CN100509853C - 淀粉 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过诱变和/或使用生物技术和/或繁育实践在植物中产生具有独特功能性的淀粉的一种方法。本发明还涉及来自玉米植物和/或其它植物的淀粉，这些植物产生含有低直链淀粉淀粉的淀粉贮藏器官，其直链淀粉含量为1.5%-15%，优选地1.5%-10%，最优选地1.5%-8%。本发明包括由于至少一个甲磺酸乙酯诱导的突变从这些谷粒中提取的淀粉。另外，本发明也使用一种生物技术方法，包括控制淀粉贮藏器官中颗粒结合的淀粉合酶的活性。本发明包括淀粉的用途，及其蒸煮、糊和凝胶性质。

Description

淀粉

本发明以2001年10月17日提交的美国临时申请号60/329,525为基础，并要求它的权益，其完整内容在此引用作为参考。

本发明涉及在此定义为弹性淀粉的一种淀粉。通过改构产淀粉植物的waxy基因座，或者合成直链淀粉的waxy基因座的基因产物(即GBSS蛋白)，可制得此处公开的淀粉。本发明的淀粉因此可以被看作还原的直链淀粉淀粉，或具有新弹性特性的一种特殊类型的糯性(waxy)淀粉。本发明的淀粉在此被称为waxy-E或wx-E淀粉，用来强调以前已知的糯性淀粉所没有的这种弹性特性。具体而言，本发明的淀粉具有高粘度的特殊性质和有价值的糊和凝胶特性，以前在自然(即野生型)淀粉或类似植物种的糯性淀粉中没有见到。本发明的淀粉的特殊性质被认为是下列独特组合的产物，即：与相同种的野生型植物的淀粉相比，本发明的淀粉直链淀粉含量减少；且与相同种的野生型植物的淀粉相比，本发明的淀粉具有类似的支链淀粉结构。这些特殊性质在此已经用快速粘度分析仪表征，本领域技术人员应当理解，也可以用其它方法来表征可用于描述此处公开的淀粉的物理性质。本发明的淀粉可以从植物和/或植物部分中获得，方法是通过诱变或植物转化或本领域公知的其它方法，减少植物的直链淀粉含量，而不影响支链淀粉结构，不会象含有少量或不含直链淀粉的糯性淀粉一样显著减少直链淀粉含量。此外，本发明也涉及使用本发明的waxy-E淀粉提高制品弹性的一种方法。

在化学上，淀粉能够被描述为两种同型葡萄糖聚合物——直链淀粉和支链淀粉——的混合物。直链淀粉通常是一种线性α-1，4葡聚糖，有时通过α-1，6-糖苷键轻微分支。支链淀粉通常大于直链淀粉，通过α-1，6-糖苷键高度分支。从贮藏组织(如马铃薯块茎或谷粒)中分离的正常淀粉，以干淀粉重量为基础，其直链淀粉与支链淀粉的平衡通常为20-30％直链淀粉，其余70-80％被描述为支链淀粉。

显示改变的淀粉贮藏器官表型的植物在帮助我们理解植物如何产生淀粉方面非常重要。例如，已经报告了大量玉米表型(Glover和Mertz，1987，“玉米”，《农学》(Agronomy).美国农学会(AmericanSociety of Agronomy)，Madison；Coe等人，1988，“玉米的遗传学”，《玉米及玉米改良》(Corn and Corn Improvement)，第三版，G.F.Sprague和J.W.Dudley编著.美国农学会，Madison)，并且在对碳水化合物组成的影响以及对遗传背景、等位基因剂量的应答或与其它突变的相互作用方面详细描述了几种表型(例如糯性(waxy)、直链淀粉补充剂(amylose extender)、暗色(dull)、皱缩(shrunken)、糖质-2(sugary-2)和糖质(sugary))(实例参考文献：Creech，1965，Genetics 52：1175-1186；Holder等人，1974，Crop Science 14：643-646；Garwood和Vanderslice，1982，Crop Science 22：367-371；Garwood等人，1976，CerealChemistry 53：355-364)。对淀粉贮藏器官表型的多项研究集中在早期到中期发育期间淀粉贮藏器官中所见的合成多糖的分子结构和可溶性碳水化合物的浓度和类型。具体而言，检查具有不同表型的玉米淀粉贮藏器官有助于表征谷粒中的碳水化合物代谢，以及确定哪些酶在调节淀粉生物合成中起作用(综述见Boyer，1985，Phytochemistry24：15-18；Shannon和Garwood，1984，《淀粉：化学与技术》(Starch：Chemistry and Technology)；R.L.Whistler，J.N.BeMiller和E.F.Paschal编著；Academic Press，Orlando)。

在所有植物中，有一种淀粉贮藏器官表型产生含有少量直链淀粉的淀粉。由于历史原因，这种表型被称为“糯性”淀粉：在玉米中，完整种子的表型具有糯性表型外观。产生糯性淀粉的植物通常被称为糯性植物或糯性突变；该基因通常被称为糯性(waxy)基因。颗粒结合的淀粉合酶[GBSS-ADP葡萄糖：1，4-α-D-葡聚糖-4-α-D-葡糖基转移酶(E.C.2.4.1.21)]的酶活性与waxy基因的产物强烈相关(Shure等人，1983，Cell 35：225-233)。在大量物种，如玉米、水稻和马铃薯中，直链淀粉的合成依赖于该基因的表达(Tsai，1974，Biochemical Genetics11：83-96；Hovenkamp-Hermelink等人，1987，Theoretical and AppliedGenetics 75：217-221)。Visser等人描述了来自马铃薯的颗粒结合淀粉合酶的基因的分子克隆和部分表征(1989，Journal of Plant Science64：185-192)。Visser等人(1991，Molecular and General Genetics225：289-296)也描述了反义构建体对马铃薯中GBSS基因表达的抑制。此外，淀粉合酶(EC 2.4.1.11和EC2.4.1.21)延长淀粉分子(Delrue等人，1992，Bacteriology 174：3612-3620；Denyer等人，1999a，BiochemicalJournal 340：183-191；Denyer等人，1999b，Biochemical Journal 342：647-653)，被认为作用于直链淀粉和支链淀粉两者。可以发现淀粉合酶[SS-ADP葡萄糖：1，4-α-D-葡聚糖-4-α-D-葡糖基转移酶(EC2.4.1.11)]活性与颗粒和质体基质有关。结合的淀粉合酶的淀粉结合能力众所周知。众所周知，参与淀粉生物合成的多种酶具有不同的结合倾向，如Mu-Forster等人所述(1996，Plant Physiology 111：821-829)。在Frydman和Cardini的开拓性工作(Frydman和Cardini，1964，Biochemical and Biophysical Research Communications 17：407-411)后，其它SS酶被公认为是可溶性淀粉合酶。最近，根据这些酶与颗粒结合并存在于可溶相中的发现，术语“可溶的”的适当性受到怀疑(Denyer等人，1993，Plant Journal 4：191-198；Denyer等人，1995，Planta 97：57-62；Mu-Forster等人，1996，Plant Physiology111：821-829)。通常认为，支链淀粉的生物合成包括可溶性淀粉合酶与淀粉分支酶的相互作用。可溶性淀粉合酶的不同同工型已经鉴定，并且在豌豆(Denyer和Smith，1992，Planta 186：609-617；Dry等人，1992，Plant Journal，2：193-202)、马铃薯(Edwards等人，1995，PlantPhysiology 112：89-97；Marshal等人，1996，Plant Cell 8：1121-1135)和水稻(Baba等人，1993，Plant Physiology 103：565-573)中克隆，而大麦似乎有多种同工型，其中一些与淀粉分支酶有关(Tyynela和Schulman，1994，Physiologica Plantarum 89：835-841)。在玉米中已经鉴定了SS的两种可溶性形式：被称为同工型I和II(Macdonald和Preiss，1983，Plant Physiology 73：175-178；Boyer和Preiss，1978，CarbohydrateResearch 61：321-334；Pollock和Preiss，1980，Archives ofBiochemistry and Biophysics 204：578-588；Macdonald和Preiss，1985Plant Physiology 78：849-852；Dang和Boyer，1988，Phytochemistry27：1255-1259；Mu等人，1994，Plant Journal 6：151-159)，但是它们均未被克隆。发现玉米胚乳的SSI活性与可溶的和颗粒结合的级分中发现的76-kDa多肽有关(Mu等人，1994，Plant Journal 6：151-159)。SSII的多肽身份还不清楚。

基本不含直链淀粉的糯性玉米淀粉已经知道很多年了(Shannon和Garwood，1984；《淀粉：化学与技术》；R.L.Whistler，J.N.BeMiller和E.F.Paschal编著；Academic Press，Orlando；pp 50-56)。豌豆、玉米、水稻、马铃薯、高粱、小麦、大麦和其它植物中有这些糯性淀粉的例子。

对于多种植物，尤其包括小麦、豌豆、玉米和马铃薯，培育(domestication)及耕种的一个主要目的是生产淀粉。可以以整个淀粉贮藏器官本身的形式(例如烘烤的马铃薯)或者作为基本上全部淀粉贮藏器官的一种制品(例如面粉或粗粉或切片的马铃薯)利用淀粉。此外，也可以从淀粉贮藏器官中分离淀粉，掺入食品(例如饼馅、布丁、汤、酱汁、肉汁、包衣、糖块和/或糖食，和/或酸奶和其它乳制品)和/或工业产品(例如纸上浆助剂、织物上浆助剂和/或悬浮助剂)中。淀粉在植物中产生为颗粒：含有各个淀粉分子的球形、椭圆形或多面体的微小结构。

加入碘染色淀粉的颜色检查是鉴定糯性淀粉的最简单的方法之一。当用碘染色时，正常的淀粉被染色为蓝色或紫色。糯性淀粉用碘染色为红色或褐色或红褐色，因为直链淀粉成分大大减少，以致含有极少或者基本不含直链淀粉。糯性淀粉一直被描述为(a)几乎100％的支链淀粉，或(b)分离自胚乳缺乏GBSS酶的植物贮藏器官，或(c)来自植物淀粉贮藏器官，这些器官来源于一种植物，该植物产生几乎是100％支链淀粉的淀粉，或(d)来自植物淀粉贮藏器官，这些器官来源于胚乳中缺乏GBSS酶的植物，或(e)具有这些特性中的一部分或全部，或(f)具有未知的或未经证实的特性(美国专利号4,428,972；4,615,888；4,767,849；4,789,557；4,789,738；4,801,470；6,143,963)。

某些糯性淀粉由于支链淀粉结构的改变，可能被染色为蓝色或紫色，并且似乎可能含有某些直链淀粉。例如，在玉米中，由于淀粉生物合成途径中的直链淀粉-补充剂(extender)突变，淀粉分支酶活性降低，产生长链支链淀粉(Boyer等人，1976，Journal of Heredity67：209-214)。糯性直链淀粉-补充剂淀粉，即含有糯性和直链淀粉-补充剂突变的植物产生的淀粉，可能具有15％-26％的表观直链淀粉含量(Shannon和Garwood，1984；《淀粉：化学与技术》；R.L.Whistler，J.N.BeMiller和E.F.Paschal编著；Academic Press，Orlando；p65)。糯性淀粉和糯性直链淀粉-补充剂淀粉的结构差异，以及直链淀粉-补充剂突变对淀粉的影响，通常在成分链的分布中清楚地观察到(Jane等人，1999，Cereal Chemistry 76：629-637)。淀粉生物合成途径的这种及其它改变对支链淀粉结构和淀粉蒸煮、胶凝、糊化并且通常对淀粉流变性质具有影响。

因此，染色为蓝色的淀粉颗粒含有长链。长链可能是真正的直链淀粉，或者由于淀粉生物合成途径的改变(例如玉米的直链淀粉-补充剂突变)，是淀粉支链淀粉的一种成分，通过某些方法产生表观直链淀粉含量，或者通过其它方法不含直链淀粉(Klucinec和Thompson，1998，Cereal Chemistry 75：887-896)。另外，通过定量碘染色法，支链淀粉和糯性淀粉本身似乎可有5％的直链淀粉含量。这种直链淀粉可能是由于支链淀粉的低碘结合能力，当在测定过程中不考虑支链淀粉的碘结合能力时，可能错误地归因于直链淀粉(Knutson和Grove，1994，Cereal Chemistry 71：469-471)。

生产染色为红色的糯性淀粉花费了大量时间和精力，因为这种形式含有极少的直链淀粉。糯性淀粉和正常淀粉不同，它们在蒸煮过程中改变。在水或水溶液中加热淀粉导致淀粉颗粒改变(Whistler和Daniel，1985，“碳水化合物”，《食品化学》，O.R.Fennema编著，MarcelDekker，Inc.，NewYork，pp.114-115)。在加热过程中，颗粒膨胀，保持颗粒结构的组织结构解离，允许进一步膨胀。通过另外的加热及施加剪切力，颗粒最终分解，形成无组织的淀粉分子糊。这种淀粉颗粒膨胀和解离的过程被称为胶凝，本领域技术人员公知(Atwell等人，1988，Cereal Foods World 33(3)：306-311；Tester和Morrison，1990，Cereal Chemistry 67：551-557)。冷却后，淀粉开始重组为类似于最初使淀粉颗粒保持在一起的结构，但是颗粒的完全高度组织结构再也不会重建。这一结构重组过程被称为退减作用(retrogradation)，本领域技术公知(Atwell等人，1988，Cereal Foods World 33(3)：306-311)。退减作用通常涉及淀粉糊物理性质的改变，包括糊澄清度的降低和糊的胶凝。正常淀粉通常根据在数小时内胶凝的能力加以识别(Ring，1985，Starch/Starke 37：80-83)，而糯性淀粉通常根据需要数周才能胶凝(如果能够胶凝)的能力加以识别(Yuan和Thompson，1998，CerealChemistry 75：117-123；Biliaderis，1992，“通过微小应变动态振荡流变测定法表征淀粉网络”，《碳水化合物化学进展》，R.J.Alexander和H.F.Zobelz编著，美国谷类化学家协会(American Association ofCereal Chemists)，St.Paul，p103)。正常淀粉通常根据形成不透明糊和凝胶加以识别，而糯性淀粉通常根据在处理后仍然透明加以识别(Craig等人，1989，Cereal Chemistry 66：173-182)。糯性淀粉公认为可以在食品中用作水粘合剂、增粘剂和组织形成剂以及工业用途(Reddy和Seib，2000，Journal of Cereal Science 31：25-39)。煮熟后，糯性淀粉也具有比正常淀粉更好的冻融稳定性和澄清度(Whistler和BeMiller，1997，Carbohydrate chemistry for Food Scientists，Eagan Press，St.Paul，p.146；Reddy和Seib，2000，Journal of Cereal Science31：25-39)。糯性淀粉对剪切、酸和高温的耐受性也低于正常淀粉，长时间蒸煮糯性淀粉产生粘稠的糊(Whistler和BeMiller，1997，Carbohydrate chemistry for Food Scientists，Eagan Press，St.Paul，p.142；Reddy和Seib，2000，Journal of Cereal Science 31：25-39)。糯性淀粉的这些特征被认为是淀粉分子特征的结果，特别是不含直链淀粉(Whistler和Daniel，1985，“碳水化合物”，《食品化学》，O.R.Fennema编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，p.113)，尽管淀粉的准确行为也取决于淀粉的浓度和处理条件及随后的贮存条件。最后，通常认为，对于通过置换、交联或通过这两种方法化学修饰的糯性淀粉，提高其对温度、剪切和酸的稳定性以及使其不希望的糊特性最小化是共同的(Whistler和Daniel，1985，“碳水化合物”，《食品化学》，O.R.Fennema编著，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，pp.118-120)。熟练技术人员熟悉这些实践(Zheng，G.H.等人，1999，Cereal Chemistrty 76：182-188；Reddy和Seib，2000，Journal of Cereal Science 31：25-39)。

通过除去其它关键的淀粉生物合成酶，淀粉生物合成途径的其它改变能够产生有用的淀粉。关于这类淀粉的生产和用途有几项专利(美国专利号4,428,972；4,615,8884,767,849；4,789,557；4,789,738；4,801,470；5,009,911；和5,482,560)。最近，有几项专利和公开的申请描述了为了获得商业上有用的淀粉，淀粉生物合成途径中杂合突变组合的产生和应用(WO9535026，美国专利号5,356,655；5,502,270；和5,516,939)。许多这类淀粉的生产涉及双突变或三突变植物的使用。在涉及糯性淀粉的情况下，发明者声称“糯性基因纯合隐性的植物缺乏颗粒结合的淀粉合酶[GBSS]，几乎产生100％的支链淀粉”(美国专利号5,356,655；5,502,270)。由于足以改变淀粉所需的突变数(一个植物中至少需要2或3个)，许多这类淀粉的商业生产困难且昂贵，因此来自淀粉生物合成途径中含有突变的植物的许多这类淀粉与化学修饰的淀粉相比没有竞争力。此外，2种或2种以上突变的这些组合，无论它们在植物胚乳中是纯合还是杂合组合，都依赖于来自正常或糯性淀粉的支链淀粉的结构改变。

糯性马铃薯淀粉显示含有低至0％和高至7.9％的直链淀粉含量(Salehuzzaman等人，1999，Plant，Cell，and Environment 22：1311-1318，vanderLeij等人，1991，Theoretical and Applied Genetics82：289-295)。然而，所有这些淀粉的直链淀粉含量被看作0(van derLeij等人，1991，Theoretical and Applied Genetics 82：289-295)。Hovenkamp-Kermelink等人(1987，Theoretical and Applied Genetics75：217-221)通过筛查暴露于X线照射的植物产生的小块茎(microtuber)生产了马铃薯的糯性突变体。发现来自两种小块茎的淀粉有大约5％的直链淀粉含量，但是由照射的相同植物的其它小块茎产生的第二代块茎产生具有正常直链淀粉含量的淀粉。对另一组块茎的检查产生三种块茎，其中两种染色为糯性突变特有的完全的纯红褐色(Neuffler等人，1997，《玉米突变体》(Mutants of Maize)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，NY，p.298)，第三种染色为红褐色和蓝色的混合色，表明马铃薯块茎内含有糯性淀粉和未知性质的含直链淀粉淀粉的不均匀混合物。糯性马铃薯不产生GBSS酶。这些淀粉之间没有差别，直链淀粉含量低于3.5％。Van der Leij等人(1991，Theoretical and Applied Genetics 75：217-221)发现，马铃薯淀粉的直链淀粉含量为3％-7.9％，块茎用碘染色为红色，这是糯性淀粉的一个重要特征。直链淀粉含量为3％-7.9％的这些淀粉之间没有差别。

研究生产了直链淀粉含量为3.0％-8％的反义转基因马铃薯(vander Leij等人，1991，Theoretical and Applied Genetics 82：289-295；Visser等人，1991，Molecular and General Genetics 225：289-296；Kuipers等人，1994，Plant Cell 6：43-52)，以试图进一步理解GBSS的功能和活性。这些淀粉的直链淀粉含量是含有染色为蓝色和红褐色的部分的块茎的结果(Visser等人，1991，Molecular and General Genetics225：289-296)，表明是糯性淀粉和未知性质的含直链淀粉淀粉的不均匀混合物。Kuipers等人(1994，Plant Cell 6：43-52)也在颗粒水平上发现了不均匀性，淀粉颗粒具有蓝色核心，周围是红褐色的淀粉外壳，蓝色核心的大小随淀粉中直链淀粉含量的增加而增加。此外，糊的弹性特性和胶凝能力，以及这些低直链淀粉淀粉产生的凝胶的凝胶特性未知。曾经进行研究，试图通过用其它植物产生的GBSS酶的基因转化植物，恢复糯性马铃薯植物中直链淀粉的产生。Salehuzzaman等人(1999，Plant Celland Environment 22：1311-1318)通过用含有不同造粉体转运肽的木薯GBSS酶转化，将马铃薯的直链淀粉到无直链淀粉突变体部分恢复为3.5％-13％直链淀粉。对于含有3.5％-13％直链淀粉的淀粉，产生的淀粉是含直链淀粉的淀粉和染色为红褐色的糯性淀粉的不均匀混合物：淀粉颗粒含有蓝色核心，围绕着红褐色的淀粉外壳，蓝色核心的大小随着淀粉中直链淀粉含量的增加而增加(Salehuzzaman等人，1999，Plant Cell and Environment22：1311-1318)。Salehuzzaman等人(1999，Plant Cell and Environment22：1311-1318)还发现，表观直链淀粉含量为13％的马铃薯淀粉糊在冷却过程中发展弹性模量(eIastic modulus)，而糯性马铃薯淀粉糊则不然；直链淀粉含量较低的不均匀淀粉的弹性行为还没有报告。用来自豌豆的GBSS同工酶转化的糯性马铃薯产生直链淀粉含量为0.8％-1％的马铃薯，类似于其它低直链淀粉马铃薯和豌豆淀粉，在颗粒内观察到不均匀性：用碘染色的颗粒显示处于同心环中或含有蓝色染色颗粒核心的直链淀粉(Edwards等人，2002，The Plant Cell 14：1767-1785)。豌豆GBSS产生的直链淀粉的存在据称对淀粉的蒸煮性质有影响(Edwards等人，2002，The Plant Cell 14：1767-1785)，然而，观察到的淀粉之间的差异在与仪器测量类型有关的误差范围之内。Flipse等人(1996，Theoretical and Applied Genetics 92：121-127)从糯性马铃薯与正常马铃薯杂交产生的植物中提取淀粉；马铃薯块茎具有不同水平的GBSS活性，GBSS活性与直链淀粉含量之间未观察到线性相关性。检查直链淀粉含量为2.50％、16.94％、18.96％和20.32％的淀粉的膨胀特性和膨胀的淀粉颗粒的流变性质。在颗粒的膨胀和流变性质上没有观察到直链淀粉作用的明显差别。可以得到的一个唯一结论是，直链淀粉的存在(16.94％以上)对颗粒的物理行为有影响。

