of a specific sugar in a seed or a grain is increased or decreased with respect to a wild-type plant is selected, or (2) Select plants in which at least two mutations or exogenous polynucleotides selected from the above (a) to (c) are detected; A method for producing a gramineous plant, including.
  • a gramineous plant is obtained in which the amount is increased or decreased as compared with the wild type plant.
  • a gramineous plant in which the amount of starch in the seed or grain is reduced can be obtained.
  • FIG. 2A is a photograph of the morphology of the ISA1 mutant (A mutant), the sbeIIa mutant (B mutant) and the fra mutant (C mutant) derived from Haruna Nijo obtained in Test Example 1 and the wild-type seed. Is.
  • the figure on the left side of FIG. 2B is a graph showing the results of measuring the chain length of amylopectin in these seeds. The horizontal axis shows the length of the chain, and the vertical axis shows the frequency (%). The figure on the right side of FIG.
  • 2B is a graph showing the difference obtained by subtracting the frequency of wild-type Haruna Nijo from the frequency of each mutant at each chain length. It is a figure which shows the result of having discriminated wild type and A to C mutant alleles in a heterozygous type or a homozygous type by PCR using the mutant allele discrimination primer prepared in Test Example 2.
  • 3A and 3B are electrophoretic images of DNA fragments after PCR with a primer pair for discriminating an individual having an A mutant allele and a B mutant allele and then undergoing a specific restriction enzyme treatment.
  • FIG. 3C is an electrophoretic image of a DNA fragment obtained by PCR with two types of primer pairs for discriminating an individual having a C mutant allele.
  • FIGS. 6-1 to 4 are continuous base sequences, and are base sequences (SEQ ID NO: 1) starting from the 5'end of the start codon of the ISA1 gene of barley (Haruna Nijo). The uppercase letters represent exons and the lowercase letters represent introns.
  • the boxed G corresponds to the third letter base of the codon of the 490th tryptophan residue.
  • the NN surrounded by a frame represents an undetermined region, and the actual base length thereof is not limited to 2 bases.
  • FIGS. 7-1 to 4 are continuous base sequences, and are base sequences (SEQ ID NO: 2) starting from the 5'end of the start codon of the sbeIIa gene of barley (Haruna Nijo).
  • the uppercase letters represent exons and the lowercase letters represent introns.
  • the boxed G corresponds to the base of the first letter of the codon of the 564th glycine residue.
  • the NN surrounded by a frame represents an undetermined region, and the actual base length thereof is not limited to 2 bases.
  • FIGS. 8-1 and 8-2 are continuous base sequences, and are base sequences (SEQ ID NO: 3) starting from the 5'end of the start codon of the fra gene of barley (Haruna Nijo).
  • the uppercase letters represent exons and the lowercase letters represent introns.
  • the framed GG corresponds to the base of the third letter of the codon of the 216th serine residue and the first letter of the codon of the 217th glutamic acid residue. It is an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the ISA1 polypeptide of barley (Haruna Nijo). It is an amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of the sbeIIa polypeptide of barley (Haruna Nijo). It is an amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the fla polypeptide of barley (Haruna Nijo).
  • ISA1 polypeptide of hexaploid wheat TraesCS7D02G249500.1; SEQ ID NO: 15).
  • One amino acid sequence of the ISA1 polypeptide of hexaploid wheat (TraesCS7A02G251400.1; SEQ ID NO: 16). It is one amino acid sequence (TraesCS7B02G139700.2; SEQ ID NO: 17) of the ISA1 polypeptide of hexaploid wheat.
  • polynucleotide is also referred to as “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and represents a polymer of nucleotides.
  • base sequence is also expressed as a “nucleic acid sequence” or a “nucleotide sequence”, and represents a sequence of a deoxyribonucleotide (DNA) or a sequence of a ribonucleotide (RNA) unless otherwise specified.
  • polypeptide is synonymous with “protein”.
  • gene refers to a region composed of exons and introns that is transcribed in the genome.
  • the gene represents a region from the transcription start site (the most upstream base on the 5'side of the first exon) to the most downstream base on the 3'side of the last exon.
  • the "coding region (CDS)” is a region translated into a polypeptide in a gene, and represents a region from the first base of the start codon to the third base of the stop codon of the gene.
  • the CDS may be divided by one or more introns.
  • the "5'-untranslated region (UTR)” is a region connected to the 5'end of the coding region and represents a region that is not translated into a polypeptide.
  • the "3'-untranslated region (UTR)” is a region connected to the 3'end of the coding region and represents a region that is not translated into a polypeptide.
  • the percentage of "identity” and “similarity” of a specific base sequence or amino acid sequence to a control base sequence or amino acid sequence is a value obtained by the following procedure.
  • NCBI BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) blastn (in the case of base sequence) or blastp (in the case of amino acid sequence) using Align two or more sequences. Enter a specific sequence into the Query Sequence and a reference sequence into the Subject Sequence to align with the default parameters.
  • the percentage of "Identities” displayed in the obtained results shall be the percentage of "identity” of a specific base sequence or amino acid sequence.
  • the percentage of “Similarities” is defined as the percentage of "similarity" of a specific base sequence or amino acid sequence.
  • mutation means, for example, substitution, deletion, insertion, duplication (eg, doubling, increase in the number of genes by introduction of a new polynucleotide, etc.), translocation or reverse in DNA. Represents a place. Unless otherwise stated, “mutation” refers to a difference in the base sequence of a wild-type organism of the same species and strain as the organism.
  • expression of a particular polypeptide means that the mRNA encoding the particular polypeptide is translated and exists as a polypeptide in plant cells.
  • “decreased activity" of a specific polypeptide means that the activity of the polypeptide (for example, in the case of an enzyme, the enzyme activity) is decreased as compared with a control plant.
  • the "deficiency of activity" of a specific polypeptide is not only when the polypeptide in the cell does not function at all, but also when the activity of the polypeptide is reduced to an undetectable level and the activity is substantially 0.
  • the control plant is a wild-type plant of the same species, preferably a wild-type plant of the same species and strain.
  • “decreased expression” of a specific polypeptide means that the intracellular amount of the polypeptide is reduced as compared with a control plant.
  • the "deficiency of expression” of a specific polypeptide is such that the expression of the polypeptide is reduced to an undetectable level and the expression is substantially 0, in addition to the case where the polypeptide is not present at all in the cell.
  • the control plant is a wild-type plant of the same species, preferably a wild-type plant of the same species and strain.
  • Mutations in the gene encoding the polypeptide that result in decreased activity or expression of such a particular polypeptide include, for example, the appearance of a stop codon in the middle of CDS, the deletion of a start codon (ATG), and the like. Partial or total deletion of CDS, mutations in which amino acid residues involved in the polypeptide activity are replaced with other residues, splicing abnormalities, decreased transcription or translation of mRNA encoding the polypeptide, and poly. Examples include, but are not limited to, mutations that result in one alone or a combination of two or more selected from the group consisting of increased degradation of mRNA or polypeptide encoding the peptide.
  • mutations in the promoter region of a specific gene that cause a decrease or deletion in the activity or expression of a specific polypeptide include, for example, partial or total deletion of the promoter region.
  • the portion of the promoter region include 200 bases, 150 bases or 100 bases on the 5'side of the transcription initiation site.
  • an exogenous polynucleotide that causes a decrease or deletion in the activity or expression of a specific polypeptide is, for example, a target gene having a gene encoding the polypeptide as a target gene, and a sense strand or an antisense strand of the target gene. It is a polynucleotide that can suppress the transcription or translation of a gene by forming a double strand with the wild type organism.
  • Such polynucleotides include, for example, gene silencing chimeric genes, antisense RNAs, co-suppression RNAs, dsRNA molecules for RNA interference, hairpin RNA molecules or microRNAs, CRISPR-Cas9 and its variants. Guide RNA and the like can be mentioned.
  • plant part includes plant tissues (for example, leaves, stems, roots, side buds, flowers, reproductive organs, embryos and parts thereof), seeds and the like.
  • the present invention includes a gramineous plant or a portion thereof, which comprises any two or more selected from the following (a) to (c).
  • B Mutations in the sbeIIa gene, mutations in the promoter region of the gene or exogenous polynucleotides or combinations thereof, which result in decreased activity or expression of the sbeIIa polypeptide; and (c) activity or expression of the fra polypeptide.
  • the gramineous plant of the present invention or a portion thereof includes the above-mentioned (a) and (c), but does not include (b).
  • Gramineae plants containing any two or more of the above genetic factors A to C have an increased content of various polysaccharides in their seeds or grains compared to their corresponding wild-type gramineous plants. Or it has the characteristic of decreasing. Therefore, the grains obtained from the Gramineae plant are suitable for producing foods or feeds with new functionality.
  • the corresponding wild-type plant described above is a wild-type plant of the same species, preferably a wild-type plant of the same species and strain.
  • the gramineous plants containing the above-mentioned genetic factors A and C but not containing B are characterized in that the amount of starch accumulated in the seeds is significantly reduced as compared with the corresponding wild-type gramineous plants.
  • the grass is one or more sugars selected from the group consisting of glucose, sucrose, maltose, and oligosaccharides in its seeds as compared to its corresponding wild-type grass. Contains more. Therefore, the gramineous plant itself can be used as a raw material for preparing these sugars.
  • the Gramineae plant is suitable for producing new functional polysaccharides in the plant by using these saccharides as a material.
  • the corresponding wild-type grasses described above are wild-type plants of the same species, preferably wild-type plants of the same species and strain.
  • the grasses of the present invention have a starch content of the obtained seeds or grains of, for example, 50% or less, 40% or less, and 30% or less with respect to the seeds or grains of the wild-type plant. , 25% or less, 20% or less, 15% or less, or 10% or less.
  • the wild-type plant is a wild-type plant of the same species, preferably a gramineous plant of the same species and strain.
  • the starch content of the seed or grain of each plant is determined, for example, by the average value of the starch content of the seed or grain of each grain.
  • the starch content can be quantified according to the protocol of the product using, for example, Total Starch Assay Kit (AA / AMG) manufactured by Megazyme.
  • the grass family plant to which the present invention is intended is not particularly limited as long as it is a plant corresponding to the grass family (Poaceae).
  • grasses barley, wheat (quadruplicate wheat such as macaroni wheat, hexagonal wheat such as normal wheat), wheat plants such as limewood and embaku, rice, corn, awa, morokoshi, etc. Can be mentioned.
  • a wheat plant is preferable, a barley or a wheat is more preferable, and a barley is further preferable.
  • barley (barley plant) is a plant of the Gramineae family and represents a plant species represented by the scientific name Hordeum vulgare.
  • Examples of barley include two-row barley including "Haruna Nijo”, six-row barley including “Molex”, cultivated barley such as bare barley (H. vulgare subsp. Vulgare), and wild barley (H. vulgare subsp. Spontaneum). ) Is included.
  • the "isoamylase 1 gene (ISA1)” is a gene encoding one of the starch debranching enzymes involved in the biosynthesis of amylopectin in plants.
  • the ISA1 gene-deficient mutant is called the sugary-1 mutant.
  • the nucleotide sequence and CDS of wild-type ISA1 of barley can be found in the NCBI-provided Genbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) with accession numbers. It is registered with FN179385.
  • the three wild-type ISA1 polypeptides of hexaploid wheat are, for example, the accession number TraesCS7D02G249500.1 (SEQ ID NO: 15) of EnsenblPlants (http://plants.ensembl.org/) provided by EMBL-EBI. , TraesCS7A02G251400.1 (SEQ ID NO: 16), TraesCS7B02G139700.2 (SEQ ID NO: 17).
  • the mutation in genetic factor A is an ISA1 gene mutation that results in a deficiency in the activity or expression of the ISA1 polypeptide.
  • Such mutations include, for example, one or more selected from the group consisting of the appearance of a stop codon in the middle of the CDS of the ISA1 gene, the deletion of the start codon (ATG), and the mutation resulting in partial or total deletion of the CDS. Mutations include. Further, in the case of a gramineous plant having a plurality of ISA1 genes such as tetraploid and hexaploid, it is sufficient that any ISA1 gene has a mutation that causes a defect in activity or expression, but in the genome. It is preferable to have a mutation in all ISA1 genes that causes a defect in activity or expression.
  • the ISA1 gene mutation that causes a decrease or deletion of the activity or expression of the ISA1 polypeptide corresponds to, for example, one or more residues of the ISA1 polypeptide of SEQ ID NO: 4 from 1 to 490. It may be a mutation in which the codon to be used becomes a stop codon. For example, the mutation may be a mutation in which the codon corresponding to the 490th tryptophan residue of SEQ ID NO: 4 is a stop codon.
  • the ISA1 gene mutation that causes a decrease or deletion of the activity or expression of the ISA1 polypeptide is, for example, 1 to 492 of SEQ ID NO: 15, 1-491 of SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17
  • the codon corresponding to at least one residue selected from the group consisting of the 1st to 491st of the above may be a mutation in which the stop codon is used.
  • the mutation corresponds to at least one residue at positions 1-492 of SEQ ID NO: 15, at least 1 residue at positions 1-491 of SEQ ID NO: 16, and at least 1 residue at positions 1-491 of SEQ ID NO: 17. It can be a mutation in which each codon is a stop codon.
  • starch debranching enzyme IIa (sbeIIa)
  • BEIIa starch debranching enzyme IIa
  • sbeIIa starch debranching enzyme IIa
  • BEIIa starch debranching enzyme IIa
  • the nucleotide sequence and CDS of the wild-type sbeIIa of barley are registered at NCBI's Genbank with accession number AF064560.
  • the nucleotide sequence of the wild-type sbeIIa of "Haruna Nijo", which is one of the barley varieties, is shown in SEQ ID NO: 2
  • the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the wild-type sbeIIa is shown in SEQ ID NO: 5.
  • Examples of the three wild-type sbeIIa polypeptides of hexaploid wheat include Accession Nos. TraesCS2A02G293400.1 (SEQ ID NO: 18), TraesCS2D02G290800.4 (SEQ ID NO: 19), and TraesCS2B02G309500.3 (SEQ ID NO: 20) of Ensenbl Plants. ).
  • the mutation in genetic factor B is a sbeIIa gene mutation that results in a deficiency in the activity or expression of the sbeIIa polypeptide.
  • Such mutations include, for example, one or more mutations selected from the group consisting of the appearance of a stop codon in the middle of the CDS of the sbeIIa gene, the deletion of the start codon (ATG), and the partial or total deletion of the CDS. Can be mentioned.
  • ATG start codon
  • any of the sbeIIa genes has a mutation that causes a defect in activity or expression, but in the genome. It is preferred that all sbeIIa genes have mutations that result in loss of activity or expression.
