CN113462702B - 一种突变型waxy基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种突变型waxy基因及其应用，具体地涉及一种突变型的waxy基因，所述的突变型waxy基因与亲本waxy基因相比，在对应于SEQ ID NO.:1的第435位核苷酸发生突变。waxy基因突变后的植物直链淀粉含量降低，在改善稻米的食用品质方面具有非常广阔的应用前景。

Description

一种突变型waxy基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术、作物遗传育种领域，具体涉及一种突变型waxy基因及其应用，尤其涉及一种突变型waxy基因及其在降低植物中直链淀粉含量的方法与应用。

背景技术

稻米(Oryza sativa)被世界人口的2/3所食用，是至少其中一半人口饮食中的主要能量来源。大米是一种低成本食品，制备简便，快速，并且可以与各种菜肴搭配食用。

水稻主要由碳水化合物组成，在胚乳中主要以淀粉(90％)的形式存在。淀粉广泛用于食品，造纸和化学工业。淀粉根据结构不同，可以分为直链淀粉和支链淀粉。在水稻中，Waxy(Wx)基因编码颗粒结合淀粉合成酶(GBSS1)，该基因可以控制胚乳中的直链淀粉合成，Waxy位点内的自然等位基因变异是影响大米中的直链淀粉含量(AC)的主要原因。直链淀粉含量(Amylose content， AC)为直链淀粉占精米粉干重的百分比，是决定稻米蒸煮与食味品质的关键因素之一。根据其含量高低，可将稻米直链淀粉含量分为极低(2％～9％)、低(10 ％～20％)、中(20％～25％)和高(＞25％)四类，糯稻直链淀粉含量一般低于2 ％。稻米胚乳中直链淀粉含量能影响蒸煮后米饭柔软性，直链淀粉含量过低，膨胀性小，米饭粘；直链淀粉含量过高，膨胀性大，变冷后质地较硬；中等直链淀粉含量的稻米煮后比较松软，蒸煮品质相对好。不同品种的稻米中直链淀粉和支链淀粉的比例存在很大差异。

CRISPR/Cas基因编辑技术是近几年新兴的基因工程技术，其是由 guideRNA介导的DNA切割技术，针对Cas的不同已经开发出多种编辑系统。基因组编辑及商户可以定向修饰基因组，加速了育种进程，是实验精准育种的重要技术突破。

CRISPR/Cas编辑技术可以实现4种定点编辑：第一种是基因的定点敲除， Cas蛋白在靶向RNA(gRNA)的指导下识别和切割靶点，产生双链DNA断裂；断裂的DNA通常以非同源末端连接(NHEJ)来修复；在修复时容易产生移码突变以破坏这个基因。第二种是对靶标进行同源置换来更换靶标序列或者定点插入。在产生双链DNA断裂时，如果在附近存在同源修复模板，这时可能发生同源置换或定点插入。同源置换的效率较低，并随着要置换的序列的长度增长而变得更低。第三种是单碱基编辑。单碱基编辑是利用CRISPR/Cas系统将脱氨酶靶向基因组中特定的位点从而对特定碱基进行修饰的基因编辑方法。此种方法已经在水稻中成功运用。第四种是基因组引导编辑技术。引导编辑是将逆转录酶与cas9切口酶结合，在单链引导RNA引导下，按转录模板进行点突变、插入或缺失突变的编辑方法。

因此，本领域急需运用基因编辑技术，突变waxy基因，降低直链淀粉含量，改善稻米的食用品质。

发明内容

本发明目的是提供一种可降低植物中直链淀粉含量的突变型waxy基因及其应用。

一方面，本发明提供了一种突变型waxy基因，所述突变基因与野生型基因序列相比，在对应于SEQ ID NO.:1所示核苷酸序列的第435位核苷酸处发生突变。

在一个实施方式中，所述亲本waxy基因第435位核苷酸为胞嘧啶(C)

在一个实施方式中，所述第435位核苷酸为胞嘧啶(C)，突变为非胞嘧啶(C)，所述非胞嘧啶(C)的核苷酸选自下组的一种或多种核苷酸：腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)。

