CN113174379B - 一种提高植物直链淀粉含量的多肽、核酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高植物直链淀粉含量的多肽、核酸及其应用，涉及突变型GBSS1多肽、核酸及其应用，具体地，涉及突变型GBSS1多肽、核酸及其在植物育种中的应用，具体地，本发明提供了一种突变型的GBSS1多肽，并且所述的突变型GBSS1多肽与亲本GBSS1多肽相比，在对应于SEQ ID NO.:1的第427位和/或第428位氨基酸发生突变。GBSS1突变后的植物具有很高的直链淀粉含量，在培育高直链淀粉含量植物中具有非常广阔的应用前景。

Description

一种提高植物直链淀粉含量的多肽、核酸及其应用

技术领域

本发明属于生物技术、作物遗传育种领域，涉及一种提高植物直链淀粉含量的多肽、核酸及其应用，具体涉及一种GBSS1突变型蛋白及其在提高植物中直链淀粉含量的方法与应用。

背景技术

稻米(Oryza sativa)被世界人口的2/3所食用，是至少其中一半人口饮食中的主要能量来源。大米是一种低成本食品，制备简便，快速，并且可以与各种菜肴搭配食用。

水稻主要由碳水化合物组成，在胚乳中主要以淀粉(90％)的形式存在。淀粉广泛用于食品，造纸和化学工业。淀粉根据结构不同，可以分为直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉本质上是线性分子，其中D-葡萄糖单元通过α-1.4糖苷键连接，而支链淀粉同时包含α-1.4和α-1.6键。不同品种的稻米中直链淀粉和支链淀粉的比例存在很大差异。

在水稻中，颗粒结合淀粉合成酶(GBSS1)由Waxy(Wx)基因编码，该基因可以控制胚乳中的直链淀粉合成，Waxy位点内的自然等位基因变异是影响大米中的直链淀粉含量(AC)的主要原因。

CRISPR/Cas基因编辑技术是近几年新兴的基因工程技术，其是由guideRNA介导的DNA切割技术，针对Cas的不同已经开发出多种编辑系统。基因组编辑及商户可以定向修饰基因组，加速了育种进程，是实验精准育种的重要技术突破。

CRISPR/Cas编辑技术可以实现4种定点编辑：第一种是基因的定点敲除，Cas蛋白在靶向RNA(gRNA)的指导下识别和切割靶点，产生双链DNA断裂；断裂的DNA通常以非同源末端连接(NHEJ)来修复；在修复时容易产生移码突变以破坏这个基因。第二种是对靶标进行同源置换来更换靶标序列或者定点插入。在产生双链DNA断裂时，如果在附近存在同源修复模板，这时可能发生同源置换或定点插入。同源置换的效率较低，并随着要置换的序列的长度增长而变得更低。第三种是单碱基编辑。单碱基编辑是利用CRISPR/Cas系统将脱氨酶靶向基因组中特定的位点从而对特定碱基进行修饰的基因编辑方法。此种方法已经在水稻中成功运用。第四种是基因组引导编辑技术。引导编辑是将逆转录酶与cas9切口酶结合，在单链引导RNA引导下，按转录模板进行点突变、插入或缺失突变的编辑方法。

目前，暂无通过突变waxy基因而提升直链淀粉含量的报道。

发明内容

本发明目的是提供一种可提高植物中直链淀粉含量的突变型GBSS1多肽、编码所述蛋白或片段的多核苷酸及其应用。

一方面，本发明提供了一种颗粒结合淀粉合成酶(GBSS1)的突变多肽，所述突变多肽与亲本颗粒结合淀粉合成酶(GBSS1)的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的第427位和/或第428位氨基酸处发生突变。

在一个实施方式中，所述亲本GBSS1第427位氨基酸为谷氨酰胺(Q)，第428位氨基酸为谷氨酸(E)。

在一个实施方式中，所述第427位的谷酰胺酸(Q)突变为非谷酰胺酸(Q)的氨基酸，所述非谷酰胺酸(Q)的氨基酸选自下组的一种或多种氨基酸：丙氨酸(A)、缬氨酸(V)，甘氨酸(G)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，苯丙氨酸(F)，色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，天冬氨酸(D)，天冬酰胺(N)，谷氨酸(E)，赖氨酸(K)，甲硫氨酸(M)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，半胱氨酸(C)，脯氨酸(P)，组氨酸(H)或精氨酸(R)。