  • the sbeIIa gene mutation that causes a decrease or deletion of the activity or expression of the sbeIIa polypeptide is, for example, the codon corresponding to the 564th glycine of the sbeIIa polypeptide of SEQ ID NO: 5 becomes an arginine codon. It can be a mutation.
  • the sbeIIa gene mutation that causes a decrease or deletion of the activity or expression of the sbeIIa polypeptide is, for example, glycine at position 658 of SEQ ID NO: 18, glycine at position 655 of SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NO: 20.
  • the codon corresponding to at least one selected from the group consisting of the 658th glycine of the above may be a mutation that becomes an arginine codon.
  • the mutation is a mutation in which the codon corresponding to the 658th glycine of SEQ ID NO: 18, the 655th glycine of SEQ ID NO: 19, and the 658th glycine of SEQ ID NO: 20 is replaced with an arginine codon.
  • the codon corresponding to the 658th glycine of SEQ ID NO: 18, the 655th glycine of SEQ ID NO: 19, and the 658th glycine of SEQ ID NO: 20 is replaced with an arginine codon.
  • the "fra gene” is a mutation in barley that has crushed starch granules that are significantly smaller in diameter than normal starch granules, resulting in grains that exhibit an opaque appearance. It is a gene identified as the causative gene of the fra mutation (see Theoretical and Applied Genetics, 2018, Vol.131, pp.353-364).
  • the fra gene is a homologue of the FLOURY ENDOSPERM 6 (FLO6) gene in rice.
  • FLO6 FLOURY ENDOSPERM 6
  • the base sequence of the wild-type fla gene of "Haruna Nijo", which is one of the worms, is the same as the sequence registered in Genbank, and is represented by SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the encoding polypeptide is a sequence. It is represented by the number 6.
  • Examples of the three wild-type fla polypeptides of hexaploid wheat include Accession Nos. TraesCS4B02G029700.2 (SEQ ID NO: 21), TraesCS4A02G284000.1 (SEQ ID NO: 22), and TraesCS4D02G026700.2 (SEQ ID NO: 23) of Ensenbl Plants. ).
  • the mutation in genetic factor C is a fra gene mutation that results in a deficiency in the activity or expression of the fra polypeptide.
  • Such mutations include, for example, one or more selected from the group consisting of mutations that result in the appearance of a stop codon in the middle of the CDS of the fra gene, a deletion of the start codon (ATG), and a partial or total deletion of the CDS. Mutations include. Further, in the case of a gramineous plant having a plurality of fra genes such as tetraploid and hexaploid, it is sufficient that any of the fra genes has a mutation that causes a defect in activity or expression, but it may be present in the genome. It is preferred that all fra genes have mutations that result in loss of activity or expression.
  • the fra gene mutation that causes a decrease or deletion of the activity or expression of the fla polypeptide corresponds to, for example, one or more residues of the fla polypeptide of SEQ ID NO: 6 at positions 1 to 217. It may be a mutation in which the codon to be used becomes a stop codon. In a more specific embodiment, the mutation can be a mutation in which the codon corresponding to the 217th glutamic acid residue of the fra polypeptide of SEQ ID NO: 6 is the stop codon.
  • the fra gene mutation that causes a decrease or deletion of the activity or expression of the fla polypeptide is, for example, 1-167th of SEQ ID NO: 21, 1-120th of SEQ ID NO: 22, and SEQ ID NO: 23. It is a mutation in which the codon corresponding to at least one residue selected from the group consisting of the 1st to 219th positions is a stop codon. In a more specific embodiment, the mutation is at least one residue at positions 1-167 of SEQ ID NO: 21, at least one residue at positions 1-120 of SEQ ID NO: 22, and at least positions 1-219 of SEQ ID NO: 23. It is a mutation in which the codon corresponding to one residue is a stop codon.
  • the exogenous polynucleotide of genetic factors A to C comprises any of the following characteristics selected from (i) to (iii) below.
  • a polynucleotide comprising a sense strand consisting of the base sequence of a target gene (ISA1, sbeIIa or fra) or a part thereof, and an antisense strand capable of forming a double strand with the sense strand or a part thereof.
  • a sense strand or a part thereof consisting of a base sequence in which 1, 2, 3, 4 or 5 bases are deleted, substituted or inserted, and the sense strand or a part thereof.
  • a polynucleotide comprising a sense strand or a part thereof consisting of the base sequence of the above, and an antisense strand capable of forming a double chain with the sense strand or a part thereof.
  • the above-mentioned foreign polynucleotide may be contained in a vector.
  • the vector can optionally include, for example, a promoter sequence, an enhancer sequence, a terminator sequence, a poly A addition signal, a selectable marker gene, a reporter gene, a virus origin of replication, and the like.
  • exogenous polynucleotide may be inserted into the genome after being introduced into a plant and contained in the genome of the gramineous plant of the present invention.
  • the activity or expression of the ISA1 polypeptide of the Gramineae plant of the present invention is, for example, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, and 5) with respect to the wild-type plant. % Or less, 2% or less, 0.5% or less, or 0.2% or less.
  • the reduction in activity or expression of the sbeIIa polypeptide of the Gramineae plant of the present invention is, for example, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less with respect to the wild-type plant. 5% or less, 2% or less, 0.5% or less or 0.2% or less.
  • the reduction in activity or expression of the fla polypeptide of the Gramineae plant of the present invention is, for example, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less with respect to the wild-type plant. 5% or less, 2% or less, 0.5% or less or 0.2% or less.
  • the decrease in the expression of the polypeptides of the genetic factors A to C can be confirmed by comparing the amounts of the polypeptides in each of the wild-type plant and the plant of the present invention.
  • Examples of the quantification of the polypeptide include a Western blotting method using an antibody against the polypeptide, an ELISA method, an immunochromatography method, a protein chip method and the like.
  • the conjugation type in the rice plant of the present invention it is preferable that at least one of the loci containing the mutation among the ISA1, sbeIIa and fr loci is homozygous, and all the loci including the mutation are homozygous. Is more preferable.
  • the gramineous plant of the present invention may further comprise (d) a Transformation amenability loci.
  • the TFA locus is a locus contained in, for example, barley, an individual having a high probability of successful transformation by the Agrobacterium method (high sensitivity to transformation by the Agrobacterium method). In barley, there are three TFA loci, TFA1 to TFA3, and TFA2 and TFA3 are present on chromosome 2H, and TFA1 is present on chromosome 3H.
  • Gramineae plants containing the TFA locus are preferable in that breeding by various transformations by the Agrobacterium method is easy, and gene manipulation by genome editing such as CRISPR / Cas9 is easy.
  • TFA1 to 3 When the gramineous plant is barley, it is preferable to contain at least one of TFA1 to 3, and it is more preferable to contain all of TFA1 to 3. Whether or not TFA1 to 3 are contained can be determined, for example, by detecting a marker capable of distinguishing each locus according to the method described in International Publication WO2017 / 222051.
  • the gramineous plant of the present invention may optionally contain any one or more selected from the following (e) to (g).
  • the other one or more carbohydrate metabolism genes are not particularly limited, but for example, fructan synthase such as sucrose: fructan 6-fructosyltransferase (6-SFT), fructan degrading enzyme such as fructan 6-exohydrolase, and the like.
  • fructan synthase such as sucrose: fructan 6-fructosyltransferase (6-SFT)
  • fructan degrading enzyme such as fructan 6-exohydrolase
  • Examples include genes involved in fructan synthesis or accumulation.
  • Specific embodiments of (e) include, for example, mutations that enhance the expression or function of fructan synthase, or mutations that cause a decrease or deficiency in the expression or function of fructan-degrading enzyme.
  • Specific embodiments of (f) include, for example, exogenous polynucleotides containing wild-type or mutant fructan synthase genes.
  • Specific embodiments of (g) include, for example, foreign polynucleotides that cause
  • the present invention includes grains or processed products thereof obtained from gramineous plants containing any two or more of the above genetic factors A to C.
  • the grains may be, for example, whole grains, or whole grains that have been coarsely ground, groated, blanched, rolled, milled, crushed, refined, refined, or the like.
  • Processed grains include, for example, starch, starch granules, or foods or feeds containing grains.
  • the order of introduction of genetic factors A to C is not particularly limited. Usually, a parent plant containing any of the genetic factors A to C is prepared first. Then, by mating the parent plant with a parent plant containing another genetic factor or artificially introducing another genetic factor, a gramineous plant containing a plurality of genetic factors can be obtained. can. In addition, two or more mutations such as genetic factors A and B and A and C may be artificially introduced into one plant at the same time.
  • the mutations of the above-mentioned genetic factors A to C may be, for example, natural mutations or mutations artificially introduced by a gene recombination technique or the like.
  • the method for producing an individual containing at least one of the mutations of the genetic factors A to C by artificial mutation introduction is not particularly limited. For example, (i) preparation and selection of mutants by various mutagenesis treatments, (ii) gene disruption and selection by transposon, T-DNA tagging, etc., (iii) CRISPR-Cas9 method, TALEN method, ZFN method, etc.
  • the introduction of the desired mutation by genome editing using an artificial restriction enzyme can be appropriately used.
  • at least one mutation of the mutations in the genetic factors A to C of the grasses of the present invention is artificially introduced.
  • Mutagen treatment is performed, for example, by treating with various mutagenic chemical substances (alkylating agent, nucleic acid base analog, sodium azide, etc.) and various radiations (electromagnetic waves, ultraviolet rays, X-rays, ⁇ -rays, particle beams, etc.). , Neutron rays, ⁇ rays, ⁇ rays, electrons, ion beams, etc.) can be applied to plants.
  • sodium azide can be used for mutagen treatment.
  • a mutagen treatment a method of treating the seeds of grasses at 20 to 30 ° C. for 1 to 5 hours in an acidic solution containing 1 mM sodium azide and planting them in a field can be mentioned. More specific conditions for the sodium azide treatment include, for example, the conditions of the following examples.
  • Various methods such as an Agrobacterium method, a PEG-calcium phosphate method, an electroporation method, a liposome method, a particle gun method, and a microinjection method can be used to introduce an exogenous polynucleotide, depending on the type and composition of the polynucleotide.
  • the transformation method of can be appropriately selected and used.
  • foreign polynucleotides can be introduced into, for example, plant cells (including protoplasts), callus, plant tissues, or individual plants.
  • the above-mentioned method for producing a rice plant further includes (d) a TFA locus, (e) a mutation in one or more sugar metabolism genes or a mutation in the promoter region of the gene, and (f) another one or more. Selected from the group consisting of an exogenous polynucleotide containing a wild-type or mutant sugar-metabolizing gene, and (g) an exogenous polynucleotide that reduces or deletes the expression or function of another one or more sugar-metabolizing genes. It may include a step of introducing more than a seed. The introduction of these factors (e) to (g) can be carried out, for example, by the same method as the introduction of the above-mentioned genetic factors A to C.
  • the selection of the target plant is, for example, screened by the trait that the abundance of a specific sugar is increased or decreased with respect to the wild-type plant, or This is done by detecting mutations or exogenous polynucleotides of any two or more of the genetic factors A to C.
  • specific sugar in seed or grain is, for example, glucan [starch (amylopectin, amylose, etc.), phytoglycogen, ⁇ -glucan, etc.], fructan (inulin, etc.), arabinoxylan, gluco.
  • Polysaccharides such as mannan and pectin; oligosaccharides such as raffinose and stachiose; disaccharides such as sucrose, maltose and trehalose; monosaccharides such as glucose, fructose and galactose can be mentioned.
  • the wild-type plant for which the abundance of the above-mentioned sugars is to be compared is a wild-type plant of the same species as the target grass family plant, preferably a wild-type plant of the same species and strain.
  • screening by the above traits is performed, for example, by quantifying a specific sugar in a seed obtained from a plant, and the content of the specific sugar is, for example, 50% or more with respect to a wild-type plant. It is performed by selecting plants that have decreased by 60% or more, 70% or more, 80% or more or 90% or more, or 100% or more, 150% or more, 200% or more, 250% or more or 300% or more. .. Further, in a specific embodiment, the starch content can be used for screening as the content of the specific sugar. Such screening is particularly preferred for the selection of gramineous plants that contain genetic factors A and C but do not contain genetic factor B.
  • the method for detecting a mutation or exogenous polynucleotide of genetic factors A to C is, for example, a method for identifying the presence or absence or sequence of a polynucleotide at a mutation site or an alien polynucleotide, and translation from a gene related to genetic factors A to C. Examples thereof include a method for measuring the amount or activity of the obtained polypeptide.
  • a method for specifying the presence / absence or sequence of a polynucleotide detection of an amplified fragment by a sequence-specific PCR method (including qPCR method, CAPS method, dCAPS method, etc.), and high using single-stranded DNA as a probe.
  • a sequence-specific PCR method including qPCR method, CAPS method, dCAPS method, etc.
  • Hybridization methods including DNA chips and the like
  • DNA or RNA sequencing DNA or RNA sequencing
  • restriction enzyme mapping RFLP and the like
  • the method for producing a gramineous plant of the present invention includes selecting a target plant by detecting an amplified fragment by a PCR method.
  • a primer set capable of specifically detecting the presence of a mutation in any of the genetic factors A to C possessed by the gramineous plant of the present invention is designed, and the primer set is used to detect the gramineous plant. This is done by PCR of DNA samples obtained from plants to confirm the presence or absence of amplified fragments or the chain length.
  • the dCAPS (derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) method may be used to specifically detect the presence of mutations in any of the genetic factors A to C (eg, Michaels SD, Amasino RM, 1998, Plant Journal, See Vol.14, pp.381-385, Neff MM et al., 1998, Plant Journal, Vol.14, pp.387-392).
  • the dCAPS method was designed, for example, to include a sequence containing a mutation or a corresponding wild-type sequence, and to generate a restriction enzyme recognition site only in a PCR-amplified fragment of either the mutant sequence or the wild-type sequence after PCR amplification.
  • a plant DNA sample is PCR using a primer pair consisting of an oligonucleotide primer and an oligonucleotide primer designed to sandwich the mutation with respect to the primer. From the presence or absence of cleavage when the obtained amplified fragment is treated with a restriction enzyme (for example, change in the chain length of the amplified fragment), it is possible to determine whether the sequence hybridized with the primer is a mutant sequence or a wild-type sequence.
  • a restriction enzyme for example, change in the chain length of the amplified fragment
  • the selection of gramineous plants containing the mutation of 3387G ⁇ A of SEQ ID NO: 1 as the genetic factor A is, for example, A first oligonucleotide primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 8 at the 3'end, It comprises performing PCR with a primer pair consisting of a second oligonucleotide primer containing a portion of the base sequence consisting of bases 1-3386 of SEQ ID NO: 1, preferably bases 3186-3386 of SEQ ID NO: 1.
  • the selection further comprises digesting the PCR amplified fragment with HinfI.
