BRPI0616845A2 - plantas com produção de hialuronan aumentada - Google Patents

Abstract

PLANTAS COM PRODUçãO DE HIALURONAN AUMENTADA. A presente invenção refere-se a células de planta e plantas que sintetizam uma quantidade aumentada de hialuronan e a métodos para preparação de tais plantas, e também a métodos para preparação de hialuronan com o auxílio dessas células de planta ou plantas. Aqui, células de planta ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção têm atividade de hialuronan sintase e adicionalmente uma atividade de glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) aumentada comparado com células de planta do tipo selvagem ou plantas do tipo selvagem. A presente invenção refere-se ainda ao uso de plantas tendo síntese de hialuronan aumentada para preparação de hialuronan e alimento e ração contendo hialuronan.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLANTASCOM PRODUÇÃO DE HIALURONAN AUMENTADA".

A presente invenção refere-se a células de planta e plantas quesintetizam uma quantidade aumentada de hialuronan, e a métodos para pre- paração de tais plantas, e também a métodos para preparação de hialuronancom auxílio dessas células de planta ou plantas. Aqui, células de planta ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção têm atividadede hialuronan sintase e adicionalmente uma atividade de glutamina:frutose6-fosfato amidotransferase (GFAT) aumentada comparado com células deplanta do tipo selvagem ou plantas do tipo selvagem. A presente invençãorefere.Se ainda ao uso de plantas tendo síntese de hialuronan aumentadapara preparação de hialuronan e alimento ou ração contendo hialuronan.

O Hialuronan é um mucopolissacarídeo linear, não-ramificado,(glicosaminoglucano) que é construído de moléculas alternadas de ácidoglucurônico e N-acetil-glicosamina. O bloco de formação principal do hialu-ronan consiste no dissacarídeo ácido glucurônico-beta-1,3-N-acetil-·glicosamina. Em hialuronan, essas unidades de repetição são ligadas umasàs outras através de ligações beta-1,4. Em Farmácia, uso é freqüentementefeito do termo ácido hialurônico. Uma vez que hialuronan está na maioriados casos presente como um poliânion e não como o ácido livre, aqui abai-xo, o termo hialuronan é de preferência usado, mas cada termo deve serentendido como compreendendo ambas formas moleculares.

O hialuronan tem propriedades físico-químicas incomuns, talcomo, por exemplo, propriedades de polieletrólito, propriedades viscoelásti-cas, uma alta capacidade de ligar água, propriedades de formação de gel,que, em adição a propriedades adicionais do hialuronan, são descritas emum artigo de revisão de Lapcik e outros (1998, Chemicals Reviews 98(8),2663-2684).

O hialuronan é um componente de tecido conectivo extracelulare fluidos do corpo de vertebrados. Em humanos, o ácido hialurônico é sinte-tizado pela membrana celular de todas as células do corpo, especialmentecélulas mesenquimais, e ubiquitariamente presente no corpo com uma con-centração particularmente alta nos tecidos conectivos, na matriz extracelular,no cordão umbilical, no fluido da junta, no tecido cartilaginoso, na pele e nocorpo vítreo do olho (Bernhard Gebauer, 1998, Inaugural-Dissertation, Vir-chow-Klinikum Medizinische Fakultát Charité der Humboldt Universitát zuBerlin; Fraser e outros, 1997, Journal of International Medicine 242, 27-33).Recentemente, o hialuronan foi encontrado em organismos animais não-vertebrados (moluscos) (Volpi e Maccari, 2003, Biochimie 85, 619-625). Ain-da, algumas bactérias gram-positivas patogênicas (Streptococcus grupos Ae C) e bactérias gram-negativas (Pasteurella) sintetizam hialuronan comoexopolissacarídeos que protegem essas bactérias contra ataque pelo siste-ma imune de seu hospedeiro, uma vez que hialuronan é uma substâncianão-imunogênica. Vírus que infectam algas verdes de célula única do gêneroChlorella, alguns dos quais estão presentes como endossimbiontes em es-pécies Paramecium, conferem às algas verdes de célula única a habilidadeem sintetizar hialuronan após infecção pelo vírus (Graves e outros, 1999,Virology 257, 15-23). No entanto, a habilidade em sintetizar hialuronan não éuma característica que caracterize as algas em questão. A habilidade dasalgas em sintetizar hialuronan é mediada por uma infecção com um víruscujo genoma tem uma seqüência codificando hialuronan sintase (DeAngelis,1997, Science 278, 1800-1803). Ainda, o genoma do vírus contém seqüên-cias codificando uma glutamina: frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT).GFAT converte frutose 6-fosfato e glutamina em glicosamina 6-fosfato que éum metabólito importante no curso metabólico de síntese de hialuronan.Ambos genes codificam proteínas ativas que, tal como a hialuronan sintasedo vírus, são transcritas simultaneamente na fase inicial da infecção viral(DeAngelis e outros, 1997, Science 278, 1800-1803, Graves e outros, 1999,Virology 257, 15-23). A atividade de uma proteína tendo atividade de gluta-mina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) não pôde ser detectadanem em extratos de células não-infectadas por um vírus nem em células in-fectadas com vírus (Landstein e outros, 1998, Virology 250, 388-396). Destemodo, o papel da expressão de GFAT em células de Chlorella infectadascom vírus para a síntese de hialuronan, e se elas são requeridas para sínte-se de hialuronan, não é conhecido. As próprias plantas de ocorrência naturalnão têm quaisquer ácidos nucléicos em seu genoma que codifiquem proteí-nas catalisando a síntese de hialuronan e, embora um grande número decarboidratos de planta tenha sido descrito e caracterizado, não foi até agorapossível detectar hialuronan ou moléculas relacionadas com hialuronan emplantas não-infectadas (Graves e outros, 1999, Virology 257, 15-23).

A catálise da síntese de hialuronan é realizada por uma enzimaintegrada à membrana ou associada à membrana única, hialuronan sintase.As hialuronan sintases que foram até agora estudadas podem ser classifica- das em dois grupos: hialuronan sintases de Classe I e hialuronan sintasesde Classe Il (DeAngelis, 1999, CMLS, Cellular and Molecular Life Sciences56, 670-682). As hialuronan sintases de vertebrados são distinguidas maispelas isoenzimas identificadas. As isoenzimas diferentes são referidas naordem de sua identificação usando números arábicos (por exemplo, h-sHAS1, hsHAS2, hsHAS3).

O mecanismo da transferência de moléculas de hialuronan sin-tetizado através da membrana do citoplasma para o meio circundando a cé-lula não foi ainda completamente elucidado. Hipóteses anteriores supunhamque transporte através da membrana celular fosse realizado pela própriahialuronan sintase. No entanto, resultados mais recentes indicam que otransporte de moléculas de hialuronan através da membrana do citoplasmaacontece através de transporte dependente de energia através de proteínasde transporte responsáveis por esta ação. Deste modo, cepas de Strepto-coccus foram geradas através de mutação onde a síntese de uma proteína de transporte ativa foi inibida. Essas cepas sintetizaram menos hialuronando que as cepas bacterianas do tipo selvagem correspondentes (Ouskova eoutros, 2004, Glycobiology 14(10), 931-938). Em fibroblastos humanos foipossível demonstrar, com o auxílio de agentes especificamente inibindo pro-teínas de transporte conhecidas, que é possível reduzir ambos a quantidadede hialuronan produzida e a atividade das hialuronan sintases (Prehm e S-chumacher, 2004, Biochemical Pharmacology 68, 1401-1410). Em qualquantidade, se alguma, proteínas de transporte capazes de transporte dehialuronan estão presentes em planta não é conhecida.

As propriedades incomuns de hialuronan oferecem uma riquezade possibilidades para aplicação em vários campos, tal como, por exemplo,farmácia, na indústria cosmética, na produção de alimento e ração, em apli-cações técnicas (por exemplo, como lubrificantes), etc, As aplicações maisimportantes onde hialuronan está atualmente sendo usado são nos camposmedicinal e cosmético (vide, por exemplo, Lapcik e outros, 1998, ChemicalReviews 98(8), 2663-2684, Goa e Benfield, 1994, Drugs 47(3), 536-566).

No campo médico, produtos contendo hialuronan são atualmen-te usados para o tratamento intra-articular de artrose e em oftálmicos usadospara cirurgia do olho. Hialuronan é também usado para tratamento de distúr-bios da junta em cavalos de raça. Ainda, ácido hialurônico é um componentede alguns rinológicos que, por exemplo, na forma de gotas para o olho e na-sais, servem para umidificar as membranas mucosais secas. Soluções con-tendo hialuronan para injeção são usadas como analgésicos e anti-reumáticos. Emplastros compreendendo hialuronan ou hialuronan derivati-zado são empregados em cicatrização de ferida. Como dermáticos, implan-tes em gel contendo hialuronan são usados para correção de deformaçõesda pele em cirurgia plástica. Para aplicações farmacológicas, preferência édada ao uso de hialuronan tendo um peso molecular alto. Em medicina cos-mética, preparações de hialuronan estão dentre os materiais de carga depele mais adequados. Através da injeção de hialuronan, por um período detempo limitado, é possível suavizar rugas ou aumentar o volume dos lábios.Em produtos cosméticos, em particular em cremes e loções para a pele, hia-Iuronan é freqüentemente usado como umidificante em virtude de sua capa-cidade de ligação com água grande.

Ainda, preparações contendo hialuronan são vendidas como oschamados nutracêuticos (suplementos alimentares) que podem ser tambémusados em animais (por exemplo, cachorros, cavalos) para a profilaxia e alí-vio de artrose.

Hialuronan usado para propósitos particulares é atualmente iso-lado de tecidos animais ("roostercombs') ou preparado fermentativamenteusando culturas bacterianas. A US 4.141.973 descreve um processo paraisolamento de hialuronan de "roostercombs" ou alternativamente de cordõesumbilicais. Em adição a hialuronan, tecidos animais (por exemplo, "rooster-combs", cordões umbilicais) também contêm mucopolissacarídeos relacio-nados a hialuronan, tal como sulfato de condroitina, dermatan sulfato, quera-tan sulfato, heparan sulfato e heparina. Ainda, organismos animais contêmproteínas (hialadreninas) que se ligam especificamente a hialuronan e quesão requeridas para as mais diferentes funções no organismo, tal como, porexemplo, a degradação de hialuronan no fígado, a função do hialuronan co-mo estrutura principal para migração celular, a regulagem de endocitose, oancoramento de hialuronan na superfície celular ou a formação de redes dehialuronan (Turley, 1991, Adv Drug Delivery Revi, 257 ff.; Laurent and Fra-ser, 1992, FASEB J. 6, 183 ff.; Stamenkovic and Aruffo, 1993, MethodsEnzymoL 245, 195 ff; Knudson e Knudson, 1993, FASEB 7, 1233 ff.).

As cepas de Streptococcus usadas para a produção bacterianade hialuronan são exclusivamente bactérias patogênicas. Durante cultivo,essas bactérias produzem exotoxinas (pirogênicas) e hemolisinas (estrepto-Iisina (em particular alfa- e beta-hemosilina) (Kilian, M.: Streptococcus andEnterococeus. Em: Medicai Microbiology. Greenwood, D.; Slack, RCA; Peu-therer, J.F. (Eds.). Capítulo 16. Churchill Livingstone, Edinburgh, UK: pp.174-188, 2002, ISBN 0443070776) que são liberadas no meio de cultura.Isto torna purificação e isolamento do hialuronan preparado com o auxílio decepas Streptococcus mais difíceis. Em particular para aplicação farmacêuti-ca, a presença de exotoxinas e hemolisinas na preparação é um problema.A US 4.801.539 descreve a preparação de hialuronan através de fermenta-ção de uma cepa bacteriana mutagenizada (Streptoeoeeus zooedemieus). Acepa bacteriana mutagenizada usada não sintetiza mais beta-hemolisina. Orendimento conseguido foi 3,6 g de hialuronan por litro de cultura. A EP0694616 descreve um método para cultivo de Streptoeoeeus zooedemieusou Streptoeoeeus equi, onde, sob as condições de cultura empregadas, ne-nhuma estreptolisina, mas quantidades aumentadas de hialuronan são sinte-tizadas. O rendimento obtido foi de 3,5 g de hialuronan por litro de cultura.Durante cultivo, cepas de Streptococcus liberam a enzima hialuronidase nomeio de cultura, como uma conseqüência do que, neste sistema de produ-ção, também, o peso molecular é reduzido durante a purificação. O uso decepas de Streptococcus negativas para hialuronidase ou de métodos para aprodução de hialuronan onde a produção de hialuronidase durante cultivo éinibida são descritos na US 4.782.046. O rendimento obtido foi até 2,5 g dehialuronan por litro de cultura, e o peso molecular médio máximo atingido foi3,8 χ 106 Da, em uma distribuição de peso molecular de a partir de 2,4 χ 106a 4,0 χ 106. A US 20030175902 e o WO 03 054163 descrevem a preparaçãode hialuronan com o auxílio de expressão heteróloga de uma hialuronan sin-tase de Streptoeoceus equisimilis em Bacillus subtilis. Para conseguir a pro-dução de quantidades suficientes de hialuronan, em adição à expressão he-teróloga de uma hialuronan sintase, expressão simultânea de uma UDP-glicose desidrogenase nas células Bacillus é também requerida. A US20030175902 e o WO 03 054163 não declaram a quantidade absoluta dehialuronan obtido na produção com o auxilio de Bacillus subtilis. O peso mo-lecular médio máximo obtido foi cerca de 4,2 χ 106. No entanto, este pesomolecular médio foi apenas obtido para a cepa de Bacillus recombinanteonde um gene codificando o gene de hialuronan sintase de Streptoeoceusequisimilis e o gene codificando a UDP-glicose desidrogenase de Baeillussubtilis foram integrados no genoma de Baeillus subtilis sob o controle dopromotor amyQ, onde ao mesmo tempo o gene cxpV endógeno de Baeillussubtilis (que codifica uma citocroma P450 oxidase) foi inativado.

O WO 05 012529 descreve a preparação de plantas de tabacotransgênicas que foram transformadas usando moléculas de ácido nucléicocodificando hialuronan sintases de vírus infectando Chlorella. No WO 05012529, foi feito uso, por outro lado, de seqüências de ácido nucléico codifi-cando hialuronan sintase da cepa do vírus de Chlorella CVH1 e, por outrolado, da cepa do vírus de Chlorella CVKA1 para transformação de plantas detabaco. A síntese de hialuronan poderia ser apenas demonstrada para umaplanta transformada com um ácido nucléico codificando uma hialuronan sin-tase isolada da cepa do vírus de Chlorella CVKA1. Para plantas de tabacotransformadas com uma seqüência de ácido nucléico codificando uma hialu-ronan sintase isolada de cepa de vírus de Chlorella CVHH, não foi possíveldetectar síntese de hialuronan nas plantas transgênicas correspondentes. Aquantidade de hialuronan sintetizado pela única planta de tabaco transgêni-ca produtora de hialuronan no WO 05 012529 é declarada como sendo cer-ca de 4,2 pg de hialuronan por ml de volume medido que, levando em contaa descrição para realizar o experimento em questão, corresponde aproxima-damente a uma quantidade de no máximo 12 pg de hialuronan produzidopor grama de peso fresco de material de planta.

Hialuronan sintase catalisa a síntese de hialuronan a partir dosmateriais de partida UDP-N-acetil-glicosamina e UPD-ácido glucorônico.Ambos materiais de partida mencionados estão presentes em células deplanta.

Para a síntese de UDP-N-acetil-glicosamina em células de plan-ta, o WO 98 35047 descreve um curso metabólico onde glicosamina é con-vertida através de várias etapas de reação enzimaticamente catalisada su-cessivas com formação dos metabólitos N-acetil-glicosamina, N-acetil-glicosamina 6-fosfato, N-acetil-glicosamina 1-fosfato em UDP-N-acetilglicosamina. Um curso metabólico alternativo compreende uma reaçãode frutose 6-fosfato e glutamina dando glicosamina 6-fosfato que é subse-qüentemente convertida por várias etapas de reação enzimaticamente cata-lisada sucessivas com formação dos metabólitos glicosamina 1 -fosfato e N-acetil-glicosamina 1-fosfato em UDP-N-acetilglicosamina. A conversão defrutose 6-fosfato e glutamina em glicosamina 6-fosfato é catalisada por umaproteína tendo atividade de glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase(GFAT) (Mayer e outros, 1968, Plant Physioi 43, 1097-1107).

O WO 00 11192 descreve a superexpressão específica de en-dosperma de uma molécula de ácido nucléico de milho codificando uma pro-teína tendo uma atividade de enzima de uma GFAT em plantas de milhotransgênicas com o objetivo de sintetizar um amido catiônico em plantas quetem moléculas de 2-aminó-anidroglicose. O curso metabólico descrito que,de acordo com a descrição do WO 00 11192 deve resultar em 2-amino-anidroglicose sendo incorporada ao amido, compreende inter alia a incorpo-ração de UDP-glicosamina através de amido sintases e/ou glicogênio sinta-ses no amido. É declarado que quantidades aumentadas de UDP-glicosamina poderiam ser detectadas em farinha de endosperma das plantasde milho transgênicas em questão superexpressando uma molécula de áci-do nucléico codificando uma proteína tendo a atividade (enzimática) de umaGFAT traducionalmente fundida com um peptídeo de sinal de plastídeo.Quando a proteína tendo a atividade (enzimática) de uma GFAT foi expressasem peptídeo de sinal, foi possível detectar uma quantidade maior de glico-samina 1-fosfato nas farinhas correspondentes de tecido de endosperma demilho. Não foi possível detectar amido catiônico nas plantas transgênicas.

A produção de hialuronan pela fermentação de cepas bacteria-nas está associada com custos altos, uma vez que as bactérias têm que serfermentadas em recipientes estéreis vedados sob condições de cultura con-troladas caras (vide, por exemplo, US 4.897.349). Ainda, a quantidade dehialuronan que pode ser produzida através de fermentação de cepas bacte-rianas é limitada pelas instalações de produção presentes em cada caso.

Aqui, foi também levado em consideração que fermentadores, como umaconseqüência de leis físicas, não podem ser construídos para volumes decultura excessivamente grandes. Menção particular pode ser feita aqui demistura homogênea das substâncias alimentadas do exterior (por exemplo,fontes nutrientes essenciais para bactérias, reagentes para regulagem dopH, oxigênio) com o meio de cultura requerido para produção eficiente que,em fermentadores grandes, pode ser assegurada apenas com gasto técnicogrande, se alguma.

A purificação de hialuronan a partir de organismos animais écomplicada devido à presença, em tecidos de animal, de outros mucopolis-sacarídeos e proteínas que especificamente se ligam a hialuronan. Em paci-entes, o uso de preparações medicinais contendo hialuronan contaminadaspor proteínas animais pode resultar em reações imunológicas indesejadasdo corpo (US 4.141.973), em particular se o paciente for alérgico a proteínasanimais (por exemplo, ovo de galinha branca). Ainda, as quantidades (ren-dimentos) de hialuronan que podem ser obtidas de tecidos de animal emqualidade e pureza satisfatórias são baixas (roosterscomb: 0,079% p/p,EP 0144019, US 4.782.046), que necessita do processamento de quantida-des grandes de tecidos animais. Um problema adicional no isolamento de hialuronan a partir de tecidos animais consiste em efeito que o peso molecu-lar do hialuronan durante a purificação é reduzido uma vez que tecidos ani-mais também contêm uma enzima de degradação de hialuronan (hialuroni-dase).

Em adição às hialuronidases e exotoxinas mencionadas, cepasde Streptococcus também produzem endotoxinas que, quando presentes emprodutos farmacológicos, apresentam risco para a saúde do paciente. Emum estudo científico, foi mostrado que mesmo produtos medicinais contendohialuronan no mercado contêm quantidades detectáveis de endotoxinas bac-teriana (Dick e outros, 2003, Eur. J. OpthalmoL 13(2), 176-184). Uma des- vantagem adicional do hialuronan produzido como auxílio de cepas de Strep-tococcus é o fato de que o hialuronan isolado tem um peso molecular menordo que hialuronan isolado de "roostercombs" (Lapcik e outros 1998, Chemi-cal Reviews 98(8), 2663-2684). A US 20030134393 descreve o uso de umacepa de Streptococcus para produção de hialuronan que sintetiza uma cáp- sula de hialuronan particularmente pronunciada (supercapsulada). O hialu-ronan isolado após fermentação tinha um peso molecular de 9,1 χ 106. Noentanto, o rendimento foi apenas 350 mg por litro.

Algumas das desvantagens de produção de hialuronan atravésde fermentação bacteriana ou através de isolamento de tecidos animais po-dem ser evitadas através da produção de hialuronan usando plantas trans-gênicas; no entanto, as quantidades atualmente obtidas de hialuronan quepodem ser produzidas usando plantas transgênicas requereriam uma árearelativamente grande sob cultivo para produzir quantidades relativamentegrandes de hialuronan. Ainda, o isolamento ou purificação de hialuronan apartir de plantas tendo um teor de hialuronan menor é consideravelmentemais complicado e custoso do que o isolamento ou purificação a partir deplantas tendo um teor de hialuronan maior.Embora hialuronan tenha propriedades incomuns, ele é, devidoà sua escassez e ao alto preço, raramente, se de algum modo, usado paraaplicações industriais.

Deste modo, é um objeto da presente invenção prover meios emétodos que permitam a provisão de hialuronan em quantidades e qualida-de suficientes e que tornem possível prover hialuronan mesmo para aplica-ções industriais e aplicações no campo de alimento e ração.

Este objetivo é alcançado pelas modalidades descritas nas rei-vindicações.

Deste modo, a presente invenção refere-se a células de plantageneticamente modificadas ou plantas geneticamente modificadas tendouma molécula de ácido nucléico, estavelmente integrada ao seu genoma,codificando uma hialuronan sintase, caracterizado pelo fato de que as ditascélulas de planta ou ditas plantas têm adicionalmente atividade aumentada> 15 de uma proteína tendo uma atividade (enzimática) de glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) comparado com células de planta do tiposelvagem correspondentes não-geneticamente modificadas ou plantas dotipo selvagem não-geneticamente modificadas.

Aqui, a modificação genética de células de planta geneticamen-te modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamente modifi-cadas de acordo com a invenção pode ser qualquer modificação genéticaresultando em uma integração estável de uma molécula de ácido nucléicocodificando uma hialuronan sintase em uma célula de planta ou uma plantae aumento da atividade de uma proteína tendo a atividade (enzimática) deuma GFAT em células de planta geneticamente modificadas ou plantas ge-neticamente modificadas, comparado com células de planta do tipo selva-gem não-geneticamente modificadas ou plantas do tipo selvagem não-geneticamente modificadas.

No contexto da presente invenção, o termo célula de planta dotipo selvagem deve ser compreendido como significando células de plantaque servem como material de partida para a preparação das células de plan-ta geneticamente modificadas de acordo com a invenção, isto é, sua infor-mação genética, sem considerar modificações genéticas introduzidas e re-sultando em uma integração estável de uma molécula de ácido nucléico co-dificando uma hialuronan sintase e aumentando a atividade de uma proteínatendo a atividade de uma GFAT, corresponde àquela de uma célula de plan-ta geneticamente modificada de acordo com a invenção.

No contexto da presente invenção, o termo planta do tipo selva-gem deve ser compreendido como significando plantas que serviram comomaterial de partida para a preparação das plantas geneticamente modifica-das de acordo com a invenção, isto é, sua informação genética, sem consi-derar as modificações genéticas introduzidas e resultando em uma integra-ção estável de uma molécula de ácido nucléico codificando uma hialuronansintase e aumentando a atividade de uma proteína tendo a atividade de umaGFAT, corresponde àquela de uma célula de planta geneticamente modifi-cada de acordo com a invenção.