在优选的实施方式中，所述427位的谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)

在一个实施方式中，所述428位的谷氨酸(E)突变为非谷氨酸(E)的氨基酸，所述非谷氨酸(E)的氨基酸选自下组的一种或多种氨基酸：丙氨酸(A)、缬氨酸(V)，甘氨酸(G)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，苯丙氨酸(F)，色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，天冬氨酸(D)，天冬酰胺(N)，赖氨酸(K)，谷氨酰胺(Q)，甲硫氨酸(M)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，半胱氨酸(C)，脯氨酸(P)，组氨酸(H)或精氨酸(R)。

在优选的实施方式中，所述428位的谷氨酸(E)突变为甘氨酸(G)。

在一个实施方式中，所述的突变选自下组：Q427R、E428G、或其组合。

在一个实施方式中，所述亲本颗粒结合淀粉合成酶可以来源于任何植物。

在一个实施方式中，所述亲本GBSS1多肽来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。

在一个实施方式中，所述亲本GBSS1多肽来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

在一个优选实施方式中，本发明的野生型颗粒结合淀粉合成酶来源于稻属，特别是水稻。

在一个实施方式中，所述亲本GBSS1蛋白具有GBSS1活性、并且所述亲本GBSS1的氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。

在优选的实施方式中，所述亲本GBSS1的氨基酸序列具有SEQ ID NO.:1所示的序列，或者，所述亲本GBSS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在一个实施方式中，所述的突变多肽与SEQ ID NO.:2-4所示序列的同源性至少为60％，较佳地至少为70％，更佳地至少为80％，最佳地至少为90％，如95％、97％、99％。

在一个实施方式中，所述的突变多肽为具有SEQ ID NO.:2-4所示氨基酸序列的多肽、其活性片段、或其保守性变异多肽。

在一个实施方式中，所述的突变多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2-4所示。

另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码所述突变型GBSS1蛋白或其活性片段。

在一个实施方式中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:2-4所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:5-7所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:5所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸；或者，核苷酸序列与SEQ ID NO.:6所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:3所示多肽的多核苷酸；或者，核苷酸序列与SEQ ID NO.:7所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:4所示多肽的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cDNA序列、RNA序列、或其组合。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸在所述突变多肽的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。

在一个实施方式中，该多核苷酸还包含与所述突变多肽的ORF序列操作性连接的启动子。

在一个实施方式中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。

另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，包含本发明的突变型GBSS1蛋白，例如标签肽如，组氨酸标签，6×His，或者质体引导肽，例如引导到叶绿体内的肽，或者调控元件，例如启动子序列、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、标记基因等。

本发明还提供了一种载体，所述载体包含有编码本发明的突变型颗粒结合淀粉合成酶或者融合蛋白的核酸序列，优选的，所述载体还包括与上述核酸序列可操作连接的表达调控元件。

在一个实施方式中，所述的载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

在一个实施方式中，载体也可以是对宿主细胞内源性的GBSS1基因进行基因编辑的载体。

在一个实施方式中，所述的载体含有编码如SEQ ID NO.:2-4所示多肽的多核苷酸。

在一个实施方式中，所述表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。

在一个实施方式中，所述载体可以是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。

载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。

优选地，本发明中的表达载体是质粒。

另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，含有所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。

在一个实施方式中，所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。

另一方面，本发明了提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述的核酸构建体或所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个实施方式中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或动物细胞或植物细胞。

在一个实施方式中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。

在一个实施方式中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在一个实施方式中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在一个实施方式中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在一个实施方式中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

另一方面，本发明，提供了一种制备所述突变型GBSS1多肽或其活性片段的方法，所述的方法包括步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养包含所述突变型GBSS1多肽的宿主细胞，从而表达所述的突变型GBSS1多肽；优选的，所述方法还包括