  • the mutation of 9636G ⁇ A of SEQ ID NO: 2 (in the present specification, the mutation of 9636G ⁇ A is from the 5'side when “NN” representing an undetermined site is excluded in SEQ ID NO: 2.
  • the selection of gramineous plants containing is, for example, A third oligonucleotide primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 at the 3'end, It comprises performing PCR with a primer pair consisting of a fourth oligonucleotide primer containing a portion of the complementary sequence of the base sequence consisting of bases 9639 to 11169 of SEQ ID NO: 2, preferably bases 9639 to 9839 of SEQ ID NO: 2.
  • the selection further comprises digesting the PCR amplified fragment with NcoI.
  • the above-mentioned second oligonucleotide primer is, for example, a primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the above-mentioned fourth oligonucleotide primer is, for example, a primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 10.
  • a primer capable of specifically amplifying the base sequence containing the mutation or the base sequence constituting the mutation a primer capable of specifically amplifying the base sequence containing the mutation or the base sequence constituting the mutation.
  • a primer set consisting of a pair of combinations may be used.
  • the primer set is, for example, A fifth oligonucleotide primer that forms a PCR-amplifying duplex with the sequence containing the mutation, but does not form a PCR-amplifying duplex with the corresponding wild-type sequence, and the primer and the mutation.
  • a first primer pair including a designed sixth oligonucleotide primer, and A seventh oligonucleotide primer that forms a PCR-amplifiable duplex with the corresponding wild-type sequence but does not form a PCR-amplifiable duplex with the sequence containing the mutation, and sandwiches the oligonucleotide primer with the mutation.
  • a second primer pair which comprises an eighth oligonucleotide primer designed as described above. If an amplified fragment is obtained only with the first primer pair, the mutation is determined to be homozygous. Further, when an amplified fragment is obtained with the first primer pair and the second primer pair, the mutation is determined to be heterozygous.
  • the 6th oligonucleotide primer and the 8th oligonucleotide primer may be the same or may contain different sequences from each other.
  • the selection of gramineous plants containing the mutations of SEQ ID NO: 3 827G ⁇ T and 828G ⁇ T as genetic factor C is, for example,
  • the fifth oligonucleotide primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 at the 3'end and PCR is performed with a primer pair consisting of the sixth oligonucleotide primer containing a part of the complementary sequence of the base sequence consisting of the bases 829 to 5687 of SEQ ID NO: 3, preferably the bases 829 to 1029 of SEQ ID NO: 3;
  • the sixth oligonucleotide primer and the eighth oligonucleotide primer are, for example, oligonucleotide primers containing the base sequence of SEQ ID NO: 12 (SEQ ID NO: 14).
  • the annealing temperature of PCR containing at least one of the first to eighth oligonucleotide primers is, for example, 45 to 70 ° C, preferably 50 ° C to 60 ° C.
  • One of the embodiments of the method for producing a gramineous plant of the present invention includes a method for producing a progeny plant of a gramineous plant of the present invention.
  • the method for producing a progeny plant of a gramineous plant of the present invention includes the following (i) and (ii).
  • (I) Genetic factors A gramineous plant containing two or more of the genetic factors A to C is used as at least one parent plant by self-fertilization, mating with a second plant, or an alien polynucleotide.
  • progeny plants by transforming with; (Ii) (1) From the progeny plants, a plant in which the abundance of a specific polysaccharide in the obtained seed or grain is increased or decreased with respect to a wild-type plant is selected, or ( 2) Select plants in which mutations of any two or more of the genetic factors A to C or foreign polynucleotides are detected.
  • more specific embodiments of the above-mentioned method for producing a progeny plant of a gramineous plant include the following (i) and (ii).
  • the second plant is not particularly limited as long as it is a plant that can be mated with the above-mentioned parent plant.
  • the second plant may also contain one or more of the genetic factors A to C, or may not contain any of the genetic factors A to C.
  • the starch content in the obtained seeds or grains is, for example, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% with respect to the wild-type plant. Less than or equal to or less than 10%.
  • the wild-type plant is a wild-type plant of the same species as the gramineous plant, and is preferably a gramineous plant of the same species and strain as the gramineous plant.
  • the method for producing a gramineous plant of the present invention includes the following (i) and (ii). (I) Mating any two plants selected from the following (A) to (C) as parent plants; (A) Plants containing double-grained starch grains in seeds; (B) Plants containing elongated starch granules in seeds; (C) Plants containing starch granules in the form of aggregated fine starch particles in seeds and giant starch granules: and (Ii) From the plants obtained by mating, select plants in which the abundance of specific sugars in seeds or grains is increased or decreased with respect to wild-type plants.
  • the "double-grained starch granule" contained in the seed of the plant (A) represents a starch granule characterized by an aggregated form of a plurality of small starch granules.
  • the starch granules contained in wild-type rice seeds are compound-grained starch granules.
  • the average major axis of the small starch particles contained in the seeds of the plant (A) is, for example, 3 to 15 ⁇ m or 5 to 10 ⁇ m, and is, for example, 50% with respect to the average major axis of the starch particles which are aggregates of the starch particles. , 40%, 30%, 20% or 10%.
  • the number of double-grained starch granules in the seeds of the plant (A) is, for example, 1% or more, 2% or more, 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% of the total number of starch grains in the seeds.
  • the "elongated starch granules" contained in the seeds of the plant (B) represent starch granules having a major axis of 400% or more, preferably 500% or more with respect to the minor axis.
  • the average major axis of the elongated starch granules contained in the seeds of the plant (B) is, for example, 10 to 50 ⁇ m or 20 to 40 ⁇ m.
  • the number of elongated starch grains in the seeds of the plant (B) is, for example, 1% or more, 2% or more, 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more of the total number of starch grains in the seeds.
  • the "starch granules in the form of aggregated fine starch particles" contained in the seeds of the plant (C) are aggregated fine starch particles having a major axis smaller than that of the starch particles constituting the double-grained starch granules. It is a starch grain characterized by the above-mentioned morphology.
  • the major axis of the fine starch particles is, for example, 0.5% or more and less than 10% of the average major axis of the starch granules of wild-type plants.
  • the "giant starch granules" contained in the seeds of the plant (C) represent starch granules having a major axis of 150% or more of the average major axis of the starch granules of a wild-type plant.
  • the surface of the huge starch granules is characterized by the appearance of kudzu and wrinkles and not being smooth.
  • the average major axis of the fine starch particles contained in the seeds of the plant (C) is, for example, 0.2 to 3 ⁇ m or 0.5 to 2 ⁇ m.
  • the number of starch particles in the form of aggregated fine starch particles in the seeds of the plant (C) is, for example, 1% or more, 2% or more, 5% or more, 10% or more of the total number of starch particles in the seeds. 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more or 90% or more, and for example, 90% or less of the total number of starch grains in seeds, It may be 80% or less, 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less or 10% or less.
  • the number of huge starch grains in the seeds of the plant (C) is, for example, 1% or more, 2% or more, 5% or more, 10% or more, 20% or more, and 30% or more of the total number of starch grains in the seeds. , 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more or 90% or more, and for example, 90% or less, 80% or less, 70% or less of the total number of starch grains in seeds. , 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less or 10% or less.
  • the ratio of the major axis, the minor axis and the number of starch granules in the seeds described above is obtained by obtaining an image of the starch granules in the seed using an optical microscope, and the major axis, minor axis and number of each starch granule are obtained. Obtained by measuring.
  • the selection of (ii) is to select a plant whose starch content in the resulting seed or grain is reduced relative to a wild-type plant.
  • the starch content in the obtained seeds or grains is, for example, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% with respect to the wild-type plant. Less than or equal to or less than 10%.
  • the wild-type plant is a wild-type plant of the same species as the gramineous plant, and is preferably a gramineous plant of the same species and strain as the gramineous plant.
  • the present invention includes a primer set containing any one or more selected from the following (I) to (III).
  • a primer pair consisting of a first oligonucleotide primer and a second oligonucleotide primer;
  • a combination of primer pairs consisting of nucleotide primers. Specific embodiments and methods of use of the primer set can be understood from the description in the above section ⁇ Detection of mutations of any two or more of genetic factors A to C or foreign polynucleotides>.
  • the primer set of the present invention comprises (A) a mutation of SEQ ID NO: 1 as 3387G ⁇ A as a genetic factor A, and (B) a mutation of SEQ ID NO: 2 as 9636G ⁇ A as a genetic factor B among the gramineous plants of the present invention. Mutations, (C) Suitable for selecting plants containing at least one of the mutations 827G ⁇ T and 828G ⁇ T of SEQ ID NO: 3 as genetic factor C.
  • the primer set of the present invention is a primer set containing any two or more selected from the above (I) to (III), or all of (I) to (III).
  • the primer set is suitable for selecting a plant containing any two or more of (A) to (C).
  • the present invention also includes a primer kit including the above primer set.
  • the primer kit may include one or more containers containing one kind alone or a combination of a plurality of oligonucleotide primers constituting the above-mentioned primer set.
  • the above primer kit may further contain reagents for PCR (DNA polymerase, buffer, purified water, etc.), size markers, restriction enzymes, and the like.
  • the present invention further comprises a gramineous plant further comprising a genetic factor B, i.e., (b) a mutation in the sbeIIa gene or a mutation in the promoter region of the gene, which results in a decrease or deletion of the activity or expression of the sbeIIa polypeptide.
  • a genetic factor B i.e., (b) a mutation in the sbeIIa gene or a mutation in the promoter region of the gene, which results in a decrease or deletion of the activity or expression of the sbeIIa polypeptide.
  • the method for producing a gramineous plant can be understood based on the method described in the above [Method for producing a gramineous plant containing two or more genetic factors among genetic factors A to C]. ..
  • mutants having similar gene mutations and traits have been obtained from about 4000 strains, those skilled in the art can prepare a mutant library similar to this test example and perform screening. It can be understood that mutants having reduced function or expression or deletion in each gene of ISA1, sbeIIa, and fla can be obtained.
  • FIGS. 2A and 2B For the A, B and C mutants derived from the above Haruna Nijo, the results of seed shape observation and analysis of the distribution of amylopectin chain length in seeds by capillary electrophoresis are shown in FIGS. 2A and 2B.
  • the major axis of the seed was the same as that of the wild type, but the seed was slightly thinner and the seed volume was reduced.
  • the A mutant amylopectin had an increase in short chains having a degree of polymerization (DP) of 8 or less and a decrease in long chains having a degree of polymerization (DP) of 9 or more.
  • the B mutant which showed the accumulation of elongated starch granules, had a reduced seed size compared to the wild type.
  • the chain length distribution of amylopectin was smaller in the wild type than in the A mutant, the chains of DP9 to 14 decreased and the chain length of DP15 or more increased.
  • the C mutant which showed the accumulation of starch granules in the form of aggregated small particles and starch granules having huge starch granules, did not have a large difference in seed size and chain length distribution of amylopectin as compared with the wild type.
  • the A to C mutants in Table 2 are stored at the Institute of Resources and Plant Sciences, Okayama University, and will be sold to a third party as necessary.
  • mutant allele discrimination primer Oligonucleotide primers for discriminating the presence or absence of each mutant allele (referred to as mutant alleles A to C) and wild-type allele possessed by the A to C mutants in Table 2 were designed.
  • Table 3 shows the characteristics of the designed oligonucleotide primers, amplification conditions, and amplified fragments of the mutant allele.
  • the amplified fragments of the mutant alleles A and B can be distinguished from the amplified fragments of the wild-type allele by the length of the fragments after digestion with HinfI and NcoI for 5 hours, respectively.
  • the amplified fragment of the mutant allele C can be distinguished from the amplified fragment of the wild-type allele by being amplified by the pair of CPrimerSet2-F and CPrimerSet2-R but not by CPrimerSet1-F and CPrimerSet1-R.
  • Mutants A to C are artificially crossed and selected by the PCR method using the above primer set, and two or three of the three types of mutant alleles A to C are performed. Mutants having one (AB double mutant, AC double mutant, BC double mutant, ABC triple mutant) were prepared.
  • the AB double variant means a mutant having a mutant allele A and a mutant allele B.
  • Homozygotes were selected from the offspring obtained by self-fertilization by the PCR method using the above primer set. The homozygous mutants obtained were used in subsequent test examples.
  • FIG. 4-2 shows that the amount of starch accumulated in the seeds of the AC double mutant is reduced. This result indicates that starch synthesis is inhibited in the AC double mutant in ripened seeds and ripe seeds. Furthermore, the AC double mutant significantly increased the accumulation of glucose, sucrose, and maltose in the ripened seeds as compared with the wild type.
  • FIG. 4-3 shows a comparison of the amount of maltose accumulated in the ripened seeds. Furthermore, as shown in FIG. 4-4, the AC double mutant has a remarkable accumulation of fructose, glucose, sucrose, and maltose in the ripe seeds as compared with the wild type, A mutant, and C mutant. Was increasing.
  • the AB double mutant, BC double mutant, AC double mutant and ABC triple mutant obtained in Test Example 2 were cultivated, and ripe seeds were collected. After preparing technobit sections of ripe seeds, they were stained with Lugol's solution (potassium iodide / iodine solution; manufactured by MP Biomedicals) and observed under an optical microscope (method: Matsushima, R. Bio-protocol, 2014, 4: e1239). checking). The results of comparing the starch granules in the seeds of the AB double mutant, the BC double mutant, the AC double mutant and the ABC triple mutant with the starch granules of the wild-type seed are shown in FIG.

