CN101273135B

CN101273135B - 透明质烷产量增加的植物

Info

Publication number: CN101273135B
Application number: CN200680035690.8A
Authority: CN
Inventors: C·弗罗贝格; B·埃西格曼
Original assignee: Bayer CropScience AG
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2005-10-05
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2026-10-05
Also published as: CN101273135A; CN101283098B; AR057535A1; DK1951878T3; HUE025455T2; ZA200802625B; ES2536925T3; BRPI0616845A2; CN101283098A; ZA200803972B; BRPI0616845A8; PT1951878E

Abstract

本发明涉及合成增量的透明质烷的植物细胞和植物，并且涉及制备这类植物的方法，也涉及借助这些植物细胞或植物制备透明质烷的方法。在此，与野生型植物细胞或野生型植物相比，根据本发明的植物细胞或遗传修饰的植物具有透明质烷合酶活性和额外增强的谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性。本发明还涉及具有增加的透明质烷合成的植物在制备透明质烷和含有透明质烷的食品或饲料中的用途。

Description

透明质烷产量增加的植物

技术领域

本发明涉及透明质烷合成量增加的植物细胞和植物，和涉及制备这类植物的方法，还有利用这些植物细胞或植物来制备透明质烷(hyaluronan)的方法。在此，与野生型植物细胞或野生型植物相比，根据本发明的植物细胞或遗传修饰植物具有透明质烷合酶活性和额外增加的谷氨酰胺：果糖6-磷酸-酰胺转移酶(GFAT)活性。本发明还涉及具有增强的透明质烷合成的植物在制备透明质烷和含有透明质烷的食品或饲料中的用途。

背景技术

透明质烷是天然存在的无分支、线型黏多糖(葡糖胺聚糖)，其由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的分子交替构成。透明质烷的基本构成区由葡萄糖醛酸二糖-β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖组成。在透明质烷中，这些重复单位通过β-1，4键彼此连接。在制药业，常使用术语透明质酸。由于在多数情况下透明质烷以聚阴离子而不是以游离酸存在，在下文中，优选地使用术语透明质烷，但每一术语都应当理解为包含两种分子形式。

透明质烷具有特殊的物理化学性质，如：聚合电解质性质、粘弹性质、高结合水能力、凝胶形成特性，透明质烷另外的性质参见Lapcik等人的综述文献(1998，Chemical Reviews 98(8)，2663-2684)。

透明质烷是脊椎动物细胞外结缔组织和体液的成分。在人体内，透明质烷是由所有体细胞，特别是间充质细胞的细胞膜合成。其在结缔组织、细胞外基质、脐带、关节液、软骨组织、皮肤及眼睛的玻璃体内以显著高浓度普遍存在于人体内。最近，在动物无脊椎生物(软体动物)中也发现了透明质烷(Volpi和Maccari，2003，Biochimie 85，619-625)。

此外，由于透明质烷是非免疫原性物质，某些革兰氏阳性病原菌(链霉菌属(Streptococcus)A和C)和革兰氏阴性菌(巴斯德菌属(Pasteurella))合成透明质烷作为保护这些细菌免受其宿主免疫系统攻击的胞外多糖。

侵染小球藻属(chlorella)的单细胞绿藻的病毒，其中一些在草履虫(paramecium)种中以内共生体存在，病毒侵染后赋予单细胞绿藻合成透明质烷的能力(Graves等人，1999，Virology 257，15-23)。然而，该合成透明质烷的能力并不是表征所研究藻类的特征。藻类合成透明质烷的能力由其基因组具有编码透明质烷合酶序列的病毒的侵染介导(DeAngelis，1997，Science 278，1800-1803)。此外，病毒基因组含有谷氨酰胺：果糖6-磷酸-酰胺转移酶(GFAT)的编码序列。GFAT将果糖6-磷酸和谷氨酰胺转变成透明质烷合成代谢途径中重要的代谢物葡糖胺6-磷酸。两个基因编码有活性的蛋白质，如病毒的透明质烷合酶，其在病毒侵染的早期被同时转录(DeAngelis等人，1997，Science 278，1800-1803，Graves等人，1999，Virology257，15-23)。具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸-酰胺转移酶(GFAT)活性的蛋白质的活性既不能从未受病毒侵染的细胞提取物中也不能从病毒侵染的细胞中检测到(Landstein等人，1998，Virology 250，388-396)。因此，在病毒侵染的小球藻细胞内用于透明质烷合成的GFAT表达的作用以及他们是否是透明质烷合成必需的都是未知的。

在天然存在的植物本身在其基因组内没有任何编码催化透明质烷合成的蛋白质的核酸，尽管许多植物碳水化合物已被描述和表征，迄今为止在未侵染的植物中仍无法检测到透明质烷或与透明质烷有关的分子(Graves等人，1999，Virology 257，15-23)。

透明质烷合成的催化作用受单一膜整合或膜结合的酶，透明质烷合酶的影响。迄今已被研究的透明质烷合酶可分成两组：I类透明质烷合酶和II类透明质烷合酶(DeAngelis，1999，CMLS，Cellular and Molecular LifeSciences 56，670-682)。

脊椎动物的透明质烷合酶可通过标记的同工酶另外区分。不同的同工酶按照它们鉴定的顺序使用不同的阿拉伯数字查阅(例如，hsHAS1、hsHAS2、hsHAS3)。

合成的透明质烷分子穿过细胞质膜进入细胞周围介质的转移机理尚未得到完全阐明。早期的假设认为穿过细胞膜的转运受透明质烷合酶自身的影响。然而，最近的结果表明，透明质烷分子穿过细胞质膜的转运是经由负责这一作用的转运蛋白的能量依赖性转运。因此，链球菌菌株由突变产生，其中有活性转运蛋白的合成被抑制。这些菌株比相应的野生型细菌菌株合成较少的透明质烷(Ouskova等人，2004，Glycobiology 14(10)，931-938)。通过特定抑制已知转运蛋白的试剂的帮助，可证明在人类的纤维原细胞中可以减少产生的透明质烷量和透明质烷合酶的活性(Prehm和Schumacher，2004，Biochemical Pharmacology 68，1401-1410)。存在于植物中的能够转运透明质烷的转运蛋白(如果有的话)以多少量存在是未知的。

透明质烷的特殊性质为应用于不同领域，比如制药业、化妆品行业、食品和饲料生产过程、技术应用(如润滑剂)等提供很多致富的可能。目前透明质烷的最主要的应用是在医药和化妆品领域(参见Lapcik等人，1998，Chemical Reviews 98(8)，2663-2684，Goa和Benfield，1994，Drugs 47(3)，536-566)

在医学领域内，含有透明质烷的产品目前已被用于关节病的关节腔内治疗及眼科中用于眼睛手术。透明质烷也用于治疗赛马比赛中的关节疾病。此外，透明质烷是某些鼻科的组成要素，例如以眼药水和鼻骨孔的形式用来湿润干燥的粘膜。含有透明质烷的注射液用作止痛剂和治疗风湿的药剂。含有透明质烷或衍生透明质烷的贴片被用于外伤治疗。就皮肤而言，含有透明质烷的凝胶灌注物可在整形手术中用于矫正皮肤变形。

对于药理学应用，优选使用具有高分子量的透明质烷。

在化妆品医学中，透明质烷制剂是最适皮肤填充材料之一。通过在限定的时间内注入透明质烷可平整皱纹或增大唇体积。

在化妆产品中，特别是在护肤膏和洗液中，透明质烷因其高束水能力而经常用作保湿剂。

另外，含透明质烷的制剂以所谓的营养保健品(食品增补剂)销售，其也可在动物(如狗、马)中用于关节病的预防和缓解。

用于商业目的的透明质烷目前从动物组织(如雄鸡冠)中分离或使用细菌培养发酵制备。

美国专利4,141,973描述从雄鸡冠中或备选地从脐带中分离透明质烷的工艺。除透明质烷外，动物组织(如雄鸡冠、脐带)也含有另外的和透明质烷有关的粘多糖，如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素及肝磷脂。此外，动物机体含有蛋白质(透明质烷黏附质(hyaladherins))，其特定地结合到透明质烷并在机体内是不同功能所必需的，比如透明质烷在肝脏内的降解、透明质烷作为细胞移植的引导结构的功能、细胞内吞作用的调节、透明质烷在细胞表面或透明质烷网络构型上的锚定(Turley，1991，Adv Drug Delivery Rev 7，257 ff.；Laurent和Fraser，1992，FASEB J.6，183 ff.；Stamenkovic和Aruffo，1993，Methods Enzymol.245，195 ff；Knudson和Knudson，1993，FASEB 7，1233 ff.)。

可用于透明质烷的细菌生产的链球菌菌株是专性病原菌。在培养过程中，这些细菌也产生释放到培养基中的(致热)外毒素和溶血素(链球菌溶血素，(特别是α和β溶血素)(Kilian，M.：Streptococcus and Enterococcus.In：Medical Microbiology.Greenwood，D.；Slack，RCA；Peutherer，J.E.(编辑).第16章.Churchill Livingstone，Edinburgh，UK：第174-188页，2002，ISBN 0443070776)。这使借助链球菌菌株制备的透明质烷的净化和分离更困难。特别是用于制药上的应用，在制备中外毒素和溶血素的存在是难题。美国专利4,801,539描述通过发酵诱变的细菌菌株兽疫链球菌(Streptococcus zooedemicus)制备透明质烷。使用的诱变菌株不再合成β-溶血素。产量可达3.6g透明质烷/升培养基。

欧洲专利0694616描述兽疫链球菌或马链球菌(Streptococcus equi)的培养方法，其中在使用的培养条件下，没有链球菌溶血素，但合成增量的透明质烷。产量可达3.5g透明质烷/升培养基。

在培养过程中，链球菌菌株释放透明质酸酶到培养基中，其结果是在这个生产系统中，纯化期间也降低分子量。美国专利4,782,046中描述使用透明质酸酶阴性的链球菌菌株或生产透明质烷的方法的用途，其中在培养期间抑制透明质酸酶的产生。其产量可达2.5g透明质烷/升培养基，并且最大的平均分子量达到3.8×10⁶Da，分子量范围是2.4×10⁶到4.0×10⁶。

US 20030175902和WO 03 054163描述在来自枯草杆菌(Bacillussubtilis)中的类马链球菌(Streptococcus equisimilis)的异源表达的透明质烷合酶的帮助下制备透明质烷。为实现足够量的透明质烷的生产，除透明质烷合酶的异源表达外，芽胞杆菌细胞内UDP-葡萄糖脱氢酶的同步表达也是必要的。US 20030175902和WO 03 054163没有给出在枯草杆菌作用下生产获得的透明质烷的绝对量。达到的最大平均分子量约为4.2×10⁶。然而，该平均分子量仅在重组的杆菌菌株中得到，其中类马链球菌中透明质烷合酶基因的编码基因和枯草杆菌中UDP-葡萄糖脱氢酶的编码基因被整合到在amyQ启动子的调控下的枯草杆菌基因组中，其中同时失活枯草杆菌内源cxpY基因(其编码细胞色素P450氧化酶)。

WO 05 012529描述遗传修饰烟草植物的制备，其中转化使用小球藻侵染病毒中编码透明质烷合酶的核酸分子。在WO 05 012529中，一方面是采用编码小球藻病毒菌株CVHI1透明质烷合酶的核酸序列转化烟草植物，另一方面是采用编码小球藻病毒菌株CVKA1透明质烷合酶的核酸序列转化烟草植物。仅能证明透明质烷的合成是对于从小球藻病毒菌株CVKA1中分离出的编码透明质烷合酶的核酸序列转化的植物。对于从小球藻病毒菌株CVHI1中分离出的编码透明质烷合酶的核酸序列转移的烟草植物，是不可能在相应的转基因植物中检测到透明质烷的合成。据称用在WO 05 012529中唯一的透明质烷生产转基因烟草植物合成透明质烷的数量可以为约4.2μg透明质烷/ml测量体积，考虑进行讨论中的实验的描述，近似相当于12μg产生的透明质烷/g植物材料鲜重。

透明质烷合酶可将初始原料UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-葡萄糖醛酸催化合成透明质烷。上述两种初始原料均存在于植物细胞中。

在植物细胞中，对于UDP-N-乙酰葡糖胺的合成，WO 98 35047描述氨基葡萄糖被许多连续酶催化反应步骤以N-乙酰葡糖胺代谢物、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的形式转化成UDP-N-乙酰葡糖胺的代谢途径。备选的代谢途径包括果糖-6-磷酸和谷氨酰胺合成葡糖胺-6-磷酸的反应，其随后被一系列连续的酶催化反应步骤以葡糖胺-1-磷酸代谢物和N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的形式转化成UDP-N-乙酰葡糖胺。果糖-6-磷酸和谷氨酰胺转化成葡糖胺-6-磷酸是由具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性的蛋白质催化的(Mayer等人，1968，Plant Physiol.43，1097-1107)。

WO 00 11192描述在转基因玉米植物中编码具有GFAT酶活性的蛋白质的玉米核酸分子胚乳特定过表达，其目的是在植物中合成具有2-氨基-葡糖酐分子的阳离子淀粉。依据WO 00 11192的描述，上述代谢途径应导致2-氨基-葡糖酐聚合成淀粉，其中包括经淀粉合酶和/或肝糖合酶将UDP-葡糖胺聚合成淀粉。该专利指出UDP-葡糖胺的增加量可从遗传修饰玉米植物的胚乳粉末中检测到，该遗传修饰玉米植物可能会过表达编码具有以质粒信号肽翻译性融合的GFAT(酶)活性的蛋白质的核酸分子。在表达无信号肽的具有GFAT(酶)活性的蛋白质时，在相应的玉米胚乳组织的粉末中可能会检测到增加量的葡糖胺-1-磷酸。在转基因植物中不可能检测到阳离子淀粉。

通过细菌菌株发酵生产透明质烷涉及到高成本，因为细菌只能在高价控制的培养条件下的密闭无菌容器内发酵(参见例如美国专利4,897,349)。另外，细菌菌株发酵生产的透明质烷量受每一环节的生产设备的限制。在这里，根据物理学定律，必须考虑到发酵罐不能建成过大的培养体积。这里特别注意的可能是外界提供的底物(如：细菌生长必需的营养源、调整pH的试剂、氧气)必须和有效生产必需的培养基均匀混合，所述有效生产在大型的发酵罐中，如果有的话，仅可以用巨大的技术费用来保证。

从动物机体中纯化透明质烷是复杂的，因为在动物组织中存在着其他与透明质烷特定结合的粘多糖和蛋白质。在患者中，使用被动物蛋白污染的含有透明质烷的医药制剂可导致机体有害的免疫反应(US 4,141,973)，尤其当患者对动物蛋白过敏时(如鸡蛋蛋白)。另外，从动物组织中可以以期望的质量和纯度获得的透明质烷的量(产量)较低(雄鸡冠：0.079％w/w(体积比)，EP 0144019，US 4,782,046)，其必须处理大量的动物组织。从动物组织中分离透明质烷的另一个问题是效果，即由于动物组织也含有透明质烷降解酶(透明质酸酶)因而在纯化期间降低分子量。