(b)分离所述的突变型GBSS1多肽的步骤。

另一方面，本发明提供了一种具有高直链淀粉含量的植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分、植物，其中，所述植物细胞、植物组织、植物种子、植物部分、植物含有所述的突变型GBSS1多肽或其多核苷酸序列。

另一方面，本发明还提供了上述具有高直链淀粉含量的植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物在生产直链淀粉中的应用。

另一方面，本发明提供了一种提高植物直链淀粉含量的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入所述GBSS1突变多肽的步骤；优选的，所述提高植物直链淀粉含量为提高植物种子中的直链淀粉含量。

另一方面，本发明还提供了一种制备高直链淀粉含量的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入所述GBSS1突变多肽的步骤。

在一个实施方式中，本发明所述的引入GBSS1突变多肽，包括将GBSS1突变多肽在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤，例如，通过表达载体对所述突变多肽进行表达的，或者将所述突变多肽整合到植物基因组上进行表达。

在另一优选例中，上述方法包括以下步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的突变型GBSS1多肽或其活性片段的DNA编码序列；

(2)将植物细胞、植物组织、植物部分与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述突变型GBSS1多肽或其活性片段的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；和

(3)选择已转入所述突变型GBSS1多肽或其活性片段的DNA编码序列的植物细胞。

在一个实施方式中，所述引入GBSS1突变多肽包括将植物的内源性GBSS1进行突变从而引入所述突变多肽的步骤。

在另一优选例中，所述的方法包括使植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分内源性GBSS1编码序列在相应于SEQ ID NO.:1的427和/或428氨基酸位点发生突变的步骤。

在另一优选例中，所述的方法包括将以下步骤：

(1)在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分中引入含有基因编辑工具的表达载体；

(2)使基因编辑工具作用于其内源性GBSS1编码序列，并使其在相应于SEQ IDNO.:1的427和/或428位氨基酸位点发生突变。

进一步的，上述方法还包括筛选突变的植物细胞、植物组织、植物部分，以及任选的，分离所述的基因编辑工具的步骤。

在另一优选例中，所述的基因编辑工具包括CRISPR、TALEN和ZFN。

另一方面，本发明还提供了由上述制备方法制备得到的植物在生产直链淀粉中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种利用植物制备直链淀粉的方法，所述植物由上述制备方法制备得到。

另一方面，本发明还提供了所述突变多肽、多核苷酸、核酸构建体或宿主细胞在制备直链淀粉含量提高的植物中的用途。

在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

另一方面，本发明提供了所述突变多肽、所述多核苷酸、所述融合蛋白、所述核酸构建体或所述载体在制备具有高直链淀粉含量的植物的试剂或试剂盒中的用途。

一般定义：

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。因此，本发明的组合物和方法还包含本发明的核苷酸序列和多肽序列(例如，SEQ ID NO:1-7)的同源物。可以通过包括但不限于以下的已知方法计算“同源性”：ComputationalMolecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press[牛津大学出版社],纽约(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物运算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑)Academic Press[学术出版社],纽约(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I[序列数据的计算机分析，第I部分](Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡马纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学中的序列分析](von Heinje,G.编辑)Academic Press[学术出版社](1987)；以及Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约(1991)。

术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，作为在具有限定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。

术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如Q427R表示第427位的谷酰胺酸(Q)变为精氨酸(R)，E428G表示第428位的谷氨酸(E)变为氨基酸甘氨酸(G)，以此类推。对于双重或多重突变，各突变之间以“/”隔开，例如，Q427R/E428G表示相对于SEQ ID NO.:1的氨基酸序列而言，第427位的谷酰胺酸(Q)被精氨酸(R)取代且第428位的谷氨酸(E)被甘氨酸(G)取代，两个突变均存在于所述具体的突变型GBSS1蛋白内。

术语“调控元件”在本发明中指的是能够调节与之可操作连接的核酸的转录和/或翻译的核酸序列。所述的调控元件包括启动子序列、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因等。

术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链DNA的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。

术语“GBSS1”是指颗粒结合淀粉合酶(Granule-Bound Starch Synthase1)，或者称之为，颗粒结合型淀粉合成酶，由水稻蜡质基因(waxy)编码。