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Abstract

本発明は、種子中の澱粉、糖質（多糖類、オリゴ糖、単糖など）、食物繊維などの含有量が野生型植物と比べて増加又は減少している、新規なイネ科植物を提供する。　本発明は、下記のイネ科植物の作製方法、作製されたイネ科植物又はその部分を含む：　下記（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも２つを含むイネ科植物を作製すること；　（ａ）イソアミラーゼ１ポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、イソアミラーゼ１遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ、　（ｂ）ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｓｂｅＩＩａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ、　（ｃ）ｆｒａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｆｒａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ。

Description

イネ科植物及びその作製方法
　本発明は、種々の糖質の生産に適したイネ科植物、及びその作製方法に関する。
　オオムギ（Hordeum vulgare）やコムギ（Triticum aestivum）等のイネ科植物は、世界中で栽培され、食用、醸造用及び家畜の飼料用として利用される。そのため、イネ科植物の穀粒の収量改善や機能性の改善を目的として研究開発が行われ、穀粒の糖質存在量に影響を及ぼす種々の形質が知られている。例えば、高いアミロース含有量を示すオオムギとして、外来性のポリヌクレオチドを導入して、枝切り酵素であるｓｂｅＩＩａ活性のレベルを減少させたオオムギ（特許文献１）が報告されている。
特開２００９－２０１５１６号公報
　本発明者らは、上記のように食品及び飼料としてニーズの高いイネ科植物をターゲットとした。そして、種子中の種々の糖質（多糖類、オリゴ糖、単糖など）、食物繊維などの含有量が野生型植物と比べて増加又は減少している、新規なイネ科植物を提供することを本発明の第１の課題とした。
　また、本発明者らは、イネ科植物の穀粒中に機能性の生体物質を蓄積させるためには、当該生体物質が存在できる穀粒中の空間と、当該生体物質の材料となる糖及びその代謝物の確保が重要であると考えた。そこで、穀粒中の大部分を占める澱粉含有量（以下、「澱粉含有量」を単に「澱粉量」と略記する場合がある）をあえて減少させることを課題とした。即ち、野生型植物と比べて種子中の澱粉量が減少している新規なイネ科植物を作製することを本発明の第２の課題とした。
　本発明者らは、下記３種類の遺伝的因子Ａ～Ｃのうち、いずれか２以上を含むイネ科植物が、種々の糖質の含有量が野生型植物と比べて増加又は減少していることを見出した。
　（遺伝的因子Ａ）イソアミラーゼ１ポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、イソアミラーゼ１遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ。
　（遺伝的因子Ｂ）ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｓｂｅＩＩａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ。
　（遺伝的因子Ｃ）ｆｒａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｆｒａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ。
　また、本発明者らは、その一実施形態として、上記の遺伝的因子Ａ～Ｃのうち、遺伝的因子Ａ及び遺伝的因子Ｃを含み、遺伝的因子Ｂを含まないイネ科植物では、その種子中の澱粉量が、野生型植物に比べて顕著に減少していることを見出した。
　さらに、本発明者らは、（Ａ）種子中に複粒型の澱粉粒を含む植物、（Ｂ）種子中に細長い澱粉粒を含む植物、及び（Ｃ）種子中に微小な澱粉粒子が集合した形態の澱粉粒と巨大な澱粉粒を含む植物から選ばれるいずれか２つの植物を親植物として交配することによって得られるイネ科植物から、種子中の種々の糖質の含有量が野生型植物と比べて増加又は減少した植物を容易に得られることを見出した。
　本発明者らは、上記の知見をもとに、本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、下記のイネ科植物又はその部分、及び当該イネ科植物から得られる穀粒又はその加工品を提供する。
　［１］
　下記（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも２つを含む、イネ科植物又はその部分：
　（ａ）イソアミラーゼ１ポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、イソアミラーゼ１遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ；
　（ｂ）ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｓｂｅＩＩａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ；
　（ｃ）ｆｒａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｆｒａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ。
　［２］
　下記（ａ）及び（ｃ）を含み、かつ（ｂ）を含まない、イネ科植物又はその部分：
　（ａ）イソアミラーゼ１ポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、イソアミラーゼ１遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ；
　（ｂ）ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｓｂｅＩＩａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ；
　（ｃ）ｆｒａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｆｒａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ。
　［３］
　前記変異を含む遺伝子座の少なくとも１つがホモ接合型である、［１］又は［２］に記載のイネ科植物又はその部分。
　［４］
　さらに（ｄ）ＴＦＡ遺伝子座を含む、［１］～［３］のいずれか１に記載のイネ科植物又はその部分。
　［５］
　さらに下記（ｅ）～（ｇ）から選ばれる少なくとも１つを含む、［１］～［４］のいずれか１に記載のイネ科植物又はその部分：
　（ｅ）少なくとも１つの別の糖質代謝遺伝子の変異又は該遺伝子のプロモーター領域の変異；
　（ｆ）少なくとも１つの別の野生型又は変異型の糖質代謝遺伝子を含む外来性ポリヌクレオチド；
　（ｇ）少なくとも１つの別の糖質代謝遺伝子の発現又は機能を低下又は欠損を生じる外来性ポリヌクレオチド。
　［６］
　得られる種子又は穀粒の澱粉含有量が、野生型植物の種子又は穀粒に対して５０％以下である、［１］～［５］のいずれか１に記載のイネ科植物又はその部分。
　［７］
　［１］～［６］のいずれか１に記載のイネ科植物から得られる、穀粒又はその加工品。
　また、本発明は下記のイネ科植物の作製方法を提供する。
　［８］
　（ｉ）［１］～［６］のいずれか１に記載のイネ科植物を少なくとも１つの親植物として、自家受精によって、第２の植物との交配によって、又は、外来性ポリヌクレオチドで形質転換することによって、子孫植物を得ること；及び、
　（ｉｉ）（１）前記子孫植物の中から、種子若しくは穀粒中の特定の糖質の存在量が野生型植物に対して増加若しくは減少している植物を選抜すること、又は、
　　（２）前記（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも２つの変異若しくは外来性ポリヌクレオチドが検出される植物を選抜すること；
　を含む、イネ科植物の作製方法。
　さらに、本発明は下記のプライマーセットを提供する。
　［９］
　下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）から選ばれる少なくとも１つを含む、プライマーセットであって、
　（Ｉ）配列番号８の塩基配列を３′末端に含む第１オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１の１～３３８６番塩基からなる塩基配列の一部を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対；
　（ＩＩ）配列番号９の塩基配列を３′末端に含む第３オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２の９６３９～１１１６９番塩基からなる塩基配列の相補配列の一部を含む第４オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対；
　（ＩＩＩ）
　配列番号１１の塩基配列を３′末端に含む第５オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３の８２９～５６８７番塩基からなる塩基配列の相補配列の一部を含む第６オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対、及び
　配列番号１３の塩基配列を３′末端に含む第７オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３の８２９～５６８７番塩基からなる塩基配列の相補配列の一部を含む第８オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対の組み合わせ；
　ここで、前記第６オリゴヌクレオチドプライマーと第８オリゴヌクレオチドプライマーは同一又は異なるオリゴヌクレオチドプライマーである、プライマーセット。
　さらに、本発明は、下記のイネ科植物又はその部分を提供する。
　［１０］
　（ｂ）ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｓｂｅＩＩａ遺伝子の変異若しくは該遺伝子プロモーター領域の変異又はそれらの組み合わせを含む、イネ科植物又はその部分。
　さらに、本発明は、下記のイネ科植物の作製方法を提供する。
　［１１］
　イネ科植物の作製方法であって：
　（ｉ）下記（Ａ）～（Ｃ）から選ばれるのいずれか２つの植物を親植物として交配すること；
　　（Ａ）種子中に複粒型の澱粉粒を含む植物；
　　（Ｂ）種子中に細長い澱粉粒を含む植物；
　　（Ｃ）種子中に微小な澱粉粒子が集合した形態の澱粉粒と巨大な澱粉粒を含む植物：及び、
　（ｉｉ）前記交配により得られた植物から、種子又は穀粒中の特定の糖質の存在量が野生型植物に対して増加又は減少している植物を選抜すること：
　を含む、イネ科植物の作製方法。
　さらに、本発明は以下の態様を含む。
　［１２］
　前記イネ科植物がオオムギである、［１］～［６］のいずれか１に記載のイネ科植物又はその部分。
　［１３］
　前記（ａ）のイソアミラーゼ１遺伝子の変異は、配列番号４のイソアミラーゼ１ポリペプチドの１～４９０番から選ばれる少なくとも１つの残基に対応するコドンが終止コドンとなる変異であり、好ましくは配列番号４の４９０番目のトリプトファン残基に対応するコドンが終止コドンとなる変異である、［１２］に記載のイネ科植物又はその部分。
　［１４］
　前記（ｂ）のｓｂｅＩＩａ遺伝子の変異は、配列番号５のｓｂｅＩＩａポリペプチドの５６４番目のグリシンに対応するコドンが、アルギニンコドンとなる変異である、［１２］又は［１３］に記載のイネ科植物又はその部分。
　［１５］
　前記（ｃ）のｆｒａ遺伝子の変異は、配列番号６のｆｒａポリペプチドの１～２１７番目の少なくとも１つの残基に対応するコドンが終止コドンとなる変異であり、好ましくは、配列番号６のｆｒａポリペプチドの２１７番目のグルタミン酸残基に対応するコドンが終止コドンとなる変異である、［１２］～［１４］のいずれか１に記載のイネ科植物又はその部分。
　［１６］
　前記（ａ）～（ｃ）の少なくとも１つの遺伝子若しくはプロモーターの変異が人為的に導入された変異である、又は前記（ａ）～（ｃ）の遺伝子若しくはプロモーターの変異が人為的に導入された変異である、［１］～［６］及び［１２］～［１５］のいずれか１に記載のイネ科植物又はその部分。
　［１７］
　（ｉ）［１］～［６］及び［１２］～［１６］のいずれか１に記載のイネ科植物を少なくとも１つの親植物として、自家受精によって、第２の植物との交配によって、又は、外来性ポリヌクレオチドで形質転換することによって、子孫植物を得ること；及び、
　（ｉｉ）（１）前記子孫植物の中から、種子若しくは穀粒中の特定の糖質の存在量が野生型植物に対して増加若しくは減少している植物を選抜すること、又は、
　　（２）前記（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも２つの変異若しくは外来性ポリヌクレオチドが検出される植物を選抜すること；
　を含む、イネ科植物の作製方法。
　遺伝的因子Ａ～Ｃから選ばれるいずれか２以上の遺伝的因子を組み合わせることによって、種子又は穀粒中の澱粉、糖質（多糖類、オリゴ糖、単糖など）、食物繊維などの含有量が野生型植物と比べて増加又は減少しているイネ科植物が得られる。
　殊に、遺伝的因子Ａ及びＣを含み、遺伝的因子Ｂを含まないことにより、種子又は穀粒中の澱粉量が減少したイネ科植物が得られる。
　（Ａ）種子中に複粒型の澱粉粒を含む植物、（Ｂ）種子中に細長い澱粉粒を含む植物、及び（Ｃ）種子中に微小な澱粉粒子が集合した形態の澱粉粒と巨大な澱粉粒を含む植物から選ばれるいずれか２つの植物を親植物として交配することにより、種子又は穀粒中の特定の糖質の存在量が野生型植物に対して増加又は減少した植物が得られる。
　したがって、本発明によれば、イネ科植物の種子又は穀粒中の澱粉、糖質（多糖類、オリゴ糖、単糖など）、食物繊維などの含有量が、野生型植物と比べ、高いものや低いものを容易に取得できる。