在优选的实施方式中，所述第435位的胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)。

在一个实施方式中，所述亲本waxy基因可以来源于任何植物。

在一个实施方式中，所述亲本waxy基因来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。

在一个实施方式中，所述亲本waxy基因来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

在一个优选实施方式中，本发明的亲本waxy基因来源于稻属，特别是水稻。

在一个实施方式中，所述亲本waxy基因能编码具有活性的蛋白、并且所述亲本waxy基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列具有至少80 ％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。

在优选的实施方式中，所述亲本waxy基因具有SEQ ID NO.:1所示的序列，或者，所述亲本waxy基因核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在一个实施方式中，所述的突变waxy基因与SEQ ID NO.:2所示序列的同源性至少为60％，较佳地至少为70％，更佳地至少为80％，最佳地至少为90％，如95％、97％、99％。

在一个实施方式中，所述的突变waxy基因具有SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述的突变waxy基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2 所示。

另一方面，本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸序列为上述突变型waxy基因的多核苷酸。

在一个实施方式中，上述多核苷酸还包括与上述多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cDNA序列、 RNA序列、或其组合。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸在所述突变基因的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。

在一个实施方式中，该多核苷酸还包含与所述突变型waxy基因的ORF序列操作性连接的启动子。

在一个实施方式中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。

另一方面，本发明还提供了一种载体。

在一个实施方式中，所述载体包含上述突变型waxy基因，优选的，所述载体还包括与上述核酸序列可操作连接的表达调控元件。

在一个实施方式中，所述的载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

在一个实施方式中，载体也可以是对宿主细胞内源性的waxy基因进行基因编辑的载体。

在一个实施方式中，所述表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。

在一个实施方式中，所述载体可以是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。

在一个实施方式中，载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。

优选地，本发明中的表达载体是质粒。

另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，含有所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。

在一个实施方式中，所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。

另一方面，本发明了提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述的核酸构建体或所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个实施方式中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或动物细胞或植物细胞。

在一个实施方式中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。

在一个实施方式中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在一个实施方式中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在一个实施方式中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在一个实施方式中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

另一方面，本发明提供了一种具有低直链淀粉含量的植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分、植物，其中，所述植物细胞、植物组织、植物种子、植物部分、植物含有所述的突变型waxy基因。

另一方面，本发明提供了一种降低植物直链淀粉含量的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入所述突变型waxy 基因的步骤；优选的，所述降低植物直链淀粉含量为降低植物种子中的直链淀粉含量。

另一方面，本发明还提供了一种制备低直链淀粉含量的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入所述突变型waxy基因的步骤。

在一个实施方式中，本发明所述的引入突变型waxy基因，包括将突变型 waxy基因在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤，例如，通过表达载体对所述突变型waxy基因进行表达的，或者将所述突变型waxy基因整合到植物基因组上进行表达。

在另一优选例中，上述方法包括以下步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的突变型waxy 基因；

(2)将植物细胞、植物组织、植物部分与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述突变型waxy基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；和

(3)选择已转入所述突变型waxy基因的植物细胞。

在一个实施方式中，所述引入突变型waxy基因包括将植物的内源性waxy 基因进行突变从而引入所述突变型waxy基因的步骤。

上述突变可以采用定点突变或者基因编辑的方式来实现。

在另一优选例中，所述的方法包括使植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分内源性waxy基因在相应于SEQ ID NO.:1的第435核苷酸发生突变的步骤。

优选的，所述内源性waxy基因的核酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的方法包括将以下步骤：

(1)在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分中引入含有基因编辑工具的表达载体；

(2)使基因编辑工具作用于其内源性waxy序列，并使其在相应于SEQ ID NO.:1的第435位核苷酸位点发生突变。

进一步的，上述方法还包括筛选突变的植物细胞、植物组织、植物部分，以及任选的，分离所述的基因编辑工具的步骤。

在另一优选例中，所述的基因编辑工具包括CRISPR、TALEN和ZFN。

另一方面，本发明还提供了所述多核苷酸、载体、核酸构建体或宿主细胞在制备低直链淀粉含量的植物中的用途。

在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

另一方面，本发明提供了所述多核苷酸、载体、核酸构建体或宿主细胞在制备具有低直链淀粉含量的植物的试剂或试剂盒中的用途。

一般定义：

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个核酸之间序列的匹配情况。因此，本发明的组合物和方法还包含本发明的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:1-2)的同源物。可以通过包括但不限于以下的已知方法计算“同源性”：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press[牛津大学出版社],纽约(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物运算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑)Academic Press[学术出版社],纽约(1993)；Computer Analysis ofSequence Data,Part I[序列数据的计算机分析，第I部分](Griffin,A.M. 和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡马纳出版社],新泽西州(1994)； Sequence Analysis inMolecular Biology[分子生物学中的序列分析](von Heinje,G.编辑)Academic Press[学术出版社](1987)；以及Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约(1991)。