因此，在马铃薯中，淀粉的直链淀粉含量的减少导致产生含直链淀粉淀粉与糯性淀粉的不均匀混合物，淀粉颗粒群体之间以及各个淀粉颗粒之内具有不均一性。此外，直链淀粉含量为0％-7.9％的糯性淀粉的物理性质没有差别。因此，根据现有文献可以推断，对于马铃薯淀粉，低于7.9％的直链淀粉含量使这些淀粉除了糯性马铃薯或正常马铃薯淀粉观察到的性质之外没有独特的流变或糊化特性。此外，糊的弹性特性和胶凝能力，以及低于13％直链淀粉的淀粉产生的凝胶的凝胶特性未知，已经进行的那些试验表明，物理性质在与糯性马铃薯淀粉或具有正常直链淀粉含量的马铃薯淀粉的物理性质有关的误差之内。

类似于转基因马铃薯淀粉，产生的淀粉的直链淀粉含量低于正常豌豆淀粉的豌豆突变体产生具有蓝色核心和红褐色外周的颗粒(Denyer等人，1995，Plant Cell and Environment 18：1019-1026)，表明它们是含直链淀粉的淀粉和糯性淀粉的不均匀混合物。这些淀粉的蒸煮、糊及凝胶行为还没有报告。

最早在日本进行的大量工作鉴定了糯性小麦淀粉。这些糯性突变体的直链淀粉含量范围较窄，报告的最高水平与最低水平之间大约相差0.5％。在所有情况下，报告淀粉用碘染成红色，报告直链淀粉含量为0％或接近于0％。也可以利用诱变被称为“lke”的双无效小麦，产生一种用碘染色为红色的非无效小麦(WO09815621)，从而产生一种糯性小麦淀粉。无效等位基因在特定染色体上该等位基因处不产生特定蛋白质，无效突变体在染色体任一处不产生特定蛋白质。这与不产生蛋白质的非无效突变体不同。用转基因系进行的进一步的工作发现，利用反义技术破坏糯性基因能够产生缺乏直链淀粉的系。在所有情况下，通过碘染色筛查这些系，从转化子中发现并选出染色为红褐色的淀粉。

Miura和Sugawara(1996，Theoretical and Applied Genetics93：1066-1070)证实，用无效等位基因置换产生功能GBSS酶的基因能够产生正常对照的22-23％直链淀粉含量，而不是25.5％直链淀粉含量的淀粉。同样，Miura等人(1999，Euphytica 108：91-95)证实，除去小麦胚乳中3种GBSS同工酶中的2种的功能性产生直链淀粉含量至少为16％，通常为20-21％的小麦淀粉，淀粉中存在的直链淀粉正常为25％。因此，一种野生型GBSS酶的存在足以产生直链淀粉含量至少为16％的淀粉。Oda等人(1992，Japanese Journal of Breeding 42：151-154)证实，通过种子的甲磺酸乙酯(EMS)诱变能够产生直链淀粉含量为14.1-16.7％的低直链淀粉小麦淀粉。Sasaki等人(2000，CerealChemistry 77：58-63)通过杂交正常小麦与糯性小麦产生了直链淀粉含量约为7.5％和13.5％的小麦淀粉。所有淀粉的峰粘度与糯性小麦淀粉的峰粘度相差不到20％，低直链淀粉淀粉的峰粘度高于正常和糯性小麦淀粉。糯性小麦的胶凝温度和焓最高，以糯性>13.5％直链淀粉小麦>7.5％直链淀粉小麦>正常小麦淀粉的顺序降低。糯性小麦、正常小麦或任何低直链淀粉小麦淀粉的退减温度和焓没有显著不同。根据退减数据不能做出这些低直链淀粉小麦淀粉显示独特流变性质的推断。此外，所有这些低直链淀粉淀粉产生的糊的弹性特性和胶凝能力，和凝胶的凝胶性质均未知。另外，在这种情况下，由于低直链淀粉性状在一个小麦系中不固定，而是直链淀粉含量非常不同的两个系的产物，获得的低直链淀粉种子在生长时将不产生含有一种低直链淀粉的种子，而是产生一种种子混合物，其中含有直链淀粉含量介于最初糯性和正常亲本之间的非常不同的淀粉。正常植物与糯性植物杂交产生的这些淀粉不是本发明的主题。

Kiribuchi-Otobe等人(1998，Cereal Chemistry 75：671-672)发现，从诱变的Tanikei A6099产生的小麦株中提取的淀粉颗粒具有1.6％的表观直链淀粉含量，染色为含有暗色核心的暗褐色，与之相比，糯性小麦淀粉染色为红色(0.4％表观直链淀粉)。在美国专利号6,165,535中宣称同一种小麦的直链淀粉含量为0.8％-2.5％，大概占与直链淀粉含量测定有关的误差的近1％。Kiribuchi-Otobe等人(1998，CerealChemistry 75：671-672)发现，与糯性小麦淀粉(0.4％直链淀粉)相比，这种突变小麦淀粉具有最初的高温粘度稳定性。然而，在连续蒸煮中淀粉糊的粘度显著降低到与糯性小麦相同的粘度，在蒸煮后仍保持与糯性小麦相同的粘度。公知诱变的Tanikei A6099小麦产生一种突变GBSS酶(Yanagisawa等人，2001，Euphytica 121：209-214)，但是突变对酶活性的影响还不知道(Yanagisawa等人，2001，Euphytica121：209-214)。另外，还不清楚淀粉是含有真正的直链淀粉还是含有修饰的支链淀粉结构，前者用碘通常染色为蓝色，而不是突变淀粉的暗褐色。诱变本身的作用在植物基因组中可能产生其它突变，这对淀粉的生物合成，因而对淀粉的蒸煮性质具有另外的影响(例如玉米中的直链淀粉-补充剂突变)，也清楚地知道支链淀粉的结构对淀粉的糊和凝胶性质有显著影响(Jane等人，1999，Cereal Chemistry 76：629-637)。已知其它这样的酶是在淀粉生物合成、生物化学和化学领域起作用的酶。此外，也提出GBSS可能影响支链淀粉的结构(Martin和Smith，1995，The Plant Cell 7：971-985)，可以想象，GBSS中的突变将产生一种酶，该酶优先产生一种改变的支链淀粉，而不是合成直链淀粉。因此，淀粉的支链淀粉结构的改变也可能影响淀粉的蒸煮和流变性质。Kiribuchi-Otobe及同事(美国专利号6,165,535；Kiribuchi-Otobe等人，1998，Cereal Chemistry 75：671-672；Yanagisawa等人，2001，Euphytica 121：209-214)没有证实他们的植物产生活性GBSS，也没有证实它们的淀粉含有直链淀粉和/或产生正常的小麦支链淀粉。此外，由这种低直链淀粉的小麦淀粉产生的糊的弹性特性和胶凝性质以及凝胶的凝胶性质还不清楚。

因此，在小麦系中，淀粉中直链淀粉含量的减少导致产生染色为褐色的淀粉的不均匀混合物，与正常的小麦淀粉相比，这些淀粉的直链淀粉和支链淀粉性质未知。此外，直链淀粉含量为1.6％-15％的淀粉的流变性质也没有差别。因此，根据现有的文献，来自杂种小麦植物的直链淀粉含量为1.6％-15％的淀粉的流变性质未知。一些证据表明，含有7.5％或13.5％直链淀粉的小麦淀粉也可能具有一些独特的蒸煮性质，但是这些淀粉的产生是杂交和遗传重组的结果，不能被均匀地携带到未来几代材料中。此外，直链淀粉少于1.6％和15％的小麦淀粉产生的糊的弹性特性和胶凝能力以及凝胶的凝胶性质还不清楚。

低直链淀粉的高粱淀粉证实含有可达约5％的表观直链淀粉，尽管这些低直链淀粉高粱淀粉通常被称为糯性高粱淀粉。Horan和Heider(1946，Cereal Chemistry 23：492-503)指出，某些糯性高粱淀粉的直链淀粉含量高达5％，但是他们承认用来测定直链淀粉含量的方法主要是用来区别糯性与正常高粱淀粉，是一种具有较大误差的快速方法。Miller和Burns(1970，Journal of Food Science 35：666-668)也发现糯性高粱含有可达约5％的直链淀粉，这种含5％直链淀粉的淀粉与直链淀粉含量低于1％的糯性高粱淀粉之间没有区别。因此可以推断，对于高粱，少量直链淀粉显然不能使这些淀粉具有特殊的蒸煮或流变性质。

糯性淀粉和低直链淀粉的水稻淀粉已经证实含有0％-3％的直链淀粉，但是这些淀粉通称为糯性水稻淀粉(Reyes等人，1965，Journal ofAgricultural and Food Chemistry 13：438-442；Juliano等人，1969，Journal of Agricultural and Food Chemistry 17：1364-1369；Sanchez等人，1988，Cereal Chemistry 65：240-243)。对于这些糯性水稻淀粉，假定这些淀粉的不同蒸煮和糊性质是由于淀粉的支链淀粉结构的不同，而不是淀粉的直链淀粉含量的不同(Wang和Wang，2002，CerealChemistry 79：252-256)。因此，由文献可以推断，对于水稻，比正常淀粉降低的直链淀粉水平不会使这些淀粉具有特殊的蒸煮或其它流变性质。水稻淀粉的直链淀粉和其它分子和组成特征对水稻的影响(Champagne等人，1999，Cereal Chemistry 76：764-771；Bett-Garber等人，2001，Cereal Chemistry 78：551-558)或水稻淀粉的性质仍不清楚(Lai等人，2000，Cereal Chemistry 77：272-278)。

低直链淀粉的水稻淀粉已经证实直链淀粉含量为7％-15％(Kumar和Khush，1988，Euphytica 38：261-269)。Shimada等人(1993，Theoretical and Applied Genetics 86：665-672)生产了几种反义水稻植物，它们含有直链淀粉含量为6％-13％的淀粉。这些淀粉颗粒的碘染色性质未曾报告。此外，这些淀粉的任何蒸煮性质，糊的弹性特性和胶凝能力，以及转基因水稻植物产生的这些低直链淀粉水稻淀粉产生的凝胶的凝胶性质，都还不清楚。

Sano(1984，Theoretical and Applied Genetics 68：467-473)和Sano等人(1986，Euphytica 35：1-9)研究了两种等位基因对水稻waxy基因座处基因表达的影响。显示Wx^b等位基因与GBSS酶和直链淀粉的无效产生有关，而Wx^a等位基因显示产生较大量的GBSS酶和直链淀粉。Villareal等人(1989，Starch 41：369-371)也证实，根据对40种水稻变种的分析，Wx^a等位基因在直链淀粉产生上效率低于Wx^b等位基因。另外，Isshiki等人(1998，PlantJournal 15：133-138)也发现，对于两种野生型水稻等位基因Wx^a和Wx^b，Wx^b具有在蛋白质和mRNA水平上比Wx^a低10倍的GBSS活性。与Wx^a相比，Wx^b活性的降低是正常水稻酶基因序列(Wx^a等位基因)内点突变的结果。由于点突变使mRNA序列内含有一个内含子，Wx^b等位基因导致3.4k碱基对mRNA转录物的合成，而与之相比，Wx^a导致2.3k碱基对的mRNA转录物。水稻植物产生的淀粉与该植物从mRNA序列上切割内含子的能力有关。表达高水平成熟mRNA(不含内含子1)和不表达前mRNA(含有内含子1)的植物产生最高水平的GBSS蛋白和最高水平的直链淀粉(20.0-27.8％直链淀粉)。随着成熟和前mRNA的更平衡的表达，观察到更低水平的GBSS蛋白和直链淀粉(6.7-16.0％直链淀粉)。当所有mRNA都含有内含子1，并且观察不到成熟mRNA时，则观察不到GBSS蛋白，也检测不到直链淀粉(Wang等人，1995，Plant Journal7：613-622)。将直链淀粉含量与含有适当切割的内含子1的成熟mRNA相关联的这种模式能够用于31种不同的水稻栽培种(cultivar)(Wang等人，1995，Plant Journal 7：613-622)。因此根据Shimada等人(1993，Theoretical and Applied Genetics 86：665-672)、Isshiki等人(1998，Plant Journal 15：133-138)和Wang等人(1995，Plant Journal 7：613-622)的工作，低直链淀粉水稻似乎是正常GBSS含量降低的结果，这是由于导致mRNA处理出现问题的突变，而不是由于成熟mRNA序列中的突变。此外，水稻与水稻淀粉性质和直链淀粉含量之间没有明确的关系。

根据玉米基因组数据库[由美国农业部农业科研局(USDA-ARS)、国家科学基金会(NSF)和密苏里州大学支持]，认为糯性玉米淀粉被碘染色为红色。存在产生一种活性GBSS蛋白(表1)的大量显性突变等位基因和产生糯性淀粉的隐性突变等位基因(表2)。在玉米中，众所周知提高种子胚乳中wx突变的数量能够降低淀粉的直链淀粉含量，但是含有2倍数量wx突变(三倍体胚乳中可能有3种)的种子产生一种淀粉，在成熟种子中其表观直链淀粉含量接近18％，与之相比，从正常种子中分离的淀粉其直链淀粉为23-25％(Sprague等人，1943，Journalof the American Society of Agronomy 35，817-822；Boyer等人，1976，Journal of Heredity 67：209-214)。

表1.Waxy(Wx)的显性突变等位基因

表2.Waxy(Wx)的隐性突变等位基因

二十世纪四十年代早期，在两种外来的阿根廷小种硬质玉米变种中发现了一种糯性突变体(wx^a)，它所含淀粉的直链淀粉含量为2.4％(Brimhall等人，1945，Journal of the American Society of Agronomy37：937-944)。该淀粉被染色为浅紫色(Brimhall等人，1945，Journal ofthe American Society of Agronomy 37：937：944)。另外，当含有这种淀粉的植物与一种糯性植物杂交时，随着性状量的增加，该淀粉的直链淀粉含量从0％(糯性)到0.65％提高到1.3％到2.4％(全部wxa)(Brimhall等人，1945，Journal of the American Society of Agronomy.37：937-944；Sprague和Jenkins，1948，lowa State College Journal ofScience 22：205-213)。Echt和Schwartz(1981，Maize GeneticsCooperation Newsletter 55：8-9)描述了wx-a等位基因，它使产生的GBSS蛋白的量减少95％，产生低直链淀粉含量的淀粉。对蒸煮的淀粉的检查显示，糊的粘度以waxy>waxy x wx^a>wx^a x waxy>wx^a的顺序升高，其中在样品waxyx wx^a中waxy是雌性，在样品wx^a x waxy中wx^a是雌性。wx^a与正常淀粉相比，蒸煮的淀粉的粘度以正常<正常x wx^a<wx^a x正常<wx^a的顺序升高。因此在检测蒸煮的糊的粘度的这些实验中，显示wx^a淀粉的粘度低于糯性淀粉，高于正常淀粉。由这种低直链淀粉淀粉产生的糊的弹性特性和胶凝能力、凝胶的凝胶性质还不清楚。此外，导致这种性状的具体突变也不清楚。

低直链淀粉的大麦淀粉已经证实含有可达约5％的表观直链淀粉，这些淀粉通常被称为糯性大麦淀粉(Tester和Morrison，1992，Cereal Chemistry 69：654-658)。然而，这种表观直链淀粉是由于大麦植物的淀粉贮藏器官中淀粉颗粒的混合物。这些颗粒的直链淀粉含量一般从检测不到的水平到约10％，最接近种子表面的颗粒具有最高的直链淀粉含量(Andersson等人，1999，Journal of Cereal Science30：165-171)。最近用糯性大麦淀粉进行的研究表明，直链淀粉含量可达6.44％直链淀粉的淀粉(Li等人，2001，Food Chemistry 74：395-405)在剪切下的蒸煮过程中，其粘度发展可能不同(Li等人，2001，FoodChemistry 74：407-415)。在这些含有低于6.44％直链淀粉的大麦淀粉中，不含直链淀粉的淀粉发展粘度最快，较高直链淀粉含量的淀粉在峰粘度发展上延迟。另外，所有糯性大麦淀粉都在蒸煮过程中的相似的点(时间和温度)开始发展粘度。没有对这些淀粉进行进一步的流变学分析。

一种具体种的植物产生的淀粉颗粒的大小和形态学和淀粉分子是这些种所特有的(Jane等人，1994，Starch/Starke 46：121-129)。由于淀粉的物理性质是由于淀粉颗粒的总体物理组成和结构所致，因此难以预测淀粉的一种物理性质与淀粉的精确蒸煮行为之间的确切关系。颗粒的这些差别也伴随着淀粉颗粒内所含脂类的种特异性性质(Morrison，1988，Journal of Cereal Science 8：1-15；Tester和Morrison，1992，Cereal Chemistry 69：654-658)，支链淀粉的种特异性结构(Jane等人，1999，Cereal Chemistry 76：629-637)和直链淀粉的种特异性大小和结构(Takeda等人，1987，Carbohydrate Research 165：139-145；Hizukuri等人，1981，Carbohydrate Research 94：205-213；Takeda等人，1989，Cereal Chemistry 66：22-25；Takeda等人，1986，CarbohydrateResearch 148：299-308；Takeda等人，1984，Carbohydrate Research132：83-92)。同样众所周知，淀粉的物理行为依赖于所有这些特性(Gidley和Bulpin，1989，Macromolecules 22：341-346；Eliasson和Kim，1995，Journal of Rheology 39：1519-1534；Klucinec和Thompson，1998，Cereal Chemistry 75：887-896；Klucinec和Thompson，1999，CerealChemistry 76：282-291；Jane等人，1999，Cereal Chemistry 76：629-637；Klucinec和Thompson，2002a，Cereal Chemistry，79：19-23；Klucinec和Thompson，2002b，Cereal Chemistry，79：24-35)。由于糯性马铃薯淀粉在某些高温烘烤用途中的较好的热稳定粘度(EP1102547)，直链淀粉含量低于1％高于糯性玉米淀粉的糯性马铃薯淀粉的满意性说明了这一点。

由于来自不同植物种的淀粉的物理结构和组成不同，如果一种植物种的结构和组成在另一个植物种中再现，难以预测在一个植物种中是否可观察到淀粉的结构或组成与它们的蒸煮和流变性质之间的特殊关系。然而，在从不同植物种分离的淀粉中，不含直链淀粉的效果显然是糯性淀粉与正常淀粉比较的结果：正常淀粉能够形成弹性凝胶，而糯性淀粉形成稳定的粘糊。正常和糯性淀粉的这些性质在文献中已经得到公认。然而，胶凝中含或不含少量直链淀粉与淀粉的流变性质之间的关系还不清楚。此外，参与淀粉生物合成的许多不同淀粉酶之间的相互作用也不清楚。此外，对于不是糯性淀粉与含直链淀粉的淀粉的不均匀混合物，直链淀粉含量为1.5％-15％的淀粉，其例子很少。再者，这些淀粉在产品中的普通价值和用途还不清楚：还没有表征它们的糊和凝胶性质，以及如何从糊发展为这些淀粉的凝胶。

向新的植物系中引入性状可以通过传统的繁育方法来实现，这种方法从将含有该性状的植物系与不含该性状的靶植物系(转化系)杂交开始。然而，杂交也在获得的含有该性状的植物染色体内产生全新的基因组合。因此，初始植物系的身份和农学特征显著改变。农学性状通常是多基因的，在许多植物种中，多组染色体使这些性状进一步复杂化。将转化植物系重建成它的原始遗传状态但是含有新的性状费时且需要大量杂交，甚至在大量杂交后，转化系的遗传学仍含有具有该性状的原始植物系的某些残余。因此，新植物不等同于具有新性状的未转化亲本。

显然，玉米繁育工业知道在玉米中产生突变的方法，这些突变对产生的淀粉的处理特征具有影响。化学诱变剂如甲磺酸乙酯(EMS)在基因组内产生一个突变。Neuffer早在1971年就发表了一种EMS花粉突变方法(Neuffer，1971，Maize Genetics Cooperation Newsletter45：146-149)。EMS诱变也可以在植物基因组中产生更复杂的损伤(Okagaki等人，1991，Genetics 128：425-431)。另一种产生突变的方法是使用转座子标记，在核酸序列内形成突变。这种方法不形成点突变。衣阿华州立大学(ISU)使用该方法在玉米中产生了一种显性形式的直链淀粉-补充剂。在ISU，研究人员有一个惊人的发现：通过转座子标记技术能够产生一种显性直链淀粉-补充剂基因，这在美国专利号5,004,864中得到证实。如预期的，衣阿华州立大学研究人员发现的显性基因在70％的表观直链淀粉区内产生谷粒。该专利说明，由于该基因的显性性质，实际上在谷粒中增加突变体的量不能提高植物产生的表观直链淀粉的水平。这两种方法具有相同的优点，即亲本的原始遗传性在加入新性状后大部分保留。与亲本植物基本相同的植物是等基因系。等基因系是含有基本相同的基因的系。利用诱变向植物内引入一种新性状可以避免传统繁育中的问题，因为在新植物的染色体内不产生全新的基因组合。尽管除了引入的性状之外，诱变结果与亲本系几乎是等基因的，但是通过诱变引入新性状并不简单。性状的成功引入包括为每个植物系筛选上千个诱变的种子；幸运的是，某些性状能够根据淀粉贮藏器官(例如玉米种子)的表型来鉴定，从而能够加速筛选。

众所周知，通过诱变，酶的活性和作用能够改变，而不是简单的消除。例如，玉米淀粉合酶(SS)SSlla(SEQ ID NO：8)和SSllb-2(SEQID NO：7)已经被位点特异地诱变(Imparl-Radosevich等人，1999，FEBS Letters 457：357-362；Nichols等人，2000，Biochemistry39：7820-7825)。获得活性大大降低或者ADPG亲和力降低的突变体(表4-6)。