試験例１で得られたＡ～Ｃ変異体及び野生型（はるな二条）の種子中の澱粉粒の光学顕微鏡写真である。 図２Ａは、試験例１で得られたはるな二条由来のＩＳＡ１変異体（Ａ変異体）及びｓｂｅＩＩａ変異体（Ｂ変異体）及びｆｒａ変異体（Ｃ変異体）と野生型の種子の形態の写真である。図２Ｂの左側の図は、これらの種子のアミロペクチンの鎖長を測定した結果を示すグラフである。横軸は鎖の長さを示し、縦軸は頻度（％）を示している。図２Ｂの右側の図は、各鎖長における各変異体の頻度から野生型のはるな二条の頻度を引いた差分を示すグラフである。 試験例２で作製した変異アレル判別プライマーを用いて、野生型及びＡ～Ｃ変異アレルをヘテロ接合型又はホモ接合型で有する個体につきＰＣＲを用いて判別した結果を示す図である。図３Ａ及びＢは、Ａ変異アレル及びＢ変異アレルを有する個体を判別するためのプライマー対でＰＣＲしてから特定の制限酵素処理を行った後のＤＮＡ断片の電気泳動像である。図３Ｃは、Ｃ変異アレルを有する個体を判別するための２種類のプライマー対でＰＣＲして得られたＤＮＡ断片の電気泳動像である。 試験例３のＡＣ二重変異体と野生型オオムギの登熟種子切片のヨウ素溶液染色の光学顕微鏡像である。黒い粒状の部分が澱粉粒を表す。 試験例３において、野生型、変異体Ａ、変異体Ｃ及びＡＣ二重変異体の登熟種子及び完熟種子中の澱粉蓄積量を比較したグラフである。 試験例３において、野生型、変異体Ａ、変異体Ｃ及びＡＣ二重変異体の登熟種子中のマルトースの蓄積量を比較したグラフである。 試験例３において、野生型、変異体Ａ、変異体Ｃ及びＡＣ二重変異体の完熟種子中のフルクトース、グルコース、スクロース及びマルトースの蓄積量を比較したグラフである。 試験例３のＡＢ二重変異体、ＢＣ二重変異体、ＡＣ二重変異体、ＡＢＣ三重変異体の種子の澱粉粒の光学顕微鏡像である。 図６－１～４は連続した塩基配列であり、オオムギ（はるな二条）のＩＳＡ１遺伝子の開始コドンの５′末端を起点とする塩基配列（配列番号１）である。大文字部分はエキソン、小文字部分はイントロンを表す。枠で囲ったＧは、４９０番目のトリプトファン残基のコドンの３文字目の塩基に対応する。また、枠で囲ったＮＮは、未決定領域を表し、その実際の塩基長は２塩基に限定されない。 図７－１～４は連続した塩基配列であり、オオムギ（はるな二条）のｓｂｅＩＩａ遺伝子の開始コドンの５′末端を起点とする塩基配列（配列番号２）である。大文字部分はエキソン、小文字部分はイントロンを表す。枠で囲ったＧは、５６４番目のグリシン残基のコドンの１文字目の塩基に対応する。また、枠で囲ったＮＮは、未決定領域を表し、その実際の塩基長は２塩基に限定されない。 図８－１～２は連続した塩基配列であり、オオムギ（はるな二条）のｆｒａ遺伝子の開始コドンの５′末端を起点とする塩基配列（配列番号３）である。大文字部分はエキソン、小文字部分はイントロンを表す。枠で囲ったＧＧは、２１６番目のセリン残基のコドンの３文字目及び２１７番目のグルタミン酸残基のコドンの１文字目の塩基に対応する。 オオムギ（はるな二条）のＩＳＡ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）である。 オオムギ（はるな二条）のｓｂｅＩＩａポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）である。 オオムギ（はるな二条）のｆｒａポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号６）である。 ６倍体コムギのＩＳＡ１ポリペプチドの１つのアミノ酸配列（TraesCS7D02G249500.1；配列番号１５）である。 ６倍体コムギのＩＳＡ１ポリペプチドの１つのアミノ酸配列（TraesCS7A02G251400.1；配列番号１６）である。 ６倍体コムギのＩＳＡ１ポリペプチドの１つのアミノ酸配列（TraesCS7B02G139700.2；配列番号１７）である。 ６倍体コムギのｓｂｅＩＩａポリペプチドの１つのアミノ酸配列（TraesCS2A02G293400.1；配列番号１８）である。 ６倍体コムギのｓｂｅＩＩａポリペプチドの１つのアミノ酸配列（TraesCS2D02G290800.4；配列番号１９）である。 ６倍体コムギのｓｂｅＩＩａポリペプチドの１つのアミノ酸配列（TraesCS2B02G309500.3；配列番号２０）である。 ６倍体コムギのｆｒａポリペプチドの１つのアミノ酸配列（TraesCS4B02G029700.2；配列番号２１）である。 ６倍体コムギのｆｒａポリペプチドの１つのアミノ酸配列（TraesCS4A02G284000.1；配列番号２２）である。 ６倍体コムギのｆｒａポリペプチドの１つのアミノ酸配列（TraesCS4D02G026700.2；配列番号２３）である。
　本明細書中、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」又は「核酸分子」とも表され、ヌクレオチドの重合体を表す。また、「塩基配列」は、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」とも表され、特に記載がない限り、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）の配列又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ）の配列を表す。
　本明細書中、「ポリペプチド」は、「タンパク質」と同義である。
　本明細書中、「遺伝子」とは、エキソン及びイントロンから構成される、ゲノム中で転写される領域を表す。即ち、遺伝子は転写開始点（最初のエキソンの５′側最上流の塩基）から、最後のエキソンの３′側最下流の塩基までの領域を表す。
　本明細書中、「コーディング領域（ＣＤＳ）」とは、遺伝子においてポリペプチドに翻訳される領域であり、当該遺伝子の開始コドンの１塩基目から終止コドンの３塩基目までの領域を表す。ＣＤＳは１以上のイントロンで分断されて存在してもよい。
　本明細書中、「５′－非翻訳領域（ＵＴＲ）」は、コーディング領域の５′末端に接続する領域であり、ポリペプチドに翻訳されない領域を表す。
　本明細書中、「３′－非翻訳領域（ＵＴＲ）」は、コーディング領域の３′末端に接続する領域であり、ポリペプチドに翻訳されない領域を表す。
　対照となる塩基配列又はアミノ酸配列（「参照配列」と呼ぶ）に対する、特定の塩基配列又はアミノ酸配列の「同一性」及び「類似性」の百分率は、次の手順で得られる値である。
　（１）NCBIのBLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）のblastn（塩基配列の場合）又はblastp（アミノ酸配列の場合）において、Align two or more sequencesを用いて、当該特定の配列をQuery Sequenceに、また参照配列をSubject Sequenceに入力し、デフォルトのパラメータでアラインメントを行う。
　（２）得られた結果に表示される「Identities」の百分率を、特定の塩基配列又はアミノ酸配列の「同一性」の百分率とする。また、「Similarities」の百分率を、特定の塩基配列又はアミノ酸配列の「類似性」の百分率とする。
　本明細書中、「変異」とは、例えば、ＤＮＡにおける塩基の置換、欠失、挿入、重複（例えば、倍数化、新たなポリヌクレオチドの導入による遺伝子の数の増加等）、転座又は逆位を表す。特に記載がない場合、「変異」は、その生物と同種同系統の野生型生物の塩基配列に対する差異を表す。
　本明細書中、特定のポリペプチドの「発現」とは、植物の細胞において特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡが翻訳されて、ポリペプチドとして存在することを意味する。
　本明細書中、特定のポリペプチドの「活性の低下」とは、当該ポリペプチドの活性（例えば、酵素の場合は酵素活性）が、対照植物に比べて低下することを表す。また、特定のポリペプチドの「活性の欠損」は、細胞内の当該ポリペプチドが全く機能しない場合のほか、当該ポリペプチドの活性が検出不可能なレベルにまで低下し、実質的に活性が０である場合を含む。ここで、対照植物は、同種植物の野生型植物であり、好ましくは同種同系統の野生型植物である。
　本明細書中、特定のポリペプチドの「発現の低下」とは、当該ポリペプチドの細胞内の量が、対照植物に比べて減少することを表す。また、特定のポリペプチドの「発現の欠損」は、細胞内に当該ポリペプチドが全く存在しない場合のほか、当該ポリペプチドの発現が検出不可能なレベルにまで低下し、実質的に発現が０である場合を含む。ここで、対照植物は、同種植物の野生型植物であり、好ましくは同種同系統の野生型植物である。
　このような特定のポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損をもたらす、当該ポリペプチドをコードする遺伝子の変異としては、例えば、ＣＤＳ途中での終止コドンの出現、開始コドン（ＡＴＧ）の欠失、ＣＤＳの部分又は全部欠失、当該ポリペプチド活性に関与するアミノ酸残基が別の残基に置換される変異、スプライシング異常、当該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの転写又は翻訳量の低下、及び当該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はポリペプチドの分解量の増加からなる群より選ばれる１種単独又は２種以上の組み合わせを生じる変異が挙げられるが、それらに限定されない。
　本明細書中、特定のポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損をもたらす、特定の遺伝子のプロモーター領域の変異としては、例えば、当該プロモーター領域の部分又は全部欠失が挙げられる。当該プロモーター領域の部分としては、例えば、転写開始点の５′側２００塩基、１５０塩基又は１００塩基が挙げられる。
　本明細書中、特定のポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる外来性のポリヌクレオチドは、例えば、当該ポリペプチドをコードする遺伝子を標的遺伝子とし、当該標的遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖と二重鎖を形成して、遺伝子の転写又は翻訳を抑制することができ、かつ野生型生物が有しないポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、遺伝子サイレンシングキメラ遺伝子、アンチセンスＲＮＡ、コサプレッションＲＮＡ、ＲＮＡ干渉用のｄｓＲＮＡ分子、ヘアピンＲＮＡ分子又はマイクロＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及びその改変体の構成成分であるガイドＲＮＡなどが挙げられる。
　本明細書中、「植物の部分」は、植物組織（例えば、葉、茎、根、わき芽、花、生殖器官、胚及びそれらの一部など）、種子等が含まれる。
　本明細書中、交配する２つの親植物は、特に記載がない限り同種の植物である。
　［遺伝的因子Ａ～Ｃから選ばれるいずれか２以上を含む、イネ科植物又はその部分］
　本発明は、下記（ａ）～（ｃ）から選ばれるいずれか２以上を含む、イネ科植物又はその部分を含む。
　（ａ）イソアミラーゼ１ポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、イソアミラーゼ１遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ；
　（ｂ）ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｓｂｅＩＩａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ；及び
　（ｃ）ｆｒａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｆｒａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ。
　また、一実施形態では、本発明のイネ科植物又はその部分は、上記の（ａ）及び（ｃ）を含み、（ｂ）を含まない。
　本明細書中、上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を、それぞれ遺伝的因子Ａ、Ｂ及びＣと呼ぶ。
　（表現型及び用途）
　上記の遺伝的因子Ａ～Ｃのいずれか２つ以上を含むイネ科植物は、その対応する野生型のイネ科植物と比較して、種子又は穀粒中の種々の多糖類の含有量が増加又は減少しているという特徴を有する。そのため、当該イネ科植物から得られる穀粒は、新たな機能性が付与された食品又は飼料を製造するのに適している。
　ここで、上記の対応する野生型植物は、同種の野生型植物であり、好ましくは同種同系統の野生型植物である。
　また、上記の遺伝的因子Ａ及びＣを含み、Ｂを含まないイネ科植物は、その対応する野生型のイネ科植物と比較して、種子中の澱粉の蓄積量が顕著に減少するという特徴を有する。
　一実施形態において、当該イネ科植物は、その対応する野生型のイネ科植物と比較して、その種子中に、グルコース、スクロース、マルトース、及びオリゴ糖からなる群より選ばれる１種以上の糖類をより多く含有する。そのため、当該イネ科植物自体をこれらの糖類を調製するための原材料に用いることができる。また、当該イネ科植物は、これらの糖類を材料として、当該植物内で新たな機能性多糖類を生産させるのに適している。
　ここで、上記の対応する野生型のイネ科植物は、同種の野生型植物であり、好ましくは同種同系統の野生型植物である。
　一実施形態において、本発明のイネ科植物は、得られる種子又は穀粒の澱粉含有量が、野生型植物の種子又は穀粒に対して、例えば、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下又は１０％以下である。ここで、野生型植物とは、同種の野生型植物であり、好ましくは同種同系統のイネ科植物である。それぞれの植物の種子又は穀粒の澱粉含有量は、例えば、１粒毎の種子又は穀粒の澱粉含有量の平均値により決定される。本明細書中、澱粉含有量は、例えば、Megazyme社製のTotal Starch Assay Kit (AA/AMG)を用いて、当該製品のプロトコールに従って定量することができる。
　（イネ科植物）
　本発明の対象となるイネ科植物は、イネ科（Poaceae）に該当する植物であれば特に限定されない。例えば、イネ科植物としては、オオムギ、コムギ（マカロニコムギ等の４倍体コムギ、普通系コムギ等の６倍体コムギなど）、ライムギ、エンバク等のムギ類植物、イネ、トウモロコシ、アワ、モロコシ等が挙げられる。中でもイネ科植物としては、ムギ類植物が好ましく、オオムギ又はコムギがより好ましく、オオムギが更に好ましい。
　本明細書中、「オオムギ（オオムギ植物）」とは、イネ科の植物であり、学名Hordeum vulgareで表される植物種を表す。オオムギには、例えば、「はるな二条」などを含む二条オオムギ、「Ｍｏｒｅｘ」などを含む六条オオムギ、裸麦などの栽培オオムギ（H. vulgare subsp. vulgare）、並びに、野生オオムギ（H. vulgare subsp. spontaneum）が包含される。
　（遺伝的因子Ａ～Ｃ）
　本明細書中、「イソアミラーゼ１遺伝子（ＩＳＡ１）」は、植物のアミロペクチン生合成に関わる澱粉枝切り酵素（starch debranching enzyme）の１種をコードする遺伝子である。イネにおいてはＩＳＡ１遺伝子の欠損変異体はsugary-1変異体と呼ばれる。
　例えば、オオムギ（Hordeum vulgare subsp. vulgare）の野生型のＩＳＡ１のヌクレオチド配列及びＣＤＳは、NCBIが提供するGenbank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）において、アクセッション番号FN179385で登録されている。また、オオムギの１品種である「はるな二条」の野生型のＩＳＡ１の塩基配列は配列番号１に、そのコードするポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に示した。
　また、６倍体コムギの３種類の野生型ＩＳＡ１ポリペプチドは、例えば、EMBL-EBIが提供するEnsenblPlants（http://plants.ensembl.org/）のアクセッション番号TraesCS7D02G249500.1（配列番号１５）、TraesCS7A02G251400.1（配列番号１６）、TraesCS7B02G139700.2（配列番号１７）が挙げられる。
　一実施形態において、遺伝的因子Ａの変異は、ＩＳＡ１ポリペプチドの活性又は発現の欠損を生じるＩＳＡ１遺伝子変異である。このような変異としては、例えば、ＩＳＡ１遺伝子のＣＤＳ途中での終止コドンの出現、開始コドン（ＡＴＧ）の欠失、及びＣＤＳの部分又は全部欠失をもたらす変異からなる群より選ばれる１種以上の変異が挙げられる。また、例えば４倍体や６倍体などの、ＩＳＡ１遺伝子を複数有するイネ科植物の場合は、いずれかのＩＳＡ１遺伝子に活性又は発現の欠損を生じる変異を有していればよいが、ゲノム中の全てのＩＳＡ１遺伝子に活性又は発現の欠損を生じる変異を有することが好ましい。
　イネ科植物がオオムギの場合、ＩＳＡ１ポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じるＩＳＡ１遺伝子変異は、例えば、配列番号４のＩＳＡ１ポリペプチドの１～４９０番のいずれか１以上の残基に対応するコドンが終止コドンとなる変異であってもよい。例えば、当該変異は、配列番号４の４９０番目のトリプトファン残基に対応するコドンが終止コドンとなる変異であり得る。
　イネ科植物がコムギの場合、ＩＳＡ１ポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じるＩＳＡ１遺伝子変異は、例えば、配列番号１５の１～４９２番目、配列番号１６の１～４９１番目、及び配列番号１７の１～４９１番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの残基に対応するコドンが終止コドンとなる変異であってもよい。例えば、当該変異は、配列番号１５の１～４９２番目の少なくとも１残基、配列番号１６の１～４９１番目の少なくとも１残基、及び配列番号１７の１～４９１番目の少なくとも１残基に対応するコドンがそれぞれ終止コドンとなる変異であり得る。
　本明細書中、「澱粉枝切り酵素ＩＩａ（ｓｂｅＩＩａ）」遺伝子は、ＢＥＩＩａとも呼ばれ、澱粉にα－１，６－グルコシド結合を導入してアミロペクチンのクラスターの分岐を合成する酵素をコードする遺伝子である（例えば、Nakamura Y. Plant and Cell Physiology, 2002, Vol.43, Issue 7, pp.718-725参照）。
