CN109852635A - 一种快速检测基因编辑有效性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速检测基因编辑有效性的方法，包括将gRNA转入载体中，再将该载体转入受体菌中，将所得的受体菌转入待检测植物的器官中，培育，然后提取所述器官上被处理部位的细胞基因组DNA，检测靶标基因的表达情况，实现对gRNA剪切效率的快速评估。本发明通过在马铃薯叶片中瞬时表达基因编辑的系统来检测其对靶标基因的剪切效率，涉及的DNA提取方法简单、高效、便宜，实现对靶标基因的成功敲除。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑效率的检测技术领域，特别是涉及一种快速检测基因编辑有效性的方法。
背景技术
基因编辑技术使用一种切割细胞中特定DNA序列的核酸酶，针对动植物相关基因进行定点的精确编辑。而CRISPR-Cas9(cluster regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)基因编辑技术由于它的简单性和低成本，是目前最受欢迎的基因编辑技术。在向导RNA的带领下，通过碱基互补配对可以靶向PAM(原间隔序列临近基序，protospacer adjacent motif)附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中靶标基因的敲除。这种技术已经在很多作物中得到应用，如水稻，番茄等。由于马铃薯是四倍体种，难以获得基因敲除的纯合体，该方法在马铃薯中的研究报道很少。即便是针对同一个基因进行编辑，不同的向导RNA效率也是不一样的，而有些向导RNA会出现没有效果的情况，目前对于出现这种情况还没有客观合理的解释。由于获得进行过基因编辑的作物的过程较长，所以一般在决定将哪个向导RNA转入作物体内前都会对向导RNA的效率进行检测。在拟南芥、水稻和番茄中检测向导RNA对于编辑靶标基因的效率一般用原生质体进行预实验，而马铃薯等植物的原生质体的获取和转化相对于其他作物来说要难很多，所以至今都还没有成功的针对基因编辑预实验的报道。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种快速检测基因编辑有效性的方法，用于快速检测植物基因编辑中针对靶标基因的向导RNA的剪切效率。
本发明提供一种快速检测基因编辑有效性的方法，包括：将gRNA转入中，再将该载体转入受体菌中，将所得的受体菌转入待检测植物的器官中，培育，然后提取所述器官上被处理部位的细胞基因组DNA，检测靶标基因的表达情况，实现对gRNA剪切效率的快速评估。
可选地，先在所述待检测植物的器官上制造伤口，然后将所述受体菌的菌液注入该伤口。
可选地，所述载体选自能用于CRISPR-CAS9表达的载体。
可选地，所述载体选自双元载体。
可选地，所述双元载体选自pCAMBIA1301、pCAMBIA1300中的至少一种。
可选地，所述受体菌选自农杆菌。
可选地，所述农杆菌选自菌株BLA4404、AGL1中的至少一种。
可选地，所述待检测植物处于生长期。
可选地，所述待检测植物可以是二倍体、四倍体或其他多倍体植物。
可选地，所述待检测植物选自马铃薯、甘薯、木薯、西红柿、黄瓜、拟南芥中的至少一种，其中，马铃薯具体可以为Desiree、大西洋等品种。
可选地，所述植物器官选自营养器官、生殖器官中的至少一种。
可选地，所述营养器官选自根、茎、叶中的至少一种。
可选地，所述生殖器官选自种子、花、果实中的至少一种。
例如，如果处理对象为马铃薯，则选择叶片进行受体菌的转入，如果是拟南芥，则可以选择花进行受体菌的转入。
可选地，提取基因组DNA之后，通过PCR检测靶标基因的表达情况。
如上所述，本发明一种快速检测基因编辑有效性的方法，具有以下有益效果：本发明通过在植物器官的细胞中瞬时表达基因编辑的系统来检测其对靶标基因的剪切效率，涉及的DNA提取方法简单、高效、便宜，实现对靶标基因的成功敲除。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中PCR检测不同质粒的剪切效果电泳图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以马铃薯为例，马铃薯的转基因周期更长，而且由于是四倍体，需要得到更多的转基因植株才有可能筛选到基因编辑的纯合体，所以尤其需要筛选出针对靶标基因编辑效率更高的向导RNA才能进行下一步转基因的操作，这样才能更节省时间和成本。
当然，本发明的方法也适用于二倍体、四倍体或其他多倍体植物，具体还可以是甘薯、木薯、西红柿、黄瓜、拟南芥等。
实施例1
一、材料与试剂
1. 1毫升的注射器；
2.马铃薯苗，品种大西洋；
3.农杆菌菌株：AGL1(购自北京中农天地农业发展有限公司)；
4.抗生素：卡那霉素；
5.YEB培养基(Yeast Extract Beef Broth)；
6. 10毫摩尔MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)(pH 5.6)；
7. 200毫摩尔乙酰丁香酮。
二、仪器设备
1.恒温摇床；
2.分光光度计；
3.移液枪；
4.离心机。
三、溶液配方
1、YEB配方(1L)：蛋白胨5克、酵母提取物1克、牛肉浸膏5克、0.5M硫酸镁4毫升、蔗糖5克。用10M氢氧化钠水溶液调pH至7.2。
2、DNA提取液
100mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)；
10mM EDTA(pH8.0)；
1mM氯化钾。
四、本实施例的具体操作步骤如下：
1.构建表达gRNA的质粒，首先根据软件的预测，选择所要敲除的马铃薯靶标基因的gRNA，并将其转入到能用于CRISPR-CAS9表达的双元载体pCAMBIA1301(购自优宝生物公司)中，然后导入到能用于马铃薯瞬时表达的农杆菌AGL1菌株中。
