CN101283098A

CN101283098A - 具有提高的氨基糖含量的植物

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Publication number: CN101283098A
Application number: CNA2006800369861A
Authority: CN
Inventors: C·弗罗贝格; B·埃西格曼
Original assignee: Bayer CropScience AG
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2005-10-05
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2008-10-08
Anticipated expiration: 2026-10-05
Also published as: CN101273135A; ES2536925T3; DK1951878T3; CN101273135B; PT1951878E; CN101283098B; ZA200802625B; BRPI0616845A2; BRPI0616845A8; AR057535A1; HUE025455T2; ZA200803972B

Abstract

本发明涉及具有提高的N－乙酰化的葡糖胺衍生物含量的植物细胞和植物。另外，本发明涉及合成糖胺聚糖的植物细胞和植物。本发明还提供了用于生产所述植物的方法和包含所述植物细胞的组合物。

Description

具有提高的氨基糖含量的植物

本发明涉及具有提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量的植物细胞和植物。另外，本发明涉及合成糖胺聚糖(glucosaminoglycan)的植物细胞和植物。本发明还提供了用于生产所述植物的方法和包含所述植物细胞的组合物。

氨基糖葡糖胺、葡糖胺衍生物和包含葡糖胺衍生物的聚合物特别可以作为食品增补剂用于预防动物和人的关节疾病。在医学领域，一些含葡糖胺衍生物的聚合物也被用于治疗疾病。

WO 06032538描述了已用编码乙酰透明质酸(hyaluronan)合酶的核酸分子转化的转基因植物。所述植物中乙酰透明质酸的合成能被明确证明。

WO 9835047(US 6,444,878)描述了在植物细胞中用于合成GlcNAc的代谢途径，其中葡糖胺通过多个连续的酶催化反应步骤，随着代谢物GlcNAc、N-乙酰葡糖胺6-磷酸、N-乙酰葡糖胺1-磷酸的形成而被转化为UDP-GlcNAc。作为植物中的替代途径而描述的一个代谢途径包括果糖6-磷酸和谷氨酰胺转化为葡糖胺6-磷酸，随后所述葡糖胺6-磷酸通过多个连续的酶催化反应步骤被转化为UDP-GlcNAc，其间伴随着代谢物葡糖胺1-磷酸和N-乙酰葡糖胺1-磷酸的形成。果糖6-磷酸和谷氨酰胺向葡糖胺6-磷酸的转化由具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性的蛋白质催化(Mayer等，1968，Plant Physiol.43，1097-1107)。相对高浓度的葡糖胺6-磷酸对植物细胞是有毒的(WO 9835047)。

WO 0011192描述了来自玉米的核酸分子(其编码具有植物GFAT酶活性的蛋白质)在转基因玉米植物中的胚乳特异性过表达，目的在于在植物中合成具有2-氨基葡糖酐(2-amidoanhydroglucose)分子的阳离子淀粉。根据WO 0011192的描述将导致2-氨基葡糖酐(2-aminoanhydroglucose)掺进淀粉中的代谢途径，特别包括通过淀粉和/或糖原合酶将UDP-葡糖胺掺进淀粉中。可以证明在所述过表达核酸分子(编码具有植物GFAT酶活性的蛋白质，所述蛋白质与质体信号肽在翻译水平融合)的转基因玉米植物胚乳的面粉中提高的UDP-葡糖胺量。当具有GFAT酶活性的蛋白质以不具有信号肽的形式表达时，可以证明来自玉米胚乳组织的相应面粉中提高的葡糖胺1-磷酸量。在该转基因植物中不能检测到阳离子淀粉或提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物(例如UDP-GlcNAc或N-乙酰葡糖胺6-磷酸)量。

氨基糖β-D-葡糖胺(葡糖胺)和/或葡糖胺的衍生物是多种聚合物(糖胺聚糖)的成分，所述聚合物特别地是节肢动物外骨骼、哺乳动物细胞外基质或一些细菌微生物外泌多糖的主要成分。因此，例如N-乙酰基-D-葡糖-2-胺(N-乙酰葡糖胺，GlcNAc)是在氮原子上乙酰化的葡糖胺衍生物。GlcNAc为例如乙酰透明质酸(β-1，4-[葡糖醛酸β-1，3-GlcNAc]_n)的分子构件(building block)，乙酰透明质酸为滑液的主要成分。

在医学领域，含乙酰透明质酸的产品目前被用于关节内治疗关节病和用作眼科手术的眼药。衍生的交联乙酰透明质酸被用于治疗关节疾病(FongChong等，2005，Appl Microbiol Biotechnol 66，341-351)。另外，乙酰透明质酸是用于湿润干燥粘膜的一些鼻科用药(rhinologics)的成分，所述鼻科用药为例如滴眼剂和nasalia的形式。注射用的含乙酰透明质酸的溶液被用作镇痛药和抗风湿药。包含乙酰透明质酸或衍生的乙酰透明质酸的贴剂(patch)被用于伤口愈合。对皮肤学而言，含有乙酰透明质酸的凝胶埋植剂被用于在整形手术(plastic surgery)中纠正皮肤变形。在整容手术中，乙酰透明质酸制剂属于合适的皮肤填充材料。通过在有限的时间段中注射乙酰透明质酸，可以抚平皱纹或增加嘴唇的厚度。

在化妆品中，特别是在皮肤的霜剂和洗剂中，乙酰透明质酸常常因为其结合水的高能力被用作湿润剂。另外，含有乙酰透明质酸的制剂可以作为预防和减轻关节病的所谓营养药(食品增补剂)出售，其也可用于动物(例如犬、马)。

乙酰透明质酸的合成由单个膜缔合性的或膜结合性的酶催化，所述酶即为乙酰透明质酸合酶(DeAngelis，1999，CMLS，Cellular and MolecularLife Sciences 56，670-682)。乙酰透明质酸合酶催化从底物UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)和UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成乙酰透明质酸。

用于商业目的的乙酰透明质酸目前从动物组织(雄鸡冠)中分离或使用细菌培养物发酵制备。

一种糖蛋白——蛋白聚糖特别地是软骨的主要成分，其具有附着在核心蛋白质上由重复的二糖单位组成的糖胺聚糖。这些重复二糖单位通过特征性的碳水化合物结合序列共价结合在核心蛋白质上。根据二糖单位的组成，特别可以区分出糖胺聚糖硫酸乙酰肝素/肝素、硫酸角质素和硫酸软骨素/皮肤素，它们的二糖单位均含有葡糖胺或葡糖胺衍生物分子。在这些物质中，硫酸基团在二糖单位的各种原子或取代基上引入，使得提到的各物质不是均一的聚合物，而是概括在各总称(generic term)下的一组聚合物。在这里，所述聚合物群体的个体分子之间可以在硫酸化程度及含有硫酸基团的单体的位置上均不同。

软骨素/皮肤素的二糖链([β-1，4]-[葡糖醛酸β-1，4-N-乙酰半乳糖胺]_n)由软骨素合酶催化从UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的差向异构体UDP-N-乙酰半乳糖胺开始合成(Kitagawa等，2001，J Biol Chem 276(42)，38721-38726)。软骨素的葡糖醛酸分子可以被差向异构酶转化为艾杜糖醛酸。如果多于10％的葡糖醛酸分子以艾杜糖醛酸形式存在，则聚合物被称作皮肤素。然后由其他酶催化在软骨素或皮肤素的二糖链的不同位置中引入硫酸基团，得到硫酸软骨素/皮肤素。此处，分子与分子之间硫酸化的程度可有差异。

一段时间以来，硫酸软骨素被认为是治疗骨关节炎的潜在活性化合物(Clegg等，2006，The New England Journal of Medicine 354(8)，795-808)。

肝素/乙酰肝素(heparosan)的二糖链([α-1，4]-[葡糖醛酸β-1，4-葡糖胺]_n或[α-1，4]-[艾杜糖醛酸α-1，4-葡糖胺]_n)由肝素/heparosan合酶从UDP-GlcA和UDP-GlcNAc催化合成(DeAngelis und White，2004，J.Bacteriology 186(24)，8529-8532)。肝素/heparosan的葡糖醛酸分子可以由差向异构酶转化为艾杜糖醛酸。然后由其他酶催化在heparosan二糖链的不同位置中引入硫酸基团，得到硫酸肝素或硫酸乙酰肝素。比起硫酸乙酰肝素，硫酸肝素具有高相当多的硫酸基团取代。硫酸肝素具有约90％的艾杜糖醛酸分子，而在硫酸乙酰肝素的情况下，葡糖醛酸分子的比例占据优势(Gallagher等，1992，Int.J.Biochem 24，553-560)。与硫酸软骨素/皮肤素的情况一样，在硫酸肝素/乙酰肝素的情况下，分子与分子之间硫酸化的程度也可有差异。

硫酸肝素尤其可以用作抗凝剂，例如用于血栓形成的预防和治疗。

硫酸软骨素/皮肤素和硫酸肝素/乙酰肝素目前通过从动物组织中分离而生产。硫酸软骨素主要从牛或鲨鱼软骨中分离，硫酸肝素/乙酰肝素从猪肠或牛肺中分离。由于硫酸软骨素/皮肤素或硫酸肝素/乙酰肝素的二糖链不具有均一的硫酸化模式，所以难于获得均一的特异产物。因此，产物总是具有不同硫酸化程度的分子的混合物。

糖胺聚糖壳多糖(chitin)([β-1，4-GlcNAc]_n)是真菌细胞壁和昆虫、千足虫、蜘蛛和甲壳类动物外骨骼的主要成分之一，并是不溶于水的聚合物。壳多糖合酶通过连接UDP-GlcNAc催化壳多糖的合成(Merzendorfer andZimoch，2003，J.Experimental Biology 206，4393-4412)。

作为用于分离壳多糖的原料来源，迄今为止主要使用甲壳动物(虾、蟹)和真菌，例如曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)的种。例如，WO 03031435描述了通过发酵酵母制备GlcNAc的方法。根据从所述原料来源中分离壳多糖的方法，壳多糖除了含有GlcNAc外还含有其脱乙酰化形式，即，葡糖胺，作为构件。如果多于50％的构件是GlcNAc，则聚合物被称作壳多糖，而包含多于50％的葡糖胺的聚合物被称作壳聚糖(chitosan)。

目前，葡糖胺或其衍生物(例如GlcNAc)通过降解壳多糖生产。壳多糖可首先被脱乙酰化，导致壳聚糖形成，或直接降解导致GlcNAc形成。

可以借助于壳多糖脱乙酰酶(Kafetzopoulos等，1993，Pro.Natl.Acad.Sci.90，2564-2568)用酶学方法或通过化学脱乙酰化作用将壳多糖脱乙酰化。

也可以用酶(例如使用壳多糖酶、葡聚糖酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶)和通过化学水解进行壳多糖或壳聚糖的降解。

壳聚糖的降解或GlcNAc的脱乙酰化导致葡糖胺的形成。

通过降解壳多糖制备氨基糖的所有方法的一个实质性缺点在于下述事实：由于不完全水解和/或不完全的脱乙酰化，获得的不是均一产物，而是多种单体和寡聚体的混合物。

借助于重组微生物(特别是大肠杆菌(Escherichia coli))制备葡糖胺的备选方法描述于US 2002/0160459，其不需要降解壳多糖。

一段时间以来，葡糖胺和含葡糖胺的物质也被认为是治疗骨关节炎的潜在活性化合物(Clegg等，2006，The New England Journal of Medicine354(8)，795-808)。葡糖胺或含葡糖胺的物质也存在于许多食品增补剂中。富含GlcNAc的食品描述于例如US 2006/0003965中。

如前文所述，糖胺聚糖(例如硫酸软骨素、硫酸肝素/乙酰肝素或壳多糖)目前从动物组织中分离。除了在每种情况下所期望的物质外，这些组织还含有其他糖胺聚糖。单种糖胺聚糖的分离，就算可以完全分离，也是困难和复杂的。另外，可在人中引发疾病的致病微生物和/或其他物质(例如BSE病原体或禽流感病原体)在动物组织中的可能存在，也成为使用从动物组织中分离的糖胺聚糖时的一个问题。应用被动物蛋白质污染的药物制品可在患者中导致不期望的身体免疫反应(对于乙酰透明质酸制品，参阅例如US 4,141,973)，特别是如果患者对动物蛋白质过敏的话。

从动物组织分离糖胺聚糖的另一个问题在于下述事实：糖胺聚糖的分子量常常在纯化过程中被降低，这是因为动物组织还含有降解糖胺聚糖的酶。

从甲壳类动物中分离的葡糖胺或其衍生物常常含有可以在人中触发变应性反应的物质(蛋白质)。得自真菌的葡糖胺或其衍生物可含有真菌毒素。

能够以令人满意的品质和纯度从动物组织中获得的糖胺聚糖的量(产率)是低的(例如来自雄鸡冠的乙酰透明质酸：0.079％w/w，EP 0144019，US4,782,046)，这意味着不得不加工大量的动物组织。

借助于细菌发酵的糖胺聚糖生产伴随着高成本，因为细菌必须在密封的无菌容器中、在复杂的受控培养条件下发酵(对于乙酰透明质酸，参阅例如US 4,897,349)。另外，可通过发酵细菌菌株生产的糖胺聚糖的量受到现有生产设施的限制。此处，也考虑到由于物理限制，不可能建造用于相对大培养体积的发酵罐。在此，特别可提到的是有效生产所需的进料物质(例如用于细菌的必需营养源、用于调节pH的试剂、氧气)与培养基的均匀混合，该混合就算能够保证，也只能在大发酵罐中以高技术支出才能确保。

另外，从动物原材料制备的物质对于某些生活方式，例如素食主义或对于符合犹太教规的食品制备是不可接受的。

植物并不天然地生产糖胺聚糖，例如乙酰透明质酸、壳多糖、硫酸乙酰肝素/肝素、硫酸角质素或硫酸软骨素/皮肤素。

对糖胺聚糖的合成而言，尤其必须的是能够获得足够量的乙酰化葡糖胺衍生物(特别是UDP-GlcNAc)和/或UDP-GlcA作为合成中涉及的各种酶的底物。没有关于植物细胞中存在的N-乙酰化葡糖胺的量的信息。WO2005035710描述了通过干燥允许植物材料的葡糖胺含量提高的方法。对于菊苣而言，新鲜的湿植物材料中的最高葡糖胺含量经测定为每1kg鲜重10mg葡糖胺，其按葡糖胺178的分子量计相应于每1克植物材料鲜重约56nmol的葡糖胺。WO 2005035710不含有有关植物中N-乙酰化葡糖胺衍生物含量的信息。

另外，根据上文所述的现有技术，显而易见的是植物中葡糖胺代谢的途径尚未完全阐明。在WO 0011192中，可以通过用编码具有植物GFAT活性的蛋白质的核酸分子转化，产生具有提高的葡糖胺衍生物(UDP-葡糖胺或葡糖胺1-磷酸)含量的植物；然而，未发现提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

因此，本发明的一个目的是提供N-乙酰化的葡糖胺衍生物的备选来源，和制备所述N-乙酰化葡糖胺衍生物的备选来源的方法。

本发明的第一方面涉及植物细胞或植物，其具有至少每克鲜重2.50μmol，优选至少每克鲜重5.00μmol，特别优选至少每克鲜重10.00μmol，非常特别优选至少每克鲜重15.00μmol，尤其优选至少每克鲜重20.00μmol的N-乙酰化葡糖胺衍生物含量。优选本发明的植物细胞或本发明的植物具有至多每克鲜重250μmol，

优选至多每克鲜重200μmol，特别优选至多每克鲜重150μmol，非常特别优选至多每克鲜重100μmol，尤其优选至多每克鲜重50μmol的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

与现有技术相比，本发明的植物细胞或本发明的植物提供下述优点：它们含有更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。与通过发酵微生物生产N-乙酰化葡糖胺衍生物或从动物原材料来源或真菌中分离N-乙酰化葡糖胺相比，本发明的植物细胞或本发明的植物提供下述优点：本发明的植物细胞和本发明的植物能够以无性方式或有性方式无限繁殖，且它们连续地生产N-乙酰化的葡糖胺衍生物。另外，与已知的植物相比，本发明的植物提供下述优点：它们更适用于制备糖胺聚糖，例如软骨素、乙酰透明质酸、壳多糖、heparosan，因为它们含有更大量的用于在所述糖胺聚糖的催化合成中所涉及的酶(糖胺聚糖合酶)的底物。

可以使用本领域技术人员已知的方法检测N-乙酰化的葡糖胺衍生物(Morgan and Elson(1934，Biochem J.28(3)，988-995)。在本发明的上下文中，为了测定N-乙酰化的葡糖胺衍生物的含量，优选使用于一般方法之第4条中描述的方法。

在本发明中，术语“N-乙酰化的葡糖胺衍生物”应当理解为表示葡糖胺(2-氨基-2-脱氧葡萄糖)的所有衍生物，其也包括差向异构体，例如半乳糖胺(2-氨基-2-脱氧半乳糖)或甘露糖胺(2-氨基-2-脱氧甘露糖)，它们可以使用于一般方法之第4条中所述的方法测量。该N-乙酰化的葡糖胺衍生物优选为N-乙酰葡糖胺磷酸(N-乙酰葡糖胺1-磷酸和/或N-乙酰葡糖胺6-磷酸)、N-乙酰葡糖胺和/或UDP-N-乙酰葡糖胺。

优选本发明的植物细胞或本发明的植物除了含有提高的N-乙酰化葡糖胺衍生物含量外，还具有提高的葡糖胺磷酸(葡糖胺1-磷酸和/或葡糖胺6-磷酸)含量。

本发明的植物细胞或本发明的植物可以通过例如引入外源核酸分子来制备，所述核酸分子编码具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)同种型II(GFAT-2)活性的蛋白质，或编码具有细菌GFAT活性的蛋白质。

在本发明优选的实施方案中，本发明的植物细胞或本发明的植物因此分别是遗传修饰的植物细胞和遗传修饰的植物。

令人惊奇地发现：含有编码具有GFAT-2活性的蛋白质或具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子的植物细胞或植物，与含有编码具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶同种型I(GFAT-1)活性的蛋白质的核酸分子的植物细胞或植物相比，含有显著更多的N-乙酰化的葡糖胺衍生物。如前文所提到的，在含有编码具有植物GFAT活性的蛋白质的核酸分子的植物中未能检测到提高的乙酰化葡糖胺衍生物含量(WO 0011192)。

因此，本发明也提供了经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物，其含有编码具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性的蛋白质的外源核酸分子，其中所述外源核酸分子编码具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶同种型II(GFAT-2)活性的蛋白质或具有细菌谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(细菌GFAT)活性的蛋白质。

本发明的植物细胞或本发明的植物的遗传修饰可以是适于将外源核酸分子整合进植物细胞或植物中的任何遗传修饰。

优选外源核酸分子被整合进基因组中；特别优选外源核酸分子被稳定地整合进本发明的植物细胞或本发明的植物的基因组中。

可以获得大量技术将核酸分子(稳定)整合进植物宿主细胞中，用于生产本发明的植物细胞或本发明的植物。这些技术包括使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化手段用T-DNA转化植物细胞，原生质体融合、注射、电穿孔DNA，通过生物射弹(biolistic)途径引入DNA和其他可选方案(综述见″Transgenic Plants″，Leandro ed.，Humana Press 2004，ISBN1-59259-827-7)。农杆菌介导的植物细胞转化已进行了深入研究并被详尽地描述于EP 120516和Hoekema，IN：The Binary Plant Vector SystemOffsetdrukkerij Kanters B.V.Alblasserdam(1985)，Chapter V；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.4，1-46和An等EMBO J.4，(1985)，277-287中。马铃薯的转化参阅例如Rocha-Sosa等，EMBO J.8，(1989)，29-33，番茄植物的转化参阅例如US 5,565,347。

以农杆菌转化为基础使用载体转化单子叶植物也已被描述(Chan等，Plant Mol.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等，Plant J.6，(1994)271-282；Deng et al，Science in China 33，(1990)，28-34；Wilmink等，Plant CellReports 11，(1992)，76-80；May等，Bio/Technology 13，(1995)，486-492；Conner and Domisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie et al，Transgenic Res.2，(1993)，252-265)。转化单子叶植物的其他可选体系是使用生物射弹途径转化(Wan and Lemaux，Plant Physiol.104，(1994)，37-48；Vasil等，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等，Plant Mol.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)、原生质体转化、电穿孔被部分透化的细胞，或使用玻璃纤维引入DNA。特别是玉米的转化已几次在文献中被描述(参考例如WO95/06128、EP0513849、EP0465875、EP0292435；Fromm等，Biotechnology 8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等，Plant Cell 2，(1990)，603-618；Koziel等，Biotechnology 11(1993)，194-200；Moroc等，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。其他草类例如柳枝稷(Panicum virgatum)的转化也已被描述(Richards等，2001，Plant Cell Reporters 20，48-54)。