表4.SSIIb-2^a和突变体的动力学

^aSSIIb-2是大肠杆菌产生的一种N端截短形式的mSSIIb。

^b突变酶的命名是根据氨基酸序列的改变。第一个字母和数字分别对应于氨基酸和它在非突变酶序列中的位置，最后一个字母是指置换突变酶序列中非突变体氨基酸的氨基酸。

^cV_max值表示为mol葡萄糖/min/mg。对于ADPGIc动力学，K_m值表示为mM ADPGIc，糖原浓度为20mg/ml，支链淀粉浓度为5mg/ml。对于引物动力学，K_m值表示为mg/ml引物。对于SSIIb-2、D21E和D139E，使用1mM ADPGIc，对于D21N和E391D使用5mMADPGIc。

表5.在粗大肠杆菌提取物中测定的SSIIa突变体的淀粉合酶活性

^a突变酶的命名是根据氨基酸序列的改变。第一个字母和数字分别对应于氨基酸和它在非突变酶序列中的位置，最后一个字母是指置换突变酶序列中非突变体氨基酸的氨基酸。

表6.玉米SSIIa野生型和突变体^a K139R、K193Q、K193E和K497Q的动力学

^a突变酶的命名是根据氨基酸序列的改变。第一个字母和数字分别对应于氨基酸和它在非突变酶序列中的位置，最后一个字母是指置换突变酶序列中非突变体氨基酸的氨基酸。

^bV_max值的单位是mol/min/mg蛋白质。

^cADP-葡萄糖(ADPG)的K_m表示为mM ADP-葡萄糖。

^d引物(支链淀粉和糖原)的K_m表示为mg/ml引物。

根据以前的诱变研究可以预期，突变能够导致直链淀粉含量的改变。然而，根据文献所知，无法预期此处公开和报告的流变性质改变的糯性淀粉的发明和发现。

可以利用公知的克隆技术提供DNA构建体，产生酶或蛋白质。筛选并鉴定可能的供体生物。之后可以使用两种方法：(a)使用酶纯化和抗体/序列产生，或(b)使用cDNAs作为异源探针，在来源于所述生物的文库中鉴定酶的基因组DNA。基因转化、植物再生和检测方案在本领域公知。在转基因编码一种淀粉生物合成酶的情况中，制备用于转化的核酸序列构建体是必要的，这些构建体也含有在淀粉形成过程中确保表达的调节序列。这些调节序列存在于许多谷粒和块茎和根中。例如，这些调节序列在玉米胚乳易于获得，作为DNA编码的淀粉合酶(SS或GBSS)或分支酶(BE)或其它玉米胚乳淀粉合成途径的酶。来自胚乳的这些调节序列确保蛋白质在正确的发育时间表达(例如ADPG焦磷酸化酶)。

在多糖酶领域，报告了利用不同植物种的大量淀粉合成基因在植物淀粉途径中进行工程修饰的载体。GBSS酶使得直链淀粉众所周知。多糖酶的用途的一个具体专利实例显示了GBSS酶的突变修饰植物淀粉的用途。公开文本如WO9211376、JP04104791、EP788735、WO09827212、WO028052可以获得，它们讲述了含有DNA的载体，用于控制植物细胞内GBSS生物合成酶的活性。具体而言，这些公开文本涉及由于引入这些酶造成的马铃薯淀粉的改变。也报告了其它淀粉合成基因及其改变淀粉的用途，尽管通常不直接集中于改变直链淀粉含量。

一旦形成编码杂合多肽的连接的DNA，即制备能够将DNA转移到宿主中表达杂合多肽的克隆载体或质粒。本发明的重组核酸序列插入适当的克隆载体或质粒中。对于淀粉生物合成酶，优选的宿主通常是产生淀粉颗粒的宿主。但是也可以使用细菌宿主。特别有用的是转化后含有植物的一些或全部淀粉合成基因的细菌宿主。本领域技术人员理解质粒适应于宿主。例如，在细菌宿主中，转录调节启动子包括lac、TAC、trp等。另外，编码转运肽的DNA最不可能使用，可以利用位于结构核酸序列上游的分泌型前导区使多肽进入培养基。此外，产物也可以保留在宿主中，裂解宿主，通过淀粉提取方法或通过将材料与淀粉基质(或淀粉样基质，如直链淀粉或支链淀粉、糖原等)结合提取产物，分离并纯化产物。

优选的宿主是植物，因而优选的质粒适用于植物。质粒应当含有一个启动子，优选的是适于定向植物含淀粉组织中蛋白质表达的启动子。启动子可以是不同组织特异的，如种子、根、块茎等；或者可以是遍布植物组织的用于核酸序列表达的组成型启动子。众所周知的启动子包括10kD玉米醇溶蛋白(玉米)启动子、CAB启动子、patastin、35S和19S花椰菜花叶病毒启动子(在双子叶植物中非常有用)、聚遍在蛋白启动子(在单子叶植物中有用)，和本领域公知的它们的增强和修饰。

克隆载体可含有转运肽的编码序列，用来引导质粒进入正确的位置。也能够使用其它转运肽的编码序列。所用宿主中自然存在的转运肽是优选的。转运肽的目的在于使肽靶向正确的胞内区域。

供体核酸序列通过转化掺入到受体植物的基因组内。适于靶植物的任何方法都可以使用。从文献中已知大量转化方法，如使用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或其Ti质粒的农杆菌感染法、电穿孔、植物细胞和原生质体的显微注射、微粒转化、花粉管转化和较少提到的＂颈须(whiskers)＂技术(美国专利号5,302,523和5,464,765)。已知方法的全部细节可以参考文献。转化的细胞然后可以再生为完整的转基因植物，其中新的核物质稳定掺入基因组中。再生植物的方法本领域公知。转化的单子叶植物和双子叶植物都可以这样获得，但是后者通常更容易再生。一旦宿主被转化且蛋白质在此表达，编码有效载荷多肽的DNA在宿主中的存在即得到证实。表达的蛋白质的存在可以通过Western Blot或ELISA证实，或者是由于植物或细胞的改变。

本发明提供在产生或贮藏淀粉的所有受体植物中产生预料之外的有价值的性状。受体植物可以是：谷类，如玉米、小麦、水稻、高粱或大麦；产水果种，如香蕉、苹果、西红柿或梨；根或块茎作物，如木薯、马铃薯、山药或萝卜；油籽作物，如油菜籽、向日葵、油椰、椰子、亚麻子或花生；面粉作物(meal crop)，如大豆、菜豆、豌豆；或其它任何合适的种。优选地，突变或多突变受体植物是禾本科(Gramineae)，最优选的是玉蜀黍(Zea mays)种。

本发明提供在所有产生或贮藏淀粉的供体植物中产生有益性状的方法。供体植物是可以是：谷类，如玉米、小麦、水稻、高粱或大麦；产水果种，如香蕉、苹果、西红柿或梨；根或块茎作物，如木薯、马铃薯、山药或萝卜；油籽作物，如油菜籽、向日葵、油椰、椰子、亚麻子或花生；面粉作物，如大豆、菜豆、豌豆；或其它任何合适的种。优选地，突变或多突变受体植物是禾本科，最优选的是玉蜀黍种。

本发明提供通过生物技术和植物转化方法在所有植物中产生有益性状的方法。本领域技术人员应当理解，有几种影响植物直链淀粉含量的方法。

一直需要发展流变性质改善的淀粉。具体而言，发展在成为淀粉糊时具有高粘度并且具有基本弹性特征的淀粉具有意义。这些特性在食用制品中有用，包括馅饼(pie)、布丁、汤、酸乳、酱或作为增粘剂和悬浮助剂的其它食品。此外，这些淀粉也可用于食品的包衣和膜层，如黄油包衣。一旦在表面上沉积，弹性淀粉糊即比现有淀粉更倾向于粘着并粘附于表面，而不是随重力流动。

本发明提供一种淀粉贮藏器官，它产生具有独特的蒸煮、增稠和/或胶凝特性的淀粉(在此被称为弹性糯性或waxy-E或wx-E淀粉)。本发明的淀粉贮藏器官的特征在于产生突变的但是具有活性的颗粒结合的淀粉合酶。本发明的淀粉具有低直链淀粉含量。淀粉的性质在多种用途中具有价值。此处所述的淀粉颗粒分离自植物的淀粉贮藏器官，在该淀粉贮藏器官中含有突变的但是具有活性的颗粒结合的淀粉合酶，直链淀粉含量为1.5-15％，最优选地，直链淀粉含量为1.5-10％，更优选地，直链淀粉含量为2％-8％，用碘染色为蓝色或紫色。

在本发明中利用诱变发展含淀粉的植物，在淀粉贮藏器官中产生突变的但是具有活性的颗粒结合的淀粉合酶，产生具有独特蒸煮、增稠和胶凝性质的淀粉，用碘也染色为蓝色，直链淀粉含量低。检查从突变植物中回收的淀粉的蒸煮、增稠和胶凝性质，用来鉴定具有waxy-E特征的淀粉。此处也提供了显示GBSS活性和低直链淀粉含量的基因型。这些基因型可以用来以其它方法筛选新的突变酶或淀粉合成酶的重组。

本发明提供一种淀粉，其具有独特的蒸煮、增稠和胶凝性质，用碘也染色为蓝色，直链淀粉含量低。本发明还提供一种生产公开的淀粉的方法。本发明提供生产及鉴定有用的植物变体的方法，这些植物变体产生由于酶变异而具有独特的功能性、直链淀粉含量低的淀粉。所有这些淀粉合成酶的核酸序列都可以用于根据本发明的构建体。

本发明提供一种具有独特的蒸煮、增稠和/或胶凝性质的淀粉。

本发明提供一种方法，用来产生特征为含有突变的植物，与野生型相比，其直链淀粉合成减少，但是可以检测。

本发明提供一种方法，用来产生特征为含有突变的植物，与野生型相比，其GBSS酶活性降低，但是可以检测。

本发明提供一种淀粉，由于诱变它用碘染色为蓝色或蓝紫色，直链淀粉含量低。

本发明提供一种来自可商业获得的植物系的淀粉。

本发明提供一种方法，用于将产生本发明的淀粉的一种植物与产生本发明的淀粉的第二种植物杂交，获得可产生本发明的淀粉的淀粉贮藏器官。由这种杂交获得的繁殖结构可以生长，产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官。

此外，本发明也提供将产生本发明的淀粉的一种植物与一种糯性植物杂交，获得产生本发明的淀粉的淀粉贮藏器官。由这种杂交获得的繁殖结构可以生长，产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官。

另外，本发明也提供将一种植物(在其遗传史上至少包括一种产生本发明的淀粉的植物)与一种产生本发明的淀粉的植物或其它任何植物杂交。获得的繁殖结构可以在下一个季节生长，产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官。

本发明也提供植物转化为产生本发明的淀粉的植物。

本发明提供一种淀粉，其在胶凝或糊化后具有高于糯性淀粉糊但低于正常淀粉的弹性模量(EM)。

在优选实施方案中，淀粉来自于玉米植物。

在其它实施方案中，该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。

在其它实施方案中，当使用Rapid Visco分析仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热和搅拌程序指定的仪器条件，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5％淀粉悬液(干重％)时，以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时，本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下弹性模量高于糯性淀粉，或者优选地弹性模量至少2倍于糯性淀粉，或者再更优选地弹性模量大于10Pa，或者再更优选地弹性模量大于15Pa，或最优选地弹性模量大于20Pa，或者弹性模量为10-100Pa，或15-60Pa，或20-50Pa。

在另一个实施方案中，当使用Rapid Visco分析仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热和搅拌程序，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成悬液时，当淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时，以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时，本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下弹性模量高于糯性淀粉，或者优选地弹性模量至少2倍于糯性淀粉，或者再更优选地弹性模量大于10Pa，或者再更优选地弹性模量大于15Pa，或最优选地弹性模量大于20Pa，或者弹性模量为10-100Pa，或15-60Pa，或20-50Pa。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉在掺入食品中时，在低于屈服应变的应变下，弹性模量高于用相同量的糯性淀粉制成的产品的弹性模量，或者优选地弹性模量至少2倍于用相同量的糯性淀粉同样制成的产品，或者更优选地弹性模量至少3倍于用相同量的糯性淀粉同样制成的产品。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉在掺入食品中时，在低于屈服应变的应变下，相角小于用相同量的糯性淀粉制成的产品，或者优选地相角最多是糯性淀粉的75％，或者更优选地相角小于15度，或者最优选地相角小于7度。

本发明提供一种淀粉，其在胶凝或糊化后具有高于糯性淀粉糊的凝胶样特征。

在优选实施方案中，淀粉来自于玉米植物。

在其它实施方案中，该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。

在另一个实施方案中，当使用快速粘度仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5％淀粉悬液(干重％)时，以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时，本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下相角小于糯性淀粉，或者优选地相角小于12度，或者再更优选地相角小于10度，或者最优选地相角小于6度。

在另一个实施方案中，当使用快速粘度仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序，将本发明的淀粉在pH

6.5磷酸缓冲液中煮成悬液时，当淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时，以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时，本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下相角小于糯性淀粉，或者优选地相角小于12度，或者再更优选地相角小于10度，或者最优选地相角小于6度。

在一个实施方案中，当使用快速粘度仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序确定的仪器条件，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5％淀粉(干重％)悬液时，以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时，本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下，随着振荡频率升高G′成比例的升高低于糯性淀粉，或者优选地，在低于屈服应变的试验应变下当振荡频率从0.1rad/s升高到100rad/s时，升高不到3倍，或者再更优选地，在低于屈服应变的试验应变下当振荡频率从0.1rad/s升高到100rad/s时，升高不到40Pa，或者最优选地，在低于屈服应变的试验应变下当振荡频率从0.1rad/s升高到100rad/s，升高不到30Pa。

在一个实施方案中，当使用快速粘度仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成淀粉悬液时，当淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时，以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时，本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下，随着振荡频率升高G′成比例的升高低于糯性淀粉，或者优选地，在低于屈服应变的试验应变下当振荡频率从0.1rad/s升高到100rad/s时，升高不到3倍，或者再更优选地，在低于屈服应变的试验应变下当振荡频率从0.1rad/s升高到100rad/s时，升高不到40Pa，或者最优选地，在低于屈服应变的试验应变下当振荡频率从0.1rad/s升高到100rad/s时，升高不到30Pa。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉当掺入食品中时，在低于屈服应变的应变下，其振荡频率依赖性小于用糯性淀粉同样配制制成的食品，其振荡频率依赖性大于或等于正常淀粉。

本发明提供一种淀粉，在胶凝或糊化后它具有高于或等于正常淀粉的低温稳定性。

在优选实施方案中，淀粉来自于一种玉米植物。

在其它实施方案中，该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。

在一个实施方案中，本发明的淀粉具有等于或低于正常淀粉的差示扫描量热退减焓(differential scanning calorimetry retrogradationenthalpy)；或者优选地在淀粉胶凝后差示扫描量热退减焓低于正常淀粉，方法是以每分钟10℃加热淀粉至140℃，冷却至4℃，在4℃下保持7天，然后在以每分钟10℃将淀粉从5℃重新加热至140℃后分析观察到的退减焓；或者最优选地，差示扫描量热退减焓为3.5J/g-10J/g，方法是将25％w/w的淀粉水悬液以10℃/min加热到140℃，冷却至4℃，在4℃下保持7天，然后以10℃/min将淀粉从5℃重新加热到140℃进行分析。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的差示扫描量热直链淀粉-脂类复合物焓低于正常淀粉；或者优选地平均直链淀粉-脂类复合物焓低于1.2J/g，最优选地低于1.1J/g。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的糊稳定性高于正常淀粉，其检测是根据用本发明的淀粉制备的糊在两个贮藏时间点之间的流变性质的改变。

本发明提供一种淀粉，它能形成不同于糯性或正常淀粉的凝胶结构。

在优选实施方案中，淀粉来自于一种玉米植物。

在其它实施方案中，该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。

在一个实施方案中，本发明的胶凝淀粉在有用的淀粉含量时，或者淀粉含量为2-80％，优选地淀粉含量为2％-40％，更优选地淀粉含量为2％-20％，最优选地淀粉含量为5-15％形成凝胶的能力强于糯性淀粉。

在另一个实施方案中，当使用快速粘度仪和Newport科学方法1(STD1)版本5的方法指定的仪器条件，将本发明的淀粉煮成10％淀粉(干重％)悬液时，以及当产生的糊在4℃下贮存7天而几乎没有水分损失时，本发明的胶凝淀粉形成易变形的、高弹性的凝胶结构而不是薄膜，正常淀粉在相同浓度下形成脆的凝胶结构，或者优选地，当其含有10％胶凝淀粉固体时，形成如正常淀粉一样易碎的凝胶，或者更优选地，当其含有10％胶凝淀粉固体时，具有高于50％的弹性，或者最优选地形成没有确定的断裂点、坚度低于30g-s、弹性至少为50％的凝胶。

本发明提供一种淀粉，其蒸煮粘性稳定性高于糯性淀粉。

在优选实施方案中，该淀粉来自于一种玉米植物。

在其它实施方案中，该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。

在一个实施方案中，当使用快速粘度仪和Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5％淀粉(干重％)悬液时，本发明的淀粉形成粘度的速度慢于在相同加热和剪切条件下蒸煮的糯性淀粉，优选地，糊化时间与峰时间之间的时间大于糯性淀粉的持续时间，更优选地，糊化时间与峰时间之间的时间大于90秒，最优选地糊化时间与峰时间之间的时间大于75秒。

在另一个实施方案中，当使用快速粘度仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成悬液时，以及当淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时，本发明的淀粉发展粘度的速度慢于在相同加热和剪切条件下蒸煮的糯性淀粉，优选地，糊化时间与峰时间之间的时间大于糯性淀粉的持续时间，更优选地，糊化时间与峰时间之间的时间大于90秒，最优选地糊化时间与峰时间之间的时间大于75秒。

在另一个实施方案中，当使用快速粘度仪4和Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5％淀粉(干重％)悬液时，本发明的淀粉达到峰粘度的时间晚于糯性淀粉，优选地峰时间大于4分钟，最优选地，峰时间大于5分钟。

在另一个实施方案中，当使用快速粘度仪4和Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成悬液时，以及当淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时，本发明的淀粉达到峰粘度的时间晚于糯性淀粉，优选地峰时间大于4分钟，最优选地，峰时间大于5分钟。

在另一个实施方案中，当使用快速粘度仪和Newport科学ST-01版本3加热与搅拌程序指定的仪器条件，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5％淀粉(干重％)悬液时，本发明的淀粉达到峰粘度的时间晚于糯性淀粉，最优选地峰时间大于4分钟。

在另一个实施方案中，当使用快速粘度仪和Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5％淀粉(干重％)悬液时，本发明的淀粉在达到峰粘度后失去粘性的速度慢于糯性淀粉，优选地分解粘度与峰粘度(B/P)之比小于35％，最优选地小于30％。

在另一个实施方案中，当使用快速粘度仪4和Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成悬液时，以及当淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时，本发明的淀粉在达到峰粘度后失去粘性的速度慢于糯性淀粉，优选地分解粘度与峰粘度(B/P)之比小于35％，最优选地小于30％。

在另一个实施方案中，当使用快速粘度仪4和Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5％淀粉(干重％)悬液时，本发明的淀粉形成糊，其终粘度高于糯性淀粉糊，优选地终粘度大于850cp，更优选地大于900cp；当使用快速粘度仪4和Newport科学ST-01修订版3的加热与搅拌程序指定的仪器条件，将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5％淀粉(干重％)悬液时，优选地终粘度大于650cp，更优选地大于700cp。

本发明包括在溶解的溶质存在下制备本发明的淀粉的溶胶和糊。

本发明包括制备本发明的淀粉的凝胶。

本发明包括制备本发明的淀粉的溶胶或凝胶，用于食品，如饼馅、布丁、汤、酱、肉汁、包衣、糖块和/或糖食，和/或酸奶和其它乳制品。

本发明包括向食品中添加本发明的淀粉作为一种配料，如饼馅、布丁、汤、酱、肉汁、包衣、糖块和/或糖食，和/或酸奶和其它乳制品。

本发明提供一种淀粉，其直链淀粉含量介于糯性淀粉与正常淀粉之间。

在优选实施方案中，该淀粉来自一种玉米植物。

在优选实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为1.5％-15％重量。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为2％-15％重量。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为2.5％-15％重量。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为3.5％-15％重量。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为1.5％-10％重量。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为2％-10％重量。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为2.5％-10％重量。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为3.5％-10％重量。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为1.5％-8％重量。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为2％-8％重量。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为2.5％-8％重量。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉的直链淀粉含量为3.5％-8％重量。

在另一个实施方案中，该淀粉是一种马铃薯淀粉，其直链淀粉含量为3.5％-12.5％，更优选地为4％-12.5％。

在另一个实施方案中，该淀粉是一种小麦淀粉，其直链淀粉含量为1.5％-15％，更优选地为2.5％-15％，最优选地为3％-10％。

在另一个实施方案中，该淀粉是一种水稻淀粉，其直链淀粉含量为1.5％-15％，更优选地为3％-15％，最优选地为3％-6％。

在另一个实施方案中，该淀粉是一种大麦淀粉，其直链淀粉含量为1.5％-15％，更优选地为7％-15％。

本发明提供在小麦、大麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦或玉米的淀粉贮藏器官中形成本发明的淀粉的一种方法。

