BRPI0616961A2 - plantas tendo um teor aumentado de aminoaçúcares - Google Patents

Abstract

PLANTAS TENDO UM TEOR AUMENTADO DE AMINOAçúCARES. A presente invenção refere-se à células de planta e plantas tendo um teor aumentado de derivados de glicosamina N-acetilada. Além disso, a presente invenção refere-se à células de planta e plantas as quais sintetizam glicosaminoglicanas. A presente invenção também proporciona processos para produção das referidas plantas e composições compreendendo as referidas células de planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLANTASTENDO UM TEOR AUMENTADO DE AMINOAÇÚCARES".

A presente invenção refere-se a células de planta e plantas ten-do um teor aumentado de derivados de glicosamina N-acetilados. Além dis-so, a presente invenção refere-se a células de planta e plantas que sinteti-zam glicosaminoglicanas. A presente invenção também refere-se a proces-sos para a produção das referidas plantas e composições compreendendoas referidas plantas.

O aminoaçúcar glicosamina, derivados de glicosamina e políme-ros compreendendo derivados de glicosamina são usados, inter alia, comosuplementos alimentícios para a profilaxia de distúrbios da articulação emanimais e no homem. No campo médico, também, alguns polímeros conten-do derivado de glicosamina são usados para o tratamento de distúrbios.

O WO 06 032538 descreve plantas transgênicas as quais foramtransformadas com moléculas de ácido nucléico que codificam sintases dehialuronana. A síntese de hialuronana nas plantas em questão pode ser de-monstrada inequivocamente.

O WO 98 35047 (US 6.444.878) descreve uma via metabólicapara a síntese de GIcNAc em células de planta onde glicosamina é converti-da através de uma série de etapas de reação enzimaticamente catalisadassucessivas com formação de metabólito GIcNAc, N-acetilglicosamina 6-fosfato, N-àcetilglicosamina 1-fosfato em UDP-GIcNAc. Uma via metabólicaa qual foi descrita como uma alternativa para plantas compreende a conver-são de 6-fosfato de frutose e glutamina em 6-fosfato de glicosamina a qual é,então, convertida através de uma série de etapas de reação enzimaticamen-te catalisada sucessiva com formação dos metabólitos 1 -fosfato de glicosa-mina e 1-fosfato de N-acetilglicosamina em UDP-GIcNAc. A conversão de 6-fosfato de frutose e glutamina em 6-fosfato de glicosamina é catalisada poruma proteína tendo a atividade de uma glutamina:amidotransferase de 6-fosfato de frutose (GFAT) (Mayer e outros, 1968, Plant Physiol. 43, 1097-1107). Concentrações relativamente altas de 6-fosfato de glicosamina sãotóxicas para células de planta (WO 98 35047).O WO 00 11192 descreve a superexpressão endosperma-específica de uma molécula de ácido nucléico de milho que codifica umaproteína tendo a atividade enzimática de uma GFAT de planta em plantas demilho transgênicas com o objetivo de sintetizar um amido catiônico tendomoléculas de 2-amidoanidroglicose em plantas. A via metabólica descrita aqual, de acordo com a descrição do WO 00 11192, resultaria na incorpora-ção de 2-aminoanidroglicose no amido compreende, inter alia, a incorpora-ção de UDP-glicosamina através de sintases de amido e/ou glicogênio noamido. Foi possível demonstrar quantidades aumentadas de UDP-glicosamina na farinha de endosperma das plantas de milho transgênicasem questão superexpressando uma molécula de ácido nucléico que codificauma proteína tendo a atividade enzimática de uma GFAT de planta traducio-nalmente fundida com um peptídeo sinalizador de plastídeo. Quando a pro-teína tendo a· atividade enzimática de GFAT foi expressa sem um peptídeosinalizador, foi possível demonstrar uma quantidade aumentada de 1 -fosfatode glicosamina na farinha correspondente de tecido de endosperma de mi-lho. Não foi possível detectar amido catiônico ou quantidades aumentadasde derivados de glicosamina N-acetilada tais como, por exemplo, UDP-GIcNAc ou 6-fosfato de N-acetilglicosamina, nas plantas transgênicas.

O aminoaçúcar beta-D-glicosamina (glicosamina) e/ou derivadosde glicosamina são componentes de vários polímeros (glicosaminoglicanas)os quais, inter alia, são componentes essenciais do exoesqueleto de artró-podes, da matriz extracelular de mamíferos ou dos exopolissacarídeos dealguns microorganismos bacterianos.

Assim, por exemplo, N-acetil-D-glicos-2-amina (N-acetilglicosamina, GIcNAc) é um derivado de glicosamina acetilado no átomode nitrogênio. GIcNAc é, por exemplo, um bloco de construção molecular dehialuronana (beta-1,4-[ácido beta glucurônico-1,3-GlcNAc]n), o qual é umcomponente essencial do fluido sinovial.

No campo médico, produtos contendo hialuronana são atual-mente usados para o tratamento intra-articular de artrose e como produtosoftálmicos usados para cirurgia nos olhos. Hialuronana cruzado-ligado deri-vatizado é usado para tratamento de distúrbios da articülação (Fong Chonge outros, 2005, Appl Microbiol Biotechnol 66, 341-351). Além disso, hialuro-nana é um componente de alguns rinológicos os quais, por exemplo, na for-ma de gotas oculares e nasais, servem para umedecer as membranas mu-cosas secas. Soluções contendo hialuronana para injeção são usadas comoanalgésicos e anti-reumáticos. Emplastros compreendendo hialuronana ouhialuronana derivatizada são empregados em cicatrização de ferimentos.

Como produtos dermatológicos, implantes de gel contendo hialuronana sãousados para corrigir deformações da pele em cirurgia plástica. Em cirurgiacosmética, preparados de hialuronana estão dentre os materiais para preen-chimento cutâneo adequados. Através de injeção de hialuronana, duranteum período de tempo limitado, é possível suavizar rugas ou aumentar o vo-lume dos lábios.

Em produtos cosméticos, em particular em cremes e loções paraa pele, hialuronana é freqüentemente usada como um umidificante em virtu-de de sua alta capacidade de ligação à água. Além disso, preparados con-tendo hialuronana são vendidos como os assim denominados neutracêuticos(suplementos alimentícios) os quais também podem ser usados em animais(por exemplo, cães, cavalos) para a profilaxia e alívio de artrose.

A catálise da síntese de hialuronana é detectada através de umaúnica enzima membrana-integrada ou membrana-associada, isto é, sintasede hialuronana (DeAngelis, 1999, CMLS, Cellular and Molecular Life Scien-ces 56, 670-682). A sintase de hialuronana catalisa a síntese de hialuronanade substratos UDP-ácido glucurônico (UDP-GIcA) e UDP-N-acetilglicosamina (UDP-GIcNAc).

Hialuronana usada para fins comerciais é atualmente isolada detecidos animais (coelhos) ou preparado fermentativamente usando culturasbacterianas.

Proteoglicanas, uma classe de glicoproteínas, são, inter alia, umcomponente essencial da cartilagem e têm, presas a uma proteína central,glicosaminoglicanas compostas de unidades de dissacarídeo repetidas. Asunidades de dissacarídeo repetidas, por sua vez, são covalentemente pre-sas a uma proteína central via uma seqüência de ligação de carboidrato ca-racterística. Dependendo da composição das unidades de dissacarídeo, umadistinção é feita, inter alia, das glicosaminoglicanas heparana/sulfato de he-parina, sulfato de queratana e condroitina/sulfato de dermatana, cujas uni-dades de dissacarídeo contêm, cada uma, uma molécula a qual é glicosami-na ou um derivado de glicosamina. Nessas substâncias, grupos sulfato sãointroduzidos em vários átomos ou substituintes das unidades de dissacarí-deo, de modo que as respectivas substâncias mencionadas não são políme-ros uniformes, mas grupos poliméricos resumidos sob o respectivo termogeral. Aqui, as moléculas individuais dos grupos poliméricos em questão po-dem diferir quanto ao grau de sulfatação e na posição dos monômeros con-tendo grupos sulfato.

A síntese da cadeia de dissacarídeo da condroitina/dermatana([beta-1,4]-[ácido beta glucurônico-1,4-N-acetilgalactosamina]n) é catalisadapor uma sintase de condroitina começando com UDP-GIcA e UDP-N-acetilgalactosamina, um epímero de UDP-GIcNAc (Kitagawa e outros, 2001,J Biol Chem 276(42), 38721-38726). As moléculas de ácido glucurônico decondroitina podem ser convertidas por uma epimerase em ácido idurônico.Se mais de 10% das moléculas de ácido glucurônico estão presentes comoácido idurônico, o polímero é referido como dermatana. A introdução dosgrupos sulfato em várias posições da cadeia de dissacarídeo da condroitinaou a dermatana é, então, catalisada por outras enzimas, resultando em con-droitina/sulfato de dermatana. Aqui, o grau de sulfatação pode diferir de mo-lécula para molécula.

Durante algum tempo, sulfato de condroitina foi considerado co-mo um composto ativo potencial para tratamento de osteoartrite (Clegg eoutros, 2006, The New England Journal of Medicine 354(8), 795-808).

A síntese da cadeia de dissacarídeo de heparina/heparana (he-parosana) ([alfa-1,4]-[ácido beta glucurônico-1,4-glicosamina]n ou [alfa-1,4]-[ácido alfa idurônico-1,4- glicosamina]n) é catalisada por uma sintase de he-parina/heparosana a partir de UDP-GIcA e UDP-GIcNAc (DeAngeIis e White,2004, J. Bacteriology 186(24), 8529-8532). As moléculas de ácido glucurôni-co da heparina/heparosana podem ser convertidas através de uma epimera-se em ácido idurônico. A introdução dos grupos sulfato em várias posiçõesda cadeia de dissacarídeo da heparosana é, então, catalisada por outrasenzimas, dando origem ao sulfato de heparina ou sulfato de heparana. Sulfa-to de heparina tem uma substituição consideravelmente alta por grupos sul-fatos do que o sulfato de heparana. Sulfato de heparina tem cerca de 90%de moléculas de ácido idurônico, enquanto que no caso de sulfato de hepa-rana, a fração de moléculas de ácido glucurônico predomina (Gallagher eoutros, 1992, Int. J. Biochem 24, 553-560). Conforme no caso de condroiti-na/sulfato de dermatana, no caso de heparina/sulfato de heparina, também,o grau de sulfatação pode diferir de molécula para molécula.

Sulfato de heparina é usado, inter alia, como um anticoagulante,por exemplo, para a profilaxia e tratamento de tromboses.

Condroitina/sulfato de dermatana e heparina/sulfato de heparinasão atualmente produzidos através de isolamento de tecidos de animal. Sul-fato de condroitina é principalmente isolado de cartilagem bovina ou de tuba-rão e heparina/sulfato de heparana de intestino de porco ou pulmões bovi-nos. Uma vez que as cadeias de dissacarídeo de condroitina/sulfato de der-matana ou heparina/sulfato de heparana não têm um padrão de sulfataçãouniforme, é difícil obter um produto específico uniforme. Conseqüentemente,os produtos são sempre misturas de moléculas com graus variados de sulfa-tação.

A glicosaminoglicana quitina ([beta-1,4-GlcNAc]n) é um dos prin-cipais componentes da parede celular de fungos e do exoesqueleto de inse-tos, milípedes, aracnídeos e crustáceos e é um polímero o qual é insolúvelem água. A enzima sintase de quitina catalisa a síntese de quitina através deligação a UDP-GIcNAc (Merzendorfer e Zimoch, 2003, J. Experimental Bio-Iogy 206, 4393-4412).

Como uma fonte de matéria-prima para isolamento de quitina,uso é feito, no momento, de crustáceos (camarões, caranguejos) e fungostais como, por exemplo, Aspergillus spec., Penicillium spec. Mucor spec. OWO 03 031435 descreve, por exemplo, um método para preparo de GIcNAcatravés de fermentação de levedos. Dependendo do método pelo qual a qui-tina é isolada da fonte de matéria-prima em questão, a quitina contém, alémde GIcNAc, também sua forma desacetilada, glicosamina, como um bloco deconstrução. Se mais de 50% dos blocos dé construção são GIcNAc, o polí-mero é referido como quitina, enquanto que polímeros compreendendo maisde 50% da glicosamina são referidos como quitosana.

Atualmente, a glicosamina ou derivados da mesma tal como, porexemplo, GIcNAc, são produzidos através de degradação de quitina. Quitinapode ser desacetilada primeiro, resultando na formação de quitosana ou serdegradada diretamente, resultando na formação de GIcNAc.

Quitina pode ser desacetilada enzimaticamente com o auxílio dedesacetilases de quitina (Kafetzopoulos e outros, 1993, Pro. Natl. Acad. Sei.90, 2564-2568) ou através de desacetilação química.

A·degradação de quitina ou quitosana pode também ocorrer en-Zimaticamente (por exemplo, usando quitinases, glucanases, beta-N-acetilglicosaminidases) e através de hidrólise química.

A degradação de quitosana ou a desacetilação de GIcNAc resul-ta na formação de glicosamina.

Uma desvantagem substancial de todos os métodos para prepa-ro de aminoaçúcares através de degradação de quitina consiste no fato deque, considerando-se a hidrólise incompleta e/ou desacetilação incompleta,o que é obtido não é um produto uniforme, mas uma mistura de vários monoe oligômeros.

Um processo alternativo para preparo de glicosamina com o au-xílio de microorganismos recombinantes, em particular Escherichia coli, oqual não requer a degradação de quitina, é descrito na US 2002/0160459.

Durante algum tempo, glicosamina e substâncias contendo gli-cosamina, também, foram consideradas como compostos ativos potenciaispara o tratamento de osteoartrite (Clegg e outros, 2006, The New EnglandJournal of Medicine 354(8), 795-808). Glicosamina ou substâncias contendoglicosamina também estão presentes em muitos suplementos alimentícios.

Alimentos enriquecidos com GIcNAc são descritos, por exemplo, na US2006/0003965.

Conforme já descrito, glicosaminoglicanas tais como, por exem-plo, sulfato de condroitina, heparina/sulfato de heparana ou quitina são, atu-almente, isolados de tecidos animais. Além das substâncias desejadas emcada caso, esses tecidos também contêm outras glicosaminoglicanas. A se-paração das glicosaminoglicanas individuais, se uma separação completa épossível em geral, é difícil e complicada. Além disso, a presença potencial,em tecidos animais, de microorganismos patogênicos e/ou de outras subs-tâncias tais como, por exemplo, o patógeno BSE ou o patógeno da gripe a-viaria, os quais podem causar doenças no homem, representam um proble-ma quando de uso de glicosaminoglicanas isoladas de tecido animal. O usode preparados medicinais contaminados com proteínas animais pode, nopaciente, resultar em reações imunológicas indesejadas do corpo (para pre-parados de hialuronana vide, por exemplo, US 4.141.973), em particular se opaciente é alérgico a proteínas animais.

Um outro problema durante o isolamento de glicosaminoglicanasde tecidos animais consiste no fato de que o peso molecular das glicosami-noglicanas é, freqüentemente, reduzido durante purificação, uma vez quetecidos animais também contêm enzimas as quais degradam a glicosamino-glicana.

Glicosamina ou derivados da mesma isolados de crustáceos fre-qüentemente contêm substâncias (proteínas) as quais podem disparar umareação alérgica no homem. Glicosamina ou derivados obtidos de fungos po-dem conter micotoxinas.

As quantidades (rendimentos) de glicosaminoglicanas as quaispodem ser obtidas em qualidade e pureza satisfatórias de tecidos animaissão baixas (por exemplo, hialuronana de coelhos: 0,079% peso/peso, EP0144019, US 4.782.046), o que significa que as grandes quantidades de te-cidos animais têm de ser processadas.

A produção de glicosaminoglicanas com o auxílio de fermenta-ção de bactérias está associada a altos custos, uma vez que bactérias têmde ser fermentadas em recipientes estéreis vedados sob condições de cultu-ra controladas complicadas (para hialuronana vide, por exemplo, US4.897.349). Além disso, a quantidade de glicosaminoglicanas a qual podeser produzida através de fermentação de cepas bacterianas é limitada pelasunidades de produção existentes. Aqui, também deve ser levado em conta que, a despeito das limitações físicas, não é possível construir fermentado-res para volumes de cultura relativamente grandes. Nesse contexto, mençãopode ser feita, em particular, à mistura homogênea, requerida para produçãoeficiente, de substâncias alimentadas (por exemplo, fontes de nutrientes es-senciais para bactérias, reagentes para regulação do pH, oxigênio) com omeio de cultura a qual, se houver, pode ser assegurada em grandes fermen-tadores apenas com alto gasto técnico.

Além disso, substâncias preparadas a partir de matérias-primasanimais são inaceitáveis para determinadas formas de vida tais como, porexemplo, vegetarianos e para o preparo de alimentos judaicos.

Plantas não produzem naturalmente glicosaminoglicanas taiscomo, por exemplo, hialuronana, quitina, heparana/sulfato de heparana, sul-fato de queratana ou condroitinâ/sulfato de dermatana.

Para a síntese de glicosaminoglicanas, é necessário, inter alia,que quantidades suficientes de derivados de glicosamina acetilada (em par-ticular UDP-GIcNAc) e/ou UDP-GIcA estejam disponíveis como substratopara as respectivas enzimas envolvidas na síntese. Não há informação comrelação às quantidades de glicosaminas N-acetiladas presentes em célulasde planta. O WO 2005 035710 descreve um processo o qual permite que oteor de glicosamina de um material vegetal seja aumentado através de se- cagem. O maior o teor de glicosamina em material vegetal úmido fresco foideterminado para chicória com 10 mg de glicosamina por 1 kg em peso fres-co o qual, em um peso molecular de 178 para glicosamina, corresponde acerca de 56 nmoles de glicosamina por 1 grama em peso fresco de materialvegetal. O WO 2005 035710 não contém informação referente ao teor dederivados de glicosamina N-acetilada em plantas.

Além disso, a partir da técnica anterior descrita acima, é eviden-te que as vias do metabolismo de glicosamina em plantas ainda não foramtotalmente elucidadas. No WO OO 11192, foi possível gerar plantas atravésde transformação com uma molécula de ácido nucléico que codifica umaproteína tendo a atividade de uma GFAT de planta, plantas as quais tinhamum teor elevado de derivados de glicosamina (UDP-glicosamina ou 1-fosfatode glicosamina); contudo, quantidades aumentadas de derivados de glico-samina N-acetilada não foram encontradas.

Conseqüentemente, é um objetivo da presente invenção propor-cionar fontes alternativas de derivados de glicosamina N-acetilada e proces-sos para preparo das referidas fontes alternativas para derivados de glico-samina N-acetilada.

Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a célulasde planta e plantas tendo um teor de derivados de glicosamina N-acetiladade pelo menos 2,50 μιτιοίβε por grama em peso fresco, de preferência depelo menos 5,00 μιτιοίβε por grama em peso fresco, particularmente de pre-ferência de pelo menos 10,00 μηιοΐββ por grama em peso fresco, muito par-ticularmente de preferência de pelo menos 15,00 μηιοΐββ por grama em pesofresco, especialmente de preferência de pelo menos 20,00 μηιοΐββ por gra-ma em peso fresco.

De preferência, células de planta de acordo com a invenção ouplantas de acordo com a invenção têm um teor de derivados de glicosaminaN-acetilada de no máximo 250 μηιοίβε por grama em peso fresco, de prefe-rência de no máximo 200 μηιοΐββ por grama em peso fresco, particularmentede preferência de no máximo 150 μητιοίβε por grama em peso fresco, muitoparticularmente de preferência de no máximo 100 μιηοίβε por grama em pe-so fresco, especialmente de preferência de no máximo 50 μιηοΐββ por gramaem peso fresco.

Comparado com a técnica anterior, células de planta de acordocom a invenção ou plantas de acordo com a invenção oferecem a vantagemde que elas contêm maiores quantidades de derivados de glicosamina N-acetilada. Comparado com a produção de derivados de glicosamina N-acetilada através de fermentação de microorganismos ou o isolamento deglicosaminas N-acetiladas de fontes de matéria-prima animal ou fungos, cé-lulas de planta de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a inven-ção da presente invenção oferecem a vantagem de que células de planta deacordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção podem ser pro-pagadas infinitamente de uma maneira vegetativa ou sexual e que elas pro-duzem continuamente derivados de glicosamina N-acetilados. Além disso,comparado com plantas conhecidas, as plantas de acordo com a invençãooferecem a vantagem de que elas são melhor adequadas para o preparo deglicosaminoglicanas tais como, por exemplo, condroitina, hialuronana, quiti-na, heparosana, uma vez que elas contêm uma maior quantidade de subs-tratos para as enzimas envolvidas na catálise das glicosaminoglicanas men-cionadas (sintases de glicosaminoglicana).