术语“亲本型GBSS1多肽”、“亲本GBSS1多肽”指的是所述GBSS1突变多肽所来源的多肽，在优选的实施方式中，所述亲本GBSS1多肽是可以在自然界中被发现存在的核酸分子或蛋白质(多肽)，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型GBSS1多肽的氨基酸序列，例如SEQ ID NO.:1所示；在某些实施方式中，所述亲本GBSS1多肽可以是对野生型的GBSS1多肽进行一个或多个氨基酸残基改变的、但不影响其酶活性质的多肽。

术语“突变的GBSS1多肽”、“突变型GBSS1多肽”、“突变GBSS1蛋白”、“突变GBSS1酶”、“突变蛋白”、“突变多肽”、“本发明多肽”等可互换使用。优选地，所述突变蛋白在对应于SEQ ID NO.:1所示序列的第427位和/或第428位的氨基酸突变。

术语“直链淀粉”又称糖淀粉，是一种由葡萄糖组成的线性聚合物，各葡萄糖单体主要以α(1→4)糖苷键连接，每个直链淀粉分子通常含有数千个葡萄糖单体。直链淀粉与支链淀粉(胶淀粉)组成生物中常见的淀粉。α(1→4)糖苷键导致直链淀粉应承螺旋状结构，右图为其分子结构式，其重复的葡萄糖单体数目通常为300个到3000个。

直链淀粉的水解消化作用比支链淀粉缓慢，但作为能量储存物质，直链淀粉占据较少空间，因而植物中有约20％的淀粉是直链淀粉。淀粉酶在直链淀粉分子的末端，通过水解作用把直链淀粉拆散为葡萄糖单体，因支链淀粉拥有更多的末端，所以相对水解速度较快。

所述高直链淀粉含量是指，所述植物(尤其是植物种子)中的直链淀粉含量与亲本型植物相比，其直链淀粉含量至少提高50％，优选，60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％。

术语“直链淀粉含量(Amylose content，AC)”为直链淀粉占精米粉干重的百分比，是决定稻米蒸煮与食味品质的关键因素之一。根据其含量高低，可将稻米直链淀粉含量分为极低(2％～9％)、低(10％～20％)、中(20％～25％)和高(＞25％)四类，糯稻直链淀粉含量一般低于2％。稻米胚乳中直链淀粉含量能影响蒸煮后米饭柔软性，直链淀粉含量过低，膨胀性小，米饭粘；直链淀粉含量过高，膨胀性大，变冷后质地较硬；中等直链淀粉含量的稻米煮后比较松软，蒸煮品质相对好。

术语“宿主生物”应理解为可以引入突变型GBSS1蛋白编码核酸的任何单细胞或多细胞生物，包括例如细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。

术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。

术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

术语“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。

术语“基因编辑”技术包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR技术是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)，其来自微生物的免疫系统。其中基因编辑工具包括guideRNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)。TALEN技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。

在本发明中，野生型颗粒结合淀粉合成酶可以来源于任何植物，特别是前述单子叶或双子叶植物。现有技术文献中已经公开了一些来源的野生型颗粒结合淀粉合成酶序列以及编码序列，这些现有技术文献在此引入本文作为参考。

优选地，本发明的野生型颗粒结合淀粉合成酶来源于稻属，特别是水稻。更优选地，所述野生型颗粒结合淀粉合成酶具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO.:1所示氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

例如，本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维构型产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不损害蛋白质的生物活性，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的突变型GBSS1蛋白除了包含上述突变之外，还可以在氨基酸序列中包含一个或多个其他突变例如保守性取代。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的突变型GBSS1蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。

如本领域中所熟知的，可以从蛋白质的N和/或C末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，在另一方面，本发明还涉及从突变型GBSS1蛋白的N和/或C末端缺失了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的片段(比如含有本发明突变位点的氨基酸片段)，它们也在本发明的范围内，被称为生物活性片段。在本发明中，“生物活性片段”是指本发明的突变型GBSS1蛋白的一部分，其保留了本发明的突变型GBSS1蛋白的生物学活性。例如，突变型GBSS1蛋白的生物学活性片段可以是在所述蛋白质的N和/或C末端缺失了一个或多个(例如1-50个、1-25个、1-10个或1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。