除透明质酸酶和提及的外毒素外，链球菌菌株也产生内毒素，当其存在于药品中时，会对患者的健康造成威胁。科学研究表明甚至市场上含透明质烷的医药产品中也含有可检测出的细菌内毒素(Dick等人，2003，Eur JOpthalmol.13(2)，176-184)。以链球菌菌株作用生产的透明质烷的另一个缺点是分离到的透明质烷比从雄鸡冠中分离到的透明质烷的分子量低的事实(Lapcik等人1998，Chemical Reviews 98(8)，2663-2684)。US 20030134393描述使用链球菌菌株生产透明质烷的用途，其合成特指的透明质烷胶囊(超级胶囊)。发酵后分离到的透明质烷具有9.1×10⁶的分子量。然而产量仅为350mg/L。

通过细菌发酵或动物组织中分离生产透明质烷的某些缺点可通过利用转基因植物生产透明质烷来避免，然而，当前采用转基因植物可生产获得的透明质烷的量要求相对大的培育面积以生产相对大量的透明质烷。此外，从具有低透明质烷含量的植物中分离或纯化透明质烷比从高透明质烷含量的植物中分离和纯化更加相当的复杂和昂贵。

尽管透明质烷具有特殊的性质，但由于其稀少和昂贵，其很少(如果有的话)用于工业用途。

发明内容

因此，本发明的目的是提供方法和手段，允许提供大量、优质的透明质烷，并且其使提供透明质烷甚至用于工业应用和食品及饲料领域的应用成为可能。

通过权利要求中列举的实施方案实现这一目的。

因此，本发明涉及遗传修饰的植物细胞或遗传修饰的植物，其含有稳定整合进它们的基因组中、编码透明质烷合酶的核酸分子，与那些相应的无转基因的野生型植物细胞或无转基因的野生型植物相比，上述植物细胞或植物的表征是额外具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)(酶)活性的增强的蛋白质活性。

在此，根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物的遗传修饰可以是任意的遗传修饰，该遗传修饰与那些相应的无遗传修饰的野生型植物细胞或无遗传修饰的野生型植物相比，导致将编码透明质烷合酶的核酸分子稳定整合到植物细胞或植物内并在遗传修饰的植物细胞或遗传修饰的植物中增加具有GFAT(酶)活性的蛋白质活性。

本发明情况中，术语“野生型植物细胞”可理解为指植物细胞，其根据本发明被提供作为初始原料用于制备遗传修饰的植物细胞，即它们的遗传信息是除了引入的遗传修饰和产生编码透明质烷合酶的核酸分子的稳定整合和增强具有GFAT活性的蛋白质活性外，相应于根据本发明的遗传修饰的植物细胞的遗传信息。

本发明情况中，术语“野生型植物”可理解为指根据本发明用作制备遗传修饰植物初始原料的植物。即它们的遗传信息是除了引入的和引起编码透明质烷合酶且增强具有GFAT活性的蛋白质的活性的核酸分子的稳定整合的遗传修饰外，相应于那些根据本发明遗传修饰植物所具有的遗传信息。

本发明情况中，术语“相应的”指在比较多个对象时，讨论中的用来与另一个作比较的对象被保持在相同条件下。本发明情况中，在野生型植物细胞或野生型植物情况下的术语“相应的”是指相同培养条件下培养的彼此相比较的植物细胞或植物，同时它们具有相同的(培养)年龄。

本发明情况中，术语“透明质烷合酶”(EC 2.4.1.212)应理解为指从底物UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)和N-乙酰基-葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成透明质烷的蛋白质。依据以下反应历程催化透明质烷合成：

nUDP-GlcA+nUDP-GlcNAc→β-1，4-[GlcA-β-1，3-N-GlcNAc]_n+2nUDP

已描述编码透明质烷合酶的核酸分子和相应的蛋白质序列，尤其是对于下列生物体：兔(穴兔(oryctolagus cuniculus))ocHas2(EMBLAB055978.1，US 20030235893)、ocHas3(EMBL AB055979.1，US20030235893)；狒狒(东非狒狒(Papio anubis))paHas1(EMBL AY463695.1)；青蛙(光滑爪蟾(Xenopus laevis))xlHas1(EMBL M22249.1，US 20030235893)、xlHas2(DG42)(EMBL AF168465.1)、xlHas3(EMBLAY302252.1)；人(智人(homo sapiens))hsHAS1(EMBL D84424.1，US20030235893)、hsHAS2(EMBL U54804.1，US 20030235893)、hsHAS3(EMBL AF232772.1，US 20030235893)；小鼠(小家鼠(Mus musculus))，mmHas1(EMBL D82964.1，US 20030235893)、mmHAS2(EMBL U52524.2，US 20030235893)、mmHas3(EMBLU86408.2，US 20030235893)；牛(欧洲牛(Bos taurus))btHas2(EMBL AJ004951.1，US 20030235893)；小鸡(原鸡(Gallus gallus))ggHas2(EMBL AF106940.1，US 20030235893)；大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus))rnHas 1(EMBL AB097568.1，ltano等人，2004，J.Biol.Chem.279(18)18679-18678)、rnHas2(EMBL AF008201.1)；rnHas 3(NCBI NM_72319.1，ltano等人，2004，J.Biol. Chem.279(18)18679-18678)，马(普氏野马(Equus caballus))ecHAS2(EMBL AY056582.1，Gl：23428486)，猪(野猪(Sus scrofa))sscHAS2(NCBI NM_214053.1，Gl：47522921)、sscHas 3(EMBLAB159675)，斑马鱼(斑马鱼(Danio rerio))brHas1(EMBL AY437407)，brHas2(EMBL AF190742.1)brHas3(EMBLAF190743.1)；多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)pmHas(EMBLAF036004.2)；生脓链球菌(Streptococcus Pyogenes)spHas(EMBL，L20853.1、L21187.1、US 6,455,304、US 20030235893)；马链球菌(Streptococcus equis)seHas(EMBL AF347022.1，AY173078.1)，乳链球菌(Streptococcus uberis)suHasA(EMBL AJ242946.2，US 20030235893)，类马链球菌(Streptococcus equisimilis)seqHas(EMBL AF023876.1，US20030235893)；硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)ssHAS(US20030235893)，超嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii)stHas(AP000988.1)，小球藻病毒1(Paramecium bursaria Chlorella Virus 1)，cvHAS(EMBLU42580.3，PB42580，US 20030235893)。

本发明情况中，术语“谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)”(E.C.2.6.1.16)，在专业文献中也称作葡糖胺合酶，应理解为指从底物谷氨酰胺和果糖-6-磷酸(Fruc-6-P)合成谷氨酰胺-6-磷酸(GlcN-6-P)的蛋白质。催化过程依据以下反应历程：

谷氨酰胺+Fruc-6-P→GlcN-6-P+谷氨酸酯

尤其是在动物机体中，可能显示两种不同的具有GFAT(酶)活性的蛋白质异构体(文献中分别称为GFAT-1和GFAT-2)。Hu等人((2004)，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)描述小鼠的相应蛋白质的差异：除了讨论中的具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶1(GFAT-1)和谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶2(GFAT-2)(酶)活性的蛋白质在组织特效表达上的差异外，可能这两种异构体均受到cAMP依赖的蛋白激酶所引起的磷酸化作用的调节。具有GFAT-1(酶)活性的蛋白质的活性被讨论中的氨基酸序列中的保守的丝氨酸残基的磷酸化作用抑制(小鼠GFAT-1中的丝氨酸205，基因库登录号：AF334736.1)，而具有GFAT-2活性的蛋白质的活性则被讨论中的氨基酸序列中的保守的丝氨酸残基的磷酸化作用增强(小鼠GFAT-2中的丝氨酸202，基因库登录号：NM 013529)。具有GFAT-1活性的蛋白质和具有GFAT-2活性的蛋白质均以与浓度无关的方式受UDP-N-乙酰氨基葡萄糖浓度的抑制；然而，与具有GFAT-1活性的蛋白质相比(UDP-N-乙酰氨基葡萄糖引起的最大活性降低量约51％或80％)，具有GFAT-2活性的蛋白质受UDP-N-乙酰氨基葡萄糖的抑制是较低的(UDP-N-乙酰氨基葡萄糖引起的最大活性降低量约15％)。有迹象表明在动物机体中具有GFAT-1活性的蛋白质的抑制作用与以下事实有关，即在提高UDP-N-乙酰氨基葡萄糖浓度的条件下，所讨论的蛋白质存在O-葡萄糖-N-乙酰氨基葡萄糖糖基化作用。这种由O-糖基化作用引起的蛋白质活性调节是否也能发生在植物体内尚未充分了解(Huber und Hardin，2004，Current Opinion in PlantBiotechnology 7，318-322)。

本发明情况中，术语“谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶-1(GFAT-1)”应理解为指具有GFAT活性并且其活性通过cAMP依赖的蛋白激酶引起的磷酸化来抑制的蛋白质。

本发明情况中，术语“谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶-2 (GFAT-2)”应理解为指具有GFAT活性并且其通过cAMP依赖的蛋白激酶引起的磷酸化激活的蛋白质。

本发明情况中，术语“谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)”被用作理解性术语，其包括所有具有GFAT活性的蛋白质。因此，它也包括文献中提及作为“谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶1(GFAT1)”或“谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶2(GFAT2)”的蛋白质，但并不限于这些。

本发明情况中，术语“具有GFAT(酶)活性的蛋白质的增强活性”指编码具有GFAT活性的蛋白质的内源基因的增强表达，和/或编码具有GFAT活性的蛋白质的增加的转录量，和/或在细胞中具有GFAT活性的蛋白质的增加量，和/或在细胞中具有GFAT活性的蛋白质的增强的酶活性。

例如通过测定编码具有GFAT活性的蛋白质的转录体数量来确定增强的表达，如通过RNA印迹分析或RT-PCR。在此，增强优选地意指与相应的无遗传修饰的野生型植物细胞或无遗传修饰的野生型植物相比，转录体数量上增加至少50％，特别是至少70％，优选至少85％并且特别优选至少100％。编码具有GFAT活性的蛋白质的转录体数量的增加也意指含有不可检测数量的编码具有GFAT活性的蛋白质的转录体的植物或植物细胞，在依据本发明进行遗传修饰后，含有可检测数量的编码具有GFAT活性的蛋白质的转录体。

具有GFAT活性的蛋白质数量的增加例如可通过免疫学方法如蛋白质印迹分析、ELISA(酶联免疫吸附试验)或RIA(放射免疫分析法)来检测，其中GFAT导致提及的植物细胞中的这些蛋白质活性增强。制备与特殊蛋白质发生特定反应，即与所述蛋白质特定地结合的抗体的方法是本领域技术人员公知的(参见例如：Lottspeich和Zorbas(编辑)，1998，Bioanalytik[Bioanalysis]，Spektrum akad.Verlag，Heidelberg，Berlin，ISBN3-8274-0041-4)。某些公司(如比利时的欧洲基因技术(Eurogentee)公司)提供这些抗体的制剂的定购服务。在此，蛋白质量的增加优选地指与相应的无遗传修饰的野生型植物细胞或无遗传修饰的野生型植物相比，具有GFAT活性的蛋白质数量上的增加至少为50％，特别是至少70％，优选至少85％和特别优选至少100％。具有GFAT活性的蛋白质数量的增加也指含有不可检测数量的具有GFAT活性的蛋白质的植物或植物细胞，在依据本发明进行遗传修饰后，含有可检测数量的具有GFAT活性的蛋白质。

在植物提取物中具有GFAT活性的蛋白质增强的活性可通过所述的本领域技术人员公知的方法来检测，如Samac等(2004，Applied Biochemistryand Biotechnology 113-116，Humana Press，Editor Ashok Mulehandani，1167-1182，ISSN 0273-2289)。检测具有GFAT活性的蛋白质活性量的优选的方法参见常用方法(General Methods)，条目5。

在本专利中，具有GFAT活性的蛋白质的(酶)活性的增量优选地指与相应的无遗传修饰的野生型植物细胞或无遗传修饰的野生型植物相比，这类蛋白质活性的增加至少为50％，优选至少70％，尤其优选至少85％和特别优选至少100％。具有GFAT活性的蛋白质的酶活性量上的增加也指含有不可检测数量的具有GFAT活性的蛋白质的植物或植物细胞，在依据本发明进行遗传修饰后，含有可检测数量的具有GFAT活性的蛋白质。

本发明情况中，术语“基因组”应理解为指存在于植物细胞中的全部遗传物质。本领域技术人员公知的，除细胞核外，其他细胞器(如：质粒、线粒体)也包含遗传物质。

本发明情况中，术语“稳定整合的核酸分子”应理解为指核酸分子整合进入植物基因组。稳定整合的核酸分子其特征在于在复制相应整合位点期间，其与在整合位点边界的宿主的核酸序列同时加倍，因此复制的DNA链中的整合位点被与充当复制子的读码链上的相同核酸序列包围。

许多技术用于将核酸分子稳定结合到植物宿主细胞中。这些技术包括通过使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)转化、原生质体融合、注射、DNA电穿孔、DNA基因枪导入的方式还有其他方法(参见“遗传修饰植物”综述，Leandro编辑，Humana Press 2004，ISBN 1-59259-827-7)用T-DNA转化植物细胞。

根癌土壤杆菌介导的植物细胞转化的用途已得到深入研究并已被详尽地描述于EP 120516中(Hoekema，IN：The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V. Alblasserdam(1985)，Chapter V；Fraley等人，Crit.Rev.Plant Sci.4，1-46和在An等人EMBO J.4，(1985)，277-287)。对于马铃薯转化，参见例如Rocha-Sosa等人，EMBO J.8，(1989)，29-33)；对于西红柿转化，参见例如US 5,565,347。

利用基于根癌土壤杆菌的载体转化单子叶植物也已被描述(Chan等人，Plant MoI.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等人，Plant J.6，(1994)271-282；Deng等人，Science in China 33，(1990)，28-34；Wilmink等人，Plant CellReports 11，(1992)，76-80；May等人，Bio/Technology 13，(1995)，486-492；Conner和Domisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie等人，Transgenic Res.2，(1993)，252-265)。转化单子叶植物的备选系统是利用基因枪方法(Wan and Lemaux，Plant Physiol.104，(1994)，37-48；Vasil等人，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等人，Plant MoI.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等人，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)、原生质转化、部分浸透的细胞的电穿孔、使用玻璃纤维的DNA介导的转化。特别地玉米的转化已被多次描述于文献中(例如，WO95/06128，EP0513849，EP0465875，EP0292435；Fromm等人，Biotechnology 8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2，(1990)，603-618；Koziel等人，Biotechnology 11(1993)，194-200；Moroc等人，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。其他草类植物的转化，例如柳枝稷(Panicum virgatum)也已被描述(Richards等人，2001，Plant Cell Reporters 20，48-54)。

其他谷类植物的成功转化也已被描述，如大麦(Wan和Lemaux，s.o.；Ritala等人，s.o.；Krens等人，Nature 296，(1982)，72-74)和小麦(Nehra等人，Plant J.5，(1994)，285-297；Becker等人，1994，Plant Journal 5，299-307)。上述所有方法均适于本专利的情况。