Derivados de glicosamina N-acetilada podem ser detectadosusando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica (Morgan eElson (1934, Biochem J. 28(3), 988-995). No contexto da presente invenção,para determinação do teor de derivados de glicosamina N-acetilada, uso éfeito, de preferência, do método descrito sob Métodos Gerais, Item 4.

No contexto da presente invenção, o termo "derivados de glico-samina N-acetilada" deve ser compreendido como significando todos os de-rivados de glicosamina (2-amino-2-deóxiglicose), os quais também incluemepímeros tais como, por exemplo, galactosamina (2-amino-2-deóxigalactose)ou manosamina (2-amino-2-deóximanose), os quais são medidos usando ométodo descrito sob Métodos Gerais, Item 4. Os derivados de glicosaminaN-acetilada são, de preferência, fosfato de N-acetilglicosamina (1-fosfato deN-acetilglicosamina e/ou 6-fosfato de N-acetilglicosamina),N-acetilglicosamina e/ou UDP-N-acetilglicosamina.

De preferência, células de planta de acordo com a invenção ouplantas de acordo com a invenção têm um teor aumentado de fosfato de gli-cosamina (1-fosfato de glicosamina e/ou 6-fosfato de glicosamina), além deum teor aumentado de derivados de glicosamina N-acetilada.

Células de planta de acordo com a invenção ou plantas de acor-do com a invenção podem ser preparadas, por exemplo, através de introdu-ção de moléculas de ácido nucléico estranhas para uma proteína tendo aatividade de glutamina:amidotransferase de 6-fosfato de frutose (GFAT) deisoforma Il (GFAT-2) ou codifica uma proteína tendo a atividade de umaGFAT bacteriana.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, as célulasde planta de acordo com a invenção ou as plantas de acordo com a inven-ção são, assim, células de planta genéticamente modificadas e plantas ge-néticamente modificadas, respectivamente.

Surpreendentemente, descobriu-se que células de planta ouplantas contendo uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteínatendo a atividade de uma GFAT-2 ou uma proteína tendo a atividade de umaGFAT bacteriana contêm consideravelmente mais derivados de glicosaminaN-acetilada do que células de planta ou plantas contendo uma molécula deácido nucléico que codifica uma proteína tendo a atividade de uma glutami-na:amidotransferase de 6-fosfato de frutose de isoforma I (GFAT-1). Con- forme já mencionado, não foi possível detectar quantidades aumentadas dederivados de glicosamina N-acetilada em plantas contendo uma molécula deácido nucléico que codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT deplanta (WO 00 11192).

Conseqüentemente, a presente invenção também proporciona células de planta genéticamente modificadas ou plantas genéticamente mo-dificadas contendo uma molécula de ácido nucléico estranha para uma pro-teína tendo a atividade de uma glutamina:amidotransferase de 6-fosfato defrutose (GFAT), em que a molécula de ácido nucléico estranha codifica umaproteína tendo a atividade de uma glutamina:amidotransferase de 6-fosfato de frutose de isoforma Il (GFAT-2) ou uma proteína tendo a atividade deuma glutamina:amidotransferase de 6-fosfato de frutose bacteriana (GFATbacteriana).

A modificação genética de uma célula de planta de acordo coma invenção ou uma planta de acordo com a invenção pode ser qualquer mo-dificação genética adequada para integração de uma molécula de ácido nu-cléico estranha em uma célula de planta ou planta.

De preferência, a molécula de ácido nucléico estranha é integra-da no genoma; particularmente de preferência, a molécula de ácido nucléicoestranha é estavelmente integrada no genoma de células de planta de acor-do com a invenção ou plantas de acordo com a invenção.

Um grande número de técnicas para integração (estavelmente)de moléculas de ácido nucléico em uma célula hospedeira vegetal para pro-dução de células de planta de acordo com a invenção ou plantas de acordocom a invenção está disponível. Essas técnicas incluem a transformação decélulas de planta com T-DNA usando Agrobacterium tumefaciens ou Agro-bacterium rhizogenes como meios de transformação, fusão de protoplasta,injeção, eletroporação de DNA, introdução de DNA através da'abordagembiolística e também outras opções (revisto em "Transgenic Plants", Leandroed., Humana Press 2004, ISBN 1-59259-827-7).

O uso de transformação agrobacterium-mediada de células deplanta foi submetido a estudos profundos e foi descrito exaustivamente noEP 120516 e Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System OffsetdrukkerijKanters B.V. Alblasserdam (1985), Capítulo V; Fraley e outros, Crit. Rev.Plant Sei. 4, 1-46 e em An e outros. EMBO J. 4, (1985), 277-287. Para atransformação de batatas, vide, por exemplo, Rocha-Sosa e outros, EMBOJ. 8, (1989), 29-33, para a transformação de plantas de tomate vide, por e-xemplo, US 5.565.347.

A transformação de plantas monocotiledôneas usando vetoresbaseados em transformação com Agrobacterium foi descrita também (Chane outros, Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei e outros, Plant J. 6, (1994)271-282; Deng e outros, Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink e ou-tros, Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May e outros, Bio/Technology 13,(1995), 486-492; Conner e Domisse, Int. J. Plant Sei. 153 (1992), 550-555;Ritchie e outros, Transgenic Res. 2, (1993), 252-265). Sistemas alternativospara transformação de plantas monocotiledôneas são a transformação u-sando a abordagem biolística (Wan e Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994),37-48; Vasil e outros, Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala e outros,Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer e outros, Theor. Appl. Genet.79, (1990), 625-631), a transformação de protoplasta, a eletroporação decélulas parcialmente permeabilizadas ou a introdução de DNA usando fibrasde vidro. Em particular, a transformação de milho foi descrita várias vezes naliteratura (cf., por exemplo, W095/06128, EP0513849, EP0465875,EP0292435; Fromm e outros, Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm e outros, Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel e outros, Biotechnology11 (1993), 194-200; Moroc e outros, Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726). A transformação de outras gramíneas tais como, por exemplo, switch-grass (Panicum virgatum) também foi descrita (Richards e outros, 2001,Plant Cell Reporters 20, 48-54).

A transformação com sucesso de outras espécies de cereal foi,da mesma forma, descrita, por exemplo, para cevada (Wan e Lemaux, loc.cit.; Ritala e outros, loc. cit.; Krens e outros, Nature 296, (1982), 72-74) epara trigo (Nehra e outros, Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker e outros,1994, Plant Journal 5, 299-307). Todos os métodos acima são adequados nocontexto da presente invenção.

Células de planta genéticamente modificadas e plantas genéti-camente modificadas para uma molécula de ácido nucléico estranha podemser distinguidas de células de planta do tipo silvestre e plantas do tipo silves-tre, respectivamente, não tendo a referida molécula de ácido nucléico estra-nha, inter alia, pelo fato de que elas contêm uma molécula de ácido nucléicoestranha a qual não ocorre naturalmente nas células de planta do tipo silves-tre e plantas do tipo silvestre, respectivamente. Tal integração de uma molé-cula de ácido nucléico estranha em uma célula de planta ou planta pode serdetectada usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica taiscomo, por exemplo, análise de Southern blot ou através de PCR.

No contexto da presente invenção, o termo "molécula de ácidonucléico estavelmente integrada" deve ser compreendido como significandoa integração de uma molécula de ácido nucléico no genoma de uma planta.Uma molécula de ácido nucléico estavelmente integrada é caracterizada pe-Io fato de que, durante a replicação do sítio de integração correspondente,ela é multiplicada junto com as seqüências de ácido nucléico do hospedeiroo qual margeia o sítio de integração, de modo que o sítio de integração nafita de DNA filha replicado é circundado pelas mesmas seqüências de ácidonucléico conforme a fita mãe lida, a qual serve como uma matriz para repli-cação.

A integração de uma molécula de ácido nucléico no genoma de uma planta ou uma planta pode ser demonstrada através de métodos gené-ticos e/ou métodos de biologia molecular. Uma integração estável de umamolécula de ácido nucléico no genoma de uma célula de planta ou no ge-noma de uma planta é caracterizada pelo fato de que a prole a qual herdou areferida molécula de ácido nucléico, a molécula de ácido nucléico estavel- mente integrada está presente no mesmo ambiente genômico que a geraçãoprecursora. A presença de uma integração estável de uma seqüência deácido nucléico no genoma de uma célula de planta ou no genoma de umaplanta pode ser demonstrada usando métodos conhecidos por aqueles ver-sados na técnica, inter alia, com o auxílio de análise de Southern blot ou a-nálise por RFLP (Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição)(Nam e outros, 1989, The Plant Cell 1, 699-705; Leister e Dean, 1993, ThePlant Journal 4 (4), 745-750), com métodos baseados em PCR tais como,por exemplo, a análise de diferenças no comprimento do fragmento amplifi-cado (Polimorfismo de Comprimento de Fragmento Amplificado, AFLP) (Castiglioni e outros, 1998, Genetics 149, 2039-2056; Meksem e outros,2001, Molecular Genetics and Genomics 265, 207-214; Meyer e outros,1998, Molecular and General Genetics 259, 150-160) ou usando fragmentosamplificados clivados usando endonucleases de restrição (Seqüências Poli-mórficas Amplificadas Clivadas, CAPS) (Konieczny e Ausubel, 1993, The Plant Journal 4, 403-410; Jarvis e outros, 1994, Plant Molecular Biology 24,685-687; Bachem e outros, 1996, The Plant Journal 9 (5), 745-753).

No contexto da presente invenção, o termo "genoma" deve sercompreendido como significando o material genético todo presente em umacélula de planta. É sabido por aqueles versados na técnica que, além do nú- cleo, outros compartimentos (por exemplo, plastídeos, mitocôndrias) tambémcontêm material genético.

Um outro assunto preferido da presente invenção refere-se àcélulas de planta genéticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas genéticamente modificada de acordo com a invenção expressandouma molécula de ácido nucíéico estranha que codifica uma proteína tendo aatividade de uma glutamina:amidotransferase de 6-fosfato de frutose de iso-forma II (GFAT-2) ou codifica uma proteína tendo a atividade de uma gluta-mina:amidotransferase de 6-fosfato de frutose bacteriana (GFAT bacteriana).

No contexto da presente invenção, o termo "expressar" ou "ex-pressão" deve ser compreendido como significando a presença de transcri-tos (mRNA) codificados por uma molécula de ácido nucíéico estranha e/ou apresença de proteínas tendo a atividade de uma GFAT-2 ou uma GFAT bac-teriana.

Uma expressão pode ser demonstrada, por exemplo, através dedetecção de transcritos específicos (mRNA) de moléculas de ácido nucíéicoestranhas através de análise por Northern blot ou RT-PCR.

Se células de planta ou plantas contêm proteínas tendo a ativi-dade de uma GFAT-2 ou proteínas tendo a atividade de uma GFAT-2 ouproteínas tendo a atividade de uma GFAT bacteriana pode ser determinado,por exemplo, através de métodos imunológicos, tais como análise de Wes-tern blot, ELISA (Ensaio Imuno Absorvente Enzima Ligado) ou RIA (RadioImune Ensaio). Aqueles versados na técnica estão familiarizados com méto-dos para preparo de anticorpos os quais reagem especificamente com umadeterminada proteína, isto é, os quais se ligam especificamente a uma de-terminada proteína (vide, por exemplo, Lottspeich e Zorbas (eds.), 1998, Bi-oanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4).Algumas companhias (por exemplo, Eurogentec, Bélgica) oferecem o prepa-ro de tais anticorpos como um servido por encomenda.

Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, célulasde planta de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a invençãotêm uma atividade de uma proteína tendo a atividade de uma glutami-na:amidotransferase de 6-fosfato de frutose de isoforma Il (GFAT-2) ou decodificação de uma proteína tendo a atividade de uma glutami-na:amidotransferase de 6-fosfato de frutose bacteriana (GFAT bacteriana).A atividade de proteínas tendo a atividade de uma GFAT-2 ouproteínas tendo a atividade de uma GFAT bacteriana em extratos de célulasde planta de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a invençãopode ser detectada usando métodos conhecidos por aqueles versados natécnica tais como, por exemplo, descrito em Samac e outros (2004, AppliedBiochemistry and Biotechnology 113-116, Humana Press, Editor Ashok Mu-lehandani, 1167-1182, ISSN 0273-2289). Um método preferido para deter-minação da quantidade de atividade de uma proteína tendo a atividade deuma GFAT é fornecida em Métodos Gerais, Item 8.

No contexto da presente invenção, o termo "glutami-na:amidotransferase de 6-fosfato de frutose (GFAT)" (E.C. 2.6.1.16), na lite-ratura especializada, também referida como sintase de glicosamina, deveser compreendido como significando uma proteína a qual sintetiza, a partirdos materiais de partida glutamina e 6-fosfato de frutose (Fruc-6-Ρ), 6-fosfato de glicosamina (GlcN-6-Ρ). Essa catálise se processa de acordo como esquema de reação a seguir:

glutamina + Fruc-6-Ρ GlcN-6-Ρ + glutamato

No contexto da presente invenção, o termo "glutami-na:amidotransferase de 6-fosfato de frutose (GFAT)" é usado como um ter-mo geral o qual inclui todas as isoformas conhecidas.

Um artigo revisto por Milewski (2002, Biochimica et BiophysicaActa 1597, 173-193) descreve características estruturais de proteínas tendoa atividade de uma GFAT. A seqüência de aminoácido de todas as proteínasconhecidas tendo a atividade de GFAT contém regiões com seqüências deaminoácido conservadas. A seqüência de aminoácido de proteínas tendo aatividade de GFAT tem um domínio de ligação à glutamina N-terminal e umdomínio de ligação de 6-fosfato de frutose C-terminal os quais são separa-dos por uma seqüência de 40 a 90 aminoácidos não-conservados. Ambos osdomínios são ativos mesmo se eles estiverem presentes sobre moléculas deaminoácido separadas. Análises da estrutura de cristal de um fragmentocompreendendo o domínio de ligação à glutamina N-terminal da proteínatendo a atividade de uma GFAT de Escherichia coli mostrou que o centroativo desse domínio esta localizado no N-término e o aminoácido Cysl estáenvolvido na hidrólise de glutamina. Os aminoácidos Arg73 e Asp123 intera-gem com grupos carboxila e amino da glutamina. Essa interação é suporta-da pelos aminoácidos Thr76 e His77. A formação de ligações de hidrogêniocom o grupo amido da glutamina é atribuído aos aminoácidos Gly99 e Trp74.Os aminoácidos Asn98 e Gly99 estabilizam a bolsa com quatro faces docentro ativo. Os aminoácidos 25 a 29 e 73-80 formam Ioops flexíveis osquais, após ligação do substrato glutamina, contribuem através de uma alte-ração conformacional da proteína à reação catalisada por uma proteína ten- do a atividade de uma GFAT. Análise da estrutura de cristal do domínio deligação a 6-fosfato de frutose C-terminal da proteína tendo a atividade deuma GFAT de Escherichia coli mostrou que esse domínio é construído dedois domínios topologicamente idênticos (aminoácidos 241 a 424 e 425 a592) seguido por um domínio presente na extremidade C-terminal como um loop irregular (aminoácidos 593 a 608), mas o qual tem um único centro ati-vo. Os aminoácidos Ser303, Ser347, Gln348, Ser349 e Thr352 estão envol-vidos na ligação ao substrato, enquanto que os aminoácidos Glu488, His504e Lys603 estão diretamente envolvidos na catálise da reação da proteínatendo a atividade de uma GFAT.

Em particular, em organismos animais, foi possível demonstrarduas isoformas diferentes de proteínas tendo a atividade de uma GFAT (re-ferida na literatura como GFAT-1 e GFAT-2, respectivamente). Hu e outros(2004, J. Biol. Chem. 279(29), 29988-29993) descrevem diferenças das res-pectivas isoformas de proteínas tendo a atividade de uma GFAT. Além dasdiferenças na expressão tecido-específicas das isoformas em questão tendoa atividade de uma GFAT-1 e uma GFAT-2, é possível mostrar que ambasas isoformas são reguladas através de fosforilação por meio de uma quinasede proteína cAMP-dependente. A atividade de uma proteína tendo a ativida-de de uma GFAT-1 é inibida através de fosforilação de um resíduo de serinaconservado (serina 205 na GFAT-1 de um camundongo, Ac. ao GenBankNo.: AF334736.1) da seqüência de aminoácido em questão, enquanto que aatividade de uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 é aumentadaatravés de fosforilação de um resíduo de serina conservado (serina 202 naGFAT-2 de camundongo, Ac. ao GenBank No.: NM_013529) da seqüênciade ácido nucléico em questão. Ambas as proteínas tendo a atividade de umaGFAT-1 e proteínas tendo a atividade de uma GFAT-2 são inibidas de umamaneira concentração-dependente pela UDP-GIcNAc; contudo, para umaproteína tendo a atividade de uma GFAT-2, a inibição por UDP-GIcNAc émenor (redução máxima de atividade pela UDP-GIcNAc de cerca de 15%)comparado com uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-1 (reduçãomáxima de atividade pela UDP-GIcNAc em cerca de 51% ou 80%, respecti-vãmente). Há indicações de que a inibição de uma proteína tendo a ativida-de de uma GFAT-1 em organismos animais é baseada no fato de que, emconcentrações elevadas de UDP-GIcNAc, há uma glicosilação de O-glicose-N-acetilglicosamina das proteínas em questão. Se uma regulação da ativi-dade de proteínas através de O-glicosilação também ocorre em células deplanta não é ainda totalmente compreendido (Huber e Hardin, 2004, CurrentOpinion in Plant Biotechnology 7, 318-322).

Proteínas tendo a atividade de uma GFAT bacteriana são distin-guidas pelo fato de que elas não são inibidas pela UDP-GIcNAc (Kornfeld,1967, J. Biol. Chem. 242(13), 3135-3141). Proteínas tendo a atividade deuma GFAT-1, proteínas tendo a atividade de uma GFAT-2 e mesmo proteí-nas tendo a atividade de uma GFAT bacteriana são inibidas pelo produto 6-fosfato de glicosamina formado em sua reação (Broschat e outros, 2002, J.Biol. Chem. 277(17), 14764-14770; Deng e outros, 2005, Metabolic Enginee-ring 7, 201-214).

No contexto da presente invenção, o termo "proteína tendo aatividade de uma glutamina:amidotransferase de 6-fosfato de frutose de iso-forma I (GFAT-1)" deve ser entendido como significando uma proteína a qualtem a atividade de uma GFAT e cuja atividade é inibida através de fosforila-ção por uma quinase de proteína cAMP-dependente.

No contexto da presente invenção, o termo "proteína tendo aatividade de uma glutamina:amidotransferase de 6-fosfato de frutose de iso-forma Il (GFAT-2)" deve ser compreendido como significando uma proteínaa qual tem a atividade de uma GFAT e a qual é ativada através de fosforila-ção por uma quinase de proteína cAMP-dependente.

No contexto da presente invenção, o termo "proteína tendo aatividade de uma glutamina:amidotransferase de 6-fosfato de frutose bacte-riana (GFAT bacteriana)" deve ser compreendido como significando umaproteína a qual tem a atividade de uma GFAT e cuja atividade não é inibidapela UDP-GIcNAc. Alternativamente, "proteínas tendo a atividade de umaGFAT bacteriana" pode também ser referida como "proteínas tendo a ativi-dade de uma GFAT não-eucariota".

No contexto da presente invenção, o termo "molécula de ácidonucléico estranha" deve ser compreendido como significando tal molécula aqual não ocorre naturalmente em células de planta do tipo silvestre corres-pondentes ou a qual não ocorre naturalmente na disposição espacial especí-fica nas células de planta do tipo silvestre ou a qual está localizada em umlocal no genoma da célula de planta do tipo silvestre onde ela não ocorrenaturalmente.

De preferência, a molécula de ácido nucléico estranha é umamolécula recombinante a qual consiste em vários elementos (moléculas deácido nucléico) cuja combinação ou disposição espacial específica não ocor-re naturalmente em células de planta.