此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。

本发明还提供编码所述突变型GBSS1多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。优选的所述突变型GBSS1多肽如SEQ ID NO.:2-4所示。本领域技术人员十分清楚，由于遗传密码的简并性，有多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同蛋白质的其他核酸序列在本领域普通技术人员的能力范围内，因此本发明涵盖因遗传密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的核酸序列。例如，为了在目标宿主生物例如植物中实现异源基因的高表达，可以对所述基因采用宿主生物偏好的密码子进行优化，以使其更好地表达。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。所获得的核苷酸序列可将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到大批量有关序列。本发明突变位点亦可通过人工合成引入。

可将一拷贝以上的本发明之多核苷酸插入宿主细胞中以提高基因产物的产量。可通过将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组中或者通过将可扩增的可选择标记基因与所述多核苷酸包含在一起来达到多核苷酸拷贝数目的增加，在后一情形下，包含扩增拷贝的选择标记基因以及由此而来的附加拷贝的多核苷酸的细胞可通过在适当的可选择制剂存在的条件下人工培养所述细胞进行选择。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GBSS1突变多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pBR322(ATCC37017)，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pD10，psiX174pBluescript IIKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pKK232-8，pCM7，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL(Pharmacia)等。

本发明还提供了包含本发明GBSS1突变多肽编码核酸序列、核酸构建体或表达载体的宿主细胞。将包含编码本发明的载体引入宿主细胞中使得载体作为染色体整合体的一部分存在或如早先所述作为自我复制的染色体外载体存在，或者载体可以对宿主细胞内源性的GBSS1基因进行基因编辑。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核生物细胞和真核生物细胞。

本发明的核酸序列、核酸构建体或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等。

在本发明的生产方法中，用本领域众所周知的方法将所述细胞培养于适于所述多肽产生的营养培养基上。若所述多肽被分泌入营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。若所述多肽不分泌到培养基中，则可从细胞裂解物中回收它。

本发明的主要优点：

1、本发明筛选出了一组突变型的GBSS1突变多肽。

2、含有本发明突变型GBSS1多肽的植物相比野生型植物其直链淀粉含量提高了至少50％。

附图说明

图1.ABE-nCas9碱基编辑器示意图；其中，OsU6、ZmUbi为启动子；sgRNA为向导RNA；bp-NLS为核定位信号；NOS为终止子。

图2.对基因编辑的种子和野生型种子染色观察直链淀粉含量结果。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、基因编辑载体构建及突变位点的筛选

1、构建靶向水稻内源GBSS1基因的ABE-nCas9碱基编辑器(如图1所示)

ABE碱基编辑器可以在一定的序列窗口范围内实现A/T->G/C的碱基转换，本发明以ABE-nCas9碱基编辑器为载体，在水稻内源GBSS1基因中设计sgRNA(表1所示的sgRNA)，分别克隆至ABE-nCas9载体，形成靶向水稻内源GBSS1基因的碱基编辑器，水稻内源GBSS1基因编码的氨基酸如SEQ ID No.1所示。

表1靶向水稻GBSS1基因的sgRNA序列

sgRNA编号	guide-PAM序列(5’-3’)
		A-GBSS10	ATGCAGGAGGACGTCCAGAT(SEQ ID NO.8)

2、水稻遗传转化及转基因植株鉴定

以秀水134水稻品种作为实验材料，把以上构建好的碱基编辑器分别通过农杆菌转化，获得基因编辑植株。通过PCR及测序对以上植株进行鉴定，发现部分植株在靶点范围内出现预期的碱基替换，具体碱基编辑类型如表2所示。

同时，取下述表格中各植株的干种子，打样机打碎或研磨，37度烘箱过夜。取25mg样品干粉，加入0.5ml的乙醇，再各加4.5ml 1N NaOH振荡混匀，沸水浴10分钟。取0.5ml至50ml离心管中，加入25ml ddH₂O。加0.5ml 1N HAc，加0.5ml I-KI试剂，定容至50ml，放置l0min充分混匀。分光光度计测720nm光密度读数，并根据标准曲线(以Sigma.公司的马铃薯直链淀粉样品为标准样品)拟合方程计算直链淀粉含量，各植株种子直链淀粉含量(AC含量)如表2所示。