No contexto da presente invenção, o termo correspondendo sig-nifica que quando uma pluralidade de objetos é comparada, os objetos emquestão que são comparados uns com os outros foram mantidos sob asmesmas condições. No contexto da presente invenção, o termo correspon-dendo no contexto de células de planta do tipo selvagem ou plantas do tiposelvagem significa que as células de planta ou plantas comparadas umascom as outras foram cultivadas sob as mesmas condições de cultivo e queelas têm a mesma idade (cultura).

No contexto da presente invenção, o termo hialuronan sintase(EC 2.4.1.212) deve ser compreendido como significando uma proteína quesintetiza hialuronan a partir de substratos UDP-ácido glucorônico (UDP-GIcA) e N-acetil glicosamina (UDP-GIcNAc). A síntese de hialuronan é cata-lisada de acordo com os esquemas de reação abaixo:

nUDP-GIcA + nUDP-GlcNAc->beta-1,4-[GlcA-beta-1,3-GlcNAc]n+ 2 nUDP

Moléculas de ácido nucléico e seqüências de proteína corres-pondentes codificando hialuronan sintases foram descritas, inter alia, para osorganismos que seguem: coelho (Oryctolagus cuniculus) ocHas2 (EMBLΑΒ055978.1, US 20030235893), ocHas3 (EMBL AB055979.1, US20030235893); babuíno (Papio anubis) paHasl (EMBL AY463695.1); sapo(Xenopus laevis) xlHasl (EMBL M22249.1, US 20030235893), xlHas2(DG42) (EMBL AF168465.1), xlHas3 (EMBL AY302252.1); humano (Homo sapiens) hsHASI (EMBL D84424.1, US 20030235893), hsHAS2 (EMBLU54804.1, US 20030235893), hsHAS3 (EMBL AF232772.1, US20030235893); camundongo (Mus musculus), mmHasl (EMBL D82964.1,US 20030235893), mmHAS2 (EMBL U52524.2, US 20030235893), mmHas3(EMBL U86408.2, US 20030235893); gado (Bos taurus) btHas2 (EMBLAJ004951.1, US 20030235893); galinha (Gallus gallus) ggHas2 (EMBLAF106940.1, US 20030235893); rato (Rattus norvegicus) rnHas 1 (EMBLAB097568.1, Itano e outros, 2004, J. Bioi Chem. 279(18) 18679-18678),rnHas2 (EMBL AF008201.1); rnHas 3 (NCBI NM_172319.1, Itano e outros,2004, J. BioL Chem. 279(18) 18679-18678), cavalo (Equus caballus) e-cHAS2 (EMBL AY056582.1, Gl:23428486), porco (Sus scrofa) sscHAS2(NCBI NM_214053.1, Gl:47522921), sscHas 3 (EMBLAB159675), peixe ze-bra (Danio rerio) brHasl (EMBL AY437407), brHas2 (EMBL AF190742.1)brHas3 (EMBL AF190743.1); Pasteurella multocida pmHas (EMBLAF036004.2); Streptococcuspyogenes spHas (EMBL, L20853.1, L21187.1,US 6,455,304, US 20030235893); Streptococcus equis seHas (EMBLAF347022.1, AY173078.1), Streptoeoceus uberis suHasA (EMBLAJ242946.2, US 20030235893), Streptoeoceus equisimilis seqHas (EMBLAF023876.1, US 20030235893); Sulfolobus solfatarieus ssHAS (US20030235893), Sulfolobus tokodaii stHas (AP000988.1), Parameeium bursa- ria Chlorella Virus 1, cvHAS (EMBL U42580.3, PB42580, US 20030235893).

No contexto da presente invenção, o termo glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) (E.C. 2.6.1.16), na literatura especializadatambém referida como glicosamina sintase, deve ser compreendido comosignificando uma proteína que sintetiza, a partir dos substratos glutamina e frutose 6-fosfato (Fruc-6-Ρ), glucosamina 6-fosfato (GlcN-6-Ρ). Esta catáliseacontece de acordo com o esquema de reação que segue:Glutamina + Fruc-6-P-> GlcN-6-Ρ + GlutamatoEm particular em organismos animais, foi possível demonstrarduas isoformas diferentes de proteínas tendo a atividade (enzimática) deuma GFAT (referida como GFAT-1 e GFAT-2, respectivamente, na literatu-ra). Hu e outros (2004), J. Bioi Chem. 279(29), 29988-29993 descrevemdiferenças das respectivas proteínas do camundongo: em adição a diferen-ças na expressão específica de tecido das proteínas em questão tendo aatividade (enzimática) de uma glutamina:frutose 6-fosfato amidrotransferase1 (GFAT-1) e uma glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase 2 (GFAT 2),foi possível mostrar que ambas isoformas são reguladas por fosforilação poruma proteína cinase dependente de cAMP. A atividade de uma proteína ten-do a atividade (enzimática) de uma GFAT-1 é inibida pela fosforilação de umresíduo serina conservado (serina 205 na GFAT-1 do camundongo, N9 deAcesso no GenBank: AF334736.1) da seqüência de aminoácido em questão,enquanto a atividade de uma proteína tendo a atividade de GFAT-2 é au-mentada pela fosforilação de um resíduo serina conservado (serina 202 naGFAT-2 do camundongo, N9 de Acesso no GenBank: NM_013529) da se-qüência de aminoácido em questão. Ambas proteínas tendo a atividade deuma GFAT-1 e proteínas tendo a atividade de uma GFAT-2 são inibidas deuma maneira dependente da concentração pela UDP-N-acetilglicosamina;no entanto, para uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2, a inibiçãopela UDP-N-acetilglicosamina é menor (redução máxima de atividade pelaUDP-N-acetilglicosamina cerca de 15%) comparado com uma proteína tendoa atividade de uma GFAT-1 (redução de atividade máxima pela UDP-N-acetilglicosamina cerca de 51% ou 80%). Existem indicações que a inibiçãode uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-1 em organismos animaisé baseada no fato de que em concentrações de UDP-N-acetilglicosaminaelevadas há uma glicosilação de O-glicose-N-acetilglicosamina das proteí-nas em questão. Se uma regulagem da atividade de proteínas pela O-glicosilação também acontece em células de planta não é ainda completa-mente conhecido (Huber e Hardin, 2004, Current Opinion in Piant Biotechno-Iogy 7, 318-322).

No contexto da presente invenção: o termo glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase-1 (GFAT-I)deve ser compreendido como signifi-cando uma proteína que tem a atividade de uma GFAT e cuja atividade éinibida pela fosforilação por uma proteína cinase dependente de cAMP.

No contexto da presente invenção, o termo glutamina: frutose 6-fosfato amidotransferase-2 (GFAT-2) deve ser compreendido como signifi-cando uma proteína que tem a atividade de uma GFAT e que é ativada porfosforilação por uma proteína cinases dependente de cAMP.

No contexto da presente invenção, o termo glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase -2 (GFAT-2) deve ser entendido como uma medidade proteína, a qual apresenta a atividade de um GFAT e, a qual é ativadapor fosforilação por uma proteína quinase dependente de CAMP é usadocomo um termo compreensivo que inclui todas as proteínas tendo a ativida-de de uma GFAT. Deste modo, ele também compreende proteínas referidasna literatura como glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase-1 (GFAT-1)ou como glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase-2 (GFAT-2), mas nãoé limitado a essas.

No contexto da presente invenção, o termo atividade aumentadade uma proteína tendo a atividade (enzimática) de uma GFAT significa umaexpressão aumentada de genes endógenos codificando proteínas tendo aatividade de uma GFAT e/ou uma quantidade aumentada de transcritos codi-ficando proteínas tendo a atividade de uma GFAT e/ou uma quantidade au-mentada de proteína tendo a atividade de uma GFAT nas células e/ou umaatividade enzimática aumentada de proteínas tendo a atividade de umaGFAT nas células.

Uma expressão aumentada pode ser determinada, por exemplo,através da medição da quantidade de transcritos codificando uma proteínatendo a atividade de uma GFAT, por exemplo, através de análise Northernblot ou RT-PCR. Aqui, um aumento de preferência significa um aumento naquantidade de transcritos comparado com células de planta do tipo selva-gem não-geneticamente modificadas correspondentes ou plantas do tiposelvagem não-geneticamente modificadas em pelo menos 50%, em particu-lar em pelo menos 70%, de preferência pelo menos 85% e particularmentede preferência em pelo menos 100%. Um aumento na quantidade de trans-critos codificando uma proteína tendo a atividade de uma GFAT tambémsignifica que plantas ou células de planta não tendo quaisquer quantidadesdetectáveis de transcritos codificando uma proteína tendo a atividade deuma GFAT têm, após modificação genética de acordo com a invenção,quantidades detectáveis de transcritos codificando uma proteína tendo a ati-vidade de uma GFAT.

Um aumento na quantidade de proteína tendo a atividade deuma GFAT resultando em uma atividade aumentada dessas proteínas nascélulas de planta em questão pode ser determinado, por exemplo, atravésde métodos imunológicos, tal como análise Western blot, ELISA (EnzymeLinked Immuno Sorbent Assay) ou RIA (Radio Immune Assay). Métodos pa-ra preparação de anticorpos reagindo especificamente com uma proteínaparticular, isto é, se ligando especificamente à dita proteína, são conhecidosda pessoa versada na técnica (vide, por exemplo, Lottspeich e Zorbas(Eds.), 1998, Bioanalytik [Bioanalysis]; Spektrum akad. Verlag, Heidelberg,Berlin, ISBN 3-8274-0041-4). Algumas companhias (por exemplo, Eurogen-tec, Bélgica) oferecem a preparação de tais anticorpos como um serviço sobencomenda. Aqui, um aumento na quantidade de proteína de preferênciasignifica um aumento na quantidade de proteína tendo uma atividade deuma GFAT comparado com células de planta do tipo selvagem não-geneticamente modificadas ou plantas do tipo selvagem não-geneticamentemodificadas em pelo menos 50%, em particular em pelo menos 70%, de pre-ferência em pelo menos 85% e particularmente de preferência em pelo me-nos 100%. Um aumento na quantidade de proteína tendo uma atividade deuma GFAT também significa que plantas ou células de planta não tendo ne-nhuma quantidade detectável de uma proteína tendo a atividade de umaGFAT têm, após modificação genética de acordo com a invenção, umaquantidade detectável de uma proteína tendo a atividade de uma GFAT.

A atividade aumentada de uma proteína tendo a atividade deuma GFAT em extratos de planta pode ser determinada através de métodosconhecidos da pessoa versada na técnica conforme descrito, por exemplo,em Samac e outros (2004, Applied Biochemistry and Biotechnology 113-116,Humana Press, Editor Ashok Mulehandani, 1167-1182, ISSN 0273-2289).

Um método preferido para determinação da quantidade da atividade de umaproteína tendo a atividade de uma GFAT é dado em Métodos Gerais, item 5.

Uma quantidade aumentada de atividade (enzimática) de prote-ínas tendo a atividade de uma GFAT significa de preferência um aumento daatividade de tais proteínas em pelo menos 50%, de preferência pelo menos70%, especialmente de preferência pelo menos 85% e particularmente depreferência pelo menos 100% comparado com células de planta do tipo sel-vagem não-geneticamente modificadas ou plantas do tipo selvagem não-geneticamente modificadas. Um aumento na quantidade de atividade enzi-mática de proteínas tendo a atividade de uma GFT também significa queplantas ou células de planta não tendo nenhuma quantidade detectável deuma proteína tendo a atividade de uma GFAT têm, após modificação genéti-ca de acordo com a invenção, uma quantidade detectável de uma proteínatendo a atividade de uma GFAT.

No contexto da presente invenção, o termo genoma deve sercompreendido como significando todo o material genético presente em umacélula de planta. A pessoa versada na técnica sabe que, em adição ao nú-cleo, outros compartimentos (por exemplo, plastídeos, mitocôndria) tambémcontêm material genético.

No contexto da presente invenção, o termo molécula de ácidonucléico estavelmente integrada deve ser compreendido como significando aintegração de uma molécula de ácido nucléico no genoma da planta. Umamolécula de ácido nucléico estavelmente integrada é caracterizada pelo fatode que, durante a replicação do sítio de integração correspondente, ela émultiplicada junto com as seqüências de ácido nucléico do hospedeiro quedelimitam o sítio de integração, de modo que o sítio de integração no fila-mento de DNA replicado é circundando pelas mesmas seqüências de ácidonucléico que no filamento de leitura que serve como uma matriz para a repli-cação.

Um grande número de técnicas para integrar estavelmente mo-léculas de ácido nucléico em uma célula hospedeiro de planta está disponí-vel. Essas técnicas incluem a transformação de células de planta com T-DNA usando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes comomeio de transformação, fusão de protoplasto, injeção, eletroporação deDNA, introdução de DNA através da abordagem biolística e também opçõesadicionais (revisto em Transgenic Plants, Leandro ed., Humana Press 2004,ISBN 1-59259-827-7). O uso de transformação mediada por agrobacteriumde células de planta foi submetido a estudos minuciosos e foram descritosexaustivamente na EP 120516; Hoekema, Em: The Binary Plant Vector Sys- tem Offsetdrukkerij Kanters B.V. Albiasserdam (1985), Capítulo V; Fraley eoutros, Crit. Rev. Piant Sei. 4, 1-46 e em An e outros EMBO J. 4, (1985),277-287. Para a transformação de batatas vide, por exemplo, Rocha-Sosa eoutros, EMBO J. 8, (1989), 29-33), para a transformação de plantas de toma-te vide, por exemplo, US 5.565.347.

A transformação de plantas monocotiledôneas usando vetoresbaseados em transformação de Agrobacterium foi descrita, também (Chan eoutros, Piant Moi. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei e outros, Piant J. 6, (1994)271-282; Deng e outros, Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink e ou-tros, Piant Ceii Reports 11, (1992), 76-80; May e outros, Bio/Technoiogy 13, (1995), 486-492; Conner e Domisse, Int. J. Plant Sei. 153 (1992), 550-555;Ritchie e outros, Transgenic Res. 2, (1993), 252-265). Um sistema alternati-vo para transformação de plantas monocotiledôneas é a transformação u-sando a abordagem biolística (Wan e Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994),37-48; Vasil e outros, Bio/Technoiogy 11 (1993), 1553-1558; Ritala e outros,Plant Moi. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer e outros, Theor. Appi. Genet.79, (1990), 625-631), a transformação de protoplasto, a eletroporação decélulas parcialmente permeabilizadas, a introdução de DNA usando fibras devidro. Em particular, a transformação de milho foi descrita várias vezes naliteratura (cf., por exemplo, W095/06128, EP0513849, EP0465875,EP0292435; Fromm e outros, Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gor-don-Kamm e outros, PIantCeII 2, (1990), 603-618; Koziel e outros, Biotech-nology 11 (1993), 194-200; Moroc e outros, Theor. Appi. Genet. 80, (1990),721-726). A transformação de outras gramas, tal como "switchgrass" (Pani-cum virgatum) foi também descrita (Richards e outros, 2001, Plant Cell Re-porters 20, 48-54). A transformação bem sucedida de outras espécies decereal foi também descrita, por exemplo, para cevada (Wan e Lemaux, s.o.;Ritala e outros, s.o.; Krens e outros, Nature 296, (1982), 72-74) e para trigo(Nehra e outros, Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker e outros, 1994, PlantJournal 5, 299-307). Todos os métodos acima são adequados no contextoda presente invenção.

Comparado com a técnica anterior, células de planta genetica-mente modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção oferecem a vantagem de que elasproduzem quantidades maiores de hialuronan do que plantas tendo apenasa atividade de uma hialuronan sintase. Isto permite que hialuronan seja pro-duzido com pouco gasto uma vez que o isolamento de hialuronan de plantastendo um teor de hialuronan maior é menos complicado e de custo mais efi-ciente. Ainda, comparado com as plantas descritas na técnica anterior, áreasde cultivo menores são requeridas para produzir hialuronan usando as plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção. Isto leva à possi-bilidade de prover hialuronan em quantidades suficientes mesmo para apli-cação industrial onde ele não é atualmente usado devido à sua escassez e oalto preço. Organismos de planta infectados com vírus do gênero Chlorellasão inadequados para produção de quantidades relativamente grandes dehialuronan. Na produção de hialuronan, algas infectadas com vírus têm adesvantagem de que os genes requeridos para síntese de hialuronan nãosão estavelmente integrados ao seu genoma (Van Etten and Meints, 1999,Annu. Rev. Microbiol. 53, 447-494), de modo que, para produção de hialuro-nan, a infecção com vírus tem que ser repetida. Deste modo, não é possívelisolar células de Chlorella individuais que sintetizem continuamente a quali-dade e a quantidade desejadas de hialuronan. Ainda, em algas Chlorellainfectadas com vírus, hialuronan é apenas produzido por um período detempo limitado, e como um resultado da Iise causada pelo vírus, as algassão mortas apenas cerca de 8 horas após a infecção (Van Etten e outros,2002, Arch. Viroi 147, 1479-1516). Em contraste, a presente invenção ofe-rece a vantagem que as células de planta geneticamente modificadas deacordo com a invenção e as plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção podem ser propagadas de uma maneira ilimitada vegetati-vãmente ou sexualmente e que elas produzem hialuronan continuamente.As plantas transgênicas descritas no WO 05 012529, que têm uma moléculade ácido nucléico codificando uma hialuronan sintase, sintetizam uma quan-tidade relativamente pequena de hialuronan. Em contraste, a presente in-venção oferece a vantagem de que células de planta geneticamente modifi-cadas de acordo com a invenção e plantas geneticamente modificadas deacordo com a invenção sintetizam quantidades consideravelmente maioresde hialuronan.

Deste modo, a presente invenção também provê células deplanta geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou plantas ge-neticamente modificadas de acordo com a invenção que sintetizam hialuro-nan. De preferência células de planta de acordo com a invenção ou plantasde acordo com a invenção sintetizam pelo menos 500 pg de hialuronan porgrama de peso fresco, com preferência pelo menos 1500 pg de hialuronanpor grama de peso fresco, particularmente de preferência pelo menos 3500pg de hialuronan por grama de peso fresco, especialmente de preferênciapelo menos 4000 pg de hialuronan por grama de peso fresco e com maispreferência ainda pelo menos 5500 pg de hialuronan por grama de pesofresco. De preferência células de planta de acordo com a invenção ou plan-tas de acordo com a invenção sintetizam no máximo 25000 pg de hialuronanpor grama de peso fresco, com preferência no máximo 20000 pg de hialuro-nan por grama de peso fresco, particularmente de preferência no máxima15000 pg de hialuronan por grama de peso fresco, especialmente de prefe-rência no máximo 10000 pg de hialuronan por grama de peso fresco e commais preferência no máximo 6500 pg de hialuronan por grama de peso fres-co.

Foi observado que, durante o tempo de desenvolvimento, hialu-ronan acumula em tecido de planta; deste modo, a quantidade de hialuronancom relação ao peso fresco ou com relação ao peso seco nas células deplanta geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou nas plantasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção deve ser determinadacom preferência particular durante coleta ou (um ou dois) dias antes da cole-ta das células de planta em questão ou das plantas em questão. Aqui, é feitouso em particular de material de planta (por exemplo, bulbos, sementes, fo-lhas) com relação à quantidade de hialuronan que deve ser usada para pro-cessamento adicional.

Células de planta geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãoque sintetizam hialuronan podem ser identificadas através de isolamento dohialuronan que é sintetizado por elas e provisão de sua estrutura. Uma vezque tecido de planta tem a vantagem que ele não contém hialuronidases, ummétodo de isolamento simples e rápido pode ser usado para confirmação dapresença de hialuronan em células de planta geneticamente modificadas deacordo com a invenção ou plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção. Para esta finalidade, água é adicionada ao tecido de plantaa ser examinado e o tecido de planta é então mecanicamente cominuído(com o auxílio de, por exemplo, um moinho de conta, um moinho de braço,um misturador Warring1 um extrator de suco, etc). Se necessário, mais águapode então ser adicionada à suspensão, e os restos celulares e componen-tes insolúveis em água são então removidos através de centrifugação oupeneiramento. A presença de hialuronan no sobrenadante obtido após cen-trifugação pode ser então demonstrada usando, por exemplo, uma proteínaque se liga especificamente a hialuronan. Um método para detecção de hia-luronan com o auxílio de uma proteína que se liga especificamente a hialu-ronan é descrito, por exemplo, na US 5.019.498. Estojos de teste (por e-xemplo, o Hyaluronic acid (HA) test kitóa Corgenix, Inc., Colorado, USA, N5do Produto 029-001); vide também Métodos Gerais item 4). Em paralelo, épossível inicialmente digerir uma alíquota do sobrenadante de centrifugaçãoobtido com hialuronidase e então confirmar a presença de hialuronan com oauxílio de uma proteína que se liga especificamente a hialuronan, conformeacima descrito. Através da ação da hialuronidase na batelada paralela, ohialuronan presente nela é degradado, de modo que após digestão completanão é mais possível detectar quantidades significantes de hialuronan. A pre-sença de hialuronan no sobrenadante de centrifugação pode então ser tam-bém confirmada usando outros métodos de análise, tal como, por exemplo,IR, RMN ou espectroscopia de massa.

A superexpressão, em milho, de uma proteína tendo a atividade(enzimática) de uma GFAT fundida traducionalmente com um peptídeo desinal de plastídeo resultou em um teor de UDP-glicosamina aumentado, e asuperexpressão citosólica, em milho, de uma proteína tendo a atividade (en-zimática) de uma GFAT resultou em um teor de glicosamina 1-fosfato au-mentado em tecido de endosperma moído. No entanto, UDP-glicosamina eglicosamina 1-fosfato não são substratos para a síntese de hialuronan atra-vés de hialuronan sintase. Ainda, sabe-se que glicosamina tem um efeitocitotóxico sobre células de planta (Roberts e outros, 1971, Plant Physiol. 48,36-42) e que, se concentrações relativamente altas estiverem presentes emcélulas de planta, ela é convertida em glicosamina 6-fosfato. Glicosamina 6-fosfato é da mesma maneira tóxica para células de planta (WO 98 35047,US 6.444.878). Ainda, sabe-se que proteínas tendo a atividade de umaGFAT podem ser reguladas de uma maneira inibidora por metabólitos quesão formados no curso metabólico adicional para a síntese de UDP-N-acetil-glicosamina. Proteínas tendo a atividade de uma GFAT, isoladas de eucario-tes (ambos com organismos animais e planta), são inibidas, por exemplo,pela UDP-N-acetil-glicosamina, que é um dos dois substratos para hialuro-nan sintase (Kornfeld, 1967, J. Biol. Chem. 242(13), 3135-3141; Graack eoutros, 2001, Biochem. J. 360, 401-412; Mayer e outros, 1968, Plant Physiol.43, 1097-1107). Proteínas bacterianas tendo a atividade de uma GFAT sãoinibidas por glicosamina 6-fosfato, um produto de reação direta da reaçãocatalisada por GFAT (Deng e outros, 2005, Metabolic Engineering 7, 201-214). Não há quaisquer indicações na literatura do que pode limitar a quanti-dade de hialuronan sintetizado em células de planta. Deste modo, foi sur-preendentemente verificado que células de planta geneticamente modifica-das ou plantas geneticamente modificadas tendo uma molécula de ácidonucléico codificando uma hialuronan sintase e tendo atividade de GFAT adi-cionalmente aumentada comparado com células de planta geneticamentemodificadas ou plantas geneticamente modificadas tendo (apenas) atividadede hialuronan sintase produzem quantidades significantemente altas de hia-luronan.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se acélulas de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, caracterizadopelo fato de que elas produzem uma quantidade aumentada de hialuronancomparado com células de planta geneticamente modificadas ou comparadocom plantas geneticamente modificadas que (apenas) têm a atividade deuma hialuronan sintase ou comparado com células de planta geneticamentemodificadas ou comparado com plantas geneticamente modificadas tendo aatividade de uma hialuronan sintase e nenhuma atividade aumentada deuma proteína tendo a atividade de uma GFAT.