No contexto da presente invenção, o termo "molécula de ácidonucléico recombinante" deve ser compreendido como significando uma mo-lécula de ácido nucléico a qual tem várias moléculas de ácido nucléico asquais não estão naturalmente presentes em combinação como presentes emuma molécula de ácido nucléico recombinante. Assim, moléculas de ácidonucléico recombinantes podem ter, além de moléculas de ácido nucléico es-tranhas que codificam uma proteína, por exemplo, seqüências de ácido nu-cléico adicionais as quais não estão naturalmente presentes em combinaçãocom as referidas moléculas de ácido nucléico que codificam a proteína. Aqui,as seqüências de ácido nucléico adicionais mencionadas, as quais estãopresentes em uma molécula de ácido nucléico recombinante em combinaçãocom uma molécula de ácido nucléico que codifica a proteína, podem serquaisquer seqüências. Elas podem, por exemplo, representar seqüências deácido nucléico genômicas e/ou de planta.

As seqüências de ácido nucléico adicionais mencionadas são,de preferência, seqüências regulatórias (promotores, sinais de término, in-tensificador, íntrons), particularmente de preferência seqüências regulatóriasativas em tecido de planta, muito particularmente de preferência seqüênciasregulatórias tecido-específicas ativas em tecido de planta.

Métodos para geração de moléculas de ácido nucléico recombi-nantes são conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem métodosde-engenharia genética tais como, por exemplo, ligação de moléculas deácido nucléico através de ligação, recombinação genética ou a nova síntesede moléculas de ácido nucléico (vide, por exemplo, Sambrook e outros, Mo-lecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edição (2001) Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor1 NY. ISBN: 0879695773; Ausubel eoutros, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5ã edição(2002),ISBN: 0471250929).

A presente invenção proporciona, de preferência, células deplanta genéticamente modificadas de acordo com a invenção ou plantas ge-néticamente modificadas de acordo com a invenção em que as moléculas deácido nucléico estranhas que codificam uma proteína tendo a atividade deuma GFAT-2 ou codificam uma proteína tendo a atividade de uma GFATbacteriana são ligadas a elementos regulatórios que iniciam a transcrição emcélulas de planta (promotores). Esses podem ser promotores homólogos ouheterólogos. Os promotores podem ser promotores constitutivos, tecido-específicos ou desenvolvimento-específicos ou promotores regulados porfatores externos (por exemplo, após a aplicação de substâncias químicas,através da ação de fatores abióticos, tais como calor e/ou frio, estiagem, do-ença, etc.).

Em geral, quaisquer promotores ativos em células de planta sãoadequados para expressão de uma molécula de ácido nucléico estranha.Promotores adequados são, por exemplo, o promotor de RNA 35S do vírusmosaico da couve-flor ou o promotor de ubiquitina de milho ou o promotor deYLCV Cestrum (Vírus de Enrolamento da Folha Amarela; WO 01 73087;Stavolone e outros, 2003, Plant Mol. Biol. 53, 703-713) para uma expressãoconstitutiva, o promotor B33 de patatingen (Rocha-Sosa e outros, EMBO J. 8(1989), 23-29) para uma expressão tubérculo-específica em batatas ou umpromotor fruto-específico para tomate tal como, por exemplo, o promotor depoligalacturonase de tomate (Metha e outros, 2002, Nature Biotechnol.20(6), 613-618) ou o promotor de oxidase ACC de pêssego (Moon e Çalla-han, 2004, J. Experimental Botany 55 (402), 1519-1528) ou um promotor oqual assegura expressão apenas em tecidos fotossinteticamente ativos, porexemplo, o promotor ST-LS1 (Stockhaus e outros, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus e outros, EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) ou, para uma expressão endosperma-específica, o promotor HMWGde trigo, o promotor USP, o promotor de faseolina, promotores de genes dezeína de milho (Pedersen e outros, Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio eoutros, Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93), um promotor de glutelina (Leisy eoutros, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng e outros, Plant J. 4 (1993),357-366; Yoshihara e outros, FEBS Lett. 383 (1996), 213-218), um promotorde globulina (Nakase e outros, 1996, Gene 170(2), 223-226), um promotorde prolamina (Qu e Takaiwa, 2004, Plant Biotechnology Journal 2(2), 113-125) ou um promotor de shrunken-1 (Werr e outros, EMBO J. 4 (1985),1373-1380). Contudo, também é possível usar promotores os quais são ati-vos apenas em um ponto de tempo determinado por fatores externos (vide,por exemplo, WO 9307279). De interesse particular aqui podem ser promo-tores de proteínas do choque térmico os quais permitem uma indução sim-pies. Além disso, é possível usar promotores semente-específicos tais como,por exemplo, o promotor USP de Vicia faba o qual assegura uma expressãosemente-específica em Vicia faba e outras plantas (Fiedler e outros, PlantMol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bàumlein e outros, Mol. Gen. Genet. 225(1991), 459-467).

O uso de promotores presentes no genoma de um vírus que in-fecta algas é também adequado para expressão de seqüências de ácidonucléico em plantas (Mitra e outros, 1994, Biochem. Biophys Res Commun204(1), 187-194; Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol Biol 26(1), 85-93, Van Et-ten e outros, 2002, Arch Virol 147, 1479-1516).

No contexto da presente invenção, o termo "tecido-específico"deve ser compreendido como significando a limitação substancial de umamanifestação (por exemplo, início de transcrição) a um determinado tecido.

No contexto da presente invenção, os termos "célula de tubércu-lo, fruto ou endosperma" deve ser compreendido como significando todas ascélulas presentes em um tubérculo, um fruto e no endosperma de uma se-mente, respectivamente.

No contexto da presente invenção, o termo "promotor homólogo"deve ser compreendido como significando um promotor o qual está natural-mente presente em células de planta ou plantas usadas para o preparo decélulas de planta genéticamente modificadas de acordo com a invenção eplantas genéticamente modificadas de acordo com a invenção, respectiva-mente (homólogas com relação à célula de planta ou à planta) ou como sig-nificando um promotor o qual regula a regulação da expressão de um geno-ma de organismo do qual a respectiva molécula de ácido nucléico estranhaque codifica uma proteína foi isolado (homóloga com relação à molécula deácido nucléico a ser expressa).

No contexto da presente invenção, o termo "promotor heterólo-go" deve ser compreendido como significando um promotor o qual não estánaturalmente presente em células de planta ou plantas usadas para o prepa-ro de células de planta genéticamente modificadas de acordo com a inven-ção e em plantas genéticamente modificadas de acordo com a invenção,respectivamente (heterólogas com relação à célula de planta ou planta) oucomo significando um promotor o qual é, no organismo do qual a respectivamolécula de ácido nucléico estranha que codifica uma proteína foi isolado,não naturalmente presente para regulação da expressão da referida molécu-la de ácido nucléico estranha (heteróloga com relação à molécula de ácidonucléico a ser expressa).

Também presente pode ser uma seqüência de término (sinal depoliadenilação) a qual serve para adicionar uma cauda de poli-A ao transcri-to. Acredita-se que a cauda de poli-A atue na estabilização dos transcritos.Tais elementos são descritos na literatura (cf. Gielen e outros, EMBO J. 8(1989), 23-29) e podem ser trocados conforme desejado.

Também é possível que seqüências intrônicas estejam presen-tes entre o promotor e a região de codificação da molécula de ácido nucléicoestranha. Tais seqüências intrônicas podem levar à estabilidade de expres-são e uma expressão aumentada em plantas (Callis e outros, 1987, GenesDevei. 1, 1183-1200; Luehrsen, e Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier e outros, 1997; Plant Journal 12(4), 895-899; Rose e Belia-koff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil e outros, 1989, Plant Phy-siol. 91, 1575-1579; XU e outros, 2003, Science in China Series C Vol.46No.6, 561-569). Seqüências intrônicas adequadas são, por exemplo, o pri-meiro íntron do gene sh1 de milho, o primeiro íntron do gene 1 de poliubiqui-tina de milho, o primeiro íntron do gene EPSPS de arroz ou um dos primei-ros dois íntrons do gene PAT1 de Arabidopsis.

De acordo com a invenção, a molécula de ácido nucléico estra-nha que codifica uma proteína tendo a atividade enzimática de uma GFAT-2pode se originar de qualquer organismo eucariota; de preferência, a referidamolécula de ácido nucléico se origina de animais, particularmente de prefe-rência de mamíferos e muito particularmente de preferência de camundongo.

De acordo com a invenção, a molécula de ácido nucléico estra-nha que codifica uma proteína tendo a atividade enzimática de uma GFATbacteriana pode se originar de qualquer organismo não-eucariota ou de umgenoma viral; de preferência, a referida molécula de ácido nucléico se origi-na de bactérias ou vírus; particularmente de preferência, a referida moléculade ácido nucléico se origina de Escherichia coli. Uma vez que seqüências deaminoácido que codificam proteínas virais tendo a atividade de uma GFATtêm uma identidade consideravelmente maior com seqüências de aminoáci-do que codificam proteínas tendo a atividade de uma GFAT bacteriana euma identidade consideravelmente menor com proteínas tendo a atividadede uma GFAT-1 ou uma GFAT-2, proteínas virais tendo a atividade de umaGFAT são classificadas com as proteínas bacterianas tendo a atividade deuma GFAT (Landstein e outros, 1998, Virology 250, 388-396).

Com relação ao vírus, a molécula de ácido nucléico estranhaque codifica uma proteína tendo a atividade enzimática de uma GFAT seorigina, de preferência, de um vírus que infecta uma alga, com preferênciapor um vírus o qual infecta algas do gênero Chlorella, particularmente depreferência de um vírus Paramecium bursaría Chlorella e muito particular-mente de preferência de um vírus Paramecium bursaría Chlorella de umacepa H1.

Ao invés de uma molécula de ácido nucléico que ocorre natu-ralmente que codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 oucodifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT bacteriana, uma mo-lécula de ácido nucléico introduzida em células de planta genéticamente co-dificadas de acordo com a invenção ou plantas genéticamente modificadasde acordo com a invenção também podem ter sido geradas através de mu·tagênese, onde a referida molécula de ácido nucléico estranha com mutaçãoé caracterizada pelo fato de que ela codifica uma proteína tendo a atividadede uma GFAT-2 ou uma proteína tendo a atividade de uma GFAT bacterianaa qual tem inibição reduzida por metabólitos (por exemplo, do metabolismode glicosamina). De uma maneira exemplificativa, o preparo de tais molécu-Ias de ácido nucléico com mutagênese é descrito em Deng e outros (2005,Metabolic Engineering 7, 201-214; WO 04 003175) para uma proteína tendoa atividade de uma GFAT bacteriana de Escherichia coli. Mutantes de umaproteína tendo a atividade de uma GFAT-2 de camundongo são descritos,por exemplo, em Hu e outros (2004, J. Biol. Chem. 279 (29), 29988-29993).

Moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína tendo aatividade de uma GFAT são conhecidas por aqueles versados na técnica edescritas na literatura. Assim, moléculas de ácido nucléico que codificamuma proteína tendo a atividade de uma GFAT bacteriana são descritas, porexemplo, para Eseherichia coli (Dutka-Malen, 1988, Biochemie 70 (2), 287-290; Ac. ao EMBL No: L10328.1), Bacillus subtilis (ac. ao EMBL NoU21932), Haemophilus infíuenzae (ac. ao EMBL Nos AB006424.1, BA-A33071). Moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína tendo aatividade de uma GFAT bacteriana são também descritas para vírus taiscomo, por exemplo, o vírus k2 de Chlorella (ac. ao EMBL No AB107976.1).

Moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína tendo aatividade de uma GFAT-2 são descritas, inter alia, para insetos, por exem-pio, para Drosophila melanogaster (ac. ao NCBI No NM_143360.2), de ver-tebrados, por exemplo, para Homo sapiens (ac. ao NCBI No BC000012.2,Oki e outros, 1999, Genomics 57 (2),227-34) ou Mus musculus (ac. ao EMBLNo AB016780.1).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se àcélulas de planta genéticamente modificadas de acordo com a invenção eplantas genéticamente modificadas de acordo com a invenção onde a molé-cula de ácido nucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividadede uma GFAT-2 ou codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFATbacteriana é selecionada de um grupo consistindo em:

a) moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína ten-do a seqüência de aminoácido fornecidas sob SEQ ID NO 7 (GFTA-2) ouuma proteína tendo a seqüência de aminoácido fornecida em SEQ ID NO 9(GFAT bacteriana);

b) moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína cujaseqüência é pelo menos 60%, de preferência pelo menos 70%, mais preferi-velmente pelo menos 80%, particularmente de preferência pelo menos 90%,muito particularmente de preferência 95% e, ainda mais preferivelmente,pelo menos 98% idêntica à seqüência de aminoácido mostrada sob SEQ IDNO: 7 (GFAT-2) ou sob SEQ ID NO: 9 (GFAT bacteriana);

c) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência denucleotídeo mostrada sob SEQ ID NO: 6 (GFAT-2) ou sob SEQ ID NO: 8(GFAT bacteriana) ou sob SEQ ID NO: 10 (GFAT bacteriana) ou uma se-qüência complementar à mesma;

d) moléculas de ácido nucléico as quais são pelo menos 60%,de preferência pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, par-ticularmente de preferência pelo menos 90%, muito particularmente de pre-ferência pelo menos 95% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 98%idênticas às seqüências de ácido nucléico mostradas sob a) ou c);

e) moléculas de ácido nucléico as quais se hibridizam sob condi-ções estringentes com pelo menos uma fita das seqüências de ácido nucléi-co descritas sob a) ou c);

f) moléculas de ácido nucléico cuja seqüência de nucleotídeodifere da seqüência das moléculas de ácido nucléico mencionadas sob a) ouc) levando-se em conta a degenerância do código genético e

g) moléculas de ácido nucléico as quais são fragmentos, varian-tes alélicas e/ou derivados das moléculas de ácido nucléico mencionadassob a), b), c), d), e) ou f). ~

No contexto da presente invenção, o termo "hibridização" refere-se a uma hibridização sob condições convencionais de hibridização, de pre-ferência sob condições estringentes conforme descrito, por exemplo, emSambrook e outros (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edição(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN:0879695773) ou Ausubel e outros (Short Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons; 55 edição (2002), ISBN: 0471250929). Com preferênciaparticular, "hibridização" significa uma hibridização sob as seguintes condições:

Tampão de hibridização: 2 χ SSC; 10 χ solução de Denhardt (Fi-koll 400 + PEG + BSA; proporção de 1:1:1); SDS a 0,1%; EDTA a 5 mM;Na2HPO4 a 50 mM; 250 pg/ml de DNA de esperma de salmão; 50 pg/ml detRNA; ou tampão de fosfato de sódio, pH de 7,2, EDTA a 1 mM; SDS a 7%

Temperatura de hibridização: T = 65 a 68°C

Tampão de lavagem: 0,1 χ SSC; SDS a 0,1%

Temperatura de lavagem: T = 65 a 68°C.

Moléculas de ácido nucléico as quais se hibridizam com molécu-las de ácido nucléico que codificam uma proteína tendo a atividade de umaGFAT-2 ou codificam uma proteína tendo a atividade de uma GFAT bacteri-ana podem se originar de qualquer organismo: conseqüentemente, eles po-dem se originar de bactérias, fungos, animais, plantas ou vírus.

Moléculas de ácido nucléico as quais se hibridizam com molécu-Ias de ácido nucléico que codificam uma proteína tendo a atividade de umaGFAT-2 se originam, de preferência, de animais, particularmente de prefe-rência de mamíferos e, muito particularmente de preferência, de camundon-go.

Moléculas de ácido nucléico as quais se hibridizam com molécu-

las de ácido nucléico que codificam uma proteína tendo a atividade de umaGFAT bacteriana se originam, de preferência, de bactérias ou vírus, particu-larmente de preferência de Escherichia coli.

Moléculas de ácido nucléico as quais se hibridizam com as mo-léculas mencionadas podem ser isoladas,-por exemplo, de bibliotecas decDNA ou genômicas. Tais moléculas de ácido nucléico podem ser identifica-das e isoladas usando as moléculas de ácido nucléico mencionadas ou par-tes dessas moléculas ou os complementos invertidos dessas moléculas, porexemplo, através de hibridização de acordo com métodos padrões (vide, por15 exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3âedição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1 NY.ISBN: 0879695773; Ausubel e outros, Short Protocols in Molecular Biology1John Wiley & Sons; 5â edição (2002),ISBN: 0471250929) ou através de am-plificação usando PCR.

Como uma amostra de hibridização para isolamento de uma se-qüência de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo a atividade deuma GFAT-2, é possível usar, por exemplo, moléculas de ácido nucléicotendo exatamente ou essencialmente as seqüências de ácido nucléico des-critas sob SEQ ID NO: 6 ou fragmentos dessas seqüências de ácido nucléi-co. Como amostra de hibridização para isolamento de uma seqüência deácido nucléico que codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFATbacteriana, é possível usar, por exemplo, moléculas de ácido nucléico tendoexatamente ou essencialmente as seqüências de ácido nucléico descritassob SEQ ID NO: 8 ou fragmentos dessas seqüências de ácido nucléico.

Os fragmentos usados como amostras de hibridização tambémpodem ser fragmentos sintéticos ou oligonucleotídeos preparados usando astécnicas de síntese comuns, cuja seqüência é essencialmente idêntica à mo-lécula de ácido nucléico descrita no contexto da presente invenção. Uma vezque genes os quais se hibridizam com as seqüências de ácido nucléico des-critas no contexto da presente invenção são identificadas e isoladas, a se-qüência será determinada e as propriedades das proteínas codificadas paraessa seqüência serão analisadas para determinar se elas são proteínas ten-do a atividade de uma GFAT-2 ou a atividade de uma GFAT bacteriana. Mé-todos de como determinar se uma proteína tem a atividade de uma proteínatendo a atividade de uma GFAT-2 ou tendo a atividade de uma GFAT bacte-riana são conhecidas por aqueles versados na técnica e descritos, inter alia,na literatura (GFAT bacteriana: por exemplo, Deng e outros, 2005, MetabolicEngineering 7, 201-214; Kornfeld, 1967, J. Biol. Chem. 242(13), 3135-3141;GFAT-2: por exemplo, Hu e outros, 2004, J. Biol. Chem. 279 (29), 29988-29993).

As moléculas que se hibridizam com as moléculas de ácido nu-cléico descritas no contexto da presente invenção compreendem, em parti-cular, fragmentos, derivados e variantes alélicas das moléculas de ácido nu-cléico mencionadas. No contexto da presente invenção, o termo "derivado"significa que as seqüências dessas moléculas diferem em uma ou mais po-sições das seqüências das moléculas de ácido nucléico descritas acima esão altamente idênticas a essas seqüências. As diferenças nas moléculas deácido nucléico descritas acima podem, por exemplo, ser em virtude de dele-ção (em particular deleção de regiões N- e/ou C-terminais), adição, substitui-ção, inserção ou recombinação.

No contexto da presente invenção, o termo "identidade" significauma identidade de seqüência sobre o comprimento todo da região de codifi-cação de uma molécula de ácido nucléico ou o comprimento todo de umaseqüência de aminoácido que codifica uma proteína de pelo menos 60%, emparticular uma identidade de pelo menos 70%, de preferência de pelo menos80%, particularmente de preferência de pelo menos 90%, muito particular-mente de preferência de pelo menos 95% e, ainda mais preferivelmente, depelo menos 98%. No contexto da presente invenção, o termo "identidade"deve ser compreendido como significando o número de aminoáci-dos/nucleotídeos idênticos (identidade) com outras proteínas/ácidos nucléi-cos, expressa em percentual.

De preferência, a identidade com relação a uma proteína tendo aatividade de uma GFAT-2 é determinada através de comparações com aseqüência de aminoáçido fornecida sob SEQ ID NO: 7 e a identidade comrelação a uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo aatividade de uma GFAT-2, conforme determinado através de comparaçõesda seqüência de ácido nucléico fornecida sob SEQ ID NO: 6 com outras pro-teínas/ácidos nucléicos com o auxílio de programas de computador. De pre-ferência, a identidade com relação a uma proteína tendo a atividade de umaGFAT bacteriana é determinada através de comparações da seqüência deaminoáçido fornecida sob SEQ ID NO: 9 e a identidade com relação a umamolécula de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo a atividade deuma GFAT bacteriana é determinada através de comparações da seqüênciade ácido nucléico fornecida sob SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10 com ou-tras proteínas/ácidos nucléicos com o auxílio de programas de computador.

