ES2536925T3 - Plantas con producción de hialuronano aumentada - Google Patents

Abstract

Una célula vegetal modificada genéticamente que tiene una molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa integrada de manera estable en su genoma, teniendo dicha célula vegetal además una molécula de ácido nucleico foránea integrada de manera estable en su genoma, codificando dicha molécula de ácido nucleico foránea una proteína que tiene la actividad de una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT) y teniendo la célula vegetal una actividad aumentada de una proteína que tiene la actividad de una glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa (GFAT) en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente.

Description

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amidotransferasa-1 (GFAT-1)" o como "glutamina:fructosa-6-fosfato amidotransferasa-2 (GFAT-2)", pero sin limitación.

En el contexto de la presente invención, la expresión "actividad aumentada de una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT" significa un aumento de la expresión de los genes endógenos que codifican proteínas que tienen la actividad de una GFAT y/o un aumento de la cantidad de transcripciones que codifican proteínas que tienen la actividad de una GFAT y/o un aumento de la cantidad de proteína que tiene la actividad de una GFAT en las células y/o un aumento de la actividad enzimática de proteínas que tienen la actividad de una GFAT en las células.

Es posible determinar un aumento de la expresión, por ejemplo, midiendo la cantidad de transcripciones que codifican una proteína que tiene la actividad de una GFAT, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Northern

o RT-PCR. En el presente documento, un aumento significa preferentemente un aumento de la cantidad de transcripciones en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente o plantas de tipo natural no modificadas genéticamente de al menos un 50 %, en particular de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 85 %, y de manera particularmente preferida de al menos un 100 %. Un aumento de la cantidad de transcripciones que codifican una proteína que tiene la actividad de una GFAT también significa que las plantas o células vegetales que no tienen cantidades detectables de transcripciones que codifican una proteína que tiene la actividad de una GFAT tienen, tras la modificación genética de acuerdo con la invención, cantidades detectables de transcripciones que codifican una proteína que tiene la actividad de una GFAT.

Es posible determinar un aumento de la cantidad de proteína que tiene la actividad de una GFAT que produce un aumento de la actividad de estas proteínas en las células vegetales en cuestión, por ejemplo, mediante procedimientos inmunológicos tales como análisis de transferencia Western, ELISA (inmunoensayo de sorbencia ligado a una enzima) o RIA (radioinmunoensayo). Los procedimientos de preparación de anticuerpos que reaccionan específicamente con una determinada proteína, es decir, que se unen específicamente a dicha proteína, son conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Lottspeich y Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik [Bioanalysis], Spektrum akad. Verlag, Heidelberg, Berlín, ISBN 3-8274-0041-4). Algunas compañías (por ejemplo, Eurogentec, Bélgica) ofrecen la preparación de dichos anticuerpos como un servicio bajo pedido. En el presente documento, un aumento de la cantidad de proteína significa preferentemente un aumento de la cantidad de proteína que tiene una actividad de una GFAT en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente o plantas de tipo natural no modificadas genéticamente de al menos un 50 %, en particular, de al menos un 70 %, preferentemente de al menos un 85 %, y de manera particularmente preferida, de al menos un 100 %. Un aumento de la cantidad de proteína que tiene una actividad de una GFAT también significa que las plantas o células vegetales que no tienen cantidad detectable de una proteína que tiene la actividad de una GFAT tienen, tras la modificación genética de acuerdo con la invención, una cantidad detectable de una proteína que tiene la actividad de una GFAT.

Es posible determinar el aumento de la actividad de una proteína que tiene la actividad de una GFAT en extractos vegetales mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia como se describe, por ejemplo, en Samac et al. (2004, “Applied Biochemistry and Biotechnology” 113-116, Humana Press, Editor Ashok Mulehandani, 1167-1182, ISSN 0273-2289). En el punto 5 del apartado de Procedimientos generales se ofrece un procedimiento preferido de determinación de la cantidad de la actividad de una proteína que tiene la actividad de una GFAT.

Un aumento de la cantidad de actividad (enzimática) de proteínas que tienen la actividad de una GFAT significa preferentemente un aumento de la actividad de dichas proteínas de lo menos un 50 %, preferentemente de al menos un 70 %, de manera especialmente preferida de al menos un 85 % y de manera particularmente preferida de al menos un 100 % en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente o plantas de tipo natural no modificadas genéticamente. Un aumento de la cantidad de actividad enzimática de proteínas que tienen la actividad de una GFAT también significa que las plantas o células vegetales que no tienen cantidad detectable de una proteína que tiene la actividad de una GFAT tienen, tras la modificación genética de acuerdo con la invención, una cantidad detectable de una proteína que tiene la actividad de una GFAT.

En el contexto de la presente invención, el término "genoma" se debe entender en el sentido de todo el material genético presente en una célula vegetal. El experto en la materia sabe que, además del núcleo, otros compartimentos (por ejemplo, plástidos, mitocondrias) también contienen material genético.

En el contexto de la presente invención, la expresión "molécula de ácido nucleico integrada de forma estable" se debe entender en el sentido de la integración de una molécula de ácido nucleico en el genoma de la planta. Una molécula de ácido nucleico integrada de manera estable se caracteriza porque, durante la replicación del sitio de integración correspondiente, se multiplica junto con las secuencias de ácidos nucleicos del huésped que bordean el sitio de integración, de manera que el sitio de integración de la cadena de ADN replicada está rodeado por las mismas secuencias de ácidos nucleicos que en la hebra de lectura que sirve como una matriz para la replicación.

Hay un gran número de técnicas para integrar de manera estable las moléculas de ácido nucleico a una célula vegetal huésped. Estas técnicas incluyen la transformación de células vegetales con T-ADN usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como medio de transformación, la fusión de protoplastos, la inyección, la

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consiguiente, se ha de determinar la cantidad de hialuronano con respecto al peso fresco o con respecto al peso seco en las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o en las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, prefiriéndose particularmente durante la cosecha o (uno o dos) días antes de la recolección de las células vegetales en cuestión o de las plantas en cuestión. En el presente documento, se hace uso, en particular, de material vegetal (por ejemplo, tubérculos, semillas, hojas) con respecto a la cantidad de hialuronano que se vaya a usar para su posterior procesamiento.

Las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención que sintetizan hialuronano se pueden identificar mediante el aislamiento del hialuronano que es sintetizado por las mismas y la demostración de su estructura. Dado que el tejido de la planta tiene la ventaja de que no contiene hialuronidasas, se puede usar un procedimiento de aislamiento simple y rápido para confirmar la presencia de hialuronano en las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención. Con este fin, se añade agua al tejido vegetal que se va a examinar y, a continuación, se tritura mecánicamente el tejido vegetal (con la ayuda de, por ejemplo, un molino de bolas, un molino de batidor, un mezclador Warring, un extractor de zumo, etc.). Si es necesario, luego se puede añadir más agua a la suspensión, y después se eliminan los restos celulares y los componentes insolubles en agua por centrifugación o tamizado. Después, se puede demostrar la presencia de hialuronano en el sobrenadante obtenido tras la centrifugación usando, por ejemplo, una proteína que se una específicamente al hialuronano. Un procedimiento de detección de hialuronano con la ayuda de una proteína que se une específicamente al hialuronano se describe, por ejemplo, en el documento US 5.019.498. Los kit de ensayo (por ejemplo, el kit de ensayo de ácido hialurónico (HA) de Corgenix, Inc., Colorado, EE.UU., Nº de prod. 029-001); véase también el punto 4 del apartado de Procedimientos generales). En paralelo, es posible digerir inicialmente una parte alícuota del sobrenadante de centrifugación obtenido con una hialuronidasa y luego confirmar la presencia de hialuronano con la ayuda de una proteína que se una específicamente al hialuronano, como se describe anteriormente. Mediante la acción de la hialuronidasa en el lote paralelo, el hialuronano presente en la misma se degrada, de modo que tras la digestión completa ya no es posible detectar cantidades significativas de hialuronano. Además, también se puede confirmar la presencia de hialuronano en el sobrenadante de la centrifugación usando otros procedimientos de análisis tales como, por ejemplo, IR, RMN o espectroscopia de masas.