术语“调控元件”在本发明中指的是能够调节与之可操作连接的核酸的转录和/或翻译的核酸序列。所述的调控元件包括启动子序列、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因等。

术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链DNA的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。

术语“waxy”是水稻蜡质基因，编码颗粒结合淀粉合酶(Granule-Bound StarchSynthase 1)，该基因可以控制胚乳中的直链淀粉合成。

术语“亲本型waxy基因”、“亲本waxy基因”、“亲本型的waxy基因”、指的是所述突变waxy基因所来源的基因，在优选的实施方式中，所述亲本waxy 基因是可以在自然界中被发现存在的核酸分子或蛋白质(多肽)，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述亲本waxy基因的核苷酸序列，例如SEQ ID NO.:1所示；在某些实施方式中，所述亲本waxy基因可以是对亲本waxy基因进行一个或多个核苷酸残基改变的、但不影响表达的核苷酸序列。

术语“突变的waxy基因”、“突变型waxy基因”“突变waxy基因”可互换使用。优选地，所述突变基因在对应于SEQ ID NO.1所示序列的第435 位的核苷酸突变。

术语“直链淀粉”又称糖淀粉，是一种由葡萄糖组成的线性聚合物，各葡萄糖单体主要以α(1→4)糖苷键连接，每个直链淀粉分子通常含有数千个葡萄糖单体。直链淀粉与支链淀粉(胶淀粉)组成生物中常见的淀粉。α(1→4)糖苷键导致直链淀粉应承螺旋状结构，右图为其分子结构式，其重复的葡萄糖单体数目通常为300个到3000个。

直链淀粉的水解消化作用比支链淀粉缓慢，但作为能量储存物质，直链淀粉占据较少空间，因而植物中有约20％的淀粉是直链淀粉。淀粉酶在直链淀粉分子的末端，通过水解作用把直链淀粉拆散为葡萄糖单体，因支链淀粉拥有更多的末端，所以相对水解速度较快。

所述低直链淀粉含量是指，所述植物(尤其是植物种子)中的直链淀粉含量与亲本型植物相比，其直链淀粉含量至少降低50％，优选地，60％、70％、80％、 90％。

术语“直链淀粉含量(Amylose content，AC)”为直链淀粉占精米粉干重的百分比，是决定稻米蒸煮与食味品质的关键因素之一。根据其含量高低，可将稻米直链淀粉含量分为极低(2％～9％)、低(10％～20％)、中(20％～25％) 和高(＞25％)四类，糯稻直链淀粉含量一般低于2％。稻米胚乳中直链淀粉含量能影响蒸煮后米饭柔软性，直链淀粉含量过低，膨胀性小，米饭粘；直链淀粉含量过高，膨胀性大，变冷后质地较硬；中等直链淀粉含量的稻米煮后比较松软，蒸煮品质相对好。

术语“宿主生物”应理解为可以引入突变型waxy基因的任何单细胞或多细胞生物，包括例如细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。

术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。

术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

术语“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。

术语“基因编辑”技术包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR 技术是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)，其来自微生物的免疫系统。其中基因编辑工具包括guide RNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)。TALEN 技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL 效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。

优选地，本发明的waxy基因来源于稻属，特别是水稻。更优选地，所述野生型waxy基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO.1 所示核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。所获得的核苷酸序列可将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到大批量有关序列。本发明突变位点亦可通过人工合成引入。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含突变waxy基因和合适的转录/ 翻译控制信号的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到载体中的适当启动子上，以指导mRNA 合成。载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pBR322(ATCC37017)，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)， GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)， pD10，psiX174pBluescript IIKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A (Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)， pKK232-8，pCM7，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV， pMSG，和pSVL(Pharmacia)等。