在优选实施方案中，含有淀粉的植物是一种玉米植物。

在其它实施方案中，该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。

本发明进一步提供从植物的产淀粉器官中提取的本发明的淀粉。

在优选实施方案中，这种含淀粉植物是一种玉米植物。

在其它实施方案中，该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。

在一个实施方案中，在诱变筛选后由繁殖结构生长而成的植物上形成淀粉贮藏器官。

本发明提供一种方法，用于在植物的淀粉贮藏器官中产生本发明的淀粉，包括下列步骤：对植物的花粉施以EMS，形成处理的花粉；用处理的花粉使植物自花传粉；选择至少含有一个突变的植物繁殖结构，它们表现为产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官；种植这些植物繁殖结构，产生其它植物繁殖结构；从表现为产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官的植物上选择繁殖结构；重复这个种植和筛选的循环，提高繁殖结构的数量；任选地，为了确保纯度，这些植物可以回交；提取淀粉，其中该淀粉是本发明的淀粉。该方法可包括增加这些植物繁殖结构的步骤。

本发明提供一种方法，用于在植物淀粉贮藏器官中产生本发明的淀粉，包括下列步骤：诱变植物的繁殖结构；由这些繁殖结构生长成植物；选择至少含有一个突变的植物繁殖结构，它们表现为产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官；种植这些植物繁殖结构，产生其它植物繁殖结构；选择表现为产生含有本发明的淀粉的其它淀粉贮藏器官的繁殖结构；重复这个种植和筛选的循环，提高繁殖结构的数量；任选地，为了确保纯度，这些植物可以回交；提取淀粉，其中该淀粉是本发明的淀粉。该方法可包括增加这些植物繁殖结构的步骤。

本发明提供一种方法，用于在植物淀粉贮藏器官中产生本发明的淀粉，包括下列步骤：诱变植物细胞；由这些细胞再生为植物；选择至少含有一个突变的植物繁殖结构，它们表现为产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官；种植这些植物繁殖结构，产生其它植物繁殖结构；选择表现为产生含有本发明的淀粉的其它淀粉贮藏器官的繁殖结构；重复这个种植和筛选的循环，提高繁殖结构的数量；任选地，为了确保纯度，这些植物可以回交；提取淀粉，其中该淀粉是本发明的淀粉。该方法可包括增加这些植物繁殖结构的步骤。

其它方法步骤可以是种植这些繁殖结构产生植物的步骤，旨在形成更多的繁殖结构，它们将在含淀粉植物上产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官，或者是收获繁殖结构的步骤，或者含淀粉植物与产生本发明的淀粉的第二种植物杂交的步骤，其中在至少一种植物上形成杂种繁殖结构，以及收获繁殖结构的另一个步骤。

本发明的范围内也包括为了提取淀粉收获淀粉贮藏器官的步骤。

本发明也能够描述为一种产生植物的方法，该植物产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官，该方法包括下列步骤：在植物的waxy基因座内诱导至少一个突变；从至少含有一个突变的植物上选择繁殖结构；由这些繁殖结构生长为植物；在植物上形成繁殖结构；从淀粉贮藏器官中提取本发明的淀粉。

更具体而言，该突变位于植物基因组内的淀粉有关基因座waxy基因座内，再更具体而言，该突变是一个点突变。

本发明也包括一种产物，它是从一种植物的淀粉生产器官中提取的本发明的淀粉，包括至少含有一个突变的植物产生的淀粉，最初用EMS和至少一个突变诱导为该植物的遗传祖先，其中植物的淀粉贮藏器官产生本发明的淀粉。

在另一个实施方案中，在用来降低正常植物中GBSS酶活性的植物转化后，通过选择形成淀粉贮藏器官。

本发明也能够描述为一种产生植物的方法，该植物产生本发明的淀粉，该方法包括下列步骤：诱导种子植物的淀粉相关基因座的反义构建体；从含有该反义构建体的植物上选择繁殖结构；由这些繁殖结构生长为植物；在植物上形成淀粉贮藏器官；从淀粉贮藏器官中提取本发明的淀粉。

本发明也提供编码颗粒结合的淀粉合酶的cDNA，其含有序列SEQ ID NO：2。

在另一个实施方案中，在用来提高糯性植物中GBSS样酶活性的植物转化后，通过选择形成淀粉贮藏器官。

本发明也能够描述为一种产生植物的方法，该植物产生本发明的淀粉，该方法包括下列步骤：诱导种子植物的淀粉相关基因座的有义构建体；从含有该有义构建体的植物上选择繁殖结构；由繁殖结构生长为植物；在植物上形成淀粉贮藏器官；从淀粉贮藏器官中提取本发明的淀粉。

本发明也能够描述为一种产生植物的方法，该植物产生本发明的淀粉，该方法包括下列步骤：诱导淀粉贮藏植物的淀粉相关基因座的表达构建体，该植物在直链淀粉形成中含有突变；从含有该表达构建体的植物上选择繁殖结构；由繁殖结构生长为植物；在植物上形成淀粉贮藏器官；从淀粉贮藏器官中提取本发明的淀粉。

本发明还提供转化的植物，它们以有义方向含有一个或多个拷贝的cDNA。

本发明也提供颗粒结合的淀粉合酶，其含有氨基酸序列SEQ IDNO：4。

在本发明的其它实施方案中，含淀粉植物可以是任何谷类植物(如小麦、大麦、高粱、水稻、燕麦、黑麦等)或任何淀粉形成植物。

在优选实施方案中，该植物是一种玉米植物。

在其它实施方案中，该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。

本发明广泛地提供植物的淀粉贮藏器官，其中含有具有独特蒸煮和功能性质的淀粉和直链淀粉含量低于15％的淀粉(这些淀粉在此被称为waxy-E淀粉)。

为了提高产物的弹性，本发明提供使用直链淀粉含量为3.5％-12.5％、更优选地为4％-12.5％的马铃薯淀粉。

为了提高产物的弹性，本发明提供使用直链淀粉含量为1.5％-15％、更优选地为2.5％-15％的小麦淀粉。

为了提高产物的弹性，本发明提供使用直链淀粉含量为1.5％-15％、更优选地为3％-15％、最优选地为3％-6％的水稻淀粉。

为了提高产物的弹性，本发明提供使用直链淀粉含量为1.5％-15％、更优选地为7％-15％的大麦淀粉。

为了提高产物的弹性，本发明提供使用直链淀粉含量为1.5％-15％、更优选地为2.5％-15％的玉米淀粉。

这些种子组EX385wx-E1、EX56wx-E1和EX12wx-E2已经根据布达佩斯条约的条款，在2001年9月27日分别保藏为EX385wxa、EX56wxa和EX12wxa，保藏于美国典型培养物保藏中心，10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，分配的保藏号分别为PTA-3730、PTA-3731和PTA-3732。

因此，本发明提供一种植物淀粉，其直链淀粉含量降低，EM大于(或者至少两倍于)同一植物种的糯性淀粉的EM，EM小于同一种的野生型植物的淀粉的EM，其中本发明的植物淀粉的AP比在同一种的野生型植物淀粉的0.5之内。在一个实施方案中，本发明的植物淀粉的EM至少为10帕，本发明的植物淀粉的AP比在同一种的野生型植物淀粉的0.5之内。

在一个实施方案中，本发明的淀粉如上所述，在用快速粘度仪4仪器和Newport科学方法1(STD1)版本5的加热、搅拌方案指定的仪器条件，将该淀粉煮成淀粉悬液，并且25℃贮存24小时后，测定EM。

在另一个实施方案中，本发明的淀粉在屈服应变以下的相角小于同一植物种的糯性植物淀粉的相角。

本发明的淀粉可以进一步表征为在屈服应变以下的凝胶特性多于同一植物种的糯性植物淀粉，凝胶特性少于同一种的野生型植物的植物淀粉。

本发明的淀粉也可以表征为当经受低于屈服应变的应变时，当振荡检测频率由0.1弧度/秒提高到100弧度/秒时，G’提高不到2倍。

而且，本发明的植物淀粉在按照RVA标准方法煮成10％淀粉(干重％)悬液，并且在4℃下贮存7天后，其坚度低于30g-s，高于1g-s，本发明的植物淀粉的AP比在相同种的野生型植物淀粉的AP比的0.5之内。

本发明的植物淀粉在按照RVA标准方法煮成10％淀粉(干重％)悬液，然后在4℃下贮存7天后，其具有至少50％的弹性，该植物淀粉的AP比在相同种的野生型植物淀粉的AP比的0.5之内。

本发明的植物淀粉根据RVA标准方法证实，在该淀粉以一定浓度蒸煮，使得以该浓度蒸煮的相同种的糯性淀粉的终粘度为600-850厘泊后，糊化时间与峰时间之间的时间超过75秒，该淀粉的AP比在相同种的野生型植物淀粉的AP比的0.5之内。

本发明的植物淀粉含有降低的直链淀粉含量，证实分解粘度与峰粘度之比小于35％，如在该淀粉以一定浓度煮熟，从而使得以该浓度煮熟的相同种的糯性淀粉的终粘度为600-850厘泊后通过RVA标准方法测定，该植物淀粉的AP比在相同种的野生型植物淀粉的AP比的0.5之内。

此处所述的淀粉可以从在植物waxy基因座内含有至少一个突变的植物中获得。

本发明的植物淀粉可以从选自玉米植物、马铃薯植物、小麦植物、水稻植物或大麦植物的植物中获得。

本发明提供产生本发明的淀粉的一种植物。

本发明的植物由于至少一个基因突变和基因转化，具有降低的GBSS活性。

本发明提供一种产生本发明的淀粉的方法，包括下列步骤：对植物的花粉施以EMS，形成处理的花粉，用处理的花粉或繁殖结构对植物授粉；收获由受粉的植物产生的M1繁殖结构；种植这些M1繁殖结构，由种植的M1繁殖结构收获M2繁殖结构，选择和/或筛选来自这种M2繁殖结构的淀粉。

本发明提供一种产生本发明的淀粉的方法，包括下列步骤：在含有淀粉贮藏器官的植物的淀粉相关基因座中诱导一个突变，从该突变植物上选择繁殖结构，由这种繁殖结构生长为植物，选择和/或筛选淀粉贮藏器官。

本发明提供根据如上所述、此处公开的方法选择和/或筛选的淀粉。

在一个实施方案中，本发明提供一种产生本发明的植物淀粉的方法，包括向该植物的遗传祖先内加入一个突变，其中该突变导致淀粉的产生。

本发明的植物可以是玉米植物、马铃薯植物、小麦植物、水稻植物或大麦植物。本发明进一步提供公开的植物的繁殖和非繁殖部分。

本发明提供一种分离的核酸分子，其编码一种多肽，该多肽具有氨基酸序列为SEQ ID NO：4的多肽的淀粉合酶活性。提供了编码或包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的核酸序列。此处进一步描述了含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的一种分离的核酸分子，由本发明提供。

本发明提供一种含有本发明的淀粉的溶胶或糊，以及含有它们的食品。本发明还提供本发明的淀粉的凝胶，以及含有它们的食品。在此也提供了含有本发明的淀粉的食品。在此也公开了制备此处所述的食品的方法，例如包括将本发明的淀粉、凝胶、溶胶、糊和/或溶胶与食用配料混合在一起。此处也提供了制备更具弹性的淀粉制品的方法，包括将此处所述的本发明的淀粉、凝胶、溶胶、糊和/或溶胶与需要更多弹性特性的可食用的和/或含淀粉的配料和/或成分混合在一起。

根据随后的说明书、附图和实施例，其它目的和优点将更加清楚。

淀粉是颗粒或粉状复合碳水化合物，这是植物中碳水化合物的主要贮藏形式。

直链淀粉含量是通过与标准比较测定的淀粉中直链淀粉的量，以干重为基础。

正常淀粉是从含有调节淀粉生物合成途径的预期基因的植物(野生型)种子中提取的淀粉，其直链淀粉含量平均为18％-28％。用碘染色后，正常淀粉被均匀染色为蓝色或紫色。

糯性淀粉是从植物种子中提取的淀粉，用碘染色后，被均匀染色为红色、褐色或红褐色。

未修饰的淀粉是从种子中提取的淀粉，它们未用化学物质或酶进一步处理，或者未用加热、冷却、压力或者旨在改变原始状态淀粉的化学、结构或流变学或组织性质的其它任何物理方法处理。

修饰的淀粉是如下任何淀粉，从种子中提取后用化学物质或酶处理，或用加热、冷却、压力或者旨在提取后改变原始状态淀粉的结构或流变学或组织性质的其它任何物理方法处理。

突变体是任何生物化学个体(例如DNA、RNA、蛋白质、酶)的描述，由于DNA序列的改变，它们在结构或功能或表达上与正常的不同。

突变是产生突变生物化学个体的DNA改变。

诱变的是为了在植物DNA中诱导突变，用诱变剂处理的任何植物组织。

糯性突变体是产生糯性淀粉的任何植物。这种淀粉在碘染色后被均匀染色为红色或褐色或红褐色。

繁殖结构。对于某些植物，可以是有花植物的受精的成熟胚珠，它含有胚芽或通常能够发芽产生新的植物。对于其它植物，通常可以是肉质的短地下茎，其带有小叶，在其叶腋中均有一个芽，可能能够产生新的植物。另外也可以是种子植物体的地下部分，它们通常来源于胚轴，作为吸收、通气和食品贮藏器官，或者作为固定和支持的工具，不同于茎，尤其是缺乏节、芽和叶。此外也可以是能够再生为新的植物的任何插条或组织。繁殖结构可以是植物的淀粉贮藏器官。

淀粉贮藏器官是植物贮藏淀粉的结构。可以是植物的繁殖结构。

溶胶或糊是一种液态胶体系统，其中连续相是一种液体，主要用于其粘性或其它流变学性质。

糊化是产生糊或溶胶的过程或行为。

凝胶是一种半刚性或刚性的胶状系统。

厘泊或cp是粘度度量单位，相当于1 x 10^-3帕秒(Pas)。

峰粘度是淀粉糊在处理中达到的最大粘度。

热糊粘度或HP粘度是淀粉糊在95℃ 2.5分钟后的粘度。

分解是淀粉糊粘度在处理过程中从其峰粘度降低到最小粘度。最小粘度在峰粘度一定时间后观察到。

终粘度是淀粉糊在处理结束时的粘度。

倒退(Setback)是淀粉糊粘度在处理过程中从达到的最小粘度升高到终粘度。最小粘度在峰粘度一定时间后观察到。

峰时间是在处理过程中达到峰粘度的时间。

糊化温度是在处理过程中检测到粘度开始升高时的温度。

糊化时间是在处理过程中检测到粘度开始升高时的时间。

GBSS(颗粒结合的淀粉合酶)酶活性或GBSS活性是在复性PAGE凝胶上显示的60kDa淀粉合酶的活性，有别于其它淀粉酶活性，因为它在KI/I₂染色后染色为浓密的蓝色或暗带，这是由于葡糖基单位通过形成(1-4)键，从反应混合物中的ADP-葡萄糖转移给聚丙烯酰胺凝胶基质中包埋的糖原或支链淀粉。

附图简述

图1.淀粉颗粒的碘染色特性。大批染色特性位于左侧，淀粉颗粒的代表性区域的染色特性位于右侧。淀粉名称标于图的左侧远处。所有糯性淀粉通过“wx”名称(实验室分离的)或“Waxy”名称(商业分离的)区别。所有waxy-E淀粉被命名为“wx-E1”或“wx-E2”名称。

图2.来自EX68背景和脱支EX52wxae淀粉的脱支正常淀粉和脱支糯性淀粉的高效大小排阻层析。示差折光率反应对洗脱时间作图。

图3.脱支糯性淀粉和脱支waxy-E淀粉的高效大小排阻层析。插图显示检测器的全部反应。在两张图中，示差折光率反应对洗脱时间作图。

图4.pH6.5缓冲液中的5％淀粉悬液的RVA粘度图，包括一个95℃ 2.5分钟的蒸煮步骤。粘度和温度对时间作图。

图5.pH6.5缓冲液中的5％淀粉悬液的RVA粘度图，包括一个95℃ 20分钟的蒸煮步骤。插图显示分析的前500秒，以更好地显示waxy-E淀粉相对于糯性淀粉的粘度发展延迟。在两张图中，粘度和温度对时间作图。

图6.使用95℃ 2.5分钟蒸煮步骤编程的RVA，在pH6.5缓冲液中制备的5％淀粉糊在1％应变时的频率依赖性(rad/s)。弹性模量和相角对频率作图。

图7.使用95℃ 2.5分钟蒸煮步骤编程的RVA，在pH6.5缓冲液中制备的5％淀粉糊在1rad/s频率时的应变依赖性。弹性模量和相角对应变(％)作图。

图8.异淀粉酶脱支的EX12wx-E2淀粉的高效阴离子交换层析。以纳库仑为单位的检测器反应对时间作图。

图9.EX68糯性淀粉、EX12wx-E2淀粉与EX52糯性直链淀粉-补充剂双突变淀粉的相对链长分布的比较。相对百分面积对聚合程度作图。

图10.(a)用复性梯度凝胶(7-20％)检测与未成熟的淀粉颗粒(14-23天)结合的淀粉合酶活性。等量的淀粉(基于鲜重)加样到每个道中。标出每一道的淀粉身份和种子成熟度。(b)用复性凝胶(7-20％)检测与成熟淀粉颗粒结合的淀粉合酶活性。等量的淀粉加样到每个道中。标出每一道的淀粉身份。

图11.(a)利用western blotting检测与未成熟淀粉颗粒(14-23天)结合的GBSS蛋白。标出每一道的淀粉身份和种子成熟度。(b)利用western blotting检测与成熟淀粉颗粒结合的GBSS蛋白。标出每一道的淀粉身份和种子成熟度。

图12.利用考斯蓝染色检测与未成熟淀粉颗粒(14-23天)结合的GBSS蛋白的量。标出每一道的淀粉身份和种子成熟度。

图13.(a)是一张示意图，显示用来改变核酸在植物中表达水平的植物转化载体的设计和限制酶切位点。(b)是一张示意图，显示用来向植物内引入核酸序列的植物转化的设计和限制酶切位点。

本发明描述了从植物(如玉米植物和/或产生waxy-E淀粉的其它植物)中提取的淀粉的产生、鉴定和检测。waxy-E淀粉具有几个特征，它们组合起来比糯性淀粉有所改良：

1)waxy-E淀粉产生高的峰粘度，在剪切和高温下保持高于糯性淀粉的粘度。

2)waxy-E淀粉具有独特的糊和凝胶流变性质。

3)waxy-E淀粉具有有用的低温糊和凝胶稳定性。

这些特性是waxy-E淀粉的独特分子组成的结果，主要在于waxy-E淀粉的直链淀粉含量低于大多数淀粉颗粒分布的10％。产生的直链淀粉是相对于正常淀粉贮藏器官的相对较高的GBSS活性和糯性淀粉贮藏器官的检测不到的GBSS活性而言，在淀粉贮藏器官中GBSS酶活性降低但是可以检测的结果。

另外，本发明也包括一种通过诱变或利用生物技术在植物中产生waxy-E淀粉的方法。

突变植物的产生和筛选

糯性淀粉可以从含有隐性wx基因的玉米、小麦、水稻、马铃薯或其它淀粉作物的繁殖种群中提取。该种群含有wx基因和对于wx基因纯合的修饰种质的选择。本发明允许生产能够在植物近交系或变种中产生waxy-E淀粉的植物。本发明包括这些植物能够通过花粉诱变产生这一发现。该方法在植物基因组内产生点突变。此处产生的waxy-E突变体是等位基因突变体。基因座与waxy基因座是等位基因的。当waxy-E基因座诱变时产生一种不同的表型：具有独特蒸煮和流变特性和低直链淀粉含量的一种淀粉，和含有具有部分活性的GBSS酶的淀粉贮藏器官。野生型的waxy基因编码颗粒结合的淀粉合酶(GBSS)，waxy-E突变体与waxy突变体一样在waxy基因座内含有一个点突变。

具有上述特征的本发明的改良作物可以通过对原种玉米近交系或植物种的任何变种进行下列花粉诱变方法产生。另外也能考虑产生相同waxy-E表型的其它技术方法，包括诱变、生物技术和繁育。

产生这些原种(在农业上称为高产量waxy-E突变体)的方法是一种公知的方法，称为诱变。该方法在Neuffer paper Maize GeneticNewsletter 45：146中概述。应当指出，甲磺酸乙酯(EMS)是一种诱导突变的化学品(诱变剂)。如同所有突变方法一样，突变的作用能够不利地影响农业性状，特别是植物产量。然而，初始种质优于通常形成低直链淀粉突变体的植物。因此，本发明的植物的总体农业性状比工业轮回选择(recurrent selection)或回交方法更容易保持和选择。根据Neuffer(1974，Maize Genetic Newsletter 45：146)所述的方法，通过用石蜡油中的EMS处理花粉，在近交系中诱导突变。对来自谷类不同植物基因型的大量近交系进行这种处理。该实施例将集中于玉米waxy-E突变体通过该方法的发育。这种诱变方法已经用于制备大量谷类突变体，包括糯性和直链淀粉-补充剂。该方法确保waxy-E植物的产生和简单鉴定。为了发现推断的waxy突变体，需要筛选来自上百个植物系的上万个种子。在这组推断的waxy突变体中，需要第二次集中筛选才能发现waxy-E突变体。第二次筛选包括提高种子数量，从种子中分离淀粉，以及进一步检测产生的淀粉的蒸煮特性，检测产生的淀粉的直链淀粉含量，并检测种子的GBSS酶活性。只有在第二次集中筛选后，才能将推断的waxy突变体的少数突变体归类为产生waxy-E淀粉。通过正常和糯性植物的交叉授粉杂合组合正常(Wx)和突变(waxy)基因，在玉米中不能产生本发明的waxy-E淀粉。另外，通过混合来自正常植物和糯性植物的淀粉，产生直链淀粉含量低于15％的混合物，也不能再现低直链淀粉的特性。轮回选择和回交是由现有的waxy系产生waxy系的最常用技术，由现有的waxy系产生本发明的waxy-E淀粉将不会成功。另外，轮回选择和回交需要许多代来发育希望的植物，而本发明的waxy-E淀粉通过EMS诱变在一代内产生。