La sobreexpresión, en el maíz, de una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT condensada traduccionalmente con un péptido señal plastídico produce un aumento del contenido de UDP-glucosamina, y la sobreexpresión citosólica, en el maíz, de una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT produce un aumento del contenido de glucosamina 1-fosfato en el tejido endospérmico triturado. Sin embargo, la UDPglucosamina y la glucosamina 1-fosfato no son sustratos para la síntesis de hialuronano por la hialuronano sintasa. Además, se sabe que la glucosamina tiene un efecto citotóxico sobre las células vegetales (Roberts et al., 1971, Plant Physiol. 48, 36-42) y que, si hay concentraciones relativamente altas en las células vegetales, se convierte en glucosamina 6-fosfato. Asimismo, la glucosamina-6-fosfato es tóxica para las células vegetales. (WO 98 35047, US 6.444.878). Además, se sabe que las proteínas que tienen la actividad de una GFAT pueden ser reguladas de una manera inhibidora por los metabolitos que se forman en la ruta metabólica posterior para la síntesis de UDP-N-acetilglucosamina. Las proteínas que tienen la actividad de una GFAT, aisladas de eucariotas (tanto con organismos animales como vegetales) son inhibidas, por ejemplo, por la UDP-N-acetil-glucosamina, que es uno de los dos sustratos para la hialuronano sintasa (Kornfeld, 1967, J. Biol. Chem. 242(13), 3135-3141; Graack et al., 2001, Biochem. J. 360, 401-412; Mayer et al., 1968, Plant Physiol. 43, 1097-1107). Las proteínas bacterianas que tienen la actividad de una GFAT son inhibidas por la glucosamina-6-fosfato, un producto de reacción directa de la reacción catalizada por GFAT ((Deng et al., 2005, Metabolic Engineering 7, 201-214). No hay indicios en la literatura de lo que puede limitar la cantidad de hialuronano sintetizado en las células vegetales. Por consiguiente, sorprendentemente, se ha encontrado que las células vegetales modificadas genéticamente o las plantas modificadas genéticamente que tienen una molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa y que tienen una actividad de GFAT más aumentada en comparación con las células vegetales modificadas genéticamente o las plantas modificadas genéticamente que (solo) tienen la actividad de hialuronano sintasa producen cantidades significativamente altas de hialuronano.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o a plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, caracterizadas porque producen una mayor cantidad de hialuronano en comparación con las células vegetales modificadas genéticamente

o en comparación con las plantas modificadas genéticamente que (solo) tienen la actividad de una hialuronano sintasa o en comparación con las células vegetales modificadas genéticamente o en comparación con las plantas modificadas genéticamente que tienen la actividad de un hialuronano sintasa y no una actividad aumentada de una proteína que tiene la actividad de una GFAT.

En el contexto de la presente invención, la expresión "célula vegetal o planta que (solo) tiene la actividad de una hialuronano sintasa" se ha de entender en el sentido de una célula vegetal modificada genéticamente o de una planta modificada genéticamente en la que la modificación genética consiste en que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa, en comparación con las células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente o las plantas de tipo natural no modificadas genéticamente correspondientes. En particular, las "células vegetales o plantas que (solo) tienen la actividad de una hialuronano sintasa" se caracterizan porque sintetizan hialuronano y no tienen modificaciones genéticas adicionales distintas de la introducción de una

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molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa en células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente o plantas de tipo natural no modificadas genéticamente. Preferentemente, dichas plantas no tienen una actividad aumentada de una proteína que tiene la actividad de una GFAT.

La cantidad de hialuronano producida por las células vegetales o plantas se puede determinar con la ayuda de los procedimientos que ya se han descrito anteriormente, por ejemplo, usando un kit de ensayo comercial (por ejemplo, el kit de ensayo de ácido hialurónico (HA) de Corgenix, Inc., Colorado, EE.UU., Nº de producto 029-001). En el punto 4 del apartado de Procedimientos generales, se describe un procedimiento que se prefiere en el contexto de la presente invención para determinar el contenido de hialuronano en células vegetales o plantas.

En una realización adicional de la presente invención, las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención son células vegetales de una planta terrestre verde o plantas terrestres verdes, respectivamente, que sintetizan hialuronano.

En el contexto de la presente invención, la expresión "planta terrestre verde (embriofita)" ha de entenderse como se define en Strasburger, "Lehrbuch der Botanik" [Libro de texto de botánica], XXXIV ed., Spektrum Akad. Verl., 1999, (ISBN 3-8274-0779-6).

Una realización preferida de la presente invención se refiere a células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención de plantas multicelulares o plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención que son organismos multicelulares. Por consiguiente, dicha realización se refiere a células vegetales o plantas que no proceden de plantas unicelulares (protistas) o que no son protistas.

Las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención pueden ser, en principio, células vegetales y plantas, respectivamente, de cualquier especie de planta, es decir, plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se trata preferentemente de plantas de cultivo, es decir, plantas cultivadas por el ser humano con el fin de alimentar a seres humanos y animales o para la producción de biomasa y/o la preparación de sustancias para fines técnicos, industriales (por ejemplo maíz, arroz, trigo, alfalfa, centeno, avena, cebada, yuca, patata, tomate, pasto alto (Panicum virgatum), sagú, fríjol mungo, pas, sorgo, zanahoria, berenjena, rábano, colza, soja, cacahuete, pepino, calabaza, melón, puerro, ajo, coles, espinaca, patata dulce, espárrago, calabacín, lechuga, alcachofa, maíz dulce, chirivía, escorzonera, alcachofa de Jerusalén, plátano, remolacha azucarera, caña de azúcar, remolacha, brócoli, repollo, cebolla, remolacha amarilla, diente de león, fresa, manzana, albaricoque, ciruela, durazno, vid, coliflor, apio, pimiento, colinabo, ruibarbo). Se prefieren particularmente las plantas de arroz, tomate o patata.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención en las que la molécula de ácido nucleico que codifica la hialuronano sintasa se caracteriza porque codifica una hialuronano sintasa viral. La molécula de ácido nucleico que codifica la hialuronano sintasa codifica preferentemente una hialuronano sintasa de un virus que infecta algas. Con respecto a un virus que infecta algas, la molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa codifica preferentemente una hialuronano sintasa de un virus que infecta al género Chlorella, de manera particularmente preferida una hialuronano sintasa de un Virus 1 de Chlorella de Paramecium bursaria y de manera especialmente preferida una hialuronano sintasa de un virus de Chlorella de Paramecium bursaria de una cepa H1.

En una realización preferida adicional, la presente invención se refiere a células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención en las que la molécula de ácido nucleico que codifica la hialuronano sintasa se caracteriza porque los codones de la molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa están modificados en comparación con los codones de la molécula de ácido nucleico que codifica la hialuronano sintasa del organismo del que procede la hialuronano sintasa. Con particular preferencia, los codones de la hialuronano sintasa se han modificado de manera que se adaptan a la frecuencia de uso de los codones de la célula vegetal o la planta en cuyo genoma se integran o se van a integrar.