其他谷类物种的成功转化同样地也已被描述，例如针对大麦(Wan andLemaux，同上引文；Ritala等，同上引文；Krens等，Nature 296，(1982)，72-74)和小麦(Nehra等，Plant J.5，(1994)，285-297；Becker等，1994，Plant Journal 5，299-307)。所有上述方法均适用于本发明。

带有外源核酸分子的遗传修饰的植物细胞和遗传修饰的植物可以尤其通过下述事实分别与不带有所述外源核酸分子的野生型植物细胞和野生型植物相区别：它们分别含有不天然地存在于野生型植物细胞和野生型植物中的外源核酸分子。外源核酸分子在植物细胞或植物中的这类整合可以使用本领域技术人员已知的方法检测，例如通过Southern印迹分析或通过PCR。

在本发明中，术语“稳定整合的核酸分子”应当理解为表示核酸分子整合进入植物的基因组中。稳定整合的核酸分子的特征在于：在相应整合位点的复制过程中，其与毗接整合位点的宿主核酸序列一起扩增，由此在复制的子代DNA链中整合位点被与作为复制模板的母阅读链上相同的核酸序列包围。

核酸分子在植物细胞或植物的基因组中的整合可以通过遗传方法和/或分子生物学方法证明。核酸分子进入植物细胞基因组或进入植物基因组的稳定整合的特征在于：在遗传了所述核酸分子的后代中，稳定整合的核酸分子存在于与其在亲代中相同的基因组环境中。植物细胞基因组或植物基因组中核酸序列的稳定整合的存在可以使用本领域技术人员已知的方法证明，特别是Southern印迹分析或RFLP分析(限制性片段长度多态性)(Nam等，1989，The Plant Cell 1，699-705；Leister and Dean，1993，ThePlant Journal 4(4)，745-750)，基于PCR的方法，例如扩增片段的长度差异分析(扩增片段长度多态性，AFLP)(Castiglioni等，1998，Genetics 149，2039-2056；Meksem等，2001，Molecular Genetics and Genomics 265，207-214；Meyer等，1998，Molecular and General Genetics 259，150-160)或用限制性内切酶切割扩增的片段(切割的扩增多态序列，CAPS)(Koniecznyand Ausubel，1993，The Plant Journal 4，403-410；Jarvis等，1994，PlantMolecular Biology 24，685-687；Bachem等，1996，The Plant Journal 9(5)，745-753)。

在本发明中，术语“基因组”应当理解为表示存在于植物细胞中的全部遗传物质。本领域技术人员已知除了细胞核以外，其他区室(例如质体、线粒体)也含有遗传物质。

本发明的另一优选主题涉及本发明的遗传修饰的植物细胞或本发明的遗传修饰的植物，其表达外源核酸分子，所述核酸分子编码具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶同种型II(GFAT-2)活性的蛋白质，或编码具有细菌谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(细菌GFAT)活性的蛋白质。

在本发明中，术语“表达”应当理解为表示存在由外源核酸分子编码的转录物(mRNA)和/或存在具有GFAT-2或细菌GFAT的活性的蛋白质。

表达可以例如通过Northern印迹分析或RT-PCR检测外源核酸分子的特异转录物(mRNA)而证明。

可以例如通过免疫学方法，例如Western印迹分析、ELISA(酶联免疫吸附测定)或RIA(放射性免疫测定)，确定植物细胞或植物是否含有具有GFAT-2活性的蛋白质或具有细菌GFAT活性的蛋白质。本领域技术人员熟知制备可以与某种蛋白质特异反应，即与某种蛋白质特异结合的抗体的方法(参阅例如Lottspeich and Zorbas(eds.)，1998，Bioanalytik，Spektrum akad，Verlag，Heidelberg，Berlin，ISBN 3-8274-0041-4)。一些公司(例如Eurogentec，Belgium)提供这类抗体的制备作为定单服务。

在本发明另一优选的实施方案中，本发明的植物细胞或本发明的植物具有蛋白质，即具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶同种型II(GFAT-2)的活性的蛋白质，的活性，或具有编码蛋白质，即，具有细菌谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(细菌GFAT)的活性的蛋白质，的活性。

具有GFAT-2活性的蛋白质或具有细菌GFAT活性的蛋白质在本发明的植物细胞或本发明的植物的提取物中的活性可以使用本领域技术人员已知的方法检测，例如描述于Samac等(2004，Applied Biochemistry andBiotechnology 113-116，Humana Press，Editor Ashok Mulehandani，1167-1182，ISSN 0273-2289)中的方法。用于检测具有GFAT活性的蛋白质的活性量的一个优选方法在一般方法之第8条中给出。

在本发明中，术语“谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)”(E.C.2.6.1.16)(其在专业文献中也称作葡糖胺合酶)应当理解为指从起始材料谷氨酰胺和果糖6-磷酸(Fruc-6-P)合成葡糖胺6-磷酸(GlcN-6-P)的蛋白质。该催化根据以下反应式进行：

谷氨酰胺+Fruc-6-P→GlcN-6-P+谷氨酸

在本发明中，术语“谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)”作为一个上位术语使用，其包括所有已知的同种型。

Milewski(2002，Biochimica et Biophysica Acta 1597，173-193)的综述文章描述了具有GFAT活性的蛋白质的结构特征。所有已知具有GFAT活性的蛋白质的氨基酸序列都含有具有保守氨基酸序列的区域。具有GFAT活性的蛋白质的氨基酸序列具有N-端谷氨酰胺结合结构域和C-端果糖6-磷酸结合结构域，它们被一段40到90个非保守氨基酸的序列分开。两个结构域即便它们存在于不同的氨基酸分子上也均有活性。片段(其包含来自大肠杆菌的具有GFAT活性的蛋白质的N-端谷氨酰胺结合结构域)的晶体结构分析显示，该结构域的活性中心位于N-末端，且氨基酸Cys1参与谷氨酰胺的水解。氨基酸Arg73和Asp123与谷氨酰胺的羧基和氨基基团相互作用。该相互作用得到氨基酸Thr76和His77的支持。氨基酸Gly99和Trp74与谷氨酰胺的酰胺基团形成氢键。氨基酸Asn98和Gly99稳定了活性中心的四个面的口袋(four-faced pocket)。氨基酸25到29和73-80形成柔性环，其在底物谷氨酰胺发生结合后通过蛋白质的构象改变而有助于由具有GFAT活性的蛋白质催化的反应。来自大肠杆菌的具有GFAT活性的蛋白质的C-端果糖6-磷酸结合结构域的晶体结构分析显示：该结构域由两个拓扑学相同的域(氨基酸241到424和425到592)及之后以不规则环形式存在于C-端末端的域(氨基酸593到608)组成，但是其仅有一个活性中心。氨基酸Ser303、Ser347、Gln348、Ser349和Thr352涉及底物结合，而氨基酸Glu488、His504和Lys603直接参与具有GFAT活性的蛋白质的催化反应。

特别是在动物生物中，可以证明具有GFAT活性的蛋白质的两种不同的同种型(文献中分别称作GFAT-1和GFAT-2)。Hu等(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)描述了具有GFAT活性的蛋白质的不同同种型的差异。除了具有GFAT-1和GFAT-2活性的所述同种型之间的组织特异性表达差异外，可以证实两种同种型均通过cAMP-依赖型蛋白激酶的磷酸化作用而调节。具有GFAT-1酶活性的蛋白质的活性受到在所述氨基酸序列的保守丝氨酸残基(在来自小鼠的GFAT-1中丝氨酸205，GenBankAce No.：AF334736.1)上的磷酸化的抑制，而具有GFAT-2活性的蛋白质的活性通过在所述氨基酸序列的保守丝氨酸残基(在来自小鼠的GFAT-2中丝氨酸202，GenBank Ace No.：NM 013529)上的磷酸化而提高。具有GFAT-1活性的蛋白质和具有GFAT-2活性的蛋白质均被UDP-GlcNAc以浓度依赖性的方式抑制；然而，与具有GFAT-1活性的蛋白质(UDP-GlcNAc导致活性分别最大降低约51％或80％)相比，对于具有GFAT-2活性的蛋白质而言，UDP-GlcNAc对其的抑制较低(UDP-GlcNAc导致活性最大降低约15％)。有迹象表明，在动物生物中对具有GFAT-1活性的蛋白质的抑制基于下述事实：在提高的UDP-GlcNAc浓度下，存在所述蛋白质的O-葡萄糖-N-乙酰葡糖胺糖基化。O-糖基化对蛋白质活性的调节是否也存在于植物细胞中尚未完全明了(Huber and Hardin，2004，Current Opinionin Plant Biotechnology 7，318-322)。

具有细菌GFAT活性的蛋白质可以通过它们不被UDP-GlcNAc抑制的事实来辨别(Kornfeld，1967，J.Biol.Chem.242(13)，3135-3141)。具有GFAT-1活性的蛋白质、具有GFAT-2活性的蛋白质，以及甚至具有细菌GFAT活性的蛋白质均被其反应中形成的产物葡糖胺6-磷酸抑制(Broschat等，2002，J.Biol.Chem.277(17)，14764-14770；Deng等，2005，MetabolicEngineering 7，201-214)。

在本发明中，术语“具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶同种型I(GFAT-1)活性的蛋白质”应当理解为指具有GFAT活性且其活性被cAMP-依赖型蛋白激酶引起的磷酸化抑制的蛋白质。

在本发明中，术语“具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶同种型II(GFAT-2)活性的蛋白质”应当理解为指具有GFAT活性且可以被cAMP-依赖型蛋白激酶引起的磷酸化激活的蛋白质。

在本发明中，术语“具有细菌谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(细菌GFAT)活性的蛋白质”应当理解为指具有GFAT活性且其活性不被UDP-GlcNAc抑制的蛋白质。或者，“具有细菌GFAT活性的蛋白质”也可称作“具有非真核生物GFAT的活性的蛋白质”。

在本发明中，术语“外源核酸分子”应当理解为指这类分子，其不天然存在于相应的野生型植物细胞中，或其不天然地以此特异空间排布存在于野生型植物细胞中，或其在野生型植物细胞基因组中位于其天然不存在的位点上。

优选外源核酸分子为由多种元件(核酸分子)组成的重组分子，所述多种元件的组合或特异空间排布不天然存在于植物细胞中。

在本发明中，术语“重组核酸分子”应当理解为指具有多种核酸分子的核酸分子，其中所述多种核酸分子天然不以重组核酸分子中的组合方式存在。因此，重组核酸分子除了具有编码蛋白质的外源核酸分子外，还可具有例如额外的核酸序列，所述额外的核酸序列天然不与所述蛋白质的编码核酸分子组合存在。此处所提到的、与蛋白质的编码核酸分子组合存在于重组的核酸分子中的额外核酸序列可以是任何序列。它们可以例如是基因组序列和/或植物核酸序列。所提到的额外的核酸序列优选为调节序列(启动子、终止信号、增强子、内含子)，特别优选在植物组织中有活性的调节序列，非常特别优选在植物组织中有活性的组织特异性调节序列。

用于产生重组核酸分子的方法为本领域技术人员已知，并可包括遗传工程方法，例如通过连接作用来连接核酸分子、遗传重组或新合成核酸分子(参阅例如Sambrok等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rdedition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.ISBN：0879695773；Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；5th edition(2002)，ISBN：0471250929)。

本发明优选提供本发明的遗传修饰的植物细胞或本发明的遗传修饰的植物，其中外源核酸分子(其编码具有GFAT-2活性的蛋白质或编码具有细菌GFAT活性的蛋白质)与在植物细胞中启始转录的调节元件(启动子)相连。这些可以是同源或异源的启动子。启动子可以是组成型的、组织特异性的或发育特异性的启动子，或受外部因素调节的启动子(例如在应用化学物质后，在非生物因素的作用下，所述非生物因素例如热和/或冷、干旱、疾病等等)。

通常，在植物细胞中有活性的任何启动子都适用于表达外源核酸分子。合适的启动子为例如用于组成型表达的花椰菜花叶病毒35S RNA的启动子或来自玉米的泛素启动子或夜来香树属(Cestrum)YLCV启动子(YellowLeaf Curling病毒；WO 0173087；Stavolone等，2003，Plant Mol.Biol.53，703-713)；用于在马铃薯中块茎特异性表达的patatingen启动子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29)；或用于番茄的果实特异性启动子，例如来自番茄的多聚半乳糖醛酸酶启动子(Montgomery等，1993，Plant Cell 5，1049-1062)或来自番茄的E8启动子(Metha等，2002，NatureBiotechnol.20(6)，613-618)或来自桃子的ACC氧化酶启动子(Moon andCallahan，2004，J.Experimental Botany 55(402)，1519-1528)；或确保仅在光合活性组织中表达的启动子，例如ST-LS1启动子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-2451)；或用于胚乳特异表达的来自小麦的HMWG启动子、USP启动子、菜豆蛋白启动子、来自玉米的玉米醇溶蛋白基因启动子(Pedersen等，Cell 29(1982)，1015-1026；Quatroccio等，Plant Mol.Biol.15(1990)，81-93)、谷蛋白启动子(Leisy等，Plant Mol.Biol.14(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4(1993)，357-366；Yoshihara等，FEBS Lett.383(1996)，213-218)、球蛋白启动子(Nakase等，1996，Gene 170(2)，223-226)、谷醇溶蛋白启动子(Qu and Takaiwa，2004，Plant Biotechnology Journal 2(2)，113-125)或Shrunken-1启动子(Werr等，EMBO J.4(1985)，1373-1380)。然而，也可以使用仅在由外部因素确定的时间点上有活性的启动子(参阅例如WO 9307279)。在此特别有意义的可以是允许简单诱导的热激蛋白启动子。还可以使用种子特异性启动子，例如来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子，其确保在蚕豆和其他植物中的种子特异性表达(Fiedler等，PlantMol.Biol.22(1993)，669-679；Baumlein等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。

感染藻类的病毒基因组中存在的启动子也适用于在植物中表达核酸序列(Mitra等，1994，Biochem.Biophys Res Commun 204(1)，187-194；Mitraand Higgins，1994，Plant MoI Biol 26(1)，85-93，Van Etten等，2002，ArchVirol 147，1479-1516)。

在本发明中术语“组织特异性”应当理解为表示将表现(例如转录起始)实质性地限制到某种组织。

在本发明中，术语“块茎、果实或胚乳细胞”应当理解为分别指块茎、果实和种子胚乳中存在的所有细胞。

在本发明中，术语“同源启动子”应当理解为指天然存在于分别用于制备本发明的遗传修饰的植物细胞和本发明的遗传修饰的植物的植物细胞或植物中的启动子(相对于所述植物细胞或植物而言同源)，或指在编码蛋白质的外源核酸分子所分离自的相应生物中调节基因表达的启动子(相对于待表达的核酸分子而言同源)。

在本发明中，术语“异源启动子”应当理解为指不天然存在于分别用于制备本发明的遗传修饰的植物细胞或本发明的遗传修饰的植物的植物细胞或植物中的启动子(相对于植物细胞或植物异源)，或指在编码蛋白质的外源核酸分子所分离自的相应生物中，不天然存在用于调节所述外源核酸分子的表达的启动子(相对于待表达的核酸分子异源)。

还可以存在终止序列(多聚腺苷酸化信号)，其作用在于向转录物添加多聚-A尾。多聚-A尾被认为具有稳定转录物的作用。这类元件描述于文献(参考Gielen等，EMBO J.8(1989)，23-29)中并可根据期望进行调换。

内含子序列也可以存在于启动子和外源核酸分子的编码区之间。这类内含子序列可以在植物中导致表达的稳定性和提高的表达(Callis等，1987，Genes Devel.1，1183-1200；Luehrsen，and Walbot，1991，Mol.Gen.Genet.225，81-93；Rethmeier等，1997；Plant Journal 12(4)，895-899；Rose andBeliakoff，2000，Plant Physiol.122(2)，535-542；Vasil等，1989，PlantPhysiol.91，1575-1579；XU等，2003，Science in China Series C Vol.46No.6，561-569)。合适的内含子序列为例如来自玉米的sh1基因的第一个内含子、来自玉米的多聚泛素基因1的第一个内含子、来自稻的EPSPS基因的第一个内含子，或来自拟南芥属(Arabidopsis)的PAT1基因的前两个内含子之一。

根据本发明，编码具有GFAT-2酶活性的蛋白质的外源核酸分子可源于任何真核生物；优选所述核酸分子源于动物，特别优选源自哺乳动物，非常特别优选源自小鼠。

根据本发明，编码具有细菌GFAT酶活性的蛋白质的外源核酸分子可以源自任何非真核生物或来自病毒基因组；优选所述核酸分子源于细菌或病毒；特别优选所述核酸分子源于大肠杆菌。因为编码具有GFAT活性的病毒蛋白质的氨基酸序列与编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的氨基酸序列具有显著较高的同一性，并与具有GFAT-1或GFAT-2活性的蛋白质具有显著较低的同一性，所以具有GFAT活性的病毒蛋白质与具有GFAT活性的细菌蛋白质被归为一类(Landstein等，1998，Virology 250，388-396)。

就病毒而言，编码具有GFAT酶活性的蛋白质的外源核酸分子优选源自感染藻类的病毒，优选感染小球藻属(Chlorella)藻类的病毒，特别优选源自绿草履虫小球藻病毒(Paramecium bursaria chlorella virus)，特别优选源自绿草履虫小球藻病毒的H1株。

代替天然存在的、编码具有GFAT-2活性的蛋白质或编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子，也可以通过诱变产生核酸分子以引入本发明的遗传修饰的植物细胞或本发明的遗传修饰的植物中，其中所述诱变的外源核酸分子的特征在于其编码具有GFAT-2活性的蛋白质或具有细菌GFAT活性的蛋白质，其中(例如葡糖胺代谢的)代谢物对所述蛋白质具有降低的抑制作用。举例而言，对于来自大肠杆菌的具有细菌GFAT活性的蛋白质，这类诱变的核酸分子的制备描述于Deng等(2005，MetabolicEngineering 7，201-214；WO 04003175)。来自小鼠的具有GFAT-2活性的蛋白质的突变体描述于例如Hu等(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)。

编码具有GFAT活性的蛋白质的核酸分子是本领域技术人员已知的，并描述于文献中。因此，编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子针对例如大肠杆菌(Dutka-Malen，1988，Biochemie 70(2)，287-290；EMBLacc No：L10328.1)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)(EMBL acc No U21932)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(EMBL acc Nos AB006424.1，BAA33071)被描述。编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子也针对病毒，例如小球藻病毒k2(EMBL acc No AB107976.1)被描述。

此外，还描述了来自以下来源的编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸分子：昆虫，例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(NCBI acc NoNM 143360.2)、来自脊椎动物，例如来自人类(Homo sapiens)(NCBI accNo BC000012.2，Oki等，1999，Genomics 57(2)，227-34)或小家鼠(Musmusculus)(EMBL acc No AB016780.1)。

在优选的实施方案中，本发明涉及本发明的遗传修饰的植物细胞和本发明的遗传修饰的植物，其中所述外源核酸分子(其编码具有GFAT-2活性的蛋白质或编码具有细菌GFAT活性的蛋白质)选自：

a)编码具有SEQ ID NO 7(GFAT-2)的氨基酸序列的蛋白质、或具有SEQ ID NO 9(细菌GFAT)的氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；

b)编码的蛋白质序列与SEQ ID NO 7(GFAT-2)或SEQ ID NO 9(细菌GFAT)所示的氨基酸序列具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、特别优选至少90％、非常特别优选至少95％和最优选至少98％同一性的核酸分子；

c)包含SEQ ID NO 6(GFAT-2)或SEQ ID NO 8(细菌GFAT)或SEQID NO 10(细菌GFAT)所示的核苷酸序列或与之互补的序列的核酸分子；

d)与a)或c)所述的核酸序列具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、特别优选至少90％、非常特别优选至少95％和最优选至少98％同一性的核酸分子；

e)在严格条件下与a)或c)所述核酸序列的至少一条链杂交的核酸分子；

f)其核苷酸序列与a)或c)所述核酸分子的序列由于遗传密码子简并性而不同的核酸分子，和

g)其为a)、b)、c)、d)、e)或f)所述核酸分子的片段、等位基因变体和/或衍生物的核酸分子。

在本发明中，术语“杂交”是指在常规杂交条件下、优选严格条件下的杂交，例如如Sambrook等(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY.ISBN：0879695773)或Ausubel等(Short Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons；5th edition(2002)，ISBN：0471250929)中所述的条件。特别优选“杂交”为在以下条件下的杂交：