No contexto da presente invenção, o termo célula de planta ouplanta (apenas) tendo a atividade de uma hialuronan sintase deve ser com-preendido como significando uma célula de planta geneticamente modificadaou uma planta geneticamente modificada onde a modificação genética con-siste em que ela compreende uma molécula de ácido nucléico codificandouma hialuronan sintase, comparado com células de planta do tipo selvagemnão-geneticamente modificada ou plantas do tipo selvagem não-geneticamente modificadas. Em particular, células de planta ou plantas (a- penas) tendo a atividade de uma hialuronan sintase são caracterizadas pelofato de que elas sintetizam hialuronan e que elas não têm quaisquer modifi-cações genéticas adicionais outras que não a introdução de uma moléculade ácido nucléico codificando uma hialuronan sintase em células de plantado tipo selvagem não-geneticamente modificadas ou plantas do tipo selva-gem não-geneticamente modificadas. De preferência, tais plantas não têmuma atividade aumentada de uma proteína tendo a atividade de uma GFAT.

A quantidade de hialuronan produzido por células de planta ouplantas pode ser determinada com o auxílio dos métodos que já foram des-critos acima, por exemplo, usando um estojo de teste comercial (por exem-plo, o Hyaluronic acid (HA) test kit da Corgenix, Inc., Colorado, USA, Ne doproduto 029-001). Um método que é preferido no contexto da presente in-venção para determinação do teor de hialuronan em células de planta ouplantas é descrito sob Métodos Gerais, item 4.

Em uma modalidade adicional da presente invenção, as célulasde planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou as plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção são células deplanta de uma planta terrestre verde ou plantas terrestres verdes, respecti-vamente, que sintetizam hialuronan.

No contexto da presente invenção, o termo planta terrestre ver-de (Embryophyta) deve ser compreendido como definido em Strasburger,Lehrbuch der Botanik [Textbook of Botanyuma], 34- Ed., Spektrum Akad.Verl., 1999, (ISBN 3-8274-0779-6)

Uma modalidade preferida da presente invenção refere-se acélulas de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção deplantas multicelulares ou plantas geneticamente modificadas de acordo coma invenção que são organismos multicelulares. Deste modo, a presente mo-dalidade refere-se a células de planta ou plantas que não se originam deplantas de célula única (protistas) ou que não são protistas.

As células de planta geneticamente modificadas de acordo coma invenção ou as plantas geneticamente modificadas de acordo com a in-venção podem, a princípio, ser células e plantas, respectivamente, ou qual-quer espécie de planta, isto é, ambas plantas monocotiledôneas e dicotile-dôneas. Elas são de preferência plantas de cultura, isto é, plantas cultivadaspelo homem para o propósito de alimentação do homem e animal ou paraprodução de biomassa e/ou para preparação de substâncias para propósitostécnicos, industriais (por exemplo, milho, arroz, trigo, alfalfa, centeio, aveias,cevada, mandioca, batata, tomate, "switchgrass" (Panicum virgatum), sagu,feijões mung, ervilhas, sorgo, cenouras, beringela, rabanete, semente decolza, sojas, amendoins, pepinos, abóboras, melões, alho-poró, alho, repo-lho, espinafre, batata doce, aspargo, abobrinhas, alface, alcachofras, milhoverde, pastinaca, escorcinoeira, alcachofra de Jerusalém, banana, beterrabaaçucareira, cana-de-açúcar, raiz de beterraba, brócolis, repolho, cebola, be-terraba amarela, dente-de-leão, morango, maçã, abricó, ameixa, pêssego,videiras, couve-flor, aipo, pimentões vermelhos, nabo, ruibarbo). Particular-mente preferidas são plantas de arroz, tomate ou batata.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se acélulas de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção onde a molé-cuia de ácido nucléico codificando hialuronan sintase é caracterizada pelofato de que ela codifica hialuronan sintase viral. A molécula de ácido nucléi-co codificando a hialuronan sintase codifica de preferência uma hialuronansintase de um vírus que infecta algas. Com relação a um vírus de infecçãode alga, a molécula de ácido nucléico que codifica uma hialuronan sintasecodifica de preferência uma hialuronan sintase de um vírus de infecção deChlorella, particularmente de preferência uma hialuronan sintase de um Pa-ramecium bursaria Chlorella Virus 1 e especialmente de preferência umahialuronan sintase de um vírus de Paramecium bursaria Chlorella de umalinhagem H1.

Em uma modalidade preferida adicional, a presente invençãorefere-se a células de planta geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãoonde a molécula de ácido nucléico que codifica hialuronan sintase é caracte-rizada pelo fato de que os códons da molécula de ácido nucléico codificandouma hialuronan sintase são modificados comparado com os códons da mo-lécula de ácido nucléico codificando a hialuronan sintase do organismo doqual a hialuronan sintase se origina. Com preferência particular, os códonsda hialuronan sintase foram modificados de modo que eles são adaptadospara a freqüência de uso dos códons da célula de planta ou planta no geno-ma da qual eles são integrados ou devem ser integrados.

Devido à degeneração do código genético, aminoácidos podemser codificados por um ou mais códons. Em organismos diferentes, os có-dons codificando um aminoácido são usados em freqüências diferentes. A-daptação do códon de uma seqüência de ácido nucléico de codificação àfreqüência de seu uso na célula de planta na planta cujo genoma a seqüên-cia a ser expressa deve ser integrada pode contribuir para uma quantidadeaumentada de proteína traduzida e/ou para a estabilidade do mRNA emquestão nas células de planta ou plantas particulares. A freqüência de usode códons nas células de planta ou plantas em questão pode ser determina-da pela pessoa versada na técnica através de exame do máximo possível deseqüências de ácido nucléico de codificação do organismo em questão paraa freqüência com a qual certos códons são usados para codificação de umcerto aminoácido. A freqüência de uso de códons de certos organismos éconhecida da pessoa versada na técnica e pode ser determinada de umamaneira simples e rápida usando programas de computador. Programas decomputador adequados estão publicamente acessíveis e providos grátis interalia na internet (por exemplo, http://gcua.schoedl.de/;http://www.kazusa.or.jp/codon/;

http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html). Adaptação dos códons deuma seqüência de codificação de ácido nucléico à freqüência de seu uso nacélula de planta ou planta cujo genoma a seqüência a ser expressa deve serintegrada pode ser realizada através de mutagênese in vitro ou, de preferên-cia, através de síntese de novo da seqüência de gene. Métodos para a sín-tese de novo de seqüências de ácido nucléico são conhecidos da pessoaversada na técnica. Uma síntese de novo pode ser realizada, por exemplo,inicialmente sintetizando oligonucleotídeos de ácido nucléico individuais, hi-bridização desses com oligonucleotídeos complementares a eles, então elesformam um filamento de DNA duplo, e então ligação dos oligonucleotídeosde filamento duplo individuais de modo que a seqüência de ácido nucléicodesejada é obtida. A síntese de novo de seqüências de ácido nucléico inclu-indo a adaptação da freqüência com a qual os códons são usados para umcerto organismo alvo pode ser também solicitada a companhias que ofere-cem este serviço (por exemplo, Entelechon GmbH, Regensburg, Alemanha).

A molécula de ácido nucléico codificando a hialuronan sintase éde preferência caracterizada pelo fato de que ela codifica uma hialuronansintase cujas seqüências de aminoácido são pelo menos 70%, de preferên-cia pelo menos 80%, com preferência pelo menos 90%, especialmente depreferência pelo menos 95% e com mais preferência pelo menos 98% idên-ticas à seqüência de aminoácido mostrada sob SEQ ID NO:2. Em uma mo-dalidade particularmente preferida, a molécula de ácido nucléico codificandoa hialuronan sintase é caracterizada pelo fato de que ela codifica uma hialu-ronan sintase tendo uma seqüência de aminoácido mostrada sob SEQ IDNO:2.

Em uma modalidade adicional, a molécula de ácido nucléicocodificando uma hialuronan sintase é pelo menos 70%, de preferência pelomenos 80%, com preferência pelo menos 90%, especialmente de preferên-cia pelo menos 95% e com mais preferência pelo menos 98% idêntica à se-qüência de ácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 3. Emuma modalidade particularmente preferida, a molécula de ácido nucléico co-dificando a hialuronan sintase é caracterizada pelo fato de que ela tem a se-qüência de ácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO 3.

Em 25 de agosto de 2004, o plasmídeo IC 34-222, compreen-dendo uma molécula de ácido nucléico sintética codificando uma hialuronansintase de Paramecium bursaria Chlorella vírus foi depositado no DeutscheSammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, MascheroderWeg. 1b, 38124 Brunswick, Alemanha, sob o número DSM16664, de acordocom o Tratado de Budapeste. A seqüência de aminoácido mostrada na SEQID NO 2 pode ser derivada da região de codificação da seqüência de ácido nucléico integrada ao plasmídeo IC 341-222 e codifica uma hialuronan sinta-se de Paramecium bursaria Chlorella vírus.

Deste modo, a presente invenção refere-se também a células deplanta geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou plantas ge-neticamente modificadas de acordo com a invenção onde a molécula de áci- do nucléico que codifica a hialuronan sintase é caracterizada pelo fato delacodificar uma proteína cuja seqüência de aminoácido pode ser derivada daregião de codificação da seqüência de ácido nucléico inserida no plasmídeoDSM16664 ou que ela codifica uma proteína cuja seqüência de aminoácidoé pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, com preferência pelomenos 90%, especialmente de preferência pelo menos 95% e com mais pre-ferência pelo menos 98% idêntica à seqüência de aminoácido que pode serderivada da região de codificação da seqüência de ácido nucléico inseridano plasmídeo DSM16664.

A presente invenção refere-se também a células de planta gene-ticamente modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção onde a molécula de ácido nucléicocodificando hialuronan sintase é caracterizada pelo fato de que ela é a se-qüência de ácido nucléico codificando hialuronan sintase integrada ao plas-mídeo DSM16664 ou que ela é pelo menos 70%, de preferência pelo menos80%, com preferência pelo menos 90%, especialmente de preferência pelomenos 95% e com mais preferência pelo menos 98% idêntica à seqüênciade ácido nucléico integrada no plasmídeo DSM16664.

A presente invenção refere-se ainda a células de planta geneti-camente modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção que são caracterizadas pelo fato deque elas têm uma molécula de ácido nucléico estranha estavelmente inte-grada no seu genoma, a dita molécula de ácido nucléico estranha aumen-tando a atividade de uma proteína tendo a atividade de uma GFAT compa-rado com células de planta do tipo selvagem não-geneticamente modificadascorrespondentes ou plantas do tipo selvagem não-geneticamente modifica-das correspondentes.

No contexto da presente invenção, o termo "molécula de ácidonucléico estranha" deve ser compreendido como significando uma moléculaque ou não acontece naturalmente nas células de planta do tipo selvagemcorrespondentes ou que não acontece naturalmente na disposição espacialconcreta em células de planta do tipo selvagem ou que está localizada emum sítio no genoma da célula de planta do tipo selvagem onde ela não acon-tece naturalmente. De preferência, a molécula de ácido nucléico estranha éuma molécula recombinante compreendendo vários elementos cuja combi-nação ou disposição espacial específica não acontece naturalmente em cé-lulas de planta.

No contexto da presente invenção, o termo molécula de ácidonucléico recombinante" deve ser compreendido como significando uma mo-lécula de ácido nucléico que tem várias moléculas de ácido nucléico que nãoestão naturalmente presentes em uma combinação tal como aquela presen-te em uma molécula dé ácido nucléico recombinante. Então, moléculas deácido nucléico recombinantes podem, em adição a moléculas de ácido nu-cléico codificando uma hialuronan sintase e/ou uma proteína tendo a ativida-de de uma GFAT, adicionalmente ter seqüências de ácido nucléico que nãoestão naturalmente presentes em combinação com as moléculas de ácidonucléico mencionadas. As seqüências de ácido nucléico adicionais mencio-nadas que estão presentes em uma molécula de ácido nucléico recombinan-te em combinação com uma molécula de ácido nucléico codificando umahialuronan sintase ou uma proteína tendo a atividade de uma GFAT podemser quaisquer seqüências. Por exemplo, elas podem ser seqüências de áci-do nucléico de planta genômicas. As seqüências de ácido nucléico adicio-nais são de preferência seqüências reguladoras (promotores, sinais de ter-minação, aumentadores), particularmente de preferência seqüências regula-doras que são ativas em tecido de planta, especialmente de preferência se-qüências reguladoras específicas de tecido que são ativas em tecido deplanta. Métodos para geração de moléculas de ácido nucléico recombinan-tes são conhecidos da pessoa versada na técnica e compreendem métodosde engenharia genética, tal como, por exemplo, ligação de moléculas de áci-do nucléico através de ligação, recombinação genética e ou a síntese denovo de moléculas de ácido nucléico (vide, por exemplo, Sambrook e outros,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3- edição (2001) Cold Spring Har-bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773, Ausubele outros, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 5- edição(2002), ISBN: 0471250929).

Células de planta geneticamente modificadas e plantas geneti-camente modificadas tendo uma molécula de ácido nucléico estranha esta-velmente integrada ao seu genoma ou uma pluralidade de moléculas de áci-do nucléico estranhas estavelmente integradas ao seu genoma que codifi-cam hialuronan sintase e que aumentam a atividade de uma proteína tendoa atividade de uma GFAT comparado com células de planta do tipo selva-gem não-geneticamente modificadas ou plantas do tipo selvagem não-geneticamente modificadas podem ser distinguidas das ditas células deplanta do tipo selvagem e ditas plantas do tipo selvagem, respectivamente,inter alia, pelo fato de que elas compreendem uma molécula de ácido nucléi-co estranha que não acontece naturalmente em células de planta do tiposelvagem e plantas do tipo selvagem, respectivamente, ou pelo fato de quetal molécula é integrada em um sítio no genoma da célula de planta geneti-camente modificada de acordo com a invenção ou no genoma da planta ge-neticamente modificada de acordo com a invenção onde ela não aconteceem células de planta do tipo selvagem e planta do tipo selvagem, respecti-vãmente, isto é, em um ambiente genômico diferente. Ainda, tais células deplanta geneticamente modificadas de acordo com a invenção e plantas ge-neticamente modificadas de acordo com a invenção podem ser distinguidasdas células de planta do tipo selvagem não-geneticamente modificadas eplantas do tipo selvagem não-geneticamente modificadas, respectivamente, pelo fato de que elas compreendem pelo menos uma cópia da molécula deácido nucléico estranha estavelmente integrada ao seu genoma, se apropri-ado em adição a cópias tal como uma molécula naturalmente presente nascélulas de planta do tipo selvagem ou plantas do tipo selvagem. Se a(s) mo-lécula(s) de ácido nucléico estranha(s) introduzida(s) nas células de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou a planta geneti-camente modificada de acordo com a invenção forem cópias adicionais demoléculas já naturalmente presentes nas células de planta do tipo selvagemou plantas do tipo selvagem, as células de planta geneticamente modifica-das de acordo com a invenção e as plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção podem ser distinguidas de células de planta do tiposelvagem e plantas do tipo selvagem, respectivamente, em particular pelofato de que essa cópia/essas cópias adicional (is) é/estão localizada (s) emsítios no genoma onde ela elas não está/estão presente(s) em células deplanta do tipo selvagem e plantas do tipo selvagem, respectivamente.

A integração estável de uma molécula de ácido nucléico no ge-noma de uma célula de planta ou uma planta pode ser demonstrada atravésde métodos genéticos e ou métodos de biologia molecular. Uma integraçãoestável de uma molécula de ácido nucléico no genoma de uma célula deplanta ou no genoma de uma planta é caracterizada pelo fato de que na pro-gênie que herdou a dita molécula de ácido nucléico, a molécula de ácidonucléico estavelmente integrada está presente no mesmo ambiente genômi-co que na geração de origem. A presença de uma integração estável de umaseqüência de ácido nucléico no genoma de uma célula de planta ou no ge-noma de uma planta pode ser demonstrada usando métodos conhecidos dapessoa versada na técnica, inter alia, com o auxílio de análise Souther blotda análise RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorfism) (Nam e outros,1989, The Plant Cell 1, 699-705; Leister e Dean, 1993, The Plant Journal4(4), 745-750), com métodos baseados em PCR, tal como, por exemplo, aanálise de diferenças em comprimento nos fragmentos amplificados (Ampli-fied Fragment Lenght Polymorfism, AFLP) (Castilgioni e outros, 1998, Gene-tics 149, 2039-2056; Meksem e outros, 2001, Molecular Genetics and Ge-nomics 265, 207-214; Meyer e outros, 1998, Molecular and General Genetics259, 150-260) ou usando fragmentos amplificados clivados usando endonu-cleases de restrição (Cleaved Amplified Polymorfic Sequences, CAPS) (Ko-nieczny e Ausubel, 1993, The Plant Journal 4, 403-410; Jarvis e outros,1994, Plant Molecular Biology 24, 685-687; Bachem e outros, 1996, ThePlant Journal9(5), 745-753).

A princípio, a molécula de ácido nucléico estranha pode serqualquer molécula de ácido nucléico que aumente, na célula de planta ouplanta, a atividade de uma proteína tendo a atividade de uma GFAT.

No contexto da presente invenção, células de planta genetica-mente modificadas de acordo com a invenção e plantas geneticamente mo-dificadas de acordo com a invenção podem ser também preparadas usandomutagênese de inserção (revisão: Thorneycrof e outros, 2001, Journal ofExperimental Botany 52 (361), 1593-1601). No contexto da presente inven-ção, mutagênese de inserção deve ser compreendida como significando emparticular a inserção de transposon ou DNA de transferência (T-DNA) em umgene ou na vizinhança de um gene codificando uma proteína tendo a ativi-dade de uma GFAT, deste modo aumentando a atividade de uma proteínatendo a atividade de uma GFAT na célula em questão.

Os transposons podem ou ser transposons que ocorrem natu-ralmente na célula (transposons endógenos) ou aqueles que não estão natu-ralmente presentes na dita célula, mas foram introduzidos na célula atravésde engenharia genética, tal como, por exemplo, transformação da célula(transposons heterólogos). A modificação da expressão de genes pelostransposons é conhecida da pessoa versada na técnica. Uma revisão do usode transposons endógenos e heterólogos como ferramentas em biotecnolo-gia de planta é dada em Ramachandran e Sundaresan (2001, Plant Physio-Iogy and Biochesmitry 39, 234-252). Mutagênese por inserção de T-DNA ébaseada no fato de que certas seções (T-DNA) de plasmídeos Ti de Agro-bacterium podem ser integradas no genoma de células de planta. O sítio deintegração no cromossoma da planta não é predeterminado, integração podeestar em qualquer local. Se o T-DNA for integrado em uma seção ou na vizi-nhança de uma seção do cromossomo representando uma função de gene,isto pode resultar em uma expressão de gene aumentada e então ser tam-bém uma mudança na atividade da proteína codificada pelo gene em ques-tão.

As seqüências inseridas no genoma (em particular transposonsou T-DNA) são caracterizadas pelo fato de que elas compreendem seqüên-cias resultando na ativação de seqüências reguladoras de um gene codifi-cando uma proteína tendo a atividade de uma GFAT (tagging de ativação).De preferência, as seqüências inseridas no genoma (em particular transpo-sons ou T-DNA) são caracterizadas pelo fato de que elas são integradas navizinhança de moléculas de ácido nucléico endógenas no genoma da célulade planta ou planta codificando uma proteína tendo a atividade de umaGFAT.Células de planta geneticamente modificadas de acordo com ainvenção e plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãopodem ser geradas, por exemplo, usando o método de tagging de ativação(vide, por exemplo, Walden e outros, Plant J. (1991), 281-288; Walden e ou-tros, Plant Moi Biol. 26 (1994), 1521-1528). Este método é baseado na ati-vação de promotores endógenos pelas seqüências aumentadoras, tal como,por exemplo, o aumentador do promotor de RNA 35S do vírus do mosaicoda couve-flor ou o aumentador de octopina sintase.

No contexto da presente invenção, o termo tagging de ativaçãode T-DNA deve ser compreendido como significando um fragmento de T-DNA que compreende seqüências aumentadoras e, através de integraçãono genoma de uma célula de planta, aumenta a atividade de uma proteínatendo a atividade de uma GFAT.

No contexto da presente invenção, o termo tagging de ativaçãode transposon deve ser compreendido como significando um transposon quecompreende seqüências aumentadoras e, através de integração no genomade uma célula de planta, aumenta a atividade de uma proteína tendo a ativi-dade de uma GFAT.

Uma modalidade preferida da presente invenção refere-se acélulas de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção que são ca-racterizadas pelo fato de pelo menos uma molécula de ácido nucléico estra-nha codifica uma proteína tendo a atividade (enzimática) de uma GFAT.

Uma modalidade particularmente preferida da presente invenção refere-se acélulas de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção que são ca-racterizadas pelo fato de que uma molécula de ácido nucléico estranha codi-fica uma proteína tendo a atividade (enzimática) de uma GFAT.

De acordo com a invenção, a molécula de ácido nucléico estra-nha codificando uma proteína tendo a atividade (enzimática) de uma GFATpode se originar de qualquer organismo; de preferência, a dita molécula deácido nucléico se origina de bactérias, fungos, animais, plantas ou vírus, par-ticularmente de preferência de mamíferos, plantas ou bactérias e especial-mente de preferência de camundongo ou Escherichia coli. Com relação avírus, a molécula de ácido nucléico estranha codificando uma proteína tendoa atividade (enzimática) de uma GFAT de preferência se origina de um vírusque infecta algas, com preferência de um vírus que infecta algas do gêneroChlorella, particularmente de preferência de um Paramecium bursaria Chlo-relia vírus e especialmente de preferência de um Paramecium bursaria Chlo-rella vírus de uma linhagem H1. Ao invés da molécula de ácido nucléico deocorrência natural codificando uma proteína tendo a atividade (enzimática)de uma GFAT1 é também possível que uma molécula de ácido nucléico ge-rada através de mutagênese seja introduzida nas células de planta geneti-camente modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção, onde a dita molécula de ácido nu-cléico estranha mutagenizada é caracterizada pelo fato de que ela codificauma proteína tendo a atividade (enzimática) de uma GFAT com inibição re-duzida por metabólitos (por exemplo, do metabolismo de glicosarhina). Apreparação de tais moléculas de ácido nucléico mutagenizadas é descrita deuma maneira exemplar para uma proteína tendo a atividade (enzimática) deuma GFAT de Eseheriehia coli em Deng e outros (2005, Metabolie Enginee-ring 7, 201-214; WO 04 003175). Mutantes para uma proteína tendo a ativi-dade de uma GFAT do camundongo são descritos, por exemplo, em Hu eoutros (2004, J. Bioi Chem. 279 (29), 29988-29993).

Moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína tendo aatividade de uma GFAT são conhecidas da pessoa versada na técnica edescritas na literatura. Então, moléculas de ácido nucléico codificando umaproteína tendo a atividade de uma GFAT são descritas de vírus, por exem-plo, para o Chlorella vírus k2 (Ne de acesso EMBL AB107976.1), de bacté-rias, por exemplo, para Eseheriehia coli (Dutka-Malen, 1988, Biochemie 70(2), 287-290; EMBL Ng de acesso: L10328.1), de fungos, por exemplo, paraSaceharomyces eerevisiae (N2 de acesso EMBL AF334737.1, Watzele e ou-tros, 1989, J. Biol. Chem. 264, 8753-8758), Aspergillus niger (EMBL N9 deacesso AY594332.1), Candida albicans (NQ de acesso EMBL X94753.1), deinsetos, por exemplo, para Aedes aegyti {Kato e outros, 2002, lnsect. BioL11 (3), 207,216; N9 de acesso EMBL AF399922.1), Drosophila melanogaster(GFAT-1: N9 de acesso EMBL Y18627.1, GFAT-2: N9 de acesso NCBINM_143360.2), de algas para Volvariella volvacea (N9 de acesso EMBLAY661466.1), de vertebrados, por exemplo, para Homo sapiens (GFAT-1: N9de acesso EMBL AF334737.1; GFAT-2: N9 de acesso EMBL BC000012.2,Oki e outros, 1999, Genomics 57 (2),227-34), Mus musculus (GFAT-1: N9 deacesso EMBL AF334736.1; GFAT-2: N9 de acesso EMBL AB016780.1), oude plantas, por exemplo, para Arabidopsis thaliana (N9 de acesso EMBLAP001297.1; N9 de acesso NCBI cds BAB03027.1).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se acélulas de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção eplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção onde a molé-cula de ácido nucléico estranha codificando uma proteína tendo a atividadede uma GFAT é selecionada do grupo consistindo em:

a) moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína tendoa seqüência de aminoácido dada sob SEQ ID NO 5 ou uma proteína tendouma seqüência de aminoácido dada sob SEQ ID NO 7 ou uma proteína ten-do a seqüência de aminoácido dada sob SEQ ID NO 9;

b) moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína cujaseqüência é pelo menos 60%, de preferência pelo menos 80%, com prefe-rência pelo menos 90%, especialmente de preferência pelo menos 95% ecom mais preferência pelo menos 98% idênticas à seqüência de aminoácidodada sob SEQ ID NO 5, sob SEQ ID NO 7 ou sob SEQ ID NO 9;

c) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência denucleotídeo mostrada sob SEQ ID NO 4 ou uma seqüência complementar aela, a seqüência de nucleotídeo mostrada sob SEQ ID NO 6 ou uma se-qüência complementar a ela, a seqüência nuclear mostrada sob SEQ ID NO8 ou uma seqüência complementar a ela ou a seqüência de nucleotídeo mostrada sob SEQ ID NO 10 ou uma seqüência complementar a ela;

d) moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 70%, depreferência pelo menos 80%, com preferência pelo menos 90%, especial-mente de preferência pelo menos 95% e com mais preferência pelo menos98% idênticas às seqüências de aminoácido descritas sob a) ou c);

e) moléculas de ácido nucléico que hibridizam sob condiçõesestringentes com pelo menos um filamento das seqüências de ácido nucléi-co sob a) ou c);

f) moléculas de ácido nucléico cuja seqüência de nucleotídeodifere da seqüência das moléculas de ácido nucléico mencionadas sob a) ouc) devido à degeneração do código genético; e

g) moléculas de ácido nucléico que são fragmentos, variantesalélicas e/ou derivados das moléculas de ácido nucléico mencionadas soba), b), c), d), e) ou f).

No contexto da presente invenção, o termo hibridização significauma hibridização sob condições de hibridização convencionais, de preferên-cia sob condições estringentes, conforme descrito, por exemplo, em Sam-brook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 ed. (1989) ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Com preferênciaparticular, hibridização significa uma hibridização sob as condições que se-guem:

TAMPÃO DE HIBRIDIZAÇÃO:

2xSSC; 10xsolução Denhardt (Fikoll 400+PEG+BSA; razão1:1:1); SDS a 0,1%; EDTA a 5 mM; Na2HPO4 a 50 mM; 250 pg/ml de DNAde esperma de arenque; 50 pg/ml de tRNA; ou tampão de fosfato de sódio aM pH 7,2; EDTA a 1 mM; SDS a 7%

TEMPERATURA DE HIBRIDIZAÇÃO:

T=65 a 68SC

Tampão de lavagem: 0,1xSSC; 0,1% de SDS

Temperatura de lavagem: T=65 a 68e C.

Moléculas de ácido nucléico que hibridizam com moléculas deácido nucléico codificando uma proteína tendo a atividade de uma GFATpodem se originar de qualquer organismo: deste modo, elas podem se origi-nar de bactérias, fungos, animais, plantas ou vírus. Moléculas de ácido nu-cléico que hibridizam com moléculas de ácido nucléico codificando proteínatendo a atividade de uma GFAT particularmente de preferência se originamde mamíferos, plantas ou bactérias e especialmente de preferência do ca-mundongo ou Escherichia coli. Moléculas de ácido nucléico hibridizando commoléculas de ácido nucléico codificando proteína tendo a atividade de umaGFAT-1 ou uma GFAT-2 de preferência se originam de um organismo euca-riótica, particularmente de preferência elas se originam de um organismoanimal, especialmente de preferência do camundongo. Moléculas de ácidonucléico que hibridizam com as moléculas mencionadas podem ser isoladas,por exemplo, de cDNA genômico ou biblioteca. Tais moléculas de ácido nu-cléico podem ser identificadas e isoladas usando as moléculas de ácido nu-cléico mencionadas ou partes dessas moléculas ou os complementos rever-sos dessas moléculas, por exemplo, através de hibridização de acordo commétodos padrão (vide, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, MolecularCloning, A Laboratory Manual, 2 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY) ou através de amplificação usando PCR. Comoamostra de hibridização para isolamento de uma seqüência de ácido nucléi-co codificando uma proteína tendo a atividade de uma GFAT ou a atividadede uma GFAT-1 ou a atividade de uma GFAT-2, é possível usar, por exem-plo, moléculas de ácido nucléico tendo exatamente ou essencialmente a se-qüência de nucleotídeo dada sob SEQ ID NO 4 ou sob SEQ ID NO 6 ou sobSEQ ID NO 8 ou sob SEQ ID NO 10 ou partes dessas seqüências. Os frag-mentos usados como amostras de hibridização podem ser também fragmen-tos sintéticos ou oligonucleotídeos preparados usando as técnicas de sínte-se comuns, cuja seqüência é essencialmente idêntica à molécula de ácidonucléico descrita no contexto da presente invenção. Uma vez genes que hi-bridizam com as seqüências de ácido nucléico descritas no contexto da pre-sente invenção sendo identificados e isolados, a seqüência deve ser deter-minada e as propriedades das proteínas codificadas por esta seqüência de-vem ser analisadas para determinar se elas são proteínas tendo a atividadede uma GFAT. Métodos de como determinar se uma proteína tem a ativida-de de uma proteína tendo a atividade de uma GFAT (por exemplo, Mayer eoutros, 1968, Plant Physiol. 43, 1097-1107; Deng e outros, 2005, MetabolicEngineering 7, 201-214), uma GFAT-1 ou uma GFAT-2 (por exemplo Hu eoutros, 2004, J. Biol Chem. 279 (29), 29988-29993) são conhecidos da pes-soa versada na técnica e descritos, inter alia, na literatura mencionada. Asmoléculas hibridizando com as moléculas de ácido nucléico descritas nocontexto da presente invenção compreendem em particular fragmentos, de-rivados e variantes alélicas das moléculas de ácido nucléico mencionadas.No contexto da presente invenção, o termo derivado significa que as se-qüências dessas moléculas diferem em uma ou mais posições das seqüên-cias das moléculas de ácido nucléico descritas acima e são altamente idênti-cas a essas seqüências. As diferenças para as moléculas de ácido nucléicodescritas acima podem, por exemplo, ser devido à deleção (em particulardeleções 5'- e/ou 3' levando a deleções N- e/ou C-terminais da proteína cor-respondente), adição, substituição, inserção ou recombinação.

No contexto da presente invenção, o termo identidade significauma identidade de seqüência sob todo o comprimento da região de codifica-ção de uma molécula de ácido nucléico ou de todo o comprimento de umaseqüência de aminoácido codificando uma proteína de pelo menos 60%, emparticular em identidade de pelo menos 70%, de preferência pelo menos80%, particularmente de preferência de pelo menos 90% e especialmente depreferência de pelo menos 95% e com mais preferência pelo menos 98%.No contexto da presente invenção, o termo identidade deve ser compreendi-do como significando o número de aminoácidos/nucleotídeos idênticos (iden-tidade) com outras proteínas/ácidos nucléicos, expressos em porcentagem.De preferência, a identidade com relação a uma proteína tendo a atividadede uma GFAT é determinada através de comparação com a seqüência deaminoácido dada sob SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 7 ou SEQ ID NO 9 e aidentidade com relação a uma molécula de ácido nucléico codificando umaproteína tendo a atividade de uma GFAT é determinada através de compa-ração com a seqüência de ácido nucléico dada sob SEQ ID NO 4 ou SEQ IDNO 6 ou SEQ ID NO 8 ou SEQ ID NO 10 com outras proteínas/ácidos nu-cléicos com o auxílio de programas de computador. Se seqüências a seremcomparadas umas com as outras forem de comprimentos diferentes, a iden-tidade deve ser determinada através da determinação da identidade em por-centagem do número de aminoácidos que a seqüência mais curta comparti-lha com a seqüência mais longa. De preferência, a identidade é determinadausando o programa de computador conhecido e publicamente disponívelCIustaIW (Thompson e outros, Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). CIustaIW é publicamente disponibilizado por Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) e Toby Gibson (Gibson@ EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1,D 69117 Heidelberg, Germany. CIustaIW pode ser também baixado de vá-rias páginas na internet, inter alia, do IGBMC (Institut de Génétique et deBiologie Moléculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, France;ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) e de EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) etodas as páginas da internet espelhadas do EBI (European BioinformaticsInstitute, Wellcome Trust Genome Campus1Hinxton, Cambridge CB10 1SD,UK). De preferência, é feito uso do programa de computador CIustaIW deversão 1.8 para determinar a identidade entre proteínas descritas no contex-to da presente invenção e outras proteínas. Aqui, os parâmetros têm que serajustados como segue: KTUPLE=I, T0PDIAG=5, WINDOW=5, PAIR-GAP=3, GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0,05, GAPDIST=8, MAXDIV=40,MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.

De preferência, é feito uso do programa de computador Clus-talW de versão 1.8 para determinar a identidade, por exemplo, entre a se-qüência de nucleotídeo das moléculas de ácido nucléico descritas no contex-to da presente invenção e a seqüência de nucleotídeo de outras moléculasde ácido nucléico. Aqui, os parâmetros têm que ser ajustados como segue:KTUPLE=2, T0PDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAP0PEN=10,GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: não-pesado.

Identidade significa ainda que existe uma equivalência funcionale/ou estrutural entre as moléculas de ácido nucléico em questão ou as prote-ínas codificadas por elas. As moléculas de ácido nucléico que são homólo-gas às moléculas descritas acima e representam derivados dessas molécu-las são geralmente variações dessas moléculas que representam modifica-ções tendo a mesma função biológica. Eles podem ser variações de ocor-rência ou natural, por exemplo, seqüências de outras espécies, ou muta-ções, onde essas mutações podem ter acontecido de uma maneira naturalou foram introduzidas através de mutagênese direcionada. Ainda, as varia-ções podem ser seqüências sinteticamente produzidas. As variantes alélicaspodem ou ser variantes de ocorrência natural ou variantes sinteticamenteproduzidas ou variantes geradas através de técnicas de DNA recombinante.Uma forma especial de derivados são, por exemplo, moléculas de ácido nu-cléico que diferem das moléculas de ácido nucléico descritas no contexto dapresente invenção devido à degeneração do código genético.

Os vários derivados das moléculas de ácido nucléico codifican-do uma proteína tendo a atividade de uma GFAT têm certas característicasem comum. Essas podem ser, por exemplo, a atividade biológica, especifici-dade de substrato, peso molecular, reatividade imunológica, conformaçãoetc; e também propriedades físicas, tal como, por exemplo, as propriedadesde mobilidade em eletroforese de gel, comportamento cromatográfico, coefi-ciente de sedimentação, solubilidade, propriedades espectroscópicas, esta-bilidade, pH ótimo, temperatura ótima, etc. Propriedades preferidas de prote-ínas tendo a atividade de uma GFAT são conhecidas da pessoa versada na.técnica, já foram mencionadas acima e são para ser aplicadas de uma ma-neira análoga.

Em uma modalidade preferida adicional, a presente invençãorefere-se a células de planta geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãoonde moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína tendo a ativida-de (enzimática) de uma GFAT são caracterizadas pelo fato de que os có-dons das ditas moléculas de ácido nucléico são diferentes dos códons dasmoléculas de ácido nucléico que codificam a dita proteína tendo a atividade(enzimática) de uma GFAT do organismo de origem. Particularmente de pre-ferência, os códons das moléculas de ácido nucléico codificando a proteínatendo a atividade (enzimática) de uma GFAT são mudados, então eles sãoadaptados para a freqüência de uso dos códons da célula de planta ou plan-ta cujo genoma eles são integrados ou devem ser integrados.

A presente invenção provê ainda células de planta geneticamen-te modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamente modifi-cadas de acordo com a invenção caracterizado pelo fato de que as molécu-Ias de ácido nucléico estranhas integraram estavelmente no genoma da cé-lula de planta ou da planta codificando uma hialuronan sintase e/ou codifi-cando uma proteína tendo a atividade (enzimática) de uma GFAT são liga-das a elementos reguladores iniciando a transcrição em células de planta(promotores). Esses podem ser promotores homólogos ou heterólogos. Ospromotores podem ser constitutivos, específicos de tecido, específicos dedesenvolvimento ou regulados por fatores externos (por exemplo, após apli-cação de substâncias químicas, através da ação de fatores abióticos, talcomo calor e/ou frio, seca, doença, etc). Aqui, moléculas de ácido nucléicocodificando uma hialuronan sintase ou uma proteína tendo a atividade (en-zimática) de uma GFAT, cujas moléculas de ácido nucléico são integradasno genoma de uma célula de planta geneticamente modificada de acordocom a invenção ou uma planta geneticamente modificada de acordo com ainvenção, podem em cada caso ser ligadas ao mesmo promotor, ou as se-qüências individuais podem ser ligadas a promotores diferentes.

Uma modalidade preferida da presente invenção refere-se acélulas de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção onde pelomenos uma molécula de ácido nucléico estranha, particularmente de prefe-rência pelo menos duas moléculas de ácido nucléico estranhas, especial-mente de preferência três moléculas de ácido nucléico estranhas seleciona-das do grupo consistindo em moléculas de ácido nucléico codificando umahialuronan sintase ou uma proteína tendo a atividade (enzimática) de umaGFAT é (são) ligada (s) a um promotor específico de tecido. Promotores es-pecíficos de tecidos são promotores que iniciam a transcrição especifica-mente em células de bulbo, fruta ou semente de planta ou folhas.

Para expressar moléculas de ácido nucléico codificando umahialuronan sintase ou uma proteína tendo a atividade (enzimática) de umaGFAT, essas são de preferência ligadas a seqüências de DNA reguladorasassegurando a transcrição em células de planta. Essas incluem em particu-lar promotores. Em geral, qualquer promotor ativo em células de planta éadequado para a expressão. Aqui, o promotor pode ser escolhido de modoque expressão é constitutivamente ou apenas em um certo tecido, em umcerto ponto do desenvolvimento da planta ou em um ponto de tempo deter-minado por fatores externos. Ambos com relação à planta e com relação àmolécula de ácido nucléico a ser expressa, o promotor pode ser homólogoou heterólogo. Promotores adequados são, por exemplo, o promotor 35SRNS do vírus do mosaico da couve-flor ou o promotor da ubiquitina de milhoou o Cestrum YLCV (Yellow Leaf Curling Virus; WO 01 73087; Stavolone eoutros, 2003, Plant Moi Biol. 53, 703-713) para uma expressão constitutiva,o promotor do gene de patatina B33 (Rocha-Sosa e outros, EMBO J. 8(1989), 23-29) para uma expressão específica de bulbo em batatas ou umpromotor específico de fruta para tomate, tal como, por exemplo, o promotorda poligalacturonase de tomate (Montgomery e outros, 1993, Plant Cell 5,1049-1062) ou o promotor E8 do tomate (Metha e outros, 2002, Nature Bio-technol. 20(6), 613-618) ou o promoter da ACC oxidase do pêssego (Moonand Callahan, 2004, J. Experimental Botany 55 (402), 1519-1528) ou umpromotor que assegure expressão apenas em tecidos fotossinteticamenteativos, por exemplo, o promotor da ST-LS1 (Stockhaus e outros, Proc. NatLAcad. Sei. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus e outros, EMBO J. 8(1989), 2445-2451) ou para uma expressão específica de endosperma dopromotor HMWG de trigo, o promotor USP, o promotor da faseolina, o pro-motor dos genes de zeína de milho (Pedersen e outros, Cell 29 (1982),1015-1026; Quatroccio e outros, Plant Moi Biol. 15 (1990), 81-93), o promo-tor da gluteína (Leisy e outros, Plant Moi Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng eoutros, Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara e outros, FEBS Lett. 383(1996), 213-218), o promotor do shrunken-1 (Werr e outros, EMBO J. 4(1985), 1373-1380), um promotor da globulina (Nakase e outros, 1996, Gene170(2), 223-226) ou um promotor da prolamina (Qu e Takaiwa, 2004, PlantBiotechnology Journal 2(2), 113-125). No entanto, é também possível usarpromotores que são apenas ativos em um ponto no tempo determinado porfatores externos (vide, por exemplo, W09307279). De interesse particularaqui podem ser promotores de proteínas de choque térmico que permitemuma indução simples. É ainda possível usar promotores específicos de se-mente, tal como, por exemplo, o promotor USP de Vicia faba que assegurauma expressão específica de semente em Vicia faba e outras plantas (Fie-dler e outros, Plant MoL BioL 22 (1993), 669-679; Báumlein e outros, MoLGeri. Genet. 225 (1991), 459-467). O uso de promotores presentes no ge-noma de vírus de infecção de algas é também adequado para expressão deseqüências de ácido nucléico em plantas (Mitra e outros, 1994, Biochem.Biophys Res Commun 204(1), 187-194; Mitra e Higgins, 1994, Piant Moi.BioL 26(1), 85-93, Van Etten e outros, 2002, Arch. Virol. 147, 1479-1516).

No contexto da presente invenção, o termo específico de tecidodeve ser compreendido como significando a limitação substancial de umamanifestação (por exemplo, iniciação de transcrição) a um certo tecido.

No contexto da presente invenção, o termo célula de bulbo, frutaou semente deve ser compreendido como significando todas as células pre-sentes em um bulbo, uma fruta ou em uma semente.

No contexto da presente invenção, o termo promotor homólogodeve ser compreendido como significando um promotor que está natural-mente presente em células de planta ou plantas usadas para a preparaçãode células de planta geneticamente modificadas de acordo com a invençãoou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção (homólogocom relação à célula de planta ou planta) ou como significando um promotorque regula a regulagem da expressão de um gene no organismo do qual aseqüência foi isolada (homólogo com relação à molécula de ácido nucléico aser expressa).

No contexto da presente invenção, o termo promotor heterólogodeve ser compreendido como significando um promotor que não está natu-ralmente presente em células de planta ou plantas usadas para a prepara-ção de células de planta geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção (hete-rólogo com relação à célula de planta ou planta) ou como significando umpromotor que é, no organismo do qual uma seqüência de ácido nucléico aser expressa foi isolada, não naturalmente presente para regulagem da ex-pressão da dita seqüência de ácido nucléico (heterólogo com relação à mo-lécula de ácido nucléico a ser expressa).

Pode ser também apresentada uma seqüência de terminação(sinal de poliadenilação) que serve para adicionar um filamento poli-A aotranscrito. O filamento poli-A é imaginado agir na estabilização dos transcri-tos. Tais elementos são descritos na literatura (cf. Gielen e outros, EMBO J. 8 (1989), 23-29) e podem ser trocados conforme desejado.

É também possível que seqüências de íntron estejam presentesentre o promotor e a região de codificação. Tais seqüências de íntron podemlevar à estabilidade de expressão e expressão aumentada em plantas (Callise outros, 1987, Genes Devei. 1, 1183-1200; Luehrsen e Walbot, 1991, Mol.Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier e outros, 1997; Plant Journal 12(4), 895-899; Rose e Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil e outros,1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; XU e outros, 2003, Science in ChinaSeries C Vol.46 Ns6, 561-569). Seqüências de íntron adequadas são, porexemplo, o primeiro íntron do gene sh1 do milho, o primeiro íntron do genepoli-ubiquitina 1 do milho, o primeiro íntron do gene EPSPS do arroz ou umdos primeiros dois íntrons do gene PAT1 da Arabidopsis.

A presente invenção refere-se também a plantas compreenden-do células de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção.Tais plantas podem ser produzidas através de regeneração a partir de célu-las de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção.

A presente invenção refere-se também a partes processáveis ouconsumíveis de plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção compreendendo células de planta geneticamente modificadas de acordocom a invenção.

No contexto da presente invenção, o termo partes processáveisdeve ser compreendido como significando partes de planta que são usadaspara preparação de gêneros alimentícios ou ração, que são usadas comouma fonte de matéria-prima para processos industriais, como uma fonte dematéria-prima para a preparação de produtos farmacêuticos ou como umafonte de matéria-prima para a preparação de produtos cosméticos.

No contexto da presente invenção, o termo partes consumíveisdeve ser compreendido como significando partes de planta que servem co-mo alimento para o homem e são usadas como ração animal.

A presente invenção refere-se também a um material de propa-gação de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãocompreendendo uma célula de planta geneticamente modificada de acordocom a invenção.

Aqui, o termo material de propagação compreende aquelescomponentes da planta que são adequados para geração de progênie atra-vés da via vegetativa ou geradora. Adequados para propagação vegetativasão, por exemplo, mudas, culturas de calos, rizomas ou bulbos. Outro mate-rial de propagação inclui, por exemplo, frutas, sementes, plantas brotadas dasemente, protoplastos, culturas de célula, etc. O material de propagação depreferência tem a forma de bulbos, frutas ou sementes.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se apartes de planta colhidas de plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção, tal como frutas, raízes de armazenamento e outras, flores,brotos, galhos, folhas ou caules, de preferência sementes, frutas ou bulbos,essas partes que podem ser colhidas compreendendo células de planta ge-neticamente modificadas de acordo com a invenção.

De preferência, a presente invenção refere-se a material de pro-pagação de acordo com a invenção ou partes que podem ser colhidas deplantas de acordo com a invenção compreendendo hialuronan. Particular-mente preferido é um material de propagação de acordo com a invenção oupartes que podem ser colhidas de plantas de acordo com a invenção quesintetizam hialuronan.

No contexto da presente invenção, o termo planta de batata oubatata deve ser compreendido como significando espécie de planta do gêne-ro Solanum, particularmente espécies de produção de bulbo do gênero So-Ianum e em particular Solanum tuberosum.