Debido a la degeneración del código genético, los aminoácidos pueden ser codificados por uno o más codones. En los distintos organismos, los codones que codifican un aminoácido se usan en diferentes frecuencias. La adaptación del codón de una secuencia de ácido nucleico codificante a la frecuencia de uso en la célula vegetal o en la planta en cuyo genoma se va a integrar la secuencia que debe expresarse puede contribuir a una mayor cantidad de proteína traducida y/o a la estabilidad del ARNm en cuestión en las células vegetales o plantas en particular. La frecuencia de uso de los codones en las células vegetales o las plantas en cuestión puede ser determinada por el experto en la materia mediante el examen de la mayor cantidad de secuencias de ácidos nucleicos codificantes del organismo en cuestión que sea posible para la frecuencia con que ciertos codones se usan para la codificación de un determinado aminoácido. La frecuencia de uso de los codones de ciertos organismos es conocida por el experto en la materia, y se puede determinar de una manera sencilla y rápida usando programas informáticos. Los programas informáticos adecuados son de acceso público y gratuitos entre otros a través de Internet (por ejemplo, http://gcua.schoedl.de/; http://www.kazusa.or.jp/codon/; http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html). La adaptación de los codones de una secuencia de ácido nucleico codificante a la frecuencia de uso en la célula

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nucleico que codifican una hialuronano sintasa y/o una proteína que tiene la actividad de una GFAT, secuencias de ácidos nucleicos que no estén presentes de forma natural en combinación con las moléculas de ácido nucleico mencionadas. Las secuencias de ácido nucleico adicionales mencionadas que están presentes en una molécula de ácido nucleico recombinante en combinación con una molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa o una proteína que tiene la actividad de una GFAT pueden ser cualquier secuencia. Por ejemplo, pueden ser secuencias de ácido nucleico de plantas genómicas. Las secuencias de ácidos nucleicos adicionales son preferentemente secuencias reguladoras (promotores, señales de terminación, potenciadores), prefiriéndose particularmente las secuencias reguladoras que son activas en el tejido vegetal, prefiriéndose especialmente las secuencias reguladoras específicas del tejido que son activas en el tejido vegetal. Los procedimientos de generación de moléculas de ácido nucleico recombinantes son conocidos por el experto en la materia, y comprenden procedimientos de ingeniería genética tales como, por ejemplo, la vinculación de las moléculas de ácido nucleico mediante ligadura, la recombinación genética o la síntesis de novo de moléculas de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Sambrok et al., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, III edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., “Short Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons; V Edición (2002), ISBN: 0471250929).

Las células vegetales modificadas genéticamente y las plantas modificadas genéticamente que tienen una molécula de ácido nucleico foránea integrada de forma estable en su genoma o una pluralidad de moléculas de ácido nucleico foráneas integradas de forma estable en su genoma que codifican la hialuronano sintasa y que aumentan la actividad de una proteína que tiene la actividad de una GFAT en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente o plantas de tipo natural no modificadas genéticamente se pueden distinguir de dichas células vegetales de tipo natural y dichas plantas de tipo natural, respectivamente, entre otras cosas, por el hecho de que comprenden una molécula de ácido nucleico foránea que no se produce de forma natural en las células vegetales de tipo natural y plantas de tipo natural, respectivamente, o en que dicha molécula se integra en un sitio del genoma de la célula vegetal modificada genéticamente de acuerdo con la invención o del genoma de la planta modificada genéticamente de acuerdo con la invención en el que no se producen en las células vegetales de tipo natural y plantas de tipo natural, respectivamente, es decir, en un ambiente genómico diferente. Además, dichas células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención y plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención se pueden distinguir de las células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente y de las plantas de tipo natural no modificadas genéticamente, respectivamente, en que comprenden al menos una copia de la molécula de ácido nucleico foránea integrada de forma estable en su genoma, si procede, además de copias de dicha molécula presente de forma natural en las células vegetales de tipo natural o plantas de tipo natural. Si la/s molécula/s de ácido nucleico foránea/s introducida/s en las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o en la planta modificada genéticamente de acuerdo con la invención son copias adicionales de moléculas ya presentes de forma natural en las células vegetales de tipo natural

o las plantas de tipo natural, las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención y las plantas genéticamente modificadas de acuerdo con la invención se pueden distinguir de las células vegetales de tipo natural y de las plantas de tipo natural, respectivamente, en particular, por el hecho de que esta/s copia/s adicional/es se encuentra/n en sitios del genoma en los que está/n presente/s en las células vegetales de tipo natural y las plantas de tipo natural, respectivamente. La integración estable de una molécula de ácido nucleico en el genoma de una célula vegetal o una planta se puede demostrar mediante procedimientos genéticos y/o procedimientos de biología molecular. Una integración estable de una molécula de ácido nucleico en el genoma de una célula vegetal o el genoma de una planta se caracteriza porque en la progenie que ha heredado dicha molécula de ácido nucleico, la molécula de ácido nucleico integrada de forma estable está presente en el mismo entorno genómico que en la generación parental. La presencia de una integración estable de una secuencia de ácido nucleico en el genoma de una célula vegetal o en el genoma de una planta se puede demostrar usando procedimientos conocidos por el experto en la materia, entre otros, con ayuda del análisis de transferencia Southern del análisis RFLP (polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción) (Nam et al., 1989, “The Plant Cell” 1, 699-705; Leister y Dean, 1993, “The Plant Journal” 4 (4), 745-750), con procedimientos basados en la PCR tales como, por ejemplo, el análisis de las diferencias en la longitud de los fragmentos amplificados (polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados, AFLP) (Castiglioni et al., 1998, “Genetics” 149, 2039-2056; Meksem et al., 2001, “Molecular Genetics and Genomics” 265, 207-214; Meyer et al., 1998, “Molecular and General Genetics” 259, 150-160) o usando fragmentos amplificados escindidos usando endonucleasas de restricción (secuencias polimórficas amplificadas escindidas, CAPS) (Konieczny y Ausubel, 1993, “The Plant Journal” 4, 403-410; Jarvis et al., 1994, “Plant Molecular Biology” 24, 685-687; Bachem et al., 1996, “The Plant Journal” 9(5), 745-753).

En principio, la molécula de ácido nucleico foránea puede ser cualquier molécula de ácido nucleico que aumente, en la célula vegetal o la planta, la actividad de una proteína que tenga la actividad de una GFAT.

En el contexto de la presente invención, las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención y las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención también se pueden preparar mediante el uso de mutagénesis de inserción (revisión: Thomeycroft et al., 2001, “Journal of experimental Botany” 52 (361), 1593-1601). En el contexto de la presente invención, la mutagénesis de inserción se ha de entender en el sentido de, en particular, la inserción de transposones o ADN de transferencia (ADN-T) en un gen o en las proximidades de un gen que codifique una proteína que tenga la actividad de una GFAT, aumentando así la actividad de una proteína que tenga la actividad de una GFAT en la célula en cuestión. Los transposones pueden

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acceso de EMBL AF334737.1, Watzele et al., 1989, J. Biol. Chem. 264, 8753-8758), Aspergillus niger (Nº de acceso de EMBL AY594332.1), Candida albicans (Nº de acceso de EMBL X94753.1), de insectos, por ejemplo, para Aedes aegyti (Kato et al., 2002, Insect. Biol. 11 (3), 207,216; Nº de acceso de EMBL AF399922.1), Drosophila melanogaster (GFAT-1: Nº de acceso de EMBL Y18627.1, GFAT-2: Nº de acceso de EMBL NM_143360.2), de algas para Volvariella volvacea (Nº de acceso de EMBL AY661466.1), de vertebrados, por ejemplo, para Homo sapiens (GFAT

1: Nº de acceso de EMBL AF334737.1; GFAT-2: Nº de acceso de NCBI BC000012.2, Oki et al., 1999, Genomics 57 (2),227-34), Mus musculus (GFAT-1: Nº de acceso de EMBL AF334736.1; GFAT-2: Nº de acceso de EMBL AB016780.1) o de plantas, por ejemplo, para Arabidopsis thaliana (Nº de acceso de EMBL AP001297.1; Nº de acceso de cads NCBI BAB03027.1)

En una realización preferida, la presente invención se refiere a células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención y a plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención en las que la molécula de ácido nucleico foránea que codifica una proteína que tiene la actividad de una GFAT se selecciona del grupo que consiste en:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEC ID Nº 5 o una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEC ID Nº 7 o una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEC ID Nº 9; b) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína cuya secuencia es al menos un 60 %, preferentemente al menos un 80 %, con preferencia al menos un 90 %, de manera especialmente preferida al menos un 95 % y lo más preferentemente al menos un 98 % idéntica a la secuencia de aminoácidos dada en SEC ID Nº 5, en SEC ID Nº 7 o en SEC ID Nº 9; c) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº 4 o una secuencia complementaria a la misma, la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº 6 o una secuencia complementaria a la misma, la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº 8 o una secuencia complementaria a la misma o la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº 10 o una secuencia complementaria a la misma; d) moléculas de ácido nucleico que son al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, con preferencia al menos un 90 %, de manera especialmente preferida al menos un 95 % y lo más preferentemente al menos un 98 % idénticas a las secuencias de ácido nucleico descritas en a) o c); e) moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con al menos una hebra de las secuencias de ácido nucleico descritas en a) o c); f) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos difiere de la secuencia de las moléculas de ácido nucleico mencionadas en a) o c) debido a la degeneración del código genético; y g) moléculas de ácido nucleico que son fragmentos, variantes alélicas y/o derivados de las moléculas de ácido nucleico mencionadas en a), b), c), d), e) o f).