与以前的技术领域相比，本发明中提到的遗传修饰的植物细胞和遗传修饰的植物具有优势即比那些仅具有透明质烷合酶活性的植物产生更高的透明质烷量。这使透明质烷以较低成本生产，因为从高透明质烷含量的植物中分离透明质烷较不复杂同时更经济有效。此外，与现有技术中描述的植物相比，采用本发明中的经遗传修饰的植物生产透明质烷需要较小的种植面积。这使得甚至为目前因其稀少和昂贵而无法进行的工业应用提供足够量的透明质烷变成可能。病毒侵染的小球藻植物体不适用于生产相对大量的透明质烷。在透明质烷的生产中，病毒侵染的藻类具有缺点即透明质烷合成所需基因未稳定整合进它们的基因组中(Van Etten和Meints，1999，Annu.Rev.Microbiol.53，447-494J)，这导致为了生产透明质烷必须不断重复病毒侵染。因此，不可能分离单个能连续合成所需质量和数量的透明质烷的小球藻细胞。而且，在病毒侵染的小球藻中，仅在有限时期内能够生产透明质烷，并且病毒引起的裂解使得藻类在侵染后仅约8小时死亡(VanEtten等人，2002，Arch Virol 147，1479-1516)。相反，本发明提供优势即根据本发明的遗传修饰的植物细胞和根据本发明的遗传修饰的植物能以无限定的方式无性或有性繁殖且它们可连续生产透明质烷。

WO05 012529中描述的遗传修饰植物，其具有编码透明质烷合酶的核酸分子，合成相对少量的透明质烷。与之相比，本发明提供优势即根据本发明的遗传修饰的植物细胞和根据本发明的遗传修饰的植物合成相当多数量的透明质烷。

因此，本发明也提供合成透明质烷的根据本发明的遗传修饰的植物细胞和根据本发明的遗传修饰的植物。优选地根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物合成至少500μg透明质烷/g鲜重，优选至少1500μg透明质烷/g鲜重，特别优选至少3500μg透明质烷/g鲜重，尤其优选至少4000μg透明质烷/g鲜重，最优选至少5500μg透明质烷/g鲜重。

优选地，根据本发明的植物细胞或根据本发明的植物合成至多25000μg透明质烷/g鲜重，优选至多20000μg透明质烷/g鲜重，特别优选至多15000μg透明质烷/g鲜重，尤其优选至多10000μg透明质烷/g鲜重；最优选至多6500μg透明质烷/g鲜重。

已观察到在整个发育阶段透明质烷累积在植物组织中，因此，根据本发明的遗传修饰的植物细胞和根据本发明的遗传修饰的植物中关于鲜重或干重的透明质烷量确定于具体指在上述植物或上述植物细胞收获期间或收获前1-2天。在此，关于用于进一步处理的透明质烷的量，特别地使用植物材料(例如块茎、种子、叶)制备。

合成透明质烷的根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物可通过分离它们合成的的透明质烷并证实其结构来识别。由于植物组织具有优点即其不含透明质酸酶，可用简单、快速的分离方法在根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物中确定透明质烷的存在。为此，将水加入待测植物组织中，然后植物组织被机械性粉碎(如借助珠磨机、搅拌研磨机、互撞式搅拌器、压汁机等)。如果需要，可将更多的水加入到该悬浮液中，然后细胞碎片和不溶于水的成分可通过离心或筛分移除。然后可通过使用例如特异地结合到透明质烷的蛋白质来证明离心后获得的上清液中透明质烷的存在。借助特异地结合到透明质烷的蛋白质用于检测透明质烷的方法描述于例如US 5,019,498。检测试剂盒(如美国科罗拉多州的科占尼克(Corgenix)有限公司的透明质烷(HA)检测试剂盒，产品号：029-001)参见常用方法中条目4)。同时，它能以透明质酸酶初步消化获得的整分试样的离心上清液，然后如上所述借助特异地结合到透明质烷的蛋白质确定透明质烷的存在。通过平行组中透明质酸酶的作用，其中存在的透明质烷被降解，这使得彻底消化后，不再能检测到明显数量的透明质烷。

在离心上清液中透明质烷的存在也可使用其他分析方法证实，如红外(IR)、磁共振(NMR)或质谱法。

玉米中具有与质粒信号肽翻译融合的GFAT(酶)活性的蛋白质的过表达导致UDP-葡糖胺含量的增加，并且玉米中具有GFAT(酶)活性的蛋白质的细胞溶质的过表达导致地面上胚乳组织中葡糖胺-1-磷酸含量的增加。然而UDP-葡糖胺和葡糖胺-1-磷酸并不是通过透明质烷合酶合成透明质烷的底物。此外，公知的葡糖胺对植物细胞具有细胞毒素作用(Roberts等人，1971，Plant Physiol.48，36-42)，而且在植物细胞中如果存在相对高浓度的葡糖胺，其会转变成葡糖胺-6-磷酸。葡糖胺-6-磷酸对植物细胞同样具有毒性(WO 98 35047，US 6,444,878)。此外，公知的具有GFAT活性的蛋白质可以抑制方式被在另外合成UDP-N-乙酰葡糖胺的代谢途径中形成的代谢物调控。例如，从真核细胞(动物和植物体内)中分离的具有GFAT活性的蛋白质被UDP-N-乙酰葡糖胺抑制，其是透明质烷合酶两种底物之一(Kornfeld，1967，J.Biol.Chem.242(13)，3135-3141；Graack等人，2001，Biochem.J.360，401-412；Mayer等人，1968，Plant Physiol.43，1097-1107)。GFAT催化反应的直接反应产物葡糖胺-6-磷酸抑制具有GFAT活性的细菌蛋白质(Deng等人，2005，Metabolic Engineering 7，201-214)。文献中没有指明在植物细胞中可限制合成的透明质烷量的物质。

因此，已经惊奇地发现与(仅)具有透明质烷合酶活性的遗传修饰的植物细胞或遗传修饰的植物相比，含有编码透明质烷合酶的核酸分子和额外增强的GFAT活性的遗传修饰的植物细胞或遗传修饰的植物产生明显高的透明质烷量。

在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其特征在于与仅具有透明质烷合酶活性的遗传修饰的植物细胞或遗传修饰的植物相比，或与具有透明质烷合酶活性但不具有增强GFAT活性的蛋白质活性的遗传修饰的植物细胞或遗传修饰的植物相比，它们产生增加量的透明质烷。

本发明情况中，术语“(仅)具有透明质烷合酶活性的植物细胞或植物”可理解为遗传修饰的植物细胞或遗传修饰的植物，其中与相应的无遗传修饰的野生型植物细胞或无遗传修饰的野生型植物相比，遗传修饰存在于包括编码透明质烷合酶的核酸分子中。

特别地，“(仅)具有透明质烷合酶活性的植物细胞或植物”其特征在于它们合成透明质烷且它们除将编码透明质烷合酶的核酸分子引入无遗传修饰的野生型植物细胞或无遗传修饰的野生型植物外不具有另外的遗传修饰。优选这类植物没有增强的具有GFAT活性的蛋白质的活性。

可借助上述方法确定由植物细胞或植物产生的透明质烷的量。如采用商品化的检测试剂盒(如美国科罗拉多州的科占尼克(Corgenix)有限公司的透明质烷(HA)检测试剂盒，产品型号：029-001)。本发明情况中用于确定植物细胞或植物中透明质烷含量的优选方法描述于常用方法中的条目4。

在本发明另外的实施方案中，根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物分别是合成透明质烷的绿色陆生植物的植物细胞或绿色陆生的植物。

在本发明情况中，术语“绿色陆生植物(有胚植物)”应以Strasburger的“Lehrbuch der Botanik”(植物学教科书)34版，Spektrum Akad.Verl.，1999，(ISBN 3-8274-0779-6)中的定义理解。

本发明优选的实施方案涉及多细胞植物的根据本发明的遗传修饰的植物细胞或其为多细胞有机体的根据本发明的遗传修饰的植物。因此，该实施方案涉及并不源于单细胞植物(原生生物)或不是原生生物的植物细胞或植物。

根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物原则上分别是任何植物种即单子叶植物的或双子叶植物的植物细胞或植物。它们优选的是农作物，即人工种植用于人和动物食用或用于生产生物量和/或用于技术、工业目的制备原料的植物(例如：玉米、稻、小麦、紫花苜蓿、黑麦、燕麦、大麦、树薯、马铃薯、西红柿、柳枝稷(Panicum virgatum)、西米、绿豆、pas、高粱、胡萝卜、茄子、萝卜、芸苔、大豆、花生、黄瓜、南瓜、甜瓜、韭菜、大蒜、卷心菜、菠菜、甘薯、芦笋、小胡瓜、莴苣、朝鲜蓟、甜玉米、欧洲防风草、鸦葱、耶路撒冷蓟、香蕉、甜菜、甘蔗、甜菜根、椰菜、卷心菜、洋葱、黄甜菜、蒲公英、草莓、苹果、杏、李子、桃子、葡萄、花椰菜、芹菜、灯笼椒、蕉青甘蓝(swede)、大黄)。特别优选的是稻、西红柿或马铃薯植物。

在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其中编码透明质烷合酶的核酸分子的特征在于它编码病毒的透明质烷合酶。编码透明质烷合酶的该核酸分子优选编码侵染藻类的病毒的透明质烷合酶。

关于侵染藻类的病毒，编码透明质烷合酶的核酸分子优选编码侵染小球藻的病毒的透明质烷合酶编码，特别优选小球藻病毒1的透明质烷合酶并且尤其优选H1菌株的小球藻病毒的透明质烷合酶。

在另外优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其中编码透明质烷合酶的核酸分子的特征在于与透明质烷合酶所源自有机体的编码透明质烷合酶的核酸分子的密码子相比，其密码子是经修饰的。特别优选地，透明质烷合酶的密码子已被修饰，这使它们适应那些基因组被整合或将被整合的植物细胞或植物的密码子的使用频率。

由于遗传密码的简并性，氨基酸可被一个或多个密码子编码。在不同的有机体中，编码氨基酸的密码子的使用频率不同。使编码核酸序列的密码子适应它们在那些表达的序列已被整合到基因组中的植物细胞或植物中的使用频率会有助于增加特定植物细胞或植物中所讨论的翻译蛋白的数量和/或mRNA的稳定性。所讨论的植物细胞或植物中的密码子的使用频率可由本领域技术人员通过尽可能多地检测所讨论有机体的编码核酸序列，从而确定用于编码某一氨基酸的某一密码子的频率。某些有机体密码子的使用频率是本领域技术人员公知的并且也可以通过使用计算机程序以简单而又快捷的方式确定。相应的计算机程序是公开易得的，并且尤其在网上免费提供(例如：http://gcua.schoedl.de/；http://www.kazusa.or.jp/codon/；http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html)。可通过体外突变或优选通过基因序列的从头合成来实现使编码核酸序列的密码子适应它们在那些所表达的序列已被整合到基因组中的植物细胞或植物中的使用频率。从头合成核酸序列的方法是本领域技术人员公知的。例如从头合成的进行可通过首先合成单个核酸寡核苷酸，将这些核酸寡核苷酸与互补的寡核苷酸杂交，使它们形成DNA双链，然后将这些单个的双链寡核苷酸连接以获得所需核酸序列。包括适应某靶标有机体所使用的密码子频率的核酸序列的从头合成也可从提供这项服务的公司(例如德国雷根斯堡的安太勒克公司(Entelechon GmbH))获得。

编码透明质烷合酶的核酸分子的优选特征在于它编码透明质烷合酶，该透明质烷合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的同一性至少为70％，优选至少80％，更优选至少90％，特别优选至少95％和最优选至少98％。在特别优选的实施方案中，编码透明质烷合酶的核酸分子的特征在于它编码具有SEQ ID No 2中所示的氨基酸序列的透明质烷合酶。

在另外的实施方案中，编码透明质烷合酶的核酸分子与SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3中所示的核酸序列的同一性至少为70％，优选至少80％，更优选至少90％，特别优选至少95％和最优选至少98％。在特别优选的实施方案中，编码透明质烷合酶的核酸分子的特征在于它具有SEQ ID No3中所示的核酸序列。

根据布达佩斯条约规定，含有编码小球藻病毒透明质烷合酶的合成核酸分子的质粒IC 341-222在2004年8月25日，被保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung yon Mikroorganismen undZellkulturen GmBH)，马舍尔欧德路(Mascheroderweg)1b，D-38124不伦瑞克(Braunschweig)，德国)，保藏号为DSM16664。SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列可源自于整合到质粒IC 341-222中且编码小球藻病毒透明质烷合酶的核酸序列的编码区。

因此，本发明也涉及根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其中编码透明质烷合酶的核酸分子的特征在于它编码的蛋白质的氨基酸序列源自插入到质粒DSM16664中的核酸序列编码区，或它编码的蛋白质的氨基酸序列与源自插入到质粒DSM16664中的核酸序列编码区的氨基酸序列的同一性至少为70％，优选至少80％，更优选至少90％，特别优选至少95％和最优选至少98％。

本发明也涉及根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其中编码透明质烷合酶的核酸分子的特征在于它是整合进质粒DSM16664中的透明质烷合酶编码核酸序列，或其与整合进质粒DSM16664中的核酸序列的同一性至少为70％，优选至少80％，更优选至少90％，特别优选至少95％和最优选至少98％。

此外本发明涉及根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其特征在于它们具有稳定整合进它们基因组的外源核酸分子，与相应的无遗传修饰的野生型植物细胞或相应的无遗传修饰的野生型植物相比，所述的外源核酸分子增强具有GFAT活性的蛋白质的活性。

在本发明情况中，术语“外源核酸分子”应理解为指既不是天然存在于相应的野生型植物细胞中，也不是天然存在于野生型植物细胞的具体空间排列中，而是定位在野生型植物细胞基因组中非天然存在的位点上的分子。优选地，外源核酸分子是包括多种元件的重组分子，这些元件的组合或特殊的空间排列并不天然存在于植物细胞中。

在本发明情况中，术语“重组的核酸分子”应理解为指其具有的多个核酸分子以不存在于天然存在的核酸分子中的组合方式组合的核酸分子。因此，重组的核酸分子除编码透明质烷合酶和/或具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子之外，另外具有与提及的核酸分子非天然组合存在的核酸序列。提及的存在于与编码透明质烷合酶或具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子组合的重组核酸分子中的另外的核酸序列可以是任何序列。例如，它们可以是基因组植物核酸序列。另外的核酸序列优选是调节序列(启动子、终止信号、增强子)，特别优选的调节序列是在植物组织中有活性的，特别优选的组织特异性调节序列是在植物组织中有活性的。产生重组核酸分子的方法是本领域技术人员公知的，包括基因工程方法，例如通过连接反应的核酸分子连接、遗传重组或核酸分子的从头合成(参见例如Sambrok等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.ISBN：0879695773，Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；第5版(2002)，ISBN：0471250929)。

遗传修饰的植物细胞和遗传修饰的植物，其具有一个或多个稳定整合进它们的基因组中的编码透明质烷合酶的外源核酸分子且所述外源核酸分子与相应的无遗传修饰的植物细胞和无遗传修饰的植物相比增强具有GFAT活性的蛋白质的活性，可与所述野生型植物细胞和所述野生型植物分别相区分，尤其分别通过它们包含非自然存在于野生型植物细胞和野生型植物中的外源核酸分子的事实，或由于该分子被整合在根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物的基因组中的位点上，其中该位点并不分别存在于野生型植物细胞和野生型植物中，即在不同的基因环境中。而且，此类根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物可分别与无遗传修饰的植物细胞和无遗传修饰的植物相区分，如果合适，除了这样的存在于野生型植物细胞或野生型植物中的分子拷贝外，它们至少包括稳定整合到其基因组中的外源核酸分子的一个拷贝。如果引入到根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物中的外源核酸分子是自然存在于野生型植物细胞或野生型植物中的分子之外的附加拷贝，可将根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物与野生型植物细胞或野生型植物相区分，特别是通过该附加拷贝/这些附加拷贝被定位在基因组中的某些位点上，而它/它们并不分别存在于野生型植物细胞和野生型植物中的事实。