本发明还提供了包含本发明突变型waxy基因、核酸构建体或表达载体的宿主细胞。将包含突变型waxy基因的载体引入宿主细胞中使得载体作为染色体整合体的一部分存在或如早先所述作为自我复制的染色体外载体存在，或者载体可以对宿主细胞内源性的waxy基因进行基因编辑。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核生物细胞和真核生物细胞。

本发明的核酸序列、核酸构建体或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等。

本发明的主要优点：

1、本发明筛选出了一种突变型的waxy基因，所述突变型waxy基因与亲本 waxy基因相比，其编码的氨基酸序列没有发生变化，但是，在第435位核苷酸位点发生突变。

2、尽管所编码的氨基酸序列没有发生变化，但是，含有本发明突变型waxy 基因的植物相比野生型植物其直链淀粉含量降低了至少50％。

附图说明

图1.CBE-nCas9碱基编辑器示意图；其中，OsU6、ZmUbi为启动子；sgRNA 为向导RNA；bp-NLS为核定位信号；NOS为终止子。

图2.对基因编辑的种子和野生型种子染色观察直链淀粉含量结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、基因编辑载体构建及突变位点的筛选

1、构建靶向水稻内源waxy基因的CBE-nCas9碱基编辑器(如图1所示)

CBE碱基编辑器可以在一定的序列窗口范围内实现C/G->T/A的碱基转换，本发明以CBE-nCas9碱基编辑器为载体，在水稻内源waxy基因中设计如表1 所示sgRNA，克隆至CBE-nCas9载体，形成靶向水稻内源waxy基因的碱基编辑器，水稻内源waxy基因序列如SEQID No.1所示。

表1靶向水稻waxy基因的sgRNA序列

sgRNA编号	guide-PAM序列(5’-3’)
		1	TGCAGACAGGTACGAGAGGG(SEQ ID NO.:3)

2、水稻遗传转化及转基因植株鉴定

以秀水134水稻品种作为实验材料，把以上构建好的碱基编辑器分别通过农杆菌转化，基因编辑植株。通过PCR及测序对以上植株进行鉴定，发现部分植株在靶点范围内出现预期的碱基替换，具体碱基编辑类型如表2所示。

同时，取下述表格中各植株的干种子，打样机打碎或研磨，37度烘箱过夜。取25mg样品干粉，加入0.5ml的乙醇，再各加4.5ml 1N NaOH振荡混匀，沸水浴10分钟。取0.5ml至50ml离心管中，加入25ml ddH₂O。加0.5ml 1N HAc，加0.5ml I-KI试剂，定容至50ml，放置l0min充分混匀。分光光度计测720nm 光密度读数，并根据标准曲线(以Sigma.公司的马铃薯直链淀粉样品为标准样品)拟合方程计算直链淀粉含量，各植株种子直链淀粉含量(AC含量)如表2 所示。

表2.编辑植株的突变类型以及直链淀粉含量

植株编号	碱基突变类型	AC含量
			WT	未突变	18.38％
H-528	C435->T	13.70％

如表2所示，编辑植株相对于野生型来说，种子的直链淀粉含量都有显著性的降低。

另外，针对上述直链淀粉含量降低的种子进行染色，染色方法：准备秀水134 的正常和编辑植株种子，将上述种子去除颖壳得到糙米，用单面刀沿种子背线将糙米切为两半，在漏出的胚乳切面上涂抹相同剂量的I-KI溶液，静置10min钟后拍照记录显色。

如图2所示，结果显示，上述经编辑的水稻种子比野生型水稻种子颜色更浅，这也反映了经编辑的水稻种子的直链淀粉含量更低。

3、实验结论

waxy基因第435位核苷酸位点的突变可以赋予植物低直链淀粉含量，本发明在培育低直链淀粉含量的突变型waxy作物中具有重要应用价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 一种突变型waxy基因及其应用