No contexto da presente invenção, o termo planta de tomate outomate deve ser compreendido como significando espécie de planta do gê-nero Lycopersicon, em particular Lycopersicon esculentum.

A vantagem adicional da presente invenção é que as partes quepodem ser colhidas, material de propagação, partes processáveis ou partesconsumíveis de plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção compreendem mais hialuronan do que plantas transgênicas de sintetiza-ção de hialuronan descritas na literatura. Deste modo, plantas geneticamen-te modificadas de acordo com a invenção não são apenas particularmenteadequadas para uso como matéria-prima da qual hialuronan pode ser isola-do, mas também podem ser usadas diretamente como gênero alimentí-cio/ração ou para preparação de gênero alimentício/ração tendo um caráterprofilático ou terapêutico (por exemplo, para profilaxia de osteoartrite, US6.607.745). Uma vez que plantas geneticamente modificadas de acordo coma invenção têm teor de hialuronan maior do que as plantas descritas na lite-ratura, a preparação de tais gêneros alimentícios/ração requer quantidadesmenores de partes que podem ser colhidas, material de propagação, partesprocessáveis ou partes consumíveis de plantas geneticamente modificadasde acordo com a invenção. Se partes consumíveis de plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção forem consumidas, por exemplo, di-retamente como um chamado nutracêutico, é possível se obter um efeitopossível mesmo através da ingestão de quantidades relativamente peque-nas de substância. Isto pode ser de significância particular inter alia na pro-dução de ração animal, uma vez que ração animal tendo um teor muito altode componentes de planta é inadequada como ração para várias espéciesanimais. Em virtude da alta capacidade do hialuronan em ligar água, partesque podem ser colhidas, material de propagação, partes processáveis oupartes consumíveis de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção têm ainda a vantagem de que menos espessantes são requeridosquando gênero alimentício/ração solidificado é produzido. Deste modo, porexemplo, a produção de geléia requer menos açúcar, que está associado aum efeito positivo adicional sobre a saúde. Na produção de gênero alimentí-cio/ração requerendo a desidratação do material de planta bruto, a vantagemde uso de partes que podem ser colhidas, material de propagação, partesprocessáveis ou partes consumíveis de plantas geneticamente modificadasde acordo com a invenção consiste no fato de que menos água tem que serremovida do material de planta em questão, resultando em custos de produ-ção menores e, devido a métodos de preparação mais suaves (por exemplo,aplicação de calor menor e/ou mais curta), um valor nutricional elevado dogênero alimentício/ração em questão. Deste modo, por exemplo, na produ-ção de ketchup de tomate menos energia tem que ser introduzida a fim dese obter a consistência desejada.

A presente invenção provê ainda um processo para preparaçãode uma planta que sintetiza hialuronan, o qual compreende:

a) modificar geneticamente uma planta, onde a modificação ge-nética compreende etapas i a ii abaixo

i) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha codifi-cando uma hialuronan sintase na célula de planta

ii) introdução de uma modificação genética na célula de planta,a modificação genética resultando em um aumento da atividade de uma pro-teína tendo a atividade enzimática de uma GFAT comparado com células deplanta do tipo selvagem não-geneticamente modificadasonde as etapas i a ii podem ser realizadas em qualquer ordem,individualmente, ou quaisquer combinações de etapas i a ii podem ser reali-zadas simultaneamente

b) regeneração de uma planta a partir de células de planta daetapa a);

c) geração, se apropriado, de plantas adicionais usando as plan-tas de acordo com a etapa b), onde, se apropriado, as células de planta sãoisoladas de plantas de acordo com a etapa b) e as etapas de processo a) ac) são repetidas até que uma planta seja gerada a qual tem uma moléculade ácido nucléico estranha codificando uma hialuronan sintase e tem umaatividade aumentada de uma proteína tendo a atividade (enzimática) de umaGFAT comparado com as células de planta do tipo selvagem não-geneticamente modificadas correspondentes.

A presente invenção refere-se de preferência a processos parapreparação de uma planta que sintetiza hialuronan que compreende

a) modificar geneticamente uma célula de planta, onde a modifi-cação genética compreende etapas i a ii abaixo em qualquer ordem ouquaisquer combinações de etapas i a ii podem ser realizadas ou individual-mente ou simultaneamente,

i) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha codifi-cando uma hialuronan sintase na célula de planta

ii) introdução de uma modificação genética na célula de planta,a modificação genética resultando em um aumento na atividade de uma pro-teína tendo a atividade (enzimática) de uma GFAT comparado com célulasde planta do tipo selvagem não-geneticamente modificadas

b) regeneração de uma planta a partir de células de planta com-preendendo a modificação genética de acordo com as etapas

i) a) i

ii) a) ii

iii) a) i e a) ii,

c) introdução em células de planta de plantas de acordo com aetapa

i) b) i uma modificação genética de acordo com a etapa a) ii,

ii) b) ii uma modificação genética de acordo com a etapa a) i,e regeneração de uma planta

d) geração, se apropriado, de plantas adicionais com o auxíliodas plantas obtidas de acordo com qualquer etapa b) iii ou c) i ou c) ii.

As modificações genéticas introduzidas de acordo com a etapaa) na célula de planta podem a princípio ser qualquer tipo de modificaçãoresultando em uma atividade aumentada de uma proteína tendo a atividade(enzimática) de uma GFAT.

A regeneração das plantas de acordo com a etapa b) e, se a-propriado, etapa c) dos processos de acordo com a invenção pode ser reali-zada usando métodos conhecidos da pessoa versada na técnica (descrito,por exemplo, em Plant Cell Culture Protocols, 1999, editado por R.D. Hall,Humana Press, ISBN 0-89603-549-2).

A geração de plantas adicionais (dependendo do processo deacordo com a etapa c) ou etapa d)) dos processos de acordo com a inven-ção pode ser realizada, por exemplo, através de propagação vegetativa (porexemplo, através de mudas, bulbos ou através de cultura de calos e regene-ração de plantas intactas) ou através de propagação geradora. Neste con-texto, propagação geradora geralmente acontece sob condições controla-das, isto é, plantas selecionadas com características específicas são hibridi-zadas umas com as outras e multiplicadas. A geração de preferência acon-tece de tal maneira que as plantas adicionais (dependendo dos processosgerados de acordo com a etapa c) ou etapa d)) compreendem as modifica-ções introduzidas nas etapas precedentes.

Em processos de acordo com a invenção para a preparação deplantas que sintetizam hialuronan, as modificações genéticas para geraçãodas células de planta geneticamente modificadas de acordo com a invençãopodem ser realizadas simultaneamente ou em etapas sucessivas. Aqui, éinsignificante se o mesmo método para a modificação genética introduzindouma molécula de ácido nucléico estranha codificando uma hialuronan sinta-se na célula de planta é usado para modificações genéticas sucessivas re-sultando em uma atividade aumentada de uma proteína tendo a atividade(enzimática) de uma GFAT.

Em uma modalidade adicional de processos de acordo com ainvenção para preparação de uma planta que sintetiza hialuronan, a modifi-cação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de áci-do nucléico estranha no genoma da célula de planta, onde a presença ouexpressão da(s) molécula(s) de ácido nucléico estranha(s) resulta em umaatividade aumentada de uma proteína tendo a atividade (enzimática) de umaGFAT na célula de planta.

Como já descrito acima para as moléculas de ácido nucléicoestranhas introduzidas para modificação genética na célula de planta ouplanta, o que é introduzido na etapa a) dos processos de acordo com a in-venção para preparação de uma planta que sintetiza hialuronan pode seruma molécula de ácido nucléico individual ou uma pluralidade de moléculasde ácido nucléico. Então, as moléculas de ácido nucléico estranhas codifi-cando uma hialuronan sintase e/ou codificando uma proteína tendo a ativi-dade (enzimática) de uma GFAT podem estar presentes juntas em uma úni-ca molécula de ácido nucléico, ou elas podem estar presentes em moléculasde ácido nucléico separadas. Se as moléculas de ácido nucléico codificandouma hialuronan sintase e codificando uma proteína tendo a atividade de umaGFAT estiverem presentes em uma pluralidade de moléculas de ácido nu-cléico, essas moléculas de ácido nucléico podem ser introduzidas simulta-neamente ou em etapas sucessivas em uma célula de planta.

Ainda, para introduzir uma molécula de ácido nucléico estranhana prática de processos de acordo com a invenção para preparação de umaplanta que sintetiza hialuronan, é possível usar, ao invés de uma célula deplanta do tipo selvagem ou planta do tipo selvagem, células mutantes oumutantes que são distinguidos pelo fato de que eles já têm uma atividadeaumentada de uma proteína tendo a atividade (enzimática) de uma GFAT.Se a célula mutante ou o mutante já tiver uma atividade aumentada de umaproteína tendo a atividade (enzimática) de uma GFAT comparado com ascélulas de planta do tipo selvagem ou plantas do tipo selvagem correspon-dentes, ela é suficiente para realizar um processo de acordo com a invençãopara produção de uma planta que sintetiza hialuronan para introduzir na ditacélula mutante ou mutante uma molécula de ácido nucléico estranha codifi-cando uma hialuronan sintase. Tudo dito mais com relação ao uso de mutan-tes para a preparação de células de planta geneticamente modificadas deacordo com a invenção ou plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção se aplica aqui de uma maneira análoga.

Em modalidades preferidas, a presente invenção refere-se a umprocesso de acordo com a invenção para produção de uma planta que sinte-tiza hialuronan, onde a molécula de ácido nucléico codificando uma hialuro-nan sintase na etapa a) é selecionada do grupo consistindo em:a) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma hialuronan sintase viral,

b) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma hialuronan sintase de um vírus infeccioso de Chlorella,

c) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma hialuronan sintase de um Paramecium bursaria ChlorellaVírus 1,

d) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma hialuronan sintase de um Paramecium bursaria ChlorellaVírus 1 de linhagem H1,

e) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queos códons da molécula de ácido nucléico codificando uma hialuronan sintasesão modificados comparado com os códons da molécula de ácido nucléicoque codifica a hialuronan sintase no organismo de origem da hialuronan sin-tase,

f) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queos códons da hialuronan sintase foram modificados de modo que eles sãoadaptados para a freqüência do uso dos códons da célula de planta ou daplanta em cujo genoma elas devem ser integradas ou são integradas,

g) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma hialuronan sintase tendo a seqüência de aminoácidomostrada sob SEQ ID NO 2 ou que elas codificam uma hialuronan sintasecuja seqüência de aminoácido é pelo menos 70%, de preferência pelo me-nos 80%, particularmente de preferência pelo menos 90%, especialmente depreferência pelo menos 95% e com mais preferência pelo menos 98% idên-tica à seqüência de aminoácido mostrada sob SEQ ID NO 2,

h) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma proteína cuja seqüência de aminoácido pode ser deriva-da da região de codificação da seqüência de ácido nucléico inserida noplasmídeo DSM16664 ou que elas codificam uma proteína cuja seqüênciade aminoácido é pelo menos 70%, de preferência, pelo menos 80%, particu-larmente de preferência pelo menos 90%, especialmente de preferência pelomenos 95% e com mais preferência pelo menos 98% idêntica à seqüênciade aminoácido que pode ser derivada da região de codificação da seqüênciade ácido nucléico inserida no plasmídeo DSM16664,

i) moléculas de ácido nucléico compreendendo umaseqüência de ácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 3 ousendo pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, com preferênciapelo menos 90%, especialmente de preferência pelo menos 95% e com maispreferência pelo menos 98% idêntica à seqüência de ácido nucléico mostra-da sob SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 3;

j) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência deácido nucléico inserida no plasmídeo DSM16664 ou sendo pelo menos 70%,de preferência pelo menos 80%, com preferência pelo menos 90%, especi-almente de preferência pelo menos 95% e com mais preferência pelo menos98% idêntica à seqüência de ácido nucléico mostrada inserida no plasmídeo15 DSM16664,

k) moléculas de ácido nucléico codificando uma hialuronan sin-tase, onde as seqüências de ácido nucléico codificando a hialuronan sintasesão ligadas a elementos reguladores (promotor) que iniciam a transcriçãoem células de planta ou;

I) moléculas de ácido nucléico de acordo com k) onde os promo-tores são promotores específicos de tecido, particularmente de preferênciapromotores que iniciam a iniciação de transcrição especificamente em célu-las de bulbo, fruta ou semente de planta.

Em modalidades preferidas, a presente invenção refere-se aprocessos de acordo com a invenção para produção de uma planta que sin-tetiza hialuronan, onde a molécula de ácido nucléico codificando uma proteí-na tendo a atividade de uma GFAT é selecionada do grupo consistindo em:

a) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma proteína tendo a atividade de uma GFAT se originandode bactérias, animais ou plantas, de preferência de Escherichia coli ou docamundongo;

b) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma proteína tendo a atividade de uma GFAT de um vírusinfeccioso de Chlorella·,

c) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma proteína tendo a atividade de uma GFAT de um Para-mecium bursaria Chlorella vírus;

d) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queos códons da molécula de ácido nucléico codificando uma proteína tendo aatividade de uma GFAT são modificados comparado com os códons de umamolécula de ácido nucléico codificando a proteína correspondente tendo aatividade de uma GAFT do organismo de origem;

e) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queos códons da proteína tendo a atividade de uma GFAT são modificados demodo que eles são adaptados para a freqüência do uso dos códons da célu-la de planta ou da planta em cujo genoma elas devem ser integradas ou sãointegradas;

f) moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína tendo aseqüência de aminoácido mostrada sob SEQ ID NO 5 ou uma proteína ten-do a seqüência de aminoácido mostrada sob SEQ ID NO 7 ou uma proteínatendo a seqüência de aminoácido mostrada sob SEQ ID NO 9;

g) moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína cujaseqüência é pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, com prefe-rência pelo menos 90%, especialmente de preferência pelo menos 95% ecom mais preferência pelo menos 98% idêntica à seqüência de aminoácidomostrada sob SEQ ID NO 5 ou sob SEQ ID NO 7 ou sob SEQ ID NO 9;

h) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência deácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO 4 ou uma seqüência complementara ela ou a seqüência de ácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO 6 ou umaseqüência complementar a ela ou a seqüência de ácido nucléico mostradasob SEQ ID NO 8 ou uma seqüência complementar a ela ou a seqüência deácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO 10 ou uma seqüência complemen-tar a ela;

i) moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 70%, de pre-ferência pelo menos 80%, com preferência pelo menos 90%, especialmentede preferência pelo menos 95% e com mais preferência pelo menos 98%idêntica às seqüências de ácido nucléico descritas sob h);

j) moléculas de ácido nucléico que hibridizam sob condiçõesestringentes com pelo menos um filamento das seqüências de ácido nucléi-co descritas sob f) ou h);

k) moléculas de ácido nucléico cuja seqüência de nucleotídeodifere da seqüência das moléculas de ácido nucléico mencionadas sob f) ouh) devido à degeneração do código genético; e

I) moléculas de ácido nucléico que são fragmentos, variantesalélicas e/ou derivados das moléculas de ácido nucléico mencionadas soba), b), c), d), e), f) ou h),

m) moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína tendoa atividade de uma GFAT, onde as seqüências de ácido nucléico codificandouma proteína tendo a atividade de uma GFAT são ligadas a elementos regu-ladores (promotor) que iniciam a transcrição em células de planta ou

n) moléculas de ácido nucléico de acordo com m), onde os pro-motores são promotores específicos de tecido, particularmente de preferên-cia promotores que iniciam a transcrição especificamente em células de bul-bo, folha, fruta ou semente de planta.

Em uma modalidade adicional preferida, processos de acordocom a invenção para produção de uma planta que sintetiza hialuronan sãousados para produção de plantas geneticamente modificadas de acordo coma invenção.

A presente invenção também provê plantas obteníveis atravésde um processo de acordo com a invenção para produção de uma plantaque sintetiza hialuronan.

A presente invenção refere-se ainda a um processo para produ-ção de hialuronan que compreende a etapa de extração de hialuronan decélulas de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção, deplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, de materialde propagação de acordo com a invenção, de partes de planta que podemser colhidas de acordo com a invenção ou de plantas ou partes dessas plan-tas obteníveis através de um processo de acordo com a invenção para pro-dução de plantas que sintetizam hialuronan.

De preferência, tal processo também compreende a etapa decoleta das células de planta geneticamente modificadas de acordo com ainvenção, das plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção, do material de propagação de acordo com a invenção, das partes deplanta que podem ser colhidas de acordo com a invenção, das partes deplanta processáveis de acordo com a invenção antes da extração do hialu-ronan, e particularmente de preferência ainda a etapa de cultivo de célulasde planta geneticamente de acordo com a invenção ou plantas geneticamen-te modificadas de acordo com a invenção antes da coleta.

Em contraste com tecidos bacterianos ou animais, tecidos deplanta não têm quaisquer hialuronidases e não contêm quaisquer hialaderi-nas. Deste modo, como já descrito acima, extração de hialuronan a partir detecidos de planta é possível usando métodos relativamente simples. Se ne-cessário, os extratos aquosos, descritos acima, de células ou tecidos deplanta contendo hialuronan podem ser purificados mais usando métodosconhecidos da pessoa versada na técnica, tal como, por exemplo, precipita-ção repetida com etanol. Um método preferido para purificação de hialuro-nan é descrito sob os Métodos Gerais item 2.

Os processos já descritos para extração de hialuronan de célu-las de planta geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção são também ade-quados para isolamento de hialuronan de material de propagação de acordocom a invenção, de partes de planta que podem ser colhidas de acordo coma invenção ou de plantas ou partes dessas plantas obteníveis através de umprocesso de acordo com a invenção para preparação de plantas que sinteti-zam hialuronan.

A presente invenção também provê o uso de células de plantageneticamente modificadas de acordo com a invenção, plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção, material de propagação deacordo com a invenção, partes de planta que podem ser colhidas de acordocom a invenção, partes de planta processáveis de acordo com a invenção ouplantas obteníveis através de um processo de acordo com a invenção parapreparação de hialuronan.

A presente invenção refere-se ainda a composições compreen-dendo células de planta geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção. Aqui, é insignificante se as células de planta são intactas ou não maisintactas porque elas foram destruídas, por exemplo, através de processa-mento. As composições são de preferência gêneros alimentícios ou ração,produtos farmacêuticos ou cosméticos.

A presente invenção provê de preferência composições com-preendendo componentes de células de planta geneticamente modificadasde acordo com a invenção, de plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção, de material de propagação de acordo com a invenção, departes de planta que podem ser colhidas de acordo com a invenção ou deplantas que podem ser obtidas através de um processo de acordo com ainvenção e compreendendo moléculas de ácido nucléico recombinantes,onde as moléculas de ácido nucléico recombinantes são caracterizadas pelofato de que elas compreendem moléculas de ácido nucléico codificando umahialuronan sintase e proteínas tendo a atividade (enzimática) de uma GFAT.

Uma integração estável de moléculas de ácido nucléico estra-nhas no genoma de uma célula de planta ou planta resulta nas moléculas deácido nucléico estranhas sendo flanqueadas após integração ao genoma deuma célula de planta ou planta por seqüências de ácido nucléico. Deste mo-do, em uma modalidade preferida, composições de acordo com a invençãosão caracterizadas pelo fato de que as moléculas de ácido nucléico recom-binantes presentes na composição de acordo com a invenção são flanquea-das por seqüências de ácido nucléico de planta genômicas. Aqui, as se-qüências de ácido nucléico de planta genômicas podem ser quaisquer se-qüências naturalmente presentes no genoma da célula de planta ou plantausada para preparação da composição.

As moléculas de ácido nucléico recombinantes presentes nascomposições de acordo com a invenção podem ser moléculas de ácido nu-cléico recombinantes individuais ou várias moléculas de ácido nucléico codi-ficando uma hialuronan sintase e proteínas tendo a atividade (enzimática) deuma GFAT que estão presentes em uma molécula de ácido nucléico, ou a-quelas onde as moléculas de ácido nucléico podem estar presentes em mo-léculas de ácido nucléico recombinantes separadas. Moléculas de ácido nu-cléico codificando uma hialuronan sintase ou codificando uma proteína tendoa atividade (enzimática) de uma GFAT podem estar presentes juntas emuma molécula de ácido nucléico recombinante única, ou duas das moléculasde ácido nucléico mencionadas podem estar presentes juntas em uma molé-cula de ácido nucléico recombinante única e a terceira molécula de ácidonucléico pode estar presente em outra molécula de ácido nucléico recombi-nante em qualquer combinação possível, ou todas as moléculas de ácidonucléico mencionadas podem em cada caso estar presentes em moléculasde ácido nucléico recombinantes separadas individuais. Dependendo decomo as moléculas de ácido nucléico codificando uma hialuronan sintase oucodificando uma proteína tendo a atividade (enzimática) de uma GFAT estãopresentes em uma composição de acordo com a invenção, elas podem serflanqueadas por seqüências de ácido nucléico de planta genômicas idênticasou diferentes.

As composições de acordo com a invenção que compreendemmoléculas de ácido nucléico recombinantes podem ser demonstradas usan-do métodos conhecidos da pessoa versada na técnica, tal como, por exem-plo, métodos baseados em hibridização ou, de preferência, usando métodosbaseados em PCR (reação de cadeia de polimerase).

De preferência, composições de acordo com a invenção com-preendem pelo menos 0,005%, com preferência pelo menos 0,01%, particu-larmente de preferência pelo menos 0,05% e especialmente de preferênciapelo menos 0,1% de hialuronan. De preferência, as composições de acordocom a invenção compreendem no máximo 5%, com preferência no máximo2%, particularmente de preferência no máximo 1% e especialmente de pre-ferência pelo menos 0,5% de hialuronan.Como já mencionado acima, é possível usar células de plantageneticamente modificadas de acordo com a invenção, plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção, material de propagação deacordo com a invenção, partes de planta que podem ser colhidas de acordocom a invenção, partes de planta que podem ser processadas de acordocom a invenção, partes de planta que podem ser consumidas de acordo coma invenção ou plantas que podem ser obtidas através de um processo deacordo com a invenção para preparar gêneros alimentícios ou ração. No en-tanto, uso como matérias-primas para aplicações industriais é também pos-sível, sem hialuronan tendo que ser isolado. Deste modo, por exemplo, plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou partes de plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção podem ser aplica-das a áreas sob cultivo agricultural para se obter ligação de água aumentadado solo. Ainda, plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção ou células de planta geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção podem ser usadas para preparação de agentes de secagem (por exem-plo, para uso quando embarcando itens sensíveis à umidade) ou como ab-sorvedores de líquidos (por exemplo, em fraldas ou para absorção de líqui-dos aquosos derramados). Para tais aplicações, é possível usar plantas ge-neticamente modificadas inteira de acordo com a invenção, partes das plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneti-camente modificadas cominuídas (por exemplo, moídas) de acordo com ainvenção ou partes de planta de acordo com a invenção, conforme requeri-do. Adequadas para aplicações onde plantas ou partes de planta moídassão usadas são em particular partes de planta contendo hialuronan, masapenas uma proporção baixa de água. Essas são de preferência grãos deplantas cereais (milho, arroz, trigo, centeio, aveias, cevada, sagu ou sorgo).Uma vez que células de planta geneticamente modificadas de acordo com ainvenção e plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãotêm um teor de hialuronan maior do que as plantas transgênicas descritas naliteratura, comparado com essas menos material tem que ser usado paraaplicações industriais quando é feito usado de células de planta genetica-mente modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção.