可通过遗传方法和/或分子生物学方法证明核酸分子与植物细胞或植物的基因组间的稳定整合。核酸分子与植物细胞或植物的基因组间的稳定整合的特征在于在遗传上述核酸分子的后代中，稳定整合的核酸分子存在于和其亲代相同的基因组环境中。可通过采用本领域技术人员公知的方法，尤其借助RFLP(限制性片段长度多态性)分析的DNA印迹分析(Nam等人，1989，The Plant Cell 1，699-705；Leister和Dean，1993，The PlantJournal 4(4)，745-750)；基于PCR的方法，如扩增片段长度中的差异分析(扩增片段长度多态性，AFLP)(Castiglioni等人，1998，Genetics 149，2039-2056；Meksem等人，2001，Molecular Genetics and Genomics 265，207-214；Meyer等人，1998，Molecular and General Genetics 259，150-160)或采用限制性核酸内切酶酶切的扩增片段(酶切扩增的多态序列，CAPS)(Konieczny和Ausubel，1993，The Plant Journal 4，403-410；Jarvis等人，1994，Plant Molecular Biology 24，685-687；Bachem等人，1996，The PlantJournal 9(5)，745-753)来证明在植物细胞基因组或植物基因组中稳定整合的核酸序列的存在。

原则上，外源核酸分子可以是在植物细胞或植物中增强具有GFAT活性的蛋白质的活性的任何核酸分子。

在本发明情况中，也可通过采用插入诱变的方式制备根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物(参见：Thomeycroft等人，2001，Journal of experimental Botany 52(361)，1593-1601)。在本发明情况中，插入诱变应理解为指将转座子或转运DNA(T-DNA)插入到基因或具有GFAT活性的蛋白质的编码基因的附近，从而提高所讨论细胞中具有GFAT活性的蛋白质的活性。

转座子既可以是存在于天然细胞中的转座子(内源转座子)也可以是那些非天然存在于上述细胞中，却由基因工程，例如细胞转化引入细胞中的转座子(外源转座子)。由转座子引起的基因表达的修饰是本领域技术人员公知的。Ramachandran和Sundaresan撰写了关于在植物生物技术领域内，应用内源、外源转座子作为工具的综述(2001，Plant Physiology andBiochemistry 39，234-252)。

T-DNA插入诱变基于根据根癌土壤杆菌中Ti质粒的某些片段(T-DNA)可被整合到植物细胞基因组中的事实。整合进植物染色体中的位点不是预定的。整合可发生在任何位置。如果T-DNA被整合进片段或被整合进表现基因功能的染色体片段附近，这可导致增强的基因表达并因此也致使由所讨论基因编码的蛋白质活性改变。

插入基因组中的序列(尤其是转座子或T-DNA)的特征在于它们包含可导致具有GFAT活性的蛋白质的编码基因的调节序列激活的序列。优选地，插入到基因组(尤其是转座子或T-DNA)中的序列的特征在于它们被整合到编码具有GFAT活性的蛋白质的植物细胞或植物的基因组中的内源核酸分子附近。

可使用如激活标记的方法产生根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物(参见例如Walden等人，Plant J.(1991)，281-288；Walden等人，Plant MoI.Biol.26(1994)，1521-1528)。该方法基于增强子序列引起的内源启动子活化例如花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子的增强子或者章鱼碱合酶的增强子。

在本发明情况中，术语“T-DNA激活标记”应理解为指T-DNA片段，该T-DNA片段包括增强子序列和通过整合进入植物细胞的基因组来增强具有GFAT活性的蛋白活性。

在本发明情况中，术语“转座子激活标记”应理解为指转座子，该转座子包括增强子序列和通过整合进植物细胞的基因组来增强具有GFAT活性的蛋白活性。

本发明优选的实施方案涉及根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其特征在于至少有一种编码具有GFAT(酶)活性的蛋白质的外源核酸分子。

本发明特别优选的实施方案涉及根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其特征在于有编码具有GFAT(酶)活性的蛋白质的外源核酸分子。

根据本发明，编码具有GFAT(酶)活性的蛋白质的外源核酸分子可来自任何有机体，所述核酸分子优选的源自细菌、真菌、动物、植物或病毒，特别优选来自哺乳动物、植物或细菌并且尤其优选来自小鼠或大肠杆菌(Escherichia coli)。

就病毒而言，编码具有GFAT(酶)活性的蛋白质的外源核酸分子源自侵染藻类的病毒，优选来自侵染小球藻属藻类的病毒，特别优选来自小球藻病毒并且尤其优选来自H1菌株的小球藻病毒。

也可能将突变产生的核酸分子引入根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，代替天然存在的编码具有GFAT(酶)活性的蛋白质的核酸分子，其中所述诱变的外源核酸分子的特征在于它编码具有GFAT(酶)活性的蛋白质以减少通过代谢物的抑制作用(例如葡糖胺代谢)。从大肠杆菌中制备具有GFAT(酶)活性的蛋白质的这类诱变核酸分子的制备以示例性的方式被描述在Deng等(2005，Metabolic Engineering 7，201-214；WO 04 003175)中。从小鼠中获得的具有GFAT活性的蛋白质的突变体被描述于例如Hu等人(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993) 中。

编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子是本领域技术人员公知的并描述于文献中。因此，描述了编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子，其来自病毒，如小球藻病毒k2(EMBL登录号AB107976.1)；来自细菌，如大肠杆菌(Dutka-Malen，1988，Biochemie 70(2)，287-290；EMBL登录号：L10328.1)；来自真菌，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(EMBL登录号AF334737.1，Watzele等人，1989，J.Biol.Chem.264，8753-8758)、黑曲霉(Aspergillus niger)(EMBL登录号AY594332.1)、白色念珠菌(Candidaalbicans)(EMBL登录号X94753.1)；来自昆虫，如伊蚊(Aedes aegyti)(Kato等人，2002，Insect.Biol.11(3)，207，216；EMBL登录号AF399922.1)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(GFAT-1：EMBL登录号Y18627.1，GFAT-2：NCBI登录号NMJ43360.2)；来自藻类，如草菇(Volvariella volvacea)(EMBL登录号AY661466.1)；来自脊椎动物，如智人(Homo sapiens)(GFAT-1：EMBL登录号AF334737.1；GFAT-2：NCBI登录号BC000012.2，Oki等人，1999，Genomics 57(2)，227-34)、小家鼠(Mus musculus)(GFAT-1：EMBL登录号AF334736.1；GFAT-2：EMBL登录号AB016780.1)、或者来自植物，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)(EMBL登录号AP001297.1；cds NCBI登录号BAB03027.1)。

在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其中编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子选自以下组成的组：

a)核酸分子，其编码具有SEQ ID NO 5中提供的氨基酸序列的蛋白质，或具有SEQ ID NO 7中提供的氨基酸序列的蛋白质，或具有SEQ IDNO 9中提供的氨基酸序列的蛋白质；

b)核酸分子，其编码的蛋白质的序列与SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 9中提供的氨基酸序列具有至少为60％、优选至少为80％、更优选至少为90％、特别优选至少为95％和最优选至少为98％的同一性；

c)核酸分子，其包含SEQ ID NO 4中所示的核苷酸序列或其互补序列、SEQ ID NO 6中所示的核苷酸序列或其互补序列、SEQ ID NO 8中所示的核苷酸序列或其互补序列，或SEQ ID NO 10中所示的核苷酸序列或其互补序列；

d)核酸分子，其与a)或c)中描述的核酸序列的同一性至少为70％，优选至少为80％，更优选至少为90％，特别优选至少为95％和最优选至少为98％；

e)核酸分子，其在严紧条件下与a)或c)中描述的核酸序列的至少一条链杂交；

f)核酸分子，其核苷酸序列由于遗传密码简并性而不同于a)或c)中提到的核酸分子的序列；和

g)核酸分子，其可以是a)、b)、c)、d)、e)或f)中提到的核酸分子的片段、等位基因变体和/或衍生物。

在本发明情况中，术语“杂交”应理解为指在传统杂交条件下的杂交，优选在严紧条件下，描述于例如Sambrock等人(参见MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)中。优选地，“杂交”指在如下条件下的杂交：

杂交缓冲液：

2×SSC；10×Denhardt溶液(Fikoll 400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na₂HPO₄；250μg/ml的鲱鱼精DNA；50μg/ml的tRNA；或25M磷酸钠缓冲溶液pH 7.2；1mM EDTA；7％SDS。

杂交温度：

T＝65-68℃；

洗涤缓冲液：0.1×SSC；0.1％SDS；

洗涤温度：T＝65-68℃。

与编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子杂交的核酸分子可来自任何有机体，因此它们可来自细菌、真菌、动物、植物或病毒。

与编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子杂交的核酸分子特别优选来自哺乳动物、植物或细菌并且尤其优选来自小鼠或大肠杆菌。

与编码具有GFAT-1或GFAT-2活性蛋白质的核酸分子杂交的核酸分子优选来自真核生物，特别优选来自动物有机体，尤其优选来自小鼠。

例如，与上述分子杂交的核酸分子可从基因组或cDNA文库中分离。可用上述核酸分子或这些分子的片段或这些分子的互补体，如根据标准方法(参见：Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)进行的杂交或通过PCR的扩增来识别和分离这样的核酸分子。例如，作为用于分离编码具有GFAT活性或GFAT-1活性或GFAT-2活性蛋白质的核酸序列的杂交样本，可能使用准确的或主要的具有SEQ ID NO 4或SEQID NO 6或SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 10提供的核苷酸序列或这些序列的部分中的核酸分子。

作为杂交样本的片段也可以是合成片段或采用常规的合成技术制备的寡核苷酸，其序列和本发明情况中描述的核酸分子的序列基本上一致。一旦和本发明情况中描述的核酸序列杂交的基因被鉴定和分离，应确定该序列并且分析由该序列编码的蛋白质性质以确定它们是否是具有GFAT活性的蛋白质。如何确定蛋白质是否是具有GFAT(例如：Mayer等人，1968，Plant Physiol.43，1097-1107；Deng等人，2005，Metabolic Engineering 7，201-214)、GFAT-1或GFAT-2(例如Hu等人，2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)活性的蛋白质的方法是本领域技术人员公知的，而且描述于上述文献中。

与本发明情况中描述的核酸分子杂交的分子中特别包含上述核酸分子的片段、衍生物和等位基因变体。在本发明情况中，术语“衍生物”指这些分子的序列在一个或多个方面与上述核酸分子序列有所不同并且与这些序列高度一致。例如，与上述核酸分子间的差异可能是由于缺失(尤其是5′-和/或3′-缺失，导致相应蛋白质的N-和/或C-末端缺失)、增加、取代、插入或重组。

在本发明情况中，术语“同一性”指在核酸分子编码区的全长范围内或在编码蛋白质的氨基酸序列全长范围内至少70％，优选至少80％，特别优选至少为90％并且尤其优选至少95％和最优选至少98％的序列同一性。在本发明情况中，术语“同一性”应理解为指与其他蛋白质/核酸相同的氨基酸/核苷酸的数目，以百分数表示。优选地，对于具有GFAT活性的蛋白质的同一性可通过与SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 9提供的氨基酸序列比较来确定，对于编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子的同一性可借助计算机程序通过将SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 10提供的核酸序列与其他蛋白质/核酸比较来确定。如果彼此进行比较的序列具有不同长度，其同一性可通过确定短序列与长序列共有的氨基酸数量的百分比来确定。优选地，可通过采用熟知的、公开采用的计算机程序ClustalW来确定同一性(Thompson等人，Nucleic Acids Research 22(1994)，4673-4680)。公开可用的ClustalW由Julie Thompson(ThompsonEMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(GibsonEMBL-Heidelberg.DE)两人开发(欧洲分子生物学实验室，Meyerhofstrasse 1，D 69117海德尔堡，德国)。ClustalW也可从各种网页上下载，另外从IGBMC(Institut de Genetique et de Biologie Moleculaireet Cellulaire，B.P.163，67404 lllkirch Cedex，France；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)或从EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)以及所有的EBI(European Bioinformatics Institute，Wellcome Trust GenomeCampus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK)镜像网页上下载。

优选地，利用1.8版本的ClustalW计算机程序来确定本发明情况中描述的蛋白质与其他蛋白质间的同一性。在此，设置参数如下：KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。

优选地，1.8版本的ClustalW计算机程序的用途是用来确定本发明情况中描述的核酸分子的核苷酸序列与其他核酸分子的核苷酸序列间的同一性。在此，设置参数如下：

KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIX：IUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS：不加权。

同一性还指在上述核酸分子间或是由其编码的蛋白质间具有功能和/或结构方面的等值。与上述分子同源的并代表这些分子的衍生物的核酸分子通常是不同于那些代表具有相同生物学功能的修饰的分子。它们既可以是天然存在的差异，例如来自其他物种的序列，或突变，其中这些突变可以自然的方式发生或由靶标突变引入。此外，这些变异也可以是合成产生的序列。等位基因变体可以是天然存在的变体或合成产生的变体或由重组DNA技术产生的变体。衍生物的特殊形式是例如，由于遗传密码的简并性而不同于本发明情况中描述的核酸分子的核酸分子。

编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子的不同衍生物具有某些共同的性质。例如，这些性质可以是生物活性、底物特异性、分子量、免疫反应、构象等，以及物理性质，如凝胶电泳中的迁移率性质、层析特性、沉降系数、溶解性、分光性质、稳定性、最适pH值、最适温度等。具有GFAT活性的蛋白质的优选性质是本领域技术人员公知的，已在上文中提到并且在此以类似方式应用。

在另外优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其中编码具有GFAT活性的蛋白质的质的核酸分子的特征在于所述核酸分子的密码子不同于亲代有机体中编码具有GFAT(酶)活性的所述蛋白质的核酸分子密码子。特别优选地，编码具有GFAT(酶)活性的蛋白质的核酸分子密码子被改变，从而使它们适应基因组被整合或将被整合的植物细胞或植物的密码子的使用频率。

本发明另外提供根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其特征在于稳定整合进入编码透明质烷合酶和/或编码具有GFAT(酶)活性的蛋白质的植物细胞或植物的基因组中的外源核酸分子与植物细胞中起始转录的调节元件(启动子)相连接。这些可以是同源的或异源的启动子。该启动子可以是组成型的、组织特异的、发育特异的或是受外界因子调节的(例如在应用化学物质后，由非生物因子作用，如热和/或冷、干旱、疾病等)。在此，编码透明质烷合酶或具有GFAT1(酶)活性的蛋白质的核酸分子被整合进入根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物的基因组中，在各个情况下均可连接到相同启动子，或个体序列可连接到不同启动子。

本发明优选的实施方案涉及根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物，其中选自编码透明质烷合酶或具有GFAT(酶)活性的蛋白质的核酸分子组成的组的至少一种外源核酸分子，特别优选至少两种外源核酸分子，尤其优选三种外源核酸分子与组织特异性启动子连接。优选的组织特异性启动子是在植物块茎、果实或种子细胞或叶内特异性起始转录的启动子。