Se as seqüências a serem comparadas umas com as outras são de diferen-te comprimento, a identidade tem de ser determinada através de determina-ção da identidade, em percentual, do número de aminoácidos/nucleotídeosos quais a seqüência mais curta compartilha com a seqüência mais longa.

De preferência, a identidade é determinada usando o programa de computa-dor conhecido e publicamente disponível CIustaIW (Thompson e outros, Nu-cleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). O CIustaIW foi tornado publi-camente por Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) e TobyGibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Labo-ratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Alemanha. Download doCIustaIW pode também ser feito de várias páginas na Internet, inter alia, doIGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire,B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, França; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) e doEBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) e todas as páginas na Internet de espe-lho do EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust GenomeCampus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, Reino Unido).De preferência, uso é feito do programa de computador CIustaIWda versão 1.8 para determinar a identidade entre proteínas descritas no con-texto da presente invenção e outras proteínas. Aqui, os parâmetros têm deser ajustados como segue: KTUPLE = 1, TOPDIAG = 5, WINDOW = 5, PA-IRGAP = 3, GAPOPEN = 10, GAPEXTEND = 0,05, GAPDIST = 8, MAXDIV= 40, MATRIX = GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.

De preferência, uso é feito do programa de computador CIustaIWda versão 1.8 para determinar a identidade, por exemplo, entre a seqüênciade nucleotídeo das moléculas de ácido nucléico descritas no contexto dapresente invenção e a seqüência de nucleotídeo de outras moléculas de áci-do nucléico. Aqui, os parâmetros têm de ser ajustados como segue: KTU-PLE = 2, TOPDIAGS = 4, PAIRGAP = 5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN = 10,GAPEXT = 5, MAXDIV = 40, TRANSITIONS: sem peso.

Identidade, além disso, significa que há uma equivalência fun-cional e/ou estrutural entre as moléculas de ácido nucléico em questão ou asproteínas codificadas pelas mesmas. As moléculas de ácido nucléico asquais são homólogas às moléculas descritas acima e representam derivadosdessas moléculas são, geralmente, variações dessas moléculas as quaisrepresentam modificações tendo a mesma função biológica, isto é, codificamuma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 ou a atividade de umaGFAT bacteriana. Elas podem ser variações que ocorrem naturalmente, porexemplo, seqüências de outras espécies, ou mutações, onde essas muta-ções podem ter ocorrido de uma maneira natural ou foram introduzidas atra-vés de mutagênese sistemática. Além disso, as variações podem ser se-qüências sinteticamente produzidas. As variantes alélicas podem ser varian-tes que ocorrem naturalmente ou variantes sinteticamente produzidas ouvariantes geradas através de técnicas de DNA recombinante. Uma formaespecial de derivados são, por exemplo, moléculas de ácido nucléico asquais diferem das moléculas de ácido nucléico descritas no contexto da pre-sente invenção como um resultado da degenerância do código genético.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção refere-se à células de planta genéticamente modificadas de acordo com a invençãoou plantas genéticamente modificadas de acordo com a invenção onde mo-léculas de ácido nucléico que codificam uma proteína tendo a atividade deuma GFAT-2 ou codificam uma proteína tendo a atividade de uma GFATbacteriana são caracterizadas pelo fato de que os códons das referidas mo-léculas de ácido nucléico são diferentes dos códons das moléculas de ácidonucléico as quais codificam a referida proteína tendo a atividade dé umaGFAT-2 ou a referida proteína tendo a atividade de uma GFAT bacteriana doorganismo precursor. Particularmente de preferência, os códons das molécu-las de ácido nucléico que codificam uma proteína tendo a atividade de umaGFAT-2 ou codificam uma proteína tendo a atividade de uma GFAT bacteri-ana são trocados de modo que eles são adaptados à freqüência de uso doscódons da célula de planta ou da planta em cujo genoma eles são integra-dos ou serão integrados.

Como um resultado da degenerância do código genético, ami-noácidos podem ser codificados por um ou mais códons. Em diferentes or-ganismos, os códons que codificam um aminoácido são usados em diferen-tes seqüências. Adaptação dos códons de uma seqüência de ácido nucléicode codificação à freqüência de seu uso na célula de planta ou na planta emcujo genoma a seqüência a ser expressa deve ser integrada pode contribuirpara uma quantidade aumentada de proteína traduzida e/ou a estabilidadedo mRNA em questão nas células de planta ou plantas em particular. A fre-qüência dé uso de códons nas células de planta ou plantas em questão podeser determinada por aqueles versados na técnica examinando tantas se-qüências de ácido nucléico de codificação do organismo em questão quantopossível com relação à freqüência com a qual determinados códons são u-sados para codificação de um determinado aminoácido. A freqüência do usode códons de determinados organismos é conhecida por aqueles versadosna técnica e pode ser determinada de uma maneira simples e rápida usandoprogramas de computador. Tais programas de computador são publicamen-te acessíveis e proporcionados livremente, inter alia, na Internet (por exem-plo, http://gcua.schoedl.de/; http://www.kazusa.or.jp/codon/;http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html).Adaptação dos códons de uma seqüência de ácido nucléico decodificação à freqüência de seu uso na célula de planta ou na planta em cujogenoma a seqüência a ser expressa tem de ser integrada pode ser realizadaatravés de mutagênese in vitro ou, de preferência, através de síntese de no-vo da seqüência de gene. Métodos para a síntese de novo de seqüências deácido nucléico são conhecidas por aqueles versados na técnica. Uma sínte-se de novo pode ser realizada, por exemplo, inicialmente sintetizando oligo-nucleotídeos de ácido nucléico individuais, hibridização desses com oligonu-cleotídeos complementares aos mesmos, de modo que eles formam uma fitadupla de DNA e, então, ligação dos oligonucleotídeos fita dupla individuaisde modo que a seqüência de ácido nucléico desejada seja obtida. A síntesede novo de seqüências de ácido nucléico, incluindo a adaptação da freqüên-cia com a qual os códons são usados a um determinado organismo alvo,também podem ser fornecidas de companhias que oferecem esse serviço(por exemplo, Entelechon GmbH, Regensburg, Alemanha).

Todas as moléculas de ácido nucléico mencionadas são ade-quadas para a produção de células de planta de acordo com a invenção ouplantas de acordo com a invenção.

As células de planta genéticamente modificadas de acordo coma invenção ou as plantas genéticamente modificadas de acordo com a in-venção podem, em princípio, ser células de planta e plantas, respectivamen-te, de quaisquer espécies de planta, isto é, plantas monocotiledôneas e dico-tiledôneas. Elas são, de preferência, plantas de safra, isto é, plantas cultiva-das pelo homem para fins de alimentação do homem e animais ou para aprodução de biomassa e/ou para preparo de substâncias para fins técnicos,industriais. As células de planta genéticamente modificadas de acordo com ainvenção ou plantas genéticamente modificadas de acordo com a invençãosão, particularmente de preferência, milho, arroz, trigo, centeio, aveias, ce-vada, mandioca, batata, tomate, gramínea ("switchgrass") (Panicum virga-tum), sagu, broto de feijão (moyashi), ervilhas, sorgo, cenouras, berinjela,rabanete, colza, alfafa, soja, amendoins, abóboras, morangas, melões, alho-poró, alho, couve, espinafre, batata doce, aspargo, abobrinha, alface, alca-chofra, milho verde, pastinaca cercefi, ("salsify"), alcachofra de Jerusalém,banana, beterraba sacarínica, cana-de-açúcar, raiz de beterraba, brócolis,couve, cebola, beterraba, dente-de-leão, morango, maçã, abricó, ameixa,pêssego, uvas, couve-flor, aipo, pimentão, swede, ruibarbo. Elas são, depreferência, plantas de milho, arroz, trigo, centeio, aveia ou cevada, muitoparticularmente de preferência plantas de arroz, tomate ou batata.

No contexto da presente invenção, o termo "planta de batata" ou"batata" deve ser compreendido como significando espécies de planta dogênero Solanum, particularmente espécies que produzem tubérculo do gê-nero Solanum e em particular Solanum tuberosum.

No contexto da presente invenção, o termo "planta de tomate"ou "tomate" deve ser compreendido como significando espécies de planta dogênero Lycopersicon, em particular Lycopersicon esculentum.

No contexto da presente invenção, o termo "planta de arroz" de-ve ser compreendido como significando uma espécie de planta do gêneroOryza, em particular uma espécie de planta do gênero Oryza agricolamentecultivada para fins comerciais, particularmente de preferência Oryza sativa.

Conforme já discutido, células de planta de acordo com a inven-ção ou plantas de acordo com a invenção são adequadas para produção deglicosaminoglicanas tais como, por exemplo, condroitina, hialuronana, quiti-na, heparina (heparosana), uma vez que elas contêm uma maior quantidadede substratos para as enzimas envolvidas na catálise das glicosaminoglica-nas mencionadas.

Conseqüentemente, a presente invenção se refere, além disso,à células de planta ou plantas que sintetizam glicosaminoglicana, de prefe-rência pelo menos 500 μg de glicosaminoglicana por grama em peso fresco,mais preferivelmente pelo menos 1500 μg de glicosaminoglicana por gramaem peso fresco, particularmente de preferência pelo menos 3500 μg de gli-cosaminoglicana por grama em peso fresco, muito particularmente de prefe-rência pelo menos 4000 μg de glicosaminoglicana por grama em peso frescoe especialmente de preferência pelo menos 5500 μg de glicosaminoglicanapor grama em peso fresco. Nesse contexto, a glicosaminoglicana é, de pre-ferência, condroitina, hialuronana, quitina ou heparina (heparosana), particu-larmente de preferência hialuronana.

Células de planta de acordo com a invenção ou plantas de acor-do com a invenção têm, de preferência, um teor de glicosaminoglicana de nomáximo 25 000 μιτιοίβε por grama em peso fresco, de preferência no máxi-mo 20 000 μηιοίβε por grama em peso fresco, particularmente de preferên-cia no máximo 15 000 μιτιοίβε por grama em peso fresco, muito particular-mente de preferência no máximo 10 000 μιηοΙββ por grama em peso fresco,especialmente de preferência no máximo 6500 μηιοίβε por grama em peso-fresco.

Células de planta de acordo com a invenção ou plantas de acor-do com a invenção as quais sintetizam glicosaminoglicana podem ser produ-zidas, por exemplo, através de introdução de moléculas de ácido nucléicoestranhas que codificam uma proteína tendo a atividade dé uma GFAT ecodificam uma proteína tendo a atividade de uma sintase de glicosaminogli-cana em uma célula de planta.

Conseqüentemente, a presente invenção também refere-se àcélulas de planta genéticamente modificadas ou plantas genéticamente mo-dificadas contendo uma primeira molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 ou uma GFAT bac-teriana e uma segunda molécula de ácido nucléico estranha que codificauma proteína tendo a atividade de uma sintase de glicosaminoglicana.

No contexto da presente invenção, o termo "proteína tendo aatividade de uma sintase de glicosaminoglicana" deve ser compreendidocomo significando uma proteína a qual usa UDP-GIcNAc ou UDP-N-acetilgalactosamina, um epímero de UDP-GIcNAc, como um substrato parasíntese de uma glicosaminoglicana. A proteína tendo a atividade de umasintase de glicosaminoglicana é, de preferência, uma sintase de hialuronana,sintase de condroitina, sintase de heparosana/heparina, sintase de querata-na ou sintase de quitina.

Moléculas de ácido nucléico e seqüências de proteína corres-pondentes que codificam sintases de glicosaminoglicana são conhecidas poraqueles versados na técnica e descritas como sintase de hialuronana, porexemplo, de vírus (por exemplo, Vírus 1 de Paramecium bursaría Chlorella,EMBL U42580.3, PB42580, US 20030235893), como sintase de condroitina,por exemplo, de mamíferos (por exemplo, Homo sapiens, WO 03 012099,US 2005048604, US 2006052335), bactérias (por exemplo, Escherichia coli,US 2003109693, EP 1283259, Pasteurella multicoda US 2003104601), comosintase de quitina, por exemplo, de bactérias (por exemplo, Azorhizobiumcaulinodans EMBLCDS:AAB51164), de fungos (por exemplo, Chaetomiumglobosum EMBLCDS:EAQ92361, Aspergillus nidulans EMBL AB000125,Arthroderma benhamiae EMBLCDS:BAB32692 Neurospora crassa EMBLM73437.4), de insetos (por exemplo, Aedes aegypti EMBLCDS:EAT46081,Tribolium castaneum EMBLCDS: AAQ55061), nematóides (por exemplo,Dirofilaria immitis EMBL AF288618, Caenorhabditis elegans EMBLAY874871), de vírus (por exemplo, Chlorella vírus EMBLCDS: BAB83509,Paramecium bursaría Chlorella vírus CVK2 EMBLCDS: BAE48153), comosintase de heparina/heparosana, por exemplo, de bactérias (por exemplo,Pasteurella multocida EMBL AF425591, AF439804, US 20030099967, Es-cheríchia co//'X77617.1).

A segunda molécula de ácido nucléico estranha que codificauma proteína tendo a atividade de uma sintase de glicosaminoglicana é, depreferência, uma molécula de ácido nucléico recombinante. Modalidadespreferidas de moléculas de ácido nucléico recombinantes já foram descritase devem ser usadas aqui de uma maneira correspondente.

Em ainda uma outra modalidade, a segunda molécula de ácidonucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividade de uma sinta-se de glicosaminoglicana é caracterizada pelo fato de que os códons sãomodificados comparado com os códons da molécula de ácido nucléico quecodifica a referida proteína tendo a atividade de uma sintase de glicosami-noglicana do organismo precursor. Particularmente de preferência, os có-dons de moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína tendo aatividade de uma sintase de glicosaminoglicana são modificados de modoque eles são adaptados à freqüência de uso dos códons da célula de plantaou planta em cujo genoma eles são integrados ou têm de ser integrados.

O que foi estabelecido acima para moléculas de ácido nucléicoque codificam uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 ou uma GFATbacteriana com relação à modificação dos códons de uma molécula de ácidonucléico deve ser aplicado aqui de uma maneira correspondente.

A presente invenção, além disso, refere-se à plantas contendocélulas de planta de acordo com a invenção. Tais plantas podem ser gera-das através de regeneração de células de planta de acordo com a invenção.

A presente invenção também refere-se à partes de plantas deacordo com a invenção contendo células de planta de acordo com a invenção.

No contexto da presente invenção, o termo "partes de planta" ou"partes de plantas" deve ser compreendido como significando, por exemplo,partes de planta processáveis usadas na produção de gêneros alimentíciosou gêneros para ração, usadas como fonte de matéria-prima para processosindustriais (por exemplo, para o isolamento dos derivados de glicosamina ouglicosaminoglicanas), como fonte de matéria-prima para o preparo de produ-tos farmacêuticos ou como fonte de matéria-prima para o preparo de produ-tos cosméticos.

No contexto da presente invenção, o termo "partes de planta" ou"partes de plantas", além disso, deve ser compreendido como significando,por exemplo, partes de planta consumíveis as quais servem como alimentopara o homem ou as quais são usadas como ração para animal.

"Partes de planta" ou "partes de plantas" preferidas são frutos,raízes de armazenamento e outras, flores, brotos, rebentos, folhas ou cau-les, de preferência sementes, frutos, grãos ou tubérculos.

A presente invenção também refere-se ao material de propaga-ção de plantas de acordo com a invenção. De preferência, material de pro-pagação de acordo com a invenção contém células de planta de acordo coma invenção, particularmente de preferência células de planta genéticamentemodificadas de acordo com a invenção.

Aqui, o termo "material de propagação" compreende aquelescomponentes da planta os quais são adequados para geração de prole atra-vés da via vegetativa ou gerativa. Adequados para propagação vegetativasão, por exemplo, cortes, culturas de caules, rizomas ou tubérculos. Outromaterial de propagação inclui, por exemplo, frutos, sementes, grãos, mudas,culturas de células, etc. O material de propagação toma, de preferência, aforma de tubérculos, frutos, grãos ou sementes.

Uma outra vantagem da presente invenção é o fato de que par-tes de plantas de acordo com a invenção têm um maior teor de derivados deglicosamina N-acetilada do que plantas conhecidas. Conseqüentemente,plantas de acordo com a invenção são particularmente adequadas para usodireto como gêneros alimentícios/gêneros para ração ou para o preparo degêneros alimentícios/gêneros para ração tendo um efeito profilático ou tera-pêutico (por exemplo, para a profilaxia de osteoartrite). Uma vez que asplantas de acordo com a invenção têm um maior teor de derivados de glico-samina N-acetilada comparado com plantas conhecidas, as quantidades departes colhíveis, material de propagação, partes processáveis ou partesconsumíveis de plantas de acordo com a invenção usadas no preparo degêneros alimentícios/gêneros para ração tendo um teor aumentado de deri-vados de glicosamina N-acetilada podem ser reduzidas. Se partes consumí-veis de plantas genéticamente modificadas de acordo com a invenção sãoconsumidas, por exemplo, diretamente como o assim denominado nutracêu-tico, um efeito positivo pode ser obtido mesmo através do consumo de pe-quenas quantidades de substância. Isso pode ser de importância particular,inter alia, na produção de ração para animal, uma vez que uma ração paraanimal com um teor muito alto de componentes vegetais é inadequada comoum gênero para ração para várias espécies de animais. Além disso, célulasde planta de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a invençãotêm a vantagem de que elas também podem ser usadas por vegetarianos oupara o preparo de alimento judaico. Assim, é possível administrar alimentotendo um teor elevado de glicosaminas N-acetiladas mesmo a pessoas queseguem os estilos de vida mencionados.

Sabe-se que N-acetilglicosamina tem um efeito de estimulaçãosobre o crescimento de bífido bactérias (Liepke e outros, 2002, Eur. J. Bio-chem. 269, 712-718). Além disso, foi mostrado que a N-acetilglicosaminaserve como um substrato para Iactobacilos (por exemplo, Lactobacillus caseisub-espécie paracasei) do intestino de peixe (Adolfo Bucio Galindo, 2004,Proefschrift, Wageningen Universiteit, ISBN 90-5808-943-6). Conseqüente-mente, a N-aeetilglicosamina tem um efeito positivo sobre bactérias probióti-cas. Uma vez que as células de planta de acordo com a invenção, plantasde acordo com a invenção ou partes de plantas de acordo com a invençãotêm um elevado teor de N-acetilglicosamina, elas terão, conseqüentemente,um efeito-positivo sobre o crescimento de bactérias probióticas e, assim, se-rão adequadas para uso como um gênero alimentício/gênero para raçãoprobiótico para o homem e animais.

A presente invenção, além disso, refere-se a um processo paraprodução de uma planta genéticamente modificada o qual compreende asseguintes etapas:

a) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína tendo a atividade de uma glutamina:frutose 6-fosfatoamidotransferase de isoforma Il (GFAT-2)] ou codifica uma proteína tendo aatividade de uma glutamina bacteriana:frutose 6-fosfato amidotransferase(GFAT bacteriana) em uma célula de planta,

b) regeneração de uma planta de células de planta obtidas deacordo com a etapa a),

c) se apropriado, geração de outras plantas com o auxílio dasplantas de acordo com a etapa b).

A presente invenção, além disso, refere-se a processos para aprodução de uma planta a qual sintetiza glicosaminoglicana, em que:

a) uma célula de planta é genéticamente modificada, onde amodificação genética compreende as etapas i a ii a seguir em qualquer or-dem ou realização de quaisquer combinações das etapas i a ii a seguir indi-vidual ou simultaneamente:

i) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína tendo a atividade de uma glutamina:frutose 6-fosfatoamidotransferase de isoforma Il (GFAT-2) ou codifica uma proteína tendo aatividade de uma glutamina:amidotransferase de 6-fosfato de frutose bacte-riana (GFAT bacteriana) em uma célula de planta,

ii) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma sintase de glicosaminoglicana em uma célula de planta,

b) um planta é regenerada a partir das células de planta com-preendendo a modificação genética de acordo com as etapas:

i)a)i

ii) a) ii

iii) a) Ί e a) ii,

c) introdução, em células de planta, de plantas de acordo com aetapa:

i) b) i uma modificação genética de acordo com a etapa a) ii,

ii) b) ii uma modificação genética de acordo com a etapa a) i,e regeneração de uma planta

d) se apropriado, geração de outras plantas com o auxílio dasplantas obtidos de acordo com qualquer uma das etapas b) iii ou c) i ou c) ii.