　例えば、オオムギ（Hordeum vulgare cultivar Bomi）の野生型のｓｂｅＩＩａのヌクレオチド配列及びＣＤＳは、NCBIのGenbankにおいて、アクセッション番号AF064560で登録されている。また、オオムギの１品種である「はるな二条」の野生型のｓｂｅＩＩａの塩基配列は配列番号２、そのコードするポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号５に示した。
　また、６倍体コムギの３種類の野生型ｓｂｅＩＩａポリペプチドとしては、例えば、EnsenblPlantsのアクセッション番号TraesCS2A02G293400.1（配列番号１８）、TraesCS2D02G290800.4（配列番号１９）、TraesCS2B02G309500.3（配列番号２０）が挙げられる。
　一実施形態において、遺伝的因子Ｂの変異は、ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の欠損を生じるｓｂｅＩＩａ遺伝子変異である。このような変異としては、例えば、ｓｂｅＩＩａ遺伝子のＣＤＳ途中での終止コドンの出現、開始コドン（ＡＴＧ）の欠失、及びＣＤＳの部分又は全部欠失からなる群より選ばれる１種以上の変異が挙げられる。また、例えば４倍体や６倍体等のｓｂｅＩＩａ遺伝子を複数有するイネ科植物の場合は、いずれかのｓｂｅＩＩａ遺伝子に活性又は発現の欠損を生じる変異を有していればよいが、ゲノム中の全てのｓｂｅＩＩａ遺伝子に活性又は発現の欠損を生じる変異を有することが好ましい。
　イネ科植物がオオムギの場合、ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じるｓｂｅＩＩａ遺伝子変異は、例えば、配列番号５のｓｂｅＩＩａポリペプチドの５６４番目のグリシンに対応するコドンが、アルギニンコドンとなる変異であり得る。
　イネ科植物がコムギの場合、ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じるｓｂｅＩＩａ遺伝子変異は、例えば、配列番号１８の６５８番目のグリシン、配列番号１９の６５５番目のグリシン、及び配列番号２０の６５８番目のグリシンからなる群より選ばれる少なくとも１つのに対応するコドンが、アルギニンコドンとなる変異であってもよい。より特定の実施形態では、当該変異は、配列番号１８の６５８番目のグリシン、配列番号１９の６５５番目のグリシン、及び配列番号２０の６５８番目のグリシンに対応するコドンがアルギニンコドンに置換される変異であり得る。
　本明細書中、「ｆｒａ遺伝子」は、オオムギにおいて、通常の澱粉粒より顕著に粒子径が小さい破砕されたような形状の澱粉粒を有し、不透明な外観を呈する穀粒をもたらす変異であるｆｒａ変異の原因遺伝子として特定された遺伝子である（Theoretical and Applied Genetics, 2018, Vol.131, pp.353-364を参照のこと）。ｆｒａ遺伝子は、イネのＦＬＯＵＲＹ　ＥＮＤＯＳＰＥＲＭ　６（ＦＬＯ６）遺伝子のホモログである。
　例えば、オオムギ（Hordeum vulgare subsp. vulgare）の野生型のｆｒａ遺伝子のヌクレオチド配列及びＣＤＳは、NCBIのGenbankにおいて、アクセッション番号BBB89281で登録されている。また、オオムギの１品種である「はるな二条」の野生型のｆｒａ遺伝子の塩基配列はGenbankに登録された配列と同じであり、配列番号３で表され、そのコードするポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号６で表される。
　また、６倍体コムギの３種類の野生型ｆｒａポリペプチドとしては、例えば、EnsenblPlantsのアクセッション番号TraesCS4B02G029700.2（配列番号２１）、TraesCS4A02G284000.1（配列番号２２）、TraesCS4D02G026700.2（配列番号２３）が挙げられる。
　一実施形態において、遺伝的因子Ｃの変異は、ｆｒａポリペプチドの活性又は発現の欠損を生じるｆｒａ遺伝子変異である。このような変異としては、例えば、ｆｒａ遺伝子のＣＤＳ途中での終止コドンの出現、開始コドン（ＡＴＧ）の欠失、及びＣＤＳの部分又は全部欠失をもたらす変異からなる群より選ばれる１種以上の変異が挙げられる。また、例えば４倍体や６倍体等のｆｒａ遺伝子を複数有するイネ科植物の場合は、いずれかのｆｒａ遺伝子に活性又は発現の欠損を生じる変異を有していればよいが、ゲノム中の全てのｆｒａ遺伝子に活性又は発現の欠損を生じる変異を有することが好ましい。
　イネ科植物がオオムギの場合、ｆｒａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じるｆｒａ遺伝子変異は、例えば、配列番号６のｆｒａポリペプチドの１～２１７番目のいずれか１以上の残基に対応するコドンが終止コドンとなる変異であってもよい。より特定の実施形態では、当該変異は、配列番号６のｆｒａポリペプチドの２１７番目のグルタミン酸残基に対応するコドンが終止コドンとなる変異であり得る。
　イネ科植物がコムギの場合、ｆｒａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じるｆｒａ遺伝子変異は、例えば、配列番号２１の１～１６７番目、配列番号２２の１～１２０番目、及び配列番号２３の１～２１９番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの残基に対応するコドンが終止コドンとなる変異である。より特定の実施形態では、当該変異は、配列番号２１の１～１６７番目の少なくとも１残基、配列番号２２の１～１２０番目の少なくとも１残基、及び配列番号２３の１～２１９番目の少なくとも１残基に対応するコドンがそれぞれ終止コドンとなる変異である。
　一実施形態において、遺伝的因子Ａ～Ｃの外来性のポリヌクレオチドは、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）から選ばれるいずれかの特徴を含む。
　（ｉ）標的遺伝子（ＩＳＡ１、ｓｂｅＩＩａ又はｆｒａ）の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含むポリヌクレオチド、
　（ｉｉ）標的遺伝子の塩基配列において、１、２、３、４又は５個の塩基が欠失、置換又は挿入された塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖とを含む、ポリヌクレオチド、又は
　（ｉｉｉ）標的遺伝子の塩基配列と同一性が９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の塩基配列からなるセンス鎖又はその一部と、該センス鎖又はその一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖とを含む、ポリヌクレオチド。
　上記の外来性のポリヌクレオチドは、ベクターに含まれてもよい。ベクターは、任意選択で、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリＡ付加シグナル、選抜マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、ウイルス複製起点等を含むことができる。
　また、上記の外来性のポリヌクレオチドは、植物に導入後にゲノムに挿入されて、本発明のイネ科植物のゲノムに含まれてもよい。
　一実施形態において、本発明のイネ科植物のＩＳＡ１ポリペプチドの活性又は発現は、野生型植物に対して、例えば５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、０．５％以下又は０．２％以下である。
　一実施形態において、本発明のイネ科植物のｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下は、野生型植物に対して、例えば５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、０．５％以下又は０．２％以下である。
　一実施形態において、本発明のイネ科植物のｆｒａポリペプチドの活性又は発現の低下は、野生型植物に対して、例えば５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、０．５％以下又は０．２％以下である。
　遺伝的因子Ａ～Ｃのポリペプチドの発現の低下は、野生型植物及び本発明の植物それぞれの当該ポリペプチド量を比較して確認することができる。ポリペプチドの定量は、例えば、当該ポリペプチドに対する抗体を用いたウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、プロテインチップ法等が挙げられる。
　（遺伝的因子Ａ～Ｃの変異に係る各遺伝子座の接合型）
　本発明のイネ科植物における接合型は、ＩＳＡ１、ｓｂｅＩＩａ及びｆｒａ遺伝子座のうちの変異を含む遺伝子座の少なくとも１つがホモ接合型であることが好ましく、変異を含む全ての遺伝子座がホモ接合型であることがより好ましい。
　（その他の遺伝的因子）
　一実施形態では、本発明のイネ科植物は、さらに（ｄ）ＴＦＡ遺伝子座（Transformation amenability loci）を含んでもよい。ＴＦＡ遺伝子座は、例えばオオムギにおいて、アグロバクテリウム法による形質転換の成功確率が高い（アグロバクテリウム法による形質転換に対する感受性が高い）個体に含まれる遺伝子座である。オオムギでは、ＴＦＡ遺伝子座はＴＦＡ１～３の３箇所であり、染色体２ＨにＴＦＡ２とＴＦＡ３、染色体３ＨにＴＦＡ１が存在する。
　ＴＦＡ遺伝子座を含むイネ科植物は、アグロバクテリウム法による各種形質転換による育種が容易であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集による遺伝子操作が容易である点で、好ましい。
　オオムギのＴＦＡ遺伝子座の詳細は、例えば、国際公開WO2017/222051号公報、Scientific Reports, 2016, Vol.6, 37505、Plant Cell Reports, 2017, Vol.36, Issue 4, pp.611-620が参照される。
　イネ科植物がオオムギである場合、ＴＦＡ１～３のうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、ＴＦＡ１～３の全てを含むことがより好ましい。ＴＦＡ１～３を含むか否かは、例えば、国際公開WO2017/222051号公報に記載の方法にしたがって、それぞれの遺伝子座を判別可能なマーカーを検出することによって判別することができる。
　一実施形態において、本発明のイネ科植物は、任意選択で、さらに下記（ｅ）～（ｇ）から選ばれるいずれか１以上を含んでもよい。
　（ｅ）別の１以上の糖質代謝遺伝子の変異若しくは該遺伝子のプロモーター領域の変異；
　（ｆ）別の１以上の野生型又は変異型の糖質代謝遺伝子を含む外来性ポリヌクレオチド；
　（ｇ）別の１以上の糖質代謝遺伝子の発現又は機能の低下又は欠損を生じる外来性ポリヌクレオチド。
　別の１以上の糖質代謝遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、sucrose:fructan 6-fructosyltransferase（６－ＳＦＴ）のようなフルクタン合成酵素、fructan 6-exohydrolaseのようなフルクタン分解酵素などの、フルクタンの合成又は蓄積に関わる遺伝子が挙げられる。
　（ｅ）の具体的な実施形態としては、例えば、フルクタン合成酵素の発現又は機能を向上させる変異、又はフルクタン分解酵素の発現又は機能の低下又は欠損を生じる変異が挙げられる。
　（ｆ）の具体的な実施形態としては、例えば、野生型又は変異型のフルクタン合成酵素遺伝子を含む外来性ポリヌクレオチドが挙げられる。
　（ｇ）の具体的な実施形態としては、例えば、フルクタン分解酵素の発現又は機能の低下又は欠損を生じる外来性ポリヌクレオチドが挙げられる。
　［本発明のイネ科植物から得られる穀粒又はその加工品］
　本発明は、上記の遺伝的因子Ａ～Ｃのいずれか２以上を含むイネ科植物から得られる、穀粒又はその加工品を含む。穀粒は、例えば、全穀粒、又は全穀粒を粗挽き、挽き割り、湯通し、圧延、製粉、粉砕、精白、搗精等したものであってもよい。穀粒の加工品は、例えば、澱粉、澱粉顆粒、又は穀粒を含有する食品若しくは飼料が挙げられる。
　［遺伝的因子Ａ～Ｃのうちの２以上の遺伝的因子を含むイネ科植物の作製方法］
　（遺伝的因子の導入方法）
　上記のイネ科植物の作製方法において、Ａ～Ｃの遺伝的因子の導入順序は特に制限はない。通常は、Ａ～Ｃのいずれかの遺伝的因子を含む親植物をまず準備する。そして、当該親植物に対して別の遺伝的因子を含む親植物と交配するか、別の遺伝的因子を人為的に導入することによって、複数の遺伝的因子を含むイネ科植物を得ることができる。また、人為的に遺伝的因子ＡとＢ、ＡとＣなどの２以上の変異を同時に１つの植物に導入してもよい。
　上記の遺伝的因子Ａ～Ｃの変異は、例えば天然の変異であっても、遺伝子組換え技術などによって人為的に導入した変異であってもよい。遺伝的因子Ａ～Ｃの変異のうち、少なくとも１つを含む個体を人為的な変異導入で作製する方法は特に限定されない。例えば、（ｉ）各種突然変異原処理による突然変異体の作製と選抜、（ｉｉ）トランスポゾン、Ｔ－ＤＮＡタギングなどによる遺伝子破壊と選抜、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法、ＴＡＬＥＮ法、ＺＦＮ法などの人工制限酵素を用いたゲノム編集による目的の変異の導入などを適宜用いることができる。
　一実施形態では、本発明のイネ科植物の遺伝的因子Ａ～Ｃの変異の少なくとも１つの変異は、人為的に導入されたものである。
　突然変異原処理は、例えば、各種変異原性化学物質（アルキル化剤、核酸塩基アナログ、アジ化ナトリウムなど）で処理することにより、また各種放射線（電磁波、紫外線、Ｘ線、γ線、粒子線、中性子線、α線、β線、電子、イオンビームなど）を植物に照射することにより行うことができる。本発明においては、例えば突然変異原処理にアジ化ナトリウムを用いることができる。例えば、突然変異原処理としては、イネ科植物の種子を、１ｍＭアジ化ナトリウムを含む酸性溶液中で２０～３０℃で１～５時間処理し、圃場に定植する方法が挙げられる。アジ化ナトリウム処理のより具体的な条件は、例えば下記の実施例の条件が挙げられる。
　外来性ポリヌクレオチドの導入には、当該ポリヌクレオチドの種類及び構成に応じて、例えば、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等の種々の形質転換法を適宜選択して用いることができる。また、外来性ポリヌクレオチドは、例えば、植物細胞（プロトプラストを含む）、カルス、植物組織、又は植物個体に対して導入することができる。
　上記のイネ科植物の作製方法には、さらに（ｄ）ＴＦＡ遺伝子座、（ｅ）別の１以上の糖質代謝遺伝子の変異又は該遺伝子のプロモーター領域の変異、（ｆ）別の１以上の野生型又は変異型の糖質代謝遺伝子を含む外来性ポリヌクレオチド、及び（ｇ）別の１以上の糖質代謝遺伝子の発現又は機能を低下又は欠損させる外来性ポリヌクレオチドからなる群より選ばれる１種以上を導入する工程を含んでもよい。これら（ｅ）～（ｇ）の因子の導入は、例えば上記の遺伝的因子Ａ～Ｃの導入と同様の方法によって行うことができる。
　イネ科植物がオオムギの場合、ＴＦＡ遺伝子座を有する親植物として、例えば醸造用品種である「Ｇｏｌｄｅｎ　Ｐｒｏｍｉｓｅ」を用いることができる。
　（目的植物の選抜方法）
　本発明のイネ科植物の作製方法において、目的とする植物の選抜は、例えば、特定の糖質の存在量が野生型植物に対して増加又は減少しているという形質によってスクリーニングすること、又は、遺伝的因子Ａ～Ｃのいずれか２以上の変異又は外来性ポリヌクレオチドを検出することによって行われる。
　＜形質によるスクリーニング＞
　本明細書において、上記の「種子又は穀粒中の特定の糖質」は、例えば、グルカン〔澱粉（アミロペクチン、アミロース等）、フィトグリコーゲン、βグルカン等〕、フルクタン（イヌリン等）、アラビノキシラン、グルコマンナン、ペクチン等の多糖類；ラフィノース、スタキオース等のオリゴ糖；スクロース、マルトース、トレハロース等の二糖類；グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖が挙げられる。
　上記の糖質の存在量を比較する対象である野生型植物は、目的とするイネ科植物と同種の野生型植物であり、好ましくは同種同系統の野生型植物である。
　一実施形態において、上記形質によるスクリーニングは、例えば、植物から得られる種子の特定の糖質を定量して、野生型植物に対して、当該特定の糖質の含有量が、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上若しくは９０％以上減少したもの、又は、１００％以上、１５０％以上、２００％以上、２５０％以上若しくは３００％以上増加した植物を選抜することによって行われる。