En el contexto de la presente invención, el término "hibridación" significa una hibridación en condiciones de hibridación convencionales, preferentemente en condiciones rigurosas, como se describe, por ejemplo, en Sambrock et al., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, II ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Con particular preferencia, "hibridación" significa una hibridación en las siguientes condiciones: 2 x SSC; 10 x solución de Denhardt (Fikoll 400 + PEG + BSA; proporción 1:1:1); SDS al 0,1 %; EDTA 5 mM; Na2HPO4 50 mM; 250 g/ml de ADN de esperma de arenque; 50 g/ml de ARNt; o tampón de fosfato de sodio 25 M, pH 7,2; EDTA 1 mM; SDS al 7 %. Temperatura de hibridación: T = 65 a 68 ºC.

Tampón de lavado: 0,1 x SSC; SDS al 0,1 %. Temperatura de lavado: T = 65 a 68 ºC.

Las moléculas de ácido nucleico que se hibridan con las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que tiene la actividad de una GFAT pueden proceder de cualquier organismo. Por consiguiente, pueden proceder de bacterias, hongos, animales, plantas o virus. Las moléculas de ácido nucleico que se hibridan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína que tiene la actividad de una GFAT proceden de manera particularmente preferida de mamíferos, plantas o bacterias, y de manera especialmente preferida del ratón o Escherichia coli. Las moléculas de ácido nucleico que se hibridan con moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína que tiene la actividad de una GFAT-1 o una GFAT-2 proceden preferentemente de un organismo eucariota, en particular proceden preferentemente de un organismo animal, de manera especialmente preferida del ratón. Las moléculas de ácido nucleico que se hibridan con las moléculas mencionadas se pueden aislar, por ejemplo, de bibliotecas de ADNc o genómicas. Dichas moléculas de ácido nucleico se pueden identificar y aislar usando las moléculas de ácido nucleico mencionadas o partes de estas moléculas o los complementos inversos de estas moléculas, por ejemplo, por hibridación de acuerdo con procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, II ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) o por amplificación usando PCR. Como muestra de hibridación para aislar una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene la actividad de un GFAT o la actividad de una GFAT-1 o la actividad de una GFAT-2, es posible usar, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que tienen exactamente o esencialmente la secuencia de nucleótidos dada en SEC ID Nº 4 o en SEC ID Nº 6 o en SEC ID NO 8 o en SEC ID Nº 10, o partes de estas secuencias. Los fragmentos usados como muestras de hibridación también pueden ser fragmentos sintéticos u oligonucleótidos preparados usando las técnicas de síntesis habituales, cuya secuencia es esencialmente idéntica a

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materia, ya se han mencionado anteriormente y son de aplicación en el presente documento de una manera análoga.

En una realización preferida adicional, la presente invención se refiere a células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o a plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención en las que las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT se caracterizan porque los codones de dichas moléculas de ácido nucleico son diferentes de los codones de las moléculas de ácido nucleico que codifican dicha proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT del organismo parental. De manera particularmente preferida, los codones de las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT se cambian, adaptándose, por tanto, a la frecuencia de uso de los codones de la célula vegetal o la planta en cuyo genoma se integran o se van a integrar.

La presente invención proporciona además células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención caracterizadas porque las moléculas de ácido nucleico foráneas integradas de forma estable en el genoma de la célula vegetal o de la planta que codifica una hialuronano sintasa y/o que codifica una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT están ligadas a elementos reguladores que inician la transcripción en células vegetales (promotores). Estas pueden ser promotores homólogos o heterólogos. Los promotores pueden ser constitutivos, específicos del tejido, específicos del desarrollo o regulados por factores externos (por ejemplo, tras la aplicación de sustancias químicas, por la acción de factores abióticos tales como el calor y/o el frío, corrientes de aire, enfermedad, etc.). En el presente documento, las moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronano sintasa o una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT, cuyas moléculas de ácido nucleico están integradas en el genoma de una célula vegetal modificada genéticamente de acuerdo con la invención o de una planta genéticamente modificada de acuerdo con la invención, se pueden ligar, en cada caso, al mismo promotor o las secuencias individuales se pueden ligar a promotores diferentes.

Una realización preferida de la presente invención se refiere a células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o a plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención en las que al menos una molécula de ácido nucleico foránea, de manera particularmente preferida al menos dos moléculas de ácido nucleico foráneas, de manera especialmente preferida tres moléculas de ácido nucleico foráneas seleccionadas del grupo que consiste en moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronano sintasa o una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT está/n ligadas a un promotor específico del tejido. Los promotores específicos del tejido preferidos son promotores que inician la transcripción específicamente en células de tubérculos, frutos o semillas u hojas de plantas.

Para expresar moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronano sintasa o una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT, estas se ligan preferentemente a secuencias de ADN reguladoras que garantizan la transcripción en células vegetales. Se trata, en particular, de promotores. En general, cualquier promotor activo en células vegetales es adecuado para la expresión. En el presente documento, el promotor se puede seleccionar de manera que la expresión sea constitutiva o solo en un determinado tejido, en un determinado momento del desarrollo de la planta o en un punto temporal determinado por factores externos. Tanto en lo que respecta a la planta como en lo que respecta a la molécula de ácido nucleico que se va a expresar, el promotor puede ser homólogo o heterólogo. Los promotores adecuados son, por ejemplo, el promotor de 35S RNS del virus del mosaico de la coliflor o el promotor de ubiquitina del maíz o el YLCV de Cestrum (virus del enrollamiento foliar amarillo WO 01 73087; Stavolone et al., 2003, Plant Mol. Biol. 53, 703-713) para una expresión constitutiva, el promotor del gen patatín B33, (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8(1989), 23-29) para una expresión específica del tubérculo de la patata o un promotor específico del fruto del tomate tal como, por ejemplo, el promotor de poligalacturonasa del tomate (Montgomery et al., 1993, Plant Cell 5, 1049-1062) o el promotor E8 del tomate (Metha et al., 2002, Nature Biotechnol. 20(6), 613-618) el promotor de ACC oxidasa del melocotón (Moon y Callahan, 2004,

J. Experimental Botany 55 (402), 1519-1528) o un promotor que garantiza la expresión únicamente en tejidos fotosintéticamente activos, por ejemplo, el promotor ST-LS1 (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) o para una expresión específica del endospermo, el promotor HMWG del trigo, el promotor USP, el promotor de faseolina, los promotores de los genes de zeína del maíz (Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93), el promotor de glutelina (Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218), el promotor shrunken-1 (Werr et al., EMBO J. 4 (1985), 13731380), un promotor de globulina (Nakase et al., 1996, Gene 170(2), 223-226) o un promotor de prolamina (Qu y Takaiwa, 2004, Plant Biotechnology Journal 2(2), 113-125). Sin embargo, también se pueden usar promotores que solo sean activados en un punto temporal determinado por factores externos (véase, por ejemplo, el documento WO 9307279). Pueden ser de particular interés en el presente documento los promotores de proteínas de choque térmico que permiten una inducción simple. Además, se pueden usar promotores específicos de semillas tales como, por ejemplo, el promotor USP de Vicia faba, que garantiza una expresión específica de la semilla en Vicia faba y otras plantas (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol. Gen. 225 (1991), 459467). El uso de promotores presentes en el genoma de los virus que infectan a las algas son también adecuados para la expresión de secuencias de ácidos nucleicos en plantas (Mitra et al., 1994, Biochem. Biophys Res Commun 204(1), 187-194; Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol Biol 26(1), 85-93, Van Etten et al., 2002, Arch Virol 147, 14791516).