表2.编辑植株的突变类型以及直链淀粉含量

如表2所示，不管是Q427R的突变，还是E428G的突变，或者两者共同突变，编辑植株相对于野生型来说，种子的直链淀粉含量都有显著性的提高。

另外，针对上述直链淀粉含量提高的种子进行染色，染色方法：准备秀水134的正常和编辑植株种子，将上述种子去除颖壳得到糙米，用单面刀沿种子背线将糙米切为两半，在漏出的胚乳切面上涂抹相同剂量的I-KI溶液，静置10min钟后拍照记录显色。

如图2所示，结果显示，上述经编辑的水稻种子比野生型水稻种子颜色更深，这也反映了经编辑的水稻种子的直链淀粉含量更高。

3、实验结论

GBSS1多肽第427位及/或第428位氨基酸位点的突变可以赋予植株高直链淀粉含量，本发明在培育高直链淀粉含量的突变型GBSS1作物中具有重要应用价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 一种提高植物直链淀粉含量的多肽、核酸及其应用

<130> P2020-1104

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 609

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

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gaccgtgtgt tcatcgacca tccgtcattc ctggagaagg tttggggaaa gaccggtgag 540

aagatctacg gacctgacac tggagttgat tacaaagaca accagatgcg tttcagcctt 600

ctttgccagg cagcactcga ggctcctagg atcctaaacc tcaacaacaa cccatacttc 660

aaaggaactt atggtgagga tgttgtgttc gtctgcaacg actggcacac tggcccactg 720

gcgagctacc tgaagaacaa ctaccagccc aatggcatct acaggaatgc aaaggttgct 780

ttctgcatcc acaacatctc ctaccagggc cgtttcgctt tcgaggatta ccctgagctg 840

aacctctccg agaggttcag gtcatccttc gatttcatcg acgggtatga cacgccggtg 900

gagggcagga agatcaactg gatgaaggcc ggaatcctgg aagccgacag ggtgctcacc 960

gtgagcccgt actacgccga ggagctcatc tccggcatcg ccaggggatg cgagctcgac 1020

aacatcatgc ggctcaccgg catcaccggc atcgtcaacg gcatggacgt cagcgagtgg 1080

gatcctagca aggacaagta catcaccgcc aagtacgacg caaccacggc aatcgaggcg 1140

aaggcgctga acaaggaggc gttgcaggcg gaggcgggtc ttccggtcga caggaaaatc 1200

ccactgatcg cgttcatcgg caggctggag gaacagaagg gccctgacgt catggccgcc 1260

gccatcccgg agctcatgcg ggaggacgtc cagatcgttc ttctgggtac tggaaagaag 1320

aagttcgaga agctgctcaa gagcatggag gagaagtatc cgggcaaggt gagggccgtg 1380

gtgaagttca acgcgccgct tgctcatctc atcatggccg gagccgacgt gctcgccgtc 1440

cccagccgct tcgagccctg tggactcatc cagctgcagg ggatgagata cggaacgccc 1500

tgtgcttgcg cgtccaccgg tgggctcgtg gacacggtca tcgaaggcaa gactggtttc 1560

cacatgggcc gtctcagcgt cgactgcaag gtggtggagc caagcgacgt gaagaaggtg 1620

gcggccaccc tgaagcgcgc catcaaggtc gtcggcacgc cggcgtacga ggagatggtc 1680

aggaactgca tgaaccagga cctctcctgg aaggggcctg cgaagaactg ggagaatgtg 1740

ctcctgggcc tgggcgtcgc cggcagcgcg ccggggatcg aaggcgacga gatcgcgccg 1800

ctcgccaagg agaacgtggc tgctccttga 1830

<210> 6

<211> 1830

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 6

atgtcggctc tcaccacgtc ccagctcgcc acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac 60

aggtcggcgc cgtcgtcgct gctccgccac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc 120