2.准备注射用的马铃薯苗。马铃薯的薯块发芽后种于温室中，生长温度介于18-22℃，每天16小时光照。一般用于瞬时表达的马铃薯苗苗期为在温室中生长4-5周，并选择比较健康和完全发育好的嫩叶进行注射。
3.准备注射用的菌液。挑取转化有表达质粒的农杆菌克隆于1毫升含有卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃摇床250rpm培养24小时.然后按照1％的接种量接种100微升农杆菌菌液于10毫升含有相应抗生素的新鲜的YEB液体培养基中，28℃摇床250rpm(Revolutions Per minute)培养至OD600＝1.0(大约24小时)(Optical Density)。
4.4,000rpm常温离心10分钟收集菌体，用10mM MES缓冲液重悬至OD600＝1.0，每毫升菌液加入1微升浓度为200mM的乙酰丁香酮水溶液(该水溶液采用的溶剂为双蒸馏水)，室温下静置2-6小时。
5.取正处于生长旺盛时期的马铃薯叶片，用没有针头的注射器吸入菌液，然后用移液器吸头在叶片上制造一个微小的伤口，以手指抵住叶片正面，将菌液从叶片的伤口慢慢注入，并对注入菌液的部位做好标记。在马铃薯正常的生长条件下放置2-4天即可取样。
6.用打孔器取下带有标记的叶片，用于植物基因组DNA的提取。将叶片放入1.5毫升的离心管中，加入200微升的DNA提取液，用研棒将叶片捣碎并放入75℃的水浴中放置20分钟。然后12000rpm常温离心10分钟，取出120微升的上清液并加入等体积的异丙醇，再12000rpm常温离心10分钟。倒掉上清液后，用500微升70％(v/v)的乙醇洗涤沉淀一次。最后将沉淀干燥，并加入30微升的TE缓冲液(其组成是：10mM Tris-HCl、1mM EDTA；PH＝8.0)溶解沉淀的DNA。取1微升DNA作为模板进行PCR(Polymerase chain reaction)检查靶标基因是否被剪切。
上述用于提取叶片DNA的方法也可以是其他的植物提取DNA方法，如CTAB法或者采用市场上能够购买到的植物基因组DNA提取的试剂盒。
在马铃薯品大西洋中表达三对不同的向导RNA质粒，观察这些向导RNA对于马铃薯种的Waxy基因剪切效率。这个基因在被剪切前的PCR片段应该是514bp，如果向导RNA有剪切效果，出现被剪切的PCR产物大约是150bp。
质粒1的向导RNA序列为：5‘-GATATTAGAATCACATAGGG-3’和5‘-ATCCCTTTGATTGGCTTCAT-3’；
质粒2的向导RNA序列为：5‘-AAATCAACTGGATGAAGGCT-3’和5‘-GAGGCTCTTCAAGCAGCAGT-3’；
质粒3的向导RNA序列为：5‘-TTGTCTCTGCTGTTGACAAG-3’和5‘-GCTGCAATTCACAAGTTCAT-3’。
图1是根据上述方法在马铃薯叶片中瞬时表达这三个不同的向导RNA质粒，7天后从所注射的叶片中提取DNA后通过PCR来检测不同质粒的剪切效果图。
Lane 1：DNA标准；
Lane 2：PCR产物来自瞬时表达向导RNA质粒1的叶片DNA；
Lane 3：PCR产物来自瞬时表达向导RNA质粒2的叶片DNA；
Lane 4：PCR产物来自瞬时表达向导RNA质粒3的叶片DNA；
Lane 5：PCR产物来自野生型马铃薯的叶片DNA。
从图1可以发现，其中质粒1和2能对靶标基因进行剪切，而质粒3则没有剪切作用。
综上所述，本发明通过在马铃薯叶片中瞬时表达基因编辑的系统来检测其对靶标基因的剪切效率，涉及的DNA提取方法简单、高效、便宜，实现对靶标基因的成功敲除。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种快速检测基因编辑有效性的方法，其特征在于，包括：将gRNA转入载体中，再将该载体转入受体菌中，将所得的受体菌转入待检测植物的器官中，培育，然后提取所述器官上被处理部位的细胞基因组DNA，检测靶标基因的表达情况，实现对gRNA剪切效率的快速评估。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：先在所述待检测植物的器官上制造伤口，然后将所述受体菌的菌液注入该伤口。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述载体选自能用于CRISPR-CAS9表达的载体，优选地，所述载体选自双元载体，更优选地，所述双元载体选自pCAMBIA1301,pCAM1300中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体菌选自农杆菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述农杆菌选自菌株BLA4404、AGL1中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待检测植物处于生长期。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待检测植物选自马铃薯、甘薯、木薯、西红柿、黄瓜、拟南芥中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物器官选自营养器官、生殖器官中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述营养器官选自根、茎、叶中的至少一种，所述生殖器官选自种子、花、果实中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：提取细胞基因组DNA之后，通过PCR检测靶标基因的表达情况。
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