为表达编码透明质烷合酶或具有GFAT(酶)活性的蛋白质的核酸分子，优选其与植物细胞内确保转录的调控DNA序列连接。这些特别包括启动子。通常在植物细胞内任何有活性的启动子均适用表达。

在此，可选择启动子，从而使表达是组成型的或仅在某一组织内、在植物发育的某一时间点或由外界因子决定的时间点表达。对于植物和将被表达的核酸分子，启动子可以是同源的或异源的。

例如对于组成型表达，合适的启动子是花椰菜花叶病毒的35S RNS启动子或来自玉米或洋丁香(Cestrum)YLCV(Yellow Leaf Curling Virus；WO 01 73087；Stavolone等人，2003，Plant Mol.Biol.53，703-713)的泛素启动子；马铃薯中块茎特异表达的patatingen启动子B33(Rocha-Sosa等人，EMBO J.8(1989)，23-29)；或者西红柿的果实特异性启动子，例如西红柿的多聚半乳糖醛酸酶启动子(Montgomery等人，1993，Plant Cell 5，1049-1062)或西红柿的E8启动子(Metha等人，2002，Nature Biotechnol.20(6)，613-618)或桃中的ACC氧化酶启动子(Moon和Callahan，2004，J.Experimental Botany 55(402)，1519-1528)或仅在有光合作用活性的组织内确保表达的启动子，例如ST-LS1启动子(Stockhaus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等人，EMBO J.8(1989)， 2445-2451)；来自小麦的胚乳特异表达的HMWG启动子、USP启动子、菜豆蛋白启动子、玉米中玉米醇溶蛋白基因的启动子(Pedersen等人，Cell29(1982)，1015-1026；Quatroccio等人，Plant Mol.Biol.15(1990)，81-93)、谷蛋白启动子(Leisy等人，Plant MoI.Biol.14(1990)，41-50；Zheng等人，Plant J.4(1993)，357-366；Yoshihara等人，FEBS Lett.383(1996)，213-218)、shrunken-1启动子(Werr等人，EMBO J.4(1985)，1373-1380)、血球素启动子(Nakase等人，1996，Gene 170(2)，223-226)或醇溶谷蛋白启动子(Qu und Takaiwa，2004，Plant Biotechnology Journal 2(2)，113-125)。然而，也可能采用仅在由外界因子确定下的时间点有活性的启动子(例如WO9307279)。这里特定的靶标是允许简单诱导的热休克蛋白质的启动子。此外可采用种子特异性启动子，例如可在蚕豆(Vicia faba)和其他植物中确保种子特异性表达的蚕豆的USP启动子(Fiedler等人，Plant Mol.Biol.22(1993)，669-679；Baumlein等人，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。

存在于感染藻类的病毒基因组中的启动子也适用于在植物中表达核酸序列(Mitra等人，1994，Biochem.Biophys Res Commun 204(1)，187-194；Mitra和Higgins，1994，Plant MoI Biol 26(1)，85-93，Van Etten等人，2002，Arch Virol 147，1479-1516)。

在本发明情况中，术语“组织特异”应理解为指对某组织的现象的实质性限定(例如转录的起始)。

本发明情况中，术语“块茎、果实或种子的细胞”应理解为指存在于块茎、果实或种子中的所有细胞。

本发明情况中，术语“同源启动子”应理解为指天然存在于植物细胞或植物中用于制备根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物的启动子(对于植物细胞或植物而言是同源的)或指在从其分离序列的有机体中调节基因的表达调控的启动子(对于将被表达的核酸分子而言是同源的)。

本发明情况中，术语“异源启动子”应理解为指非天然存在于用于制备根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物的植物细胞或植物中的启动子(对于植物细胞或植物而言是异源的)或指在从其分离将被表达的核酸序列的有机体中非天然存在的用于调控所述核酸序列表达的启动子(对于将被表达的核酸分子而言是异源的)。

也可以是向转录物增加poly-A尾的终止序列(多腺苷酸化信号)。poly-A尾被认为是起稳定转录物作用。这样的元件描述于文献中(参见Gielen等人，EMBO J.8(1989)，23-29)并可根据需要进行调换。

内含子序列也可能存在于启动子和编码区之间。这些内含子序列可能导致植物中的表达和增强表达的稳定性(Callis等人，1987，Genes Devel.1，1183-1200；Luehrsen和Walbot，1991，Mol.Gen.Genet.225，81-93；Rethmeier等人，1997；Plant Journal 12(4)，895-899；Rose和Beliakoff，2000，Plant Physiol.122(2)，535-542；Vasil等人，1989，Plant Physiol.91，1575-1579；XU等人，2003，Science in China Series C Vol.46 No.6，561-569)。例如，合适的内含子序列是玉米sh1基因的首个内含子、玉米聚泛素基因1的首个内含子、水稻EPSPS基因的首个内含子、或拟南芥PAT1基因的前两个内含子之一。

本发明也涉及包括根据本发明的遗传修饰的植物细胞的植物。这些植物可通过根据本发明的遗传修饰的植物细胞再生来产生。

本发明也涉及根据本发明的遗传修饰植物的可加工或可消耗的部分，其包括根据本发明的遗传修饰的植物细胞。

在本发明情况中，术语“可加工部分”应理解为指用来制备食品或饲料的植物部分，其被用作工业加工的原材料来源、用作制备药品的原材料来源、或作为用于制备化妆产品的原材料来源。

在本发明情况中，术语“可消耗部分”应理解为指用作人类食物或用作动物饲料的植物体部分。

本发明也涉及根据本发明的遗传修饰的植物的繁殖材料，其包括根据本发明的遗传修饰的植物细胞。

这里，术语“繁殖材料”包括适用于通过生长或生殖途径产生后代的植物的那些组分。适于植物生长繁殖的如插条、愈伤组织培养物、根茎或块茎。其他繁殖材料包括如果实、种子、秧苗、原生质体、细胞培养物等。优选繁殖材料主要采用块茎、果实或种子的形式。

在另外的实施方案中，本发明涉及根据本发明的遗传修饰的植物的可收获植物体部分，例如果实、贮藏根或其他类型的根、花、芽(buds)、枝条(shoots)、叶子或茎(stalks)，优选种子、果实或块茎，这些可收获的部分包括根据本发明的遗传修饰的植物细胞。

优选地，本发明涉及包括透明质烷的根据本发明的繁殖材料或根据本发明的植物的可收获部分。尤其优选的是合成透明质烷的根据本发明的繁殖材料或根据本发明的植物的可收获部分。

在本发明情况中，术语“马铃薯植物”或“马铃薯”应理解为指茄(Solanum)属中的植物种，尤指茄属中的产生块茎的物种并且特别是马铃薯(Solanum tuberosum)。

在本发明情况中，术语“西红柿植物”或“西红柿”应理解为指番茄(Lycopersicon)属中的植物种，特别是番茄(Lycopersicon esculentum)。

本发明另外的优点是根据本发明的遗传修饰的植物的可收获部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分比在文献中描述的合成透明质烷的转基因植物可产生更多的透明质烷。因此，根据本发明的遗传修饰的植物不仅特别适于用作分离透明质烷的原料而且还可直接用作食品/饲料或用于制备具有预防或治疗疾病特征的食品/饲料(例如用于骨关节炎预防，US6,607,745)。由于根据本发明的遗传修饰的植物具有比文献中描述的植物更高的透明质烷含量，这类食品/饲料制备需要较少数量的根据本发明的遗传修饰植物的可收获部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分。例如，如果根据本发明的遗传修饰植物的可消耗部分被例如作为所谓的“营养食品”直接消耗，可能甚至通过消化相对少量的物质也能获得阳性效果。这一点在动物饲料生产中尤其具有特殊意义，因为具有太高含量植物成分的动物饲料不适于用作不同动物物种的饲料。

由于透明质烷具有强结合水能力，根据本发明的遗传修饰的植物的可收获部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分还具有当生产固化食品/饲料时需要较少增稠剂的优点。因此，例如，果冻的生产需要低糖，这对健康有着附加的积极作用。在需要植物原料脱水的食品/饲料的生产中，使用根据本发明的遗传修饰的植物的可收获部分、繁殖材料、可加工部分或可消耗部分的优点在于从所讨论的植物原料中需要移出的水较少，导致生产成本降低，并且由于采用更温和的制备方法(例如，较低和/或较短的加热)，所讨论的食品/饲料获得提高的营养价值。因此，例如，在生产番茄酱中，为了获得期望的稠度而需要导入的能量更少。

本发明还提供制备合成透明质烷植物的方法，其包括：

a)遗传修饰的植物细胞，其中遗传修饰包括下面步骤i和ii，

i)将编码透明质烷合酶的外源核酸分子导入植物细胞，

ii)将遗传修饰导入植物细胞，与相应的无遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有GFAT(酶)活性的蛋白质活性的增强，

其中步骤i和ii可以任何顺序单独进行，或可同时进行步骤i和ii的任一组合；

b)将步骤a)中的植物细胞再生成植物；

c)如果合适，使用步骤b)的植物产生更多的植物，其中如果合适，从步骤b)的植物中分离植物细胞并且重复该方法的步骤a)至c)，直到产生具有编码透明质烷合酶的外源核酸分子并且与相应的无遗传修饰的野生型植物细胞相比具有增强的GFAT(酶)活性的蛋白质活性的植物。

本发明优选地涉及用于制备合成透明质烷植物的方法，该方法包括：

a)遗传修饰的植物细胞，其中遗传修饰包括以下步骤i至ii的任一顺序或单独或同时进行步骤i至ii的任一组合，

i)将编码透明质烷合酶的外源核酸分子导入植物细胞，

ii)将遗传修饰导入植物细胞，与相应的无遗传修饰的野生型植物细胞相比，该遗传修饰导致具有GFAT(酶)活性的蛋白质活性增强；

b)从包含根据以下步骤的遗传修饰的植物细胞再生植物

i)a)i

ii)a)ii

iii)a)i和a)ii；

c)导入根据以下步骤的植物的植物细胞

i)b)i根据步骤a)ii的遗传修饰，

ii)b)ii根据步骤a)i的遗传修饰，和再生植物；

d)如果合适，借助根据b)iii或c)i或c)ii的任一步骤获得的植物生成更多的植物。

原则上根据步骤a)导入植物细胞内的遗传修饰可以是任一类型的导致具有GFAT(酶)活性的蛋白质活性增强的修饰。

依据本发明的方法，可通过本领域技术人员公知的方法实现按照步骤b)和(如果合适)步骤c)的植物再生(例如描述于″Plant Cell CultureProtocols″，1999，edited by R.D.Hall，Humana Press，ISBN0-89603-549-2)。

例如，根据本发明的方法的另外植物的产生(取决于按步骤c)或步骤d)的方法)可通过植物的繁殖(例如通过插条、块茎或通过愈伤组织培养和完整植物再生)或通过生殖繁殖实现。在本发明情况中，生殖繁殖通常发生在控制条件下，即选择的具有特定性质的植物彼此杂交并繁殖。优选的世代延续以这样的方式发生即更多的植物(取决于按步骤c)或步骤d)产生的方法)包含在前述步骤中引入的修饰。

在根据本发明的用于制备合成透明质烷的植物的方法中，用于产生根据本发明的遗传修饰的植物细胞的遗传修饰可同时或按连续步骤完成。在此，是否使用与将编码透明质烷合酶的外源核酸分子导入植物细胞中的遗传修饰相同的方法对于在导致具有GFAT(酶)活性的蛋白质活性增强的连续遗传修饰是不重要的。

在根据本发明的用于制备合成透明质烷的植物的方法的另外的实施方案中，遗传修饰包括将至少一个外源核酸分子引入植物细胞的基因组中，其中外源核酸分子的存在或表达在植物细胞内导致具有GFAT(酶)活性的蛋白质活性增强。

如上所述，引入植物细胞或植物中用于遗传修饰的外源核酸分子是依据本发明方法的步骤a)中引入以用于制备合成透明质烷的植物，其可以是单个核酸分子或多个核酸分子。因此，编码透明质烷合酶和/或编码具有GFAT(酶)活性蛋白质的外源核酸分子可在单一核酸分子上共存，或它们可以存在于分开的核酸分子上。如果编码透明质烷合酶和编码具有GFAT(酶)活性蛋白质的核酸分子存在于多个核酸分子上，可以同时或以连续的步骤将这些核酸分子导入植物细胞中。

此外，为在本发明方法的实践中引入用来制备合成透明质烷的植物的外源核酸分子，可能采用突变体细胞或突变体来代替野生型植物细胞或野生型植物，这些突变体细胞或突变体因其已具备具有GFAT(酶)活性的蛋白质的增强活性而区别。与相应的野生型植物细胞或野生型植物相比，如果突变体细胞或突变体已具备具有GFAT(酶)活性的蛋白质的增强活性，其足以进行根据本发明用于生产合成透明质烷的植物的方法以将编码透明质烷合酶的外源核酸分子引入所述突变体细胞或突变体中。

所有上述涉及突变体用于制备根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物的用途是以相似方式应用于此。

在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明用来生产合成透明质烷的植物，其中步骤a)中编码透明质烷合酶的核酸分子选自：

a)核酸分子，其特征在于编码病毒的透明质烷合酶；

b)核酸分子，其特征在于编码小球藻侵染病毒的透明质烷合酶；

c)核酸分子，其特征在于编码小球藻病毒1的透明质烷合酶；

d)核酸分子，其特征在于编码小球藻病毒1的H1菌株的透明质烷合酶；

e)核酸分子，其特征在于与透明质烷合酶亲代有机体中编码透明质烷合酶的核酸分子的密码子相比，编码透明质烷合酶的核酸分子的密码子是被修饰的；

f)核酸分子，其特征在于透明质烷合酶密码子已被修饰从而可适应那些将被结合或已结合到植物细胞或植物基因组中的密码子的使用频率；

g)核酸分子，其特征在于它们编码具有SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的透明质烷合酶或编码的的透明质烷合酶的氨基酸序列与SEQ IDNO 2中所示的氨基酸序列的同一性至少为70％，优选至少为80％，特别优选至少为90％，尤其优选至少为95％，以及最优选至少为98％；

h)核酸分子，其特征在于其编码蛋白质的氨基酸序列可源于插入质粒DSM16664中的核酸序列编码区，或其编码蛋白质的氨基酸序列与源于插入到质粒DSM16664中的核酸序列的编码区的氨基酸序列具有至少为70％，优选至少为80％，特别优选至少为90％，尤其优选至少为95％，和最优选至少为98％的同一性；

i)核酸分子，其包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3中所示的核酸序列，或其包含的核酸序列与SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3中所示的核酸序列具有至少为70％，优选至少为80％，更优选至少为90％，尤其优选至少为95％，和最优选至少为98％的同一性；

j)核酸分子，其包括插入到质粒DSM16664中的核酸序列，或其核酸序列与插入到质粒DSM16664中的核酸序列具有至少为70％优选至少为80％，优选至少为90％，特别优选至少为95％，个最优选至少为98％的同一性；

k)编码透明质烷合酶的核酸分子，其中编码透明质烷合酶的核酸序列被连接到植物细胞中启动转录的调节元件(启动子)，或

l)依据k)的核酸分子，其中启动子是组织特异性启动子，特别优选尤其是在植物的块茎、果实或种子细胞中启动转录起始的启动子。

在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明用于生产合成透明质烷的植物的方法，其中编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子选自以下组成的组：