Com relação à introdução de moléculas de ácido nucléico estra-nhas de acordo com a etapa a) do processo para produção de uma plantagenéticamente modificada ou de acordo com as etapas a) ou c) do processopara produção de uma planta a qual sintetiza glicosaminoglicana em umacélula de planta, essa introdução pode, em princípio, ser qualquer tipo deintrodução de moléculas de ácido nucléico adequadas para integração deuma molécula de ácido nucléico estranha em uma célula de planta ou planta.Tais métodos já foram descritos acima e podem ser aplicados aqui de umamaneira correspondente.

Com relação à molécula de ácido nucléico estranha que codificauma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 ou codifica uma proteínatendo a atividade de uma GFAT bacteriana de acordo com a etapa a) doprocesso para produção de uma planta genéticamente modificada ou comrelação à molécula de ácido nucléico estranha que codifica uma proteínatendo a atividade de uma sintase de glicosaminoglicana de acordo com umaetapa a) ii) do processo para produção de uma planta a qual sintetiza glico-saminoglicana, várias possíveis modalidades das respectivas moléculas deácido nucléico já foram descritas no contexto com células de planta de acor-do com a invenção e plantas de acordo com a invenção. Todas essas moda-Iidades preferidas as quais já foram descritas também podem ser usadaspara realização do processo de acordo com a invenção mencionada.

A regeneração das plantas dependendo do processo de acordocom a etapa b) e/ou c) do processo de acordo com a invenção pode ser rea-lizada usando métodos conhecidos por pessoas versadas na técnica (descri-tos, por exemplo, em "Plant Cell Culture Protocols", 19S9, editado por R.D.Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2).

A geração de outras plantas dependendo do processo de acordocom a etapa c) ou d) dos processos de acordo com a invenção pode ser rea-lizada, por exemplo, através de propagação vegetativa (por exemplo, viacortes, tubérculos ou via cultura de caule e regeneração de plantas intactas)ou via propagação gerativa. Nesse contexto, propagação gerativa ocorre, depreferência, sob condições controladas, isto é, plantas selecionadas comcaracterísticas específicas são hibridizadas umas com as outras e multipli-cadas. A seleção ocorre, de preferência, de uma maneira tal que as plantas,dependendo do processo de acordo com a etapa b) ou d), têm as modifica-ções introduzidas na etapa a).

Em uma outra modalidade preferida, processos de acordo com ainvenção para produção de uma planta genéticamente modificada são usa-dos para produção de plantas de acordo com a invenção.

A presente invenção também proporciona plantas obteníveis a-través de processos de acordo com a invenção para o preparo de uma plan-ta genéticamente modificada.

A presente invenção, além disso, refere-se a um processo paraprodução de glicosaminoglicanas o qual compreende a etapa de extração deglicosaminoglicanas de células de planta genéticamente modificadas de a -cordo com a invenção, de plantas genéticamente modificadas de acordocom a invenção, material de propagação de acordo com a invenção, partesde plantas de acordo com a invenção, ou plantas obteníveis através de umprocesso de acordo com a invenção para o preparo de uma planta genéti-camente modificada a qual sintetiza glicosaminoglicana. O processo de a-cordo com a invenção é, de preferência, usado para produção de condroiti-na, hialuronana, quitina ou heparina (heparosana), particularmente de prefe-rência para produção de hialuronana.

De preferência, tal processo também compreende a etapa decolheita das células de planta genéticamente modificadas cultivadas de a-cordo com a invenção, das plantas genéticamente modificadas de acordocom a invenção, do material de propagação de acordo com a invenção, daspartes de planta de acordo com a invenção antes da extração da glicosami-noglicana e, particularmente, de preferência, além disso, a etapa de culturadas células de planta genéticamente modificadas de acordo com a invençãoou plantas genéticamente modificadas de acordo com a invenção antes decolheita.

Em contraste com tecidos bacterianos ou de animais, tecidos deplanta não contêm quaisquer enzimas de degradação de glicosaminoglicana.

Conseqüentemente, extração de glicosaminoglicanas de tecido de planta épossível usando métodos relativamente simples. Se requerido, extratos a-quosos de células ou tecidos de planta contendo glicosaminoglicana podemser purificados ainda usando métodos conhecidos por versados na técnica,tais como, por exemplo, precipitação repetida com etanol. Um método prefe-rido para purificação, por exemplo, de hialuronana é descrito sob MétodosGerais, Item 5.

A presente invenção também proporciona o uso de células deplanta genéticamente modificadas de acordo com a invenção, plantas gené-ticamente modificadas de acordo com a invenção, material de propagaçãode acordo com a invenção, partes de plantas de acordo com a invenção ouplantas obteníveis através de um processo de acordo com a invenção paraprodução de uma planta genéticamente modificada a qual sintetiza glicosa-minoglicana para a produção de glicosaminoglicanas.

A presente invenção também proporciona o uso de moléculas deácido nucléico que codificam uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 ou que codificam uma proteína tendo atividade de uma GFAT bacterianapara preparo de uma planta genéticamente modificada.

A presente invenção, além disso, refere-se á uma composiçãocompreendendo células de planta genéticamente modificada de acordo coma invenção.

Aqui, não importa se as células de planta são intactas ou nãoestão mais intactas porque elas foram destruídas, por exemplo, através deprocessamento. As composições são, de preferência, gêneros alimentícios,suplementos alimentícios ou gêneros para ração, produtos farmacêuticos oucosméticos.

A presente invenção, de preferência, proporciona composiçõesde acordo com a invenção compreendendo moléculas de ácido nucléico re-combinantes, as moléculas de ácido nucléico recombinantes sendo caracte-rizadas pelo fato de que elas compreendem moléculas de ácido nucléico quecodificam uma proteína tendo a atividade enzimática de uma GFAT-2 ouuma proteína tendo uma atividade de uma GFAT bacteriana.

Uma integração estável de moléculas de ácido nucléico estra-nhas no genoma de uma célula de planta ou planta resulta na moléculas deácido nucléico estranhas sendo flanqueadas após integração no genoma dacélula de planta ou planta por seqüências de ácido nucléico de planta genô-rnicas. Conseqüentemente, em uma modalidade preferida, composições deacordo com a invenção são caracterizadas pelo fato de que as moléculas deácido nucléico recombinantes presentes na composição de acordo com ainvenção são flanqueadas por seqüências de ácido nucléico de planta ge-nômicas.

Aqui, as seqüências de ácido nucléico de planta genômicas po-dem ser de quaisquer seqüências naturalmente presentes no genoma dacélula de planta ou planta usada para preparo da composição. Essas molé-cuias de ácido nucléico recombinantes as quais estão presentes nas compo-sições de acordo com a invenção podem ser demonstradas usando métodosconhecidos por versados na técnica tais como, por exemplo, métodos base-ados em hibridização ou, de preferência, métodos baseados em PCR (Rea-ção em Cadeia de Polimerase).

De preferência, as composições de acordo com a invençãocompreendem pelo menos 0,05%, de preferência, pelo menos 0,1%, partlcu-Iarmente de preferência pelo menos 0,5%, muito particularmente de prefe-rência pelo menos 1,0% de derivados de glicosamina N-acetilada.

De preferência, as composições de acordo com a invençãocompreendem no máximo 10%, de preferência, no máximo 5%, particular-mente de preferência no máximo 3%, muito particularmente de preferênciano máximo 2% de derivados de glicosamina N-acetilada.

Composições de acordo com a invenção oferecem a vantagemde que elas têm um teor aumentado de derivados de glicosamina N-acetilada ou um teor aumentado de glicosaminoglicanas comparado comcomposições não compreendendo células de planta genéticamente modifi-cadas. N-Acetilglicosamina tem um efeito de estimulação sobre o crescimen-to de bífido bactérias (Liepke et al, 2002, Eur. J. Biochem. 269, 712-718).

Além disso, foi mostrado que a N-Acetilglicosamina serve como um substra-to para Iactobacilos (por exemplo, Lactobaciílus casei subespécie paracasei)de intestino de peixe (Adolfo Bucio Galindo, 2004, Proefschrift, WageningenUniversiteit, ISBN 90-5808-943-6). Conseqüentemente, aN-Acetilglicosamina tem um efeito positivo sobre bactérias probióticas. Umavez que as composições de acordo com a invenção têm teores aumentadosde N-Acetilglicosamina, elas terão um efeito positivo sobre o crescimento debactérias probióticas.

A invenção, além disso, proporciona processos para o preparode uma composição de acordo com a invenção usando células de planta deacordo com a invenção, plantas de acordo com a invenção, material de pro-pagação de acordo com a invenção, partes de planta dè acordo com a in-venção ou plantas obteníveis através de um processo de acordo com a in-venção para a produção de planta genéticamente modificada. Os processospara preparo de uma composição de acordo a invenção são, de preferência,processos para produção de gêneros alimentícios, gêneros para ração ousuplementos alimentícios.

Processos para produção de gêneros alimentícios, gêneros pararação, suplementos alimentícios, produtos farmacêuticos ou produtos cos-méticos são conhecidos por pessoas versadas na técnica e compreendem, inter alia, mas não são exclusivamente limitado a, a trituração ou moagemde plantas de acordo com a invenção ou partes de planta de acordo com ainvenção.

A presente invenção também proporciona composições obtení-veis através de um processo para o preparo de uma composição de acordocom a invenção. -

A presente invenção também refere-se ao uso de células deplanta genéticamente modificada de acordo com a invenção ou plantas ge-néticamente modificada de acordo com a invenção para preparo de umacomposição de acordo com a invenção.

Uma modalidade preferida de composições de acordo com ainvenção são farinhas.

Partes de plantas são freqüentemente processadas em farinhas.Exemplos de partes de plantas as quais são usadas para preparar farinhassão, por exemplo, tubérculos de plantas de batata e grãos de plantas de ce-real. Para produzir farinhas a partir de plantas de cereal, os grãos contendoendosperma dessas plantas são triturados e peneirados. No caso de outrasplantas as quais não contêm qualquer endosperma, mas por exemplo, tu-bérculos ou raízes de armazenamento, farinha é freqüentemente produzidaatravés de moagem, secagem e subseqüente trituração das partes relevan-tes das plantas. Células de planta de acordo com a invenção e plantas deacordo com a invenção têm um teor aumentado de derivados de glicosaminaN-acetilada ou glicosaminoglicanas comparado com células de planta ouplantas conhecidas. Farinhas preparadas a partir das células de planta deacordo com a invenção, das plantas de acordo com a invenção, material depropagação de acordo com a invenção ou partes de plantas de acordo coma invenção, conseqüentemente, da mesma forma, contêm uma proporçãoaumentada de derivados de glicosamina N-acetilada ou glicosaminoglicanas.Conseqüentemente, a presente invenção, além disso, refere-seà farinhas as quais são obteníveis de células de planta de acordo com a in-venção, plantas de acordo com a invenção ou de partes de plantas de acor-do com a invenção. Partes de plantas preferidas de acordo com a invençãopara produção de farinha são tubérculos e grãos contendo endosperma. Nocontexto da presente invenção, preferência particular é dada a grãos deplantas da família (sistemática) Poaceae, especialmente de preferência osgrãos originários de plantas de milho, arroz ou trigo.

A presente invenção, além disso, refere-se à farinhas de acordocom a invenção tendo um teor de derivados de gsicosamina N-acetilada depelo menos 10 Mmoles por grama, de preferência pelo menos 20 Mmoles porgrama, mais preferivelmente pelo menos 25 pmoles por grama, particular-mente de preferência pelo menos 30 pmoles por grama, muito particular-mente de preferência pelo menos 35 Mmoles por grama e especialmente depreferência pelo menos 40 Mmoles por grama.

Farinhas de acordo com a invenção têm, de preferência, um teorde derivados de glicosamina N-acetilada de no máximo 250 Mmoles porgrama em peso fresco, de preferência no máximo 200 Mnnoles por grama empeso fresco, particularmente de preferência no máximo 150 Mmoles por gra-ma em peso fresco, muito particularmente de preferência no máximo 100Mmoles por grama em peso fresco e especialmente de preferência no máxi-mo 50 Mmoles por grama em peso fresco.

No contexto da presente invenção, o termo "farinha" deve sercompreendido como significando um pó obtido através de trituração de plan-tas ou partes de planta. Se apropriado, as plantas ou partes de planta sãosecas antes de trituração e, após trituração, ainda moídas e/ou peneiradas.

Comparado com as farinhas convencionais, as farinhas de acor-do com a invenção têm a vantagem de que elas podem ser usadas para aprodução de gêneros alimentícios tais como, por exemplo, produtos assa-dos, tendo um teor aumentado de derivados de glicosamina N-acetilada ouglicosaminoglicanas sem a necessidade de adicionar derivados de glicosa-mina N-acetilada ou glicosaminoglicanas obtidas de fontes de matéria-primaanimal ou fúngica à farinha. As desvantagens do uso de derivados de glico-samina N-acetilada ou glicosaminoglicanas isoladas das fontes de matérias-primas mencionadas tais como, por exemplo, o risco de que elas possamconter patógenos ou substâncias alérgicas, já foi antes mencionado acima.

A presente invenção, além disso, proporciona um processo paraa produção de farinhas o qual compreende a etapa de trituração de célulasde planta de acordo com a invenção, plantas de acordo com a invenção oupartes de planta de acordo com a invenção .

Farinhas podem ser produzidas através de trituração de partesde plantas. É sabido por pessoas versadas na técnica como produzir fari-nhas. Um processo para produção de farinhas também compreende, de pre-ferência, a etapa de colheita das plantas cultivadas de acordo com a inven-ção ou partes de plantas de acordo com a invenção e/ou do material de pro-pagação de acordo com a invenção e, particularmente de preferência, alémdisso, a etapa de cultivação das plantas de acordo com a invenção antes decolheita.

Em uma outra modalidade da presente invenção, o processopara produção de farinhas compreende processamento de plantas de acordocom a invenção, de partes de plantas de acordo com a invenção ou de mate-rial de propagação de acordo com a invenção.

Aqui, processamento pode, por exemplo, ser tratamento térmicoe/ou secagem. Tratamento térmico seguido por secagem do material termi-camente tratado é usado, por exemplo, quando de produção de farinhas apartir de raízes de armazenamento, tubérculos tais como, por exemplo, detubérculos de batata, antes de trituração. Moagem de plantas de acordo coma invenção de partes de plantas de acordo com a invenção ou de material depropagação de acordo com a invenção pode também constituir processa-mento no sentido da presente invenção. Remoção de tecido de planta talcomo, por exemplo, remoção da casca dos grãos, antes de trituração, tam-bém constitui processamento anterior à trituração no sentido da presenteinvenção.

Em uma outra modalidade da presente invenção, o processopara produção de farinhas compreende processamento do material trituradoapós trituração.

Aqui, o material triturado pode, por exemplo, ser peneirado apóstrituração, por exemplo, para produzir diferentes tipos de farinha.

A presente invenção, além disso, proporciona o uso de célulasde planta de acordo com a invenção, plantas de acordo com a invenção, departes de plantas de acordo com a invenção ou de material de propagaçãode acordo com a invenção para produção de farinhas.

Descrição das seqüências

SEQ ID NO 1: seqüência de ácido nucléico para codificação deuma sintase de hialuronana de Paramecium bursaria Chlorella Vírus 1.

SEQ ID NO 2: seqüência de aminoácido de uma sintase de hia-luronana de Paramecium bursaria Chlorella Vírus 1. A seqüência de aminoá-cido mostrada pode ser derivada de SEQ ID NO 1.

SEQ ID NO 3: seqüência de ácido nucléico que codifica umasintase de hialuronana de Paramecium bursaria Chlorella Vírus 1. Os códonsda seqüência mostrada foram sintetizados de uma maneira que eles sãoadaptados ao uso de códons em células de planta. A seqüência de ácidonucléico mostrada codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácidomostrada sob SEQ ID NO 2.

SEQ ID NO 4: seqüência de ácido nucléico que codifica umaproteína tendo a atividade de uma GFAT-1 de camundongo.

SEQ ID NO 5: seqüência de aminoácido de uma proteína tendoa atividade de uma GFAT-1 de camundongo. A seqüência de aminoácidomostrada pode ser derivada de SEQ ID NO 4.

SEQ ID NO 6: seqüência de ácido nucléico que codifica umaproteína tendo a atividade de uma GFAT-2 de camundongo.

SEQ ID NO 7: seqüência de aminoácido de úma proteína tendoa atividade de uma GFAT-2 de camundongo. A seqüência de aminoácidomostrada pode ser derivada de SEQ ID NO 6.

SEQ ID NO 8: seqüência de ácido nucléico que codifica umaproteína tendo a atividade de uma GFAT bacteriana de Escherichia eoli.SEQ ID NO 9: seqüência de aminoácido de uma proteína tendoatividade de uma GFAT de Escherichia coli. A seqüência de aminoácidomostrada pode ser derivada de SEQ ID NO 8.

SEQ ID NO 10: seqüência de ácido nucléico sintética que codifi-ca uma proteína tendo a atividade de uma GFAT de Escherichia coli. Os có-dons da seqüência mostrada foram sintetizados de uma maneira que elessão adaptados ao uso de códons em células de planta. A seqüência de áci-do nucléico mostrada codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoáci-do mostrada sob SEQ ID NO 9.

SEQ ID NO 11: seqüência de ácido nucléico que codifica umaproteína tendo atividade de uma dehidrogenase de UDP-glicose de Parame-cium bursaria Chlorella Vírus 1.

SEQ ID NO 12: seqüência de aminoácido de uma proteína tendoatividade de uma dehidrogenase de UDP-glicose de Paramecium bursaria

A 5 Chlorella Vírus 1. A seqüência de aminoácido mostrada pode ser derivadade SEQ ID NO 11.

SEQ ID NO 13: seqüência de ácido nucléico sintética que codifi-ca uma proteína tendo a atividade de uma dehidrogenase de UDP-glicose deParamecium bursaria Chlorella Vírus 1. Os códons da seqüência mostradaforam sintetizados de uma maneira que eles são adaptados ao uso de có-dons em células de planta. A seqüência de ácido nucléico mostrada codificauma proteína tendo a seqüência de aminoácido mostrada sob SEQ ID NO12.

SEQ ID NO 14: oligonucleotídeo sintético o qual foi usado noexemplo 6.

SEQ ID NO 15: oligonucleotídeo sintético o qual foi usado noexemplo 6.

SEQ ID NO 16: oligonucleotídeo sintético o qual foi usado noexemplo 15.

SEQ ID NO 17: oligonucleotídeo sintético o qual foi usado noexemplo 15.

Os conteúdos de todas as publicações citadas, incluindo os nú-meros de acesso de moléculas de ácido nucléico e seqüências de aminoáci-do mencionadas para bancos de dados de seqüência são incorporados porreferência à descrição do pedido.

Métodos os quais podem ser usados com relação à presenteinvenção são descritos abaixo. Esse métodos são modalidades específicas;contudo, a presente invenção não está limitada a esses métodos. É sabidopor pessoas versadas na técnica que a invenção pode ser realizada damesma maneira através de modificação dos métodos descritos e/ou substi-tuição de métodos individuais ou partes de métodos por métodos alternati-vos ou partes de métodos alternativas.

Métodos Gerais

1. Transformação de plantas de batata

Plantas de batata foram transformadas com o auxílio de Agro-bacterium, conforme descrito em Rocha-Sosa e outros (EMBO J. 8, (1989),23-29).

2. Transformação de plantas de tomate

Plantas de tomate foram transformadas com o auxílio de Agro-bacterium de acordo com o método descrito na US 5.565.347.

3. Transformação de plantas de arroz

Plantas de arroz foram transformadas de acordo com o métododescrito por Hiei et al (1994, Plant Journal 6(2), 271 -282).