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En el contexto de la presente invención, la expresión "planta de patata" o “patata" se ha de entender en el sentido de especies de plantas del género Solanum, particularmente especies productoras de tubérculos del género Solanum y, en particular Solanum tuberosum.

En el contexto de la presente invención, la expresión "planta de tomate" o "tomate" se ha de entender en el sentido 5 de especies de plantas del género Lycopersicon, en particular, Lycopersicon esculentum.

La ventaja adicional de la presente invención es que las partes cosechables, el material de propagación, las partes procesables o las partes consumibles de las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención comprenden más hialuronano que las plantas transgénicas que sintetizan hialuronano descritas en la literatura. Por consiguiente, las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención no solo son particularmente 10 adecuadas para su uso como materia prima de la que se pueda aislar hialuronano, sino que también se pueden usar directamente como alimento/pienso o para la preparación de productos alimenticios/piensos que tengan un carácter profiláctico o terapéutico (por ejemplo, para la profilaxis de la osteoartritis, US 6.607.745). Dado que las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención tienen un contenido de hialuronano más elevado que las plantas descritas en la literatura, la preparación de dicho producto alimenticio/pienso requiere cantidades inferiores 15 de partes cosechables, material de propagación, partes procesables o partes consumibles de las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención. Si se consumen partes consumibles de plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, por ejemplo, directamente en forma de un denominado "producto nutracéutico", es posible lograr un efecto positivo incluso mediante la ingestión de cantidades relativamente bajas de sustancia. Esto puede ser de particular importancia, entre otras cosas, en la producción de 20 piensos para animales, ya que los alimentos para animales que tienen un contenido demasiado alto de componentes vegetales no son adecuados como piensos para diversas especies animales. En virtud de la alta capacidad del hialuronano para unirse al agua, las partes cosechables, el material de propagación, las partes procesables o las partes consumibles de las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención tienen además la ventaja de que se requieren menos espesantes en la producción de productos alimenticios/piensos solidificados. Así pues, 25 por ejemplo, la producción de jalea requiere menos azúcar, lo que se asocia con un efecto positivo adicional sobre la salud. En la producción de alimentos/piensos que requieren la deshidratación del material vegetal crudo, la ventaja de usar partes cosechables, material de propagación, partes procesables o partes consumibles de las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención consiste en el hecho de que se tiene que eliminar menos agua del material vegetal en cuestión, lo que genera menores costes de producción y, debido a los procedimientos

30 de preparación más suaves (por ejemplo, entrada de calor inferior y/o más breve), un alto valor nutritivo del producto alimenticio/pienso en cuestión. Así pues, por ejemplo, en la producción de la salsa de tomate, se ha de introducir menos energía para obtener la consistencia deseada.

La presente invención proporciona además un procedimiento de preparación de una planta que sintetiza hialuronano, que comprende:

35 a) modificar genéticamente una célula vegetal, comprendiendo la modificación genética las siguientes etapas i a

ii:

i) la introducción de una molécula de ácido nucleico foránea que codifica una hialuronano sintasa en la célula vegetal; ii) la introducción de una modificación genética en la célula vegetal, dando lugar la modificación genética a un

40 aumento de la actividad de una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente;

en el que las etapas i a ii se pueden llevar a cabo en cualquier orden, de forma individual, o se puede llevar a cabo cualquier combinación de las etapas i a ii de forma simultánea;

b) regenerar una planta a partir de células vegetales de la etapa a);

45 c) generar, si es apropiado, otras plantas usando las plantas de acuerdo con la etapa b), siendo, si es apropiado, las células vegetales aisladas de plantas de acuerdo con la etapa b), y repitiéndose las etapas a) a c) del procedimiento hasta que se genere una planta que tenga una molécula de ácido nucleico foránea que codifique una hialuronano sintasa y que tenga una actividad aumentada de una proteína que tenga la actividad (enzimática) de una GFAT en comparación con las células vegetales de tipo natural no modificadas

50 genéticamente correspondientes.

Preferentemente, la presente invención se refiere a procedimientos de preparación de una planta que sintetiza hialuronano, que comprenden:

a) modificar genéticamente una célula vegetal, comprendiendo la modificación genética las siguientes etapas i a ii en cualquier orden, o pudiéndose llevar a cabo cualquier combinación de las etapas i a ii de manera individual o

55 simultánea:

i) la introducción de una molécula de ácido nucleico foránea que codifica una hialuronano sintasa en la célula vegetal; ii) la introducción de una modificación genética en la célula vegetal, dando lugar la modificación genética a un

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aumento de la actividad de una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural no modificadas genéticamente;

b) regenerar una planta a partir de células vegetales que comprenden la modificación genética de acuerdo con las etapas:

i) a) i

ii) a) ii

iii) a) i y a) ii;

c) introducir en las células vegetales de las plantas de acuerdo con la etapa:

i) b) i una modificación genética de acuerdo con la etapa a) ii;

ii) b) ii una modificación genética de acuerdo con la etapa a) i;

y regenerar una planta;

d) generar, si es apropiado, más plantas con ayuda de las plantas obtenidas de acuerdo con cualquiera de las etapas b) iii o c) i o c) ii.

Las modificaciones genéticas introducidas de acuerdo con la etapa a) en la célula vegetal, en principio, pueden ser cualquier tipo de modificación que produzca un aumento de la actividad de una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT.

La regeneración de las plantas de acuerdo con la etapa b) y, si es apropiado, con la etapa c) de los procedimientos de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo usando procedimientos conocidos para el experto en la materia (descritos, por ejemplo, en "Plant Cell Culture Protocols", 1999, editado por R. D. Hall, Humana Press, ISBN 089603-549-2).

La generación de nuevas plantas (dependiendo del procedimiento de acuerdo con la etapa c) o la etapa d)) de los procedimientos de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo, por ejemplo, por propagación vegetativa (por ejemplo, mediante esquejes, tubérculos o por cultivo de callos y la regeneración de plantas intactas) o por propagación generativa. En este contexto, generalmente, la propagación generativa tiene lugar en condiciones controladas, es decir, se hibridan plantas seleccionadas con características específicas entre sí y se multiplican. La generación tiene lugar preferentemente de manera que las plantas adicionales (dependiendo del procedimiento generado de acuerdo con la etapa c) o la etapa d)) comprenden las modificaciones introducidas en las etapas anteriores.

En los procedimientos de acuerdo con la invención de preparación de plantas que sintetizan hialuronano, las modificaciones genéticas para la generación de las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención se pueden llevar a cabo simultáneamente o en etapas sucesivas. En el presente documento, es irrelevante si se usa el mismo procedimiento que para la modificación genética que introduce una molécula de ácido nucleico foránea que codifica una hialuronano sintasa en la célula vegetal para modificaciones genéticas sucesivas que den lugar a un aumento de la actividad de una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT.

En una realización adicional de los procedimientos de acuerdo con la invención para la preparación de una planta que sintetiza hialuronano, la modificación genética consiste en la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico foránea en el genoma de la célula vegetal, dando lugar la presencia o la expresión de la/s molécula/s de ácido nucleico foránea/s a un aumento de la actividad de una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT en la célula vegetal.

Como ya se ha descrito anteriormente para las moléculas de ácido nucleico foráneas introducidas para la modificación genética en la célula vegetal o la planta, lo que se introduce en la etapa a) de los procedimientos de acuerdo con la invención de preparación de una planta que sintetiza hialuronano puede ser una molécula de ácido nucleico individual o una pluralidad de moléculas de ácido nucleico. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico foráneas que codifican una hialuronano sintasa y/o que codifican una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT pueden estar presentes juntas en una sola molécula de ácido nucleico, o pueden estar presentes en moléculas de ácido nucleico separadas. Si las moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronano sintasa y que codifican una proteína que tiene la actividad de una GFAT están presentes en una pluralidad de moléculas de ácido nucleico, estas moléculas de ácido nucleico se pueden introducir simultáneamente o en etapas sucesivas en una célula vegetal.