一种方法的普通步骤，用来获得产生本发明的waxy-E淀粉的植物系，包括用EMS处理近交系花粉(对于玉米)。来自近交系的花粉置于油中的EMS中。用颜料刷将花粉加到受体玉米穗的丝上。形成突变体-1(M1)种子。收获这些种子，生长并自花传粉，产生突变体-2(M2)谷粒。根据waxy表型目视检查获得的M2谷粒。与正常胚乳相比，传统上它是一种完全的不透明的胚乳。

下一步是通过自花传粉使种子增多。种子的增多可以在一代或多代期间发生，以获得足以进行分析、淀粉分离或进一步繁育的种子数量。

当获得足够的种子时，下一步是将推断的具有waxy种子表型的突变体与waxy突变近交系杂交，以初步证实谷粒实际上是waxy或waxy-E突变体。选择一种标准的waxy突变体或waxy-E或其它低直链淀粉突变体近交系。使突变植物生长，并与标准杂交，再次目视检查杂种种子的表型。如果突变体与标准相同，则杂种的谷粒在表型上应当彼此一致。因为突变基因是隐性的，所以使用该试验。

为了产生waxy-E淀粉，进一步筛选来自增多的种子来源的样品。方法是在水中再水合一个或多个谷粒(50℃ 1天)，然后碾碎种子，释放出淀粉。将碾碎的胚乳的样品加到显微镜载玻片上，向样品上添加一滴水，然后在湿润的样品上加盖玻片。向显微镜载玻片的一边添加一滴稀释的碘贮存溶液(2g/L碘，20g/L碘化钾，用水稀释10倍)，通过毛细管作用吸到胚乳样品内。然后在显微镜下检查盖玻片下的碘溶液的前缘。观察到蓝色染色的颗粒是表明诱变导致waxy-E事件产生的阳性指标。从含有推断的waxy-E淀粉的种子以及waxy表型种子中大规模分离淀粉，用于其它的检查和表征。

转基因植物的产生和筛选

有一些报告是关于利用不同植物中的大量淀粉合成基因在淀粉途径中进行工程修饰的载体。例如，美国专利号5,349,123描述了一种含有DNA的载体，其在植物细胞内形成糖原生物合成酶，在马铃薯淀粉中引入改变。本发明提供GBSS活性降低的一种淀粉贮藏器官，和植物中具有独特的流变学和低直链淀粉含量的一种淀粉，获得方法是通过改组、诱变或生物技术和/或繁殖方法，使waxy-E基因座处发生改变。

在本发明中，waxy-E基因座用下列方法产生：(a)标准重组方法，(b)合成技术，或(c)这两者的组合。分离的核酸也可以通过“改组”或目的核酸序列的一种或多种等位基因形式的部分的合成排列产生。Waxy基因座将通过点突变、反义技术和/或通过敲除(knockdown)的基因沉默、定点诱变、RNAi或本领域公知的其它任何方法修饰，产生本发明的淀粉。这些改变将降低/沉默Waxy基因的表达水平和/或改变其功能性质，从而降低相应的GBSS蛋白水平，和/或降低GBSS酶的活性。

在某些实施方案中，从任何产淀粉植物中克隆、扩增或构建具有多种功能的本发明Waxy基因座的希望和修饰的多核苷酸。本发明分离的的核酸组合物，如RNA、DNA和基因组DNA，能够利用本领域公知的多种克隆技术从植物或其它生物来源中获得。本发明所包括的来自不同种的功能片段能够利用在严格条件下选择性杂交的引物(12-200个碱基)获得。功能片段能够用多种技术鉴定，如限制性酶切分析、southern分析、引物延伸分析和DNA序列分析。本发明包括的变体可含有核酸或多肽序列的单个置换、缺失或添加。这些变化将改变、添加或删除编码序列中的一个氨基酸或小部分氨基酸。

本发明优选的核酸分子包括编码waxy-E基因座的DNA，含有通过任何或上述方法在来自任何生物的GBSS酶功能性中引入的修饰，包含(SEQ ID NO：2)所示的核酸序列。

为了克隆或表达，本发明的多核苷酸能够与载体、连接体、启动子、转运肽或接头附着。本发明优选的质粒适用于特定宿主。本发明的一种多核苷酸能够以有义或反义方向表达(参见附后的关于玉米的实施例，图13)。此处提供了如下质粒，其包含启动子，质体靶向序列，编码修饰的Waxy基因座、具有修饰的GBSS酶功能性的核酸序列，和终止序列(这些质粒适于插入编码具有修饰功能性的eGBSS酶的DNA序列，在选择的宿主中表达并产生EM(弹性模量)淀粉)。本发明包括含有适用于原核和真核宿主的启动子的质粒。所述启动子也可以具体适用于在单子叶植物或双子叶植物中表达。

可以向这些克隆和/或表达序列中添加其它序列，以优化它们在克隆和/或表达中的功能，帮助多核苷酸的分离，或促进多核苷酸向细胞内的引入。克隆载体、表达载体、连接体和接头的用途在本领域公知。

用于在宿主内表达waxy-E基因座的DNA构建体大致如下：

启动子     转运肽     修饰GBSS酶的     终止子

内含子^＊   编码区     编码区(waxy-E基因座)

^＊任选成分

本领域公知，启动子是控制转录的DNA区。将为不同宿主选择不同类型的启动子。Lac和T7启动子适用于原核生物，35S CaMV启动子适用于双子叶植物。聚遍在蛋白启动子适用于许多单子叶植物。其它合适的启动子包括玉米10kDa玉米醇溶蛋白启动子、GBSS启动子、ST1启动子、TR1启动子、napin启动子等。本领域范围内能够使用本领域公知的多种不同的启动子。可以是组成型、诱导型、组织特异的，对于所述植物可以是同源的或异源的。

本领域也公知，内含子是核酸序列内不编码基因产物的核苷酸序列。在单子叶植物中通常提高表达的内含子的一种成分是Adh1内含子。该构建体的这种成分是任选的。

转运肽编码区是编码蛋白质向细胞器(如质体和线粒体)易位的核苷酸序列。被使用该转运肽的宿主识别并且与之相容的转运肽是优选的。在本发明中，选择的质体是造粉体。一个例子是铁氧还蛋白转运肽。

优选地，杂种多肽位于细胞的造粉体内，如在造粉体中合成和贮藏淀粉的植物细胞。如果宿主是细菌或不含造粉体的其它细胞，则不需要转运肽编码区。

终止子是终止转录的DNA序列。

通过上述方法产生的多肽也可以包括本领域公知的翻译后修饰，如糖基化、酰化和不干扰该多肽的希望的活性的其它修饰。

本领域公知用来转化作物或其它宿主细胞的多种方法，可以使用提供高效转化/转染的任何方法。本发明的DNA构建体可以利用以下技术直接导入植物细胞的基因组DNA内，如电穿孔、颗粒轰击、硅纤维输送或植物细胞原生质体或胚胎发生愈伤组织的显微注射。DNA构建体也可以与合适的T-DNA侧翼序列组合，并且导入常规的根瘤农杆菌宿主载体中。

本发明提供提高或降低植物或其部分中编码GBSS酶的Waxy基因座的浓度或组成的方法。该方法包括用含有waxy-E多核苷酸的表达盒转化wx植物细胞，获得转化的植物细胞，然后在有利的生长条件下生长为植物，该植物在相当长的一段时间内表达修饰的GBSS蛋白质，并且导致产生本发明的淀粉。含有分离的核酸的植物细胞或植物部分通过本领域公知的方法筛选，包括southern blot，DNA测序或PCR分析，其中使用启动子特异的和核酸特异的引物，检测由此产生的扩增子。本发明的蛋白质来源于天然GBSS，是通过本领域公知的遗传多态性或合成操作在一个或多个位点处添加或置换一个或多个氨基酸。本发明的蛋白质能够在重组工程细胞(如细菌、酵母、昆虫和植物细胞)中表达。本发明的蛋白质可以用本领域公知的方法纯化。表达的蛋白质的检测通过本领域公知的方法实现，包括例如放射性测定、放射免疫测定、不同的电泳技术、western blotting技术或免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISAs)、免疫荧光测定、高效液相层析(HPLC)、薄层层析(TLC)等。

淀粉检测

淀粉的分离

淀粉可以根据需要以较大或较小规模分离；这些方法在文献中有详细描述(例如：Singh等人，1997，Cereal Chemistry 74：40-48)。所有waxy-E淀粉都可以用上述方法容易地大量分离，而其它单突变体通常观察到产量减少(例如直链淀粉-补充剂，糖质-2，无效)，最特别的是双突变体未观察到。另外，通过在50℃进行种子的初始再水合，分离方法能够提供证据表明可以用现有的处理技术从waxy-E种子中分离waxy-E淀粉，通常包括种子在50-55℃的初始再水合。

淀粉直链淀粉含量的分析

测定推断的waxy-E淀粉的直链淀粉含量。该试验基于以下事实：淀粉中存在的两种多糖成分形成具有不同分光光度特性的螺旋多碘复合物：线性直链淀粉与碘复合，形成深蓝色复合物，分支的短链直链淀粉与碘弱复合，呈红色(Bailey和Whelan，1961，The Journal ofBiological Chemistry，236：969-973；Banks等人，1971，CarbohydrateResearch17：25-33)。因此，糯性淀粉不同于其它淀粉，因为在常用的碘和碘化钾溶液存在下进行检测时，它们不能形成这种深蓝色复合物。waxy-E淀粉含有直链淀粉，因而形成这种蓝色复合物。

waxy-E淀粉、正常淀粉和/或糯性淀粉的直链淀粉含量的更精确测定可以如下进行：将碘染色的样品的分光光度吸光度与碘染色的直链淀粉和/或支链淀粉和/或糯性淀粉的标准相比较，进行计算。淀粉的直链淀粉含量的测定是根据来源于直链淀粉和waxy玉米淀粉的标准曲线(635nm的吸光度对碳水化合物浓度)的等式，以及根据使用Dubois等人(1956，Analytical Chemistry 28：350-356)的方法测定的每种未知溶液的总碳水化合物。Knutson和Grove(1994，CerealChemistry 71：469-471)使用一种类似的标准化，根据测定溶液的总碳水化合物含量修正淀粉的直链淀粉含量。因此，获得基于重量的直链淀粉含量。

本发明的waxy-E淀粉的直链淀粉含量为1.5％到8％-12％，这取决于样品的吸光度是否对样品中支链淀粉的低吸光度进行了修正。

淀粉物理性质的分析

本发明的waxy-E淀粉如下证实：使用几种仪器分析技术，检测它们与糯性和/或正常和/或其它淀粉的物理性质。这些仪器和技术能够用来定量评价一种淀粉相对于另一种的差异。因此，在食品或工业用途上，一种淀粉相对于其它淀粉的某些价值可以评价并测定。这些技术适用于未修饰的淀粉或修饰的淀粉，淀粉用本领域技术人员熟知的实践和技术修饰(Whistler，R.L.和BeMiller，J.N.1997.《碳水化合物化学，给食品学家》(Carbohydrate chemistry for Food Scientists)，Eagan Press，St.Paul，pp.137-150；Whistler和Daniel，1985，“碳水化合物”，《食品化学》(Food Chemistry)，O.R.Fennema编著，MarcelDekker，Inc.，New York，pp.118-121；Zheng，G.H.等人，1999，CerealChemistry 76：182-188；Reddy和Seib，2000，Journal of Cereal Science31：25-39)，以改善或改变淀粉的物理行为或化学结构。

所有这些仪器分析技术都需要知道淀粉的干固体含量。固体含量如下计算：测定淀粉的百分湿度，然后用100减去该值。淀粉的含湿量用美国谷类化学家协会的标准方法44-15A的一步湿度测定法测定(2000，方法44-15A，湿空气烘箱法，美国谷类化学家协会许可的方法，第10版，American Association of C ereal Chemists，Inc.，St.Paul，MN)。

差示扫描热量计(DSC)能够测定或计算使淀粉颗粒保持在一起的结构解离所需的能量(如热量)。有时，根据温差算术测定该热能。该解离过程，被称为胶凝，是吸热的(即需要能量输入)。正常淀粉在胶凝过程中经历两次热转化：一次在较低温度下的转化是由于淀粉链之间顺序的破坏(淀粉晶体的解离和淀粉双螺旋的解旋)，较高温度下的转化是由于直链淀粉-脂类复合物的解离。糯性淀粉未观察到直链淀粉-脂类转化，因为它们不含直链淀粉，且含有很少的脂类。DSC能够测定或计算使得已经部分重组为双螺旋和晶体结构的退减淀粉糊再解离所需的能量(如热量)。此能量(焓)是淀粉稳定性的一个量度，可能随淀粉的固体含量、贮存温度和淀粉的水环境而不同。waxy-E淀粉的淀粉成分的胶凝温度范围和焓与糯性或正常淀粉的淀粉成分的胶凝无法区别。在某些情况下发现直链淀粉-脂类解离吸热，但是这种吸热的量值(如焓)显著小于正常淀粉所观察到的。这些结果提供了另外一个证据，证实使用现有的处理技术可以从waxy-E种子中分离waxy-E淀粉，通常包括50℃以上的加热步骤。waxy-E淀粉的退减温度范围与糯性或正常淀粉的退减温度范围没有差别。然而，可以发现退减焓介于糯性与正常淀粉之间，尽管这主要取决于淀粉浓度和胶凝过程中加热淀粉的温度：胶凝过程中较高的加热温度比较低的加热温度导致更低的淀粉退减焓(Liu，Q.和Thompson，D.B.，1998，Carbohydrate Research314：221-235)。提高蒸煮温度，降低淀粉含量，或者通常增加淀粉颗粒的变构，waxy-E淀粉的退减焓将接近于糯性淀粉。

淀粉胶凝过程中和胶凝之后，淀粉流变学的评价通常用不同类型的仪器进行。通常以控制方式加热、冷却样品，通过连续剪切样品监测淀粉颗粒胶凝为糊。使用的一种仪器叫做快速粘度分析仪(RVA；Rapid Visco Analyser 4，Newport Scientific Pty.Ltd.，WarriewoodNSW，Australia)。淀粉悬液的快速粘度分析可以用该仪器提供的多种标准加热、冷却方案进行(匿名.1998.第7章，普通应用，《快速粘度分析仪使用手册》，Newport Scientific Pty.Ltd.，Warriewood NSW，Australia，p.36)，或者根据具体的加热、冷却、剪切速度方案编程。在最初的加热过程中，waxy-E淀粉在略高于糯性淀粉的温度下开始发展粘度。waxy-E淀粉也晚于糯性淀粉达到峰粘度，并且粘度比糯性淀粉保持更久。在有用的淀粉固体浓度内，所有waxy-E淀粉都显示比正常淀粉更高的峰粘度。最后，当糊冷却时，waxy-E淀粉显示比糯性淀粉更高的粘度。因此，相比糯性淀粉，waxy-E淀粉显示的粘度在蒸煮过程中保持更久，并且在蒸煮后重建。由于淀粉粘度的保持和热及剪切稳定性的提高通常是淀粉化学修饰的一个主要原因，本发明可以被视为化学修饰的淀粉的一个自然备选，或者被视为改善化学修饰的淀粉的一种来源。这些淀粉也可以在法律禁止某些化学修饰食用淀粉的国家使用。

除了剪切粘度测定外，也可以用振荡剪切流变仪对淀粉糊的流变性质进行更复杂的评价，该仪器能够检测粘糊或凝胶的弹性和粘性特性。Biliaderis(1992，“通过微小应变动态流变测定法表征淀粉网络”，《碳水化合物化学发展》，R.J.Alexander和H.F.Zobel编著.美国谷类化学家协会，St.Paul)详细描述了这些信息(descriptors)及其衍化。使物体变形的力通常可以分为两部分：一部分在变形过程中被材料丧失，一部分被样品保留，在变形力消失后重现。当施加力的面积标准化，并且应变标准化时(相对于样品的厚度或高度，样品变形的程度)，合力被称为“复数模量(complex modulus)”(缩写为G^＊)，保留的弹力被称为“储能模量(storage modulus)”(缩写为G’)，失去的力被称为“粘性模量(viscous modulus)”(缩写为G”)。G^＊、G’与G”之间的关系为：

$G*=\sqrt{{G\&prime;}^2+{G\&prime;\&prime;}^2}$

在一定的应变之上，淀粉糊保存施加给它的力的能力降低，因为淀粉分子之间的长期相互作用降低(长于每个变形循环所花费的时间)；开始发生上述现象时的应变被称为物质的“屈服应变(yieldstrain)”。对于强生物聚合物凝胶，如直链淀粉，屈服应变通常低于1％(Clark，A.H.和Ross-Murphy，S.B.，1987，Advances in PolymerScience 83：57-192)。在屈服应变以下，G^＊、G′和G＂仍相对恒定，施加给物质的应变的微小递增或递减对这些值没有影响。应变对糊的改变也可以通过观察物质的相角估计。相角表示物质如何接近于完全弹性的物质(相角为0度)或完全粘性的液体(相角为90度)。当样品上的应变升高超过物质的屈服应变时，物质的相角升高，因为该物质的长期结构降低，即在高应变下分子之间的连接断裂。弹性模量和粘性模量的频率依赖性也可以用流变仪检测。弹性和粘性模量对测定频率的依赖性是聚合物系统性质的一个指标：强频率依赖性表明系统与具有低长期顺序和低凝胶样特性的分散的随机相互作用的多糖分子有关，而弱频率依赖性表明系统内的结构相对固定，这是具有高凝胶样特征的聚合物凝胶的一个特征。因此，利用连续剪切测定和振荡流变学测定，可以评价淀粉糊的性质。在屈服应变以下，waxy-E淀粉糊的G’高于糯性淀粉。另外，在屈服应变以下，waxy-E淀粉糊的相角低于waxy糊表明waxy-E糊具有较高的弹性特征。此外，waxy-E淀粉糊的频率依赖性也低于糯性淀粉糊，表明waxy-E糊的凝胶样特征高于糯性淀粉糊。这些特征的结果是静止或处于低变形下的waxy-E淀粉行为的一个指标：waxy-E淀粉在其自身重量下流动的可能性较低，产生的糊不象糯性淀粉那样具有明显的粘性。

淀粉凝胶特征的评价可以用针入度计(penetrometer)和结构分析仪进行，该仪器能够将一个探针刺入或撤出固体或半固体样品，测定使探针移动一定距离所需的力。waxy-E淀粉在相对较低的浓度(10％w/w淀粉)下形成弱凝胶。此外，waxy-E淀粉的凝胶是独特的：它们不断裂，在变形后很大程度上恢复到最初的形状。恢复到最初形状的一个量度是凝胶的回弹力(resilience)，计算为探针撤回过程中的正力与探针刺入过程中的正力之比(坚度)。正常淀粉凝胶不显示这些特性：它们形成的凝胶在低变形下破裂，在作用于凝胶上的力消失后仍然变形。

在使用情况下，通常也对常作为食品或工业制品的一部分的其它淀粉检测淀粉的物理性质和益处。当存在溶解的溶质和其它物质如蛋白质和脂类时，淀粉通常具有不同的行为。制品的检测有助于证实具体一种淀粉的益处。通过对柠檬饼馅制品中waxy-E淀粉的检测，发现waxy-E淀粉的粘度和流变性质与分离的淀粉糊的性质一致。在贮存一天和一周后馅的流变性质的相似性还显示waxy-E淀粉具有有用的低温稳定性。

淀粉化学结构的分析

淀粉也可以分化，并且根据分子结构进行评价。评价淀粉分子物理结构之间的差异的一种方法是检测其链长分布。这种分布通常用高效凝胶渗透层析(GPC)(Klucinec和Thompson，1998，CerealChemistry 75：887-896)或高效阴离子交换层析(HPAEC)及脉冲电流测量(PAD)(Jane等人，1999，Cereal Chemistry 76：629-637)评价。本领域技术人员公知其它层析或类似的功能检测方法。众所周知，淀粉生物合成途径中的其它突变影响淀粉分子的结构，由于这些其它突变引起的淀粉分子结构的改变影响淀粉的物理性质(Jane和Chen，1992，Cereal Chemistry 69：60-65；Jane等人，1999，Cereal Chemistry，76：629-637；Klucinec和Thompson，1998，Cereal Chemistry75：887-896；Klucinec和Thompson，1999，Cereal Chemistry76：282-291；Klucinec和Thompson，2001a，Cereal Chemistry，已接受；Klucinec和Thompson，2001b，Cereal Chemistry，已接受)。使用HPAEC-PAD，在脱支的waxy-E淀粉、脱支的糯性淀粉或脱支的正常淀粉之间没有观察到链长分布的差异，聚合程度可达50个葡萄糖单位。这一结果表明，waxy-E淀粉的较短链的改变不会导致独特的物理行为，不同于短链分布改变的waxy直链淀粉-补充剂淀粉。

也可以利用GPC评价淀粉的直链淀粉含量，因为直链淀粉分子一般长于支链淀粉，GPC检测和分离方法通常最适于检测链长。HPAEC-PAD层析法对长于50-100个葡萄糖单位的链一般不敏感，这是由于该检测方法的限制。使用高效GPC，为较长淀粉链的检测选择层析柱组，发现脱支的糯性淀粉在43-53分钟时洗脱，而脱支的正常淀粉在30-53分钟时洗脱。脱支的糯性淀粉与脱支的正常淀粉在最早洗脱时间上的差异是由于正常淀粉的直链淀粉，它们在30-43分钟时洗脱。脱支的waxy-E淀粉含有少量但是可再生的淀粉链，它们在43分钟之前洗脱，表明它们含有糯性淀粉中不含的长链。对于正常淀粉，这种长链物质约占总质量的24-28％，对于waxy-E淀粉，占总碳水化合物质量的1.5％-约8％。长链物质被认为是直链淀粉。这种长链物质的存在和含量与较早前描述的通过碘染色进行的分光光度直链淀粉含量测定相一致。