4. Determinação do teor de alicosaminas N-acetiladas

Derivados de glicosamina N-acetilada tendo uma extremidadereduzida foram determinados similarmente ao método de Elson e Morgan(1933, J Biochem. 27, 1824) e o método de determinação colorimétrica deReissig et al (1955, Biol. Chem. 217, 959-966). O método de determinaçãocolorimétrica é baseado em uma reação de cromogênio Ill (Muckenschnabelet al, 1998, Câncer Letters 131, 13-20) com p-dimetilaminobenzaldeído(DMAB, reagente de Ehrlich), proporcionando um produto vermelho cujaconcentração pode ser determinada fotometricamente.

a) Processamento do material de planta

Primeiro, material de planta colhido foi moído. Dependendo daquantidade de material de planta usado, moagem foi realizada em um moi-nho de esferas oscilante de laboratório (MM200, da Retsch, Alemanha) du-rante 30 segundos a 30 Hz ou usando um misturador Warring em uma velo-cidade máxima de 30 segundos. Em geral, 0,5 g de material de planta tritu-rado (por exemplo, folha, tubérculo ou grão de arroz) foram misturados com1 ml de uma solução consistindo em ácido perclórico a 7%, EGTA a 5 mM eincubados sobre gelo durante 20 minutos. A mistura foi, então, centrifugada(5 minutos a 16 000 χ g, 4°C). O sobrenadante obtido após centrifugação foicaptado e neutralizado usando uma solução consistindo em KOH a 5M, TEAa 1M (pH ajustado para 7,0) e, então, centrifugado novamente (5 min a 16000 χ g, 4°C). Após o final da centrifugação, o sobrenadante foi captado, seuvolume foi determinado e a quantidade de derivados de glicosamina N-acetilada tendo uma extremidade reduzida foi determinada usando o métododescrito sob b).

b) Determinação do teor de derivados de glicosamina N-acetilada tendo ex-tremidades reduzidas

20 μΙ de uma solução consistindo em K2B4O7 a 0,8M, pH de 9,6,são adicionados a 100 μΙ do extrato de planta obtido através do método des-crito sob a) e, após mistura completa, aquecida a 95°C durante 5 min. Apósesfriar a mistura para a temperatura ambiente, 0,7 ml de reagente de Ehrlich(solução consistindo em 10 g de DMAB em 12,5 ml de HCI concentrado,87,5 ml de ácido acético glacial, diluído a 1:10 com ácido acético glacial) sãoadicionados à mistura, a qual é misturada novamente e incubada a 37°Cdurante mais 30 minutos. A mistura é, então, centrifugada a 16 000 χ g du-rante 1 minuto, e a densidade óptica (OD) do sobrenadante obtido após cen-trifugação é subseqüentemente determinada em um fotômetro a 585 nm.

c) Cálculo da concentração de derivados de glicosamina N-acetilada

Primeiro, uma curva de calibração foi estabelecida usando quan-tidades definidas de 6-fosfato de N-acetilglicosamina. Para essa finalidade, aOD de soluções compreendendo O mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM e 10mM de 6-fosfato de N-acetilglicosamina foi determinada de acordo com ométodo descrito sob b).A curva de calibração foi estabelecida no Microsoft Excel adap-tando-se uma tendência polinômica de segunda grandeza / linha de regres-são da fórmula y = ax2 + bx + c ou y = x2 + px + q aos pontos medidos paraas concentrações individuais. Para calcular os valores, a equação obtida foiresolvida para x, resultando em: χ = -p/2 - raiz quadrada (p2 / 4 - q), onde ρ= b / a, q = (c-y) / a e y é a OD medida da amostra desconhecida. Levando-se em conta o peso fresco empregado, o volume usado e levando-se emconta qualquer fator de diluição usado, os teores foram calculados em μητιοΙ(da solução medida) ou em pmol por g em peso fresco.

5. Isolamento de glicosaminoqlicanas de tecidos de planta usando o exem-plo de hialuronana

Para detectar a presença de hialuronana e determinar o teor dehialuronana em tecido de planta, material de planta foi processado comosegue: 200 μΙ de água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ) foram adi-cionados a cerca de 0,3 g de folha ou material de tubérculo e a mistura foimoída em um moinho de esferas oscilante de laboratório (MM200, da Rets-ch, Alemanha) (30 seg a 30 Hz). Mais 800 μΙ de água (desmineralizada,condutividade = 18 ΜΩ) foram, então, adicionados, e a mistura foi bem mis-turada (usando, por exemplo, um misturador Vortex). Os restos de célula ecomponentes insolúveis foram separados do sobrenadante através de centri-fugação a 16 000 χ g durante 5 minutos. Uma alíquota do sobrenadante ob-tida foi usada para determinar a quantidade de hialuronana.

No caso de frutos de tomate, em cada caso, uma fruto de tomatemadura inteira foi processada. Para essa finalidade, o peso da fruto de toma-te foi determinado, o tomate foi moído em um misturador Warring com poucaágua, a amostra moída foi liberada dos restos de célula através de centrifu-gação á 3600 χ g durante 30 minutos e o volume do extrato foi determinado.Uma alíquota do sobrenadante obtida foi usada para determinar a quantida-de de hialuronana.

6. Purificação de glicosaminoqlicanas usando o exemplo de hialuronana

Após a adição de 100 ml de água (desmineralizada, condutivi-dade =18 ΜΩ), cerca de 100 gramas de material de planta foram moídos emum misturador Warring na velocidade máxima durante cerca de 30 segun-dos. Se partes relativamente grandes de plantas, tais como, por exemplo,tubérculos ou frutos de tomate foram usados para isolamento, elas foramcortadas previamente em pedaços com tamanho de cerca de 1 cm3'. Os res-tos de célula foram, então, removidos usando um coador de chá. Os restosde célula os quais tinham sido separados foram, mais uma vez, suspensosem 300 ml de água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ) e novamenteremovidos usando um coador de chá. As duas suspensões obtidas (100 ml +300 ml) foram combinadas e centrifugadas a 13 000 χ g durante 15 minutos.NaCI foi adicionado ao sobrenadante de centrifugação obtido até que umaconcentração final de 1% tivesse sido atingida. Após o NaCI ter entrado emsolução, precipitação foi realizada através da adição de duas vezes o volu-me de etanol, seguido por mistura completa e substituinte a -20°C durante anoite. A mistura foi, então, centrifugada a 13 000 χ g durante 15 minutos. Oprecipitado sedimentado obtido após essa centrifugação foi dissolvido em100 ml de tampão (TrisHCI a 50 mM, pH de 8, CaCI2 a 1 mM) e proteinase Kfoi, então, adicionada até uma concentração final de 100 Mg/ml e a soluçãofoi incubada a 42°C durante 2 horas. Isso foi seguido por 10 minutos de in-cubação a 95°C. Mais uma vez, NaCI foi adicionado a essa solução até queuma concentração final de 1% tivesse sido atingida. Após o NaCI ter entradoem solução, outra precipitação foi realizada através da adição de duas vezesum volume de etanol, mistura completa e incubação a -20°C durante cercade 96 horas. Isso foi seguido por 15 minutos de centrifugação a 13 000 χ g.

O precipitado sedimentado obtido após essa centrifugação foi dissolvido em30 ml de água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ), e mais uma vez,NaCI foi adicionado até uma concentração final de 1 %. Através da adição deduas vezes o volume de etanol, mistura completa e incubação at -20°C du-rante a noite, outra precipitação foi realizada. O precipitado obtido após sub-seqüente centrifugação a 13 000 χ g durante 15 minutos foi dissolvido em 20ml de água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ).

Purificação adicional foi realizada através de filtração centrífuga.Para essa finalidade, em cada caso, 5 ml do precipitado dissolvido foramaplicados a um filtro corri membrana (CentriconAmicon, largura d© poro 10000 NMWL, Prod. N2 UCF8 010 96) e a amostra foi centrifugada a 2200 χ gaté que apenas cerca de 3 ml da solução acima restasse no filtro. Mais duasvezes, em cada caso, 3 ml de água (desmineralizada, condutividade = 18ΜΩ) foram, então, adicionados à solução acima na membrana e em, cadacaso, recentrifugados sob condições idênticas até que, no final, apenas cer-ca de 3 ml da solução acima restassem no filtro. As soluções ainda presen-tes acima na membrana após filtração centrífuga foram tomadas e a mem-brana foi enxaguada repetidamente (três a cinco vezes) com cerca de 1,5 mlde água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ). Todas as soluções asquais ainda estavam presentes acima da membrana e as soluções obtidasdo enxágüe foram combinadas, NaCI foi adicionado até uma concentraçãofinal de 1%, após o NaCI ter entrado em solução, duas vezes o volume deetanol foi adicionado, a amostra foi misturada e um precipitado foi obtido a-través de armazenamento a -20°C durante a noite. O precipitado obtido apóssubseqüente centrifugação a 13 000 χ g durante 15 minutos foi dissolvidoem 4 ml de água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ) e, então, Iiofili-zado (24 horas sob uma pressão de 37 Pa (0,37 mbar), aparelho de Iiofiliza-ção Christ Alpha 1-4, da Christ, Osterode, Alemanha).

7. Detecção de hialuronana e determinação do teor de hialuronana

Hialuronana foi detectada usando um teste comercial (kit testede ácido hialurônico (HA) da Corgenix, Inc., Colorado, EUA, Prod. Ne 029-001) de acordo com as instruções do fabricante, as quais são aqui incorpo-radas à descrição como forma de referência. O princípio do teste é baseadona disponibilidade de uma proteína a qual se liga especificamente à hialuro-nana (HABP) e é realizado similarmente a um ELISA, onde reação coloridaindica o teor de hialuronana na amostra examinada. Conseqüentemente,para a determinação quantitativa de hialuronana, as amostras a serem me-didas deverão ser empregadas em uma concentração de modo que ela este-ja dentro dos limites estabelecidos (por exemplo: diluição da amostra emquestão ou uso de menos água para extração de hialuronana de tecido deplanta, dependendo se um limite foi excedido ou não atingido).8. Determinação da atividade de uma GFAT

A atividade de uma proteína tendo a atividade de uma GAFT édeterminada conforme descrito em Rachel et al (1996, J. Bacteriol. 178 (8),2320-2327).

Para distinguir se uma proteína tem a atividade de uma GFAT-1ou GFAT-2, o método descrito em Hu et al (2004, J. Biol. Chem. 279 (29),29988-29993) é usado.

9. Detecção de derivados de qlicosamina N-acetilada através de espectro-metria de massa

Para detectar derivados de glicosamina-N-acetilada através deespectrometria de massa. Para detectar derivados de glicosamina N-acetilada, um tecido de planta foi processado conforme sob Métodos Gerais,Item 4 a). Para obter um extrato tão livre de sal quanto possível, as respecti-vas amostras foram, antes de exame através de espectrometria de massa,inicialmente congeladas a -20°C e descongeladas durante centrifugação (16000 χ g em temperatura ambiente). Para a medição, o sobrenadante foi dilu-ído para 1:20 com uma mistura de metanol: água em uma taxa de 1:1 (volu-me/volume).

Para aumentar a sensibilidade de detecção para sinais fracos(picos) os espectros de EM com três diferentes sensibilidades de detectorforam registrados. Contudo, nesse caso, a resposta do detector não é maislinear, o que é notado quando as intensidades de sinal (áreas de pico) dediferentes metabólitos são comparadas e o que deverá ser levado em conta.Para assegurar que as medições podem ser comparadas umas com as ou-tras, foi assegurado que amostras individuais proporcionam intensidades desinal idênticas (em cps, contagens por segundo) no mesmo ajuste do detector.

As áreas dos sinais resultantes (áreas dé pico) atribuídas aosdiferentes metabólitos são estabelecidas com relação à área de pico de he-xoses (m/z=179) em %. A proporção das intensidades de sinal (áreas depico) em diferentes amostras pode ser usada para inferir as proporções deconcentração dos derivados de glicosamina N-acetilada correspondentescom relação à concentração de hexoses na amostra em questão.

Medições de EM-EM de amostras individuais e de substanciasde referência correspondentes (glicosamina, N-acetil glicosamina, 6-fosfatode glicosamina, 1-fosfato de glicosamina, 6-fosfato de N-acetilglicosamina,1-fosfato de N-acetilglicosamina, UDP-N-acetilglicosamina) foram realizadasem paralelo. Dessa forma, é possível avaliar se o sinal (pico) usado paradeterminação da área é um sinal gerado exclusivamente por um metabólitoespecífico ou por metabólitos isoméricos específicos tendo a mesma massaou se o sinal em questão pode ser atribuído apenas parcialmente ao meta-bólito correspondente ou aos metabólitos isoméricos específicos correspon-dentes tendo a mesma massa.

Os espectros de EM e EM-EM foram registrados no modo nega-tivo usando um espectrômetro de massa Q-STAR Pulsar i hybrid da AppliedBiosystems adaptado com uma fonte de nano-eletropulverização. Os íonsdetectados eram principalmente íons desprotonados com uma única carga.As medições foram realizadas sob as seguintes condições:Faixa de Massa: 50-700 Da.

Sensibilidade do Detector: 2000, 2050 e 2100Para cada um dos três ajustes do detector, foi assegurado queas amostras tinham intensidade de sinal similares (em cps, contagens porsegundo).

Exemplos

1. Aquisição de seqüências de ácido nucléico que codificam uma proteínatendo a atividade de uma GFAT-1 de camundonoo

A seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína tendoatividade de uma GFAT-1 (glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase ouglicosamina 6-fosfato sintase, EC 2.6.1.16) foi adquirida da BioCat GmbH,Heidelberg, Alemanha (Art. Ns MMM1013-65346, clone de cDNAMGC:58262, IMAGE:6742987). Esse é um clone o qual é produzido atravésdo consórcio I.M.A.G.E. (http://image.llnl.gov) e distribuído pela BioCat Gm-bH. O cDNA que codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-1 foiclonado no vetor pCMV Sport 6 da Invitrogen. O plasmídeo foi denominadoIC 365-256. A seqüência de ácido nuciéico que codifica a proteína tendo aatividade de uma GFAT-1 de Mus musculus é mostrada sob SEQ ID NO 4.

Para facilitar subseqüentes etapas de clonagem, a seqüênciade codificação da GFAT-1 foi excisada usando Xho I e Eco RV do plasmídeoIC 365-256 e clonada no plasmídeo pME9, o qual tinha sido cortado com asmesmas endonucleases de restrição. O plasmídeo obtido foi denominado IC367-256.

O plasmídeo pME9 é um vetor pBlueSkript da Stratagene (Prod.N9 212207) onde, em contraste ao vetor pBlueSkript mencionado, o pME9contém um Sítio_ Múltiplo de Clonagem (MCS) modificado o qual, além doMCS presente no vetor pBlueSkript, tem um sítio de restrição Pac I adicionalem ambas as extremidades do MCS.

2. Aquisição de uma seqüência de ácido nuciéico que codifica uma proteínatendo a atividade de uma GFAT-2 de um camundonoo

A seqüência de ácido nuciéico que codifica uma proteína tendo aatividade de uma GFAT-2 (glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase ouglucosamina 6-fosfato sintase, EC 2.6.1.16) foi adquirida da Invitrogen (Clo-ne ID 4167189, clone de cDNA MGC: 18324, IMAGE: 4167189). Esse é umclone produzido pelo consórcio I.M.A.G.E. (http://image.llnl.gov) e distribuídopela Invitrogen. O cDNA que codifica uma proteína tendo a atividade de umaGFAT-2 foi clonado no vetor pCMV Sport 6 da Invitrogen. O plasmídeo foidenominado IC 369-256. A seqüência de ácido nuciéico que codifica a prote-ína tendo a atividade de uma GFAT-2 de Mus musculus é mostrada sobSEQ ID NO 6.

3. Síntese das seqüências de ácido nuciéico que codificam uma proteínatendo a atividade de uma GFAT bacteriana de Escherichia coli

A seqüência de ácido nuciéico que codifica uma proteína tendo aatividade de uma GFAT bacteriana (glutamina:frutose 6-fosfato amidotrans-ferase ou glicosamina 6-fosfato sintase, gims, EC 2.6.1.16) de Escherichiacoli foi sintetizada pela Entelechon GmbH e clonada no vetor pCR4Topo daInvitrogen (Prod. N2 K4510-20). O plasmídeo obtido foi denominado IC 373-256. A seqüência de ácido nuciéico sintética que codifica a proteína tendo aatividade de uma GFAT bacteriana de Escherichia coli é mostrada sob SEQID NO 10. A seqüência de ácido nucléico correspondente originalmente iso-lada de Eseheriehia eoiié mostrada sob SEQ ID NO 8.

4. Síntese de moléculas de ácido nucléico que codificam uma sintase de hia-luronana de Parameeium bursaria Chlorella Vírus 1

A seqüência de ácido nucléico que codifica uma sintase de hialu-ronana de Parameeium bursaria Chlorella Vírus 1 foi sintetizada pela Medi-genomix GmbH (Munich, Alemanha) e clonada no vetor pCR2.1 da-Invitro-gen (Prod. Ns K2000-01). O plasmídeo obtido foi denominado IC 323-215. Aseqüência de ácido nucléico que codifica a proteína HAS de Parameeiumbursaria Chlorella Vírus 1 é mostrada sob SEQ ID NO 3. A seqüência de á-cido nucléico correspondente originalmente isolada de Parameeium bursariaChlorella Vírus 1 é mostrada sob SEQ ID NO 1.

5. Síntese de moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína tendoa atividade de uma Dehidroqenase de UDP-qlicose de Parameeium bursariaChlorella Vírus 1.

A seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo aatividade de uma Dehidrogenase de UDP-glicose de Parameeium bursariaChlorella Vírus 1 foi sintetizada pela Entelechon GmbH e clonada no vetorpCR4Topo da Invitrogen (Prod. Nq K4510-20). O plasmídeo obtido foi deno-minado IC 339-222. A seqüência de ácido nucléico sintética que codifica aproteína tendo a atividade de uma Dehidrogenase de UDP-glicose de Para-meeium bursaria Chlorella Vírus 1 é mostrada sob SEQ ID NO 13. A se-qüência de ácido nucléico correspondente originalmente isolada de Parame-eium bursaria Chlorella Vírus 1 é mostrada sob SEQ ID NO 11.

6. Preparo do vetor de expressão de planta IR 47-71

O plasmídeo pBinAR é uma derivado do plasmídeo de vetor bi-nário pBin19 (Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711-8721) o qual foi cons-truído como segue:

um fragmento de A 529 bp compreendendo os nucleotídeos6909-7437 do promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor foi isolado comoum fragmento EeoR MKpn I do plasmídeo pDH51 (Pietrzak et al, 1986 Nucle-ic Acids Res. 14, 5858) e ligado entre os sítios de restrição EcoR I e Kpn I dopoliligante do pUC18. Isso proporcionou o plasmídeo pUC18-35S. Com auxí-lio das endonucleases de restrição Hind Ill e Pvu II, um fragmento de 192 bpcompreendendo o sinal de poliadenilação (3'-terminal) do gene de sintase deoctopina (Gen 3) do T-DNA do plasmídeo Ti pTiACH5 (Gielen et al, 1984,EMBO Journal 3, 835-846) (nucleotídeos 11749-11939) foi isolado do plas-mídeo pAGV40 (Herrera-Estrella et al, 1983 Nature1 303, 209-213). Após aadição de Iigantes Sph I ao sítio de restrição Pvu II, o fragmento foi ligadoentre os sítios de restrição Sph I e Hind Ill do pUC18-35S. Isso proporcionouo plasmídeo pA7. A partir desse plasmídeo, o poliligante todo compreenden-do o promotor 35S e o terminador OCS foi excisado com EcoR I e Hind Ill eligado no vetor apropriadamente cortado pBin 19. Isso proporcionou o vetorde expressão de planta pBinAR (Hõfgen e Willmitzer, 1990, Plant Science66,221-230).'

O promotor do gene B33 de Patatina de Solanum tuberosum(Rocha-Sosa et al, 1989, EMBO J. 8, 23-29) foi ligado como um fragmentoDra I (nucleotídeos -1512 - +14) no vetor pUC19, o qual tinha sido cortadocom Sst I e cujas extremidades tinham sido cegas com o auxílio de polime-rase T4-DNA. Isso proporcionou o plasmídeo pUC19-B33. Usando EcoR I eSma I, o promotor B33 foi excisado desse plasmídeo e ligado no vetor apro-priadamente cortado pBinAR. Isso proporcionou o vetor de expressão deplanta pBinB33.