A presente invenção também provê processos para preparaçãode uma composição de acordo com a invenção,onde células de planta gene-ticamente modificadas de acordo com a invenção, material de propagaçãode acordo com a invenção, partes de planta que podem ser colhidas de a-cordo com a invenção, partes de planta processáveis de acordo com a in-venção, partes de planta consumíveis de acordo com a invenção ou plantasque podem ser obtidas através de um processo de acordo com a invençãopara a produção de uma planta que sintetiza hialuronan são usados. Os pro-cessos para preparação de uma composição de acordo com a invenção sãode preferência processos para preparação de gênero alimentício ou ração,processos para preparação de um produto farmacêutico ou processos parapreparação de um produto cosmético.

Processos para preparação de gêneros alimentícios e ração sãoconhecidos da pessoa versada na técnica. Processos para uso de plantasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção ou partes de plantade acordo com a invenção em áreas industriais são também conhecidos dapessoa versada na técnica e incluem inter alia cominuição ou moagem deplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou partes deplanta de acordo com a invenção; no entanto, eles não são exclusivamentelimitados a eles. Algumas das vantagens resultantes do uso de matérias-objeto de acordo com a invenção para preparação de gêneros alimentíciosração ou para uso em áreas industriais já foram acima descritas.

Um processo de acordo com a invenção para a preparação deuma composição é particularmente de preferência um processo para prepa-ração de uma composição que compreende hialuronan.

Composições obteníveis através de um processo para prepara-ção de uma composição de acordo com a invenção são da mesma maneiraprovidas pela presente invenção.

A presente invenção refere-se também ao uso de células deplanta geneticamente modificadas de acordo com a invenção, plantas gene-ticamente modificadas de acordo com a invenção, material de propagaçãode acordo com a invenção, partes de planta que podem ser colhidas de a-cordo com a invenção, partes de planta processáveis de acordo com a in-venção, partes de planta que podem ser consumidas de acordo com a in-venção ou plantas obteníveis através de um processo de acordo com a in-venção para produção de uma planta que sintetiza hialuronan para prepara-ção de uma composição de acordo com a invenção. Preferência é dada aouso de células de planta geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção, plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, materialde propagação de acordo com a invenção, partes de planta que podem sercolhidas de acordo com a invenção, partes de planta processáveis de acordocom a invenção, partes de planta consumíveis de acordo com a invenção oude plantas que podem ser obtidas através de um processo de acordo com ainvenção para produção de uma planta que sintetiza hialuronan para prepa-ração de gênero alimentício ou ração, para preparação de um agente farma-cêutico ou para preparação de um produto cosmético.DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS

SEQ ID NO 1: Seqüência de ácido nucléico codificando umahialuronan sintase de Paramecium bursaria Chlorella Vírus 1.

SEQ ID NO: 2 Seqüência de aminoácido de uma hialuronan sin-tase da Paramecium bursaria Chlorella Vírus 1. A seqüência de aminoácidomostrada pode ser derivada de SEQ ID NO 1.

SEQ ID NO 3: Seqüência de ácido nucléico sintética codificandouma hialuronan sintase de Paramecium bursaria Chlorella Vírus 1. A síntesedos códons da seqüência mostrada foi realizada de modo que ela seja adap-tada para uso de códons em células de planta. A seqüência de ácido nucléi-co mostrada codifica para uma proteína tendo as seqüências de aminoácidomostradas sob SEQ ID NO 2.

SEQ ID NO 4: Seqüência de ácido nucléico codificando umaproteína tendo a atividade de uma GFAT-1 do camundongo.

SEQ ID NO 5: Seqüência de aminoácido de uma proteína tendoa atividade de uma GFAT-1 do camundongo. A seqüência de aminoácidomostrada pode ser derivada da SEQ ID NO 4.

SEQ ID NO 6: Seqüência de ácido nucléico codificando umaproteína tendo a atividade de uma GFAT-2 do camundongo.

SEQ ID NO 7: Seqüência de aminoácido de uma proteína tendoa atividade de uma GFAT-2 do camundongo. A seqüência de aminoácidomostrada pode ser derivada da SEQ ID NO 6.

SEQ ID NO 8: Seqüência de ácido nucléico codificando umaproteína tendo a atividade de uma GFAT de Escherichia coli.

SEQ ID NO 9: Seqüência de aminoácido de uma proteína tendoa atividade de uma GFAT de Escherichia coli. A seqüência de aminoácidomostrada pode ser derivada da SEQ ID NO 8.

SEQ ID NO 10: Seqüência de ácido nucléico sintética codifican-do uma proteína tendo a atividade de uma GFAT de Eseheriehia coli. A sín-tese dos códons da seqüência mostrada foi realizada de modo que ela foiadaptada para uso de códons em células de planta. A seqüência de ácidonucléico mostrada codifica uma proteína tendo a seqüência de mino ácidomostrada sob SEQ ID NO 9.

SEQ ID NO 11: Oligonucleotídeo sintético usado no Exemplo 1.

SEQ ID NO 12: Oligonucleotídeo sintético usado no Exemplo 1.

SEQ ID NO 13: Oligonucleotídeo sintético usado como iniciadorde PCR no Exemplo 10.

SEQ ID NO 14: Oligonucleotídeo sintético usado como iniciadorde PCR no Exemplo 10.

Toda literatura usada, incluindo, mas não limitado a, números deacesso para ácido nucléico e seqüências de aminoácido, é incorporada nadescrição a título de referência.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Mostra uma curva de calibragem e a equação corres-pondente da linha de regressão usada para cálculo do teor de hialuronan emtecido de planta. A curva de calibragem estabelecida com o auxílio do estojode teste comercial (Hyaluronie Acid (HA) test kit da Corgenix Inc, Colorado,USA, N9 do produto 029-001) e as soluções padrão fornecidas com ele. AMÉTODOS GERAIS

Métodos que podem ser usados em conexão com a presenteinvenção são descritos abaixo. Esses métodos são modalidades específicas;no entanto, a presente invenção não é limitada a esses métodos. A pessoaversada na técnica sabe que a invenção pode ser realizada da mesma ma-neira através da modificação dos métodos descritos e ou substituindo méto-dos individuais ou partes de métodos por métodos alternativos ou partes al-ternativas de métodos.

1 .TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS DE BATATA

Plantas de batata foram transformadas com o auxílio de Agro-bacterium, conforme descrito em Rocha-Sosa e outros (EMBO J., 8, (1989)23-29).

2. ISOLAMENTO DE HIALURONAN DE TECIDO DE PLANTA

Para detectar a presença de hialuronan e para determinar o teorde hialuronan em tecido de planta, material de planta foi desenvolvido comosegue: 200 μΙ de água (desmineralizada, condutividade > 18 ΩΜ) foram adi-cionados a cerca de 0,3 g de material, e a mistura foi cominuída em um mo-edor de bola oscilatório de laboratório (MM200, da Retsch, Alemanha, 30seg a 30 Hz). Mais 800 μΙ de água (desmineralizada, condutividade >18ΩΜ)foram então adicionados, e a mistura foi bem misturada (usando, por exem-plo, um misturador Vortex). Restos de célula e componentes insolúveis fo-ram separados do sobrenadante através de centrifugação a 16.000 xg por 5minutos.

3. PURIFICAÇÃO DE HIALURONAN

Cerca de 100 gramas de bulbos foram descascados, cortadosem pedaços de um tamanho de cerca de 1 cm3 e, após adição de 100 ml deágua (desmineralizada, condutividade >18ΩΜ) cominuídos em um mistura-dor Warring em uma velocidade máxima por cerca de 30 segundos. Os res-tos de célula foram então removidos usando uma peneira de chá. Os restosde célula que tinham sido removidos foram ressuspensos em 300 ml de á-gua (desmineralizada, condutividade >18ΩΜ) e novamente removidos usan-do uma peneira de chá. As duas suspensões obtidas (100 ml + 300 ml) fo-ram combinadas e centrifugadas a 13 OOO xg por 15 minutos. NaCI foi adi-cionado ao sobrenadante de centrifugação obtido até uma concentração finalde 1 % ter sido atingida. Após o NaCI ter passado para solução, precipitarãofoi realizada através da adição de duas vezes o volume de etanol seguidopor mistura completa e incubação a -20Q C da noite para o dia. A mistura foientão centrifugada a 13 OOO xg por 15 minutos. O precipitado sedimentadoobtido após esta centrifugação foi dissolvido em 100 ml de tampão (TrisHCIa 50 mM, pH 8, CaCI2 a 1 mM) e proteinase K foi então adicionada para umaconcentração final de 100 pg ml e a solução foi incubada a 42s C por 2 ho-ras. Isto foi seguido por 10 minutos de incubação a 959 C. Mais uma vez,NaCI foi adicionado a esta solução até que uma concentração final de 1%tivesse sido atingida. Após o NaCI ter passado para solução, outra precipita-ção foi realizada através da adição de duas vezes o volume de etanol, mistu-ra completa e incubação a -209 C por cerca de 96 horas. Isto foi seguido por15 minutos de centrifugação a 13 000 xg. O precipitado sedimentado obtidoapós esta centrifugação foi dissolvido em 30 ml de água (desmineralizada,condutividade >18ΩΜ), e, mais uma vez, NaCI foi adicionado para uma con-centração final de 1%. Através da adição de duas vezes o volume de etanol,mistura completa e incubação a -209 C da noite para o dia, outra precipita-ção foi realizada. O precipitado obtido após centrifugação subseqüente a 13000 xg por 15 minutos foi dissolvido em 20 ml de água (desmineralizada,condutividade 18 M).

Purificação adicional foi realizada através de filtragem centrífu-ga. Para esta finalidade, em cada caso 5 ml do precipitado dissolvido foramaplicados ao filtro de membrana (CentriconAmicon, largura do poro 10 000NMWL, Ne do produto UCF8 010 96) e a amostra foi centrifugada a 2200 xgaté que apenas cerca de 3 ml da solução acima do filtro permanecessem.Mais duas vezes, em cada caso 3 ml de água (desmineralizada, condutivi-dade >18ΩΜ) foram então adicionados à solução acima da membrana e emcada caso recentrifugados sob condições idênticas até, no final, cerca de 3ml da solução acima do filtro permanecerem. As soluções ainda presentesacima da membrana após filtragem centrífuga foram tomadas, e a membra-na foi enxaguada repetidamente (três a cinco vezes) com cerca e 1,5 ml deágua (desmineralizada, condutividade >18ΩΜ). Todas as soluções que esta-vam ainda presentes acima da membrana e as soluções obtidas do enxágüeforam combinadas. NaCI foi adicionado para uma concentração final de 1%,após o NaCI ter passado para solução, duas vezes o volume de etanol foiadicionado, a amostra foi misturada e um precipitado foi obtido através dearmazenamento a -20g C da noite para o dia. O precipitado obtido após cen-trifugação subseqüente a 13 000 xg por 15 minutos foi dissolvido em 4 ml deágua (desmineralizada, condutividade >18ΩΜ) e então seco com congela-mento (24 horas sob uma pressão de 37 Pa (0,37 mbar), aparelho de seca-gem com congelamento Christ Alpha 1-4 da Christ, Osterode, Alemanha).4. DETECÇÃO DE HIALURONAN E DETERMINAÇÃO DO TEOR DE HIA-LURONAN

Hialuronan foi detectado usando um teste comercial (Hyaluronicacid (HA) test kit da Corgenix, Inc., Colorado, USA, Ne do produto 029-001)de acordo com as instruções do fabricante que são aqui incorporadas a títulode referência. O princípio do teste é baseado na disponibilidade de uma pro-teína que se liga especificamente a hialuronan (HABP) e é realizado simi-larmente a um ELISA, onde uma reação de cor indica o teor de hialuronanna amostra examinada. Deste modo, para a determinação quantitativa dehialuronan, as amostras a serem medidas devem ser empregadas em umaconcentração de modo que ela esteja dentro dos limites declarados (por e-xemplo, diluição da amostra em questão ou uso de menos água para extra-ção de hialuronan do tecido de planta, dependendo de se um limite foi exce-dido ou não atingido). Em bateladas paralelas, alíquotas das amostras a se-rem determinadas foram inicialmente submetidas à digestão por hialuronida-se e então medidas usando o teste comercial (Hyaloronic acid (HA) test kitda Corgenix, Inc., Colorado, USA, Ne do produto 029-001). Digestão por hia-Iuronidase foi realizada usando 400 μΙ de extrato de bulbo de batata emtampão de hialuronidase (tampão de fosfato de potássio a 0,1 M, pH 5,3;NaCI a 150 mM) através da adição de 5 pg (~3 unidades) de hialuronidase(hialuronidase tipo Ill da Sigma, N9 do produto H2251) e incubação a 37Q Cpor 30 min. Em cada caso em uma diluição de 1:10, todas as amostras fo-ram então usadas para determinação do teor de hialuronan.

5. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE UMA GFAT

A atividade de uma proteína tendo a atividade de GFAT é de-terminada conforme descrito em Rachel e outros (1996, J. Bacteriol. 178(8),2320-2327). Para distinguir se uma proteína tem a atividade de uma GFAT-1ou GFAT-2, o método descrito por Hu e outros (2004, J. BioL Chem. 279(29),29988-29993) é usado.

6. TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS DE ARROZ

Plantas de arroz foram transformadas através do método descri-to por Hiei e outros (1994, Plant Journal 6(2), 271 -282).

7. TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS DE TOMATE

Plantas de tomate foram transformadas com o auxílio de Agro-bacterium de acordo com o método descrito na US 5.565.347.

EXEMPLOS

1. PREPARAÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DE PLANTA IR 47-71

O plasmídeo pBinAR é derivado do plasmídeo do vetor bináriopBin19 (Bevan, 1984, Nuel. Acids Res. 12: 8711-8721) que foi construídocomo segue:

Um fragmento de um comprimento de 529 pb que compreendiaos nucleotídeos 6909-7437 do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor foi isolado como fragmento de EcoRI/Kpnl do plasmídeo pDH51 (Pietr-zak e outros, 1986 Nucleic Acids Res. 14, 5858) e ligado entre os sítios derestrição EeoRIe Kpnl do poliligante de pUC18. Desta maneira, o plasmídeopUC18-35S foi formado. Usando as endonucleases de restrição HinD Ill ePvu II, um fragmento de comprimento de 192 pb que incluía o sinal de polia-denilação (terminal 3') do gene da Oetopin Synthase (gene 3) do T-DNA doplasmídeo Ti pTiACH5 (Gielen e outros, 1984, EMBO Journal 3, 835-846)(nucleotídeos 11 749-11 939) foi isolado do plasmídeo pAGV40 (Herrera-

Estrella e outros, 1983 Nature, 303, 209-213). Seguindo a adição de IigantesSphl ao sítio de restrição Pvu II, o fragmento foi ligado entre os sítios de res-trição Sph I e Hind Il de pUC18-35S. Isto deu o plasmídeo pA7. Aqui, o poli-Iigante completo compreendendo o promotor 35S e terminador ocs foi remo-vido usando EcoRI e Hind Ill e ligado ao vetor apropriadamente clivadopBin19. Isto deu o vetor de expressão de planta pBinAR (Hôfgen and Wilmit-zer, 1990, Plant Science 66, 221 -230).

O promotor do gene patatina B33 de Solanum tuberosum (Ro-cha-Sosa e outros, 1989, EMBO J. 8, 23-29) era, como fragmento de Dra I(nucleotídeos -1512 +14), ligado ao vetor clivado por Sst I pUC19 cujas ex-tremidades tinham sido cegadas usando T4-DNA polimerase. Isto deu oplasmídeo pUC19-B33. A partir deste plasmídeo, o promotor B33 foi removi-do usando EcoR I e Sma I e ligado ao vetor pBinAR apropriadamente restri-to. Isto deu o vetor de expressão de planta pBinB33. Para facilitar etapas declonagem adicionais, o MCS (Sítio de Clonagem Mútiplo (Multiple CloningSite)) foi estendido. Para esta finalidade, dois oligonucleotídeos foram sinte-tizados, aquecidos a 95e C por 5 minutos, lentamente esfriados para tempe-ratura ambiente para permitir boa fixação (anelamento) e clonados nos sítiosde restrição Sal I e Kpn I de pBinB33. Os oligonucleotídeos usados para estepropósito tinham a seqüência que segue:

5'-TCg ACA ggC CTg gAT CCT TAA TTA AAC TAg TCT CgAggA gCT Cgg TAC-3'5'-CgA gCT CCT CgA gAC TAg TTT AAT TAA ggATCC Agg CCT g-3'

O plasmídeo foi chamado IR 47-71.

2. PREPARAÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DE PLANTA PBINARHYG

O fragmento compreendendo o promotor 35S, o terminador ocse o Sítio de Clonagem Múltiplo foi removido de pA7 usando as endonuclea-ses de restrição EcoR I e Hind Ill e clonado no vetor pBIBHyg (Becker, 1990,Nuclei Acids Res. 18, 203) que tinha sido cortado usando as mesmas endo-nucleases de restrição. O plasmídeo obtido foi chamado pBinARHyg.

3. PREPARAÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DE PLANTA PBINB33-HYG

O fragmento de EcoRI/HIndlll compreendendo o promotor B33,parte do poliligante e o terminador ocs foi excisado do plasmídeo pBinB33 eligado ao vetor apropriadamente restrito pBIB-Hyg (Becker, 1990, NucleicAcids Res. 18, 203). O vetor de expressão de planta obtido foi chamadopBinB33-Hyg.

4. SÍNTESE DE MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO

a) Síntese de moléculas de ácido nucléico codificando uma hia-Iuronan sintase de Paramecium bursaria Chlorella Vírus 1

A seqüência de ácido nucléico codificando uma hialuronan sin-tase (HAS) e Paramecium bursaria Chlorella Vírus 1 foi sintetizada por Me-digenomix GmbH (Munique, Alemanha) e clonada no vetor pCR2.1 da Invi-trogen (NQ do produto K2000-01).

O plasmídeo obtido foi chamado IC 323-215. A seqüência deácido nucléico sintética codificando a proteína HAS de Paramecium bursariaChlorella Vírus 1 é mostrada sob SEQ ID NO 3. A seqüência de ácido nu-cléico correspondente originalmente isolada do Parameeium bursaria Chlo-rella Vírus 1 é mostrada sob SEQ ID NO 1.

b) Síntese de moléculas de ácido nucléico codificando uma pro-teína tendo a atividade dé uma GFAT de Eseheriehia eoli

A seqüência de ácido nucléico codificando uma proteína tendo aatividade de uma GFAT de Eseheriehia eoli foi sintetizada pela EntelechonGmbH e clonada no vetor pCR4Topo da Invitrogen (Ns do produto K4510-

20). O plasmídeo obtido foi chamado IC 373-256. A seqüência de ácido nu-cléico sintética codificando uma proteína tendo a atividade de uma GFAT deEseheriehia eoli é mostrada sob SEQ ID NO 10. A seqüência de ácido nu-cléico correspondente originalmente isolada de Eseheriehia eoli é mostradasob SEQ ID NO 8.

5. ORIGEM DE MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO ADICIONAIS

a) Moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína tendoa atividade de uma GFAT-1 do camundongo

A seqüência de ácido nucléico codificando uma proteína tendo aatividade de uma GFAT-1 foi comprada da BioCat GmbH, Heidelberg (Art.

Ne MMM1013-65346, clone de cDNA MGC:58262, IMAGE:6742987). Este éum clone produzido pela I.M.A.G.E. Konsortium (http://image.llnl.gov) e dis-tribuído pela BioCat GmbH. Aqui, o cDNA codificando uma proteína tendo aatividade de uma GFAT-1 foi clonado no vetor pCMV Sport 6 da Invitrogen.O plasmídeo obtido foi chamado IC 365-256. A seqüência de ácido nucléico,inserida no IC 365-256, codificando uma proteína tendo a atividade de umaGFAT-1 de Mus musculus tem, comparado com a seqüência de ácido nu-cléico mostrada sob SEQ ID NO 4, uma troca de base de T para C na posi-ção 1090 e uma troca de base de G para A na posição 2027. Essas trocasde base não resultam em trocas de aminoácido das seqüências de aminoá-cido codificadas pelas duas moléculas de ácido nucléico diferentes. A se-qüência de ácido nucléico de codificação para a proteína tendo a atividadede uma GFAT-1 do camundongo é mostrada na SEQ ID NO: 4. Para facilitaras etapas de clonagem subseqüentes, a seqüência codificando uma proteí-na tendo a atividade de uma GFAT-1 foi isolada usando as endonucleasesde restrição Xhol e Eco RV de IC 365-256 e clonada no plasmídeo pME9(vetor pBlueSkript da Stratagene) tendo um sítio de clonagem múltiplo modi-ficado que tem adicionalmente um sítio de restrição Pac I em ambas extre-midades, plasmídeo que tinha sido cortado com as mesmas endonucleasesde restrição. O plasmídeo obtido foi chamado IC 367-256.

b) Moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína tendoa atividade de uma GFAT-2 do camundongo

Moléculas de ácido nucléico codificando uma proteína tendo aatividade de uma GFAT-2 do camundongo foram compradas da Invitrogen(Clone ID 4167189, clone de cDNA MGC:18324, IMAGÈ:4167189). Este éum clone que é produzido pela I.M.A.G.E. Konsortium (http://image.llnl.gov)e distribuído pela Invitrogen. Aqui, o cDNA codificando uma proteína tendo aatividade de uma GFAT-2 é clonado no vetor pCMV Sport 6 da Invitrogen. Oplasmídeo foi chamado IC 369-256. A seqüência de ácido nucléico codifi-cando a proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 de Mus musculus é mos-trada sob SEQ ID NO 6.

6. PREPARAÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DE PLANTA IC 341-222QUE COMPREENDE UMA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO DE CODI-FICAÇÃO PARA UMA HIALURONAN SINTASE DE PARAMECIUM BUR-SARIA CHLORELLA VÍRUS 1Usando digestão de restrição com BamH I e Xho I, moléculas deácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação de hialuronansintase foram isoladas do plasmídeo IC 323-215 e clonadas nos sítios derestrição BamH I e Xho I do plasmídeo IR 47-71. O vetor de expressão deplanta obtido foi chamado IC 341 -222.

7. PREPARAÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DE PLANTA IC 399-299COMPREENDENDO UMA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO DE CODI-FICAÇÃO PARA UMA PROTEÍNA TENDO A ATIVIDADE DE UMA GFAT-2DO CAMUNDONGO

Usando digestão de restrição com Xho I e Asp 718, moléculasde ácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação para uma pro-teína tendo a atividade de uma GFAT-2 do camundongo foram isoladas doplasmídeo 369-256 e clonadas no vetor de expressão de planta pBinB33-Hyg que tinha sido cortado com as mesmas endonucleases de restrição. Ovetor de expressão de planta foi chamado IC 399-299.

8. PREPARAÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DE PLANTA IC 399-300COMPREENDENDO UMA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO DE CODI-FICAÇÃO PARA UMA PROTEÍNA TENDO A ATIVIDADE DE UMA GFATDE E COLI

Moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência decodificação da proteína tendo a atividade de uma GFAT de E. coliforam iso-ladas do plasmídeo 373-256 através de digestão com restrição com Sac I eSbf I e clonadas no vetor de expressão de planta pBinB33-Hyg que tinhasido cortado com as mesmas endonucleases de restrição. O vetor de ex-pressão de planta obtido foi chamado IC 399-300.

9. PREPARAÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DE PLANTA PBA16. QUECONTÉM UMA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO DE CODIFICAÇÃOPARA UMA HIALURONAN SINTASE DE PARAMECIUM BURSARIA C-HLORELLA VÍRUS 1

Usando a endonuclease de restrição Asp 7181, um fragmentocompreendendo a seqüência de ácido nucléico de codificação para uma hia-luronan sintase de Paramecium bursaria Chlorella Vírus 1 foi isolada doplasmídeo IC 323-215, as extremidades do fragmento foram cegadas usan-do polimerase Klenow e o fragmento resultante foi então mais uma vez cli-vado usando a endonuclease de restrição Pac I. O fragmento obtido destamaneira foi ligado no plasmídeo IR103-123 (descrito no WO 2006 032538),que tinha sido clivado usando as endonucleases de restrição Pac I e Ecl136II. O vetor de expressão de planta obtido foi referido como pBA16.

10. PREPARAÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO DE PLANTA IC 386-299

O DNA do promotor prolamin de arroz (N9 de Acesso EMBLD63901, Sha e outros, 1996, Biosci. Biotech. Biochem. 60, 335-337, Wu eoutros, 1998, Plant Cell Physiol. 39(8), 885-889) foi amplificado usando DNAgenômico isolado de folhas de Oryza sativa (cultivar M202).

CONDIÇÕES USADAS PARA AMPLIFICACÃO POR PCR:

Para amplificação, a polimerase de DNA Expand High Fidelity(PCR Systems, Roche Ne Prod. 1732641) foi usada. As condições e tam-pões fornecidos pelo fabricante do estojo acima mencionado foram usados.DNA: 50 ng do DNA de arroz genômicodNTPs: 0,83 μΜ de dNTP Mix0,25 μΜ de Iniciador prol-F15AAA A ACTAGTTCTAC ATCG G CTTAG GTGTAG CAACACG0,25 μΜ de Iniciador prol-R15'-AAAAGATATCTGTTGTTGGATTCTACTACTATGCTTCAA

Condições de reação: Etapa 1 949 C 15 segEtapa 2 609C 15 segEtapa 3 729 C 45 seg

As Etapas 1 a 3 foram repetidas 35 vezes antes da reação seresfriada para 49 C. O fragmento obtido através de amplificação por PCR foiclonado através do uso do estojo de clonagem TA (Invitrogen N9 do produto:KNM2040-01) no plasmídeo PCR 2.1. O plasmídeo resultante foi chamadoMl 4-154. Um fragmento de ácido nucléico compreendendo a seqüência decodificação da proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 do camundongofoi isolado do plasmídeo IC 369-256 através do uso das endonucleases derestrição Not I e Kpn I e clonado nos sítios Not I e Kpn I do vetor pMCS5(comprado da MoBiTech). O plasmídeo obtido foi chamado IC 385-299. Ofragmento de ácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação daproteína tendo a atividade de uma GFAT-2 do camundongo foi isolado foiplasmídeo IC 385-299 através do uso de endonucleases de restrição Xho I eHpa I e clonado nos sítios de restrição Xho I e Ecl 136 Il do plasmídeo 9--154. O vetor de expressão de planta obtido foi chamado IC 386-299. Basepara preparação de vetor Ml 9-154 foi o plasmídeo ML 18-56 (WO 05030941). Um sítio de clonagem múltiplo (MCS) compreendendo extremida-des adesivas para clonagem nos sítios de restrição Hind Il e PsM e compre-endendo os sítios de restrição adicionais Pst I, Sac I, Bln I, Xho I, Hpa I, SpeI e Hind Ill foi preparado através de anelamento de dois oligonucleotídeossintéticos complementares. O oligonucleotídeo anelado foi clonado nos sítiosde restrição Hind Il e Pst I do plasmídeo ML 18-56. O vetor obtido foi cha-mado Ml 8-154. O fragmento de ácido nucléico compreendendo o promotorprolamin foi isolado do plasmídeo Ml 4-154 usando as endonucleases derestrição Eco RV e Spe I e clonado no vetor Ml 8-154. O plasmídeo obtido foichamado Ml 9-154.

11. TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS COM VETORES DE EXPRESSÃODE PLANTA COMPREENDENDO MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICOCODIFICANDO UMA HIALURONAN SINTASE

Plantas de batata (cv Désirée) foram transformadas usando ovetor de expressão de planta IC 341 -222, que compreende uma seqüênciade ácido nucléico de codificação para uma hialuronan sintase de Parameci-um bursaria Chlorella Vírus 1 sob o controle do promotor do gene patatinaB33 de Solanum tubesorum (Rocha-Sosa e outros, 1989, EMBO J. 8, 23-29)usando o método dado sob Métodos Gerais item 1. As plantas de batatatransgênicas obtidas, que foram transformadas com o plasmídeo IC 341--222, foram chamadas 365 ES.

12. ANÁLISE DE PLANTAS TRANSGÊNICAS TRANSFORMADAS COMVETORES DE EXPRESSÃO DE PLANTA COMPREENDENDO MOLÉCU-LAS DE ÁCIDO NUCLÉICO CODIFICANDO UMA HIALURONAN SINTASE

a) Construção de uma curva de calibragemUma curva de calibragem foi construída usando as soluçõespadrão fornecidas com o estojo de teste comercial (Hyaluronic acid (HA) testkitôa Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. N9 029-001 ), de acordo com osmétodos descritos pelo fabricante. Para determinar a extinção a 1600 ng/mlde hialuronan, dobro da quantidade, com base na quantidade padrão forne-cida indicada pelo fabricante, compreendendo 800 ng/ml de hialuronan foiusado. Em cada caso, três séries de medição independentes foram realiza-das, e a média correspondente foi determinada. Isto deu a curva de calibra-gem que segue:<table>table see original document page 72</column></row><table>

Tabela 1: Valores para construção de uma curva de calibragempara a determinação quantitativa do teor de hialuronan em tecido de planta.Com o auxílio de Software (Microsoft Office Excell 2002, SP2), os valoresmedidos obtidos foram inseridos em um diagrama e a equação da função dalinha de inclinação foi determinada (vide Figura 1). E4Sonm refere-se à extin-ção em um comprimento de onda de 450 nm, s.d. é o desvio padrão da mé-dia calculada dos valores individuais.

b) Análise de bulbos de batata de linhagens 365 ESEm uma estufa, plantas individuais da linhagem 365 ES foramcultivadas em solo em potes de 6 cm. Em cada caso cerca de 0,3 g de mate-rial de bulbos de batata das plantas individuais foi processado, de acordocom o método descrito sob Métodos Gerais item 2. Usando o método descri-to sob Métodos Gerais item 4, a quantidade de hialuronan presente nos res-pectivos extratos de planta foi determinada, com o auxílio da curva de cali-bragem mostrada no Exemplo 12a) e Figura 1. Aqui, o sobrenadante obtidoapós centrifugação foi usado em uma diluição de 1:10 para determinação doteor de hialuronan. Para plantas selecionadas, os resultados que seguemforam obtidos.

<table>table see original document page 73</column></row><table>

Tabela 2: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por gde peso fresco) produzida por plantas transgênicas independentes da linha-gem 365 ES. A coluna 1 refere-se à planta da qual material de bulbo foi cole-tado (aqui, tipo selvagem refere-se a plantas não-transformadas que, no en-tanto, têm o genótipo usado como material de partida para a transformação).A Coluna 2 indica a quantidade de material de bulbo da planta em questãousada para determinação do teor de hialuronan. A Coluna 3 contém a extin-ção medida de uma diluição 1:10 do respectivo extrato de planta. A Coluna 4foi calculada com o auxílio da equação de linha de regressão (vide Figura 1)levando em consideração o fator de diluição, como segue ((coluna 3 valor0,149)/0,00185) χ 10. A coluna 5 indica a quantidade de hialuronan com ba-se no peso fresco usado e foi calculada como segue: (coluna 4 valor/coluna2 valor)/1000. n.d. significa não-detectável.

13. TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS DE SINTETIZAÇÃO DE HIALURO-NAN COM VETORES DE EXPRESSÃO DE PLANTA COMPREENDENDOSEQÜÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLÉICO DE CODIFICAÇÃO PARA UMAPROTEÍNA TENDO A ATIVIDADE DE UMA GFAT DE ESCHERICHIA COLIa) Transformação de plantas

Plantas de batata das linhagens 365 ES 13 e 365 ES 74 foramem cada caso transformadas com o vetor de expressão de planta IC 399-300 usando o método dado sob Métodos Gerais item 1. As plantas de batatatransgênicas obtidas após transformação da linhagem 365 Es 74 com oplasmídeo 399-300 foram chamadas 433 ES.

b) Análise de bulbos de batata da linhagem 433 ES

Em uma estufa, plantas individuais da linhagem 433 ES foramcultivadas em solo em potes de 6 cm. Em cada caso, cerca de 0,3 g de ma-terial de bulbos de batata e/ou folhas das plantas individuais foi processado,de acordo com o método descrito sob Métodos Gerais item 2. Usando o mé-todo descrito sob Métodos Gerais item 4, a quantidade de hialuronan pre-sente nos respectivos extratos de planta foi determinada, com o auxílio dacurva de calibragem mostrada no Exemplo 12a) e Figura 1. Aqui, o sobrena-dante obtido após centrifugação foi usado em uma diluição de 1:10 para de-terminação do teor de hialuronan. Para plantas selecionadas, os resultadosque seguem foram obtidos:

<table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table>

Tabela 3: Quantidade de hialuronan (HA em pg de hialuronanpor g de peso fresco) produzido pelas plantas transgênicas independentesda linhagem 433 ES. A coluna 1 refere-se à planta da qual material de bulboou folha foi coletado (aqui tipo selvagem refere-se a plantas não-transformadas e ES 365 74 refere-se a plantas que foram usadas como ma-terial de partida para transformação com plasmídeo C 399-300). As Colunas2 e 3 referem-se à quantidade de hialuronan detectada em folhas ou bulbos,respectivamente.

14. TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS DE ARROZ

a) Com vetores de expressão de planta compreendendo molé-culas de ácido nucléico codificando uma hialuronan sintase de Parameciumbursaria Chlorella Vírus 1

Plantas de arroz (cultivar M202) foram transformadas com o ve-tor de expressão de planta pBA16, que contém uma seqüência de ácido nu-cléico de codificação para uma proteína hialuronan sintase de Parameciumbursaria Chlorella Vírus 1 sob o controle do promotor do gene de glubulinada Oryza sativa (Wu e outros, 1998, Plant Cell Physioi 39(8), 885-889), u-sando o método dado sob Métodos Gerais item 6. As plantas de arroz trans-gênicas obtidas que tinham sido transformadas com o plasmídeo pBA16 fo-ram referidas como Os-pBA16.

b) Com vetores de expressão de planta compreendendo se-qüências de ácido nucléico de codificação para uma proteína tendo a ativi-dade de uma GFAT-2 de camundongo

Plantas de arroz (cultivar M202) foram transformadas com o ve-tor de expressão de planta IC 386-299 que contém uma seqüência de ácidonucléico de codificação para uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2do camundongo sob o controle do promotor dos polipeptídeos prolamin de13-kDa da Oryza sativa, usando o método dado sob Métodos Gerais item 6.As plantas de arroz transgênicas obtidas que tinham sido transformadas como plasmídeo pBA16 foram referidas como GAOS0788.15. ANÁLISE DE PLANTAS DE ARROZ DA LINHAGEM OS-PBA16

a) Sementes de arroz imaturasSementes de arroz imaturas (5 a 10 dias após polinação) produ-zidas por plantas individuais da linhagem OS-pBA16, cultivadas em solo naestufa, foram colhidas, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 C. Os grãos congelados de cada planta individual foram selecionadosaleatoriamente, o endosperma foi eliminado, agrupados, pesados e congela-dos em nitrogênio líquido novamente. A amostra foi quebrada com um moe-dor Ball (Modelo MM200, Firma Retsch, Alemanha), 100 μΙ de água foramadicionados, o homógenato foi misturado, centrifugado (13000 xg, 5 min) e aconcentração de hialuronan de cada amostra foi determinada de acordo como método descrito sob Métodos Gerais, item 4.

De 37 grupos de semente, cada um compreendendo 3 semen-tes imaturas de plantas independentes da linhagem Os-pBA16, mais de 70%provaram sintetizar uma quantidade significante de hialuronan (pelo menos0,1 pg de hialuronan por g de peso fresco) em sementes. A quantidade dehialuronan em grupos de semente preparadas de plantas de arroz indepen-dentes variou entre 0,1 e 15,7 pg de hialuronan por g de preso fresco. Osresultados para grupos de semente cada um preparado de plantas indepen-dentes são mostrados na tabela que segue:

<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>

Tabela 4: Detecção de hialuronan em grupos de semente, cadaum preparado de plantas independentes da linhagem transgênica OS-pBA16.

b) Farinha de arroz

20-25 sementes maduras foram colhidas de cada planta trans-formada. As cascas foram removidos por um descascador (LaboratoryPaddy sheller, Grainman, Miami, Florida, USA) e grão de arroz marrom foimoído com um moedor de laboratório (Cyclotec, Sample mill, Foss, Dina-marca). A cerca de 40 mg da farinha de arroz obtida das sementes agrupa-das de cada planta independente, 1 ml de água foi adicionado, a amostra foimisturada, centrifugada (13000xg, 5 min) e a concentração de hialuronan dosobrenadante de cada amostra foi determinada de acordo com o métododescrito sob Métodos Gerais, item 4. Resultados para amostras de farinhaselecionadas preparadas a partir de plantas independentes são mostradas

<table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table>

Tabela 5: Detecção de hialuronan em amostras de farinha dearroz, preparadas de sementes de cada planta independente da linhagemtransgênica OS-pBA16. Detecção foi realizada usando o método descritosob Métodos Gerais item 4.

b) Análise de plantas de arroz da linhagem GAOS0788Plantas de arroz independentes da linhagem GAOS0788 obtidasapós transformação com o plasmídeo IC 386-299 foram cultivadas em solona estufa. De cada planta 20-25 sementes maduras (grãos) foram coletados,cascas foram removidas por um descascador (Laboratory Paddy sheller,Grainman, Miami, Florida, USA) e cerca de 7 grãos de arroz marrom de cadalinhagem foram moídos em um moedor de bola de laboratório (MM200,Company Retsch, Alemanha, 30 seg. bei 30 Hz), levando ã farinha de arroz.Em seguida o teor de derivados de glicosamina N-acetilada em cada amos-tra foi determinado de acordo com o método conforme descrito por Elson eMorgan (1933, J. Biochem. 27, 1824). Várias amostras analisadas realmentemostraram um aumento no teor de derivados de glicosamina N-acetiladavariando de cerca de 2 pmoles até cerca de 20 Mmoles de derivados de gli-cosamina N-acetilada por grama de peso fresco da amostra. Grãos individu-ais de plantas selecionadas (GAOS0788-00501), analisados conforme des-crito acima, mostraram realmente um teor de derivados de glicosamina N-acetilada de até cerca de 43 μηποΙ por grama de peso fresco da amostra.

Plantas selecionadas das linhagens OS-pBA16 e GAOS0788serão cruzadas umas com as outras para se obter plantas compreendendomoléculas de ácido nucléico codificando uma proteína de uma hialuronansintase e codificando uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2.Listagem de Seqüência

<110> Bayer cropscience GmbH<120> Plantas com produção de hialuronan aumentada<130> BCS 05-5008 PCT<150> EP05090279.0<151> 2005-10-05<150> US60/725,388<151> 2005-10-11<160> 14<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 1707<212> DNA<213> Paramecium bursaria chlorella virus 1<220><221> CDS<222> (1)..(1707)<300><308> PB42580<309> 1995-12-24<313> (50903)..(52609)<400> 1

atg ggt aaa aat ata atc ata atg gtt tcg tgg tac acc ate ata act 48Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val ser Trp Tyr Thr Ile He Thr1 5 10 15

tca aat cta ate gcg gtt gga gaa gcc tet cta ate ttg gct ccg gea 96ser Asn Leu Ile Ala vai Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala20 25 30

att act ggg tat gtt cta cat tgg aat att gct etc tcg aca ate tgg 144Ile Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp35 40 45

gga gta tca gct tat ggt att ttc gtt ttt ggg ttt ttc ctt gea caa 192Glv vai ser Ala Tyr Gly lie Phe vai Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln50 55 60

gtt tta ttt tca gaa ctg aac agg aaa cgt ctt cgc aag tgg att tet 240Val Leu Phe ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser65 70 75 80

ctc aga cct aag ggt tgg aat gat gtt cgt ttg gct gtg ate att gct 288Leu Arq Pro Lys Gly Trp Asn Asp vai Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala85 90 95

gga tat cgc gag gat cct tat atg ttc cag aag tgc ctc gag tet gta 336Glv Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser vaiy 100 105 110

cgt gac tet gat tat gqc aac gtt gcc cgt ctg att tgt gtg att gac 384Arq Asp Ser Asp Tyr Gly Asn vai Ala Arg Leu Ile Cys vai Ile Asp115 120 125

ggt gat gag gac gat gat atg agg atg gct gcc gtt tac aag gcg ate 432Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile130 135 140

tac aat gat aat ate aag aag ccc gag ttt gtt ctg tgt gag tca gac 480

Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp145 150 155 160

gac aag gaa ggt gaa cgc ate gac tet gat ttc tet cgc gac att tgt 528

Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp ser Asp Phe ser Arg Asp Ile Cys165 170 175

gtc ctc cag cct cat cgt gga aaa cgg gag tgt ctt tat act ggg ttt 576

vai Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe180 185 190

caa ctt gea aag atg gac ccc agt gtc aat gct gtc gtt ctg att gac 624

Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser vai Asn Ala Val Val Leu Ile Asp195 200 205

age gat acc gtt ctc gag aag gat gct att ctg gaa gtt gta tac cca 672

Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu vai vai Tyr Pro210 215 220

ctt gea tgc gat ccc gag ate caa gcc gtt gea ggt gag tgt aag att 720

Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala vai Ala Gly Glu Cys Lys Ile225 230 235 240

tgg aac aca gac act ctt ttg agt ctt ctc gtc gct tgg cgg tac tat 768

Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr245 250 255

tet gcg ttt tgt gtg gag agg agt gcc cag tet ttt ttc agg act gtt 816

Ser Ala Phe Cys VaT Glu Arg Ser Ala Gln ser Phe Phe Arg Thr vai260 265 270

cag tgc gtt ggg ggg cca ctg ggt gcc tac aag att gat ate att aag 864

Gln Cys vai Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys lie Asp lie lie Lys275 280 285

gag att aag gac ccc tgg att tcc cag cgc ttt ctt ggt cag aag tgt 912

Glu lie Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys290 295 300

act tac ggt gac gac cgc cgg cta acc aac gag ate ttg atg cgt ggt 960

Thr Tvr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly305 310 315 320

aaa aag gtt gtg ttc act cca ttt gct gtt ggt tgg tet gac agt ccgLvs Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala vai Gly Trp ser Asp Ser Pro325 330 335

acc aat gtg ttt cgg tac ate gtt cag cag acc cgc tgg agt aag tcgThr Asn vai Phe Arg Tyr Ile vai Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys ser340 345 350

tgg tgc cgc gaa att tgg tac acc ctc ttc gcc gcg tgg aag cac ggt 1104Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly355 360 365

ttg tet gga att tgg ctg gcc ttt gaa tgt ttg tat caa att aca tac 1152Leu ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr370 375 380

ttc ttc ctc gtg att tac ctc ttt tet cgc cta gcc gtt gag gcc gacPhe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala vai Glu Ala Asp385 390 395 400

cct cgc gcc cag aca gcc acg gtg att gtg age acc acg gtt gea ttgPro Arg Ala Gln Thr Ala Thr vai Ile Val Ser Thr Thr vai Ala Leu

1008

1056

1200

1248405 410 415

att aag tgt ggg tat ttt tca ttc cga gcc aag gat att cgg gcg ttt 1296

Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe420 425 430

tac ttt gtg ctt tat aca ttt gtt tac ttt ttc tgt atg att ccg gcc 1344

Tyr Phe vai Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala435 440 445

agg att act gca atg atg acg ctt tgg gac att ggc tgg ggt act cgc 1392

Arg Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg450 455 460

ggt gga aac gag aag cct tcc gtt ggc acc cgg gtc gct çtg tgg gca 1440

Gly Giy Asn Glu Lys Prò Ser vai Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala

465 470 475 480

aag caa tat ctc att gca tat atg tgg tgg gcc gcg gtt gtt ggc gct 1488

Lys Gln Tyr Leu lie Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala485 490 495

gga gtt tac age ate gtc cat aac tgg atg ttc gat tgg aat tet ctt 1536

Gly vai Tyr Ser lie Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn ser Leu500 505 510

tet tat cgt ttt gct ttg gtt ggt att tgt tet tac att gtt ttt att 1584

Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Tle Val Phe Ile515 520 525

gtt att gtg ctg gtg gtt tat ttc acc ggc aaa att acg act tgg aatVal lie vai Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn530 535 540

1632

ttc acg aag ctt cag aag gag cta ate gag gat cgc gtt ctg tac gat 1680Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp545 550 555 560

gca act acc aat gct cag tet gtg tga 1707

Ala Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val565

<210> 2<211> 568<212> PRT

<213> Paramecium bursaria Chlorella Virus 1<400> 2

Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met vai Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr1 5 10 15

Ser Asn Leu Ile Ala vai Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala20 25 30

Ile Thr Gly Tyr vai Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp35 40 45

Gly vai Ser Ala Tyr Gly Ile Phe vai Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln50 55 60

vai Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser65 70 75 80Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp vai Arg Leu Ala vai Ile Ile Ala85 90 95

Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser vai100 105 110

Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn vai Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp115 120 125

Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile130 135 140

Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp145 150 155 160

Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys165 170 175

Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe180 185 190

Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro ser vai Asn Ala vai vai Leu Ile Asp195 200 205

Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro210 215 220

Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile225 230 235 240

Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr245 250 255

Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val260 265 270

Gln Cys Val Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys Ile Asp Ile Ile Lys275 280 285

Glu Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys290 295 300

Thr Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly305 310 315 320

Lys Lys vai vai Phe Thr Pro Phe Ala vai Gly Trp Ser Asp Ser Pro325 330 335

Thr Asn Val Phe Arg Tyr Ile vai Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser340 345 350Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly355 360 365

Leu Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr370 375 380

Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp385 390 395 400

Pro Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile vai Ser Thr Thr Val Ala Leu405 410 415

Ile Lys Cys Gly Tyr Phe ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe420 425 430

Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala435 440 445

Arg Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg450 455 460

Gly Gly Asn Glu Lys Pro Ser vai Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala465 470 475 480

Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val vai Gly Ala485 490 495

Gly Val Tyr Ser Ile vai His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu500 505 510

Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile515 520 525

Val Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn530 535 540

Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp545 550 555 560

Ala Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val565

<210> 3<211> 1707<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintética codificando uma proteína hialuronansintase do vírus<400> 3atgggtaaga acattatcat tatggtgtcc tggtacacaa ttattacaag taatctcatc 60gcagttggtg gtgcatctct tattctcgct ccagctatca ctggatatgt tcttcactgg 120aacatcgccc tctcaactat ttggggagtt tccgcatatg gtatttttgt tttcgggttc 180tttttggctc aggttctgtt ctcagagctc aatcgtaaga gactcaggaa gtggattagc 240cttagaccaa aggggtggaa tgacgttcgt ctcgctgtca ttatcgctgg ctaccgtgaa 300gatccttaca tgtttcaaaa gtgcttggaa tcagttaggg atagtgatta tggcaacgtc 360gctagactga tctgtgtgat tgatggagat gaggacgacg atatgaggat ggcagctgtt 420tataaggcta tctataatga taacattaag aagcctgaat ttgttctttg cgagtctgat 480gacaaggaag gagaacggat tgattcagat ttctcacgtg atatctgcgt tctccaacct 540catcgtggga agcgtgaatg tctttataca ggtttccaac tcgccaaaat ggacccatca 600gtgaacgctg tggttcttat cgatagtgat actgtgctgg agaaagatgc tatcttggag 660gttgtttacc ctcttgcctg tgatcctgaa attcaagctg tggctggaga gtgcaagatc 720tggaacacag atactcttct ttctctgctt gtcgcatgga gatattactc cgcattctgt 780gtggagagga gcgctcaatc ctttttccgt accgttcaat gcgttggtgg tcctttggga 840gcttacaaaa ttgatatcat caaggagatt aaggacccat ggattagtca aaggtttctt 900ggtcagaagt gcacttatgg cgatgatcgt agattgacta acgaaatcct tatgaggggc 960aagaaagtcg tttttactcc atttgctgtc ggatggtctg attcacctac aaatgttttc 1020cgttatattg tgcaacaaac acgttggagt aagagctggt gtagggagat ctggtacact 1080ttgttcgctg cttggaagca cgggcttagc ggaatttggc ttgcttttga atgcctttac 1140cagattacat actttttctt ggtgatctat ttgttttcac gtcttgccgt cgaggctgac 1200cctagagcac agactgcaac tgtgattgtt tctactacag tcgcacttat taagtgtggc 1260tatttcagtt ttagagcaaa agatattaga gccttctatt ttgttttgta cacatttgtt 1320tatttctttt gcatgattcc agctcgtatt accgctatga tgaccttgtg ggacatcgga 1380tggggaacta gaggtggtaa cgaaaagcct tctgtgggaa caagggtggc cctttgggca 1440aaacaatatc tcatcgccta catgtggtgg gccgctgtcg ttggtgccgg agtgtactca 1500atcgttcata actggatgtt tgactggaac tctttgagct atcgtttcgc tcttgtgggt 1560atttgttctt acattgtttt catcgtgatt gtgctcgttg tgtatttcac tggtaaaatc 1620acaacctgga atttcactaa acttcaaaag gaattgattg aagacagggt tctgtatgat 1680gctactacca acgcccagtc agtttaa 1707

<210> 4

<211> 2298

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220><221><222>

CDS

(150)..(2192)<220>

<221> alelo

<222> (1190)..(1190)

<223> Seqüência inserida no plasmédio IC 365-256 contém uma trocade base de T para C na posição 1190.