<130> P2020-1162

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1830

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgtcggctc tcaccacgtc ccagctcgcc acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac 60

aggtcggcgc cgtcgtcgct gctccgccac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc 120

gccggcggcg acgcgacgtc gctcagcgtg acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag 180

cagcggtcgg tgcagcgtgg cagccggagg ttcccctccg tcgtcgtgta cgccaccggc 240

gccggcatga acgtcgtgtt cgtcggcgcc gagatggccc cctggagcaa gaccggcggc 300

ctcggtgacg tcctcggtgg cctcccccct gccatggctg cgaatggcca cagggtcatg 360

gtgatctctc ctcggtacga ccagtacaag gacgcttggg ataccagcgt tgtggctgag 420

atcaaggttg cagacaggta cgagagggtg aggtttttcc attgctacaa gcgtggagtc 480

gaccgtgtgt tcatcgacca tccgtcattc ctggagaagg tttggggaaa gaccggtgag 540

aagatctacg gacctgacac tggagttgat tacaaagaca accagatgcg tttcagcctt 600

ctttgccagg cagcactcga ggctcctagg atcctaaacc tcaacaacaa cccatacttc 660

aaaggaactt atggtgagga tgttgtgttc gtctgcaacg actggcacac tggcccactg 720

gcgagctacc tgaagaacaa ctaccagccc aatggcatct acaggaatgc aaaggttgct 780

ttctgcatcc acaacatctc ctaccagggc cgtttcgctt tcgaggatta ccctgagctg 840

aacctctccg agaggttcag gtcatccttc gatttcatcg acgggtatga cacgccggtg 900

gagggcagga agatcaactg gatgaaggcc ggaatcctgg aagccgacag ggtgctcacc 960

gtgagcccgt actacgccga ggagctcatc tccggcatcg ccaggggatg cgagctcgac 1020

aacatcatgc ggctcaccgg catcaccggc atcgtcaacg gcatggacgt cagcgagtgg 1080

gatcctagca aggacaagta catcaccgcc aagtacgacg caaccacggc aatcgaggcg 1140

aaggcgctga acaaggaggc gttgcaggcg gaggcgggtc ttccggtcga caggaaaatc 1200

ccactgatcg cgttcatcgg caggctggag gaacagaagg gccctgacgt catggccgcc 1260

gccatcccgg agctcatgca ggaggacgtc cagatcgttc ttctgggtac tggaaagaag 1320

aagttcgaga agctgctcaa gagcatggag gagaagtatc cgggcaaggt gagggccgtg 1380

gtgaagttca acgcgccgct tgctcatctc atcatggccg gagccgacgt gctcgccgtc 1440

cccagccgct tcgagccctg tggactcatc cagctgcagg ggatgagata cggaacgccc 1500

tgtgcttgcg cgtccaccgg tgggctcgtg gacacggtca tcgaaggcaa gactggtttc 1560

cacatgggcc gtctcagcgt cgactgcaag gtggtggagc caagcgacgt gaagaaggtg 1620

gcggccaccc tgaagcgcgc catcaaggtc gtcggcacgc cggcgtacga ggagatggtc 1680

aggaactgca tgaaccagga cctctcctgg aaggggcctg cgaagaactg ggagaatgtg 1740

ctcctgggcc tgggcgtcgc cggcagcgcg ccggggatcg aaggcgacga gatcgcgccg 1800

ctcgccaagg agaacgtggc tgctccttga 1830

<210> 2

<211> 1830

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atgtcggctc tcaccacgtc ccagctcgcc acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac 60

aggtcggcgc cgtcgtcgct gctccgccac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc 120

gccggcggcg acgcgacgtc gctcagcgtg acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag 180