a)核酸分子，其特征在于编码源自细菌、动物或植物，优选源自大肠杆菌或小鼠的具有GFAT活性的蛋白质；

b)核酸分子，其特征在于编码小球藻侵染病毒的具有GFAT活性的蛋白质；

c)核酸分子，其特征在于编码小球藻病毒的具有GFAT活性的蛋白质；

d)核酸分子，其特征在于与亲代有机体中编码具有GFAT活性的相应蛋白质的核酸分子的密码子相比，该编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子的密码子是被修饰的；

e)核酸分子，其特征在于该具有GFAT活性的蛋白质的密码子是被修饰的从而可适应将被结合或已结合到植物细胞或植物基因组中的密码子的使用频率；

f)核酸分子，其编码具有SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列的蛋白质或具有SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列的蛋白质或具有SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列的蛋白质；

g)核酸分子，其编码的蛋白质的序列与SEQ ID NO 5或SEQ ID NO7或SEQ ID NO 9中所示的氨基酸序列具有至少为70％，优选至少为80％，优选至少为90％，特别优选至少为95％，以及最优选至少为98％的同一性；

h)核酸分子，其包含SEQ ID NO 4中所示的核酸序列或其互补序列，或SEQ ID NO：6中所示的核酸序列或其互补序列，或SEQ ID NO 8中所示的核酸序列或其互补序列，或SEQ ID NO 10中所示的核酸序列或其互补序列；

i)核酸分子，其与h)中描述的核酸序列具有至少为70％，优选至少为80％，优选至少为90％，特别优选至少为95％，以及最优选至少为98％的同一性；

j)核酸分子，其与f)或h)中描述的核酸序列的至少一条链在严紧条件下杂交；

k)核酸分子，其核苷酸序列由于基因密码的简并性而不同于f)或h)中提到的核酸分子的序列；以及

l)核酸分子，其为在a)、b)、c)、d)、e)、f)或h)中提到的核酸分子的片段、等位基因变体和/或衍生物；

m)核酸分子，其编码具有GFAT活性的蛋白质，其中在植物细胞中编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸序列被连接到启动转录的调控元件(启动子)上；或

n)依据m)的核酸分子，其中启动子是组织特异性启动子，尤其优选特别是在植物块茎、叶片、果实或种子细胞中启动转录的启动子。

在另外的优选实施方案中，使用生产合成透明质烷的植物的依据本发明的方法用于生产依据发明的遗传修饰植物。

本发明也提供通过根据本发明用于生产合成透明质烷植物的方法可以获得的植物。

本发明另外涉及生产透明质烷的方法，该方法包括从根据本发明的遗传修饰的植物细胞中、从根据本发明的遗传修饰植物中、或从根据本发明的繁殖材料中、从根据本发明的可收获的植物部分中、或通过从根据本发明的生产合成透明质烷植物的方法获得的植物或植物部分中提取透明质烷的步骤。

优选地，这样的方法也包括收获培养的根据本发明遗传修饰的植物细胞、根据本发明遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明可收获的植物部分、根据本发明可加工的植物部分的步骤，和特别优选的还包括在收获前培养根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明遗传修饰植物的步骤。

与细菌或动物组织相比，植物组织不含透明质酸酶且不含任何透明质酸粘素。因此，如上所述，可以采用相对简单的方法从植物组织中提取透明质烷。如果需要，可通过本领域技术人员公知的方法进一步纯化上述的含有透明质烷的植物细胞或组织的含水提取物，例如用乙醇重复沉淀。优选的纯化透明质烷的方法描述于常用方法的条目2。

从根据本发明遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰的植物中提取透明质烷的方法已有描述，其也适用于从根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分或通过根据本发明用于制备合成透明质烷植物的方法可获得的植物或植物部分中分离透明质烷。

本发明也提供根据本发明的遗传修饰的植物细胞、根据本发明的遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分、根据本发明的可加工的植物部分或通过根据本发明制备透明质烷的方法可获得的植物的用途。

本发明还涉及包含根据本发明遗传修饰的植物细胞的组合物。在此，植物细胞是完整的或由于其例如通过加工已遭破坏而不再完整已不重要。该组合物优选是食品或饲料、药品或化妆品。

本发明优选提供组合物，该组合物包含根据本发明的遗传修饰的植物细胞、根据本发明的遗传修饰植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分或通过根据本发明方法可获得的植物的成分并且包含重组的核酸分子，其中重组核酸分子的特征在于其包含编码透明质烷合酶和具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子。

外源核酸分子稳定整合进植物细胞或植物的基因组中导致整合进植物细胞或植物基因组后外源核酸分子侧翼为基因组植物核酸序列。

因此，在优选的实施方案中，根据本发明组合物的特征在于存在于根据本发明组合物中的重组核酸分子侧翼为基因组植物核酸序列。

在此，基因组的植物核酸序列可以是天然存在于植物细胞或植物的基因组中用于制备组合物的任一序列。

根据本发明的组成物中存在的重组核酸分子可以是单个或多个重组核酸分子，该编码透明质烷合酶和具有GFAT(酶)活性的蛋白质的核酸分子存在于核酸分子上，或可存在于分开的重组核酸分子上的那些核酸分子。编码透明质烷合酶或编码具有GFAT(酶)活性的蛋白质的核酸分子可共存于单一的重组核酸分子中，或两个上述核酸分子可共存于单一的重组核酸分子上且第三个核酸分子可以任何可能的组合存在于另一重组核酸分子中，或上述所有核酸分子在任何情况下均可存在于单个分开的重组核酸分子中。取决于编码透明质烷合酶或编码具有GFAT(酶)活性的蛋白质的核酸分子是如何存在于根据本发明的组合物中，它们可以以相同的或不同的基因组的植物核酸序列为侧翼。

可以使用本领域技术人员公知的方法，例如基于杂交的方法或优选地采用基于PCR(聚合酶链式反应)的方法证明根据本发明包括重组的核酸分子的组合物。

优选地，根据本发明的组合物包含至少0.005％、优选至少0.01％、特别优选至少0.05％和尤其优选至少0.1％的透明质烷。

优选地，根据本发明的组合物包含至多5％、优选至多2％、特别优选至多1％和尤其优选至多0.5％的透明质烷。

正如上面已提到，利用根据本发明遗传修饰的植物细胞、根据本发明遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分、根据本发明的可加工的植物部分、根据本发明的可消耗的植物部分或通过根据本发明方法可获得的植物来制备食品或饲料是可能的。然而，也可能作为原材料用于工业应用，而无须分离透明质烷。因此，例如，根据本发明遗传修饰的植物或根据本发明遗传修饰的植物的部分可应用于农业种植区域以实现增强土壤结合水能力。此外，根据本发明遗传修饰的植物或根据本发明遗传修饰的植物细胞可用于制备干燥剂(如在装配湿度敏感项目时使用)或作为液体吸附剂(如在尿布中或用来吸附溢出的水溶液)。对于这些应用，根据需要可采用完整的根据本发明遗传修饰的植物、根据本发明遗传修饰的植物的部分，或粉碎的根据本发明遗传修饰的植物或根据本发明植物部分。在采用地被植物或植物部分的领域中适于应用的特别是含有透明质烷但仅含低比例水的植物部分。优选的是谷类植物(玉米、水稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、西米或高粱)的谷粒。由于根据本发明遗传修饰的植物细胞和根据本发明遗传修饰植物具有比文献中描述的遗传修饰植物更高的透明质烷含量，与这些相比，当采用的原料为根据本发明的遗传修饰的植物细胞或根据本发明的遗传修饰植物时仅需更少量的材料用于工业应用。

本发明也提供用于制备根据本发明的组合物的方法，其中采用根据本发明的遗传修饰的植物细胞、根据本发明的遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分、根据本发明的可加工的植物部分、根据本发明的可消耗的植物部分或通过根据本发明用来生产合成透明质烷植物的方法能获得的植物作为原料。制备根据本发明组合物的方法优选的是用于制备食品或饲料的方法、用于制备药品的方法或用于制备化妆品的方法。

用于制备食品或饲料的方法是本领域技术人员公知的。在工业领域使用根据本发明遗传修饰的植物或根据本发明植物部分的方法也是本领域技术人员公知的并且其中包括粉碎和切割根据本发明遗传修饰的植物或根据本发明植物部分的方法，然而，他们并不是专有的限制于此。在上文已描述了使用根据本发明用于制备食品/饲料或用于工业领域的目的材料产生的某些优点。

根据本发明用于制备组合物的方法是特别优选的用于制备含有透明质烷组合物的方法。

本发明同样提供通过根据本发明的制备组合物的方法获得的组合物。

本发明也涉及根据本发明遗传修饰的植物细胞的用途、根据本发明遗传修饰的植物的用途、根据本发明繁殖材料的用途、根据本发明可收获的植物部分的用途、根据本发明可加工的植物部分的用途、根据本发明可消耗的植物部分的用途或通过根据本发明生产合成透明质烷用于制备根据本发明的组合物的植物的方法获得的植物的用途。优选的是根据本发明遗传修饰的植物细胞的用途、根据本发明遗传修饰的植物的用途、根据本发明繁殖材料的用途、根据本发明可收获的植物部分的用途、根据本发明可加工的植物部分的用途、根据本发明可消耗的植物部分的用途或通过根据本发明生产合成透明质烷用于制备根据本发明的食品或饲料的植物的方法获得的植物的用途。

序列描述

SEQ ID NO 1：编码小球藻病毒1的透明质烷合酶的核酸序列。

SEQ ID NO 2：小球藻病毒1的透明质烷合酶的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 1。

SEQ ID NO 3：编码小球藻病毒1的透明质烷合酶的合成的核酸序列。完成所示序列的密码子合成从而适应在植物细胞中的密码子使用。所示的核酸序列编码具有SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列的蛋白质。

SEQ ID NO 4：小鼠的编码具有GFAT-1活性的蛋白质的核酸序列。

SEQ ID NO 5：小鼠的具有GFAT-1活性的蛋白质的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 4。

SEQ ID NO 6：小鼠的编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸序列。

SEQ ID NO 7：小鼠的具有GFAT-2活性的蛋白质的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 6。

SEQ ID NO 8大肠杆菌的编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸序列。

SEQ ID NO 9：大肠杆菌的具有GFAT活性的蛋白质的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 8。

SEQ ID NO 10大肠杆菌的编码具有GFAT活性的蛋白质的合成的核酸序列。完成所示序列的密码子的合成从而适应在植物细胞中的密码子使用。所示的核酸序列编码具有SEQ ID NO 9中所示的氨基酸序列的蛋白质。

SEQ ID NO 11：实施例1中采用的合成的寡核苷酸。

SEQ ID NO 12：实施例1中采用的合成的寡核苷酸。

SEQ ID NO 13：实施例10中用作PCR引物的合成的寡核苷酸。

SEQ ID NO 14：实施例10中用作PCR引物的合成的寡核苷酸。

所有引用的文献，包括但不限于核酸和氨基酸序列的登录号，全部作为参考引入说明书中。

附图描述

图1：显示校准曲线和用于计算植物组织中透明质烷含量的相应线性回归方程借助商品试剂盒(美国科罗拉多州科占尼克(Corgenix)公司的透明质烷(HA)试剂盒，产品号：029-001)和由其提供的标准溶液绘制校准曲线。

常规方法

可用于本发明的方法如下所述。这些方法为特定的实施方案。然而本发明并不限于这些方法。本领域技术人员公知，可以相同的方式通过修改所述方法和/或通过用备选方法或方法的备选部分替换个别方法或方法的部分来实现本发明。

1.马铃薯植物的转化

借助土壤杆菌转化马铃薯植物，描述于Rocha-Sosa等(EMBO J.8，(1989)，23-29)。

2.从植物组织中分离透明质烷

为检测透明质烷的存在和检测植物组织中透明质烷的含量，按以下方式处理植物材料：将200μl水(去离子化，电导率≥18MΩ)加入到约0.3g材料中，并将混合物在实验室振荡珠磨机(MM200型，德国莱驰生产，30Hz下30秒)中粉碎。然后再加入800μl水(去离子化，电导率≥18MΩ)，并将混合物混匀(例如使用涡流搅拌器)。在16000×g条件下离心5分钟使细胞碎片及不溶组分与上清液分离。

3.透明质烷的纯化

将大约100g的块茎剥、切成尺寸约为1cm³的小块，然后加入100ml水(去离子化，电导率≥18MΩ)，用互撞式搅拌机在最大速度下粉碎约30秒。然后通过茶叶滤网去除细胞碎片。将去除的细胞碎片重新悬浮于300ml水中(去离子化，电导率≥18MΩ)并再使用茶叶滤网将其去除。将两次得到的悬浮液(100ml+300ml)组合并在13000×g下离心15分钟。将氯化钠加入到离心后获得的上清液中，使其在上清液中的终浓度达到1％。加完氯化钠后，加入两倍体积的乙醇进行沉淀，然后彻底混合并在-20℃孵育过夜。然后将混合物在13000×g下离心15分钟。将离心后获得的沉淀物溶解于100ml的缓冲液(50mM TrisHCl，pH 8，1mM CaCl₂)并然后加入蛋白酶K，使其终浓度达到100μg/ml并且该溶液在42℃孵育2小时。然后在95℃孵育10分钟。再次将氯化钠加入到该溶液中并使其终浓度达到 1％。加完氯化钠后，再次用两倍体积的乙醇进行沉淀，彻底混合并在-20℃孵育约96小时。接下来在13000×g下离心15分钟。将离心获得的沉淀物溶解于30ml水中(去离子化，电导率≥18MΩ)，并再次加入氯化钠并使其终浓度达到1％。加入两倍体积的乙醇，彻底混合并在-20℃孵育过夜，再次沉淀。将在13000×g下离心15分钟获得的沉淀物溶解于20ml水中(去离子化，电导率≥18MΩ)。

通过离心过滤完成进一步纯化。为此，每次将5ml溶解的沉淀物加到膜过滤器中(CentriconAmicon，孔隙宽度10000NMWL，产品号：UCF8010 96)，并将样品在2200×g下离心直到过滤器中仅剩约3ml左右的溶液。然后以两次以上，每次将3ml水(去离子化，电导率≥18MΩ)加入到膜上的溶液中并每次在相同的条件下再次离心直到过滤器上仅剩约3ml的溶液为止。将离心过滤后仍存在于膜上的溶液弃除并且膜用约1.5ml水(去离子化，电导率≥18MΩ)反复冲洗(3-5次)。将仍存在于膜上的所有溶液与冲洗得到的溶液组合，加入氯化钠并使其终浓度达到1％。加完氯化钠后，加入两倍体积的乙醇，样品混合并在-20℃贮存过夜以获得沉淀物。将在13000×g下离心15分钟后获得的沉淀物溶解于4ml水(去离子化，电导率≥18MΩ)中，然后冷冻干燥(在压力为0.37毫巴下冷冻干燥24小时，冷冻干燥器Christ Alpha 1-4，产自德国Osterode市的克里斯坦(Christ)公司)。

4.透明质烷的检测和透明质烷含量的测定

透明质烷的检测采用商品试剂盒(美国科罗拉多州科占尼克(Corgenix)公司的透明质烷(HA)试剂盒，产品号：029-001)并按生产商提供的说明书进行，其被引用作为参考。测试原理是基于可特异地结合透明质烷的蛋白质(HABP)的可用性并通过类似酶联免疫吸附实验(ELISA)完成，其中样品检测中的颜色反应指示透明质烷含量。因此，对于定量检测透明质烷，被测样品应在规定的浓度限制范围内(例如：所讨论的样品的稀释或使用少量水从植物组织中提取透明质烷，取决于是否超过或未达到限定量。