gccggcggcg acgcgacgtc gctcagcgtg acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag 180

cagcggtcgg tgcagcgtgg cagccggagg ttcccctccg tcgtcgtgta cgccaccggc 240

gccggcatga acgtcgtgtt cgtcggcgcc gagatggccc cctggagcaa gaccggcggc 300

ctcggtgacg tcctcggtgg cctcccccct gccatggctg cgaatggcca cagggtcatg 360

gtgatctctc ctcggtacga ccagtacaag gacgcttggg ataccagcgt tgtggctgag 420

atcaaggttg cagacaggta cgagagggtg aggtttttcc attgctacaa gcgtggagtc 480

gaccgtgtgt tcatcgacca tccgtcattc ctggagaagg tttggggaaa gaccggtgag 540

aagatctacg gacctgacac tggagttgat tacaaagaca accagatgcg tttcagcctt 600

ctttgccagg cagcactcga ggctcctagg atcctaaacc tcaacaacaa cccatacttc 660

aaaggaactt atggtgagga tgttgtgttc gtctgcaacg actggcacac tggcccactg 720

gcgagctacc tgaagaacaa ctaccagccc aatggcatct acaggaatgc aaaggttgct 780

ttctgcatcc acaacatctc ctaccagggc cgtttcgctt tcgaggatta ccctgagctg 840

aacctctccg agaggttcag gtcatccttc gatttcatcg acgggtatga cacgccggtg 900

gagggcagga agatcaactg gatgaaggcc ggaatcctgg aagccgacag ggtgctcacc 960

gtgagcccgt actacgccga ggagctcatc tccggcatcg ccaggggatg cgagctcgac 1020

aacatcatgc ggctcaccgg catcaccggc atcgtcaacg gcatggacgt cagcgagtgg 1080

gatcctagca aggacaagta catcaccgcc aagtacgacg caaccacggc aatcgaggcg 1140

aaggcgctga acaaggaggc gttgcaggcg gaggcgggtc ttccggtcga caggaaaatc 1200

ccactgatcg cgttcatcgg caggctggag gaacagaagg gccctgacgt catggccgcc 1260

gccatcccgg agctcatgca gggggacgtc cagatcgttc ttctgggtac tggaaagaag 1320

aagttcgaga agctgctcaa gagcatggag gagaagtatc cgggcaaggt gagggccgtg 1380

gtgaagttca acgcgccgct tgctcatctc atcatggccg gagccgacgt gctcgccgtc 1440

cccagccgct tcgagccctg tggactcatc cagctgcagg ggatgagata cggaacgccc 1500

tgtgcttgcg cgtccaccgg tgggctcgtg gacacggtca tcgaaggcaa gactggtttc 1560

cacatgggcc gtctcagcgt cgactgcaag gtggtggagc caagcgacgt gaagaaggtg 1620

gcggccaccc tgaagcgcgc catcaaggtc gtcggcacgc cggcgtacga ggagatggtc 1680

aggaactgca tgaaccagga cctctcctgg aaggggcctg cgaagaactg ggagaatgtg 1740

ctcctgggcc tgggcgtcgc cggcagcgcg ccggggatcg aaggcgacga gatcgcgccg 1800

ctcgccaagg agaacgtggc tgctccttga 1830

<210> 7

<211> 1830

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 7

atgtcggctc tcaccacgtc ccagctcgcc acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac 60

aggtcggcgc cgtcgtcgct gctccgccac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc 120

gccggcggcg acgcgacgtc gctcagcgtg acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag 180