Además, para introducir una molécula de ácido nucleico foránea en la práctica de los procedimientos de acuerdo con la invención de preparación de una planta que sintetiza hialuronano, es posible usar, en lugar de una célula vegetal de tipo natural o una planta de tipo natural, células mutantes o mutantes que se distinguen en que ya tienen un aumento de la actividad de una proteína que tiene la actividad (enzimática) de un GFAT. Si la célula mutante o el mutante ya tiene un aumento de la actividad de una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT en comparación con las correspondientes células vegetales de tipo natural o plantas de tipo natural, para llevar a cabo un procedimiento de acuerdo con la invención de producción de una planta que sintetice hialuronano basta con

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introducir en dicha célula mutante o en dicho mutante una molécula de ácido nucleico foránea que codifique una hialuronano sintasa. Todo lo dicho anteriormente en relación con el uso de mutantes para la preparación de células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención se aplica de manera análoga en el presente documento.

En realizaciones preferidas, la presente invención se refiere a procedimientos de acuerdo con la invención de producción de una planta que sintetiza hialuronano, siendo la molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa de la etapa a) seleccionada del grupo que consiste en:

a) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque codifican una hialuronano sintasa viral; b) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque codifican una hialuronano sintasa de un virus que infecta a Chlorella; c) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque codifican una hialuronano sintasa de un Virus 1 de Paramecium bursaria de Chlorella; d) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque codifican una hialuronano sintasa de un Virus 1 de Paramecium bursaria de Chlorella de la cepa H1; e) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque los codones de la molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa están modificados en comparación con los codones de la molécula de ácido nucleico que codifica la hialuronano sintasa en el organismo parental de la hialuronano sintasa; f) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque los codones de la hialuronano sintasa han sido modificados para adaptarse a la frecuencia del uso de los codones de la célula vegetal o de la planta en cuyo genoma se van a integrar o están integrados; g) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque codifican una hialuronano sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2 o que codifican una hialuronano sintasa cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, de manera particularmente preferida al menos un 90 %, de manera especialmente preferida al menos un 95 % y lo más preferentemente al menos un 98 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO 2; h) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque codifican una proteína cuya secuencia de aminoácidos se puede derivar de la región que codifica la secuencia de ácido nucleico insertada en el plásmido DSM16664 o que codifican una proteína cuya secuencia de aminoácidos es al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, en particular preferentemente al menos un 90 %, de manera especialmente preferida al menos un 95 % y lo más preferentemente al menos un 98 % idéntica a la secuencia de aminoácidos que se puede derivar de la región que codifica la secuencia de ácido nucleico insertada en el plásmido DSM16664; i) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 3, o que son al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, con preferencia al menos un 90 %, de manera especialmente preferida al menos un 95 % y lo más preferentemente al menos un 98 % idénticas a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 3; j) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de ácido nucleico insertada en el plásmido DSM16664 o que son al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, con preferencia al menos un 90 %, de manera especialmente preferida al menos un 95 % y lo más preferentemente al menos un 98 % idénticas a la secuencia de ácido nucleico insertada en el plásmido DSM16664; k) moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronano sintasa, donde las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la hialuronano sintasa están ligadas a elementos reguladores (promotor) que inician la transcripción en células vegetales; o I) moléculas de ácido nucleico de acuerdo con k), donde los promotores son promotores específicos del tejido, en particular preferentemente promotores que inician la iniciación de la transcripción específicamente en las células de tubérculo, fruto o semilla de la planta.

En realizaciones preferidas, la presente invención se refiere a procedimientos de acuerdo con la invención de producción de una planta que sintetiza hialuronano, siendo la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene la actividad de una GFAT seleccionada del grupo que consiste en:

a) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque codifican una proteína que tiene la actividad de una GFAT procedente de bacterias, animales o plantas, preferentemente de Escherichia coli o de ratón; b) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque codifican una proteína que tiene la actividad de una GFAT de un virus que infecta a Chlorella; c) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque codifican una proteína que tiene la actividad de una GFAT de un virus de Paramecium bursaria de Chlorella; d) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque los codones de la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene la actividad de una GFAT están modificados en comparación con los codones de la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que tiene la actividad de una GFAT correspondiente en el organismo parental; e) moléculas de ácido nucleico caracterizadas porque los codones de una proteína que tiene la actividad de una GFAT han sido modificados para adaptarse a la frecuencia de uso de los codones de la célula vegetal o de la planta en cuyo genoma se van a integrar o están integrados; f) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 5 o una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 7 o una proteína

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procedimiento de acuerdo con la invención para la preparación de hialuronano.

La presente invención se refiere además a composiciones que comprenden células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención. En el presente documento, es indiferente si las células vegetales están intactas o ya no están intactas, porque se hayan destruido, por ejemplo, mediante el procesamiento. Las composiciones son preferentemente productos alimenticios o piensos, productos farmacéuticos o cosméticos.

Preferentemente, la presente invención proporciona composiciones que comprenden componentes de las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, de plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, de material de propagación de acuerdo con la invención, de partes de plantas cosechables de acuerdo con la invención o de plantas que se pueden obtener mediante un procedimiento de acuerdo con la invención y que comprenden moléculas de ácido nucleico recombinantes, donde las moléculas de ácido nucleico recombinantes se caracterizan porque comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronano sintasa y proteínas que tienen la actividad (enzimática) de una GFAT.

Una integración estable de moléculas de ácido nucleico foráneas en el genoma de una célula vegetal o de una planta produce las moléculas de ácido nucleico foráneas que están flanqueadas, tras la integración en el genoma de una célula vegetal o planta, por secuencias de ácido nucleico genómicas de la planta. Por consiguiente, en una realización preferida, las composiciones de acuerdo con la invención se caracterizan porque las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes presentes en la composición de acuerdo con la invención están flanqueadas por secuencias de ácido nucleico genómicas de la planta. En el presente documento, las secuencias de ácido nucleico genómicas de la planta pueden ser cualquiera de las secuencias presentes de manera natural en el genoma de la célula vegetal o de la planta usadas para la preparación de la composición.

Las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes presentes en las composiciones de acuerdo con la invención pueden ser una o varias moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, de manera que las moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronano sintasa y proteínas que tienen la actividad (enzimática) de una GFAT están presentes en una molécula de ácido nucleico, o aquellas en las que las moléculas de ácido nucleico pueden estar presentes en moléculas de ácido nucleico recombinantes separadas. Las moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronano sintasa o que codifican una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT pueden estar presentes juntas en una sola molécula de ácido nucleico recombinante, o dos de las moléculas de ácido nucleico mencionadas pueden estar presentes juntas en una sola molécula de ácido nucleico recombinante y la tercera molécula de ácido nucleico puede estar presente en otra molécula de ácido nucleico recombinante en cualquier combinación posible, o todas las moléculas de ácido nucleico mencionadas pueden estar presentes, en cada caso, en moléculas de ácidos nucleicos recombinantes individuales separadas. Dependiendo de cómo las moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronano sintasa o que codifican una proteína que tiene la actividad (enzimática) de una GFAT están presentes en una composición de acuerdo con la invención, pueden estar flanqueadas por secuencias idénticas o diferentes de ácido nucleico genómicas de la planta.

El hecho de que las composiciones de acuerdo con la invención comprenden moléculas de ácido nucleico recombinantes se puede demostrar usando procedimientos conocidos por el experto en la materia tales como, por ejemplo, procedimientos basados en la hibridación o, preferentemente, usando procedimientos basados en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

Preferentemente, las composiciones de acuerdo con la invención comprenden al menos un 0,005 %, con preferencia al menos un 0,01 %, de manera particularmente preferida al menos un 0,05 % y de manera especialmente preferida al menos un 0,1 % de hialuronano. Preferentemente, las composiciones de acuerdo con la invención comprenden, como máximo, un 5 %, con preferencia, como máximo, un 2 %, de manera particularmente preferida, como máximo, un 1 % y de manera especialmente preferida al menos un 0,5 % de hialuronano.