植物杂种的产生

杂种植物的产生包括组合至少两种近交植物的遗传学。杂种玉米变种的发展包括三个步骤：(1)从不同种质库中选择植物；(2)选择的几代植物自花传粉，产生一系列近交系，尽管它们彼此不同，但是纯育且十分均一；和(3)使选择的近交系与无关近交系杂交，产生杂种子代(F1)。在玉米的近交过程中，这些系的活力降低。当两种无关近交系杂交产生杂种子代时，活力恢复。近交系的纯合和同质性的一个重要后果是，任何两种具体近交系的杂种总是相同。一旦鉴定了产生优良杂种的近交系，杂种种子就能够无限繁殖，只要近交亲本的同质性一直保持。本发明的近交突变体是隐性的。基因的隐性性质使得在生产杂种作物如玉米和杂种小麦中有必要在两种近交系中产生该事件。此外，杂种作物也可以用另一种植物产生，使得本发明的突变体对于其它亲本植物所含的性状是显性或半显性的。这两种近交系应当适当杂交，产生具有高产量并且具有可以接受的商品农业特征的杂种。例如，但并非作为限制，玉米中一种近交系能够来自硬茎(stiff stalk)家族，如B73，另一种可以是Mo17或其它Lancaster型。同样，掌握植物繁殖领域技术的繁育人员能够选择原种系，它们应当诱变，以进行可以接受的杂种杂交。此外，也能够用现有的商品近交waxy系中的近交系形成两个新杂种，每一个都含有希望的突变。在这种情况下，杂种的waxy-E特性将介于两个近交系的直链淀粉含量之间。能够选择含有希望的低直链淀粉淀粉的物理和结构性状的近交系，与含有相同突变、不同突变或其它突变的另一个近交系杂交，产生杂种。近交系也能够使用其它备选繁育方法，形成杂种或繁殖群体。

本发明主要涉及利用来自供体植物种的基因改变植物谷粒中的淀粉。此外，也能够使用来自单子叶植物的基因，利用本发明改变其它受体植物的淀粉。这可以通过诱变或繁育或本领域公知的多种基因工程技术实现。制备具有不同葡聚糖链延伸性质的杂种蛋白质也是可能的。

实施例

实施例1：淀粉的分离

根据下列由Eckhoff等人(1996，Cereal Chemistry.73：54-57)和Singh等人(1997，Cereal Chemistry 74：40-48)改进的方法，从玉米种子中分离淀粉。玉米粒(100g)与200mL水浸泡溶液(0.3％偏亚硫酸氢钠和0.5％乳酸)在烧瓶中混合。然后塞好烧瓶，混合物在50℃下保持48小时。48小时后，玉米用水漂洗一次，与150mL水一起转移到商品搅拌器(Vita-Mix Commercial Food Preparing Machine，modelVM0101，Vita-Mix Corp.，Cleveland，OH)的未改变的64液体盎司罐中，然后以可变速度设置＂5＂研磨4分钟，每分钟暂停10秒，以改进匀浆。将研磨的样品转移到一个#7网筛上，在其顶部正好配置一个4L的容器(Encore Plastics Corp.，Byesville，OH)。用150mL水漂洗，从网顶部的样品中去除其它淀粉。然后用筛网振荡器(CSC-Meinzer筛网振荡器，型号184800-000，CSC Scientific Company，Inc.，Fairfax，VA)振荡整个装置5分钟，设置为＂9＂，使用可变比变压器(Powerstat可变比变压器，117C系列，Superior Electric，Bristol，CT)输送100V。在振荡过程中，另外加入200mL水漂洗样品。通过筛网的物质回送到搅拌器的罐中，然后以可变速度设置“9”研磨2分钟，每30秒暂停5秒钟，以改进匀浆。产生的样品静置10分钟，之后滗析250-300mL液体。其余的样品转移到200目的筛网上，在其顶部恰好配置一个4L的容器。然后使用如前所述的筛网振荡器振荡整个装置5分钟，在此期间用以前滗析的液体和另外600mL水洗涤样品。通过筛网的样品至少静置1.5小时，此时首先滗析样品中的大多数液体，然后将其一部分回送到样品中，使比重为1.040-1.045。沿着以0.0104的上升运行比放置的2英寸×96英寸(W×L)铝通道，以55mL/min泵送淀粉-蛋白质浆。在淀粉-蛋白质浆之后立即沿此路线(talbe)泵送滗析的液体，随后是125mL水。必要时沿此路线移动黄色的蛋白质杂质，期间利用来自空洗瓶的压缩空气沿此路线泵送滗析的液体和125mL水。残留在线路前90英寸的白色淀粉在路线上风干至少18小时，然后刮到塑料称皿上。称皿中的淀粉在强迫通风的对流烘箱中30℃再干燥18小时，之后用零售的咖啡研磨机研磨为细粉，然后转移到贮存瓶中。需要时根据Singh等人(1997，Cereal Chemistry 74：40-48)所述大规模分离淀粉。

实施例2：淀粉的形态学和颜色

该实验用来说明waxy-E淀粉的低直链淀粉含量对waxy-E淀粉的碘染色特性的影响。

用显微镜研究如实施例1所述提取的waxy-E淀粉颗粒，并与已知的糯性和正常淀粉比较。另外也检测商品正常玉米(Cerestar-USA，C^＊Gel 03420)和糯性玉米淀粉(Cerestar-USA，C^＊Gel 04230)样品。光学显微镜研究显示，所有淀粉都有相似的形状，在交叉极化的光线下全都为高度双折射。将15mg淀粉悬浮在2.85mL水中检测淀粉的碘染色。碘-碘贮存溶液(2g/L碘，20g/L碘化钾)用水稀释100倍。向淀粉悬液中加入一等份(0.15mL)稀释的碘-碘贮存溶液。目视检查淀粉的颜色(图1)。所有waxy-E淀粉添加碘后都被染色为暗蓝紫色，与正常淀粉无法区分。只有糯性淀粉被染色为浅红褐色。在添加另外3个0.15mL等份的稀释碘-碘贮存液后，用光学显微镜检查淀粉颗粒之间的颜色均一性。当用显微镜检查图1中的悬液时，waxy-E淀粉主要被染色为蓝紫色，根据碘染色特性与正常淀粉无法区别(图1)。由于污染有正常淀粉，商品糯性淀粉与实验室分离的糯性淀粉能够清楚地区别开。对于商品糯性淀粉样品，每个显微镜视野含有一个或两个染色为蓝紫色的淀粉颗粒。

实施例3：直链淀粉含量和支链淀粉链比

这些试验用来证明，利用两种直链淀粉定量技术——碘结合和凝胶渗透层析，能够区别waxy-E淀粉与糯性和正常淀粉。

淀粉的直链淀粉含量利用Morrison和Laignelet(1983，Journal ofCereal Science 1：9-20)的方法的变型检测。微量离心管中的淀粉颗粒(8mg)通过在沸水浴中加热1小时，分散到0.4mL 90％二甲基砜中。样品在加热过程中每10分钟搅拌一次。加入1.6mL乙醇沉淀分散的淀粉，在室温下用微型离心机以3000×g离心5分钟。弃去上清液。淀粉沉淀用1.0mL乙醇洗涤两次，用1.0mL丙酮洗涤一次，每次如上所述离心样品。不含干扰直链淀粉测定的天然脂类的非颗粒淀粉在开盖微量离心管中风干至少2小时。干燥后，非颗粒淀粉通过在沸水浴中加热1小时分散到1.0mL 10％ 6M尿素和90％二甲亚砜溶液中。在加热过程中每10分钟搅拌样品一次。分散的样品(0.05mL)与10mL水和0.2mL碘-碘溶液(2g/L碘，20g/L碘化钾)混合。不含碳水化合物的空白溶液用相同的方法制备。利用Klucinec和Thompson(1998，Cereal Chemistry 75：887-896)的方法，由纯度至少为95％的实验室分离的直链淀粉制备正常的玉米直链淀粉标准(0.05mL 1、2、4、6、8mg/mL贮存溶液)。直链淀粉的纯度利用Klucinec和Thompson(1998，Cereal Chemistry 75：887-896)的凝胶渗透层析法证实。从已知的无GBSS糯性(无效)突变体分离的糯性玉米用作支链淀粉标准[除了0.1mL 6mg/mL贮存溶液(12mg/mL)和0.1、0.15、0.2mL 8mg/mL贮存溶液(16、24、32mg/mL)之外，分别0.05mL 2、4、6、8mg/mL贮存溶液]。16、24、32mg/mL支链淀粉标准中的其它DMSO对随后构建的标准曲线的线性没有影响。分光光度计用空白溶液在635nm处调零，之后测定其余溶液的吸光度。用于直链淀粉定量的标准曲线是：

直链淀粉(微克)＝[(635nm的碘溶液的吸光度)-[(支链淀粉标准曲线的斜率，单位为微克^-1)×(溶液中的总碳水化合物，单位为微克)]}/[(直链淀粉标准曲线的斜率，单位为微克^-1)-(支链淀粉标准曲线的斜率，单位为微克^-1)]

获得的值除以溶液的碳水化合物含量，然后乘以100，从而将单位为微克的表观直链淀粉转换为总淀粉的百分数。每种淀粉进行三次独立分析。结果示于表7中。

为了通过凝胶渗透层析分析直链淀粉含量，样品由正常淀粉(实验室分离的和来自Cerestar-USA的商品正常淀粉C^＊Gel 03420)、糯性淀粉(实验室分离的和来自Cerestar-USA的商品糯性淀粉C^＊Gel 04230)和实验室分离的waxy-E淀粉样品组成。微量离心管中的淀粉颗粒(5.5mg)通过在沸水浴中加热1小时，分散到0.4mL 90％二甲亚砜中。在加热过程中每10分钟搅拌样品一次。加入1.6mL乙醇沉淀分散的淀粉，在室温下用微型离心机以3000×g离心5分钟。弃去上清液。淀粉沉淀用1.0mL乙醇洗涤两次，用1.0mL丙酮洗涤一次，每次如上所述离心样品。获得的非颗粒淀粉在开盖微量离心管中干燥至少2小时。干燥的非颗粒淀粉与0.9mL水和0.1mL 100mM乙酸钠(pH4.5)混合，在沸水浴中加热1小时。在加热过程中每10分钟混合样品一次。加热后，样品在水浴中冷却至40℃。加入一种异淀粉酶悬液(0.001mL；分离自假单胞菌属(Pseudomonas)的种，Megazyme InternationalIreland Ltd，Co.Wicklow，Ireland)，颠倒样品几次，之后放回40℃水浴中。18小时后，样品在沸水浴中加热5分钟灭活酶。冷却样品，之后向1.8mL DMSO中加入0.2mL消化物。为了注射，0.5mL以9,000×g离心。高效GPC与作为层析系统一部分的示差折光率检测仪联合进行(Waters Breeze HPLC系统，由1515 socratic HPLC泵、Waters2414示差折光率检测仪和具有0.250mL注射环的Rheodyne 7725i型注射器组成，Waters Corporation，Milord，MA)。三个PL-Gel10micrometer Mixed-B(300×7.5mm)分析柱(Polymer Laboratories，Amherst，MA)和一个PL-Gel 10micrometer Mixed-B(100×7.5mm)保护柱(Polymer Laboratories，Amherst，MA)用来分离淀粉的成分链。该系统以0.5mL/min的流速运行，流动相是0.1％溴化锂的DMSO溶液。该系统用麦芽糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、麦芽三糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、麦芽七糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)标准和来自碳水化合物标准试剂盒(Polymer Laboratories，Amherst，MA)的平均分子量为788000、212000、47300、22800、11800和5900的支链淀粉标准校正。所有注射剂均为0.200mL。层析谱的监测和数据的分析用附带的软件(Breeze v.3.20)进行。EX68wx和EX68正常淀粉的层析谱在图2中显示。EX68wx、EX385wx-E1和EX12wx-E2的层析谱在图3中显示。从图2和图3中清楚地发现，糯性淀粉在43分钟之前看到可以忽略的区域。对于正常淀粉，层析谱的最小值在43分钟时观察到；该最小值被用作从该系统洗脱直链淀粉与脱支的支链淀粉之间的界线：直链淀粉在43分钟前洗脱，脱支的支链淀粉在43分钟后洗脱。计算43分钟之前洗脱的面积相对于总面积的百分比，用作淀粉的直链淀粉含量的量度(w/w)。如果在43分钟前观察到小面积，则平均多个层析谱的时间片，然后计算平均层析谱上43.0分钟之前和之后的相对面积。这样由所有层析谱计算的直链淀粉含量在表7中显示。

根据GPC层析谱计算AP比(支链淀粉链比)。AP比是46.01667分钟-51分钟之间的层析谱面积与43.01667分钟-46分钟之间的层析谱面积之比。

表7.淀粉的直链淀粉含量

^a用于计算淀粉的直链淀粉含量的注射数量示于括号中。

结果显示，EX56wx-E1、EX385wx-E1、EX78wx-E1和EX12wx-E2淀粉的直链淀粉显著少于正常淀粉。另外，这些试验的结果清楚地表明，低直链淀粉淀粉的直链淀粉含量也高于纯实验室分离的糯性淀粉。C^＊糯性淀粉高于实验室分离的糯性淀粉的直链淀粉含量可能是来自商业分离过程的正常淀粉污染的人工产物。另外，根据直链淀粉含量，waxy-E淀粉可以分成两组：一组的直链淀粉含量为1％-3％(wx-E1淀粉；EX56wx-E1，EX385wx-E1，EX78wx-E1)，另一组的直链淀粉含量为6％-8％(wx-E2淀粉；EX12wx-E2)。此外，注意到对于EX52wxae淀粉，用两种方法测定的直链淀粉含量显著不同。这是因为wxae淀粉具有改变的支链淀粉结构，能够产生一定的蓝色，导致较高的分光光度测定的直链淀粉含量。然而，当用层析法分析同一淀粉时，在43分钟之前从层析仪上洗脱下总面积的极小一部分，该面积实际上是可归因于这种淀粉的支链淀粉的峰的一部分(图2)。因此，在wxae淀粉中没有真正的直链淀粉。对于低直链淀粉淀粉，在43分钟后洗脱的淀粉链的分布与糯性淀粉没有区别，长支链淀粉链不会造成观察到的waxy-E淀粉的直链淀粉。因此，waxy-E淀粉的直链淀粉可以通过分光光度法和层析测定技术定量，这两种技术都产生类似的直链淀粉含量值。另外，据我们所知，waxy-E淀粉的低直链淀粉含量不能归因于长链支链淀粉。此外，结果显示，AP比在正常淀粉的AP比的0.5之内。wxae淀粉的AP比低于正常、糯性、waxy-E淀粉的1/2，表明ae突变对支链淀粉的链分布具有严重影响。

实施例4：淀粉胶凝——pH6.5时的糊化粘度谱——95℃ 2.5分钟——waxy-E、糯性和正常淀粉

该实验用来证实waxy-E淀粉具有独特的胶凝行为。淀粉胶凝过程中粘度改变的评价通常用快速粘度分析仪进行。

如《快速粘度分析仪使用手册》(匿名.1998.第7章，“普通应用”，《快速粘度分析仪使用手册》，Newport Scientific Pty.Ltd.，Warriewood NSW，Australia，p.20)所述制备一种pH6.5缓冲溶液。对羟基苯甲酸甲酯(0.8g；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和n-丙基对羟基苯甲酸酯(0.2g；Sigma-Aldrich)加入250mL烧杯中，向其中加入150mL水。悬液在搅拌下煮沸，溶解固体。将热溶液加入在1000mL量筒中的700mL蒸馏水中，之后使体积达到1000mL。向该溶液中加入：18.9g七水合磷酸二钠(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，2.0g苯甲酸钠(Sigma-Aldrich)和2.7g无水颗粒状柠檬酸(Sigma-Aldrich)。搅拌混合物，直到所有固体都溶解。使用正确校正的pH计，将混合物调节为pH6.5，如果pH高于6.5使用柠檬酸，或者如果pH低于6.5使用磷酸二钠。对于每种淀粉，将已知质量的淀粉(干重基础)称重到铝制快速粘度分析仪杯中(Newport Scientific Pty.Ltd)。然后用pH6.5缓冲液使样品达到28g的总质量。将RVA搅棒放到RVA杯中，然后以上下动作搅动搅棒15秒，悬浮淀粉。杯、搅棒和淀粉悬液然后转移到RVA中，立即开始仪器分析程序。淀粉浆最初10秒以960rpm混合，RVA分析的其余时间以160rpm混合，而温度用控制/分析软件调节(Thermocline for Windows v.2.2，Newport Scientific Pty.Ltd.)，按照下列标准1版本5(1997年12月)加热和搅拌程序：50℃保持1min，在3.7min内加热至95℃，95℃保持2.5min，在3.8min内冷却至50℃，50℃保持2min。当使用快速粘度分析仪4仪器时，这种方法是RVA标准方法。

对于该实施例而言，所有试验均使用干重1.4g的淀粉。

粘度图的分析用附带的软件进行。对每种淀粉的三次分析的数据在表8中显示，包括从Cerestar-USA获得的商品淀粉的样品(正常淀粉，C^＊Gel 03420；糯性淀粉C^＊Gel 02430)。举例说明的粘度图在图4中显示。

表8.快速粘度分析谱数据——pH6.5-2.5min 95℃

^a相对于峰粘度的百分分解。B/P＝{[分解(cp)]/[峰粘度(cp)]}×100

^b峰时间超过7.0分钟。

所有低直链淀粉淀粉和waxy-E淀粉都具有显著高于正常淀粉的峰粘度和终粘度，表明所有糯性和waxy-E淀粉在相对较低的淀粉浓度下在粘度发展方面优秀。另外，所有waxy-E和糯性淀粉都具有低于正常淀粉的糊化温度，表明所有这些淀粉开始建立粘度都早于正常淀粉。

waxy-E淀粉在许多方面与糯性淀粉不同(表8)。所有低直链淀粉淀粉都具有低于糯性淀粉的分解粘度；当视作waxy-E淀粉的绝对分解粘度时确实如此，但是当分解粘度被视为waxy-E淀粉峰粘度的百分比时(B/P，表8)，也降低。另外，所有waxy-E淀粉的峰时间都晚于糯性淀粉。所有waxy-E淀粉都具有高于糯性淀粉的终粘度。所有这些发现都表明，waxy-E淀粉发展粘度比糯性淀粉更慢，在处理过程中也保持并持续发展粘度，时间长于糯性淀粉。

此外，waxy-E淀粉也可以分为具有不同行为的两组：一组包括EX56wx-E1、EX78wx-E1和EX385wx-E1(wx-E1组，根据功能性质，参见表8)，另一组包括EX12wx-E2(wx-E2组，也是根据功能性质，参见表8)。这些分组与关于这此淀粉的直链淀粉含量所述相同(参见实施例3)。尽管上述所有waxy-E淀粉与糯性淀粉之间有共同的差别，但是每组获得这些性质的过程以不同的方法发生。wx-E1组的淀粉发展峰粘度类似于糯性淀粉，分解低于糯性淀粉，然后倒退(setback)的量类似于糯性淀粉，产生高于糯性淀粉的终粘度。wx-E2组的淀粉在介于正常淀粉与糯性淀粉之间的粘度时达到稳定期，没有显著的分解，然后发展显著的倒退(setback)粘度，产生高于糯性淀粉的终粘度。

实施例5：淀粉胶凝——pH6.5时的糊化粘度谱——95℃20min——waxy-E、糯性和正常淀粉

该实验用来进一步证实waxy-E淀粉具有独特的胶凝行为。淀粉胶凝过程中粘度改变的评价通常用快速粘度分析仪进行。

如《快速粘度分析仪使用手册》(匿名.1998.第7章，“普通应用”，《快速粘度分析仪使用手册》，Newport Scientific Pty.Ltd.，Warriewood NSW，Australia，p.20)所述制备一种pH6.5缓冲溶液。对羟基苯甲酸甲酯(0.8g；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和n-丙基对羟基苯甲酸酯(0.2g；Sigma-Aldrich)加入250mL烧杯中，向其中加入150mL水。悬液在搅拌下煮沸，溶解固体。将该热溶液加入在1000mL量筒中的700mL蒸馏水中，之后使体积达到1000mL。向该溶液中加入：18.9g七水合磷酸二钠(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，2.0g苯甲酸钠(Sigma-Aldrich)和2.7g无水颗粒状柠檬酸(Sigma-Aldrich)。搅拌混合物，直到所有固体都溶解。使用正确校正的pH计，将混合物调节为pH6.5，如果pH高于6.5使用柠檬酸，或者如果pH低于6.5使用磷酸二钠。对于每种淀粉，将1.4g淀粉(干重基础)称重到铝制快速粘度分析仪杯中(Newport Scientific Pty.Ltd)。然后用pH6.5缓冲液使样品达到28g的总质量。淀粉浆最初10秒以960rpm混合，RVA分析的其余时间以160rpm混合，温度用控制/分析软件调节(Thermocline for Windows v.2.2，Newport Scientific Pty.Ltd.)，按照下列ST-01版本3(1998年11月)加热和搅拌程序(Newport ScientificPty.Ltd.)：50℃保持0.5min，在2.5min内加热至95℃，95℃保持20min，在3.0min内冷却至50℃，50℃保持9min。粘度图的分析用附带的软件进行。对每种淀粉的三次分析的数据在表9中显示，包括从Cerestar-USA获得的商品淀粉的样品(正常淀粉，C＊Gel03420；糯性淀粉C^＊Gel 02430)。举例说明的粘度图在图5中显示。