杂交缓冲液：

2xSSC；10x Denhardt溶液(Fikoll 400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na₂HPO₄；250μg/ml的鲱鱼精子DNA；50μg/ml的tRNA；

或

25M磷酸钠缓冲液pH7.2；1mM EDTA；7％SDS

杂交温度：

T＝65到68℃

洗涤缓冲液：0.1xSSC；0.1％SDS

洗涤温度：T＝65到68℃。

与编码具有GFAT-2活性的蛋白质或编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子杂交的核酸分子可以源自任何生物；因此，它们可以源自细菌、真菌、动物、植物或病毒。

与编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸分子杂交的核酸分子优选源自动物，特别优选来自哺乳动物，非常特别优选来自小鼠。

与编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子杂交的核酸分子优选源自细菌或病毒，特别优选来自大肠杆菌。

与所述分子杂交的核酸分子可以例如从基因组或cDNA文库中分离。可以使用所述核酸分子或其部分或所述分子的反向互补物通过例如根据标准方法进行杂交(参阅例如Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，3rd edition(2001)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY.ISBN：0879695773；Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons；5th edition(2002)，ISBN：0471250929)或使用PCR进行扩增来鉴定和分离这类核酸分子。

作为用于分离编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸序列的杂交样品，可以使用例如精确地具有或基本上具有SEQ ID NO 6所述核酸序列的核酸分子或这些核酸序列的片段。作为用于分离编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸序列的杂交样品，可以使用例如精确地或基本上具有SEQID NO 8所述核酸序列的核酸分子或这些核酸序列的片段。

用作杂交样品的片段也可以是使用常规合成技术制备的合成片段或寡核苷酸，其序列与本发明所描述的核酸分子基本相同。一旦与本发明所述核酸序列杂交的基因被鉴定和分离，则应当测定该序列并分析由该序列编码的蛋白质的性质，以确定它们是否是具有GFAT-2活性或细菌GFAT活性的蛋白质。如何确定蛋白质是否具有GFAT-2活性或具有细菌GFAT的活性的方法是本领域技术人员已知的，并特别描述于文献中(细菌GFAT：例如Deng等，2005，Metabolic Engineering 7，201-214；Kornfeld，1967，J.Biol.Chem.242(13)，3135-3141；GFAT-2：例如Hu等，2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)。

与本发明所述核酸分子杂交的分子特别包括所述核酸分子的片段、衍生物和等位基因变体。在本发明中，术语“衍生物”表示这些分子的序列与上述核酸分子的序列在一个或多个位置上有差异，并且与上述序列具有高度同一性。与上述核酸分子的差异可以例如归因于缺失(特别是N-端和/或C-端区的缺失)、添加、替代、插入或重组。

在本发明中，术语“同一性”表示沿核酸分子编码区的全长或编码蛋白质的氨基酸序列的全长的至少为60％的序列同一性，特别是至少70％的同一性，优选至少80％、特别优选至少90％、非常特别优选至少95％并最优选至少98％同一性。在本发明中，术语“同一性”应当理解为指以百分比表示的、与其他蛋白质/核酸相同的氨基酸/核苷酸的数量(相同性)。

优选通过与SEQ ID NO 7氨基酸序列进行比较来确定具有GFAT-2活性的蛋白质的同一性，以及借助于计算机程序通过将SEQ ID NO 6的核酸序列与其他蛋白质/核酸进行比较来确定编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸分子的同一性。优选通过与SEQ ID NO 9的氨基酸序列进行比较来确定具有细菌GFAT活性的蛋白质的同一性，以及借助于计算机程序通过将SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 10给出的核酸序列与其他蛋白质/核酸进行比较来确定编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子的同一性。如果要彼此比较的序列长度不同，则通过测定基于较短序列与较长序列共有的氨基酸/核苷酸数目的百分比同一性来确定同一性。优选使用已知的和公众可获得的计算机程序ClustalW(Thompson等，Nucleic Acids Research 22(1994)，4673-4680)确定同一性。公众可通过Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)，European Molecular BiologyLaboratory，Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，Germany获得ClustalW。还可以从多个因特网网页下载ClustalW，特别是从IGBMC(Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire，B.P.163，67404 Illkirch Cedex，France；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和从EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)和EBI(European BioinformaticsInstitute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB101SD，UK)的所有镜像网页下载。

优选使用1.8版的ClustalW计算机程序测定本发明所述的蛋白质与其他蛋白质之间的同一性。此处必须按如下设置参数：KTUPLE＝1、TOPDIAG＝5、WINDOW＝5、PAIRGAP＝3、GAPOPEN＝10、GAPEXTEND＝0.05、GAPDIST＝8、MAXDIV＝40、MATRIX＝GONNET、ENDGAPS(关)、NOPGAP、NOHGAP。

优选使用1.8版的ClustalW计算机程序测定例如本发明中描述的核酸分子的核苷酸序列与其他核酸分子的核苷酸序列之间的同一性。此处必须按如下设置参数：KTUPLE＝2、TOPDIAGS＝4、PAIRGAP＝5、DNAMATRIX：IUB、GAPOPEN＝10、GAPEXT＝5、MAXDIV＝40，TRANSITIONS：未加权(unweighted)。

同一性还表示所述核酸分子或由它们编码的蛋白质之间存在功能和/或结构等价性。与上述分子同源并作为这些分子的衍生物的核酸分子通常是这些分子的变体，其是具有相同生物学功能，即编码具有GFAT-2活性或具有细菌GFAT活性的蛋白质的修饰物。它们可以是天然存在的变体(例如来自其它物种的序列)或突变体，其中这些突变可以以天然方式发生或通过系统的诱变引入。另外，变体可以是合成产生的序列。等位基因变体可以是天然存在的变体或合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。一种特定形式的衍生物为例如下述核酸分子，该分子因为遗传密码子的简并性而与本发明的上下文中描述的核酸分子不同。

在另一优选的实施方案中，本发明涉及本发明的遗传修饰的植物细胞或本发明的遗传修饰的植物，其中编码具有GFAT-2活性的蛋白质或编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子的特征在于：所述核酸分子的密码子与亲本生物的编码具有GFAT-2活性的所述蛋白质或具有细菌GFAT活性的所述蛋白质的核酸分子的密码子不同。特别优选，对编码具有GFAT-2活性的蛋白质或编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子的密码子进行改变，以使得它们适应如下植物细胞或植物的密码子使用频率，其中所述核酸分子被整合或有待整合入所述植物细胞或植物的基因组中。

作为遗传密码简并性的结果，氨基酸可以被一种或多种密码子编码。在不同的生物中，编码氨基酸的密码子以不同的频率被使用。对编码核酸序列的密码子根据它们在待表达序列要整合进的基因组所在的植物细胞或植物中的使用频率进行适应性改变，可有助于在特定植物细胞或植物中提高所述被翻译的蛋白质的数量和/或所述mRNA的稳定性。所述植物细胞或植物中密码子的使用频率可以由本领域技术人员通过检查尽可能多的所述生物的编码核酸序列以得到使用某些密码子编码某一氨基酸的频率来确定。某些生物的密码子使用频率是本领域技术人员已知的，并可以使用计算机程序以简单快速的方式确定。这类计算机程序是公众可获得的，并特别在因特网上免费提供(例如http://gcua.schoedl.de/；http://www.kazusa.or.jp/codon/；http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html)。可以通过体外诱变或优选通过基因序列的从头合成来实现编码核酸序列密码子相对于它们在植物细胞或植物(待表达的序列被整合进其基因组中)中的使用频率进行的适应性修改。用于核酸序列从头合成的方法为本领域技术人员已知。从头合成可以如下完成：最初合成单个的核酸寡核苷酸，将这些寡核苷酸和与其互补的寡核苷酸杂交以便它们形成DNA双链，然后将这些单个的双链寡核苷酸连接起来从而获得所需的核酸序列。核酸序列的从头合成(包括针对某一靶生物进行的密码子使用频率的适应性改变)也可以由提供这类服务的公司(例如Entelechon GmbH，Regensburg，Germany)来完成。

所有提到的核酸分子都适用于产生本发明的植物细胞或本发明的植物。

本发明的遗传修饰的植物细胞或本发明的遗传修饰的植物原则上可以分别是任何植物物种，即单子叶和双子叶植物的植物细胞或植物。它们优选是作物植物，即为了喂养人和动物或生产生物质的目的和/或为了制备物质用于技术、工业目的而人为栽培的植物。本发明的遗传修饰的植物细胞或本发明的遗传修饰的植物特别优选是玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、番茄、柳枝稷(Panicum virgatum)、西米(sago)、绿豆、豌豆、高粱、胡萝卜、茄子、萝卜(radish)、油籽油菜、紫花苜蓿、大豆、花生、黄瓜、南瓜、甜瓜(melon)、韭菜(leek)、蒜、卷心菜、菠菜、甘薯、芦笋、西葫芦(zucchini)、莴苣、洋蓟(artichokes)、甜玉米、欧防风(parsnip)、婆罗门参(salsify)、菊芋(Jerusalem artichoke)、香蕉、甜菜、甘蔗、甜菜根、花茎甘蓝、卷心菜、洋葱、甜菜、蒲公英、草莓、苹果、杏、梅、桃、葡萄、花椰菜、芹菜、甜椒(bell peppers)、芫菁甘蓝(swede)、大黄。它们优选为玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦或大麦植物，非常特别优选稻、番茄或马铃薯植物。

在本发明中，术语“马铃薯植物”或“马铃薯”应当理解为指茄属(solanum)植物物种，特别是茄属的产块茎物种，尤其是马铃薯(Solanumtuberosum)。

在本发明中，术语“番茄植物”或“番茄”应当理解为指番茄属(Lycopersicon)的植物物种，尤其是番茄(Lycopersicon esculentum)。

在本发明中，术语“稻植物”应当理解为指稻属(Oryza)的植物物种，尤其是为了商业目的农业栽培的稻属植物物种，特别优选稻(Oryzasativa)。

如前已述，本发明的植物细胞或本发明的植物适用于产生糖胺聚糖例如软骨素、乙酰透明质酸、壳多糖、肝素(heparosan)，因为它们含有较高含量的酶底物，其中所述酶参与所提到的糖胺聚糖的催化。

因此，本发明还涉及合成糖胺聚糖的植物细胞或植物，优选每克鲜重至少500μg糖胺聚糖，更优选每克鲜重至少1500μg糖胺聚糖，特别优选每克鲜重至少3500μg糖胺聚糖，非常特别优选每克鲜重至少4000μg糖胺聚糖，尤其优选每克鲜重至少5500μg糖胺聚糖。在该上下文中，糖胺聚糖优选是软骨素、乙酰透明质酸、壳多糖或肝素(heparosan)，特别优选乙酰透明质酸。

本发明的植物细胞或本发明的植物优选具有每克鲜重至多25000μmol的糖胺聚糖含量，优选每克鲜重至多20000μmol，特别优选每克鲜重至多15000μmol，非常特别优选每克鲜重至多10000μmol，尤其优选每克鲜重至多6500μmol。

合成糖胺聚糖的本发明的植物细胞或本发明的植物可以例如通过将外源核酸分子(其编码具有GFAT活性的蛋白质和编码具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质)引入植物细胞而产生。

因此，本发明也涉及含有第一外源核酸分子(其编码具有GFAT-2或细菌GFAT的活性的蛋白质)和第二外源核酸分子(其编码具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质)的遗传修饰的植物细胞或遗传修饰的植物。

在本发明中，术语“具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质”应当理解为指这样一种蛋白质，所述蛋白质使用UDP-GlcNAc或UDP-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GlcNAc的差向异构体)作为底物用于合成糖胺聚糖。具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质优选为乙酰透明质酸合酶、软骨素合酶、heparosan/肝素合酶、角质素合酶或壳多糖合酶。

编码糖胺聚糖合酶的核酸分子和相应的蛋白质序列是本领域技术人员已知的，并描述了例如来自病毒(例如绿草履虫小球藻病毒1，EMBLU42580.3，PB42580，US 20030235893)的乙酰透明质酸合酶，例如来自哺乳动物(例如人(Homo sapiens)，WO 03012099，US 2005048604，US2006052335)、细菌(例如大肠杆菌，US2003109693，EP 1283259，Pasteurellamulticoda US 2003104601)的软骨素合酶，例如来自细菌(例如茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)EMBLCDS：AAB51164)、来自真菌(例如球毛壳(Chaetomium globosum)EMBLCDS：EAQ92361、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)EMBL AB000125、Arthroderma benhamiaeEMBLCDS：BAB32692、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)EMBL M73437.4、来自昆虫(例如埃及伊蚊(Aedes aegypti)EMBLCDS：EAT46081、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)EMBLCDS：AAQ55061)、线虫(例如犬恶线虫(Dirofilaria immitis)EMBL AF288618、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)EMBL AY874871)、来自病毒(例如小球藻病毒EMBLCDS：BAB83509、绿草履虫小球藻病毒CVK2 EMBLCDS：BAE48153)的壳多糖合酶，例如来自细菌(例如出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)EMBL AF425591，AF439804，US 20030099967，大肠杆菌X77617.1)的肝素/heparosan合酶。

编码具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质的第二外源核酸分子优选为重组的核酸分子。重组核酸分子的优选的实施方案已被描述并将在此以相应方式使用。

在另一优选的实施方案中，第二外源核酸分子(编码具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质)的特征在于密码子与亲本生物编码具有糖胺聚糖合酶活性的所述蛋白质的核酸分子的密码子相比被修饰。特别优选，该核酸分子(编码具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质)的密码子被修饰，使得它们适应于植物细胞或植物(所述核酸分子被整合或要被整合进其基因组中)的密码子使用频率。

上文针对编码具有GFAT-2或细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子在核酸分子密码子修饰方面的陈述以相应方式适用于此处。

本发明还涉及含有本发明的植物细胞的植物。这类植物可以通过从本发明的植物细胞再生而产生。

本发明还涉及本发明的植物的部分，其含有本发明的植物细胞。

在本发明中，术语“植物部分”或“植物的部分”应当理解为指例如可加工的植物部分，其可以用于食品或饲料的生产、用作工业加工(例如分离葡糖胺衍生物或糖胺聚糖)的原材料来源、用作制备药物的原材料来源或用作制备化妆品的原材料来源。

在本发明中，术语“植物部分”或“植物的部分”还应当理解为指例如可食用的植物部分，其可以用作人的食物或用作动物饲料。

优选的“植物部分”或“植物的部分”为果实、贮藏根和其它根、花、芽、枝条、叶或茎，优选种子、果实、谷粒或块茎。

本发明还涉及本发明的植物的繁殖材料。优选本发明的繁殖材料含有本发明的植物细胞，特别优选本发明的遗传修饰的植物细胞。

此处，术语“繁殖材料”包括适用于通过无性或有性途径产生后代的植物成分。适用于无性繁殖的为例如插条、愈伤组织培养物、根茎或块茎。其它繁殖材料包括例如果实、种子、谷粒、幼苗、细胞培养物等。繁殖材料优选采取块茎、果实、谷粒或种子的形式。

本发明的另一优点在于本发明的植物部分具有比已知植物更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。因此，本发明的植物特别适用于直接用作食品/饲料或用于制备食品/饲料，所述食品/饲料具有预防或治疗作用(例如用于骨关节炎预防)。因为本发明的植物与已知植物相比具有更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量，所以可以减少在制备具有提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量的食品/饲料时所用的本发明植物的可收获部分、繁殖材料、可加工部分或可食用部分的量。如果本发明的遗传修饰植物的可食用部分例如作为所谓的营养药被直接食用，则甚至通过食用小量物质也可达到积极效果。这在动物饲料生产中可能尤其重要，因为具有过高植物成分含量的动物饲料不适合作为多种动物物种的饲料。另外，本发明的植物细胞或本发明的植物具有下述优点：它们也可以被素食者使用或用于制备符合犹太教规的食物。因此甚至可以对遵循所述生活方式的人施用具有提高的N-乙酰化葡糖胺含量的食物。

已知N-乙酰葡糖胺对双歧杆细菌的生长具有刺激效应(Liepke等，2002，Eur.J.Biochem.269，712-718)。另外，已经证实N-乙酰葡糖胺可用作来自鱼肠(Adolfo Bucio Galindo，2004，Proefschrift，WageningenUniversiteit，ISBN 90-5808-943-6)的乳酸杆菌(例如干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus casei subspecies paracasei))的底物。因此，N-乙酰葡糖胺对益生菌具有正面作用。因为本发明的植物细胞、本发明的植物或本发明的植物部分具有提高的N-乙酰葡糖胺含量，所以它们应当对益生菌的生长具有正面作用，并因此适合用作益生食品/饲料用于人和动物。

本发明还涉及生产遗传修饰的植物的方法，其包括以下步骤：

a)将外源核酸分子(编码具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶同种型II(GFAT-2)活性的蛋白质或编码具有细菌谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(细菌GFAT)活性的蛋白质)引入植物细胞，

b)从根据步骤a)获得的植物细胞再生植物，

c)如果合适，借助于步骤b)的植物产生其它植物。

本发明还涉及生产合成糖胺聚糖的植物的方法，其中

a)遗传修饰植物细胞，其中该遗传修饰包括任何顺序的以下步骤i到ii或者单独地实施或同时地实施以下步骤i到ii的任何组合

i)将编码具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶同种型II(GFAT-2)活性的蛋白质或编码具有细菌谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(细菌GFAT)活性的蛋白质的外源核酸分子引入植物细胞

ii)将编码糖胺聚糖合酶的外源核酸分子引入植物细胞

b)从植物细胞再生植物，所述植物细胞包含根据步骤

i)a)i

ii)a)ii

iii)a)i和a)ii

的遗传修饰，

c)向根据步骤

i)bi)的植物的植物细胞中引入根据步骤a)ii的遗传修饰，

ii)bii)的植物的植物细胞中引入根据步骤a)i的遗传修饰，

并再生植物

d)如果合适，借助于根据b)iii或c)i或c)ii任一步骤所获得的植物产生其它植物。

关于将外源核酸分子引入植物细胞中(根据用于产生遗传修饰的植物的方法的步骤a)或根据用于产生合成糖胺聚糖的植物的方法步骤a)或c))而言，该引入原则上可以是适用于将外源核酸分子整合进植物细胞或植物中的任何类型的核酸分子引入。这类方法已经在上文描述并可以以相应方式适用于此。

关于编码具有GFAT-2活性的蛋白质或编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子(根据用于产生遗传修饰的植物的方法步骤a))或关于编码具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质的外源核酸分子(根据用于产生合成糖胺聚糖的植物的方法步骤a)ii))而言，各核酸分子的各种可能的实施方案已联系本发明的植物细胞和本发明的植物在本文中进行了描述。所有这些已被描述的优选的实施方案也可以用于实施所述的本发明方法。

取决于本发明方法步骤b)和/或c)的过程的植物再生可以使用本领域技术人员已知的方法进行(描述于例如″Plant Cell Culture Protocols″，1999，edt.by R.D.Hall，Humana Press，ISBN 0-89603-549-2中)。

取决于本发明方法步骤c)或d)的过程的其它植物的产生可以通过例如无性繁殖(例如通过插条、块茎或通过愈伤组织培养物及完整植物的再生)或通过有性繁殖来进行。在本上下文中，有性繁殖优选在受控的条件下发生，即具有特定特征的选定植物彼此杂交并增殖。所述选择优选以下述方式进行，所述方式使得，取决于步骤b)或d)的过程，这些植物具有步骤a)中引入的修饰。

在另一优选的实施方案中，根据本发明的用于生产遗传修饰的植物的方法被用于生产本发明的植物。

本发明还提供可通过本发明的用于产生遗传修饰的植物的方法获得的植物。

本发明还涉及用于生产糖胺聚糖的方法，其包括步骤：从本发明的遗传修饰的植物细胞、从本发明的遗传修饰的植物、本发明的繁殖材料、本发明的植物部分或从可通过本发明用于制备合成糖胺聚糖的遗传修饰植物的方法获得的植物中提取糖胺聚糖。本发明的该方法优选被用于生产软骨素、乙酰透明质酸、壳多糖或肝素(heparosan)，特别优选用于生产乙酰透明质酸。

优选这类方法也包括在提取糖胺聚糖之前收获栽培的本发明遗传修饰的植物细胞、本发明遗传修饰的植物、本发明的繁殖材料、本发明的植物部分的步骤，特别优选还包括在收获之前栽培本发明的遗传修饰的植物细胞或本发明的遗传修饰的植物的步骤。