cagcggtcgg tgcagcgtgg cagccggagg ttcccctccg tcgtcgtgta cgccaccggc 240

gccggcatga acgtcgtgtt cgtcggcgcc gagatggccc cctggagcaa gaccggcggc 300

ctcggtgacg tcctcggtgg cctcccccct gccatggctg cgaatggcca cagggtcatg 360

gtgatctctc ctcggtacga ccagtacaag gacgcttggg ataccagcgt tgtggctgag 420

atcaaggttg cagacaggta cgagagggtg aggtttttcc attgctacaa gcgtggagtc 480

gaccgtgtgt tcatcgacca tccgtcattc ctggagaagg tttggggaaa gaccggtgag 540

aagatctacg gacctgacac tggagttgat tacaaagaca accagatgcg tttcagcctt 600

ctttgccagg cagcactcga ggctcctagg atcctaaacc tcaacaacaa cccatacttc 660

aaaggaactt atggtgagga tgttgtgttc gtctgcaacg actggcacac tggcccactg 720

gcgagctacc tgaagaacaa ctaccagccc aatggcatct acaggaatgc aaaggttgct 780

ttctgcatcc acaacatctc ctaccagggc cgtttcgctt tcgaggatta ccctgagctg 840

aacctctccg agaggttcag gtcatccttc gatttcatcg acgggtatga cacgccggtg 900

gagggcagga agatcaactg gatgaaggcc ggaatcctgg aagccgacag ggtgctcacc 960

gtgagcccgt actacgccga ggagctcatc tccggcatcg ccaggggatg cgagctcgac 1020

aacatcatgc ggctcaccgg catcaccggc atcgtcaacg gcatggacgt cagcgagtgg 1080

gatcctagca aggacaagta catcaccgcc aagtacgacg caaccacggc aatcgaggcg 1140

aaggcgctga acaaggaggc gttgcaggcg gaggcgggtc ttccggtcga caggaaaatc 1200

ccactgatcg cgttcatcgg caggctggag gaacagaagg gccctgacgt catggccgcc 1260

gccatcccgg agctcatgcg gggggacgtc cagatcgttc ttctgggtac tggaaagaag 1320

aagttcgaga agctgctcaa gagcatggag gagaagtatc cgggcaaggt gagggccgtg 1380

gtgaagttca acgcgccgct tgctcatctc atcatggccg gagccgacgt gctcgccgtc 1440

cccagccgct tcgagccctg tggactcatc cagctgcagg ggatgagata cggaacgccc 1500

tgtgcttgcg cgtccaccgg tgggctcgtg gacacggtca tcgaaggcaa gactggtttc 1560

cacatgggcc gtctcagcgt cgactgcaag gtggtggagc caagcgacgt gaagaaggtg 1620

gcggccaccc tgaagcgcgc catcaaggtc gtcggcacgc cggcgtacga ggagatggtc 1680

aggaactgca tgaaccagga cctctcctgg aaggggcctg cgaagaactg ggagaatgtg 1740

ctcctgggcc tgggcgtcgc cggcagcgcg ccggggatcg aaggcgacga gatcgcgccg 1800

ctcgccaagg agaacgtggc tgctccttga 1830

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

atgcaggagg acgtccagat 20

Claims (12)

1.一种颗粒结合淀粉合成酶(GBSS1)的突变多肽，所述突变多肽与亲本颗粒结合淀粉合成酶(GBSS1)的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的第427位和/或第428位氨基酸处发生突变，所述第427位氨基酸由谷酰胺酸（Q）突变为精氨酸（R），所述第428位氨基酸由谷氨酸（E）突变为甘氨酸（G）。

2.根据权利要求1所述的突变多肽，其特征在于，所述亲本GBSS1来源于单子叶植物或双子叶植物。

3.根据权利要求2所述的突变多肽，其特征在于，所述亲本GBSS1来源于水稻。

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-3任一所述的突变多肽。

5.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有权利要求4所述的多核苷酸。

6.根据权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体还含有与所述的多核苷酸可操作连接的调控元件。

7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其特征在于，所述调控元件选自下组中的一种或任意几种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多核苷酸序列、标记基因。

8.一种提高植物直链淀粉含量的方法或者制备高直链淀粉含量的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入权利要求1-3任一所述突变多肽的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-3任一所述的突变多肽在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括将植物的内源性GBSS1进行突变从而引入所述突变多肽的步骤。

11.权利要求1-3任一所述的突变多肽、权利要求4所述的多核苷酸、或权利要求5-7任一所述的核酸构建体在制备高直链淀粉含量的植物中的用途。

12.一种利用植物制备直链淀粉的方法，其特征在于，所述植物由权利要求8-10任一所述的制备高直链淀粉含量的植物的方法制备得到。

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