Como ya se ha mencionado anteriormente, las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, el material de propagación de acuerdo con la invención, las partes de plantas cosechables de acuerdo con la invención, las partes de plantas procesables de acuerdo con la invención, las partes de plantas consumibles de acuerdo con la invención o las plantas que se pueden obtener mediante un procedimiento de acuerdo con la invención se pueden usar para preparar un producto alimenticio o pienso. Sin embargo, el uso como materias primas para las aplicaciones industriales también es posible, sin la necesidad de aislar el hialuronano. Así pues, por ejemplo, las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o las partes de plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención se pueden aplicar a superficies bajo cultivo agrícola para lograr una mayor unión del agua del suelo. Además, las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención se pueden usar para la preparación de agentes de secado (por ejemplo, para su uso en el envío de artículos sensibles a la humedad) o como absorbentes de líquidos (por ejemplo, en pañales o para absorber líquidos acuosos derramados). Para dichas aplicaciones, es posible usar plantas modificadas genéticamente enteras de acuerdo con la invención, partes de plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención trituradas (por ejemplo, molidas) o partes de plantas de acuerdo con la invención, según sea necesario. Son particularmente adecuadas para las aplicaciones en las que se usan plantas o partes de plantas molidas las partes

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de plantas que contienen hialuronano, pero solo una baja proporción de agua. Se trata preferentemente de granos de plantas de cereales (maíz, arroz, trigo, centeno, avena, cebada, sagú o sorgo). Dado que las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención y las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención tienen un contenido de hialuronano más elevado que las plantas transgénicas descritas en la literatura, en comparación con estas, se tiene que usar menos material para las aplicaciones industriales cuando se hace uso de las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención.

La presente invención también proporciona procedimientos de preparación de una composición de acuerdo con la invención, donde se usan las células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, las plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, el material de propagación de acuerdo con la invención, las partes de plantas cosechables de acuerdo con la invención, las partes de plantas procesables de acuerdo con la invención, las partes consumibles de plantas de acuerdo con la invención o las plantas que se pueden obtener mediante un procedimiento de acuerdo con la invención de producción de una planta que sintetiza hialuronano. Los procedimientos de preparación de una composición de acuerdo con la invención son preferentemente los procedimientos de preparación de productos alimenticios o piensos, procedimientos de preparación de un producto farmacéutico o procedimientos de preparación de un producto cosmético.

Los procedimientos de preparación de un producto alimenticio o pienso son conocidos por el experto en la materia. Los procedimientos de uso de plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o partes de plantas de acuerdo con la invención en superficies industriales también son conocidos por el experto en la materia e incluyen, entre otros, trituración o molienda de plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención o partes de plantas de acuerdo con la invención. Sin embargo, no se limitan exclusivamente a los mismos. Algunas de las ventajas resultantes del uso de las materias objeto de acuerdo con la invención para la preparación de alimentos/piensos o para su uso en superficies industriales ya se han descrito anteriormente.

Un procedimiento de acuerdo con la invención de preparación de una composición es de manera particularmente preferida un procedimiento de preparación de una composición que comprende hialuronano.

La presente invención proporciona igualmente composiciones que se pueden obtener mediante un procedimiento de preparación de una composición de acuerdo con la invención.

La presente invención también se refiere al uso de células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, material de propagación de acuerdo con la invención, partes de plantas cosechables de acuerdo con la invención, partes de plantas procesables de acuerdo con la invención, partes de plantas consumibles de acuerdo con la invención o plantas que se pueden obtener mediante un procedimiento de acuerdo con la invención de producción de una planta que sintetiza hialuronano para la preparación de una composición de acuerdo con la invención. Se da preferencia al uso de células vegetales modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, plantas modificadas genéticamente de acuerdo con la invención, material de propagación de acuerdo con la invención, partes de plantas cosechables de acuerdo con la invención, partes de plantas procesables de acuerdo con la invención, partes de plantas consumibles de acuerdo con la invención o plantas que se pueden obtener mediante un procedimiento de acuerdo con la invención de producción de una planta que sintetiza hialuronano para la preparación de alimento o pienso, para la preparación de un producto farmacéutico o para la preparación de un producto cosmético.

Descripción de las secuencias

SEC ID Nº 1: Secuencia de ácido nucleico que codifica una hialuronano sintasa del Virus 1 de Paramecium bursaria de Chlorella.

SEC ID Nº 2: Secuencia de ácido nucleico de una hialuronano sintasa del Virus 1 de Paramecium bursaria de Chlorella. La secuencia de aminoácidos mostrada se puede derivar de SEC ID Nº 1.

SEC ID Nº 3: Secuencia de ácido nucleico sintética que codifica una hialuronano sintasa del Virus 1 de Paramecium bursaria de Chlorella. La síntesis de los codones de la secuencia mostrada se llevó a cabo de manera que se adaptara al uso de los codones en las células vegetales. La secuencia de ácido nucleico mostrada codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2.

SEC ID Nº 4: Secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene la actividad de una GFAT1 del ratón.

SEC ID Nº 5: Secuencia de aminoácidos de una proteína que tiene la actividad de una GFAT-1 del ratón. La secuencia de aminoácidos mostrada se puede derivar de SEC ID Nº 4.

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hialuronano presente en los respectivos extractos vegetales, con la ayuda de la curva de calibración mostrada en el Ejemplo 12a) y en la Fig. 1. En este caso, se usó el sobrenadante obtenido tras la centrifugación en una dilución de

1:10 para la determinación del contenido de hialuronano. Se obtuvieron los siguientes resultados para las plantas seleccionadas:

5 Tabla 3: Cantidad de hialuronano (“HA” en g de hialuronano por gramo de peso fresco) producida por plantas transgénicas independientes de la línea 433 ES. La columna 1 se refiere a la planta de la que se recogió el material de tubérculo o de hoja (en el presente documento, "de tipo natural" se refiere a las plantas no transformadas y ES 365 74 se refiere a las plantas que se han usado como material de partida para la transformación con el plásmido c 399-300). Las columnas 2 y 3 se refieren a la cantidad de hialuronano detectada en las hojas o los tubérculos,

10 respectivamente.

Nombre de la planta

Cantidad de HA de las hojas [g/g FG] Cantidad de HA de los tubérculos [g/g FG]

433ES 1

111,84 126,70

433ES 3

303,34 203,16

433ES 4

3142,41

433ES 5

312,98 825,96

433ES 7

1492,94

433ES 8

914,03

433ES 9

1858,68

433ES 10

357,90

433ES 11

5962,82

433ES 12

662,99 662,99

433ES 13

626,52 624,33

433ES 14

665,23

433ES 15

601,36

433ES 16

3416,94

433ES 18

781,02

433ES 19

3294,09

433ES 20

1348,85 975,18

433ES 21

937,92

433ES 22

1086,45

433ES 23

1327,28

433ES 24

340,80 76,00

433ES 25

1529,95

433ES 26

375,53

433ES 27

425,65

433ES 28

1850,99 294,98

433ES 30

2512,40

433ES 31

3337,54

433ES 32

1583,60

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(continuación)

Nombre de la planta

Cantidad de HA de las hojas [g/g FG] Cantidad de HA de los tubérculos [g/g FG]

433ES 34

3552,44

433ES 35

5419,43

433ES 36

902,01

433ES 37

829,35

433ES 38

1536,55

Tipo natural 1

0,40 n.d.

Tipo natural 2

0,34 n.d.

Tipo natural 3

n.d.