Para facilitar outras etapas de clonagem, o MCS (Sítio de Clo-nagem Múltipla) foi ampliado. Para essa finalidade, dois oligonucleotídeoscomplementares foram sintetizados, aquecidos a 95°C durante 5 minutos elentamente esfriados para a temperatura ambiente e o fragmento fita duplaobtido foi clonado nos sítios de restrição Sal I e Kpn I do pBinB33. Os oligo-nucleotídeos usados para essa finalidade tinham a seguinte seqüência:

5'-TCG ACA GGC CTG GAT CCT TAA TTA AAC TAG TCT CGA GGA GCTCGG TAC-3'

5'-CGA GCT CCT CGA GAC TAG TTT AAT TAA GGA TCC AGG CCT G-31

O plasmídeo obtido foi denominado IR 47-71.7. Preparo do vetor de expressão de planta pBinARHvaUsando as endonucleases de restrição EcoR I e Hind Ill1 o frag-mento compreendendo o promotor 35S, o terminador OCS e o sítio de clo-nagem múltipla inteiro foi excisado do plasmídeo pA7 e clonado no vetorpBIBHyg (Becker, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 203) o qual tinha sido corta-do com as mesmas endonucleases de restrição. O plasmídeo obtido foi de-nominado pBinARHyg.

8. Preparo do vetor de clonagem IG 317-204Fragmentos de ácido nucléico compreendendo o terminadorOCS foram isolados do plasmídeo IR 47-71 usando as endonucleases derestrição Xho I e Hind Ill e clonados no vetor pBlueScript KS (da Stratagene,Prod. Nq 212207), o qual tinha sido cortado com as mesmas endonucleasesde restrição. O plasmídeo obtido foi denominado IC 306-204.

Fragmentos de ácido nucléico compreendendo o promotor B33foram isolados do plasmídeo IR 47-71 usando as endonucleases de restri-ção Bam Hl e Eco Rl e clonados no vetor pBlueScript KS (da Stratagene,Prod. Ns 212207), o qual tinha sido cortado com as mesmas endonucleasesde restrição. O plasmídeo obtido foi denominado IC 314-204.

A partir do IC 306-204, o terminador OCS foi isolado usando aendonuclease de restrição Bam Hl e clonado no plasmídeo IC 314-204, oqual tinha sido cortado com a mesma endonuclease de restrição. O plasmí-deo obtido foi denominado IC 317-204.

9. Preparo do vetor de expressão de planta IC 341 -222 compreendendo umaseqüência de ácido nucléico de codificação para um sintase de hialuronanade Paramecium bursaria Chlorella Vírus 1

Através de digestão por restrição com BamH I e Xho I, molécu-las de ácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação de sintasede hialuronana foram isoladas do plasmídeo IC 323-215 e clonadas nos sí-tios de restrição BamH I e Xho I do plasmídeo IR 47-71. O vetor de expres-são de planta obtido foi denominado IC 341-222.10. Preparo do vetor de expressão de plantas 349-222 compreendendo asseqüências de ácido nucléico de codificação para uma proteína tendo a ati-vidade de uma Dehidroaenase de UDP-qlicose de Paramecium bursaria C-hlorella Vírus 1

Usando digestão por restrição com BamH I e Kpn I, moléculasde ácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação para uma pro-teína tendo a atividade de uma Dehidrogenase de UDP-glicose de Parame-cium bursaria Chlorella Vírus 1 foram isoladas do plasmídeo IC 339-222 eclonadas no plasmídeo pA7, o qual tinha sido cortado com as mesmas en-donucleases de restrição. Q plasmídeo obtido foi denominado IC 342-222.Através de digestão por restrição com Xba I e Kpn I, moléculas de ácido nu-cléico compreendendo a seqüência de codificação para uma proteína tendoa atividade de uma Dehidrogenase de UDP-glicose de Paramecium bursariaChlorella Vírus 1 foram isoladas do plasmídeo IC 342-222 e clonadas no ve-tor de expressão pBinAR Hyg1 o qual tinha sido cortado com Xba I e Kpn I. Oplasmídeo obtido foi denominado IC 349-222.

11. Preparo do vetor de expressão de plantas IC 376-271 compreendendoas seqüências de ácido nucléico de codificação para uma proteína tendo aatividade de uma GFAT-1 de camundonqo e para uma proteína tendo a ati-vidade de uma Dehidroqenase de UDP-qlicose de Paramecium bursaria C-hlorella Vírus 1.

Um fragmento de ácido nucléico compreendendo o promotorB33 e o terminador OCS, fragmento o qual tinha sido isolado do IC 317-204através de digestão por restrição usando Eco RI, foi clonado no sítio de res-trição Eco Rl do plasmídeo IC 349-222. Aqui orientação cabeça - a - cabeçados promotores (25S e B33) foi assegurada. O vetor obtido foi denominadoIC 354-222.

Para obter um vetor de expressão de planta compreendendouma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo a ativida-de de uma GFAT-1 de camundongo, a seqüência de codificação da proteínatendo a atividade de uma GFAT-1 de camundongo foi isolada através dedigestão por restrição com Xho I e Eco RV do IC 365-256 e clonada noplasmídeo IC 354-222, o qual tinha sido cortado com Xho I e Ecl136 II. Ovetor de expressão de planta obtido foi denominado IC 376-256.

12. Preparo do vetor de expressão de planta IC 372-256 compreendendo asseqüências de ácido nucléico de codificação para uma proteína tendo a ati-vidade de uma GFAT-2 de camundonao e para uma proteína tendo a ativi-dade de uma Dehidroqenase de UDP-qlicose de Paramecium bursaria Chlo-rella Vírus 1.

Um fragmento de ácido nucléico compreendendo a seqüência decodificação da proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 de camundongofoi isoladado IC 369-256 através de digestão por restrição com Xho I e EcoRV e clonado no plasmídeo IC 354-222, o qual tinha sido cortado com Xho Ie Ec/136 II. O vetor de expressão de planta obtido foi denominado IC 372-256.

13. Preparo do vetor de expressão de planta 375-271 compreendendo se-qüências de ácido nucléico de codificação para uma proteína tendo a ativi-dade de uma GFAT de Escherichia coli e para uma proteína tendo a ativida-de de uma Dehidroqenase de UDP-qlicose de Paramecium bursaria Chlorel-Ia Vírus 1.

Um fragmento de ácido nucléico compreendendo a seqüência decodificação da proteína tendo atividade de uma GFAT de Eseherichia coli foiisolado do IC 373-256 através de digestão por restrição com Xho I e Eco RVe clonado no plasmídeo IC 354-222, o qual tinha sido cortado com Xho I eEc/136 II. O vetor de expressão de planta obtido foi denominado IC 375-271.

14. Preparo do vetor de expressão de planta IC 398-311 compreendendouma seqüência de ácido nucléico de codificação para uma proteína tendo aatividade de uma GFAT de Escherichia coli

Através de digestão por restrição com Ecl 136 I e Xho I, a se-qüência de codificação da proteína tendo a atividade de uma GFAT bacteri-ana de E. coli foi isolada do plasmídeo IC 373-256 e ligada nos sítios de res-trição Sma I e Sal I do vetor pBinAR Hyg. O vetor de expressão de plantaobtido foi denominado IC 398-311.15. Preparo do vetor de expressão de planta IC 386-299

Através de PCR usando DNA genômico isolado de folhas de ar-roz (Oryza sativa, cultivar M202j usando DNA polimerase (Expand High Fi-delity PCR Systems, Roche Prod. N3: 1732641), o DNA do promotor de pro-lamina de arroz (Acesso ao EMBL NO D63901, Sha et al, 1996, Biosci. Bio-tech. Biochem. 60, 335 - 337, Wu et al, 1998, Plant Cell Physiol.-39 (8), 885- 889) foi isolado. O amplicon obtido a partir dessa reação de PCR foi clona-do no vetor pCR 2.1 usando o kit de clonagem TA (Invitrogen Prod. No.:KNM2040-01). O plasmídeo obtido foi denominado Ml 4-154. Condições u-sadas para a amplificação do DNA que codifica o promotor de prolamina: -as condições e tampões estabelecidos pelo fabricante e 50 ngde DNA total foram usados.

Mistura de dNTP a 0,83 μΜPrimer prol-F1 a 0,25 μΜ5 '-AAAAACTAGTTCTACATCGGCTTAGGTGTAGCAACACGPrimer prol-R1 a 0,25 μΜ5'- AAAAGATATCTGTTGTTGGATTCTACTACTATGCTTCAACondições de reação:Etapal 94°C 15seg

Etapa 2 60°C 15seg

Etapa 3 72°C 45 seg

Primeiro, a reação de acordo com as Etapas 1 a 3 foi realizadausando 35 repetições (ciclos). Após a reação ter terminado, a mistura dereação foi esfriada para 4°C. Subseqüente clonagem no vetor pCR 2.1 u-sando o kit de clonagem TA (Invitrogen Prod. N9: KNM2040-01) foi realizadaseguindo as condições estabelecidas pelo fabricante. O plasmídeo contendoo promotor de prolamina de arroz foi denominado Ml 4-154.

Um fragmento de ácido nucléico compreendendo uma seqüênciade codificação da proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 de camundon-go foi isolado através de digestão por restrição usando as endonucleases derestrição Not I e Kpn I do plasmídeo IC 369-256 e clonado no vetor pMCS5(adquirido da MoBiTec), o qual tinha sido digerido com Not I e Kpn I. Oplasmídeo obtido foi denominado IC 385-299. Na próxima etapa, o fragmen-to de ácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação da proteínatendo a atividade de uma GFAT-2 de camundongo foi isolado através dedigestão por restrição com as endonucleases de restrição Xho I e Hpa I doIC 385-299 e clonado no plasmídeo Ml 9-154, o qual tinha sido cortado comXho I e Ech36 II. O vetor de expressão de planta obtido foi denominado IC386-299. O vetor inicial para o preparo do vetor Ml 9-154 é o plasmídeo ML18-56 (WO 05/030941). Um MCS sintetizado por dois oligonucleotídeos etendo as extremidades aderentes apropriadas e compreendendo os sítios derestrição Pst I, Sac I, Bln I, Xho I, Hpa I, Spe I e Hind fA foi introduzido noplasmídeo ML 18-56, o qual tinha sido digerido com Hind Ill e Pst I. O vetorobtido foi denominado Ml 8-154.

Através de digestão com Eco RV e Spe I, o promotor de prola-mina foi isolado do Ml 4-154 e ligado no vetor Ml 8-154, o qual tinha sidodigerido com Hpa I e Spe I. O vetor obtido foi denominado Ml 9-154.

16. Plantas de batata compreendendo uma molécula de ácido nucléico quecodifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT bacteriana

a) Transformação de plantas de batataPlantas de batata (cultivar Désirée) foram transformadas atravésdo método fornecido em Métodos Gerais, Item 1 usando o vetor de expres-são de planta IC 398-311, o qual compreende uma seqüência de ácido nu-cléico de codificação para uma proteína tendo a atividade de uma GFATbacteriana de Escherichia coii sob o controle do promotor do gene B33 depatatina de Soianum tuberosum (Rocha-Sosa et al, 1989, EMBO J. 8, 23-

29). As linhagens transgênicas obtidas, as quais são transformadas com oplasmídeo IC 398-311, foram denominadas 432 ES.

b) Análise das linhagens 432 ESPlantas das linhagens 432 ES foram cultivadas em uma estufano solo em vasos de 6 cm. Em cada caso, cerca de 0,3 g a 0,8 g de materialde folha, coletado de plantas individuais, foi processado de acordo com ummétodo descrito sob Métodos Gerais, Item 4 e o teor de Derivados de glico-samina N-acetilada foi determinado. Para plantas individuais tendo um teoraumentado de derivados de glicosamina N-acetilada, os seguintes resulta-dos foram obtidos:

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Tabela 1: Quantidade de derivados de glicosamina N-acetilada (em pmol porgrama em peso fresco) medida em folhas de plantas transgênicas indepen-dentes das linhagens 432 ES. A coluna 1 se refere, em cada caso, à planta,independentemente obtida da transformação, da qual o material foi colhido("wt" refere-se à plantas as quais não tinham sido transformadas).

Esses resultados mostram que plantas tendo uma molécula deácido nucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividade de umaGFAT bacteriana têm um teor consideravelmente maior de derivados de gli-cosamina N-acetilada do que plantas do tipo silvestre não-transformadascorrespondentes.17. Plantas de arroz compreendendo uma molécula dé ácido nucléico auecodifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2

a) Transformação de plantas de arroz

Plantas de arroz (variedade M202) foram transformadas de a-cordo com um método fornecido sob Métodos Gerais, Item 3 com o vetor deexpressão de planta IC 386-299, o qual compreende uma seqüência de áci-do nucléico de codificação para uma proteína tendo a atividade de umaGFAT-2 de camundongo sob o controle do promotor do polipeptídeo de pro-Iamina de 13 kDa. As linhagens transgênicas obtidas, as quais são transfor-madas com o plasmídeo IC 386-299, foram denominadas GAOS0788

b) Análise das linhagens GAOSQ788

Plantas independentes, originárias da transformação com oplasmídeo IC 386-299, da linhagem GAOS0788 foram cultivadas no solo emuma estufa. De cada planta, cerca de 20-25 sementes maduras (grãos) fo-ram colhidas, as cascas foram removidas com um descascador (descasca-dor Laboratory Paddy, Grainman, Miami, Flórida, EUA) e cerca de 7 semen-tes de arroz marrom (reservatórios) de cada linhagem foram moídas em ummoinho de esferas oscilante de laboratório (MM200, da Retsch, Alemanha,30 seg a 30 Hz), resultando em uma farinha. Usando o método descrito sobMétodos Gerais, Item 4, o teor de derivados de glicosamina N-acetilada foi,então, determinado. Para plantas individuais tendo um teor aumentado dederivados de glicosamina N-acetilada, os seguintes resultados foram obtidos:

<table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>

Tabela 2: Quantidade de derivados de glicosamina N-acetilada (em pmol porgrama em peso fresco) medida em reservatórios de sementes maduras deplantas transgênicas independentes das linhagens GAOS0788. A coluna 1refere-se à planta, independentemente obtida da transformação, da qual ma-terial foi colhido (aqui, "controle" refere-se à plantas transformadas com umplasmídeo não tendo uma molécula de ácido nucléico que codifica uma pro-teína tendo a atividade de uma GFAT. Quantidades não-detectáveis sãomarcadas "n.d.".

c) Análise de sementes individuais das plantas GAQS0788-02401 eGAOS0788-00501

As sementes colhidas no Exemplo b) originadas de plantas obti-das diretamente após transformação, plantas as quais eram, assim, hetero-zigóticas com relação aos respectivos sítios de integração dos T-DNAs emquestão. Conseqüentemente, como um resultado das leis de Mendel de he-reditariedade, os reservatórios de semente analisados continham sementescompreendendo várias quantidades dos T-DNAs em questão, sendo tam-bém possível que sementes individuais não tendo quaisquer T-DNAs inte-grados através de transformação estivessem presentes nos respectivos re-servatórios. Assim, sementes marrons individuais simples das plantas daslinhagens GAOS0788-02401 e plantas das linhagens GAOS0788-00501 fo-ram, cada uma, examinadas através do método descrito sob Métodos Ge-rais, Item 4 com relação a seu teor de derivados de glicosamina N-acetilada.Os seguintes resultados foram obtidos:<table>table see original document page 68</column></row><table>

Tabela 3: Quantidade de derivados de glicosamina N-acetilada (em pmol porgrama em peso fresco) de sementes individuais das plantas de linhagensGAOS0788-02401 e GAQS0788-00501. Em cada caso, a coluna 1 refere-seà planta, independentemente obtida da transformação, da qual sementesindividuais foram colhidas e analisadas (aqui, "controle" refere-se à semen-tes de plantas transformadas com uma estrutura não compreendendo molé-cula de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo a atividade de umaGFAT). Quantidades não-detectáveis são marcadas "n.d.".

Os resultados obtidos mostram que farinhas de sementes(grãos) de plantas de arroz tendo uma molécula de ácido nucléico que codi-fica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 têm um teor considera-velmente maior de derivados de glicosamina N-acetilada comparado comfarinhas produzidas de plantas não tendo uma molécula de ácido nucléicoque codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2.

18. Síntese de derivados de glicosamina N-acetilada em plantas de tomatetransformadas com moléculas de ácido nucléico que codificam várias iso-formas de uma proteína tendo a atividade de uma GFAT

a) Produção de plantas de tomate compreendendo uma molécula de ácidonucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividade de umaG FAT-1

Plantas de tomate (cultivar Moneymaker) foram transformadasatravés do método fornecido sob Métodos Gerais, Item 2 com o vetor de ex-pressão de planta IC 376-271, o qual compreende uma seqüência de ácidonucléico de codificação para uma proteína tendo a atividade de uma dehi-drogenase de UDP-glicose e uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-1. As linhagens trans-gênicas obtidas, as quais são transformadas com o plasmídeo 376-271, fo-ram denominadas 420 ES. Proteínas tendo a atividade de uma dehidrogena-se de UDP-glicose catalisam a síntese de UDP-GIcA a partir de UDP-glicose. Além de GIcNAc, algumas sintases de glicosaminoglicana tais como,por exemplo, sintase de hialuronana, requerem UDP-GIcA como substrato.

b) Análise das linhagens 420 ES

Plantas das linhagens 420 ES foram cultivadas em hidroculturaem vasos em uma estufa. Em cada caso, cerca de 5 g de material de planta,coletado de plantas individuais, foram processados usando o método descri-to sob Métodos Gerais, Item 4 e o teor de derivados de glicosamina N-acetilada foi determinado. Aqui, por planta, uma pluralidade de mediçõesindependentes foi realizada para cada amostra processada. Os seguintesresultados foram obtidos para plantas individuais:<table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table>

Tabela 3: Quantidade de derivados de glicosamina N-acetilada (em μιηοΙ porgrama em peso fresco) medida em folhas de plantas transgênicas indepen-dentes das linhagens 420 ES. A coluna 1 refere-se à plantas independente-mente originárias da transformação, das quais o material foi colhido (aqui,"wt" refere-se à plantas não-transformadas). A extensão dos nomes dasplantas por a, b ou c denota medições independentes realizadas para a a-mostra processada em questão. Quantidades não-detectáveis são marcadas"n.d.".

Esses resultados mostram que plantas tendo uma molécula déácido nucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividade de umaGFAT-1 e codifica uma proteína tendo a atividade de uma dehidrogenase deUDP-glicose têm um teor de derivados de glicosamina N-acetilada o qual éligeiramente maior do que aquele de plantas do tipo silvestre não-transformadas correspondentes.c) Produção de plantas de tomate compreendendo uma molécula de ácidonucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividade de umaGFAT-2

Plantas de tomate (cultivar Moneymaker) foram transformadasatravés do método fornecido sobre Métodos Gerais, Item 2 com o vetor deexpressão de planta IC 372-256 compreendendo uma seqüência de ácidonucléico de codificação para uma proteína tendo a atividade de uma Dehi-drogenase de UDP-glicose e uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2. As linhagens trans-gênicas obtidas, as quais são transformadas com o plasmídeo IC 372-256,foram denominadas 421 ES.

d) Análise das linhagens 421 ES

Plantas das linhagens 421 ES foram cultivadas em hidroculturaem vasos em uma estufa. Em cada caso, cerca de 5 g de material de planta,coletado de plantas individuais, foram processados usando o método descri-to sob Métodos Gerais, Item 4 e o teor de Derivados de glicosamina N-acetilada foi determinado. Aqui, por planta, uma pluralidade de mediçõesindependentes foi realizada para cada amostra processada. Os seguintesresultados foram obtidos para plantas individuais:

<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>

Tabela 4: Quantidade de Derivados de glicosamina N-acetilada (em μιηοΙpor grama em peso fresco) medida em folhas de plantas transgênicas inde-pendentes das linhagens 421 ES. A coluna 1 refere-se à plantas indepen-dentemente originárias da transformação, das quais o material foi colhido(aqui, "wt" refere-se à plantas não transformadas). A extensão dos nomesdas plantas por a, b ou c denota medições independentes realizadas para aamostra processada em questão. Quantidades não-detectáveis são marca-das "n.d.".