cagcggtcgg tgcagcgtgg cagccggagg ttcccctccg tcgtcgtgta cgccaccggc 240

gccggcatga acgtcgtgtt cgtcggcgcc gagatggccc cctggagcaa gaccggcggc 300

ctcggtgacg tcctcggtgg cctcccccct gccatggctg cgaatggcca cagggtcatg 360

gtgatctctc ctcggtacga ccagtacaag gacgcttggg ataccagcgt tgtggctgag 420

atcaaggttg cagataggta cgagagggtg aggtttttcc attgctacaa gcgtggagtc 480

gaccgtgtgt tcatcgacca tccgtcattc ctggagaagg tttggggaaa gaccggtgag 540

aagatctacg gacctgacac tggagttgat tacaaagaca accagatgcg tttcagcctt 600

ctttgccagg cagcactcga ggctcctagg atcctaaacc tcaacaacaa cccatacttc 660

aaaggaactt atggtgagga tgttgtgttc gtctgcaacg actggcacac tggcccactg 720

gcgagctacc tgaagaacaa ctaccagccc aatggcatct acaggaatgc aaaggttgct 780

ttctgcatcc acaacatctc ctaccagggc cgtttcgctt tcgaggatta ccctgagctg 840

aacctctccg agaggttcag gtcatccttc gatttcatcg acgggtatga cacgccggtg 900

gagggcagga agatcaactg gatgaaggcc ggaatcctgg aagccgacag ggtgctcacc 960

gtgagcccgt actacgccga ggagctcatc tccggcatcg ccaggggatg cgagctcgac 1020

aacatcatgc ggctcaccgg catcaccggc atcgtcaacg gcatggacgt cagcgagtgg 1080

gatcctagca aggacaagta catcaccgcc aagtacgacg caaccacggc aatcgaggcg 1140

aaggcgctga acaaggaggc gttgcaggcg gaggcgggtc ttccggtcga caggaaaatc 1200

ccactgatcg cgttcatcgg caggctggag gaacagaagg gccctgacgt catggccgcc 1260

gccatcccgg agctcatgca ggaggacgtc cagatcgttc ttctgggtac tggaaagaag 1320

aagttcgaga agctgctcaa gagcatggag gagaagtatc cgggcaaggt gagggccgtg 1380

gtgaagttca acgcgccgct tgctcatctc atcatggccg gagccgacgt gctcgccgtc 1440

cccagccgct tcgagccctg tggactcatc cagctgcagg ggatgagata cggaacgccc 1500

tgtgcttgcg cgtccaccgg tgggctcgtg gacacggtca tcgaaggcaa gactggtttc 1560

cacatgggcc gtctcagcgt cgactgcaag gtggtggagc caagcgacgt gaagaaggtg 1620

gcggccaccc tgaagcgcgc catcaaggtc gtcggcacgc cggcgtacga ggagatggtc 1680

aggaactgca tgaaccagga cctctcctgg aaggggcctg cgaagaactg ggagaatgtg 1740

ctcctgggcc tgggcgtcgc cggcagcgcg ccggggatcg aaggcgacga gatcgcgccg 1800

ctcgccaagg agaacgtggc tgctccttga 1830

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

tgcagacagg tacgagaggg 20

Claims (9)

1.一种突变型waxy基因，所述突变型waxy基因与亲本waxy基因的核苷酸序列相比，在对应于SEQ ID NO.:1所示序列的第435位核苷酸处发生突变，所述第435位核苷酸突变为胸腺嘧啶（T），所述亲本waxy基因来源于水稻。

2.根据权利要求1所述的突变型waxy基因，其特征在于，所述亲本waxy基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

3.一种核酸构建体，其特征在于，所述构建体含有权利要求1-2任一所述的突变型waxy基因的多核苷酸。

4.根据权利要求3所述的核酸构建体，其特征在于，所述构建体还含有与权利要求1-2任一所述的突变型waxy基因的多核苷酸可操作连接的调控元件。

5.根据权利要求4所述的核酸构建体，其特征在于，所述调控元件选自下组中的一种或任意几种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、标记基因。

6.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求1-2任一所述的突变型waxy基因的多核苷酸，或者，包含权利要求3-5任一所述的核酸构建体。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求1-2任一所述的突变型waxy基因的多核苷酸，或者，包含权利要求3-5任一所述的核酸构建体，或者，包括权利要求6所述的载体，所述宿主细胞为非植物细胞。

8.一种降低植物直链淀粉含量的方法或者制备低直链淀粉含量的植物的方法，所述方法包括将植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中的内源性waxy基因突变成权利要求1-2任一所述突变型waxy基因的步骤，所述植物为水稻。

9.权利要求1-2任一所述的突变型waxy基因、权利要求3-5任一所述所述的核酸构建体、权利要求6所述的载体或者权利要求7所述的宿主细胞在制备低直链淀粉含量的植物中的用途，所述植物为水稻。

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