　さらに特定の実施形態では、上記特定の糖質の含有量として、澱粉含有量を用いてスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングは、遺伝的因子Ａ及びＣを含むが、遺伝的因子Ｂを含まないイネ科植物の選抜に特に好ましい。
　＜遺伝的因子Ａ～Ｃのいずれか２以上の変異又は外来性ポリヌクレオチドの検出＞
　遺伝的因子Ａ～Ｃの変異又は外来性ポリヌクレオチドの検出方法は、例えば、変異箇所のポリヌクレオチド又は外来性ポリヌクレオチドの有無又は配列を特定する方法、遺伝的因子Ａ～Ｃに係る遺伝子から翻訳されたポリペプチドの量又は活性を測定する方法などが挙げられる。
　例えば、ポリヌクレオチドの有無又は配列を特定する方法としては、配列特異的なＰＣＲ法による増幅断片の検出（ｑＰＣＲ法、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法等を含む）、一本鎖ＤＮＡをプローブに用いたハイブリダイゼーション法（ＤＮＡチップ等を含む）、ＤＮＡ又はＲＮＡシーケンシング、制限酵素マッピング（ＲＦＬＰ等）などを用いることができる。
　一実施形態において、本発明のイネ科植物の作製方法は、ＰＣＲ法による増幅断片の検出によって目的とする植物を選抜することを含む。例えば、増幅断片の検出は、本発明のイネ科植物が有する遺伝的因子Ａ～Ｃのいずれかの変異の存在を特異的に検出可能なプライマーセットを設計し、そのプライマーセットで、当該イネ科植物から得られたＤＮＡ試料をＰＣＲして、増幅断片の有無又は鎖長を確認することにより行われる。
　遺伝的因子Ａ～Ｃのいずれかの変異の存在を特異的に検出するために、ｄＣＡＰＳ（derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法を用いてもよい（例えば、Michaels S.D., Amasino R.M., 1998, Plant Journal, Vol.14, pp.381-385、Neff M.M. et al., 1998, Plant Journal, Vol.14, pp.387-392を参照のこと）。
　ｄＣＡＰＳ法では、例えば、変異を含む配列又は対応する野生型配列を含み、ＰＣＲ増幅後に変異型配列又は野生型配列のいずれか一方のＰＣＲ増幅断片のみに制限酵素認識部位を生じるように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーと、該プライマーに対して変異を挟み込むように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーとからなるプライマー対を用いて、植物ＤＮＡ試料をＰＣＲする。得られた増幅断片を制限酵素処理したときの切断の有無（例えば、増幅断片の鎖長の変化）から、プライマーがハイブリダイズした配列が変異型配列か野生型配列かを判別することができる。
　より具体的な実施形態として、遺伝的因子Ａとして配列番号１の３３８７Ｇ→Ａの変異を含むイネ科植物の選抜は、例えば、
　配列番号８の塩基配列を３′末端に含む第１オリゴヌクレオチドプライマーと、
　配列番号１の１～３３８６番塩基、好ましくは配列番号１の３１８６～３３８６番塩基からなる塩基配列の一部を含む第２オリゴヌクレオチドプライマー
　からなるプライマー対によりＰＣＲを行うことを含む。
　好ましくは、当該選抜は、さらにＰＣＲ増幅断片をＨｉｎｆＩで消化することを含む。
　また、遺伝的因子Ｂとして配列番号２の９６３６Ｇ→Ａの変異（本明細書中、９６３６Ｇ→Ａ変異は、配列番号２において、未決定部位を表す「ＮＮ」を除いたときに５′側から数えて９６３６番目のＧがＡに置換した変異を表す）を含むイネ科植物の選抜は、例えば、
　配列番号９の塩基配列を３′末端に含む第３オリゴヌクレオチドプライマーと、
　配列番号２の９６３９～１１１６９番塩基、好ましくは配列番号２の９６３９～９８３９番塩基からなる塩基配列の相補配列の一部を含む第４オリゴヌクレオチドプライマー
　からなるプライマー対によりＰＣＲを行うことを含む。
　好ましくは、当該選抜は、さらにＰＣＲ増幅断片をＮｃｏＩで消化することを含む。
　ここで、上記の第２オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、配列番号７の塩基配列を含むプライマーである。上記の第４オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、配列番号１０の塩基配列を含むプライマーである。
　また、例えば、遺伝的因子Ａ～Ｃのいずれかの変異の存在を特異的に検出可能なプライマーセットとして、当該変異を含む塩基配列又は当該変異を構成する塩基配列を特異的に増幅可能なプライマー対の組み合わせからなるプライマーセットを用いてもよい。
　当該プライマーセットは、例えば、
　当該変異を含む配列とＰＣＲ増幅可能な二重鎖を形成するが、対応する野生型配列とＰＣＲ増幅可能な二重鎖を形成しない第５オリゴヌクレオチドプライマーと、該プライマーと前記変異を挟み込むように設計された第６オリゴヌクレオチドプライマーを含む、第１のプライマー対、及び、
　対応する野生型配列とＰＣＲ増幅可能な二重鎖を形成するが、当該変異を含む配列とＰＣＲ増幅可能な二重鎖を形成しない第７オリゴヌクレオチドプライマーと、該オリゴヌクレオチドプライマーと前記変異を挟み込むように設計された第８のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、第２のプライマー対、の組み合わせを含む。
　上記第１のプライマー対でのみ増幅断片が得られた場合、当該変異はホモ接合型と判定される。また、第１のプライマー対及び第２のプライマー対で増幅断片が得られた場合、当該変異はヘテロ接合型と判定される。
　なお、第６オリゴヌクレオチドプライマーと第８オリゴヌクレオチドプライマーは同一であっても、互いに異なる配列を含んでいてもよい。
　当該実施形態のより具体的な実施形態では、遺伝的因子Ｃとして配列番号３の８２７Ｇ→Ｔ及び８２８Ｇ→Ｔの変異を含むイネ科植物の選抜は、例えば、
　配列番号１１の塩基配列を３′末端に含む前記第５オリゴヌクレオチドプライマーと、
　配列番号３の８２９～５６８７番塩基、好ましくは配列番号３の８２９～１０２９番塩基からなる塩基配列の相補配列の一部を含む前記第６オリゴヌクレオチドプライマー
　からなるプライマー対によりＰＣＲを行うこと；及び
　配列番号１３の塩基配列を３′末端に含む前記第７オリゴヌクレオチドプライマーと
　配列番号３の８２９～５６８７番塩基、好ましくは配列番号３の８２９～１０２９番塩基からなる塩基配列の相補配列の一部を含む前記第８オリゴヌクレオチドプライマー
　からなるプライマー対によりＰＣＲを行うことを含む。
　ここで、前記第６オリゴヌクレオチドプライマー及び前記第８オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば配列番号１２（配列番号１４）の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーである。
　前記第１～第８オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１種を含むＰＣＲのアニーリング温度は、例えば４５～７０℃、好ましくは５０℃～６０℃である。
　（本発明のイネ科植物の子孫植物の作製方法）
　本発明のイネ科植物の作製方法の実施形態の一つとして、本発明のイネ科植物の子孫植物の作製方法が含まれる。本発明のイネ科植物の子孫植物の作製方法は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）を含む。
　（ｉ）遺伝的因子Ａ～Ｃのうちの２以上の遺伝的因子を含むイネ科植物を少なくとも１つの親植物として、自家受精によって、第２の植物との交配によって、又は、外来性ポリヌクレオチドで形質転換して、子孫植物を得ること；及び、
　（ｉｉ）（１）前記子孫植物の中から、得られる種子若しくは穀粒中の特定の多糖類の存在量が野生型植物に対して増加若しくは減少している植物を選抜すること、又は、（２）前記遺伝的因子Ａ～Ｃのいずれか２以上の変異若しくは外来性ポリヌクレオチドが検出される植物を選抜すること。
　また、上記のイネ科植物の子孫植物の作製方法のより具体的な実施形態は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）を含む。
　（ｉ）遺伝的因子Ａ及び遺伝的因子Ｃを含み、遺伝的因子Ｂを含まないイネ科植物を少なくとも１つの親植物として、自家受精によって、第２の植物との交配によって、又は、外来性ポリヌクレオチドで形質転換して、子孫植物を得ること；及び
　（ｉｉ）（１）前記子孫植物の中から、得られる種子又は穀粒中の澱粉の含有量が、野生型植物に対して減少している植物を選抜すること、又は、（２）前記遺伝的因子Ａ及び前記遺伝的因子Ｃの変異若しくは外来性ポリヌクレオチドが検出され、かつ前記遺伝的因子Ｂの変異若しくは外来性ポリヌクレオチドが検出されない植物を選抜すること。
　当該実施形態において、第２の植物は、上記の親植物と交配可能な植物であれば特に限定されない。例えば、第２の植物も遺伝的因子Ａ～Ｃのいずれか１つ以上を含んでいてもよいし、遺伝的因子Ａ～Ｃのいずれも含んでいなくてもよい。
　当該実施形態において、得られる種子又は穀粒中の澱粉の含有量は、野生型植物に対して、例えば、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下又は１０％以下である。ここで、野生型植物とは、当該イネ科植物と同種の野生型植物であり、好ましくは当該イネ科植物と同種同系統のイネ科植物である。
　（形質により特定された親植物を用いた作製方法）
　下記の実施例から理解されるように、一実施形態において、本発明のイネ科植物の作製方法は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）を含む。
　（ｉ）下記（Ａ）～（Ｃ）から選ばれるいずれか２つの植物を親植物として交配すること；
　　（Ａ）種子中に複粒型の澱粉粒を含む植物；
　　（Ｂ）種子中に細長い澱粉粒を含む植物；
　　（Ｃ）種子中に微小な澱粉粒子が集合した形態の澱粉粒と巨大な澱粉粒を含む植物：及び、
　（ｉｉ）交配により得られた植物から、種子又は穀粒中の特定の糖質の存在量が野生型植物に対して増加又は減少している植物を選抜すること。
　（Ａ）の植物の種子に含まれる「複粒型の澱粉粒」とは、複数の小さい澱粉粒子の集合した形態を特徴とする澱粉粒を表す。例えば、野生型のイネの種子に含まれる澱粉粒は、複粒型の澱粉粒である。
　（Ａ）の植物の種子に含まれる小さい澱粉粒子の平均長径は、例えば、３～１５μｍ又は５～１０μｍであり、当該澱粉粒子の集合体である澱粉粒の平均長径に対して、例えば５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％である。
　（Ａ）の植物の種子中の複粒型澱粉粒の数は、例えば、種子中の澱粉粒の総数の１％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上又は９０％以上であり、また、例えば、種子中の澱粉粒の総数の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下又は１０％以下であってもよい。
　（Ｂ）の植物の種子に含まれる「細長い澱粉粒」とは、その長径が、短径に対して４００％以上、好ましくは５００％以上である澱粉粒を表す。
　（Ｂ）の植物の種子に含まれる細長い澱粉粒の平均長径は、例えば、１０～５０μｍ又は２０～４０μｍである。
　（Ｂ）の植物の種子中の細長い澱粉粒の数は、例えば、種子中の澱粉粒の総数の１％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上又は９０％以上であり、また、例えば、種子中の澱粉粒の総数の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下又は１０％以下であってもよい。
　（Ｃ）の植物の種子に含まれる「微小な澱粉粒子が集合した形態の澱粉粒」とは、複粒型の澱粉粒を構成する澱粉粒子よりもさらに小さい長径を有する微小な澱粉粒子が集合した形態を特徴とする澱粉粒である。微小な澱粉粒子の長径は、例えば、野生型植物の澱粉粒の平均長径の０．５％以上１０％未満である。
　（Ｃ）の植物の種子に含まれる「巨大な澱粉粒」とは、その長径が、野生型植物の澱粉粒の平均長径の１５０％以上の澱粉粒を表す。当該巨大な澱粉粒の表面は、カドやしわが見られ、滑らかではないという特徴を有する。
　（Ｃ）の植物の種子に含まれる微小な澱粉粒子の平均長径は、例えば、０．２～３μｍ又は０．５～２μｍである。
　（Ｃ）の植物の種子中の微小な澱粉粒子が集合した形態の澱粉粒の数は、例えば、種子中の澱粉粒の総数の１％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上又は９０％以上であり、また、例えば、種子中の澱粉粒の総数の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下又は１０％以下であってもよい。
　（Ｃ）の植物の種子中の巨大な澱粉粒の数は、例えば、種子中の澱粉粒の総数の１％以上、２％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上又は９０％以上であり、また、例えば、種子中の澱粉粒の総数の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下又は１０％以下であってもよい。
　上記の種子中の澱粉粒の長径、短径及び澱粉粒の数の比は、光学顕微鏡を用いて種子中の澱粉粒の像を取得し、それぞれの澱粉粒の長径、短径、及び数を測定することによって求められる。
　一実施形態において、（ｉｉ）の選抜は、得られる種子又は穀粒中の澱粉の含有量が、野生型植物に対して減少している植物を選抜することである。
　当該実施形態において、得られる種子又は穀粒中の澱粉の含有量は、野生型植物に対して、例えば、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下又は１０％以下である。ここで、野生型植物とは、当該イネ科植物と同種の野生型植物であり、好ましくは当該イネ科植物と同種同系統のイネ科植物である。
　［プライマーセット及びキット］
　本発明には、下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）から選ばれる、いずれか１以上を含む、プライマーセットが含まれる。
　上記の（Ｉ）第１オリゴヌクレオチドプライマーと第２オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対；
　（ＩＩ）第３オリゴヌクレオチドプライマーと第４オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対；並びに
　（ＩＩＩ）第５オリゴヌクレオチドプライマーと第６オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対、及び、第７オリゴヌクレオチドプライマーと第８オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対、の組み合わせ。
　当該プライマーセットの具体的な実施形態及び使用方法は、上記の＜遺伝的因子Ａ～Ｃのいずれか２以上の変異又は外来性ポリヌクレオチドの検出＞の項の記載から理解することができる。
　本発明のプライマーセットは、本発明のイネ科植物のうち、（Ａ）遺伝的因子Ａとして配列番号１の３３８７Ｇ→Ａの変異、（Ｂ）遺伝的因子Ｂとして配列番号２の９６３６Ｇ→Ａの変異、（Ｃ）遺伝的因子Ｃとして配列番号３の８２７Ｇ→Ｔ及び８２８Ｇ→Ｔの変異の少なくともいずれか１つを含む植物を選抜するのに適している。
　さらに特定の実施形態において、本発明のプライマーセットは上記（Ｉ）～（ＩＩＩ）から選ばれるいずれか２以上、又は（Ｉ）～（ＩＩＩ）を全て含むプライマーセットである。当該プライマーセットは、（Ａ）～（Ｃ）のいずれか２つ以上を含む植物を選抜するのに適している。
　さらに、本発明には、上記のプライマーセットを含むプライマーキットも含まれる。当該プライマーキットには、上記のプライマーセットを構成するオリゴヌクレオチドプライマーのうち、１種単独又は複数を組み合わせて含む、１以上の容器を含んでいてもよい。
　上記のプライマーキットは、さらにＰＣＲ用の試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、精製水等）、サイズマーカー、制限酵素などを含んでも良い。