<220>

<221> ali ele

<223> sequncè inserted in plasmid IC 365-256 contains a base exchnagefrom G to A at position 2027

<300>

<308> BC050762.1

<309> 2005-03-08

<313> (150)..(2195)

ctt aaa ata gct cat acc cgt tgg gcg aca cat gga gaa ccc aat cctLeu GÍy Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu Pro Asn Pro90 95 100

ate aat agt cac ccc cag cgc tct gat aaa aat aat gaa ttc att gttvai Asn ser His Pro Gln Arg Ser Asp Lys Asn Asn Glu Phe Ile Val105 110 115 120

att cat aat gga ate ate acc aac tac aaa gac ttg aaa aag ttt ctgIle His Asn Gly Ile Ile Thr Asn Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu125 130 135

gaa age aaa ggc tat gac ttt gaa tct gaa aca gac aca gaa acc attGlu ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile140 145 150

acc aaq ctc gtc aag tac atg tat gac aac tgg gag age cag gac gtcAla Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr Asp Asn Trp Glu Ser Gln Asp Val155 160 165

agt ttt acc acc ttg gtg gag aga gtt ate caa caa ttg gaa ggc gcc

60120

<400> 4

gagagcgaag cgagcgctga gtcggactgt cgggtctgag ctgtcgcatc çcagagtcct

ctcattgcca ccaccccggc ccgagctcac cctcgcttct gaagctctcc gcgcgcccga

caqctcagcc ctcgcccgtg accaacatc atg tgc ggt ata ttt gçt tat tta 173

Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu1 5

aat tac cat gtt cct cga aca aga cga gaa ate ttg gag aca cta ate 221

Asn Tvr His Val Pro Arg Thr Arg Arg Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile10 15 20

aaa ggc ctt cag aga ctg gaa tac aga gga tat gat tct gçt ggt gtg 269

Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly vai25 30 35 40

gga ctt gac gga ggc aat gac aaa gac tgg gaa gçc aac gçc tgc aaa 317

Gly Leu Asp Gly Gly Asn Asp Lys Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys45 50 55

ate cag ctc att aag aag aaa gga aaa gtt aag gça ctg gat gaa gaa 365

Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly Lys vai Lys Ala Leu Asp Glu Glu60 65 70

gtt cac aaa caa caa gat atg gac ttg gat ata gaa ttt gat gtg cat 413

vai His Lys Gln Gln Asp Met Asp Leu Asp Ile Glu Phe Asp vai His75 80 85

461509557605653701Ser Rhe Thr Thr Leu vai Glu Arg vai lie Gln Gln Leu Glu Gly Ala170 175 180

ttt gct ctt gtg ttt aaa agt gtc cat ttt ccc ggg caa gca gtt ggc 749

Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly185 190 195 200

aca agg cga ggt age cct ctc ttg att ggt gtg cgg agt gaa cat aag 797

Thr Arg Arg Gly ser Pro Leu Leu Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys205 210 215

ctt tet aca gat cac att ccg att ctg tac aga aca ggc aaa gac aag 845

Leu ser Thr Asp His lie Pro Ile Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Asp Lys220 225 230

aaa gga age tgc ggt ctt tcc cgt gtg gac age acg aca tgc ctg ttc 893

Lys Gly Ser Cys Gly Leu Ser Arg vai Asp ser Thr Thr Cys Leu Phe235 240 245

cct gtt gag gaa aag gca gtt gaa tat tac ttt gct tet gat gca agt 941

Pro Val Glu Glu Lys Ala Val Glu Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala ser250 255 260

gcc gtg ata gag cac acc aat cgt gtc ate ttt ctg gaa gat gat gat 989

Ala Val Ile Glu His Thr Asn Arg Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp265 270 275 280

gtt gca gca gtg gtg gat ggc cgt ctc tet ate cac cga att aaa cga 1037Val Ala Ala VaT Val Asp Gly Arg Leu Ser Ile His Arg Ile Lys Arg285 290 295

act gca gga gac cat cct ggc cga gct gtg caa act ctc cag atg gag 1085Thr Ala Gly Asp His Pro Gly Arg Ala Val Gln Thr Leu Gln Met Glu300 305 310

ctc cag cag ate atg aag ggc aac ttt agt tca ttt atg cag aag gaa 1133Leu Gln Gln Ile Met Lys GTy Asn Phe Ser ser Phe Met Gln Lys Glu315 320 325

att ttt gag cag cca gaa tet gtt gtg aac aca atg aga gga aga gtc 1181Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser vai VaT Asn Thr Met Arg GTy Arg Val330 335 340

aat ttt gat gac tac act gtg aat ttg gga ggt ttg aaa gat cac att 1229Asn Phe Asp Asp Tyr Thr VaT Asn Leu GTy GTy Leu Lys Asp His Ile345 350 355 360

aag gag ate cag cgg tgt cgg cgg ttg att ctt att gct tgt ggc aca 1277Lys Glu Ile Gln Arg Cys Arg Arg Leu lie Leu Ile Ala Cys GTy Thr365 370 375

agt tac cac gct ggt gtg gca acc cgt cag gtc ctg gag gag ctg acc 1325ser Tyr His Ala GTy VaT Ala Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr380 385 390

gag ctg ccc gtg atg gtg gag ctt gcc agt gac ttc ttg gat aga aac 1373Glu Leu Pro VaT Met vaT Glu Leu Ala ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn395 400 405

act cca gtc ttt cga gat gat gtt tgc ttt ttc att agt caa tca ggc 1421Thr Pro Val Phe Arg Asp Asp vai Cys Phe Phe Ile Ser Gln ser GTy410 415 420

gag aca gct gac acc ctg atg gga ctt cgt tac tgt aag gag aga gga 1469Glu Thr Ala Asp Thr Leu Met GTy Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly425 430 435 440

gcc tta act gtg ggg ate aca aat aca gtc ggc agt tet ata tca agg 1517Ala Leu Thr vai Gly Ile Thr Asn Thr Val Gly Ser ser Ile Ser Arg

445 450 455

gag aca gat tgc ggg gtt cat att aat gct ggt cct gag att ggc gtg

Glu Thr Asp Cys Gly vai His Ile Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val

460

465

470

gcc agt aca aag gca tac acc age cag ttt gtg tcc ctc gtg atg tttAla Ser Thr Lys Ala Tyr Thr Ser Gln Phe Val ser Leu vai Met Phe475 480 485

gct ctc atg atg tgt gat gac agg ate tcc atg caa gag aga cgc aaaAla Leu Met Met Cys Asp Asp Arg Ile Ser Met Gln Glu Arg Arg Lys490 495 500

gag ate atg ctc gga ctg aag cga ctg ccg gac ttg att aag gaa gtgGlu Ile Met Leu Gly Leu Lys Arg Leu Pro Asp Leu Ile Lys Glu vai505 510 515 520

ctg age atg gat gat gaa ate cag aag ctg gcg acg gag ctt tac cacLeu Ser Met Asp Asp Glu Ile Gln Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His525 530 535

cag aag tcg gtc ctg ata atg ggg cgg ggc tac cat tat gct aca tgcGln Lys Ser vai Leu Ile Met Gly Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys

540

545

550

ctt gaa ggg gct ctg aaa ate aag gag att act tat atg cat tcg gaaLeu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys Glu Ile Thr Tyr Met His ser Glu555 560 565

ggc ate ctt gct ggt gag ctc aag cac ggc cct ctg gcc ttg gtg gacGly Ile Leu Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu VaT Asp570 575 580

aag ttg atg cct gtc ate atg ate ate atg cga gac cac act tat gcc

Lys Leu Met Pro Val Ile Met Ile Ile Met Arg Asp His Thr Tyr Ala

585 590 595 600

aag tgc cag aac gct ctt cag cag gtg gtt gca cgg cag ggg cgt cca

Lys Cys Gln Asn Ala Leu Gln Gln Val vai Ala Arg Gln Gly Arg Pro

605 610 615

gtc gtg ate tgt gat aag gag gat act gag acc att aag aat aca aaa

vai vai Ile Cys Asp Lys Glu Asp Thr Glu Thr Ile Lys Asn Thr Lys

620

625

630

agg aca ate aag gtg ccc cac tca gtg gac tgc ttg cag ggc att ctcArg Thr Ile Lys vai Pro His Ser Val Asp Cys Leu Gln-G-Ty Ile Leu635 640 645

agt gtg att ccc ctg cag ctg ctg gct ttc cac ctg gct gtg ctg agaSer vaT Πe Pro Leu Gln Leu Leu Ala Phe His Leu Ala VaT Leu Arg650 655 660

ggc tac gat gtt gat ttt cca cgg aat ctt gcc aaa tet gta aca gtaGly Tyr Asp vai Asp Phe Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val665 670 675 680

gag taacagacac ctgaaactta agacagttaa gcaacacgag ataccttttgGlu

1565

1613

1661

1709

1757

1805

1853

1901

1949

1997

2045

2093

2141

2189

2242

tatttaaatt tttgatttaa actatcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa

2298

<210> 5<211> 681<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg15 10 15

Arq Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr20 25 30

Arq Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val Gly Leu Asp Gly Gly Asn Asp Lys35 40 45

Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly50 55 60

Lys Val Lys Ala Leu Asp Glu Glu Val His Lys Gln Gln Asp Met Asp65 70 75 80

Leu Asp Ile Glu Phe Asp Val His Leu Gly Ile Ala His Thr Arg Trp85 90 95

Ala Thr His Gly Glu Pro Asn Pro Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser100 105 110

Asp Lys Asn Asn Glu Phe Ile Val Ile His Asn Gly Ile Ile Thr Asn115 120 125

Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu130 135 140

Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr145 150. . 155 160

Asp Asn Trp Glu Ser Gln Asp Val Ser Phe Thr Thr Leu Val Glu Arg165 170 175

Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val180 185 190

His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu195 200 205

Ile Gly Val Arq Ser Glu His Lys Leu Ser Thr Asp His Ile Pro Ile210 215 220

Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Asp Lys Lys Gly Ser Cys Gly Leu Ser Arg225 230 235 240

Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe Pro Val Glu Glu Lys Ala Val Glu245 250 255Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Ala Val Ile Glu His Thr Asn Arg260 265 270

vai Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp Val Ala Ala vai Val Asp Gly Arg275 280 285

Leu Ser Ile His Arg Ile Lys Arg Thr Ala Gly Asp His Pro Gly Arg290 295 300

Ala Val Gln Thr Leu Gln Met Glu Leu Gln Gln Ile Met Lys Gly Asn305 - 310 315 320

Phe Ser Ser Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser vai325 330 335

Val Asn Thr Met Arg Gly Arg vai Asn Phe Asp Asp Tyr Thr Val Asn340 345 350

Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Ile Lys Glu Ile Gln Arg Cys Arg Arg355 360 365

Leu Ile Leu Ile Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Gly Val Ala Thr370 375 380

Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met vai Glu Leu385 390 395 400

Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro vai Phe Arg Asp Asp Val405 410 415

Cys Phe Phe Ile Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu Met Gly420 425 430

Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile Thr Asn435 440 445

Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg Glu Thr Asp Cys Gly vai His Ile450 455 460

Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly vai Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr Ser465 470 475 480

Gln Phe vai ser Leu vai Met Phe Ala Leu Met Met Cys Asp Asp Arg485 490 495

Ile Ser Met Gln Glu Arg Arg Lys Glu Ile Met Leu Gly Leu Lys Arg500 505 510

Leu Pro Asp Leu Ile Lys Glu Val Leu ser Met Asp Asp Glu Ile Gln515 520 525Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His Gln Lys Ser vai Leu He Met Gly530 535 540

Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys545 550 555 560

Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu Gly Ile Leu Ala Gly Glu Leu Lys565 570 575

His Gly Pro Leu Ala Leu vai Asp Lys Leu Met Pro vai Ile Met lie580 585 590

Ile Met Arq Asp His Thr Tyr Ala Lys Cys Gln Asn Ala Leu Gln Gln595 600 605

vai vai Ala Arg Gln Gly Arg Pro vai vai Ile Cys Asp Lys Glu Asp610 615 620

Thr Glu Thr Ile Lys Asn Thr Lys Arg Thr Ile Lys Val Pro His Ser625 630 635 640

Val Asp Cys Leu Gln Gly lie Leu Ser vai lie Pro Leu Gln Leu Leu645 650 655

Ala Phe His Leu Ala Val Leu Arg Gly Tyr Asp Val Asp Phe Pro Arg660 665 670

Asn Leu Ala Lys Ser vai Thr Val Glu675 680

<210> 6

<211> 2049

<212> DNA

<213> Mus museu!us

<220>

<221> CDS<222> (1)..(2046)

<300>

<308> BC031928.1

<309> 2003-10-07

<313> (51)..(299)

<400> 6

atg tgc gga ate ttt gcc tac atg aat tac aga gtt ccc aag aca aggMet Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Met Asn Tyr Arg Val Pro Lys Thr Arg1 5 10 15

aaa gag att ttc gaa acc ctt ate agg gqt ctg cag cgg ctg gag tacLys Glu Ile Phe Glu Thr Leu Ile Arg Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr20 25 30

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192

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<223> Seqüência sintética codificando uma proteína de Escberichiaxoli apresentandoatividade de um GTFA

<400> 10

atgtgcggaa ttgttggtgc tatcgcccaa agagacgttg ctgagatttt gttagagggt 60ctgcgaaggc tagagtatag aggatatgac tccgctggtc tggctgtcgt tgatgctgag 120ggtcatatga caaggctaag aaggttagga aaggttcaga tgcttgctca ggcagctgag 180gaacatccat tgcatggagg tactggtatt gcacatacca ggtgggctac tcatggggag 240ccatcagaag ttaatgctca tccacatgtg agtgagcata tcgttgtagt tcacaatggg 300ataattgaaa accacgaacc attgagggaa gagttaaagg caagaggata tacttttgtg 360agtgagactg acactgaggt tattgcacat ttagtgaact gggaactcaa acaggggggc 420acattgcgtg aggctgtgtt aagagctatt cctcaactta gaggtgcata cggtactgtt 480attatggatt caagacaccc agatactctc cttgcagcta gatcaggtag tcccttggtc 540ataggacttg gaatgggtga aaattttatc gctagcgacc aattggcctt attgccagtt 600acaagacgat ttattttcct tgaagagggc gatattgctg agattactag aaggtctgtg 660aacatctttg ataagactgg cgctgaggtt aaacgtcagg atatcgagtc taaccttcaa 720tacgatgctg gtgataaagg aatttacagg cattatatgc aaaaggaaat ttatgaacaa 780ccaaatgcta tcaaaaacac acttactggc cgtatttctc atggacaggt cgatttaagc 840gagcttggtc ctaatgcaga cgaactgcta tcaaaagttg agcacataca gatactggca 900tgcggaacta gttataattc aggaatggtc tctagatact ggttcgaaag cttggcaggt 960ataccttgtg atgtagagat cgcttctgag tttaggtata gaaagtctgc tgtgcgtaga 1020aattcattaa tgattacatt atctcaatcc ggagaaacag cagatacact ggctggattg 1080aggctttcta aggaactcgg atatctgggt tcacttgcta tttgtaatgt accaggttcc 1140tcattggttc gtgaatcaga tctagcactt atgacaaatg caggaactga aataggtgtg 1200gcaagtacca aggctttcac aacccaactg accgtacttt taatgttggt agcaaaactc 1260agtcgattaa aggggctaga tgcatctatc gaacatgata ttgttcacgg gcttcaagct 1320ctcccttcaa gaattgaaca aatgctttca caagataaga gaatagaggc attggctgaa 1380gatttttccg acaaacatca cgcattgttt cttggacgtg gcgatcaata tccaattgca 1440ttggaaggag ctttgaagtt gaaagaaata agttacattc acgcagaagc atatgcagct 1500ggagaactca agcatggtcc tttggcactc atcgacgctg acatgcccgt gatcgtagtg 1560gctcctaata acgaactgct cgaaaagctt aaatcaaata tcgaagaggt tcgagctaga 1620ggaggtcagc tttacgtttt cgctgaacaa gatgctggat tcgtgtcaag cgataatatg 1680catataattg aaatgcctca cgttgaagaa gtgattgcac ctatatttta tacagtccca 1740ttgcaacttc tagcttacca tgttgcactt attaaaggaa ctgatgttga tcagcctaga 1800aacctagcaa aatctgtaac agtcgaataa 1830<210> 11<211> 48<212> DNA<213>Artificial

<220><223> Oligonucleotídeo sintético<400> 11

tcgacaggcc tggatcctta attaaactag tctcgaggag ctcggtac

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> synthetic oligonucleotide

<400> 12

cgagctcctc gagactagtt taattaagga tccaggcctg

<210> 13

<211> 38

<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotídeo sintético usado como iniciador<400> 13

aaaaactagt tctacatcgg cttaggtgta gcaacacg

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide used as primer

<400> 14

aaaagatatc tgttgttgga ttctactact atgcttcaa

<210><211><212><213>

Claims (13)

1.- Célula de planta geneticamente modificada que tem uma mo-lécula de ácido nucléico codificando uma hialuronan sintase estavelmenteintegrada ao seu genoma, onde a dita célula de planta tem adicionalmenteuma atividade aumentada de uma proteína tendo a atividade de uma gluta-mina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) comparado com as célulasde planta do tipo selvagem não-geneticamente modificadas.

2.- Célula de planta geneticamente modificada de acordo com areivindicação 1, em que a atividade aumentada de uma proteína tendo a ati-vidade de uma glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) é cau-sada por introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha na célulade planta.

3.- Célula de planta geneticamente modificada de acordo com areivindicação 2, em que a molécula de ácido nucléico estranha codifica umaproteína tendo a atividade enzimática de uma glutamina:frutose 6-fosfatoamidotransferase (GFAT).

4.- Célula de planta geneticamente modificada de acordo comqualquer reivindicação 1, 2 ou 3 que sintetiza uma quantidade aumentada dehialuronan comparado com células de planta tendo a atividade de uma hialu-ronan sintase e nenhuma atividade aumentada de glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT).

5.- Planta compreendendo células de planta geneticamente mo-dificadas como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6.- Material de propagação de plantas de acordo com a reivindi-cação 5, compreendendo células de planta geneticamente modificadas comodefinidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

7.- Partes de planta que podem ser colhidas de acordo com areivindicação 5, compreendendo células de planta geneticamente modifica-das como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

8.- Processo para produção de uma planta que sintetiza hialuro-nan, o qual compreende:a) modificar geneticamente uma célula de planta, onde a modifi-cação genética compreende etapas i a ii abaixoi) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha codifi-cando uma hialuronan sintase na célula de plantaii) introdução de uma modificação genética na célula de planta,a modificação genética resultando em um aumento da atividade de uma pro-teína tendo a atividade enzimática de uma glutamina:frutose 6-fosfato amido-transferase (GFAT) comparado com células de planta do tipo selvagem não-geneticamente modificadasonde as etapas i a ii podem ser realizadas em qualquer ordem,individualmente, ou quaisquer combinações de etapas i a ii podem ser reali-zadas simultaneamenteb) regeneração de uma planta a partir de células de planta daetapa a);c) geração, se apropriado, de plantas adicionais usando as plan-tas de acordo com a etapa b),onde, se apropriado, as células de planta são isoladas de plan-tas de acordo com a etapa b) i ou b) ii e as etapas de processo a) a c) sãorepetidas até que uma planta seja gerada a qual tem uma molécula de ácidonucléico estranha codificando uma hialuronan sintase e tem uma atividadeaumentada de uma proteína tendo a atividade enzimática de uma GFATcomparado com as células de planta do tipo selvagem não-geneticamentemodificadas correspondentes.

9.- Processo para preparação de hialuronan, o qual compreendea etapa de extração de hialuronan de células de planta geneticamente modi-ficadas como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, de plan-tas como definidas na reivindicação 5, de material de propagação como de-finido na reivindicação 6, de partes de planta que podem ser colhidas decomo definido na reivindicação 7 ou de plantas que podem ser obtidas atra-vés de um processo como definidas na reivindicação 8.

10.- Uso de uma célula de planta geneticamente modificada co-mo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, uma planta comodefinida na reivindicação 5, material de propagação de como definido na rei-vindicação 6, partes de planta que podem ser colhidas como definidas nareivindicação 7 ou plantas que podem ser obtidas através de um processocomo definido na reivindicação 8 para preparação de hialuronan.

11. - Composição compreendendo células de planta genetica-mente modificadas como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

12. - Processo para preparação de uma composição compreen-dendo hialuronan onde as células de planta geneticamente modificadas co-mo definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, plantas como defi-nida na reivindicação 5, material de propagação como definido na reivindica-ção 6, partes de planta que podem ser colhidas como definidas na reivindi-cação 7 ou plantas que podem ser obtidas através de um processo comodefinido na reivindicação 8 são usadas.

13.- Uso de células de planta geneticamente modificadas comodefinidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, de plantas como defini-das na reivindicação 5, de material de propagação como definido na reivindi-cação 6, de partes de planta colhidas como definidas na reivindicação 7 oude plantas que podem ser obtidas através de um processo como definido nareivindicação 8 para preparação de uma composição como definida na rei-vindicação 11.