与细菌或动物组织相反，植物组织不含有任何糖胺聚糖降解酶。因此，可以使用相对简单的方法从植物组织提取糖胺聚糖。如果需要的话，可以进一步使用本领域技术人员已知的方法(例如用乙醇重复沉淀)纯化含有糖胺聚糖的植物细胞或组织的水性提取物。纯化例如乙酰透明质酸的一个优选方法描述于一般方法之第5条中。

本发明还提供了本发明的遗传修饰的植物细胞、本发明的遗传修饰的植物、本发明的繁殖材料、本发明的植物部分或可通过本发明用于生产合成糖胺聚糖的遗传修饰植物的方法获得的植物，用于生产糖胺聚糖的用途。

本发明还提供了编码具有GFAT-2活性的蛋白质或编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子用于制备遗传修饰的植物的用途。

本发明还涉及包含本发明的遗传修饰的植物细胞的组合物。

此处植物细胞是否完整或因为它们已经通过例如加工被破坏而不再完整是无关紧要的。组合物优选为食品、食品增补剂或饲料、药物或化妆品。

本发明优选提供包含重组核酸分子的本发明组合物，所述重组核酸分子的特征在于它们包含下述核酸分子，所述核酸分子编码具有GFAT-2酶活性或具有细菌GFAT活性的蛋白质。

外源核酸分子在植物细胞或植物的基因组中的稳定整合导致外源核酸分子在整合进植物细胞或植物的基因组中后被植物基因组核酸序列侧翼包围。因此在一个优选的实施方案中，本发明的组合物的特征在于存在于本发明组合物中的重组核酸分子被植物基因组核酸序列侧翼包围。

此处，植物基因组核酸序列可以是天然存在于用于制备所述组合物的植物细胞或植物的基因组中的任何序列。存在于本发明组合物中的重组核酸分子可以使用本领域技术人员已知的方法验证，例如基于杂交的方法或优选地基于PCR(聚合酶链式反应)的方法。

优选本发明的组合物包含至少0.05％，优选至少0.1％，特别优选至少0.5％，非常特别优选至少1.0％的N-乙酰化的葡糖胺衍生物。

优选本发明的组合物包含至多10％，优选至多5％，特别优选至多3％，非常特别优选至多2％的N-乙酰化的葡糖胺衍生物。

本发明的组合物提供了下述优点：与包含未经遗传修饰的植物细胞的组合物相比，它们具有提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量或提高的糖胺聚糖含量。N-乙酰葡糖胺对双歧杆菌的生长具有刺激作用(Liepke等，2002，Eur.J.Biochem.269，712-718)。另外，已经证实N-乙酰葡糖胺可以用作来自鱼肠的乳杆菌(例如干酪乳杆菌副干酪亚种)的底物(Adolfo BucioGalindo，2004，Proefschrift，Wageningen Universiteit，ISBN90-5808-943-6)。因此，N-乙酰葡糖胺对益生菌具有正面作用。因为本发明的组合物具有提高的N-乙酰葡糖胺含量，所以它们应当对益生菌的生长具有正面作用。

本发明还提供了使用本发明的植物细胞、本发明的植物、本发明的繁殖材料、本发明的植物部分或可通过本发明用于产生遗传修饰植物的方法获得的植物来制备本发明组合物的方法。用于制备本发明组合物的方法优选为用于生产食品、饲料或食品增补剂的方法。

用于生产食品、饲料、食品增补剂、药物产品或化妆品产品的方法为本领域技术人员已知并特别包括，但不仅限于：粉碎或研磨本发明的植物或本发明的植物部分。

本发明还提供了可通过用于制备本发明组合物的方法获得的组合物。

本发明还涉及本发明的遗传修饰的植物细胞或本发明的遗传修饰的植物用于制备本发明组合物的用途。

本发明组合物的一个优选的实施方案是面粉。

植物的部分常被加工为面粉。用于制备面粉的植物部分的实例为例如马铃薯植物的块茎和谷类植物的谷粒。为了从谷类植物生产面粉，研磨并筛分这些植物的含有胚乳的谷粒。在不含有任何胚乳但是含有例如块茎和贮藏根的其它植物的情况下，常通过将植物的相关部分粉碎、干燥并随后研磨来生产面粉。与已知的植物细胞或植物相比，本发明的植物细胞和本发明的植物具有提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物或糖胺聚糖含量。从本发明的植物细胞、本发明的植物、本发明的繁殖材料或本发明的植物部分制备的面粉因此同样含有提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物或糖胺聚糖比例。

因此，本发明还涉及面粉，所述面粉可以从本发明的植物细胞、本发明的植物或本发明的植物部分获得。用于生产面粉的优选的本发明植物部分为块茎和含有胚乳的谷粒。在本发明中，特别优选的是(分类上的)禾本科(Poaceae)植物的谷粒，尤其优选来自玉米、稻或小麦植物的谷粒。

本发明还涉及本发明的面粉，其具有至少每克10μmol的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量，优选至少每克20μmol，更优选至少每克25μmol，特别优选至少每克30μmol，非常特别优选至少每克35μmol，尤其优选至少每克40μmol。

本发明的面粉优选具有至多每克鲜重250μμmol，优选至多每克鲜重200μmol，特别优选至多每克鲜重150μmol，非常特别优选至多每克鲜重100μmol，尤其优选至多每克鲜重50μmol的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

在本发明中，术语“面粉”应当理解为指通过研磨植物或植物部分获得的粉末。如果适当的话，植物或植物部分在研磨前干燥并在研磨后进一步粉碎和/或筛分。

与常规面粉相比，本发明的面粉具有下述优点：它们可以被用于生产具有提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物或糖胺聚糖含量的食品例如烘培食品，而不需要向面粉中添加得自动物或真菌原材料来源的N-乙酰化的葡糖胺衍生物或糖胺聚糖。应用从上述原材料来源中分离的N-乙酰化的葡糖胺衍生物或糖胺聚糖的缺点(例如它们可能含有病原体或变应原性物质的风险)已在前文提到。

本发明还提供用于生产面粉的方法，所述方法包括研磨本发明的植物细胞、本发明的植物或本发明的植物部分的步骤。

可以通过研磨植物部分生产面粉。本领域技术人员已知如何生产面粉。用于生产面粉的方法优选还包括收获栽培的本发明的植物或本发明的植物部分和/或本发明的繁殖材料的步骤，特别优选还包括在收获前栽培本发明植物的步骤。

在本发明的另一实施方案中，用于生产面粉的方法包括加工本发明的植物、本发明植物的部分或本发明的繁殖材料。此处，加工可以是例如热处理和/或干燥。例如，当从贮藏根、块茎(例如，马铃薯的块茎)生产面粉时，在研磨之前使用热处理，之后干燥经热处理的材料。粉碎本发明的植物、本发明植物的部分或本发明的繁殖材料也可构成本发明意义上的加工。在研磨前去除植物组织(例如从谷粒中去除谷壳)也构成本发明意义上的研磨前的加工。

在本发明的另一实施方案中，用于生产面粉的方法包括在研磨后加工经研磨的材料。

此处，在研磨后可例如将经研磨的材料过筛，例如以产生不同类型的面粉。

本发明还提供了本发明植物细胞、本发明植物、本发明的植物部分或本发明的繁殖材料用于生产面粉的用途。

序列描述

SEQ ID NO 1：编码绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶的核酸序列。

SEQ ID NO 2：绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶的氨基酸序列。所示氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 1。

SEQ ID NO 3：编码绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶的合成核酸序列。所示序列的密码子以下述方式合成，该方式使得它们适应于植物细胞中的密码子使用。所示核酸分子编码具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白质。

SEQ ID NO 4：核酸序列，其编码来自小鼠的具有GFAT-1活性的蛋白质。

SEQ ID NO 5：来自小鼠的具有GFAT-1活性的蛋白质的氨基酸序列。所示氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 4。

SEQ ID NO 6：核酸序列，其编码来自小鼠的具有GFAT-2活性的蛋白质。

SEQ ID NO 7：来自小鼠的具有GFAT-2活性的蛋白质的氨基酸序列。所示氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 6。

SEQ ID NO 8：核酸序列，其编码来自大肠杆菌的具有细菌GFAT活性的蛋白质。

SEQ ID NO 9：来自大肠杆菌的具有GFAT活性的蛋白质的氨基酸序列。所示氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 8。

SEQ ID NO 10：合成的核酸序列，其编码来自大肠杆菌的具有GFAT活性的蛋白质。所示序列的密码子以下述方式合成，该方式使得它们适应于植物细胞中的密码子使用。所示核酸序列编码具有SEQ ID NO 9所示氨基酸序列的蛋白质。

SEQ ID NO 11：核酸序列，其编码具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。

SEQ ID NO 12：具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列。所示氨基酸序列可以衍生自SEQ ID NO 11。

SEQ ID NO 13：合成的核酸序列，其编码具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。所示序列的密码子以下述方式合成，该方式使得它们适应于植物细胞中的密码子使用。所示核酸序列编码具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的蛋白质。

SEQ ID NO 14：实施例6中使用的合成寡核苷酸。

SEQ ID NO 15：实施例6中使用的合成寡核苷酸。

SEQ ID NO 16：实施例15中使用的合成寡核苷酸。

SEQ ID NO 17：实施例15中使用的合成寡核苷酸。

所有引用的公开文献的内容(包括所提及的核酸分子和氨基酸序列在序列数据库中的登录号)并入本申请的说明书中作为参考。

可用于本发明的方法在下文描述。这些方法是具体的实施方案；然而，本发明不限于这些方法。本领域技术人员已知本发明可以通过修饰所述方法和/或用备选方法或备选的方法部分替换相应方法或方法的部分来以相同方式完成。

一般方法

1.马铃薯植物的转化

借助于农杆菌，如Rocha-Sosa等(EMBO J.8，(1989)，23-29)中所述转化马铃薯植物。

2.番茄植物的转化

借助于农杆菌根据US 5,565,347中所述方法转化番茄植物。

3.稻植物的转化

根据Hiei等(1994，Plant Journal 6(2)，271-282)所述方法转化稻植物。

4.N-乙酰化的葡糖胺含量的测定

按与Elson和Morgan的方法(1933，J Biochem.27，1824)和Reissig等(1955，Biol.Chem.217，959-966)的改良比色测定法类似的方法，测定具有还原性末端的N-乙酰化的葡糖胺衍生物。该比色测定法基于色素原III(Muckenschnabel等，1998，Cancer Letters 131，13-20)与对二甲基氨基苯甲醛(DMAB，Ehrlich试剂)的反应，所述反应产生浓度可以用光度计测定的红色产物。

a)植物材料的加工

首先粉碎收获的植物材料。根据使用的植物材料用量，在实验室振动球磨机(MM200，来自Retsch，Germany)中以30Hz粉碎30秒或使用Warring搅拌机以最高速粉碎约30秒。通常将0.5g粉碎的植物材料(例如叶、块茎或稻谷粒)与1ml的溶液(其由7％高氯酸、5mM EGTA组成)混合并在冰上孵育20分钟。然后将混合物离心(16000xg，4℃下5分钟)。取出离心后获得的上清液并使用由5M KOH、1M TEA(pH调节为7.0)组成的溶液中和，然后再次离心(16000xg，4℃下5分钟)。离心结束后，取出上清液，测量其体积并使用b)所述方法测定具有还原性末端的N-乙酰化的葡糖胺衍生物的量。

b)测定具有还原性末端的N-乙酰化的葡糖胺衍生物的含量

将20μl由0.8M K₂B₄O₇，pH9.6组成的溶液加入通过a)所述方法获得的100μl植物提取物中，彻底混合后在95℃加热5分钟。将混合物冷却至室温后，向混合物中添加0.7ml的Ehrlich试剂(由10g DMAB在12.5ml浓盐酸、87.5ml冰醋酸中组成的溶液，用冰醋酸1∶10稀释)，再次混合并在37℃下再孵育30分钟。然后将混合物在16000xg离心1分钟，随后在光度计中585nm处测定离心后获得的上清液的光密度(OD)。

c)计算N-乙酰化的葡糖胺衍生物的浓度

首先使用确定量的N-乙酰葡糖胺6-磷酸建立校准曲线。为此，根据b)所述方法测定包含0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM和10mM N-乙酰葡糖胺6-磷酸的溶液的OD。

在Microsoft Excel中，通过采用式y＝ax²+bx+c或y＝x²+px+q的二阶多项式趋势/回归线拟合针对各浓度测量到的点，建立校准曲线。为了计算值，针对x解所获得的方程式，得到x＝-p/2-平方根(p²/4-q)，其中p＝b/a、q＝(c-y)/a，y是测量的未知样品的OD。考虑所使用的鲜重、所使用的体积及考虑所使用的任何稀释因素，以μmol(测量的溶液)或μmol每克鲜重为单位计算含量。

5.以乙酰透明质酸为例从植物组织中分离糖胺聚糖

为了检测乙酰透明质酸的存在以及测定植物组织中的乙酰透明质酸含量，如下加工植物材料：向约0.3g的叶或块茎材料中添加200μl的水(软化的，电导率＝18MΩ)，在实验室振动球磨机(MM200，来自Retsch，Germany)中粉碎混合物(30Hz 30秒)。然后再加入800μl水(软化的，电导率＝18MΩ)，将混合物充分混合(使用例如涡旋混合器)。通过在16000xg离心5分钟将细胞碎片和不溶成分从上清液中分离出来。使用获得的上清液的等分式样测定乙酰透明质酸的量。

对于番茄果实，在每种情况下加工整个成熟番茄果实。为此，测定番茄果实的重量，用少量水在Warring搅拌机中粉碎番茄，通过在3600xg下离心30分钟从粉碎的样品中去除细胞碎片，并测定提取物的体积。使用获得的上清液的等分式样测定乙酰透明质酸的量。

6.以乙酰透明质酸为例纯化糖胺聚糖

添加100ml水(软化的，电导率＝18MΩ)后，在Warring搅拌机(blender)中将约100g植物材料以最大速度粉碎约30秒。如果相对大的植物部分(例如块茎或番茄果实)被用于分离，则预先将它们切成约1cm³大小的块。然后使用茶叶筛(tea sieve)去除细胞碎片。分离出来的细胞碎片再次悬浮于300ml水(软化的，电导率＝18MΩ)中并使用茶叶筛再次去除。将获得的两份悬浮液(100ml+300ml)合并并在13000xg离心15分钟。向获得的离心上清液中加入NaCl直至达到1％的终浓度。NaCl溶于溶液中后，通过添加两倍体积的乙醇然后彻底混合并在-20℃孵育过夜进行沉淀。然后将混合物在13000xg离心15分钟。将该离心后获得的沉淀物溶解在100ml的缓冲液(50mM TrisHCl，pH8，1mM CaCl₂)中，然后添加蛋白酶K至100μg/ml的终浓度，并将溶液在42℃孵育2小时。然后在95℃孵育10分钟。再次向该溶液中添加NaCl，直到达到1％的终浓度。NaCl溶于溶液中后，通过添加两倍体积的乙醇、彻底混合并在-20℃孵育约96个小时进行再次沉淀。之后在13000xg离心15分钟。该离心后获得的沉淀物溶解于30ml水(软化的，电导率＝18MΩ)中，并再次添加NaCl至1％的终浓度。通过添加两倍体积的乙醇、彻底混合并在-20℃孵育过夜进行再次沉淀。随后在13000xg离心15分钟，获得的沉淀物溶于20ml水(软化的，电导率＝18MΩ)中。

通过离心过滤进行进一步的纯化。为此，在每种情况下将5ml溶解的沉淀施加于膜滤器(CentriconAmicon，孔径10000 NMWL，Prod.No.UCF801096)上，然后将样品在2200xg离心直到滤器上方仅剩余约3ml溶液。再进行两次：在每种情况下向滤膜上方的溶液中添加3ml水(软化的，电导率＝18MΩ)并在每种情况下在相同的条件下再离心直到最终滤器上方仅剩余约3ml溶液。取出离心过滤后仍然存在于膜上方的溶液，用约1.5ml水(软化的，电导率＝18MΩ)反复(三到五次)洗膜。将仍然存在于膜上方的所有溶液和漂洗获得的溶液合并，添加NaCl至1％的终浓度，NaCl进入溶液中后加入两倍体积的乙醇，混合样品并通过在-20℃储存过夜获得沉淀物。随后在13000xg离心15分钟，获得的沉淀物溶于4ml水(软化的，电导率＝18MΩ)中然后冻干(在0.37mbar的压力下24小时，冷冻干燥装置Christ Alpha 1-4，来自Christ，Osterode，Germany)。

7.检测乙酰透明质酸和测定乙酰透明质酸含量

使用商业测试(来自Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明质酸(HA)测试试剂盒，Prod.No.029-001)根据制造商的说明检测乙酰透明质酸，所说明通过参考方式并入本说明书中。该测试的原理基于与乙酰透明质酸特异结合的蛋白质(HABP)的可获得性，并类似ELISA进行，其中颜色反应指示被检查的样品中的乙酰透明质酸含量。因此，对于乙酰透明质酸的定量测定，待测量的样品应当以位于所述限定范围内的浓度使用(例如：稀释所述样品或使用较少的水从植物组织中提取乙酰透明质酸，这取决于是超出还是未达到所述限定范围)。

8.GFAT的活性测定

如Rachel等(1996，J.Bacteriol.178(8)，2320-2327)所述测定具有GFAT活性的蛋白质的活性。

为了辨别蛋白质是具有GFAT-1还是GFAT-2的活性，使用Hu等(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)中描述的方法。

9.通过质谱法检测N-乙酰化的葡糖胺衍生物

为了通过质谱法检测N-乙酰化的葡糖胺衍生物，如一般方法第4条a)下所述加工植物组织。为了获得尽可能不含盐的提取物，在通过质谱法检查之前将各样品首先冷冻在-20℃并在离心(室温下16000xg)过程中融化。对测量而言，将上清液用1∶1(体积/体积)比例的甲醇∶水混合物1∶20稀释。

为了提高对弱信号(峰)的探测灵敏度，记录使用三种不同检测器灵敏度的MS谱。然而，在该情况下检测器的响应不再是线性的，这在比较不同代谢物的信号强度(峰面积)时可以被注意到并应当被考虑进去。为了确保测量值能够彼此比较，确保了单个样品在相同的检测器设定下给出相同的信号强度(计为cps，每秒计数)。

不同代谢物的所得信号面积(峰面积)以相对于己糖(m/z＝179)峰面积的％表示。不同样品中信号强度(峰面积)的比率可以用于推断相应的N-乙酰化的葡糖胺衍生物相对于所述样品中的己糖浓度的浓度比率。

单个样品和单个相应参考物质(葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、葡糖胺6-磷酸、葡糖胺1-磷酸、N-乙酰葡糖胺6-磷酸、N-乙酰葡糖胺1-磷酸、UDP-N-乙酰葡糖胺)的MS-MS测量平行进行。以该种方法可以评估为了测定面积所使用的信号(峰)是否是由特定代谢物或由具有相同质量的特定同分异构代谢物独自产生的信号，或是否所述信号仅可以部分归于该相应的代谢物或具有相同质量的相应的特定同分异构代谢物。

使用来自Applied Biosystems的Q-STAR Pulsar i hybrid质谱仪(其上装备有纳升电喷雾源(nano electrospray source)以负离子模式记录MS和MS-MS谱。探测到的离子主要是具有单电荷的去质子化的离子。

测量在以下条件下进行：

质量范围50-700Da。

检测器灵敏度：2000、2050和2100。

对于三种检测器设定中的每种而言，确保样品具有类似的信号强度(计为cps，每秒计数)。

实施例

1.获取编码来自小鼠的具有GFAT-1活性的蛋白质的核酸序列

编码如下蛋白质的核酸序列购自BioCat GmbH，Heidelberg，Germany(Art.No.MMM1013-65346，cDNA克隆MGC：58262，IMAGE：6742987)，所述蛋白质具有GFAT-1(谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶或葡糖胺6-磷酸合酶，EC 2.6.1.16)活性。这是由I.M.A.G.E.合伙企业(http://image.llnl.gov)生产并由BioCat GmbH经销的克隆。编码具有GFAT-1活性的蛋白质的cDNA被克隆进来自Invitrogen的pCMV Sport 6载体中。该质粒被命名为IC 365-256。编码来自小家鼠的具有GFAT-1活性的蛋白质的核酸序列显示于SEQ ID NO 4。

为了利于随后的克隆步骤，使用Xho I和Eco RV将GFAT-1的编码序列从质粒IC 365-256上切下并克隆进质粒pME9中，所述质粒pME9也已用相同的限制性内切核酸酶切割。获得的质粒命名为IC 367-256。