　［遺伝的因子Ｂを含むイネ科植物］
　本発明は、さらに遺伝的因子Ｂを含むイネ科植物、即ち、（ｂ）ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｓｂｅＩＩａ遺伝子変異の変異若しくは該遺伝子のプロモーター領域の変異又はそれらの組み合わせを含む、イネ科植物又はその部分、を含む。当該イネ科植物の作製方法は、上記の［遺伝的因子Ａ～Ｃのうちの２以上の遺伝的因子を含むイネ科植物の作製方法］に記載された方法をもとに理解することができる。
　下記では本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。本実施例において使用する分子生物学的手順は、特に言及しない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)（Sambrookら、Cold Spring Harbour Laboratory Press，2012）を参照することができる。
　［試験例１．澱粉粒の形状に特徴を有する変異体のスクリーニング］
　澱粉粒の形状が野生型と異なる突然変異体を単離するために、まずアジ化ナトリウムを突然変異原としてＭ３系統（「Ｍｏｒｅｘ」ならびに「はるな二条（Ｈａｒｕｎａ　Ｎｉｊｏ）」に由来）のオオムギ種子に変異原処理を行った。オオムギ種子をエアレーション下の氷水中で２０時間吸水させた後に、２０℃で３時間、１ｍＭアジ化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）中で培養した。
　突然変異原処理後に種子を流水で水洗した後、圃場に定植して後代種子を採種し、突然変異集団とした。得られた突然変異集団及び、その集団から育成したＭ２から、澱粉粒の形状をもとに個体をスクリーニングした。スクリーニングでは１系統あたり５粒以上の完熟種子の胚乳から簡易切片（松島ら，応用糖質化学，２０１２年，第２巻，第２号，ｐｐ．１４７－１４９を参照のこと）を作製して澱粉粒の観察を行った。澱粉粒の形状に異常があった場合は、その個体の次世代の種子を観察して形質が遺伝性のものであることを確認した。観察した系統の数を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　スクリーニングの結果、種子中の澱粉粒の形状が野生型とは異なる３種類の変異体が得られた。完熟種子からテクノビット切片を調製後、ルゴール液（ヨウ化カリウム／ヨウ素溶液；MP Biomedicals製）で染色し、光学顕微鏡観察を行った（方法は、Matsushima, R. Bio-protocol,2014, 4: e1239を参照のこと）。それぞれの澱粉粒の顕微鏡写真を図１に示した。野生型のはるな二条に対して、Ａ変異体では、小さい澱粉粒子が集合した複粒型澱粉粒が発達していた。Ｂ変異体では、細長い澱粉粒が発達していた。Ｃ変異体では、小さい澱粉粒子が集合した澱粉粒や巨大な澱粉粒が発達していた。
　以降の試験では、スクリーニングで得られた個体を原品種と戻し交配して得られた個体を用いた。
　はるな二条から得られたＡ～Ｃの変異体のゲノムの一部を解析した結果、下記の表２の変異を有することが明らかとなった。これらの変異はＩＳＡ１、ｓｂｅＩＩａ、及びｆｒａ各ポリペプチドの機能の低下又は欠損をもたらす変異である。
　また、Ｍｏｒｅｘ系統の変異体のスクリーニングでは、Ａ変異体と同様の澱粉粒形質を示し、塩基置換によりＩＳＡ１のコーディング領域（ＣＤＳ）の途中に終止コドンが導入された２系統が得られた。また、はるな二条系統の変異体のスクリーニングでは、Ｂ変異体と同様の澱粉粒形質を示すｓｂｅＩＩａ遺伝子を含む領域が欠損した１系統が得られた。さらに、ｆｒａ遺伝子については別のオオムギでＣＤＳ途中に終止コドンが導入された変異体が得られており、Ｃ変異体と同様の澱粉粒が種子中に観察されることが知られている（Saito M. et al. Theor. Appl. Genet., 2017, Vol.131, pp.353-364）。よって、当業者はＩＳＡ１、ｓｂｅＩＩａ及びｆｒａ遺伝子の変異が、特有の澱粉粒の形質に密接に関連していることを理解し得る。
　さらに、およそ４０００程度の系統から、同様の遺伝子変異及び形質を有する変異体が複数得られていることから、当業者は、本試験例と同様の変異体ライブラリを作製してスクリーニングを行えば、ＩＳＡ１、ｓｂｅＩＩａ、ｆｒａの各遺伝子に機能又は発現の低下又は欠損を有する変異体が得られることを理解し得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記のはるな二条に由来するＡ、Ｂ及びＣ変異体について、種子の形状観察とキャピラリー電気泳動法による種子中のアミロペクチンの鎖長の分布の解析結果を図２Ａ及びＢに示した。
　複粒型澱粉粒の蓄積を示すＡ変異体は、野生型と比べて、種子の長径は変わらないものの、種子は若干痩せており、種子体積は減少していた。Ａ変異体のアミロペクチンは、野生型と比べて、重合度（ＤＰ）８以下の短鎖が増加し、ＤＰ９以上の長鎖が減少していた。
　細長い澱粉粒の蓄積を示すＢ変異体は、野生型と比べて、種子の大きさが減少していた。一方、アミロペクチンの鎖長分布は、Ａ変異体に比べると野生型との際は少ないものの、ＤＰ９～１４の鎖が減少し、ＤＰ１５以上の長鎖が増加していた。
　小さい粒子が集合した形態の澱粉粒と巨大な澱粉粒を有する澱粉粒の蓄積を示すＣ変異体は、野生型と比べて、種子の大きさならびにアミロペクチンの鎖長分布に大きな違いはなかった。
　なお、表２のＡ～Ｃ変異体は、国立大学法人岡山大学資源植物科学研究所で保管しており、必要に応じて第三者に分譲を行う。
　［試験例２．変異アレルの有無の判別法の検討及び二重変異体、三重変異体の作製］
　（変異アレル判別プライマーの設計）
　表２のＡ～Ｃ変異体の有する各変異アレル（変異アレルＡ～Ｃと呼ぶ）と野生型アレルの有無を判別するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。設計したオリゴヌクレオチドプライマー、増幅条件及び変異アレルの増幅断片の特徴を表３に示した。変異アレルＡ、Ｂの増幅断片は、それぞれＨｉｎｆＩ、ＮｃｏＩで５時間消化後の断片の長さによって野生型アレルの増幅断片と区別することができる。また、変異アレルＣの増幅断片はCPrimerSet2-FとCPrimerSet2-Rの対で増幅されるがCPrimerSet1-FとCPrimerSet1-Rでは増幅されないことによって、野生型アレルの増幅断片と区別することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（変異体Ａ～Ｃのホモ接合体の作製）
　試験例１で得られた変異体Ａ～Ｃの自家受精によって得られた個体と野生型個体の若い葉から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、それぞれの変異体に対応する表３に記載のプライマーセット及び条件でＰＣＲした。ＰＣＲ試薬は、Quick Taq（登録商標） HS DyeMix（東洋紡（株）製）を使用した。変異体Ａの増幅断片はＨｉｎｆＩで、変異体Ｂの増幅断片はＮｃｏＩで５時間消化した。得られた増幅断片を１５％アクリルアミド電気泳動した結果を図３に示した。設計したプライマーセットによって、ホモ接合体及びヘテロ接合体を容易に判別できることが明らかとなった。
　（二重変異体及び三重変異体の作製）
　変異体Ａ～Ｃ（いずれもホモ接合体）を人工交配し、上記のプライマーセットを用いたＰＣＲ法による選抜を行って、変異アレルＡ～Ｃの３種類の変異アレルのうち、２つ又は３つを有する変異体（ＡＢ二重変異体、ＡＣ二重変異体、ＢＣ二重変異体、ＡＢＣ三重変異体）を作製した。例えば、ＡＢ二重変異体は変異アレルＡと変異アレルＢを有する変異体を意味する。自家受精によって得られた子孫から上記のプライマーセットを用いたＰＣＲ法によりホモ接合体を選抜した。得られたホモ接合体化した変異体を、以降の試験例で使用した。
　［試験例３．二重変異体及び三重変異体の表現型の観察］
　野生型及びＡＣ二重変異体の出穂後２０日の登熟種子を採取し、中央部で横断した切片を、ハンドセクションで調製後、ルゴール液（ヨウ化カリウム／ヨウ素溶液；MP Biomedicals製）で染色し、光学顕微鏡観察を行った。種子切片の顕微鏡像を図４－１に示した。野生型種子に比べて、ＡＣ二重変異体の種子では、澱粉の蓄積量が大幅に減少していた。
　ＡＣ二重変異体の種子で澱粉蓄積量が減少していることを図４－２で示す。この結果は、登熟種子並びに完熟種子において、ＡＣ二重変異体では澱粉合成が阻害されていることを示す。さらに、ＡＣ二重変異体は、登熟種子では、野生型と比較してグルコース、スクロース、マルトースの蓄積量が顕著に増加していた。図４－３に登熟種子のマルトース蓄積量の比較を示した。さらに、図４－４に示すように、ＡＣ二重変異体は、完熟種子では、野生型、Ａ変異体、Ｃ変異体と比較して、フルクトース、グルコース、スクロース、及びマルトースの蓄積量が顕著に増加していた。
　一方、ＡＢ二重変異体、ＢＣ二重変異体及びＡＢＣ三重変異体では、このような種子中の澱粉量の顕著な減少は観察されなかった。
　試験例２で得られたＡＢ二重変異体、ＢＣ二重変異体、ＡＣ二重変異体及びＡＢＣ三重変異体を栽培し、完熟種子を採取した。完熟種子のテクノビット切片を調製後、ルゴール液（ヨウ化カリウム／ヨウ素溶液；MP Biomedicals製）で染色し、光学顕微鏡観察を行った（方法は、Matsushima, R. Bio-protocol, 2014, 4: e1239を参照のこと）。ＡＢ二重変異体、ＢＣ二重変異体、ＡＣ二重変異体及びＡＢＣ三重変異体の種子中の澱粉粒を野生型種子の澱粉粒と比較した結果を図５に示した。
　ＡＢ二重変異体では、意外にも、Ａ変異体及びＢ変異体のような澱粉粒の異常が認められず、野生型に近い澱粉粒が観察された。ＢＣ二重変異体では、Ｂ変異体の特徴である細長い形状の澱粉粒と、Ｃ変異体の特徴である小さい澱粉粒子が集合した澱粉粒の両方が観察された。ＡＣ二重変異体では、澱粉粒の形成自体が阻害されていた。ＡＢＣ三重変異体は、野生型よりも若干小さい澱粉粒であるが、その形状はＡ～Ｃ変異体のような異常が見られなかった。

Claims (11)

  1. 　下記（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも２つを含む、イネ科植物又はその部分：
    　（ａ）イソアミラーゼ１ポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、イソアミラーゼ１遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ；
    　（ｂ）ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｓｂｅＩＩａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ；
    　（ｃ）ｆｒａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｆｒａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ。
  2. 　下記（ａ）及び（ｃ）を含み、かつ（ｂ）を含まない、イネ科植物又はその部分：
    　（ａ）イソアミラーゼ１ポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、イソアミラーゼ１遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ；
    　（ｂ）ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｓｂｅＩＩａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ；
    　（ｃ）ｆｒａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｆｒａ遺伝子の変異、該遺伝子のプロモーター領域の変異若しくは外来性ポリヌクレオチド又はそれらの組み合わせ。
  3. 　前記変異を含む遺伝子座の少なくとも１つがホモ接合型である、請求項１又は２に記載のイネ科植物又はその部分。
  4. 　さらに（ｄ）ＴＦＡ遺伝子座を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のイネ科植物又はその部分。
  5. 　さらに下記（ｅ）～（ｇ）から選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のイネ科植物又はその部分：
    　（ｅ）少なくとも１つの別の糖質代謝遺伝子の変異又は該遺伝子のプロモーター領域の変異；
    　（ｆ）少なくとも1つの別の野生型又は変異型の糖質代謝遺伝子を含む外来性ポリヌクレオチド；
    　（ｇ）少なくとも１つの別の糖質代謝遺伝子の発現又は機能の低下又は欠損を生じる外来性ポリヌクレオチド。
  6. 　得られる種子又は穀粒の澱粉含有量が、野生型植物の種子又は穀粒に対して５０％以下である、請求項１～５のいずれか一項に記載のイネ科植物又はその部分。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のイネ科植物から得られる、穀粒又はその加工品。
  8. 　（ｉ）請求項１～６のいずれか一項に記載のイネ科植物を少なくとも１つの親植物として、自家受精によって、第２の植物との交配によって、又は、外来性ポリヌクレオチドで形質転換することによって、子孫植物を得ること；及び、
    　（ｉｉ）（１）前記子孫植物の中から、種子若しくは穀粒中の特定の糖質の存在量が野生型植物に対して増加若しくは減少している植物を選抜すること、又は、
    　　（２）前記（ａ）～（ｃ）から選ばれる少なくとも２つの変異若しくは外来性ポリヌクレオチドが検出される植物を選抜すること；
    　を含む、イネ科植物の作製方法。
  9. 　下記（Ｉ）～（ＩＩＩ）から選ばれる少なくとも１つを含む、プライマーセットであって、
    　（Ｉ）配列番号８の塩基配列を３′末端に含む第１オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号１の１～３３８６番塩基からなる塩基配列の一部を含む第２オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対；
    　（ＩＩ）配列番号９の塩基配列を３′末端に含む第３オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号２の９６３９～１１１６９番塩基からなる塩基配列の相補配列の一部を含む第４オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対；
    　（ＩＩＩ）配列番号１１の塩基配列を３′末端に含む第５オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３の８２９～５６８７番塩基からなる塩基配列の相補配列の一部を含む第６オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対、及び
    　配列番号１３の塩基配列を３′末端に含む第７オリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号３の８２９～５６８７番塩基からなる塩基配列の相補配列の一部を含む第８オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対の組み合わせ；
    　ここで、前記第６オリゴヌクレオチドプライマーと第８オリゴヌクレオチドプライマーは同一又は異なるオリゴヌクレオチドプライマーである、プライマーセット。
  10. 　（ｂ）ｓｂｅＩＩａポリペプチドの活性又は発現の低下又は欠損を生じる、ｓｂｅＩＩａ遺伝子の変異若しくは該遺伝子のプロモーター領域の変異又はそれらの組み合わせを含む、イネ科植物又はその部分。
  11. 　イネ科植物の作製方法であって：
    　（ｉ）下記（Ａ）～（Ｃ）から選ばれるいずれか２つの植物を親植物として交配すること；
    　　（Ａ）種子中に複粒型の澱粉粒を含む植物；
    　　（Ｂ）種子中に細長い澱粉粒を含む植物；
    　　（Ｃ）種子中に微小な澱粉粒子が集合した形態の澱粉粒と巨大な澱粉粒を含む植物：及び、
    　（ｉｉ）前記交配により得られた植物から、種子又は穀粒中の特定の糖質の存在量が野生型植物に対して増加又は減少している植物を選抜すること：
    　を含む、イネ科植物の作製方法。
     
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