在平行样中，部分待测样品首先被透明质酸酶消化并然后使用商品试剂盒(美国科罗拉多州科占尼克(Corgenix)公司的透明质烷(HA)试剂盒，产品号：029-001)测量。透明质酸酶消化可通过在透明质酸酶缓冲溶液(0.1M磷酸钾缓冲溶液，pH 5.3；150mM NaCl)中加入400μl的马铃薯块茎汁和5μg(约3个单位)透明质酸酶(希格玛(Sigma)公司的透明质酸酶III型，产品号：H 2251)，并在37℃孵育30分钟。

在每一情况下按1∶10稀释，然后使用所有样品测其透明质烷含量。

5.GFAT活性的测定

测定具有GFAT活性的蛋白质活性被描述于Rachel等(1996，J.Bacteriol.178(8)，2320-2327)。

为了区分蛋白质是否具有GFAT-1或GFAT-2的活性，使用描述于Hu等人(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)的方法。

6.稻植物的转化

通过Hiei等人描述的方法转化稻植物(1994，Plant Journal 6(2)，271-282)。

7.西红柿植物的转化

按照US 5,565,347中描述的方法，借助土壤杆菌转化西红柿植物。

实施例：

1.植物表达载体IR 47-71的制备

质粒pBinAR是二元载体质粒pBin19(Bevan，1984，Nucl Acids Res 12：8711-8721)的衍生物。其按照如下构建：将长度为529bp、包含花椰菜花叶病毒35S启动子的核苷酸6909-7437的片段作为EcoR I/Kpn I片段从质粒pDH51中分离(Pietrzak等人，1986 Nucleic Acids Res.14，5858)，并连接到pUC18的多接头中的EcoR I和Kpn I限制性位点之间。以这种方式形成质粒pUC18-35S。采用限制性核酸内切酶Hind III和Pvu II，可将长度为192bp、包括Ti质粒pTiACH5(Gielen等人，1984，EMBO Journal 3，835-846)(核苷酸11749-11939)的T-DNA的章鱼碱合酶基因(基因3)的多聚腺苷酸化信号(3′端)的片段从质粒pAGV40中分离(Herrera-Estrella等人， 1983 Nature，303，209-213)。接下来将Sph I接头添加到Pvu II的限制性位点，该片段就被连接到pUC18-35S的Sph I和Hind III限制性位点间。这就得到了质粒pA7。在此，使用EcoR I和Hind III将包含35S启动子和ocs终止子的整个多接头切离并连接进适当切割的载体pBin19中。这就得到了植物表达载体pBinAR(Hófgen和Willmitzer，1990，Plant Science 66，221-230)。

来自马铃薯植物块茎的patatin基因B33的启动子(Rocha-Sosa等人，1989，EMBO J.8，23-29)被作为Dra I片段(核苷酸-1512-+14)连接进入其末端已用T4-DNA聚合酶平末端化的SsfI切割载体pUC19上。这就得到了质粒pUC19-B33。使用EcoR I和Sma I将B33启动子从该质粒中切离并连接进适当的限制性载体pBinAR中。这就得到了植物表达载体pBinB33。

为简化进一步的克隆步骤，延长MCS(多克隆位点)。为此，合成两个互补寡核苷酸在95℃加热5分钟，缓慢冷却到室温以产生较好的固定(退火)并克隆进pBinB33的Sal I和Kpn I限制性位点。用于此目的的寡核苷酸具有以下序列：

5′-TCg ACA ggC CTg gAT CCT TAA TTA AAC TAg TCT CgA ggAgCT Cgg TAC-3’

5′-CgA gCT CCT CgA gAC TAg TTT AAT TAA ggA TCC Agg CCTg-3′

所得质粒命名为IR 47-71。

2.植物表达载体pBinARHyg的制备

使用限制性核酸内切酶EcoR I和Hind III将包含35S启动子、ocs终止子和整个多克隆位点的片段从pA7中切离并克隆进采用相同限制性核酸内切酶切割的载体pBIBHyg中(Becker，1990，Nucleic Acids Res.18，203)。所得质粒命名为pBinARHyg。

3.植物表达载体pBinB33-Hyg的制备

将包含B33启动子、多接头部分和ocs终止子的EcoR I-Hind III片段从质粒pBinB33上切离并克隆进合适的限制性载体pBIB-Hyg中(Becker，1990，Nucleic Acids Res.18，203)。所得植物表达载体命名为pBinB33-Hyg。

4.核酸分子的合成

a)编码小球藻病毒1的透明质烷合酶的核酸分子的合成

编码小球藻病毒1的透明质烷合酶(HAS)的核酸序列由麦迪基因组(Medigenomix GmbH)有限公司(慕尼黑，德国)合成并克隆进来自英杰(Invitrogen)公司的载体pCR2.1中(产品号：K2000-01)。

所得质粒命名为IC 323-215。编码来自小球藻病毒1的HAS蛋白的合成的核酸序列显示于SEQ ID NO 3中。从小球藻病毒1中最初分离的相应的核酸序列显示于SEQ ID NO 1中。

b)从大肠杆菌中合成编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子

编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子由安太勒克公司(EntelechonGmbH)从大肠杆菌中合成并克隆进入来自英杰(Invitrogen)公司的载体pCR4Topo中(产品号：K4510-20)。所得质粒命名为IC 373-256。从大肠杆菌中合成的编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸序列显示于SEQ IDNO 10。从大肠杆菌中最初分离的相应的核酸序列显示于SEQ ID NO 8。

5.其他核酸分子的来源

a)源自小鼠的编码具有GFAT-1活性的蛋白质的核酸分子

编码具有GFAT-1活性的蛋白质的核酸序列购自海德尔堡的生物猫有限公司(BioCat GmbH)(Art.No.MMM1013-65346，cDNA克隆MGC：58262，映像(IMAGE)：6742987)。这是由I.M.A.G.E.Konsortium生产的克隆(http://image.llnl.gov)，且由生物猫有限公司(BioCat GmbH)销售。在此，将编码具有GFAT-1活性的蛋白质的cDNA克隆进来自英杰(Invitrogen)公司的载体pCMV Sport 6中。所得质粒命名为IC 365-256。与SEQ ID NO 4中所示核酸序列相比，插入IC 365-256中、来自小家鼠(Mus musculus)的编码具有GFAT-1活性的蛋白质的核酸序列在1090位有从T到C的碱基交换且在2027位有从G到A的碱基交换。这些碱基交换并未导致由两种不同核酸分子编码的氨基酸序列的氨基酸交换。

来自小鼠的编码具有GFAT-1活性的蛋白质的核酸序列显示于SEQID NO 4中。

为了简化后续的克隆步骤，采用限制性核酸内切酶Xho I和EcoR v将编码具有GFAT-1活性的蛋白质的序列从IC 365-256中分离并克隆进入用相同的限制性核酸内切酶切割的具有修饰的多克隆位点的质粒pME9(来自斯彻特(Stratagene)公司的pBlueSkript载体)中，该质粒在两端额外的具有Pac I限制性位点。获得的质粒命名为IC 367-256

b)来自小鼠的编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸分子

来自小鼠的编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸分子购自英杰(Invitrogen)公司(克隆ID 4167189，cDNA克隆MGC：18324，映象(IMAGE)：4167189)。这是由I.M.A.G.E.Konsortium生产的(http://image.llnl.gov)、由英杰(Invitrogen)公司销售的克隆。在此，编码具有GFAT-2活性的蛋白质的cDNA被克隆进入来自英杰(Invitrogen)公司的载体pCMV Sport 6中。该质粒命名为IC 369-256。源自小家鼠的编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸序列显示于SEQ ID NO 6中。

6.包括编码小球藻病毒1的透明质烷合酶的核酸序列的植物表达载体IC 341-222的制备

采用BamH I和Xho I限制性消化，将包括透明质烷合酶编码序列的核酸分子从质粒IC 323-215中分离并克隆进质粒IR 47-71的BamH I和Xho I的限制性位点。所得植物表达载体命名为IC 341-222。

7.来自小鼠、包括编码具有GFAT-2活性蛋白质的核酸序列的植物表达载体IC 399-299的制备

采用Xho I和Asp 718限制性消化，将来自小鼠、包含编码具有GFAT-2活性的蛋白质序列的核酸分子从质粒369-256中分离并克隆进入已被相同限制性核酸内切酶切割的植物表达载体pBinB33-Hyg中。所得植物表达载体被命名为IC 399-299。

8.来自大肠杆菌、包含编码具有GFAT活性蛋白质的核酸序列的植物表达载体IC 399-300的制备

通过用Sac I和Sbf I限制性消化，将来自大肠杆菌、包含具有GFAT活性的蛋白质编码序列的核酸分子从质粒373-256中分离并克隆进已被相同限制性核酸内切酶切割的植物表达载体pBinB33-Hyg中。所得植物表达载体命名为IC 399-300。

9.含有编码小球藻病毒1的透明质烷合酶的核酸序列的植物表达载体pBA16的制备

采用限制性核酸内切酶Asp 7181，将包括编码小球藻病毒1的透明质烷合酶的核酸序列的片段从质粒IC 323-215中分离，片段末端用Klenow聚合酶平末端化并然后将得到的片段再次用限制性核酸内切酶Pac I切割。以这种方式获得的片段被连接进入已被限制性核酸内切酶Pac I和Ecl136II切割的质粒IR103-123中(见WO 2006 032538)。所得植物表达载体称为pBA16。

10.植物表达载体IC 386-299的制备

来自稻醇溶谷蛋白启动子的DNA(EMBL登录号D63901，Sha等人，1996，Biosci.Biotech.Biochem.60，335-337，Wu等人，1998.Plant CellPhysiol.39(8)，885-889)通过使用从稻(Oryza sativa)(栽培变种M202)叶片中分离的基因组DNA来扩增。

使用的PCR扩增条件：

使用DNA聚合酶高保真扩增系统(PCR系统，罗氏公司(Roche)产品Nr.：1732641)进行扩增。

采用前述试剂盒制造商提供的条件和缓冲液。

DNA：50ng的基因组稻DNA

dNTP：0.83μM dNTP混合物

0.25μM引物prol-F1

5′-AAAAACTAGTTCTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG

0.25μM引物prol-R1

5′-AAAAGATATCTGTTGTTGGATTCTACTACTATGCTTCAA

反应条件：步骤1 94℃ 15秒

步骤 260℃ 15秒

步骤 372℃ 45秒

将步骤1至3重复35次，之后冷却反应到4℃。通过使用TA克隆试剂盒(英杰(Invitrogen)公司，产品号：KNM2040-01)将PCR扩增得到的片段克隆进质粒pCR 2.1中。将获得的质粒命名为Ml 4-154。

通过使用限制性核酸内切酶Not I和Kpn I将源自小鼠、包含具有GFAT-2活性的蛋白质编码序列的核酸片段从质粒IC 369-256中分离并克隆进载体pMCS5的Not I和Kpn I位点(购自MoBiTec)。所得质粒命名为IC 385-299。通过使用限制性核酸内切酶Xho I和Hpa I将来自小鼠、包含具有GFAT-2活性的蛋白质编码序列的核酸片段从质粒IC 385-299中分离并克隆进质粒Ml 9-154的Xho I和Ecl136 II位点。所得质粒命名为IC386-299。

制备载体Ml 9-154的基础是质粒ML 18-56(WO 05 030941)。通过两个互补的合成寡核苷酸的退火来制备包含用来克隆进限制性位点Hind III和Pst I的粘性末端且包含额外的限制性位点Pst I、Sac I、Bin I、Xho I、Hpa I、Spe I和Hind III的多重克隆位点(MCS)。将退火的寡核苷酸克隆进质粒ML 18-56的限制性位点Hind III和Pst I。所得载体命名为Ml8-154。通过采用限制性核酸内切酶Eco RV和Spe I将包括醇溶谷蛋白启动子的核酸片段从质粒Ml 4-154中分离并克隆进载体Ml 8-154中。所得质粒命名为Ml 9-154。

11.使用包含编码透明质烷合酶的核酸分子的植物表达载体转化植物

采用常用方法中条目1给出的方法，在马铃薯植物块茎的patatin基因B33启动子控制下(Rocha-Sosa等人，1989，EMBO J.8，23-29)，使用植物表达载体IC 341-222转化马铃薯植物(cv Desiree)，该载体包含编码小球藻病毒1的透明质烷合酶的核酸序列。用质粒IC 341-222转化获得的遗传修饰马铃薯植物被命名为365ES。

12.用包含编码透明质烷合酶的核酸分子的植物表达载体转化的转基因植物的分析

a)校准曲线的构建

依据生产商描述的方法使用商品试剂盒(美国科罗拉多州科占尼克(Corgenix)公司的透明质烷(HA)试剂盒，产品号：029-001)提供的标准溶液来构建校准曲线。为确定透明质烷含量为1600ng/ml时的消光值，采用两倍于根据生产商指出的供给标准量(使用含800ng/ml的透明质烷)。在每一情况下，完成三个独立测量系列并确定相应的均值。该方法给出以下的标准曲线：

表1：在植物组织中用于构建定量检测透明质烷含量的标准曲线的数值。借助软件(微软Excel 2002，SP2)将所得测量值输入到图表中并得到趋势线的函数方程式(见图1)。E_450nm指在波长为450nm处的消光值，s.d.是个体数值的计算平均值的标准差。

b)365 ES品系的马铃薯块茎分析

在温室中，将365 ES品系的个体植株培养在6cm厚土壤的盆内。在每一情况下，根据常用方法中条目2描述的方法将大约0.3g的单株马铃薯块茎材料进行加工。采用常用方法中条目4描述的方法，借助实施例12a)和图1中所示的校准曲线，可确定存在于各植物提取液中的透明质烷量。在此，离心后获得的上清液以1∶10稀释用于检测透明质烷含量。对于待选植物，获得以下结果：

植物名	使用的植物材料的重量[g]	消光 E450	透明质烷的量 [ng/ml]	基于植物材料鲜重的透明质烷[μg/g]
					365 ES 13	0.297	2.746	14	47
365 ES 74	0.306	4.000	20816	68
					野生型	0.305	0.111	n.d.	n.d.