质粒pME9是来自Stratagene的pBlueSkript载体(Prod.No.212207)，其中与所提到的pBlueSkript载体不同，pME9含有经修饰的多克隆位点(MCS)，所述位点除了具有存在于pBlueSkript中的MCS外，在MCS的两端还具有额外的Pac I限制性位点。

2.获取编码来自小鼠的具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸序列

编码如下蛋白质的核酸序列购自Invitrogen(克隆ID 4167189，cDNA克隆MGC：18324，IMAGE：4167189)，所述蛋白质具有GFAT-2(谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶或葡糖胺6-磷酸合酶，EC 2.6.1.16)活性。这是通过I.M.A.G.E.合伙企业(http://image.llnl.gov)生产并由Invitrogen经销的克隆。编码蛋白质的cDNA被克隆进来自Invitrogen的pCMV Sport 6载体中，所述蛋白质具有GFAT-2的活性。该质粒被命名为IC 369-256。编码来自小鼠的具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸序列显示于SEQ ID NO 6。

3.合成编码来自大肠杆菌的具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸

通过Entelechon GmbH合成编码来自大肠杆菌的蛋白质的核酸序列，所述蛋白质具有细菌GFAT活性(谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶或葡糖胺6-磷酸合酶，glms，EC 2.6.1.16)，并将该核酸序列克隆进来自Invitrogen的载体pCR4Topo(Prod.No.K4510-20)中。获得的质粒命名为IC 373-256。编码来自大肠杆菌的如下蛋白质的合成核酸序列显示于SEQ ID NO 10，所述蛋白质具有细菌GFAT的活性。最初分离自大肠杆菌的相应的核酸序列显示于SEQ ID NO 8。

4.编码绿草履虫小球藻病毒1乙酰透明质酸合酶的核酸分子的合成

编码绿草履虫小球藻病毒1乙酰透明质酸合酶的核酸序列通过Medigenomix GmbH(Munich，Germany)合成并克隆进来自Invitrogen的载体pCR2.1(Prod.No.K2000-01)中。获得的质粒命名为IC 323-215。编码来自绿草履虫小球藻病毒1的HAS蛋白的合成核酸序列显示于SEQ IDNO 3。最初分离自绿草履虫小球藻病毒1的相应的核酸序列显示于SEQ IDNO 1。

5.编码绿草履虫小球藻病毒1的具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的核酸分子的合成

编码绿草履虫小球藻病毒1的具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列通过Entelechon GmbH合成并被克隆进来自Invitrogen的载体pCR4Topo(Prod.No.K4510-20)中。获得的质粒命名为IC 339-222。编码绿草履虫小球藻病毒1的具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的合成核酸序列显示于SEQ ID NO 13。最初分离自绿草履虫小球藻病毒1的相应的核酸序列显示于SEQ ID NO 11。

6.植物表达载体IR 47-71的制备

质粒pBinAR是二元载体质粒pBin19(Bevan，1984，Nucl Acids Res 12：8711-8721)的衍生物，其按如下构建：从质粒pDH51(Pietrzak et al，1986Nucleic Acids Res.14，5858)中将包含花椰菜花叶病毒35S启动子的核苷酸6909-7437的529bp片段以EcoR I/Kpn I片段形式分离，并连接在pUC18的多接头的EcoR I和Kpn I限制性位点之间。这得到质粒pUC18-35S。借助于限制性内切酶Hind III和Pvu II，从质粒pAGV40(Herrera-Estrellaet al，1983 Nature，303，209-213)中将包含Ti质粒pTiACH5(Gielen et al，1984，EMBO Journal 3，835-846)的T-DNA章鱼碱合酶基因(Gen3)多聚腺苷酸化信号(3’端)(核苷酸11749-11939)的192bp片段分离出来。向Pvu II限制性位点添加Sph I接头后，该片段被连接在pUC18-35S的SphI和Hind III限制性位点之间。这得到质粒pA7。用EcoR I和Hind III从该质粒切下包含35S启动子和OCS终止子的整个多接头，并连接进适当切割的载体pBin19中。这得到植物表达载体pBinAR(Hofgen andWillmitzer，1990，Plant Science 66，221-230)。

来自马铃薯的Patatin基因B33的启动子(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J.8，23-29)作为Dra I片段(核苷酸-1512至+14)被连接进载体pUC19中，所述载体pUC19已用Sst I切割并借助于T4-DNA聚合酶将末端补平。这得到质粒pUC19-B33。使用EcoR I和Sma I将B33启动子从该质粒切下并连接进适当切割的载体pBinAR中。这得到植物表达载体pBinB33。为了利于进一步的克隆步骤，扩宽MCS(多克隆位点)。为此，合成两个互补的寡核苷酸，在95℃加热5分钟并缓慢冷却至室温，将获得的双链片段克隆进pBinB33的Sal I和Kpn I限制性位点中。用于该目的的寡核苷酸具有以下序列：

5′-TCG ACA GGC CTG GAT CCT TAA TTA AAC TAG TCT CGAGGA GCT CGG TAC-3′

5′-CGA GCT CCT CGA GAC TAG TTT AAT TAA GGA TCC AGGCCT G-3′

获得的质粒命名为IR 47-71。

7.制备植物表达载体pBinARHyg

使用限制性内切酶EcoR I和Hind III将包含35S启动子、OCS终止子和整个多克隆位点的片段从质粒pA7上切下，并克隆进载体pBIBHyg(Becker，1990，Nucleic Acids Res.18，203)中，所述载体pBIBHyg已经用相同的限制性内切酶切割。获得的质粒命名为pBinARHyg。

8.制备克隆载体IC 317-204

使用限制性内切酶Xho I和Hind III将包含OCS终止子的核酸片段从质粒IR 47-71上分离，并克隆进载体pBlueScript KS(来自Stratagene，Prod.No.212207)中，所述载体pBlueScript KS已用相同的限制性内切酶切割。获得的质粒称作IC 306-204。

使用限制性内切酶Bam HI和EcoR I将包含B33启动子的核酸片段从质粒IR 47-71上分离，并克隆进载体pBlueScript KS(来自Stratagene，Prod.No.212207)中，所述载体pBlueScript KS已用相同的限制性内切酶切割。获得的质粒称作IC 314-204。

使用限制性内切酶Bam HI将OCS终止子从IC 306-204中分离并克隆进质粒IC 314-204中，所述质粒IC 314-204已用相同的限制性内切酶切割。获得的质粒称作IC 317-204。

9.制备植物表达载体IC 341-222，所述载体包含编码绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合酶的核酸序列

通过用BamH I和Xho I的限制性消化，将包含乙酰透明质酸合酶编码序列的核酸分子从质粒IC 323-215中分离并克隆进质粒IR 47-71的BamH I和Xho I限制性位点中。获得的植物表达载体命名为IC 341-222。

10.制备包含编码蛋白质的核酸序列的植物表达载体349-222，所述蛋白质来自绿草履虫小球藻病毒1并具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性

通过使用BamH I和Kpn I的限制性消化，将包含蛋白质(所述蛋白质来自绿草履虫小球藻病毒1、具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性)编码序列的核酸分子从质粒IC 339-222中分离，并克隆进质粒pA7中，所述质粒pA7已经用相同的限制性内切酶切割。获得的质粒命名为IC 342-222。

通过使用Xba I和Kpn I的限制性消化，将包含蛋白质(所述蛋白质来自绿草履虫小球藻病毒1、具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性)编码序列的核酸分子从质粒IC 342-222中分离，并克隆进表达载体pBinAR Hyg中，所述载体pBinAR Hyg已用Xba I和Kpn I切割。获得的质粒命名为IC349-222。

11.制备包含编码来自小鼠的具有GFAT-1活性的蛋白质的核酸序列和编码来自绿草履虫小球藻病毒1的具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列的植物表达载体IC 376-271

将包含B33启动子和OCS终止子的核酸片段(所述片段已经使用EcoR I的限制性消化从IC 317-204中分离)克隆进质粒IC 349-222的EcoRI限制性位点中。此处，确保启动子(25S和B33)的头对头(head-to-head)方向。获得的载体命名为IC 354-222。

为了获得包含编码来自小鼠的具有GFAT-1活性的蛋白质的核酸序列的植物表达载体，通过用Xho I和Eco RV的限制性消化从IC 365-256中分离蛋白质(其来自小鼠、具有GFAT-1活性)的编码序列并克隆进质粒IC 354-222中，所述质粒IC 354-222已用Xho I和Ecl136 II切割。获得的植物表达载体命名为IC 376-256。

12.制备包含编码来自小鼠的具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸序列和编码来自绿草履虫小球藻病毒1的具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列的植物表达载体IC 372-256

通过使用Xho I和Eco RV的限制性消化从IC 369-256中分离包含蛋白质(其来自小鼠、具有GFAT-2活性)编码序列的核酸片段，并克隆进质粒IC 354-222中，所述质粒IC 354-222已用Xho I和Ecl136 II切割。获得的植物表达载体称作IC 372-256。

13.制备植物表达载体375-271，所述载体包含编码来自大肠杆菌的具有GFAT活性的蛋白质的核酸序列，和编码来自绿草履虫小球藻病毒1的具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列

通过使用Xho I和Eco RV的限制性消化从IC 373-256分离包含蛋白质(来自大肠杆菌、具有GFAT的活性)的编码序列的核酸片段，并克隆进质粒IC 354-222中，所述质粒IC 354-222已用Xho I和Ecl136 II切割。获得的植物表达载体命名为IC 375-271。

14.制备植物表达载体IC 398-311，所述载体包含编码来自大肠杆菌的具有GFAT活性的蛋白质的核酸序列

通过使用Ecl136 I和Xho I的限制性消化，从质粒IC 373-256分离蛋白质(来自大肠杆菌的具有细菌GFAT活性的蛋白质)的编码序列，并连接进载体pBinAR Hyg的Sma I和Sal I限制性位点中。获得的植物表达载体命名为IC 398-311。

15.制备植物表达载体IC 386-299

通过PCR，使用DNA聚合酶(Expand High Fidelity PCR Systems，Roche Prod.No.：1732641)以及分离自稻(Oryza sativa，栽培品种M202)叶的基因组DNA，分离稻的谷醇溶蛋白启动子的DNA(EMBL登录号D63901，Sha等，1996，Biosci.Biotech.Biochem.60，335-337，Wu等，1998，Plant Cell Physiol.39(8)，885-889)。使用TA克隆试剂盒(Invitrogen Prod.No.：KNM2040-01)将从该PCR反应获得的扩增子克隆进载体pCR 2.1中。获得的质粒命名为MI 4-154。

用于扩增编码谷醇溶蛋白启动子的DNA的条件：

使用制造商描述的条件和缓冲液和50ng的总DNA。

0.83μM dNTP混合物

0.25μM引物prol-F1

5′-AAAAACTAGTTCTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACG

0.25μM引物prol-R1

5′-AAAAGATATCTGTTGTTGGATTCTACTACTATGCTTCAA

反应条件：

步骤1 94℃15秒

步骤2 60℃15秒

步骤3 72℃45秒

首先使用35次重复(循环)进行根据步骤1到3的反应。反应结束后，将反应混合物冷却至4℃。然后根据制造商陈述的条件使用TA克隆试剂盒(Invitrogen Prod.No.：KNM2040-01)克隆进载体pCR 2.1中。包含来自稻的谷醇溶蛋白启动子的质粒命名为MI 4-154。

通过使用限制性内切酶Not I和Kpn I的限制性消化，从质粒IC369-256中分离包含来自小鼠的具有GFAT-2活性的蛋白质的编码序列的核酸片段，并克隆进载体pMCS5(购自MoBiTec)中，所述载体pMCS5已用Not I和Kpn I消化。获得的质粒命名为IC 385-299。在下一步骤中，通过使用限制性内切酶Xho I和Hpa I的限制性消化，从IC 385-299中分离包含来自小鼠的具有GFAT-2活性的蛋白质的编码序列的核酸片段，并克隆进质粒MI 9-154中，所述质粒MI 9-154已用Xho I和Ecl136 II切割。获得的植物表达载体命名为IC 386-299。用于制备载体MI 9-154的起始载体为质粒ML 18-56(WO 05/030941)。将MCS引入用Hind III和Pst I消化的质粒ML 18-56中，所述MCS由两个寡核苷酸合成并具有适当的粘性末端和包含限制性位点Pst I、Sac I、Bln I、Xho I、Hpa I、Spe I和HindIII。获得的载体命名为MI 8-154。

通过使用Eco RV和Spe I的消化从MI 4-154分离谷醇溶蛋白启动子，并连接进载体MI 8-154中，所述载体MI 8-154已用Hpa I和Spe I消化。获得的载体命名为MI 9-154。

16.包含编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子的马铃薯植物

a)转化马铃薯植物

通过一般方法第1条中给出的方法，使用植物表达载体IC 398-311转化马铃薯植物(栽培品种Desiree)，所述表达载体含有位于马铃薯patatin基因B33启动子(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J.8，23-29)调控下的核酸序列，所述核酸序列编码来自大肠杆菌的具有细菌GFAT活性的蛋白质。获得的被质粒IC 398-311转化了的转基因株系命名为432 ES。

b)分析株系432 ES

在温室中6cm盆中的土壤里栽培株系432 ES的植物。在每种情况下，根据一般方法第4条中所述方法加工从不同植物收集的约0.3g到约0.8g叶材料，并测定N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。对于具有提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量的各个体植物而言，获得以下结果：

表1：在株系432 ES的独立转基因植物的叶中测量的N-乙酰化葡糖胺衍生物量(以μmol每克鲜重计)。在每一情况下第1列是指独立地从转化获得的植物，所述材料从该植物收获(″wt″是指未转化的植物)。

这些结果显示，具有外源核酸分子(其编码具有细菌GFAT活性的蛋白质)的植物与相应未转化的野生型植物相比，具有显著更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

17.包含编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸分子的稻植物

a)稻植物的转化

根据一般方法第3条给出的方法，用植物表达载体IC 386-299转化稻植物(变种M202)，所述表达载体IC 386-299包含位于13kDa谷醇溶蛋白多肽启动子调控下的编码核酸序列，所述核酸序列编码来自小鼠的具有GFAT-2活性的蛋白质。获得的被质粒IC 386-299转化了的转基因株系命名为GAOS0788。

b)分析株系GAOS0788

在温室土壤里栽培株系GAOS0788的独立植物，所述独立植物得自使用质粒IC 386-299的转化。从每株植物收集约20-25个成熟种子(谷粒)，用砻谷机(Laboratory Paddy sheller，Grainman，Miami，Florida，USA)去除谷壳并将每株约7颗棕色稻种(合并物)在实验室振动球磨机(MM200，来自Retsch，Germany，30Hz运行30秒)中粉碎，得到面粉。然后使用一般方法第4条所述方法测定N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。对于具有提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量的各个体植物而言，获得以下结果：

表2：在株系GAOS0788的独立转基因植物的成熟种子合并物中测量的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量(以μmol每克鲜重计)。第1列是指独立地从转化获得的植物，所述材料从该植物中收集(此处″对照″是指用不含下述核酸分子的质粒转化的植物，所述核酸分子编码具有GFAT活性的蛋白质)。不能检测到的量标记为″n.d.″。

c)分析植物GAOS0788-02401和GAOS0788-00501的单个种子

在实施例b)中收集的种子来自转化后直接获得的植物，所述植物因此就相应的所述T-DNA的整合位点而言是杂合的。因此，作为盂德尔遗传定律的结果，所分析的种子合并物含有包含不同的所述T-DNA含量的种子，各合并物中也有可能存在不含有任何通过转化整合的T-DNA的单个种子。因此，通过一般方法第4条所述方法检查单个、个体棕色种子的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量，所述种子来自株系GAOS0788-02401的植物和株系GAOS0788-00501的植物。获得以下结果：

样品	μmol/g FW
样品	μmol/g FW	GAOS0788-02401种子1	n.d
GAOS0788-02401种子2	22.41	GAOS0788-02401种子1	n.d
GAOS0788-02401种子2	22.41	GAOS0788-02401种子3	38.47
GAOS0788-02401种子4	16.57	GAOS0788-02401种子3	38.47
GAOS0788-02401种子4	16.57	GAOS0788-02401种子5	17.67
GAOS0788-02401种子6	3.79	GAOS0788-02401种子5	17.67
GAOS0788-02401种子6	3.79	GAOS0788-02401种子7	10.14
GAOS0788-02401种子8	18.70	GAOS0788-02401种子7	10.14
GAOS0788-02401种子8	18.70	GAOS0788-00501种子1	n.d
GAOS0788-00501种子2	17.20	GAOS0788-00501种子1	n.d
GAOS0788-00501种子2	17.20	GAOS0788-00501种子3	19.89
GAOS0788-00501种子4	15.47	GAOS0788-00501种子3	19.89
GAOS0788-00501种子4	15.47	GAOS0788-00501种子5	9.31
GAOS0788-00501种子6	20.88	GAOS0788-00501种子5	9.31
GAOS0788-00501种子6	20.88	GAOS0788-00501种子7	25.31
GAOS0788-00501种子8	31.92	GAOS0788-00501种子7	25.31
GAOS0788-00501种子8	31.92	GAOS0788-00501种子9	28.82
GAOS0788-00501种子10	43.35	GAOS0788-00501种子9	28.82
GAOS0788-00501种子10	43.35	对照种子1	n.d
对照种子2	n.d	对照种子1	n.d
对照种子2	n.d	对照种子3	n.d
对照种子4	n.d	对照种子3	n.d

表3：来自株系GAOS0788-02401和GAOS0788-00501的植物的单个种子的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量(以μmol每克鲜重计)。在每种情况下，第1列是指独立地从转化获得的植物，所述单个种子从该植物中收集并分析(此处″对照″是指用不含下述核酸分子的构建体转化的植物，所述核酸分子编码具有GFAT活性的蛋白质)。不能检测到的量标记为″n.d.″。

获得的结果显示，来自含有编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸分子的稻植物种子(谷粒)的面粉，与得自不含有编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸分子的植物的面粉相比，具有显著更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

18.N-乙酰化的葡糖胺衍生物在用编码具有GFAT活性的不同同种型蛋白质的核酸分子转化的番茄植物中的合成

a)生产包含外源核酸分子的番茄植物，所述外源核酸分子编码具有GFAT-1活性的蛋白质

通过一般方法第2条给出的方法，用植物表达载体IC 376-271转化番茄植物(栽培品种Moneymaker)，所述表达载体IC 376-271含有编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列和编码具有GFAT-1活性的蛋白质的外源核酸序列。获得的被质粒376-271转化了的转基因株系命名为420ES。具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质催化从UDP-葡萄糖合成UDP-GlcA。除了GlcNAc外，一些糖胺聚糖合酶(例如乙酰透明质酸合酶)还需要UDP-GlcA作为底物。

b)分析株系420 ES

在温室以水培法盆栽株系420 ES的植物。在每种情况下使用一般方法第4条描述的方法加工收集自各单个植物的约5g植物材料，并测定N-乙酰化的葡糖胺衍生物的含量。此处对每株植物而言，对每个经加工的样品进行多次独立的测量。对于各单个植物获得以下结果：

表4：在株系420 ES的独立转基因植物的叶中测量的N-乙酰化的葡糖胺衍生物量(以μmol每克鲜重计)。第1列是指独立地从转化获得的植物，所述材料从该植物中收集(此处″wt″是指未转化的植物)。用a、b或c对植物名称的扩展表示对所述经加工样品进行的独立测量。不能检测到的量标记为″n.d.″。

这些结果显示具有编码具有GFAT-1活性的蛋白质和编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的外源核酸分子的植物，与相应未转化的野生型植物相比，具有稍微更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

c)生产包含外源核酸分子的番茄植物，所述外源核酸分子编码具有GFAT-2活性的蛋白质

通过一般方法第2条给出的方法，用植物表达载体IC 372-256转化番茄植物(栽培品种Moneymaker)，所述表达载体IC 372-256含有编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列和编码具有GFAT-2活性的蛋白质的外源核酸分子。获得的被质粒IC 372-256转化了转基因株系命名为421 ES。

d)分析株系421 ES

在温室中以水培法盆栽株系421 ES的植物。在每种情况下使用一般方法第4条描述的方法加工收集自各单个植物的约5g植物材料，并测定N-乙酰化的葡糖胺衍生物的含量。此处对每株植物而言，对每个经加工的样品进行多次独立的测量。对于各单个植物获得以下结果：

表5：在株系421 ES的独立转基因植物叶中测量的N-乙酰化的葡糖胺衍生物量(以μmol每克鲜重计)。第1列是指独立地从转化获得的植物，所述材料从该植物中收集(此处，″wt″是指未转化的植物)。用a、b或c扩展的植物名称表示对所述经加工样品进行的独立测量。不能检测到的量标记为″n.d.″。