所有waxy-E淀粉和糯性淀粉都具有显著高于正常淀粉的峰粘度和终粘度，表明所有糯性和waxy-E淀粉在相对较低的淀粉浓度下在粘度发展方面优秀。另外，所有waxy-E和糯性淀粉都具有低于正常淀粉的糊化温度，表明所有这些淀粉开始建立粘度都早于正常淀粉。

waxy-E淀粉在许多方面不同于糯性淀粉(表9)。所有waxy-E淀粉的峰时间都晚于糯性淀粉，表明waxy-E淀粉发展粘度比糯性淀粉更慢，在比糯性淀粉更严格的温度条件下也保持并持续发展粘度。另外，waxy-E淀粉发展显著高于糯性淀粉的倒退粘度和终粘度，这可归因于waxy-E淀粉中的形成结构的直链淀粉。

此外，如实施例3和4所述，waxy-E淀粉也可以分为具有不同行为的两组：一组包括EX56wx-E1、EX78wx-E1和EX385wx-E1(wx-E1组，根据功能性质，参见表9)，另一组包括EX12wx-E2(wx-E2组，也是根据功能性质，参见表9)。尽管上述所有waxy-E淀粉与糯性淀粉之间有共同的差别，但是每组获得这些性质的过程以不同的方法发生。wx-E1组的淀粉发展峰粘度类似于糯性淀粉，然后倒退，产生高于糯性淀粉的终粘度。wx-E2组的淀粉在介于正常淀粉与糯性淀粉之间的粘度时达到稳定期，然后发展显著的倒退粘度，产生高于糯性淀粉的终粘度。

表9.快速粘度分析谱数据——pH6.5-20min 95℃

^a相对于峰粘度的百分分解。B/P＝{[分解(cp)]/[峰粘度(cp)]}×100

^b在实验过程中达到的最高温度时观察到糊化，95℃。

实施例6：淀粉胶凝——pH6.5时的糊化粘度谱——95℃ 20min——waxy与正常淀粉的混合物

该实验用来证实用正常淀粉与糯性淀粉的混合物不能再现waxy-E淀粉的性质。

制备正常淀粉与糯性淀粉的混合物，产生整体直链淀粉含量在waxy-E淀粉的范围内的淀粉。检查的淀粉是实施例4使用的EX68的糯性和正常淀粉。制备的混合物的组成和混合物的直链淀粉含量在表10中显示。对于该实验，假定正常淀粉的直链淀粉含量为20％。

表10 淀粉混合物的组成

 

估计的直链淀粉含量(％)	正常淀粉EX68(干质量％)	糯性淀粉EX68wx(干质量％)
			02468	010203040	10090807060

用RVA标准方法制备淀粉糊。对于该实施例，所有试验均使用干重1.4g的总淀粉。混合物的性质在表11中显示。

向糯性淀粉中添加正常淀粉对淀粉的整体性质有4个明确的影响：(1)峰粘度随正常淀粉含量的增加而降低，(2)淀粉的分解随正常淀粉含量的增加而减少，如分解的绝对值和B/P比所示，(3)含有正常淀粉，淀粉的倒退粘度提高，(4)淀粉的峰时间随淀粉含量的增加而延长。这些行为中的一些似乎模拟waxy-E淀粉，特别是wx-E1组的淀粉(实施例4)，然而：

1)对于wx-E1组waxy-E淀粉，观察到比80％ EX68wx/20％ EX68混合物更高的峰粘度，与100％EX68wx淀粉相比，该混合物在峰粘度时显示相当大的下降。

2)wx-E1组waxy-E淀粉作为热糊在最小粘度时保持大大高于80％ EX68wx/20％ EX68混合物的粘度，该混合物具有类似于或低于EX68wx淀粉的热糊和最小粘度。对于正常淀粉增加的糯性和正常淀粉的混合物，B/P比降低似乎主要是由于随着直链淀粉正常淀粉含量提高，混合物的峰粘度降低，而不是分解粘度降低。

表11.快速粘度分析谱数据——pH6.5

 

样品	峰粘度(cp)	HP粘度(cp)	分解(cp)	B/Pa(％)	终粘度(cp)	倒退(cp)	峰时间(min)	糊化温度(℃)
									EX68wx	1133±3	616±4	573±14	50.6	633±10	73±7	4.1±0.0	755±0.5
90％EX68wx2％直链淀粉	1065	585	533	50.0	631	99	4.2	75.9
									80％EX68wx4％直链淀粉	1029	619	472	45.9	677	120	43	76.0
70％EX68wx6％直链淀粉	971	614	411	42.3	682	122	4.4	75.9
									60％EX68wx8％直链淀粉	903	628	333	36.9	675	105	4.8	75.9

^a相对于峰粘度的百分分解。B/P＝{[分解(cp)]/[峰粘度(cp)]}×1003)wx-E1组waxy-E淀粉具有高于糯性与正常淀粉的混合物的糊化温度和峰时间；这些性质似乎取决于混合物的糯性含量。

所有这些都表明，正常淀粉与糯性淀粉混合不能再现waxy-E淀粉的特性。

实施例7：淀粉糊结构——流变学

本实验用来证实waxy-E淀粉的流变性质。

用糯性淀粉(EX68wx，EX56wx，Cerestar-USA商品糯性淀粉C＊Gel02430)和waxy-E淀粉(EX385wx-E1，EX78wx-E1，EX56wx-E1和EX12wx-E1)制备淀粉糊。在预实验中，正常淀粉在贮存过程中胶凝，表明了它们的不稳定性和高弹性模量，因此它们不能流变学检测。

用RVA标准方法蒸煮淀粉。对于本实施例，所有试验均使用干重1.4g的淀粉。

在蒸煮后立即将每种糊转移到50mL试管中，置于25℃水浴中。18-22小时后用流变仪分析样品。贮存后，淀粉糊的频率和应变依赖性用流变仪检测(RFSIII流体分光计，Rheometric Scientific，Piscataway NJ)。所有糊都在25℃下测定。用一种平行板几何学进行检测(50mm；0.9-1.1mm缺口宽度)；所加样品在流变仪板之间放置10分钟，以减少加样对测定的影响。为了使试验过程中湿气蒸发最小，向流变仪板之间糊的暴露表面施加一薄层油膜。总是首先检测糊的频率依赖性，随后是应变依赖性。在振荡应变为1％时，糊的频率依赖性检测为0.1-100弧度/秒。在恒定检测频率为1弧度/秒时，糊的应变依赖性检测为0.1-1000％变形。淀粉的EM是淀粉在屈服应变以下和1rad/sec的振荡频率时的弹性模量，是使用一定浓度的淀粉用RVA标准方法蒸煮淀粉，使得从同一种的植物中提取的糯性淀粉的终粘度为600-850厘泊之后，并且在蒸煮的淀粉25℃贮存18-22小时之后，用该检测方法观察到的。

进行两次重复实验，第二次重复实验的分析顺序与第一次相反，以试图消除贮存时间对结果的任何混淆影响。淀粉糊的应变和频率依赖性在表12中显示。显示了每次重复实验的结果。图6和图7分别显示G′和相角对频率和G′和相角对应变的说明性图表。waxy-E淀粉糊的频率依赖性低于任何糯性淀粉糊(表12)，在频率为0.1-100弧度/秒时，G′大约提高2倍，与之相比，在同一频率范围上糯性淀粉糊通常提高5倍。waxy-E淀粉糊的较低的频率依赖性显示waxy-E淀粉糊比糯性淀粉糊具有更多的凝胶样特性。

waxy-E淀粉糊在1％应变时的弹性模量高于糯性淀粉糊的弹性模量，在所有情况下均超过接近10倍。另外，waxy-E淀粉糊在1％应变时的相角低于糯性淀粉糊的相角，表明与糯性淀粉糊相比，waxy-E淀粉糊的更高比例的复合模量是由于糊的弹性成分。因此，waxy-E淀粉糊在流变学上大大不同于糯性淀粉糊。

通过500-1000％的应变，waxy-E淀粉糊的弹性模量仍然高于糯性淀粉糊的弹性模量。另外，通过100-200％的应变，waxy-E淀粉糊通常保持低于糯性淀粉糊的相角。因此，waxy-E淀粉糊不仅保持相对较高的弹性模量，而且通过高变形具有相对高于糯性淀粉糊的弹性(作为复合模量的成分，如低相角所示)。

适中的弹性模量和低相角的这种组合表明，在低变形下，通过1％-200％的应变，waxy-E淀粉的行为比粘糊更类似于凝胶。此外，waxy-E淀粉也可以象以前的实施例一样分为两组(wx-E1和wx-E2)，wx-E2组的淀粉在比wx-E1淀粉更低的应变时产生。对于所有waxy-E淀粉，它们的凝胶行为不同于天然淀粉：糯性淀粉，如表12所示，不发展高弹性模量，甚至在低应变时也具有高相角，正常淀粉或直链淀粉的凝胶易小变形(另外参见实施例8)，常常象其它强生物聚合物凝胶一样，在0.1％-1％应变时时丢失相当大的弹性模量。

实施例8：淀粉糊的结构——针入度测量法(Penetrometry)

该实验用来证实waxy-E淀粉能够发展成凝胶，不同于相同浓度的糯性淀粉，waxy-E淀粉的凝胶没有与正常淀粉凝胶相同的特性。针入度测量用Takahashi和Seib(1988，Cereal Chemistry 65：474-483)和Yamin等人(1999，Cereal Chemistry 76：175-181)改进的方法进行。在实验之前，有一个旋盖的圆柱状塑料样品容器(58mm高，22mm内径)沿长轴锯成。该容器的一半用硅酮胶连接在一起，务必与容器开口端的螺纹盖的螺纹匹配。使焊接的容器结合在一起的胶粘剂然后干燥48小时。淀粉在快速粘度分析仪中(快速粘度分析仪4，NewportScientific Pty.Ltd.)在pH6.5磷酸缓冲液中糊化为10％(w/w)的淀粉浆：以160rpm搅拌，样品在50℃下保持1分钟，在3.7分钟内加热至95℃，95℃保持2.5分钟，在3.8分钟内冷却至50℃，然后在50℃保持2分钟。在用RVA制备样品完成后，样品容器中填充RVA产生的胶凝的糊。然后用螺纹帽盖上整个容器，用实验室薄膜缠绕该帽和样品容器的一部分。胶凝的淀粉糊在4℃下贮存7天。在分析前，从冰箱中取出淀粉样品，与室温平衡2小时。为了进行分析，分开样品容器的一半，凝胶(存在时)沿其短轴切成两片：这样提供两种样品进行分析，由于样品与样品容器的底部或顶部接触，因此没有边缘效应。必要时修整这些“接触”边缘，为凝胶试验提供水平表面。制备的凝胶用针入度计分析(结构分析仪TA-XT2i，具有一个5kg负载单元，StableMicro Systems，England)，该针入度计连接一台运行有关数据分析和仪器控制软件(Texture Expert Exceed version 2.55，Stable MicroSystems，England)的计算机。用Yamin等人(1999，Cereal Chemistry76：175-181)改进的方法进行分析。用一个具有直径4mm的平面的圆柱形探针刺入高度为1.5cm的凝胶样品。凝胶用探针以0.9mm/s的速度压缩7.5mm，并以相同速度撤出。刺入凝胶过程中观察到的峰力是硬度。可断裂性是刺入样品过程中观察到的最初的峰力，与向下移动的探针最初刺入样品有关。刺入过程中的力，作为曲线面积(克-秒)，是凝胶的坚度。记录撤出过程中作用于探针的正力为曲线面积(克-秒)。凝胶的弹性计算为探针撤出过程中的正力与探针刺入过程中的正力(坚度)之比。每个凝胶进行10次测量，每种特性去除2次最高的和2次最低的测量值；这些数据一般超出平均值的2倍标准差。针入度测量数据，作为每个凝胶6次刺入的平均值，在表13中显示。该实验进行两次；每种淀粉制备的两块凝胶的结果在表13中显示。

这些试验的结果清楚地表明，waxy-E淀粉能够发展成waxy-E或正常淀粉不能发展的结构。所有waxy-E淀粉都具有低于正常淀粉的硬度和坚度。另外，waxy-E淀粉凝胶的性质不类似于正常淀粉形成的凝胶：waxy-E淀粉凝胶不象正常淀粉凝胶一样破裂。而是，形成的waxy-E凝胶具有高度的弹性和可变形性，刺入过程中的力逐渐增加，从淀粉凝胶撤出探针过程中的力逐渐释放。这种行为与利用动态振荡流变测定法观察到的waxy-E淀粉糊的高度可变形性(实施例7)一致。

表13.淀粉凝胶结构特性

^aV＝变量。对于这些样品，在凝胶最初碎裂后，硬度大大不同。结果未报告，但是通常与硬度为相同的数量级。

^bNA＝不适用。淀粉是不能测定的粘性溶胶。

^cND＝未检测。这些凝胶未观察到初始碎裂点。而是，力持续稳定地增加，直到达到最大刺入深度。

实施例9：淀粉的胶凝——量热法(Calorimetry)

该实验用来说明waxy-E淀粉的温度范围和颗粒稳定性。如前所述，淀粉的胶凝温度谱的评价通常用差示扫描热量计(DSC)进行。

对于每种淀粉，将8.0mg(±0.2mg)淀粉(干重)称量到0.05mL不锈钢DSC样品盘中。样品然后用水加到约30mg的总质量，产生25％淀粉悬液(w/w)。记录淀粉和水的质量，根据添加的水的质量和淀粉的固体含量计算淀粉的浓度。然后密封样品盘，在室温下贮存约18小时。样品在DSC(Pyris 1差示扫描热量计，PerkinElmer Instruments，Norwalk，CT)中加热，以10℃/min从5℃升到140℃。胶凝的开始温度、峰温度、结束温度和胶凝的焓以及直链淀粉-脂类复合物(如果观察到)的吸热用控制/分析软件(Pyris Software v.3.81，PerkinElmerInstruments)计算。对于野生型淀粉，在当淀粉胶凝与必要时直链淀粉-脂类复合物解离吸热之间观察到重叠时，直链淀粉-脂类复合物的焓测定为85℃后总吸热的一部分。用一个空不锈钢盘作为参照，温度和焓校准用铟标准进行。表14显示了是至少三次重复的平均值的胶凝数据。

表14.淀粉胶凝温度和焓

 

样品	开始温度(℃)	峰温度(℃)	结束温度(℃)	焓(J/g)
					正常EX68淀粉-淀粉AM-脂C*正常淀粉-淀粉AM-脂	68.4±0.2NA<sup>＊</sup>69.8±0.383.9±1.6	71.9±0.1NA<sup>*</sup>73.1±0.298.8±2.9	76.7±0.2NA<sup>＊</sup>77.9±0.2107.4±0.6	16.8±0.52.9±0.517.3±0.42.2±0.3
wx淀粉EX68wx	67.8±0.1	74.0±0.3	79.3±0.2	18.7±0.4
					EX56wxC<sup>＊</sup>waxy	67.4±0.066.8±0.3	71.0±0.074.0±0.1	76.1±0.179.5±0.3	17.8±0.518.8±0.4
wxae淀粉EX52wxae	75.1±0.4	85.7±0.4	95.0±0.6	23.5±0.4
					waxy-E淀粉EX56wx-E1EX385wx-E1EX78wx-E1EX12wx-E2淀粉-淀粉AM-脂	67.5±0.466.1±0.168.8±0.170.3±0.287.8±2.0	70.9±0.272.1±0.374.3±0.174.3±0.3101.0±0.2	76.3±0.579.1±0.179.5±0.480.5±0.1107.1±1.5	18.8±0.818.3±0.818.6±0.319.5±0.71.1±0.2

^＊NA＝不适用。焓测定为总面积的一部分。吸热中未观察到开始温度、峰温度和结束温度。

这些试验的结果清楚地表明，waxy-E淀粉在胶凝温度范围和焓上类似于糯性淀粉和正常淀粉。对于至少一种waxy-E淀粉，也有足够的直链淀粉-脂类复合物焓，在胶凝过程中用DSC检测。观察到的waxy-E淀粉低于正常淀粉的直链淀粉-脂类复合物焓与waxy-E淀粉较低的直链淀粉含量一致。

实施例10：淀粉的稳定性——量热法

该实验用来说明waxy-E淀粉的糊稳定性。如上所述，淀粉在胶凝后能够重组。这种重组过程称为退减。重组的量是淀粉温度稳定性的一个评价指标，通常用差示扫描量热计(DSC)进行。

在以前的实施例(如上)中检测其胶凝性质的样品冷却至5℃，立即置于冰箱中，贮存7天。贮存后，从冰箱中取出样品，立即置于5℃的DSC室中，在DSC(Pyris　1差示扫描量热计，PerkinElmerInstruments，Norwalk，CT)中再加热，以10℃/min从5℃加热到140℃。胶凝的开始温度、峰温度、终点温度和退减吸热的焓利用控制/分析软件(Pyris Software v.3.81，PerkinElmer Instruments)计算。用一个空盘作为参照，温度和焓校准用铟标准进行。该方法用来测量淀粉的退减焓。退减数据在表15中显示。

表15.淀粉的退减温度和焓

 

样品	开始温度(℃)	峰温度(℃)	结束温度(℃)	焓(J/g)
					正常EX68淀粉-淀粉AM-脂C<sup>＊</sup>正常淀粉-淀粉AM-脂	35.6±0.187.9±0.834.8±0.987.7±0.4	51.9±0.697.5±0.451.3±0.996.5±0.6	65.1±0.2105.2±0.865.3±0.8105.6±2.7	7.8±0.21.6±0.48.6±0.21.4±0.1
wx淀粉EX68wx	40±6	54.2±2.1	66.3±0.3	2.9±0.3
					C<sup>＊</sup>waxy	35.2±1.0	57.0±1.4	68.1±4.9	2.8±0.4
wxae淀粉EX52wxae	36.2±0.4	70.8±0.5	84.5±0.5	13.9±0.6
					waxy-E淀粉EX56wx-E1EX385wx-E1EX78wx-E1淀粉-淀粉AM-脂EX12wx-E2淀粉-淀粉AM-脂	34.4±0.634.2±0.434.8±1.393±5.034.9±1.190±3	54.9±0.555.8±0.654.2±1.098±253.2±0.994.4±0.2	64.8±0.465.8±0.565.5±0.8108±365.0±0.6106±2	4.3±0.45.4±0.66.7±0.70.31±0.077.8±0.81.0±0.2

^＊NA＝不适用。这种淀粉的吸热具有两个峰，因此不能可靠地估计开始温度。

waxy-E淀粉的退减焓介于糯性淀粉与正常淀粉之间，表明waxy-E淀粉具有适中的低温稳定性。所有waxy-E淀粉的退减焓都低于或等于正常淀粉。对于至少两种waxy-E淀粉，也有足够的直链淀粉-脂类复合物焓，在退减分析过程中用DSC检测。观察到的waxy-E淀粉低于正常淀粉的直链淀粉-脂类复合物焓与waxy-E淀粉的较低的直链淀粉含量一致。

实施例11：淀粉的结构——高效阴离子交换层析

该试验用来说明waxy-E淀粉的短链分布。微量离心管中的淀粉颗粒(5.5mg)通过在沸水浴中加热1小时，分散到0.4mL 90％二甲亚砜中。样品由来自EX68系的糯性淀粉的两个独立事件(EX68wx1和EX68wx2)、wxae淀粉(EX52wxae)和4种waxy-E淀粉(EX56wx-E1、EX385wx-E1、EX78wx-E1和EX12wx-E1)组成。样品在加热过程中每10分钟搅拌一次。加入1.6mL乙醇沉淀分散的淀粉，在室温下用微型离心机以3000×g离心5分钟。弃去上清液。淀粉沉淀用1.0mL乙醇洗涤两次，用1.0mL丙酮洗涤一次，每次如上所述离心样品。获得的非颗粒淀粉在开盖微量离心管中干燥至少2小时。干燥的非颗粒淀粉与0.9mL水和0.1mL 100mM乙酸钠(pH4.5)混合，在沸水浴中加热1小时。在加热过程中每10分钟搅拌样品一次。加热后，样品在水浴中冷却至40℃。加入异淀粉酶悬液(0.001mL；分离自假单胞菌属的种，Megazyme International Ireland Ltd，Co.Wicklow，Ireland)，颠倒样品数次，之后放回40℃水浴中。18小时后，样品在沸水浴中加热5分钟灭活酶。冷却样品，之后0.4mL通过0.22微米的滤膜离心。立即将过滤的样品流入HPAEC系统中。HPAEC与作为层析系统一部分的脉冲电流测量检测器(PAD)联合进行(Dionex DX 500层析系统，包括一个GP40梯度泵，一个ED40电化学检测器和一个具有0.050mL注射环的Rheodyne 9125型注射器，Dionex Corp，Sunnyvale，CA)。Carbopac PA1(4×250mm)分析柱(Dionex Corp，Sunnyvale，CA)与Carbopac PA1(4×50mm)保护柱(Dionex Corp，Sunnyvale，CA)用来分离淀粉的成分链。该系统以1.0mL/min的流速运行，150mM氢氧化钠(流动相＂A＂)和150mM氢氧化钠中的500mM乙酸钠(流动相＂B＂)的梯度谱如下：0min，A:B::80:20；2min，A:B::80:20；10min，A:B::70:30；20min，A:B::50:50；60min，A:B::20:80；80min，A:B::20:80。谱中的所有梯度都是线性的。该系统用葡萄糖和聚合度(DP)为2-7的寡糖的混合物校准。在脱支淀粉层析谱中DP7后出现的峰，推测其DP比以前洗脱的峰长一个葡萄糖单位。所有注射剂都是0.050mL。层析谱的监测和数据的分析用附带的软件(Peaknet v.4.30)进行。这些淀粉都不含DP小于6的链。EX12wx-E2的层析谱在图8中显示。计算DP＝50时每个峰相对于总峰面积的百分比。这些百分比在表16中显示。EX68wx1、EX12wx-E2和EX52wxae的相对面积百分比图在图9中显示。