表2：由365 ES品系单独的转基因植物产生的透明质烷量(以μg透明质烷/g鲜重计)。第1列指从其获取块茎材料的植物(这里的“野生型”指未转化的植物，然而其具有用作转化起始材料的基因型)。第2列指所讨论的用于检测透明质烷含量的植物块茎材料的量。第3列含有各个植物提取液以1∶10稀释所测得的消光值。第4列是考虑稀释因子借助线性回归方程(见图1)计算的结果，计算如下：(第3列数值-0.149)/0.00185)×10)。第5列指基于使用的鲜重的透明质烷的量，和按如下计算：(第4列数值/第2列数值)/1000。“n.d.”指未检出。

13.用来自大肠杆菌、包含编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸序列的植物表达载体转化合成透明质烷的植物

a)植物的转化

在每一情况下使用常用方法中条目1给出的方法用植物表达载体IC399-300转化365 ES 13和365 ES 74品系的马铃薯植概用质粒IC 399-300转化365 ES 74品系后，获得的遗传修饰马铃薯植物命名为433 ES。

b)433 ES品系的马铃薯块茎的分析

在温室中，将433 ES品系的个体植株培养在6cm厚土壤的盆内。在每一情况下，根据常用方法中条目2描述的方法将大约0.3g的单株马铃薯块茎和/或叶片材料进行加工。采用常用方法中条目4描述的方法，借助实施例12a)和图1中所示的校准曲线，可确定存在于各植物提取液中透明质烷的量。在此，使用离心后获得的上清液以1∶10稀释用于检测透明质烷含量。对于选择的植物，可得出以下结果：

表3：由433ES品系单独的转基因植物产生的透明质烷量(以μg透明质烷/g鲜重计)。第1列指从其获取块茎或叶材料的植物(这里的“野生型”是指未转化的植物并且ES 365 74指用作以质粒c 399-300转化的起始材料的植物)。第2列和第3列分别指在植物叶和块茎中检测到的透明质烷量。

14.稻植物的转化

a)使用具有包括编码小球藻病毒1的透明质烷合酶的核酸分子的植物表达载体

采用常用方法中条目6给出的方法，在稻的球蛋白基因启动子控制下，使用植物表达载体pBA16转化稻植物(栽培变种M202)，该载体包括编码小球藻病毒1的透明质烷合酶的核酸序列(Wu等人，1998，Plant CellPhysiol.39(8)，885-889)。用质粒pBA16转化的转基因稻植物称作Os-pBA16。

b)使用包含来自小鼠的编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸序列的植物表达载体

采用常用方法中条目6给出的方法，在稻的13-kDa醇溶谷蛋白多肽启动子控制下，使用植物表达载体IC 386-299转化稻植物(栽培变种M202)，该载体含有来自小鼠的编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸序列。用质粒pBA16转化的遗传修饰水稻植物称作GAOS0788。

15.Os-pBA16品系的稻植物的分析

a)未成熟的稻种子

收集由OS-pBA16品系的个体植株产生的、在温室土壤中培养的未成熟的稻种子(授粉后5至10天)、在液氮中冷冻并于-80℃保存。随机选择个体植物三粒冷冻谷粒，挤出胚乳、集合、称重并再次在液氮中冷冻。样品用珠磨器(MM200型，Firma Retsch，德国)破碎，加入100μl水，将匀浆物混合、离心(13000×g，5分钟)并且根据常用方法中条目4描述的方法来确定每一样品的透明质烷的浓度。

在37个种子库中，每个库包含来自OS-pBA16品系的独立植物的3粒未成熟种子，超过70％被证明在种子中合成显著量的透明质烷(至少0.1μg透明质烷/g鲜重)。从独立的稻植物中制备的种子库中透明质烷的量在0.1至15.7μg透明质烷/g鲜重之间变化。对于由独立植物制备的每个种子库的结果显示于下表：

植物材料	基于植物材料的鲜重的透明质烷 [μg/g]
		OS-pBA16 0612-00102	7,30
OS-pBA16 0612-00102	0,54
		OS-pBA16 0612-00201	12,16
OS-pBA16 0612-00401	1,12
		OS-pBA16 0612-00402	7,28
OS-pBA16 0612-00502	0,08
		OS-pBA16 0612-00601	0,37
OS-pBA16 0612-00701	0,66
		OS-pBA16 0612-00702	0,03
OS-pBA16 0612-00801	2,48
		OS-pBA16 0612-00802	3,84
OS-pBA16 0612-00902	0,02
		OS-pBA16 0612-01001	0.02

植物材料	基于植物材料的鲜重的透明质烷 [μg/g]
		OS-pBA16 0612-01201	1.71
OS-pBA16 0612-01202	0.11
		OS-pBA16 0612-01301	5.84
OS-pBA16 0612-01401	0.25
		OS-pBA16 0612-01402	0.11
OS-pBA16 0612-01501	0.16
		OS-pBA16 0612-01601	1.12
野生型-1	0.01
		野生型-2	0.02
野生型-3	0.02
		OS-pBA16 0613-00101	4.43
OS-pBA16 0613-00102	1.95
		OS-pBA16 0613-00301	0.25
OS-pBA16 0613-00401	15.72
		OS-pBA16 0613-00402	0.38
OS-pBA16 0613-00502	0.87
		OS-pBA16 0613-00601	0.02
OS-pBA16 0613-00602	0.01
		OS-pBA16 0613-00701	0.23
OS-pBA16 0613-00702	0.80
		OS-pBA16 0613-00801	1.72
OS-pBA16 0613-00802	0.15
		OS-pBA16 0613-00902	0.02
OS-pBA16 0613-01001	0.02
		OS-pBA16 0613-01002	0.01
OS-pBA16 0613-01102	0.24
		OS-pBA16 0613-01202	9.48
OS-pBA16 0613-01301	13.44
		OS-pBA16 0613-01302	9.79
OS-pBA16 0613-01501	0.63
		OS-pBA16 0613-01502	6.78

表4：检测在来自OS-pBA16转基因品系的独立植物制备各个种子库中的透明质烷。

b)米粉

从每株转化植物上收获20-25粒成熟种子。用脱皮机(美国佛罗里达州迈阿密市谷曼(Grainman)公司制造的实验室水稻脱壳机)除掉外皮并用实验室研磨机(Cyclotec，样品研磨机，丹麦福斯(Foss)公司)研磨褐色稻谷。从每株独立的植物上收集的种子制得的米粉约40mg，加入1ml水，混合样品，离心(13000×g，5分钟)并且根据常用方法中条目4描述的方法来确定每一样品上清液中透明质烷的浓度。对于选定的由独立植物制备的米粉样品的结果显示于下表：

植物材料	基于植物材料重量的透明质烷 [μg/g]
		OS-pBA16 0612-00101	2.03
OS-pBA16 0612-00102	1.19
		OS-pBA16 0612-00201	1.94
OS-pBA16 0612-00402	4.24
		OS-pBA16 0612-00502	1.19
OS-pBA16 0612-00601	1.64
		OS-pBA16 0612-00602	2.51
OS-pBA16 0612-00701	0.87
		OS-pBA16 0612-00702	1.04
OS-pBA16 0612-00801	3.61
		OS-pBA16 0612-00802	3.88
OS-pBA16 0612-00902	1.02
		OS-pBA16 0612-01001	0.58
OS-pBA16 0612-01201	4.86
		OS-pBA16 0612-01202	2.96
OS-pBA16 0612-01301	11.30
		OS-pBA16 0612-01401	1.64
OS-pBA16 0612-01402	1.50
		OS-pBA16 0612-01501	4.54
OS-pBA16 0612-01601	1.90
		OS-pBA16 0613-00101	3.46
OS-pBA16 0613-00102	3.94
		OS-pBA16 0613-00301	3.32
OS-pBA16 0613-00401	5.21
		OS-pBA16 0613-00402	3.45
OS-pBA16 0613-00502	5.20
		OS-pBA16 0613-00601	0.83
OS-pBA16 0613-00602	0.77
		OS-pBA16 0613-00701	2.63
OS-pBA16 0613-00702	3.77
		OS-pBA16 0613-00801	1.55
OS-pBA16 0613-00802	2.81

植物材料	基于植物材料重量的透明质烷 [μg/g]
		OS-pBA16 0613-00902	2.65
OS-pBA16 0613-01001	1.06
		OS-pBA16 0613-01002	0.59
OS-pBA16 0613-01102	1.19
		OS-pBA16 0613-01202	10.18
OS-pBA16 0613-01301	5.02
		OS-pBA16 0613-01302	3.84
OS-pBA16 0613-01501	4.00
		OS-pBA16 0613-01502	5.63
OS-pBA16 0613-000101	0.63
		OS-pBA16 0613-000103	0.58
OS-pBA16 0613-000104	0.87

表5：从OS-pBA16转基因品系的每一独立植物的种子制备的米粉样品中的透明质烷检测。采用常用方法中条目4描述的方法进行检测。

b)GAOS0788品系的稻植物分析

将用质粒IC 386-299转化后获得的GAOS0788品系的独立的稻植物培养于温室的土壤中。从每株植物上收获20-25粒成熟种子(谷粒)，用脱皮机(美国佛罗里达州迈阿密市谷曼(Grainman)公司制造的实验室水稻脱壳机)除掉外皮并用实验室珠磨机(MM200，若斯彻(Retsch)公司，德国，30秒.bei 30HZ)研磨来自每一品系的约7粒褐色稻谷制成米粉。然后根据Elson和Morgan(1933，J Biochem.27，1824)描述的方法确定每一样品中N-乙酰基葡糖胺衍生物的含量。分析的几组样品确实显示在N-乙酰基葡糖胺衍生物含量上的增加，范围从约2μmol至约20μmol N-乙酰基葡糖胺衍生物/g样品鲜重。如上分析，选择的植物(GAOS0788-00501)的单个谷粒确实显示N-乙酰基葡糖胺衍生物的含量高达约43μmol/g样品鲜重。

将OS-pBA16和GAOS0788品系的选定植物彼此相互杂交以获得包含编码透明质烷合酶的蛋白质和编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸分子的植物。

Claims

1.产生遗传修饰的植物细胞的方法，其中，所述遗传修饰的植物细胞具有稳定整合进入其基因组的编码透明质烷合酶的核酸分子，其中所述遗传修饰的植物细胞与相应的无遗传修饰的野生型植物细胞相比，还具有增强的具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶活性的蛋白质的活性，

所述方法包括对植物细胞进行遗传修饰，其中遗传修饰包括如下步骤i至ii：

i)将编码透明质烷合酶的外源核酸分子导入植物细胞，

ii)将外源核酸分子导入植物细胞以导致所述增强的谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶活性，其中该外源核酸分子编码具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶的酶活性的蛋白质，

其中可以任何顺序单独地进行步骤i至ii，或可同时进行步骤i至ii，

其中，步骤ii中编码具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶的酶活性的蛋白质的外源核酸分子选自以下组成的组：

a)核酸分子，其编码具有SEQ ID NO5中提供的氨基酸序列的蛋白质、或具有SEQ ID NO7中提供的氨基酸序列的蛋白质、或具有SEQ ID NO9中提供的氨基酸序列的蛋白质；

b)核酸分子，其包含SEQ ID NO4中所示的核苷酸序列或其互补序列、SEQ ID NO6中所示的核苷酸序列或其互补序列、SEQIDNO8中所示的核苷酸序列或其互补序列，或SEQ ID NO10中所示的核苷酸序列或其互补序列；和

c)核酸分子，其核苷酸序列由于遗传密码简并性而不同于a)或b)中提到的核酸分子的序列，

其中步骤i中编码透明质烷合酶的外源核酸分子选自：

(a)编码SEQ ID NO：2所示蛋白质的核酸分子；和

(b)SEQIDNO：1或3所示的核酸分子。

2.如权利要求1要求的产生遗传修饰的植物细胞的方法，其中所述具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶活性的蛋白质源自细菌或动物。

3.如权利要求2要求的产生遗传修饰的植物细胞的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。

4.如权利要求2要求的产生遗传修饰的植物细胞的方法，其中所述动物是小鼠。

5.如权利要求1-4中的任一项要求的产生遗传修饰的植物细胞的方法，其中，所述遗传修饰的植物细胞，与具有透明质烷合酶活性且无增强的谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶活性的植物细胞相比，合成增量的透明质烷。

6.生产合成透明质烷的植物的方法，该方法包括

a)遗传修饰植物细胞，其中遗传修饰包括如下步骤i至ii：

i)将编码透明质烷合酶的外源核酸分子导入植物细胞，

ii)将遗传修饰导入植物细胞，该遗传修饰为向植物细胞基因组中导入编码具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶的酶活性的蛋白质的外源核酸分子，导致与相应的无遗传修饰的野生型植物细胞相比具有增加的谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶的酶活性，

其中可以任何顺序单独地进行步骤i至ii，或可同时进行步骤i至ii的任何组合；

b)从来自步骤a)的植物细胞再生植物；

c)如果合适，使用根据步骤b)的植物产生更多的植物，

其中如果合适，将植物细胞从根据步骤b)i或b)ii获得的植物中分离并且重复该方法的步骤a)至c)直至产生与相应的无遗传修饰的野生型植物相比，具有编码透明质烷合酶的外源核酸分子且具有增强的谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶活性的植物，

其中在步骤a)ii)中编码所述具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶的酶活性的蛋白质的外源核酸分子选自以下组成的组：

a)核酸分子，其编码具有SEQ ID NO5所示的氨基酸序列的蛋白质或具有SEQ ID NO7所示的氨基酸序列的蛋白质或具有SEQ ID NO9所示的氨基酸序列的蛋白质；

b)核酸分子，其包含SEQ ID NO4中所示的核酸序列或其互补序列、或SEQ ID NO6中所示的核酸序列或其互补序列、或SEQ ID NO8中所示的核酸序列或其互补序列、或SEQ ID NO10中所示的核酸序列或其互补序列；

和

c)核酸分子，其核苷酸序列由于基因密码的简并性而不同于a)或b)中提到的核酸分子的序列，

其中步骤a)i)中编码透明质烷合酶的核酸分子选自：

(a)编码SEQ ID NO：2所示蛋白质的核酸分子；和

(b)SEQ ID NO：1或3所示的核酸分子。

7.如权利要求6要求的生产合成透明质烷的植物的方法，其中所述具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶活性的蛋白质源自细菌或动物。

8.如权利要求7要求的生产合成透明质烷的植物的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。

9.如权利要求7要求的生产合成透明质烷的植物的方法，其中所述动物是小鼠。

10.制备透明质烷的方法，该方法包括从通过权利要求1至5的任一项的方法获得的遗传修饰的植物细胞中、或从通过权利要求6-9的任一项所要求的方法获得的植物中提取透明质烷的步骤。

11.通过权利要求1至5的任一项的方法获得的遗传修饰的植物细胞、或通过权利要求6-9的任一项中要求的方法获得的植物在用于制备透明质烷中的用途。

12.组合物，其包含遗传修饰的植物细胞，其中所述遗传修饰的植物细胞具有稳定整合进入其基因组的编码透明质烷合酶的核酸分子，且与相应的无遗传修饰的野生型植物细胞相比，还具有增强的具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶活性的蛋白质的活性，其中所述增强的活性是由外源核酸分子导入植物细胞引起的，其中该外源核酸分子编码该具有谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶的酶活性的蛋白质，且选自以下组成的组：

a)核酸分子，其编码具有SEQ ID NO5中提供的氨基酸序列的蛋白质，或具有SEQ ID NO7中提供的氨基酸序列的蛋白质，或具有SEQ ID NO9中提供的氨基酸序列的蛋白质；

b)核酸分子，其包含SEQ ID NO4中所示的核苷酸序列或其互补序列、SEQ ID NO6中所示的核苷酸序列或其互补序列、SEQ ID NO8中所示的核苷酸序列或其互补序列，或SEQIDNO10中所示的核苷酸序列或其互补序列；和

其中编码透明质烷合酶的核酸分子选自：

(a)编码SEQ ID NO：2所示蛋白质的核酸分子；和

(b)SEQ ID NO：1或3所示的核酸分子。

13.用于制备包括透明质烷的组合物的方法，其中使用通过权利要求1至5的任一项的方法获得的遗传修饰的植物细胞、或通过权利要求6-9的任一项中要求的方法获得的植物。

14.通过权利要求1至5的任一项的方法获得的遗传修饰的植物细胞、或通过权利要求6-9的任一项中要求的方法获得的植物在用于制备如权利要求12中要求的组合物中的用途。