这些结果显示，具有编码具有GFAT-2活性的蛋白质和编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的外源核酸分子的植物，与相应未转化的野生型植物相比，具有显著更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

e)生产包含外源核酸分子的番茄植物，所述外源核酸分子编码具有细菌GFAT活性的蛋白质

通过一般方法第2条给出的方法，用植物表达载体IC 375-271转化番茄植物(栽培品种Moneymaker)，所述表达载体IC 375-271含有编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的核酸序列和编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子。获得的被质粒IC 375-271转化了的转基因株系命名为422 ES。

f)分析株系422 ES

在温室中以水培法盆栽株系422 ES的植物。在每种情况下使用一般方法第4条描述的方法加工收集自各单个植物的约5g植物材料，并测定N-乙酰化的葡糖胺衍生物的含量。此处对每株植物而言，对每个经加工的样品进行多次独立的测量。对于各单个植物获得以下结果：

表6：在株系422 ES的独立转基因植物叶中测量的N-乙酰化的葡糖胺衍生物量(以μmol每克鲜重计)。第1列是指独立地从转化获得的植物，所述材料从该植物中收集(此处，″wt″是指未转化的植物)。用a、b或c扩展的植物名称表示对所述经加工样品进行的独立测量。不能检测到的量标记为″n.d.″。

g)分析株系420 ES、421 ES和422 ES的果实

从株系420 ES、421 ES和422 ES的选定植物收获成熟果实。收集单个植物的多个完整番茄果实并使用一般方法第4条所述方法加工，并测定N-乙酰化的葡糖胺衍生物的含量。此处对一株植物的不同果实进行独立的测量。对于各单个植物获得以下结果：

表7：在株系420 ES、421 ES和422 ES的独立转基因植物的果实中测量的N-乙酰化的葡糖胺衍生物量(以μmol每克鲜重计)。第1列是指独立地从转化获得的植物，所述材料从该植物中收集(此处，″wt″是指未转化的植物)。用拉丁数字扩展的植物名称表示所述植物的不同果实。不能检测到的量标记为″n.d.″。

这些结果显示具有编码具有细菌GFAT活性的蛋白质和编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的外源核酸分子的植物，与相应未转化的野生型植物相比，具有显著更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。与具有编码具有GFAT-1活性的蛋白质和编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的外源核酸分子的植物相比，包含编码具有GFAT-2活性的蛋白质和编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的外源核酸分子的植物具有甚至更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。这对于所述植物的叶材料和果实均是正确的。

h)通过质谱法分析株系422 ES的N-乙酰化的葡糖胺衍生物

根据一般方法第9条所述方法，通过质谱法检查名为422 ES 13的植物的单个不同果实的提取物，以检查N-乙酰化的葡糖胺衍生物的存在。得到以下结果：

表8：通过质谱法在植物422 ES 13的果实中检测代谢物葡糖胺(GlcN)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡糖胺磷酸(GlcN-P)、N-乙酰葡糖胺磷酸(GlcNAc-P)和UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)。所显示的是在质谱中获得的所述代谢物的信号强度(峰面积)以相同测量中针对己糖(m/z＝179)获得的信号强度为基础的比例，用百分比表示。在有关灵敏度(″d.v.″)和信号强度(″cps″)的所述检测器设定下进行不同的测量(第1列)。第2列表示独立地从转化获得的植物，所述材料从该植物中收集(此处，″wt″是指未转化的植物)。用拉丁数字扩展的植物名称表示所述植物的不同果实。

平行地，使用参照物质(葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、葡糖胺6-磷酸、葡糖胺1-磷酸、N-乙酰葡糖胺6-磷酸、N-乙酰葡糖胺1-磷酸、UDP-N-乙酰葡糖胺)，通过MS-MS测量样品422 ES 13I和野生型植物(wt)的果实，分析了MS谱中所述检测到的信号强度(峰面积)是真正由相应代谢物或具有相同质量的相应同分异构代谢物的存在所致，还是MS谱中所述的信号强度可能是由其它物质的信号造成的干扰所致。得到以下观察结果：

葡糖胺(GlcN，m/z＝178)：样品422 ES 13I和wt的MS谱中探测到的最高GlcN含量在较低的检出限范围内。在MS谱中，样品422 ES 13I和wt样品之间没有观察到显著差异。因此，不可能在任何程度上肯定地确定样品是否含有GlcN。

N-乙酰葡糖胺(GlcNAc，m/z＝220)：对该代谢物发现样品422 ES 13和wt样品的MS谱之间最为显著的差异。在样品422 ES 13I、422 ES 13II和422 ES 13III的MS谱中，检测到相当大量的GlcNAc。样品422 ES 13I的相应MS-MS谱对应于参照物质(N-乙酰葡糖胺)的谱，并且如果有的话也仅具有非常小量可能在该MS谱中干扰有关信号的物质。相反，在wt样品的MS谱中，m/z＝220的信号强度非常低。Wt样品的MS-MS谱显示，GlcNAc如果有的话也仅以痕量存在。该MS-MS谱非常清晰地表明在该MS谱中针对wt样品中的m/z＝220测定到的信号强度是主要由干扰该信号的其它物质导致的结果。

葡糖胺磷酸(GlcN-P，m/z＝258)：wt样品MS谱的信号强度显著低于样品422 ES 13I、422 ES 13II和422 ES 13III的。通过MS-MS测量的所有样品显示m/z＝258的信号是由GlcN-P的存在以及其它物质对该信号的干扰共同导致的。Wt样品的MS-MS谱显示GlcN-P如果有的话仅以痕量存在。相反，MS-MS谱中样品422 ES 13I的相应信号显示在MS谱的有关信号中存在显著量的GlcN-P。

N-乙酰葡糖胺磷酸(GlcNAc-P，m/z＝300)：对wt样品而言，MS谱中m/z＝300的信号强度显著低于样品422 ES 13I、422 ES 13II和422 ES 13III的。对于wt样品通过MS-MS确定的值显示GlcNAc-P如果有的话仅以痕量存在。相反，对样品422 ES 13I而言，可以通过MS-MS测量证明，对于在该样品的MS谱中针对m/z＝300测定到的信号强度，其主要部分是GlcNAc-P导致的。

UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc，m/z＝302.5)：在野生型中，MS谱的信号强度显著低于样品422 ES 13I、422 ES 13II和422 ES 13III中的。相应的MS-MS谱显示，在所有的样品中，MS谱信号强度的某一部分不仅归因于UDP-GlcNAc的存在，而且归因于其它物质的信号干扰。然而，MS-MS测量显示，与信号干扰物质相比，样品422 ES 13I的MS谱中UDP-GlcNAc的比例显著高于wt样品中的。

19.制造合成糖胺聚糖的植物

为了确定具有提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量的植物是否适用于生产具有提高的糖胺聚糖含量的植物，首先产生表达糖胺聚糖合酶(乙酰透明质酸合酶)的植物。

a)包含编码具有乙酰透明质酸合酶活性的蛋白质的核酸分子的植物

分别使用一般方法第1条给出的方法(马铃薯植物)和一般方法第2条给出的方法(番茄植物)，用植物表达载体IC 341-222转化马铃薯植物(栽培品种Desiree)和番茄植物(栽培品种Moneymaker)，所述植物表达载体IC 341-222包含位于马铃薯patatin基因B33启动子(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J.8，23-29)调控下的编码核酸序列，所述核酸序列编码来自绿草履虫小球藻病毒1的具有乙酰透明质酸合酶活性的蛋白质。获得的被质粒IC 341-222转化了的转基因株系分别命名为365 ES(马铃薯植物)和367 ES(番茄植物)。

b)分析株系365 ES

在温室中6cm盆里土壤栽培株系365 ES的单个植物。在每种情况下使用一般方法第5条描述的方法加工各单个植物的约0.3g马铃薯块茎植物材料。

使用一般方法第7条描述的方法测定相应植物提取物中存在的乙酰透明质酸量。此处将离心后获得的上清液1∶10稀释以测定乙酰透明质酸含量。对于所选的植物获得以下结果：

植物	乙酰透明质酸[μg/g FW]
植物	乙酰透明质酸[μg/g FW]	365 ES 13	47
365 ES 74	68	365 ES 13	47
365 ES 74	68	wt	n.d.

表9：由株系365 ES的独立的选定转基因植物产生的乙酰透明质酸含量(以μg每克鲜重计)。第1列是指块茎材料所收获自的植物(此处″wt″是指未转化的植物)。第2列显示在所述植物的叶中测定到的乙酰透明质酸量的值。不能检测到的量标记为″n.d.″。

c)分析株系367 ES的植物

在每种情况下从株系367 ES的不同的选定的番茄植物中收集1片叶并冻于液氮中，所述株系的番茄植物已在温室中栽培于土壤中。如实施例19b)针对马铃薯植物块茎所述的方法进行其它加工和乙酰透明质酸含量的测定。得到以下结果：

植物	乙酰透明质酸[μg/g FW]
植物	乙酰透明质酸[μg/g FW]	367 ES 25	57.19
367 ES 42	88.99	367 ES 25	57.19
367 ES 42	88.99	wt	0.06

表10：株系367 ES的独立的选定转基因植物的叶中生产的乙酰透明质酸量(以μg每克鲜重计)。第1列是指叶材料所收获自的植物(此处″wt″是指未转化的植物)。第2列显示在所述植物的叶中测定的乙酰透明质酸量的值。

20.包含编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的外源核酸分子和编码具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质的核酸分子的植物

一些糖胺聚糖合酶(例如乙酰透明质酸合酶)需要N-乙酰化的葡糖胺衍生物和UDP-GlcA作为底物。因此，我们首先产生下述植物，所述植物具有提高的蛋白质——具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质——的活性和提高的蛋白质——具有乙酰透明质酸合酶活性的蛋白质——的活性。

a)生产马铃薯植物

使用一般方法第1条中给出的方法，使用植物表达载体IC 349-222转化株系365 ES 74(参阅实施例19b))的马铃薯植物，所述表达载体IC349-222含有位于35S启动子调控下的编码核酸序列，所述核酸序列编码具有UDP葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。获得的被质粒IC 349-222转化了的转基因株系命名为423 ES。

b)分析423 ES株系的植物

在温室中6cm盆里土壤栽培株系423 ES的植物。在每种情况下用一般方法第5条所述方法处理从各单个植物收集的约0.3g到0.8g叶材料，并使用一般方法第7条描述的方法测定乙酰透明质酸含量。对于具有提高的N-乙酰葡糖胺衍生物含量的各单个植物而言，获得以下结果：

表11：在株系423 ES的独立转基因植物的叶中测量的乙酰透明质酸量(以μmol每克鲜重计)。第1列在每种情况下是指独立地从转化获得的植物，所述材料从该植物中收集(此处，″wt1″至″wt10″是指独立的未转化的植物)。为了比较，显示了用作转化起始株系的株系365 ES植物的10个不同后代(365 ES-1到365 ES-10)的值。不能检测到的量标记为″n.d.″。

由这些结果可以看出，包含编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的外源核酸分子和编码具有乙酰透明质酸合酶活性的蛋白质的核酸分子的植物，与仅具有编码具有乙酰透明质酸合酶活性的蛋白质的核酸分子的植物相比，并未合成任何统计学上显著提高的乙酰透明质酸量。

21.合成提高量的糖胺聚糖的植物

a)生产合成提高量的糖胺聚糖的番茄植物

使用一般方法第2条给出的方法用植物表达载体IC 372-256或IC375-271再次转化含有编码乙酰透明质酸合酶的核酸分子的株系367 ES 25的番茄植物(参阅实施例19c))，所述植物表达载体IC 372-256或IC375-271包含编码具有GFAT活性的蛋白质的不同同种型的核酸分子。

转化株系367 ES 25后获得的具有质粒IC 372-256(GFAT-2)的转基因番茄植物命名为399 ES。

转化株系367 ES 25后获得的具有质粒IC 375-271(细菌GFAT)的转基因番茄植物命名为405 ES。

b)分析株系399 ES和405 ES

从温室中土壤栽培的株系399 ES和405 ES的不同番茄植物收获成熟果实，并如一般方法第7条所述测定乙酰透明质酸含量。得到以下结果：

表12：在株系399 ES和405 ES的独立转基因植物的果实中测量的乙酰透明质酸量(“HA”以μmol每克鲜重计)。第1列是指材料所收获自的植物，所述植物为独立地从转化获得的植物(此处，″wt″是指未转化的植物)。为了比较，显示了用作转化起始株系的株系367 ES植物的不同后代的值。拉丁文数字扩增的植物名表示所述植物的不同果实。不能检测到的量标记为″n.d.″。

这些结果显示，包含编码糖胺聚糖合酶、编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质、和编码具有GFAT-2或细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子的植物，与仅具有编码糖胺聚糖合酶的外源核酸分子的植物相比，合成显著更高量的糖胺聚糖。

c)生产合成提高量的糖胺聚糖的马铃薯植物

使用一般方法第1条给出的方法用植物表达载体IC 376-271、IC372-256或IC 375-271再次转化含有编码乙酰透明质酸合酶的核酸分子的株系365ES 74的马铃薯植物(参阅实施例19b))，所述植物表达载体IC376-271、IC 372-256或IC 375-271包含编码具有GFAT活性的蛋白质的不同同种型的核酸分子。

用质粒IC 376-271(GFAT-1)转化株系365 ES 74后获得的转基因马铃薯植物命名为409 ES。

用质粒IC 372-256(GFAT-2)转化株系365 ES 74后获得的转基因马铃薯植物命名为396 ES。

用质粒IC 375-271(细菌GFAT)转化株系365 ES 74后获得的转基因马铃薯植物命名为404 ES。

d)分析株系396 ES、404 ES和409 ES

从温室土壤中栽培的株系396 ES(GFAT-2)、404 ES(细菌GFAT)和409 ES(GFAT-1)的不同马铃薯植物收获叶和/或块茎材料，并如一般方法第7条所述测定乙酰透明质酸含量。对于株系409 ES的植物得到以下结果：

表13：在株系409 ES的独立转基因植物的叶和块茎中测量的乙酰透明质酸量(”HA”以μg每克鲜重计)。第1列是指材料所收获自的植物，所述植物是独立地从转化产生的植物(此处，″wt″是指未转化的植物)。为了比较，显示了用作转化起始株系的株系365 ES 74植物的不同后代的值。不能检测到的量标记为″n.d.″。

对于株系396 ES的植物获得以下结果：

表14：在株系396 ES的独立转基因植物的叶和块茎中测量的乙酰透明质酸量(”HA”以μg每克鲜重计)。第1列是指材料所收获自的植物，该植物是独立地从转化产生的植物(此处，″wt″是指未转化的植物)。为了比较，显示了用作转化起始株系的株系365 ES 74植物的不同后代的值。对于404 ES的植物获得以下结果：

表15：在株系404 ES的独立转基因植物的叶中测量的乙酰透明质酸量(”HA”以μg每克鲜重计)。第1列是指材料所收获自的植物，该植物是独立地从转化产生的植物(此处，″wt″是指未转化的植物)。为了比较，显示了用作转化起始株系的株系365 ES 74植物的不同后代的值。

这些结果显示，包含编码糖胺聚糖合酶、和编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质、和编码具有GFAT-2或细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子的植物，与包含编码糖胺聚糖合酶、和编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质、和编码具有GFAT-1活性的蛋白质的外源核酸分子的植物相比，合成显著更高量的糖胺聚糖。

e)生产包含编码乙酰透明质酸合酶和具有细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子的植物

使用一般方法第1条给出的方法，用植物表达载体IC 398-311再次转化包含编码乙酰透明质酸合酶的核酸分子的株系365 ES 74的马铃薯植物(参阅实施例19b))，所述植物表达载体IC 398-311包含编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子。来自该转化的株系命名为433 ES。

f)分析株系433 ES

从温室土壤栽培的株系433 ES的不同马铃薯植物收获叶和/或块茎材料，并如一般方法第7条所述测定乙酰透明质酸含量。对于株系433 ES的植物得到以下结果：

表16：在株系433 ES的独立转基因植物的叶和块茎中测量的乙酰透明质酸量(”HA”以μg每克鲜重计)。第1列是指材料所收获自的植物，该植物是独立地从转化产生的植物(此处，″wt″是指未转化的植物)。为了比较，显示了用作转化起始株系的株系365 ES 74植物的不同后代的值。株系365 ES 74的值对应于表14中的值，因为所有的植物在温室中同时栽培。

这些结果显示，包含编码糖胺聚糖合酶和编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子的植物，与仅具有编码糖胺聚糖合酶的外源核酸分子的植物相比，合成显著更高量的糖胺聚糖。

22.结果总结

实施例16中的结果显示，包含编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的核酸分子的植物与未转化的野生型植物相比，具有显著提高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

实施例17中的结果显示，包含编码具有GFAT-2活性的蛋白质的核酸分子的植物与未转化的野生型植物相比，具有显著更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

实施例18中描述的所有转化的植物，除了具有编码具有GFAT活性的蛋白质的不同同种型的核酸分子外，在每种情况下还具有相同的编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的核酸分子。因此，实施例18中描述的转化植物的实质性差异在于编码具有GFAT活性的蛋白质的不同同种型的不同外源核酸分子。实施例18b)显示，在具有编码具有GFAT-1活性的蛋白质的外源核酸分子的植物中，N-乙酰化的葡糖胺衍生物的含量与未转化的植物相比仅稍微提高。

而且，从实施例18d)可以看出，包含编码具有GFAT-2活性的蛋白质的外源核酸分子的植物与未转化的野生型植物相比，具有显著更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。在具有编码具有GFAT-2活性的蛋白质的外源核酸分子的植物中，N-乙酰化的葡糖胺衍生物的含量也显著高于具有编码具有GFAT-1活性的蛋白质的外源核酸分子的植物中的含量。

另外，从实施例18f)和g)可以看出，包含编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子的植物具有甚至比包含编码具有GFAT-2活性的蛋白质的外源核酸分子的植物更高的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

实施例21f)的结果显示，包含编码糖胺聚糖合酶及编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子的植物，比仅具有编码糖胺聚糖合酶的外源核酸分子的植物，合成显著更高量的糖胺聚糖。

因此可得出结论：植物中合成的糖胺聚糖的量可以通过产生下述植物而被显著地提高，所述植物除了包含编码糖胺聚糖合酶的外源核酸分子外，还包含编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子。

其结果显示于实施例21b)和d)中的所有转化植物，除了具有编码具有GFAT活性的蛋白质的不同同种型的核酸分子外，还具有编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的外源核酸分子和编码糖胺聚糖合酶的外源核酸分子。因此，其结果显示于实施例21b)和d)中的转化植物之间的实质上的差异在于：编码具有GFAT活性的蛋白质的不同同种型的不同核酸分子。

实施例21b)中所示的结果显示，与仅具有糖胺聚糖合酶活性的植物相比，在具有编码具有GFAT-2活性的蛋白质或编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子的植物中，糖胺聚糖含量显著提高。

实施例21d)中所示的结果显示，与仅具有糖胺聚糖合酶活性的植物相比，包含编码具有GFAT-1活性的蛋白质的外源核酸分子的植物含有稍微更高的糖胺聚糖量。相反，在包含编码具有GFAT-2活性的蛋白质的外源核酸分子的植物中，糖胺聚糖的含量显著高于在具有编码具有GFAT-1活性的蛋白质的外源核酸分子的植物中的含量。而且，从实施例21d)可以看出，包含编码具有细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子的单个植物，含有甚至比具有编码具有GFAT-2活性的蛋白质的外源核酸分子的植物更高的糖胺聚糖量。

实施例20b)的结果显示，包含编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的外源核酸分子和编码具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质的核酸分子的植物，与仅包含编码具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质的外源核酸分子的植物相比，并未具有统计学上显著提高的糖胺聚糖量。

总而言之，所示结果指出，在包含编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质、和编码具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质、和编码具有GFAT-2活性或具有细菌GFAT活性的蛋白质的外源核酸分子的植物中，糖胺聚糖量的显著提高不是由于具有UDP葡萄糖脱氢酶活性的外源核酸分子的存在所致，而是由于具有GFAT-2活性或具有细菌GFAT活性的核酸分子的存在所致。

由于用作具有糖胺聚糖合酶活性的蛋白质的例子的乙酰透明质酸合酶需要UDP-GIc-NAc和UDP-GlcA二者作为底物，所以也可以从所示结果得出结论：提高的乙酰透明质酸(糖胺聚糖)量是由于这些植物中提高的N-乙酰化葡糖胺衍生物量而不是提高的UDP-GlcA量所致的。