表16.DP＝50时，脱支的非颗粒淀粉的面积百分比

作为DP＝50或更低的一部分链，每种waxy-E淀粉的链分布不代表wxae(EX52wxae)淀粉观察到的范围。而是，waxy-E淀粉的链分布代表糯性淀粉观察到的链分布。如果长支链淀粉链是实施例3、4、5、7、8中所述的淀粉的蒸煮和物理性质和直链淀粉含量的原因，则预计链分布更加类似于wxae淀粉。这种层析分析与用来计算淀粉的直链淀粉含量的高效大小排阻层析(图3)的表现相一致。

实施例12：谷粒内淀粉生物合成酶的存在和活性的检测

这组实验用来证实waxy-E淀粉含有一种活性颗粒结合的淀粉合酶(GBSS)，其活性低于正常淀粉，商品糯性淀粉和实验室分离的糯性淀粉缺乏这种活性。

淀粉提取和淀粉颗粒的蛋白质分析

记录每种样品已知数量(1-5个谷粒)的干重，开始时用市售的咖啡豆研磨机研磨谷粒。随后在4℃下用Pro400匀浆器(Pro-ScientificInc.，Monroe，CT，USA)在TEB(组织提取缓冲液；50mM MES(pH7.5)，1mM EDTA，5mM DTT)中匀浆。获得的浆通过4-6层粗棉布(cheese-cloth)过滤，在4℃下以10,000rpm离心10分钟。保留上清液，沉淀用TEB洗涤2次，随后用2％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液洗涤一次。沉淀再次悬浮于TEB中，在4℃下以10,000rpm离心。弃去该洗涤液的上清液，沉淀贮存于-80℃直到进一步使用。在SDS-加样缓冲液(57mM pH6.8 Tris-HCI，2％SDS，9％甘油和一种还原剂加溴酚蓝)存在下蒸煮淀粉10分钟，回收颗粒结合的蛋白质。获得的浆冷却至室温，以10,000rpm离心10分钟。保留含有淀粉颗粒蛋白质的上清液进行电泳(见下)。这些蛋白质在SDS-PAGE或非变性-PAGE上电泳，以分别检测蛋白质水平及其活性(根据下述方法)。

SDS-PAGE(变性和非变性)和酶活性的检测

在非变性条件下的8％直线(对于Biorad MiniProtean III装置)或7％-20％梯度(Biorad Protean II)，在变性条件下(含0.1％十二烷基硫酸钠(SDS))的10％或12％的聚丙烯酰胺(37.5:1w/w丙烯酰胺:二丙烯酰胺)凝胶根据Laemmli(Laemmli，U.K.，1970，Nature 227：680-685)所述电泳。非变性凝胶含有0.1％兔肝糖原或马铃薯支链淀粉，在含有5mM DTT的电泳缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，1％SDS)中电泳。变性的凝胶含有0.1％兔肝糖原或马铃薯支链淀粉，在不含DTT的电泳缓冲液中电泳。在电泳结束时，变性凝胶在复性缓冲液(40mMTris，5mM DTT)中温育90分钟到2小时，每30分钟后更换一次溶液。非变性凝胶在5-10ml反应缓冲液[100mg/ml糖原，5mM ADPG，5mM谷胱甘肽，0.5mg/ml BSA，25mM乙酸钾，100mM二甘氨酸(pH8.5)，2M柠檬酸]中温育12小时，变性的SDS凝胶在相同缓冲液中温育48小时。在温育结束时，凝胶用碘溶液(2％KI和0.2％ I₂在0.01N HCl中)染色，检测具有淀粉合酶活性的带(图10a和10b)。该图清楚地显示所有waxy-E淀粉都有GBSS活性，waxy-E淀粉中的GBSS活性低于正常淀粉，实验室分离的糯性淀粉EX56wx或商品糯性淀粉没有活性。

Western Blotting

一块SDS凝胶(stacker 15mA和20mA，用于凝胶)浸泡于100mLTowbins缓冲液(25mM pH8.3 Tris-乙酸；192mM甘氨酸)中10分钟，使用一张硝酸纤维素膜。同时，制备由800mL Towbins缓冲液和200mL甲醇组成的Towbins转移缓冲液。浸泡的凝胶和磷酸纤维素膜在凝胶支架盒(由海绵、滤纸、凝胶、硝酸纤维素和滤纸组成)中夹心在一起。通过在海绵上滚压玻璃移液管，从盒中赶出气泡，夹住凝胶支架盒，置于转移印迹(transblot)模块中。Towbins转移缓冲液中的转移在300mA下进行1小时。硝酸纤维素膜用Ponceuau-S(Sigma，目录号P7767，由贮存液5:45ml稀释)染色10分钟。该膜然后在溶于TBS缓冲液+Tween 20(TBST：10mM pH7.5 Tris；150mM氯化钠；0.1％Tween 20)的5％脱脂奶中温育，室温下1.5-2小时，或者4℃过夜。之后，该膜与第一抗体(1:3000-60kDa)在室温下温育2小时，或者4℃过夜。然后在室温下用TBST洗膜3次，每次15分钟，随后与第二抗体(1:3000山羊抗兔IgG与AP的偶联物，Biorad，目录号1706518)在室温下温育1小时。然后在室温下用TBST洗膜3次，每次15分钟，通过膜的显色检测抗体与GBSS酶的交叉反应性，其中在10ml碱性磷酸缓冲液(100mM pH9.5 Tris-氢氧化钠，100mM氯化钠，5mM氯化镁)中，使用10mg5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP:Sigma，目录号B6777)在2mL二甲基甲酰胺中的33μl溶液和200mg四唑硝基蓝(NBT)在2mL 70％二甲基甲酰胺中的330μl溶液的混合物。然后用去离子蒸馏水洗膜。用5mM乙二胺四乙酸终止反应。为了检测淀粉样品中SSI蛋白质的水平，使用1:3000稀释的77kDa蛋白质的抗体进行如上所述的同一步骤。显色的膜在图11a和11b中显示。该膜清楚地显示，所有waxy-E溶液中都含有GBSS蛋白，而实验室分离的糯性淀粉中不含。两种商品糯性淀粉都显示极低水平的GBSS蛋白，可能来源于由于商品淀粉分离过程污染的正常淀粉(实施例1和图1)。

蛋白质的考马斯蓝染色

在凝胶电泳结束时，蛋白质用溶于缓冲液的考马斯蓝染色至少40分钟，该缓冲液含有43％去离子水，40％甲醇，17％冰醋酸，0.1％考马斯亮蓝R-250(Biorad)。凝胶用去离子水短暂漂洗，在含有50％去离子水、40％甲醇和10％冰醋酸(De-stain-l)的缓冲液中脱色20分钟，随后在含有88％去离子水、5％甲醇和7％冰醋酸(De-stain II)的缓冲液中脱色至少40分钟。在脱色程序结束时，凝胶在去离子水中浸泡，除去凝胶基质捕获的任何痕量乙酸。wx-E1淀粉在发育过程中的GBSS水平基本相当于野生型植物中的GBSS水平，如根据凝胶中与GBSS有关的带的染色水平所见(图12)。wx-E2淀粉的GBSS水平大大降低，如根据凝胶中与GBSS有关的带的染色水平所见。

实施例13：编码颗粒结合的淀粉合酶的核酸序列中点突变的鉴定

将来自EX385野生型和EX385wx-E1突变体种子的waxy基因测序，比较，鉴定EMS诱导的点突变。为此，从按照标准方案授粉17-18天后收获的未成熟谷粒中分离总RNA。用该RNA作为模板，使用逆转录酶根据标准方案合成互补DNA(cDNA)。然后用此cDNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板，用两对寡核苷酸引物通过常规方法扩增GBSS编码序列。然后用PCR扩增产物作为双脱氧核苷酸测序反应中的模板，该反应使用GBSS核苷酸序列特异的测序引物。上述方法的技术在《现代分子生物学方法》，JohnWiley & Sons，Inc.中描述。来自EX385和EX385wx-E1的序列彼此比较，并与公开数据库Genbank中可以获得的GBSS序列(保藏号X03935；SEQ ID NO：5)比较。来自EX385wx-E1的GBSS序列(SEQ ID NO：2)相对于来自EX385野生型的序列(SEQ ID NO：1)，有一个单碱基对改变，位于距转录起始位点的位点+1643处。这种突变将氨基酸484由EX385(SEQ ID NO：3)中的甘氨酸改变为EX385wx-E1(SEQ ID NO：4)中的丝氨酸。

实施例14：淀粉的用途——柠檬饼馅

该实验用来说明waxy-E淀粉在柠檬饼馅用途中的益处。柠檬饼馅用正常淀粉(EX68，Cerestar-USA商品正常淀粉C^＊Gel 03420)、糯性淀粉(EX68wx，Cerestar-USA商品糯性淀粉C^＊Gel 02430)和waxy-E淀粉(EX385wx-E1、EX56wx-E1、EX78wx-E1和EX12wx-E2)制备。柠檬饼馅使用下列配方(表17)：

表17.柠檬饼馅配方

 

配料	质量(％)	质量(40g规格)
			干配料砂糖淀粉(10％湿度)盐	25.544.550.19	10.221.820.08
液体配料水柠檬汁蛋黄	46.0911.719.66	18.444.683.86
			起酥油氢化植物油制起酥油(熔化的)	2.26	0.91

在大规模实验(总共制备500g，称为柠檬饼馅预混合物)之前，组合除了淀粉之外的所有干配料。为了每次单独分析，也预先组合液体配料(水、柠檬汁和蛋黄)。说明制品中每种淀粉的含湿量；所有制品都使用干重等质量的淀粉。用快速粘度分析仪作为温控混合器加工饼馅(40g)。为了制备饼馅，向RVA样品杯中加入淀粉和柠檬饼馅预混合物，用用于该样品的搅棒充分混合。制备的干配料和液体配料的混合物(不含起酥油)为pH3.3；表明该淀粉处于高度酸性环境。然后向含有干配料的RVA样品杯中加入液体配料，搅动搅棒在液体培养基中充分悬浮样品固体。柠檬饼馅以960rpm混合10秒钟，然后以160rpm混合蒸煮过程第一步的其余时间。蒸煮过程的第一步持续9分钟，期间用下列程序加热饼馅：配料在50℃下保持1分钟，从50℃加热到95℃ 7.5分钟，然后在95℃下保持0.5分钟。在蒸煮过程的第一步之后，在15分钟内向饼馅中加入熔化的植物油制起酥油。然后以480RPM搅拌饼馅15秒钟，掺入起酥油以及其它配料。以160RPM再次搅拌，持续蒸煮过程的其余时间：饼馅95℃再加热2分钟，在4.5分钟内冷却至50℃，然后在50℃下保持3分钟。整个蒸煮过程持续19分钟。蒸煮后立即向50mL试管中加入制成的柠檬饼馅，置于4℃冰箱中贮存。进行两次重复实验，第二次重复的分析顺序与第一次重复相反，以消除贮存时间对结果的任何混淆影响。

用正常淀粉制备的柠檬饼馅在4℃贮存24小时内形成高刚性的凝胶，在4℃贮存7天后严重脱水收缩。不在任一时间点对这些样品进行流变学测定。用糯性淀粉或waxy-E淀粉制备的柠檬饼馅样品在4℃24小时后和4℃7天后进行流变学分析；在4℃贮存一周的过程中没有样品脱水收缩。柠檬饼馅的频率和应变依赖性用流变仪(RFSIII流体分光计，Rheometric Scientific，Piscataway NJ)检测。所有饼馅都在25℃下测定。用平行的平板几何学进行检测(50mm；0.9-1.1mm缺口宽度)；所加样品静置于流变仪平板之间10分钟，以达到25℃，并且减少加样对测定的影响。为了使检测过程中的湿气蒸发最小，向流变仪平板之间的饼馅的暴露表面上添加一薄层油膜。总是首先检测饼馅的频率依赖性，随后是应变依赖性。在振荡应变为1％时，柠檬饼馅的频率依赖性检测为0.1-100弧度/秒。在1弧度/秒的恒定检测频率时，柠檬饼馅的应变依赖性检测为0.1-1000％变形。在4℃下贮存24小时和7天的用糯性和waxy-E淀粉制备的柠檬饼馅的应变和频率依赖性分别在表18和表19中显示。显示了每次重复的结果。

4℃贮存24小时的用waxy-E淀粉制备的饼馅显示低于任何糯性淀粉的频率依赖性(表18、19)，在0.1-100弧度/秒的频率时，G′增加2-3倍，与之相比，在同一频率范围内，糯性淀粉制备的饼馅通常提高5-10倍。用waxy-E淀粉制备的饼馅的频率依赖性较低，这表明waxy-E淀粉比糯性淀粉使饼馅具有更多的凝胶样特征。

用waxy-E淀粉制备的饼馅在4℃下贮存24小时后，其在1％应变时的弹性模量高于用糯性淀粉制成的饼馅的弹性模量，在所有情况下都超过4倍，对于所有wx-E1组淀粉大致为8-10倍。另外，在1％应变时，waxy-E淀粉饼馅的相角低于用糯性淀粉制成的饼馅的相角，表明与用糯性淀粉制成的饼馅相比，用waxy-E淀粉制成的饼馅的较高比例的复合模量是由于饼馅的弹性成分。因此，用waxy-E淀粉制成的饼馅在流变学上大大不同于用糯性淀粉制成的饼馅。

对于4℃贮存24小时的饼馅，在1000％应变时，用waxy-E淀粉制成的饼馅的弹性模量仍然高于用糯性淀粉制成的饼馅的弹性模量。另外，在200％应变时，用waxy-E淀粉制成的饼馅保持低于用糯性淀粉制成的饼馅的相角。因此，与用糯性淀粉制成的饼馅相比，用waxy-E淀粉制成的饼馅不仅保持相对较高的弹性模量，而且通过高变形保持相对较高的弹性(作为复数模量的一个成分，如低相角所示)。

最后，用waxy-E淀粉和糯性淀粉制成的饼馅在4℃贮存24小时与4℃贮存7天后具有类似的依赖频率的行为、依赖应变的行为、弹性模量大小和相角。24小时和7天后的测定的相似性表明，在4℃再贮存6天的过程中，饼馅的性质不会改变很多，表明含有waxy-E淀粉的制品的有用的低温稳定性。这些性质中任一项的较大改变将表明饼馅中其它结构的发展，对于需要在低温下延长贮存时间的用途来说是不希望的，如用于从wharehouse到零售口分布的即食饼的饼馅。糯性淀粉本身具有良好的低温稳定性，但是没有waxy-E所有的较高弹性。

由于高弹性和低温稳定性，waxy-E淀粉还可用于在食品制品(包括饼、布丁、汤、酸乳、酱和其它食品)中悬浮水果或其它大颗粒。糯性淀粉糊尽管是粘性的，但是不形成足以作为有用的悬浮助剂的糊结构。另外，由于waxy-E淀粉糊和凝胶的独特的流变性质，它们能用于食品的包衣和薄膜，如黄油包衣。一旦在表面沉积，waxy-E淀粉糊将比糯性淀粉更倾向于粘附于表面，而不是随重力流动。

尽管上述实施例具有许多特性，但是它们不应被视为限制本发明的范围，而只是用来说明本发明的某些优选实施方案。在其范围内，其它不同实施方案和衍生实施方案是可能的，易于被本领域技术人员理解。因此，本发明的精神和范围只受附加权利要求书限制，而不受上述说明书限制。

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此处引用的所有参考文献均全文引用作为参考。

序列表

<110>ExSeed Genetics

<120>淀粉

<130>

<140>

<141>

<150>60/329,525

<151>2001-10-01

<160>8

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>2263

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<223>野生型序列EX385

<400>1

<210>2

<211>2263

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>突变

<222>(1643)

<223>突变位于序列第1643位，起始位点之后1450bp

<220>

<221>突变

<222>(1643)

<223>野生型(EX385)中“G”在突变体中改为“A”

<400>2

<210>3

<211>600

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<223>野生型EX385序列

<400>3

<210>4

<211>600

<212>PRT

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>变体

<222>(484)

<223>甘氨酸(野生型)在残基484处突变为丝氨酸

<400>4

<210>5

<211>4800

<212>DNA

<213>玉蜀黍(Zea mays)

<220>

<221>转运肽

<222>(1233)..(1448)

<220>

<221>内含子

<222>(1554)..(1684)

<223>2号

<220>

<221>内含子

<222>(1766)..(1859)

<223>3号

<220>

<221>内含子

<222>(1959)..(2054)

<223>4号

<220>

<221>内含子

<222>(2145)..(2225)

<223>5号

<220>

<221>内含子

<222>(2290)..(2412)

<223>6号

<220>

<221>内含子

<222>(2514)..(2650)

<223>7号

<220>

<221>内含子

<222>(2761)..(2857)

<223>8号

<220>

<221>内含子

<222>(3102)..(3211)

<223>9号

<220>

<221>内含子

<222>(3395)..(3489)

<223>10号

<220>

<221>内含子

<222>(3682)..(3792)

<223>11号

<220>

<221>内含子

<222>(3880)..(3976)

<223>12号

<220>

<221>内含子

<222>(4106)..(4226)

<223>13号

<400>5

<210>6

<211>605

<212>PRT

<213>玉蜀黍

<220>

<223>颗粒结合淀粉合酶(玉米)参比序列

<220>

<223>保藏号X03035

<400>6

<210>7

<211>477

<212>PRT

<213>玉蜀黍

<220>

<223>淀粉合酶IIb-2(N-末端截短的SSIIb)

<400>7

<210>8

<211>641

<212>PRT

<213>玉蜀黍

<220>

<223>淀粉合酶IIa(SSIIa)

<400>8

Claims (17)

1.一种玉米淀粉，其直链淀粉含量降低，弹性模量EM大于糯性玉米淀粉的弹性模量EM，并且弹性模量EM小于野生型玉米淀粉的弹性模量EM，其中玉米淀粉的支淀淀粉链比在野生型玉米植物的淀粉的0.5之内，其中该玉米淀粉是由包含SEQ ID NO：2中所公开的核酸序列的玉米植物产生的。

2.权利要求1的玉米淀粉，其弹性模量EM至少两倍于所述玉米种的糯性淀粉的弹性模量EM。

3.权利要求1的玉米淀粉，其弹性模量EM至少为10帕，其中该玉米淀粉的支淀淀粉链比在相同种的野生型玉米的淀粉的0.5之内。

4.根据权利要求1的玉米淀粉，其中使用快速粘度仪4仪器和Newport科学方法1版本5加热和搅拌方案确定的仪器条件，将该淀粉煮成淀粉悬液，并在25℃下贮存24小时，然后测定弹性模量EM。

5.权利要求1-3中任一项的玉米淀粉，其在屈服应变以下的相角小于所述玉米种的糯性玉米淀粉的相角。

6.权利要求4的玉米淀粉，其在屈服应变以下具有比所述玉米种的糯性玉米淀粉更多的凝胶特征，和比相同种野生型玉米的玉米淀粉更少的凝胶特征。

7.权利要求1-3中任一项的玉米淀粉，当经受低于屈服应变的应变时，如果振荡检测频率从0.1弧度/秒提高到100弧度/秒，该淀粉的储能模量G’升高不到2倍。

8.权利要求1的玉米淀粉，在按照RVA标准方法煮成10％淀粉(干重％)悬液，并且在4℃下贮存7天后，其坚度低于30g-s，高于1g-s，其中该玉米淀粉的支淀淀粉链比在相同种野生型玉米淀粉的支淀淀粉链比的0.5之内。

9.权利要求1的玉米淀粉，在按照RVA标准方法煮成10％淀粉(干重％)悬液，然后在4℃下贮存7天后，其具有至少50％的弹性，其中该玉米淀粉的支淀淀粉链比在相同种野生型玉米淀粉的支淀淀粉链比的0.5之内。

10.权利要求1的玉米淀粉，在该淀粉以一定浓度蒸煮，使得以该浓度蒸煮的相同种的糯性淀粉的终粘度为600-850厘泊后，根据RVA标准方法证实，糊化时间与峰时间之间的时间超过75秒，该淀粉的支淀淀粉链比在相同种野生型玉米淀粉的支淀淀粉链比的0.5之内。

11.权利要求1的玉米淀粉，其直链淀粉含量降低，在该淀粉以一定浓度蒸煮，使得以该浓度蒸煮的相同种的糯性淀粉的终粘度为600-850厘泊后，通过RVA标准方法测定，证实分解粘度与峰粘度之比小于35％，该玉米淀粉的支淀淀粉链比在相同种野生型玉米淀粉的支淀淀粉链比的0.5之内。

12.一种用于生产权利要求1-3中任一项的玉米淀粉的方法，包括下列步骤：对玉米的花粉施以甲磺酸乙酯EMS，形成处理的花粉，用所述处理的花粉或繁殖结构对玉米授粉，收获受粉的玉米产生的突变体-1M1繁殖结构，种植这种突变体-1M1繁殖结构，由所述种植的突变体-1M1繁殖结构收获突变体-2M2繁殖结构，以及选择和/或筛选来自这种突变体-2M2繁殖结构的淀粉。

13.一种用于生产权利要求1-3中任一项的玉米淀粉的方法，包括下列步骤：在含有淀粉贮藏器官的玉米的淀粉相关基因座中诱发一个突变，从该突变玉米中选择繁殖结构，由这种繁殖结构生长为玉米，以及选择和/或筛选淀粉贮藏器官。

14.一种溶胶或糊，其包含权利要求1-3中任一项的玉米淀粉。

15.权利要求1-3中任一项的玉米淀粉的凝胶。

16.一种食品，其含有权利要求1-3中任一项的玉米淀粉。

17.一种含淀粉食品，其中包括权利要求1-3中任一项的玉米淀粉。

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