365 ES 74-1

265,1

365 ES 74-2

91,84

365 ES 74-3

193,5

365 ES 74-4

175,48

365 ES 74-5

73,9

365 ES 74-6

168,68

365 ES 74-7

67,58

365 ES 74-8

121,89 121,89

365 ES 74-9

62,23

365 ES 74-10

275,24

365 ES 74-11

134,56

14. Transformación de plantas de arroz

a) con vectores de expresión vegetales que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronano 5 sintasa del Virus 1 de Paramecium bursaria de Chlorella

Se transformaron plantas de arroz (variedad cultivada M202) con el vector de expresión vegetal pBA16, que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de hialuronano sintasa del Virus 1 de Paramecium bursaria de Chlorella bajo el control del promotor del gen globulina de Oryza sativa (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39 (8), 885-889), usando el procedimiento descrito en el punto 6 del apartado de Procedimientos

10 generales. Las plantas de arroz transgénicas obtenidas que habían sido transformadas con el plásmido pBA16 se conocen como Os-pBA16.

b) con vectores de expresión vegetales que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína que tiene la actividad de una GFAT-2 de ratón

Se transformaron plantas de arroz (variedad cultivada M202) con el vector de expresión vegetal IC 386-299, que

15 contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene la actividad de una GFAT-2 de ratón bajo el control del promotor de los polipéptidos de prolamina de 13 kDa de Oryza sativa, usando el procedimiento dado en el punto 6 del apartado de Procedimientos generales. Las plantas de arroz transgénicas obtenidas que habían sido transformadas con el plásmido pBA16 se conocen como GAOS0788.

15. Análisis de las plantas de arroz de la línea Os-pBA16

20 a) semillas de arroz inmaduras

Se recogieron semillas de arroz inmaduras (de 5 a 10 días tras la polinización) producidas por plantas individuales de la línea OS-pBA16, cultivadas en el suelo del invernadero, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a

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-80 ºC. Se seleccionaron aleatoriamente granos congelados de cada planta, se exprimió el endospermo, se combinaron, se pesaron y se congelaron de nuevo en nitrógeno líquido. Se deshizo la muestra con un molino de bolas (Modelo MM200, Firma Retsch, Alemania), se añadieron 100 l de agua, se mezcló el material homogeneizado, se centrifugó (13.000 xg, 5 min) y se determinó la concentración de hialuronano de cada muestra

5 de acuerdo con el procedimiento descrito en el punto 4 del apartado de Procedimientos generales.

De las 37 de combinaciones de semillas, comprendiendo cada una 3 semillas inmaduras de plantas independientes de la línea OS-pBA16, más del 70 % resultaron sintetizar una cantidad significativa de hialuronano (al menos 0,1 g de hialuronano por g de peso fresco) en las semillas. La cantidad de hialuronano de las mezclas de semillas preparadas a partir de plantas de arroz independientes varió entre 0,1 y 15,7 g de hialuronano por gramo de peso

10 fresco. En la siguiente tabla, se muestran los resultados de cada una de las combinaciones de semillas preparadas a partir de plantas independientes:

Tabla 4: Detección de hialuronano en combinaciones de semillas, cada una preparada a partir de plantas independientes de la línea transgénica OS-pBA16.

Material vegetal

Hialuronano basado en el peso fresco del material vegetal [g/g]

OS-pBA16 0612-00102

7,30

OS-pBA16 0612-00102

0,54

OS-pBA16 0612-00201

12,16

OS-pBA16 0612-00401

1,12

OS-pBA16 0612-00402

7,28

OS-pBA16 0612-00502

0,08

OS-pBA16 0612-00601

0,37

OS-pBA16 0612-00701

0,66

OS-pBA16 0612-00702

0,03

OS-pBA16 0612-00801

2,48

OS-pBA16 0612-00802

3,84

OS-pBA16 0612-00902

0,02

OS-pBA16 0612-01001

0,02

OS-pBA16 0612-01201

1,71

OS-pBA16 0612-01202

0,11

OS-pBA16 0612-01301

5,84

OS-pBA16 0612-01401

0,25

OS-pBA16 0612-01402

0,11

OS-pBA16 0612-01501

0,16

OS-pBA16 0612-01601

1,12

Tipo natural 1

0,01

Tipo natural 2

0,02

Tipo natural 3

0,02

OS-pBA16 0613-00101

4,43

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(continuación)

Material vegetal

Hialuronano basado en el peso fresco del material vegetal [g/g]

OS-pBA16 0613-00102

1,95

OS-pBA16 0613-00301

0,25

OS-pBA16 0613-00401

15,72

OS-pBA16 0613-00402

0,38

OS-pBA16 0613-00502

0,87

OS-pBA16 0613-00601

0,02

OS-pBA16 0613-00602

0,01

OS-pBA16 0613-00701

0,23

OS-pBA16 0613-00702

0,80

OS-pBA16 0613-00801

1,72

OS-pBA16 0613-00802

0,15

OS-pBA16 0613-00902

0,02

OS-pBA16 0613-01001

0,02

OS-pBA16 0613-01002

0,01

OS-pBA16 0613-01102

0,24

OS-pBA16 0613-01202

9,48

OS-pBA16 0613-01301

13,44

OS-pBA16 0613-01302

9,79

OS-pBA16 0613-01501

0,63

OS-pBA16 0613-01502

6,78

b) Harina de arroz

Se recogieron 20-25 semillas maduras de cada planta transformada. Se retiraron las cáscaras con un

5 descascarillador (Laboratory Paddy sheller, Grainman, Miami, Florida, EE.UU.) y se molió el grano de arroz integral con un molino de laboratorio (Cyclotec, molino de muestras, Foss, Dinamarca). A aproximadamente 40 mg de la harina de arroz obtenida de las semillas combinadas de cada planta independiente, se añadió 1 ml de agua, se mezcló la muestra, se centrifugó (13.000 xg, 5 min) y se determinó la concentración de hialuronano del sobrenadante de cada muestra de acuerdo con el procedimiento descrito en el punto 4 del apartado de

10 Procedimientos generales. En la siguiente tabla, se muestran los resultados para las muestras de harina seleccionadas preparadas a partir de plantas independientes:

Tabla 5: Detección de hialuronano de las muestras de harina de arroz, preparadas a partir de semillas de cada planta independiente de la línea transgénica OS-pBA16. La detección se llevó a cabo usando el procedimiento descrito en el punto 4 del apartado de Procedimientos generales.

Material vegetal

Hialuronano basado en el peso del material vegetal [g/g]

OS-pBA16 0612-00101

2,03

OS-pBA16 0612-00102

1,19

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(continuación)

Material vegetal

Hialuronano basado en el peso del material vegetal [g/g]

OS-pBA16 0612-00201

1,94

OS-pBA16 0612-00402

4,24

OS-pBA16 0612-00502

1,19

OS-pBA16 0612-00601

1,64

OS-pBA16 0612-00602

2,51

OS-pBA16 0612-00701

0,87

OS-pBA16 0612-00702

1,04

OS-pBA16 0612-00801

3,61

OS-pBA16 0612-00802

3,88

OS-pBA16 0612-00902

1,02

OS-pBA16 0612-01001

0,58

OS-pBA16 0612-01201

4,86

OS-pBA16 0612-01202

2,96

OS-pBA16 0612-01301

11,30

OS-pBA16 0612-01401

1,64

OS-pBA16 0612-01402

1,50

OS-pBA16 0612-01501

4,54

OS-pBA16 0612-01601

1,90

OS-pBA16 0613-00101

3,46

OS-pBA16 0613-00102

3,94

OS-pBA16 0613-00301

3,32

OS-pBA16 0613-00401

5,21

OS-pBA16 0613-00402

3,45

OS-pBA16 0613-00502

5,20

OS-pBA16 0613-00601

0,83

OS-pBA16 0613-00602

0,77

OS-pBA16 0613-00701

2,63

OS-pBA16 0613-00702

3,77

OS-pBA16 0613-00801

1,55

OS-pBA16 0613-00802

2,81

OS-pBA16 0613-00902

2,65

OS-pBA16 0613-01001

1,06

OS-pBA16 0613-01002

0,59

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2