序列表

<110>拜尔作物科学股份公司(Bayer CropScience GmbH)

<120>具有提高的氨基糖含量的植物

<130>BCS 06-5010 PCT

<150>EP05090279.0

<151>2005-10-05

<150>US60/725,388

<151>2005-10-11

<150>EP06090177.4

<151>2006-09-22

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1707

<212>DNA

<213>绿草履虫小球藻病毒1(Paramecium bursaria Chlorella Virus 1)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1707)

<300>

<308>PB42580

<309>1995-12-24

<313>(50903)..(52609)

<400>1

atg ggt aaa aat ata atc ata atg gtt tcg tgg tac acc atc ata act 48

Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr

1 5 10 15

tca aat cta atc gcg gtt gga gga gcc tct cta atc ttg gct ccg gca 96

Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala

20 25 30

att act ggg tat gtt cta cat tgg aat att gct ctc tcg aca atc tgg 144

Ile Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp

35 40 45

gga gta tca gct tat ggt att ttc gtt ttt ggg ttt ttc ctt gca caa 192

Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln

50 55 60

gtt tta ttt tca gaa ctg aac agg aaa cgt ctt cgc aag tgg att tct 240

Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser

65 70 75 80

ctc aga cct aag ggt tgg aat gat gtt cgt ttg gct gtg atc att gct 288

Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala

85 90 95

gga tat cgc gag gat cct tat atg ttc cag aag tgc ctc gag tct gta 336

Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser Val

100 105 110

cgt gac tct gat tat ggc aac gtt gcc cgt ctg att tgt gtg att gac 384

Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn Val Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp

115 120 125

ggt gat gag gac gat gat atg agg atg gct gcc gtt tac aag gcg atc 432

Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile

130 135 140

tac aat gat aat atc aag aag ccc gag ttt gtt ctg tgt gag tca gac 480

Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp

145 150 155 160

gac aag gaa ggt gaa cgc atc gac tct gat ttc tct cgc gac att tgt 528

Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys

165 170 175

gtc ctc cag cct cat cgt gga aaa cgg gag tgt ctt tat act ggg ttt 576

Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe

180 185 190

caa ctt gca aag atg gac ccc agt gtc aat gct gtc gtt etg att gac 624

Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser Val Asn Ala Val Val Leu Ile Asp

195 200 205

agc gat acc gtt ctc gag aag gat gct att ctg gaa gtt gta tac cca 672

Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro

210 215 220

ctt gca tgc gat ccc gag atc caa gcc gtt gca ggt gag tgt aag att 720

Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile

225 230 235 240

tgg aac aca gac act ctt ttg agt ctt ctc gtc gct tgg cgg tac tat 768

Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr

245 250 255

tct gcg ttt tgt gtg gag agg agt gcc cag tct ttt ttc agg act gtt 816

Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val

260 265 270

cag tgc gtt ggg ggg cca ctg ggt gcc tac aag att gat atc att aag 864

Gln Cys Val Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys Ile Asp Ile Ile Lys

275 280 285

gag att aag gac ccc tgg att tcc cag cgc ttt ctt ggt cag aag tgt 912

Glu Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys

290 295 300

act tac ggt gac gac cgc cgg cta acc aac gag atc ttg atg cgt ggt 960

Thr Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly

305 310 315 320

aaa aag gtt gtg ttc act cca ttt gct gtt ggt tgg tct gac agt ccg 1008

Lys Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala Val Gly Trp Ser Asp Ser Pro

325 330 335

acc aat gtg ttt cgg tac atc gtt cag cag acc cgc tgg agt aag tcg 1056

Thr Asn Val Phe Arg Tyr Ile Val Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser

340 345 350

tgg tgc cgc gaa att tgg tac acc ctc ttc gcc gcg tgg aag cac ggt 1104

Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly

355 360 365

ttg tct gga att tgg ctg gcc ttt gaa tgt ttg tat caa att aca tac 1152

Leu Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr

370 375 380

ttc ttc ctc gtg att tac ctc ttt tct cgc cta gcc gtt gag gcc gac 1200

Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp

385 390 395 400

cct cgc gcc cag aca gcc acg gtg att gtg agc acc acg gtt gca ttg 1248

Pro Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu

405 410 415

att aag tgt ggg tat ttt tca ttc cga gcc aag gat att cgg gcg ttt 1296

Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe

420 425 430

tac ttt gtg ctt tat aca ttt gtt tac ttt ttc tgt atg att ccg gcc 1344

Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala

435 440 445

agg att act gca atg atg acg ctt tgg gac att ggc tgg ggt act cgc 1392

Arg Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg

450 455 460

ggt gga aac gag aag cct tcc gtt ggc acc cgg gtc gct ctg tgg gca 1440

Gly Gly Asn Glu Lys Pro Ser Val Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala

465 470 475 480

aag caa tat ctc att gca tat atg tgg tgg gcc gcg gtt gtt ggc gct 1488

Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala

485 490 495

gga gtt tac agc atc gtc cat aac tgg atg ttc gat tgg aat tct ctt 1536

Gly Val Tyr Ser Ile Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu

500 505 510

tct tat cgt ttt gct ttg gtt ggt att tgt tct tac att gtt ttt att 1584

Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile

515 520 525

gtt att gtg ctg gtg gtt tat ttc acc ggc aaa att acg act tgg aat 1632

Val Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn

530 535 540

ttc acg aag ctt cag aag gag cta atc gag gat cgc gtt ctg tac gat 1680

Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp

545 550 555 560

gca act acc aat gct cag tct gtg tga 1707

Ala Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val

565

<210>2

<211>568

<212>PRT

<213>绿草履虫小球藻病毒1

<400>2

Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr

1 5 10 15

Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala

20 25 30

Ile Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp

35 40 45

Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln

50 55 60

Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser

65 70 75 80

Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala

85 90 95

Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser Val

100 105 110

Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn Val Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp

115 120 125

Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile

130 135 140

Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp

145 150 155 160

Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys

165 170 175

Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe

180 185 190

Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser Val Asn Ala Val Val Leu Ile Asp

195 200 205

Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro

210 215 220

Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile

225 230 235 240

Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr

245 250 255

Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val

260 265 270

Gln Cys Val Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys Ile Asp Ile Ile Lys

275 280 285

Glu Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys

290 295 300

Thr Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly

305 310 315 320

Lys Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala Val Gly Trp Ser Asp Ser Pro

325 330 335

Thr Asn Val Phe Arg Tyr Ile Val Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser

340 345 350

Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly

355 360 365

Leu Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr

370 375 380

Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp

385 390 395 400

Pro Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu

405 410 415

Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe

420 425 430

Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala

435 440 445

Arg Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg

450 455 460

Gly Gly Asn Glu Lys Pro Ser Val Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala

465 470 475 480

Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala

485 490 495

Gly Val Tyr Ser Ile Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu

500 505 510

Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile

515 520 525

Val Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn

530 535 540

Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp

545 550 555 560

Ala Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val

565

<210>3

<211>1707

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码绿草履虫小球藻病毒乙酰透明质酸合酶蛋白质的合成序列

<400>3

atgggtaaga acattatcat tatggtgtcc tggtacacaa ttattacaag taatctcatc 60

gcagttggtg gtgcatctct tattctcgct ccagctatca ctggatatgt tcttcactgg 120

aacatcgccc tctcaactat ttggggagtt tccgcatatg gtatttttgt tttcgggttc 180

tttttggctc aggttctgtt ctcagagctc aatcgtaaga gactcaggaa gtggattagc 240

cttagaccaa aggggtggaa tgacgttcgt ctcgctgtca ttatcgctgg ctaccgtgaa 300

gatccttaca tgtttcaaaa gtgcttggaa tcagttaggg atagtgatta tggcaacgtc 360

gctagactga tctgtgtgat tgatggagat gaggacgacg atatgaggat ggcagctgtt 420

tataaggcta tctataatga taacattaag aagcctgaat ttgttctttg cgagtctgat 480

gacaaggaag gagaacggat tgattcagat ttctcacgtg atatctgcgt tctccaacct 540

catcgtggga agcgtgaatg tctttataca ggtttccaac tcgccaaaat ggacccatca 600

gtgaacgctg tggttcttat cgatagtgat actgtgctgg agaaagatgc tatcttggag 660

gttgtttacc ctcttgcctg tgatcctgaa attcaagctg tggctggaga gtgcaagatc 720

tggaacacag atactcttct ttctctgctt gtcgcatgga gatattactc cgcattctgt 780

gtggagagga gcgctcaatc ctttttccgt accgttcaat gcgttggtgg tcctttggga 840

gcttacaaaa ttgatatcat caaggagatt aaggacccat ggattagtca aaggtttctt 900

ggtcagaagt gcacttatgg cgatgatcgt agattgacta acgaaatcct tatgaggggc 960

aagaaagtcg tttttactcc atttgctgtc ggatggtctg attcacctac aaatgttttc 1020

cgttatattg tgcaacaaac acgttggagt aagagctggt gtagggagat ctggtacact 1080

ttgttcgctg cttggaagca cgggcttagc ggaatttggc ttgcttttga atgcctttac 1140

cagattacat actttttctt ggtgatctat ttgttttcac gtcttgccgt cgaggctgac 1200

cctagagcac agactgcaac tgtgattgtt tctactacag tcgcacttat taagtgtggc 1260

tatttcagtt ttagagcaaa agatattaga gccttctatt ttgttttgta cacatttgtt 1320

tatttctttt gcatgattcc agctcgtatt accgctatga tgaccttgtg ggacatcgga 1380

tggggaacta gaggtggtaa cgaaaagcct tctgtgggaa caagggtggc cctttgggca 1440

aaacaatatc tcatcgccta catgtggtgg gccgctgtcg ttggtgccgg agtgtactca 1500

atcgttcata actggatgtt tgactggaac tctttgagct atcgtttcgc tcttgtgggt 1560

atttgttctt acattgtttt catcgtgatt gtgctcgttg tgtatttcac tggtaaaatc 1620

acaacctgga atttcactaa acttcaaaag gaattgattg aagacagggt tctgtatgat 1680

gctactacca acgcccagtc agtttaa 1707

<210>4

<211>2298

<212>DNA

<213>小家鼠(Mus musculus)

<220>

<221>CDS

<222>(150)..(2192)

<300>

<308>BC050762.1

<309>2005-03-08

<313>(150)..(2195)

<400>4

gagagcgaag cgagcgctga gtcggactgt cgggtctgag ctgtcgcatc ccagagtcct 60

ctcattgcca ccaccccggc ccgagctcac cctcgcttct gaagctctcc gcgcgcccga 120

cagctcagcc ctcgcccgtg accaacatc atg tgc ggt ata ttt gct tat tta 173

Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu

1 5

aat tac cat gtt cct cga aca aga cga gaa atc ttg gag aca cta atc 221

Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg Arg Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile

10 15 20

aaa ggc ctt cag aga ctg gaa tac aga gga tat gat tct gct ggt gtg 269

Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val

25 30 35 40

gga ctt gac gga ggc aat gac aaa gac tgg gaa gcc aac gcc tgc aaa 317

Gly Leu Asp Gly Gly Asn Asp Lys Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys

45 50 55

atc cag ctc att aag aag aaa gga aaa gtt aag gca ctg gat gaa gaa 365

Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val Lys Ala Leu Asp Glu Glu

60 65 70

gtt cac aaa caa caa gat atg gac ttg gat ata gaa ttt gat gtg cat 413

Val His Lys Gln Gln Asp Met Asp Leu Asp Ile Glu Phe Asp Val His

75 80 85

ctt gga ata gct cat acc cgt tgg gcg aca cat gga gaa ccc aat cct 461

Leu Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu Pro Asn Pro

90 95 100

gtc aat agt cac ccc cag cgc tct gat aaa aat aat gaa ttc att gtt 509

Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser Asp Lys Asn Asn Glu Phe Ile Val

105 110 115 120

att cat aat gga atc atc acc aac tac aaa gac ttg aaa aag ttt ctg 557

Ile His Asn Gly Ile Ile Thr Asn Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu

125 130 135

gaa agc aaa ggc tat gac ttt gaa tct gaa aca gac aca gaa acc att 605

Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile

140 145 150

gcc aag ctc gtc aag tac atg tat gac aac tgg gag agc cag gac gtc 653

Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr Asp Asn Trp Glu Ser Gln Asp Val

155 160 165

agt ttt acc acc ttg gtg gag aga gtt atc caa caa ttg gaa ggc gcc 701

Ser Phe Thr Thr Leu Val Glu Arg Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala

170 175 180

ttt gct ctt gtg ttt aaa agt gtc cat ttt ccc ggg caa gca gtt ggc 749

Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly

185 190 195 200

aca agg cga ggt agc cct ctc ttg att ggt gtg cgg agt gaa cat aag 797

Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys

205 210 215

ctt tct aca gat cac att ccg att ctg tac aga aca ggc aaa gac aag 845

Leu Ser Thr Asp His Ile Pro Ile Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Asp Lys

220 225 230

aaa gga agc tgc ggt ctt tcc cgt gtg gac agc acg aca tgc ctg ttc 893

Lys Gly Ser Cys Gly Leu Ser Arg Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe

235 240 245

cct gtt gag gaa aag gca gtt gaa tat tac ttt gct tct gat gca agt 941

Pro Val Glu Glu Lys Ala Val Glu Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser

250 255 260

gcc gtg ata gag cac acc aat cgt gtc atc ttt ctg gaa gat gat gat 989

Ala Val Ile Glu His Thr Asn Arg Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp

265 270 275 280

gtt gca gca gtg gtg gat ggc cgt ctc tct atc cac cga att aaa cga 1037

Val Ala Ala Val Val Asp Gly Arg Leu Ser Ile His Arg Ile Lys Arg

285 290 295

act gca gga gac cat cct ggc cga gct gtg caa act ctc cag atg gag 1085

Thr Ala Gly Asp His Pro Gly Arg Ala Val Gln Thr Leu Gln Met Glu

300 305 310

ctc cag cag atc atg aag ggc aac ttt agt tca ttt atg cag aag gaa 1133

Leu Gln Gln Ile Met Lys Gly Asn Phe Ser Ser Phe Met Gln Lys Glu

315 320 325

att ttt gag cag cca gaa tct gtt gtg aac aca atg aga gga aga gtc 1181

Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser Val Val Asn Thr Met Arg Gly Arg Val

330 335 340

aat ttt gat gac tac act gtg aat ttg gga ggt ttg aaa gat cac att 1229

Asn Phe Asp Asp Tyr Thr Val Asn Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Ile

345 350 355 360

aag gag atc cag cgg tgt cgg cgg ttg att ctt att gct tgt ggc aca 1277

Lys Glu Ile Gln Arg Cys Arg Arg Leu Ile Leu Ile Ala Cys Gly Thr

365 370 375

agt tac cac gct ggt gtg gca acc cgt cag gtc ctg gag gag ctg acc 1325

Ser Tyr His Ala Gly Val Ala Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr

380 385 390

gag ctg ccc gtg atg gtg gag ctt gcc agt gac ttc ttg gat aga aac 1373

Glu Leu Pro Val Met Val Glu Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn

395 400 405

act cca gtc ttt cga gat gat gtt tgc ttt ttc att agt caa tca ggc 1421

Thr Pro Val Phe Arg Asp Asp Val Cys Phe Phe Ile Ser Gln Ser Gly

410 415 420

gag aca gct gac acc ctg atg gga ctt cgt tac tgt aag gag aga gga 1469

Glu Thr Ala Asp Thr Leu Met Gly Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly

425 430 435 440

gcc tta act gtg ggg atc aca aat aca gtc ggc agt tct ata tca agg 1517

Ala Leu Thr Val Gly Ile Thr Asn Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg

445 450 455

gag aca gat tgc ggg gtt cat att aat gct ggt cct gag att ggc gtg 1565

Glu Thr Asp Cys Gly Val His Ile Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val

460 465 470

gcc agt aca aag gca tac acc agc cag ttt gtg tcc ctc gtg atg ttt 1613

Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr Ser Gln Phe Val Ser Leu Val Met Phe

475 480 485

gct ctc atg atg tgt gat gac agg atc tcc atg caa gag aga cgc aaa 1661

Ala Leu Met Met Cys Asp Asp Arg Ile Ser Met Gln Glu Arg Arg Lys

490 495 500

gag atc atg ctc gga ctg aag cga ctg ccg gac ttg att aag gaa gtg 1709

Glu Ile Met Leu Gly Leu Lys Arg Leu Pro Asp Leu Ile Lys Glu Val

505 510 515 520

ctg agc atg gat gat gaa atc cag aag ctg gcg acg gag ctt tac cac 1757

Leu Ser Met Asp Asp Glu Ile Gln Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His

525 530 535

cag aag tcg gtc ctg ata atg ggg cgg ggc tac cat tat gct aca tgc 1805

Gln Lys Ser Val Leu Ile Met Gly Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys

540 545 550

ctt gaa ggg gct ctg aaa atc aag gag att act tat atg cat tcg gaa 1853

Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu

555 560 565

ggc atc ctt gct ggt gag ctc aag cac ggc cct ctg gcc ttg gtg gac 1901

Gly Ile Leu Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Val Asp

570 575 580

aag ttg atg cct gtc atc atg atc atc atg cga gac cac act tat gcc 1949

Lys Leu Met Pro Val Ile Met Ile Ile Met Arg Asp His Thr Tyr Ala

585 590 595 600

aag tgc cag aac gct ctt cag cag gtg gtt gca cgg cag ggg cgt cca 1997

Lys Cys Gln Asn Ala Leu Gln Gln Val Val Ala Arg Gln Gly Arg Pro

605 610 615

gtc gtg atc tgt gat aag gag gat act gag acc att aag aat aca aaa 2045

Val Val Ile Cys Asp Lys Glu Asp Thr Glu Thr Ile Lys Asn Thr Lys

620 625 630

agg aca atc aag gtg ccc cac tca gtg gac tgc ttg cag ggc att ctc 2093

Arg Thr Ile Lys Val Pro His Ser Val Asp Cys Leu Gln Gly Ile Leu

635 640 645

agt gtg att ccc ctg cag ctg ctg gct ttc cac ctg gct gtg ctg aga 2141

Ser Val Ile Pro Leu Gln Leu Leu Ala Phe His Leu Ala Val Leu Arg

650 655 660

ggc tac gat gtt gat ttt cca cgg aat ctt gcc aaa tct gta aca gta 2189

Gly Tyr Asp Val Asp Phe Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val

665 670 675 680

gag taacagacac ctgaaactta agacagttaa gcaacacgag ataccttttg 2242

Glu

tatttaaatt tttgatttaa actatcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2298

<210>5

<211>681

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>5

Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg

1 5 10 15

Arg Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr

20 25 30

Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val Gly Leu Asp Gly Gly Asn Asp Lys

35 40 45

Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly

50 55 60

Lys Val Lys Ala Leu Asp Glu Glu Val His Lys Gln Gln Asp Met Asp

65 70 75 80

Leu Asp Ile Glu Phe Asp Val His Leu Gly Ile Ala His Thr Arg Trp

85 90 95

Ala Thr His Gly Glu Pro Asn Pro Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser

100 105 110

Asp Lys Asn Asn Glu Phe Ile Val Ile His Asn Gly Ile Ile Thr Asn

115 120 125

Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu

130 135 140

Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr

145 150 155 160

Asp Asn Trp Glu Ser Gln Asp Val Ser Phe Thr Thr Leu Val Glu Arg

165 170 175

Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val

180 185 190

His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu

195 200 205

Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys Leu Ser Thr Asp His Ile Pro Ile

210 215 220

Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Asp Lys Lys Gly Ser Cys Gly Leu Ser Arg

225 230 235 240

Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe Pro Val Glu Glu Lys Ala Val Glu

245 250 255

Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Ala Val Ile Glu His Thr Asn Arg

260 265 270

Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp Val Ala Ala Val Val Asp Gly Arg

275 280 285

Leu Ser Ile His Arg Ile Lys Arg Thr Ala Gly Asp His Pro Gly Arg

290 295 300

Ala Val Gln Thr Leu Gln Met Glu Leu Gln Gln Ile Met Lys Gly Asn

305 310 315 320

Phe Ser Ser Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser Val

325 330 335

Val Asn Thr Met Arg Gly Arg Val Asn Phe Asp Asp Tyr Thr Val Asn

340 345 350

Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Ile Lys Glu Ile Gln Arg Cys Arg Arg

355 360 365

Leu Ile Leu Ile Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Gly Val Ala Thr

370 375 380

Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val Glu Leu

385 390 395 400

Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro Val Phe Arg Asp Asp Val

405 410 415

Cys Phe Phe Ile Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu Met Gly

420 425 430

Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile Thr Asn

435 440 445

Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg Glu Thr Asp Cys Gly Val His Ile

450 455 460

Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr Ser

465 470 475 480

Gln Phe Val Ser Leu Val Met Phe Ala Leu Met Met Cys Asp Asp Arg

485 490 495

Ile Ser Met Gln Glu Arg Arg Lys Glu Ile Met Leu Gly Leu Lys Arg

500 505 510

Leu Pro Asp Leu Ile Lys Glu Val Leu Ser Met Asp Asp Glu Ile Gln

515 520 525

Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His Gln Lys Ser Val Leu Ile Met Gly

530 535 540

Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys

545 550 555 560

Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu Gly Ile Leu Ala Gly Glu Leu Lys

565 570 575

His Gly Pro Leu Ala Leu Val Asp Lys Leu Met Pro Val Ile Met Ile

580 585 590

Ile Met Arg Asp His Thr Tyr Ala Lys Cys Gln Asn Ala Leu Gln Gln

595 600 605

Val Val Ala Arg Gln Gly Arg Pro Val Val Ile Cys Asp Lys Glu Asp

610 615 620

Thr Glu Thr Ile Lys Asn Thr Lys Arg Thr Ile Lys Val Pro His Ser

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Val Asp Cys Leu Gln Gly Ile Leu Ser Val Ile Pro Leu Gln Leu Leu

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Ala Phe His Leu Ala Val Leu Arg Gly Tyr Asp Val Asp Phe Pro Arg

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Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu

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35 40 45

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130 135 140

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195 200 205

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<212>PRT

<213>小家鼠

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Leu Arg Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Phe Glu Ser Glu Thr

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180 185 190

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Gly Arg Gly Tyr Asn Tyr Ala Thr Cys Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile

545 550 555 560

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565 570 575

Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Val Asp Lys Gln Met Pro Val Ile Met

580 585 590

Val Ile Met Lys Asp Pro Cys Phe Ala Lys Cys Gln Asn Ala Leu Gln

595 600 605

Gln Val Thr Ala Arg Gln Gly Arg Pro Ile Ile Leu Cys Ser Lys Asp

610 615 620

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645 650 655

Leu Ser Phe His Leu Ala Val Leu Arg Gly Tyr Asp Val Asp Phe Pro

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675 680

<210>8

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<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

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<400>8

atg tgt gga att gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc 48

Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile

1 5 10 15

ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc 96

Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala

20 25 30

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Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg

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Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu

50 55 60

cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa 240

His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu

65 70 75 80

cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tct gaa cac att gtg gtg 288

Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val

85 90 95

gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cta 336

Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu

100 105 110

aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att 384

Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile

115 120 125

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Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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260 265 270

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290 295 300

tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt 960

Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly

305 310 315 320

att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct 1008

Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser

325 330 335

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Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val

385 390 395 400

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Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala

465 470 475 480

ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac gct gaa 1488

Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu

485 490 495

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Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp

500 505 510

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515 520 525

aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg 1632

Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu

530 535 540

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545 550 555 560

cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc 1728

His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe

565 570 575

tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa 1776

Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys

580 585 590

ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt 1824

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Glu

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<212>PRT

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Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg

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50 55 60

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Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu

100 105 110

Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile

115 120 125

Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu

130 135 140

Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val

145 150 155 160

Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly

165 170 175

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180 185 190

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260 265 270

Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu

275 280 285

Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser

290 295 300

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305 310 315 320

Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser

325 330 335

Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu

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355 360 365

Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg

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435 440 445

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Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp

500 505 510

Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu

515 520 525

Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu

530 535 540

Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met

545 550 555 560

His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe

565 570 575

Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys

580 585 590

Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val

595 600 605

Glu

<210>10

<211>1830

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码具有GFAT活性的大肠杆菌蛋白质的合成序列

<400>10

atgtgcggaa ttgttggtgc tatcgcccaa agagacgttg ctgagatttt gttagagggt 60

ctgcgaaggc tagagtatag aggatatgac tccgctggtc tggctgtcgt tgatgctgag 120

ggtcatatga caaggctaag aaggttagga aaggttcaga tgcttgctca ggcagctgag 180

gaacatccat tgcatggagg tactggtatt gcacatacca ggtgggctac tcatggggag 240

ccatcagaag ttaatgctca tccacatgtg agtgagcata tcgttgtagt tcacaatggg 300

ataattgaaa accacgaacc attgagggaa gagttaaagg caagaggata tacttttgtg 360

agtgagactg acactgaggt tattgcacat ttagtgaact gggaactcaa acaggggggc 420

acattgcgtg aggctgtgtt aagagctatt cctcaactta gaggtgcata cggtactgtt 480

attatggatt caagacaccc agatactctc cttgcagcta gatcaggtag tcccttggtc 540

ataggacttg gaatgggtga aaattttatc gctagcgacc aattggcctt attgccagtt 600

acaagacgat ttattttcct tgaagagggc gatattgctg agattactag aaggtctgtg 660

aacatctttg ataagactgg cgctgaggtt aaacgtcagg atatcgagtc taaccttcaa 720

tacgatgctg gtgataaagg aatttacagg cattatatgc aaaaggaaat ttatgaacaa 780

ccaaatgcta tcaaaaacac acttactggc cgtatttctc atggacaggt cgatttaagc 840

gagcttggtc ctaatgcaga cgaactgcta tcaaaagttg agcacataca gatactggca 900

tgcggaacta gttataattc aggaatggtc tctagatact ggttcgaaag cttggcaggt 960

ataccttgtg atgtagagat cgcttctgag tttaggtata gaaagtctgc tgtgcgtaga 1020

aattcattaa tgattacatt atctcaatcc ggagaaacag cagatacact ggctggattg 1080

aggctttcta aggaactcgg atatctgggt tcacttgcta tttgtaatgt accaggttcc 1140

tcattggttc gtgaatcaga tctagcactt atgacaaatg caggaactga aataggtgtg 1200

gcaagtacca aggctttcac aacccaactg accgtacttt taatgttggt agcaaaactc 1260

agtcgattaa aggggctaga tgcatctatc gaacatgata ttgttcacgg gcttcaagct 1320

ctcccttcaa gaattgaaca aatgctttca caagataaga gaatagaggc attggctgaa 1380

gatttttccg acaaacatca cgcattgttt cttggacgtg gcgatcaata tccaattgca 1440

ttggaaggag ctttgaagtt gaaagaaata agttacattc acgcagaagc atatgcagct 1500

ggagaactca agcatggtcc tttggcactc atcgacgctg acatgcccgt gatcgtagtg 1560

gctcctaata acgaactgct cgaaaagctt aaatcaaata tcgaagaggt tcgagctaga 1620

ggaggtcagc tttacgtttt cgctgaacaa gatgctggat tcgtgtcaag cgataatatg 1680

catataattg aaatgcctca cgttgaagaa gtgattgcac ctatatttta tacagtccca 1740

ttgcaacttc tagcttacca tgttgcactt attaaaggaa ctgatgttga tcagcctaga 1800

aacctagcaa aatctgtaac agtcgaataa 1830

<210>11

<211>1260

<212>DNA

<213>绿草履虫小球藻病毒1

<220>

<221>CDS

<222>(62)..(1228)

<300>

<308>U42580.4

<309>2004-09-20

<313>(291749.)..(292918)

<400>11

atcaacgtga tttatatttt aaacaaagac cattcacatc tttagtactt aattaattat 60

a atg tca cga atc gca gtc gtt ggt tgt ggt tac gtc gga acc gct tgt 109

Met Ser Arg Ile Ala Val Val Gly Cys Gly Tyr Val Gly Thr Ala Cys

1 5 10 15

gca gta ctt ctt gct caa aaa aac gaa gtc atc gtg ctt gat att agc 157

Ala Val Leu Leu Ala Gln Lys Asn Glu Val Ile Val Leu Asp Ile Ser

20 25 30

gaa gac cgt gtt caa cta atc aag aac aag aag agt cca atc gag gac 205

Glu Asp Arg Val Gln Leu Ile Lys Asn Lys Lys Ser Pro Ile Glu Asp

35 40 45

aag gaa atc gaa gag ttt ctc gaa acg aaa gac ctg aac ctg acc gcg 253

Lys Glu Ile Glu Glu Phe Leu Glu Thr Lys Asp Leu Asn Leu Thr Ala

50 55 60

acg act gac aag gtt ctt gca tac gaa aac gcc gaa ttt gtc atc atc 301

Thr Thr Asp Lys Val Leu Ala Tyr Glu Asn Ala Glu Phe Val Ile Ile

65 70 75 80

gca acc ccg act gac tat gac gtg gtt act agg tat ttt aac acg aaa 349

Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asp Val Val Thr Arg Tyr Phe Asn Thr Lys

85 90 95

tct gtg gaa aac gtc att ggg gac gtg atc aaa aat aca cag acc cat 397

Ser Val Glu Asn Val Ile Gly Asp Val Ile Lys Asn Thr Gln Thr His

100 105 110

cca act atc gtg att aaa tct acc atc ccc att gga ttt gtt gat aag 445

Pro Thr Ile Val Ile Lys Ser Thr Ile Pro Ile Gly Phe Val Asp Lys

115 120 125

gtt cgt gag caa ttc gac tac caa aat atc att ttc tcc cca gaa ttt 493

Val Arg Glu Gln Phe Asp Tyr Gln Asn Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe

130 135 140

ctg cgt gaa ggt aga gcc ttg tat gat aat ctc tac cca tcc cgt atc 541

Leu Arg Glu Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile

145 150 155 160

atc gta gga gat gat tcc ccc att gcg ctt aag ttc gca aac ctt ctc 589

Ile Val Gly Asp Asp Ser Pro Ile Ala Leu Lys Phe Ala Asn Leu Leu

165 170 175

gtt gaa ggt tct aaa act ccg ctt gcc cct gtc ctg acg atg gga act 637

Val Glu Gly Ser Lys Thr Pro Leu Ala Pro Val Leu Thr Met Gly Thr

180 185 190

cgc gaa gcc gag gcc gtc aaa cta ttc tct aac acg tat ctt gca atg 685

Arg Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Met

195 200 205

cga gtt gca tac ttc aac gaa cta gat aca ttc gca atg tct cac ggt 733

Arg Val Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Phe Ala Met Ser His Gly

210 215 220

atg aat gcg aaa gaa atc att gat ggt gtg act ctg gag cct cgc att 781

Met Asn Ala Lys Glu Ile Ile Asp Gly Val Thr Leu Glu Pro Arg Ile

225 230 235 240

ggt cag ggg tac tca aac cct tcg ttc ggt tat gga gct tat tgc ttt 829

Gly Gln Gly Tyr Ser Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Ala Tyr Cys Phe

245 250 255

cca aag gat acg aag caa ctg ctg gct aat ttc gag gga gtg cct caa 877

Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Phe Glu Gly Val Pro Gln

260 265 270

gat atc atc gga gca att gta gaa tca aat gag act cgc aag gaa gtg 925

Asp Ile Ile Gly Ala Ile Val Glu Ser Asn Glu Thr Arg Lys Glu Val

275 280 285

att gtg agt gaa gta gaa aat cgt ttc ccc acg act gtt ggt gtg tat 973

Ile Val Ser Glu Val Glu Asn Arg Phe Pro Thr Thr Val Gly Val Tyr

290 295 300

aag ctc gcc gct aaa gcg ggt tct gat aat ttt cgg agt tct gca att 1021

Lys Leu Ala Ala Lys Ala Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ser Ser Ala Ile

305 310 315 320

gta gac ata atg gag cga ctt gca aac aag ggt tat cac att aag att 1069

Val Asp Ile Met Glu Arg Leu Ala Asn Lys Gly Tyr His Ile Lys Ile

325 330 335

ttc gaa cca act gtg gaa caa ttc gaa aac ttt gaa gtt gat aac aac 1117

Phe Glu Pro Thr Val Glu Gln Phe Glu Asn Phe Glu Val Asp Asn Asn

340 345 350

ctg aca aca ttt gcg act gag agc gat gta att atc gca aac aga gtt 1165

Leu Thr Thr Phe Ala Thr Glu Ser Asp Val Ile Ile Ala Asn Arg Val

355 360 365

ccc gtt gaa cat cgc att ctc ttt ggt aaa aaa tta atc aca cgt gat 1213

Pro Val Glu His Arg Ile Leu Phe Gly Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asp

370 375 380

gta tat ggc gat aac taaaatgttt tcaatatgat gttgttaatg at 1260

Val Tyr Gly Asp Asn

385

<210>12

<211>389

<212>PRT

<213>绿草履虫小球藻病毒1

<400>12

Met Ser Arg Ile Ala Val Val Gly Cys Gly Tyr Val Gly Thr Ala Cys

1 5 10 15

Ala Val Leu Leu Ala Gln Lys Asn Glu Val Ile Val Leu Asp Ile Ser

20 25 30

Glu Asp Arg Val Gln Leu Ile Lys Asn Lys Lys Ser Pro Ile Glu Asp

35 40 45

Lys Glu Ile Glu Glu Phe Leu Glu Thr Lys Asp Leu Asn Leu Thr Ala

50 55 60

Thr Thr Asp Lys Val Leu Ala Tyr Glu Asn Ala Glu Phe Val Ile Ile

65 70 75 80

Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asp Val Val Thr Arg Tyr Phe Asn Thr Lys

85 90 95

Ser Val Glu Asn Val Ile Gly Asp Val Ile Lys Asn Thr Gln Thr His

100 105 110

Pro Thr Ile Val Ile Lys Ser Thr Ile Pro Ile Gly Phe Val Asp Lys

115 120 125

Val Arg Glu Gln Phe Asp Tyr Gln Asn Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe

130 135 140

Leu Arg Glu Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile

145 150 155 160

Ile Val Gly Asp Asp Ser Pro Ile Ala Leu Lys Phe Ala Asn Leu Leu

165 170 175

Val Glu Gly Ser Lys Thr Pro Leu Ala Pro Val Leu Thr Met Gly Thr

180 185 190

Arg Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Met

195 200 205

Arg Val Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Phe Ala Met Ser His Gly

210 215 220

Met Asn Ala Lys Glu Ile Ile Asp Gly Val Thr Leu Glu Pro Arg Ile

225 230 235 240

Gly Gln Gly Tyr Ser Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Ala Tyr Cys Phe

245 250 255

Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Phe Glu Gly Val Pro Gln

260 265 270

Asp Ile Ile Gly Ala Ile Val Glu Ser Asn Glu Thr Arg Lys Glu Val

275 280 285

Ile Val Ser Glu Val Glu Asn Arg Phe Pro Thr Thr Val Gly Val Tyr

290 295 300

Lys Leu Ala Ala Lys Ala Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ser Ser Ala Ile

305 310 315 320

Val Asp Ile Met Glu Arg Leu Ala Asn Lys Gly Tyr His Ile Lys Ile

325 330 335

Phe Glu Pro Thr Val Glu Gln Phe Glu Asn Phe Glu Val Asp Asn Asn

340 345 350

Leu Thr Thr Phe Ala Thr Glu Ser Asp Val Ile Ile Ala Asn Arg Val

355 360 365

Pro Val Glu His Arg Ile Leu Phe Gly Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asp

370 375 380

Val Tyr Gly Asp Asn

385

<210>13

<211>1170

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码具有UDP-Glc-DH活性的绿草履虫小球藻病毒蛋白质的合成序列

<400>13

atgtctcgca tagctgttgt aggatgtggc tatgtgggaa ctgcatgtgc ggttctactt 60

gctcaaaaga acgaagttat tgtgcttgat attagtgaag accgtgttca acttattaag 120

aacaagaagt ctcctattga ggataaggaa atcgaagagt tcttggaaac aaaggatctt 180

aatcttactg cgactacaga taaggttctt gcctacgaga acgctgagtt tgtgataatc 240

gctacaccaa ccgattacga cgttgtgact cgatatttca ataccaaatc cgtggaaaac 300

gttataggag atgttatcaa gaacactcaa acccacccta ctatcgtcat caagtccaca 360

attcccatcg gtttcgttga taaggtcaga gagcagtttg attatcaaaa cattatcttc 420

tcacctgagt tcttaaggga gggtcgtgct ctctacgata atttgtatcc gtcccgtatt 480

atcgttggcg acgattctcc tatcgctctc aagttcgcaa atctcttagt tgagggtagt 540

aagacccctt tggctcctgt tttgacaatg ggaaccagag aagcagaagc tgtcaagcta 600

ttctctaata cctaccttgc catgagggta gcatacttta acgaacttga tacatttgct 660

atgtcgcatg gtatgaatgc caaggagatt atagatggtg tcactttaga gcccaggatc 720

ggtcaaggat attctaaccc atcattcggc tatggagctt actgctttcc taaggacact 780

aagcagttgc tggcaaactt cgagggagtt cctcaagaca tcataggcgc tattgtggag 840

tcaaacgaaa caaggaaaga ggtgatagtt agtgaggtag agaatcgttt cccaacgaca 900

gtcggtgttt acaaactggc agctaaagct ggtagcgata acttcaggtc aagtgctatt 960

gtcgacatca tggaacgcct ggctaacaaa ggttaccaca ttaagatctt tgagccaact 1020

gtagagcagt tcgaaaattt cgaagttgac aataacttga caacgtttgc tactgagtca 1080

gacgttatta tcgcaaatcg tgtccctgtg gaacatagaa tcctatttgg aaagaagctc 1140

attaccagag atgtttacgg tgataattaa 1170

<210>14

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>14

tcgacaggcc tggatcctta attaaactag tctcgaggag ctcggtac 48

<210>15

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>15

cgagctcctc gagactagtt taattaagga tccaggcctg 40

<210>16

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>16

aaaaactagt tctacatcgg cttaggtgta gcaacacg 38

<210>17

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>17

aaaagatatc tgttgttgga ttctactact atgcttcaa 39

Claims

1. 植物细胞或植物，其具有至少每克鲜重2μmol的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

2. 植物细胞或植物，其具有至少每克鲜重300μg糖胺聚糖的糖胺聚糖含量。

3. 如权利要求1所述的植物的部分，其具有至少每克鲜重2μmol的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

4. 如权利要求2所述的植物的部分，其具有至少每克鲜重300μg糖胺聚糖的糖胺聚糖含量。

5. 如权利要求1所述的植物的繁殖材料，其具有至少每克鲜重2μmol的N-乙酰化的葡糖胺衍生物含量。

6. 如权利要求2所述的植物的繁殖材料，其具有至少每克鲜重300μg糖胺聚糖的糖胺聚糖含量。

7. 生产遗传修饰的植物的方法，其包括以下步骤：

a)将外源核酸分子引入植物细胞，所述外源核酸分子编码具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶同种型II(GFAT-2)活性的蛋白质或编码具有细菌谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶活性的蛋白质；

b)从根据步骤a)获得的植物细胞再生植物；

c)如果合适，利用根据步骤b)的植物产生其它植物。

8. 生产合成糖胺聚糖的植物的方法，其中

a)对植物细胞进行遗传修饰，其中所述遗传修饰包括任何顺序的以下步骤i到ii或者单独地或同时地实施以下步骤i到ii之任何组合：

i)将外源核酸分子引入植物细胞，所述外源核酸分子编码具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶同种型II(GFAT-2)活性的蛋白质或编码具有细菌谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(细菌GFAT)活性的蛋白质；

ii)将编码糖胺聚糖合酶的外源核酸分子引入植物细胞；

b)从植物细胞再生植物，所述植物细胞包含根据步骤

i)a)i

ii)a)ii

iii)a)i和a)ii

的遗传修饰，

c)

i)向根据步骤b)i的植物的植物细胞中引入根据步骤a)ii的遗传修饰，

ii)向根据步骤b)ii的植物的植物细胞中引入根据步骤a)i的遗传修饰，

并再生植物，

d)如果合适，利用根据b)iii或c)i或c)ii任一步骤所获得的植物产生其它植物。

9. 核酸分子用于制备遗传修饰的植物的用途，所述核酸分子编码具有谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶同种型II(GFAT-2)活性的蛋白质或编码具有细菌谷氨酰胺：果糖6-磷酸酰胺转移酶(细菌GFAT)活性的蛋白质。

10. 用于生产糖胺聚糖的方法，其包括从如权利要求2所述的植物细胞、从如权利要求4所述的植物的部分、或从如权利要求6所述的繁殖材料中提取糖胺聚糖的步骤。

11. 组合物，其包含如权利要求1或2中所述的遗传修饰的植物细胞。

12. 可以从如权利要求1或2所述的植物、从权利要求3或4所述的植物的部分、或从权利要求5或6所述的繁殖材料获得的面粉。

13. 用于生产面粉的方法，其包括研磨权利要求3或4所述的植物部分或权利要求5或6所述的繁殖材料的步骤。

14. 权利要求1或2所述的植物、权利要求3或4所述的植物的部分、或权利要求5或6所述的繁殖材料用于生产面粉的用途。