Esses resultados mostram que plantas tendo uma molécula deácido nucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividade de umaGFAT-2 e que codifica uma proteína tendo a atividade de a Dehidrogenasede UDP-glicose têm um teor de Derivados de glicosamina N-acetilada o qualé consideravelmente maior do que aquele de plantas do tipo silvestre cor-respondentes não transformadas.

e) Produção de plantas de tomate compreendendo uma molécula de ácidonucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFATbacteriana

Plantas de tomate (cultivar Moneymaker) foram transformadasatravés do método fornecido sob Métodos Gerais, Item 2 com o vetor de ex-pressão de planta IC 375-271 compreendendo uma seqüência de ácido nu-cléico de codificação para uma proteína tendo a atividade de uma Dehidro-genase de UDP-glicose e uma molécula de ácido nucléico estranha que co-difica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT bacteriana. As linhagenstransgênicas obtidas, as quais são transformadas com o plasmídeo IC 375-271, foram denominadas 422 ES.

f) Análise das linhagens 422 ES

Plantas das linhagens 422 ES foram cultivadas em hidroculturaem vasos em uma estufa. Em cada caso, cerca de 5 g de material de planta,coletado de plantas individuais, foram processados usando o método descri-to sob Métodos Gerais, Item 4 e o teor de Derivados de glicosamina N-acetilada foi determinado. Aqui, por planta, uma pluralidade de mediçõesindependentes foi realizada para cada amostra processada. Os seguintesresultados foram obtidos para plantas individuais:<table>table see original document page 75</column></row><table>

Tabela 5: Quantidade de Derivados de glicosamina N-acetilada (em pmolpor grama em peso fresco) medida em folhas de plantas transgênicas inde-pendentes das linhagens 422 ES. A coluna 1 refere-sé à plantas indepen-dentemente originárias da transformação, das quais o material foi colhido(aqui, "wt" refere-se à plantas não transformadas). A extensão dos nomesdas plantas por a, b ou c denota medições independentes realizadas para aamostra processada em questão. Quantidades não-detectáveis são marca-das "n.d.".

q) Análise de frutos das linhagens 420 ES. 421 ES e 422 ES

Frutos maduros foram colhidos de linhagens de planta selecio-nadas 420 ES1 421 ES e 422 ES. Vários frutos de tomate inteiros de plantasindividuais foram colhidos e processados usando o método descrito sob Mé-todos Gerais, Item 4 e o teor de Derivados de glicosamina N-acetilada foideterminado. Aqui, medições independentes foram realizadas para diferen-tes frutos de uma planta. Os seguintes resultados foram obtidos para plantasindividuais:

<table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>

Tabela 6: Quantidade de Derivados de glicosamina N-acetilada (em μιτιοΙpor grama em peso fresco) medida em frutos de plantas transgênicas inde-pendentes das linhagens 420 ES, 421 ES e 422 ES. A coluna 1 refere-se àplantas independentemente originárias da transformação, das quais materialfoi colhido (aqui, "wt" refere-se à plantas não transformadas). A extensãodos nomes das plantas por numerais em romano denota diferentes frutosdas plantas em questão. Quantidades não-detectáveis são marcadas "n.d.".

Esses resultados mostram que plantas tendo uma molécula deácido nucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividade de umaGFAT bacteriana e que codifica uma proíôína tendo a atividade de uma De-hidrogenase de UDP-glicose têm um teor consideravelmente maior de deri-vados de glicosamina N-acetilada do que plantas do tipo silvestre não-transformadas correspondentes. Comparado com plantas tendo uma molé-cula de ácido nucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividadede uma GFAT-1 e que codifica uma proteína tendo a atividade de uma Dehi-drogenase de UDP-glicose, plantas compreendendo uma molécula de ácidonucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividade de umaGFAT-2 e que codifica uma proteína tendo a atividade de uma Dehidrogena-se de UDP-glicose têm um teor ainda maior de Derivados de glicosamina N-acetilada. Isso é verdadeiro para material de folha e para frutos das plantàsem questão.

h) Análise de Derivados de glicosamina N-acetilada da linhagem 422 ES a-través de espectrometria de massa

Extratos de diferentes frutos individuais da planta com o nome422 ES 13 foram examinados através de espectrometria de massa de acor-do com um método descrito sob Métodos Gerais, Item 9 com relação à pre-sença de Derivados de glicosamina N-acetilada. Os seguintes resultadosforam obtidos:

<table>table see original document page 79</column></row><table>

Tabela 8: Detecção dos metabólitos glicosamina (GlcN), N-acetilglicosamina(GIcNAc), fosfato de glicosamina (GIcN-P), fosfato de N-acetilglicosamina(GIcNAc-P) e UDP-N-acetilglicosamina (UDP-GIcNAc) em frutos da planta422 ES 13 através de espectrometria de massa. O que é mostrado é a pro-porção da intensidade de sinal (área de pico) obtida para o metabólito esta-belecido no espectro de massa, baseado na intensidade de sinal para hexo-ses (m/z= 179) obtida na mesma medição, em percentual. As diferentes me-dições foram realizadas nos ajustes estabelecidos do detector com relação àsensibilidade ("d.v.") e intensidade de sinal ("cps") (coluna 1). A coluna 2 de-nota a planta, independentemente originária da transformação, da qual ma-terial foi colhido (aqui, "wt" refere-se à plantas não transformadas). A exten-são dos nomes das plantas por numerais em romano denota diferentes fru-tos da planta em questão.

Em paralelo, via medições de EM-EM das amostras 422 ES 13 Ie frutos de uma planta do tipo silvestre (wt) usando substâncias de referên-cia (glicosamina, N-acetilglicosamina, 6-fosfato de glicosamina, 1 -fosfato deglicosamina, 6-fosfato de N-acetilglicosamina, 1-fosfato de N-acetilglicosamina, UDP-N-acetilglicosamina) foi analisado se as intensidadesde sinal detectadas (áreas de pico) em questão dos espectros de EM eramrealmente em virtude da presença do metabólito correspondente ou de me-tabólitos isoméricos correspondentes da mesma massa ou se as intensida-des de sinal em questão no espectro de EM foram possivelmente causadospor interferência por sinais de outras substâncias. As seguintes observaçõesforam feitas:

Glicosamina (GlcN, m/z=178): As maiores quantidades de GIcNdetectadas nos espectros de EM das amostras 422 ES 13 I e wt estavam namesma faixa do menor limite de detecção. No espectro de EM, nenhumadiferença significativa entre a amostra 422 ES 13 I e as amostras wt foi per-cebida. Conseqüentemente, não foi possível determinar com qualquer graude precisão se as amostras continham GlcN.

* N-Acetilalicosamina (GlcNAc, m/z=220): As diferenças mais sig-nificativas nos espectros de EM das amostras 422 ES 13 e da amostra wtforam encontradas para esse metabólito. Nos espectros de EM das amos-tras 422 ES 13 I, 422 ES 13 Il e 422 ES 13 III, quantidades consideradas deGIcNAc foram detectadas. O espectro de EM-EM correspondente para aamostra 422 ES 13 I corresponde ao espectro da substância de referência(N-acetilglicosamina) e têm, se alguma, apenas uma quantidade muito pe-quena de substâncias as quais podem interferir com o sinal relevante no es-pectro de EM. Em contraste, no espectro de EM da amostra wt, a intensida-de de sinal para m/z=220 era muito baixa. O espectro de EM-EM da amostrawt mostrou que GIcNAc está presente apenas vestigialmènte, se houver. Oespectro de EM-EM mostrou claramente que a intensidade de sinal determi-nada para m/z=220 da amostra wt no espectro de EM foi o resultado princi-palmente de outras substâncias que interferem com o sinal.

Fosfatos de Glicosamina (GlcN-P, m/z=258): A intensidade desinal dos espectros de EM para as amostras wt é consideravelmente menordo que para as amostras 422 ES 13 I, 422 ES 13 Il e 422 ES 13 III. Todas asamostras medidas através de EM-EM mostraram que o sinal para m/z=258não é apenas em virtude da presença de GlcN-P, mas também da interfe-rência do sinal por outras substâncias. O espectro de EM-EM da amostra wtmostrou que apenas traços de GIcN-P estão presentes, se houver. Em con-traste, o sinal correspondente para a amostra 422 ES 13 I no espectro deEM-EM, mostrou a presença de uma quantidade significativa de GIcN-P nosinal relevante do espectro de EM.

Fosfato de N-Acetilalicosamina (GlcNAc-P. m/z=300): Para aamostra de wt, a intensidade de sinal para m/z=300 no espectro de EM ésubstancialmente menor do que para as amostras 422 ES 13 I, 422 ES 13 Ile 422 ES 13 III. Os valores determinados através de EM-EM para a amostrawt mostram que, se houver, apenas traços de GIcNAc-P estão presentes.Em contraste, para a amostra 422 ES 13 foi possível demonstrar, através demedição por EM-EM, que a parte predominante da intensidade de sinal de-terminada para m/z=300 no espectro de EM dessa amostra é em virtude deGlcNAc-P.

UDP-N-Acetilqíicosamina (UDP-GIcNAc, m/z=302,5): no tipo sil-vestre, as intensidades de sinal do espectro de EM são consideravelmentemenores do que nas amostras 422 ES 13 I, 422 ES Il e 422 ES III. Os es-pectros de EM-EM correspondentes mostram que, em todas as amostras,uma determinada parte da intensidade de sinal dos espectros de EM não éem virtude da presença de UDP-GIcNAc, mas também em virtude da interfe-rência de sinal por outras substâncias. Contudo, as medições por EM-EMmostram que, comparado com as substâncias que interferem no sinal, aproporção de UDP-GIcNAc nos espectros de EM da amostra 422 ES 13 I ésubstancialmente maior do que para a amostra wt.

19. Produção de plantas as quais sintetizam glicosaminoglicanas

Para determinar se plantas tendo um teor aumentado de Deriva-dos de glicosamina N-acetilada são adequadas para produção de plantastendo um teor aumentado de glicosaminoglicana, uma primeira planta ex-pressando uma sintase de glicosaminoglicana (sintase de hialuronana) foigerada.

a) Plantas compreendendo uma molécula de ácido nucléico que codificauma proteína tendo a atividade de uma sintase de hialuronana

Plantas de batata (cultivar Désirée) e plantas de tomate (cultivarMoneymaker) foram transformadas usando o método fornecido sob MétodosGerais, Item 1 (plantas de batata) e sob Métodos Gerais, Item 2 (plantas detomate) respectivamente, com o vetor de expressão de planta IC 341-222 oqual compreende uma seqüência de ácido nucléico de codificação para umaproteína tendo a atividade de um sintase de hialuronana de Parameciumbursaria Chlorella Vírus 1 sob o controle do promotor do gene B33 de patati-na de Solanum tuberosum (Rocha-Sosa e outros, 1989, EMBO J. 8, 23-29).As linhagens transgênicas obtidas, as quais são transformadas com o plas-mídeo IC 341-222, foram denominadas 365 ES (plantas de batata) e 367 ES(plantas de tomate), respectivamente.

b) Análise das linhagens 365 ES

Plantas individuais das linhagens 365 ES foram cultivadas nosolo em vasos de 6 cm em uma estufa. Em cada caso, cerca de 0,3 g dematerial de tubérculos de batata das plantas individuais foram processadosusando o método descrito sob Métodos Gerais, Item 5. A quantidade de hia-luronana presente nos respectivos extratos de planta foi determinada usandoo método descrito sob Métodos Gerais, Item 7. Aqui, o sobrenadante obtidoapós centrifugação foi diluído para 1:10 a fim de determinar o teor de hialu-ronana. Os seguintes resultados foram obtidos para plantas selecionadas:<table>table see original document page 83</column></row><table>

Tabela 9: Quantidade de hialuronana (em pg por grama em peso fresco)produzida por plantas transgênicas selecionadas independentes da linhagem365 ES. A coluna 1 refere-se à planta da qual material de tubérculo foi colhi-do (aqui, "wt" refere-se à plantas não transformadas). A coluna 2 estabeleceo valor para a quantidade de hialuronana determinada em folhas das plantasem questão. Quantidades não-detectáveis são marcadas "n.d.".c) Análise de plantas da linhagem 367 ES

A partir de diferentes plantas selecionadas de tomate da linha-gem 367 ES as quais tinham sido cultivadas no solo em uma estufa, em ca-da caso 1 folha foi colhida e congelada em nitrogênio líquido. Processamen-to adicional e determinação do teor de hialuronana foram realizados confor-me descrito no Exemplo 19b) para tubérculos de plantas de batata. Os se-guintes resultados foram obtidos:

<table>table see original document page 83</column></row><table>

Tabela 10: Quantidade de hialuronana (em pg por grama em peso fresco)produzida em folhas de plantas transgênicas selecionadas independentes dalinhagem 367 ES. A coluna 1 refere-se à planta da qual material de folha foicolhido (aqui, "wt" refere-se à plantas não transformadas). A coluna 2 esta-belece o valor da quantidade d® hialuronana determinada em folhas dasplantas em questão.

20. Plantas compreendendo uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína tendo a atividade de uma Dehidroaenase de UDP-qlicose e uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo aatividade de um sintase de alicosaminoalicana

Algumas sintases de glicosaminoglicana (tais como, por exem-plo, sintase de hialuronana), requerem, como um substrato, Derivados deglicosamina N-acetilada e UDP-GIcA. Conseqüentemente, foram geradosprimeiras plantas tendo uma atividade aumentada de uma proteína tendo aatividade de uma Dehidrogenase de UDP-glicose e uma atividade aumenta-da de uma proteína tendo a atividade de uma sintase de hialuronana.

a) Produção de plantas de batata

Plantas de batata da linhagem 365 ES 74 (vide Exemplo 19 b))foram transformadas usando o método fornecido sob Métodos Gerais, Item 1com o vetor de expressão de planta IC 349-222 compreendendo uma se-qüência de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo a atividade deuma Dehidrogenase de UDP-glicose sob o controle do promotor 35S. Aslinhagens transgênicas obtidas, as quais são transformadas com o plasmí-deo IC 349-222, foram denominadas 423 ES.

b) Análise de plantas da linhagem 423 ES

Plantas da linhagem 423 ES foram cultivadas no solo em vasosde 6 cm em uma estufa. Em cada caso, cerca de 0,3 g a 0,8 g de material defolha, coletado de plantas individuais, foram processados usando o métododescrito sob Métodos Gerais, Item 5 e o teor de Hialuronana foi determinadousando o método descrito sob Métodos Gerais, Item 7. Para plantas indivi-duais tendo um teor aumentado de derivados de N-acetilglicosamina, os se-guintes resultados foram obtidos:

<table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table>

Tabela 11: Quantidade de hialuronana (em pg por grama em peso fresco)medida em folhas de plantas transgênicas independentes da linhagem 423ES. A coluna 1 se refere, em cada caso, à plantasindependentemente origi-nárias da transformação, das quais material foi colhido (aqui, "wt 1" a "wt 10"refere-se a plantas independentes não transformadas). Por comparação,valores para 10 diferentes proles de plantas da linhagem 365 ES usadascomo uma linhagem de iniciação para a transformação (365 ES-1 a 365 ES-10) são mostrados. Quantidades não-detectáveis são marcadas "n.d.".

Pode ser observado a partir dos resultados que plantas compre-endendo uma molécula de ácido nucléico estranha que codifica uma proteí-na tendo a atividade de uma dehidrogenase de UDP-glicose e uma moléculade ácido nucléico que codifica uma proteína tendo a atividade de uma sinta-se de hialuronana não sintetizam qualquer quantidade estatisticamente signi-ficativa aumentada de hialuronana comparado com plantas tendo apenasuma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo a atividadede uma sintase de hialuronana.

21. Plantas que sintetizam quantidades aumentadas de alicosaminoalicana

a) Produção de plantas de tomate oue sintetizam quantidades aumentadasde qlicosaminoqlicana

Plantas de tomate da linhagem 367 ES 25 (vide exemplo 19 c),tendo uma molécula de ácido nucléico que codifica uma sintase de hialuro-nana foram transformadas novamente usando o método fornecido sob Mé-todos Gerais, Item 2 com o vetor de expressão de plantas IC 372-256 ou IC375-271 compreendendo moléculas de ácido nucléico que codificam diferen-tes isoformas de proteínas tendo a atividade de uma GFAT.

As plantas de tomate transgênicas obtidas após transformaçãoda linhagem 367 ES 25, com o plasmídeo IC 372-256 (GFAT-2), foram de-nominadas 399 ES.

As plantas de tomate transgênicas obtidas após transformaçãoda linhagem 367 ES 25 com o plasmídeo IC 375-271 (GFAT bacteriana),foram denominadas 405 ES.

b) Análise das linhagens 399 ES e 405 ES

Frutos maduros foram colhidos de diferentes plantas de tomatedas linhagens 399 ES e 405 ES cultivadas no solo em uma estufa e o teorde hialuronana foi determinado çonforme descrito sob Métodos Gerais, Item

7. Os seguintes resultados foram obtidos:

<table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table>

Tabela 12: Quantidade de hialuronana ("HA" em pg por grama em peso fres-co) medidas em frutos de plantas transgênicas independentes das linhagens399 ES e 405 ES. A coluna 1 refere-se à plantas independentemente origi-nárias da transformação, da qual material foi colhido (aqui, "wt" refere-se àplantas não transformadas). Por comparação, valores de diferentes prolesde plantas da linhagem 367 ES usadas como uma linhagem de iniciaçãopara a transformação são mostrados. As extensões dos nomes das plantaspor numerais em romano denotam diferentes frutos da planta em questão.Quantidades não-detectáveis são marcadas "n.d.".

Esses resultados mostram que plantas compreendendo molécu-las de ácido nucléico estranhas que codificam uma sintasé de glicosamino-glicana e codificam uma proteína tendo a atividade de uma Dehidrogenasede UDP-glicose e codificam uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2ou uma GFAT bacteriana sintetizam quantidades consideravelmente maioresde glicosaminoglicanas do que plantas tendo apenas uma molécula de ácidonucléico estranha que codificam uma sintase de glicosaminoglicana.

c) Produção de plantas de batata que sintetizam quantidades aumentadasde glicosaminoglicana

Plantas de batata das linhagens 365 ES 74 (vide exemplo 19 b)compreendendo uma molécula de ácido nucléico que codifica uma sintasede hialuronana foram transformadas novamente usando o método estabele-cido sob Métodos Gerais, Item 1 com o vetor de expressão de plantas IC376-271, IC 372-256 ou IC 375-271 compreendendo uma molécula de ácidonucléico que codifica diferentes isoformas de proteínas tendo a atividade deumaGFAT.

As plantas de batata transgênicas obtidas após transformaçãoda linhagem 365 ES 74 com o plasmídeo IC 376-271 (GFAT-1), foram de-nominadas 409 ES.

As plantas de batata transgênicas obtidas após transformaçãoda linhagem 365 ES 74 com o plasmídeo IC 372-256 (GFAT-2), foram de-nominadas 396 ES.

As plantas de batata transgênicas obtidas após transformaçãoda linhagem 365 ES 74 com o plasmídeo IC 375-271 (GFAT bacteriana),foram denominadas 404 ES.

d) Análise das linhagens 396 ES. 404 ES e 409 ES

Folha e/ou material de tubérculo foi colhido de diferentes plantasde batata de linhagens ES (GFAT-2), 404 ES (GFAT bacteriana) e 409 ES(GFAT-1) cultivadas no solo em uma estufa e o teor de hialuronana foi de-terminado conforme descrito sob Métodos Gerais, Item 7. Os seguintes re-sultados foram obtidos para plantas da linhagem 409 ES:

<table>table see original document page 89</column></row><table>

Tabela 13: Quantidade de hialuronana ("HA" em pg por grama em peso fres-co) medida em folhas e tubérculos de plantas transgênicas independentesda linhagem 409 ES. A coluna 1 refere-se à plantas independentemente ori-ginárias da transformação, da qual material foi colhido (aqui, "wt" refere-se àplantas não transformadas). Valores para diferentes proles de plantas delinhagem 365 ES 74, a qual foi usada como uma linhagem de iniciação paraa transformação, são mostrados para comparação. Quantidades não-detectáveis são marcadas "n.d.".

Os seguintes resultados foram obtidos para plantas da linhagem396 ES:<table>table see original document page 90</column></row><table>

Tabela 14: Quantidade de hialuronana ("HA" em pg por grama em peso fres-co) medida em folhas e tubérculos de plantas transgônicas independentesda linhagem 396 ES. A coluna 1 refere-se à plantas independentemente ori-ginárias da transformação, da qual material foi colhido (aqui, "wt" refere-se àplantas não transformadas). Valores para diferentes proles de plantas dalinhagem 365 ES 74, a qual foi usada como uma linhagem de iniciação paraa transformação são mostrados por comparação.

Os seguintes resultados foram obtidos para plantas da linhagem404 ES:

<table>table see original document page 91</column></row><table> Tabela 15: Quantidade de hialuronana (em pg por grama em peso fresco)medida em folhas de plantas transgênicas independentes da linhagem 404ES. A coluna 1 refere-se à plantas independentemente originárias da trans-formação, da qual material foi colhitíb (aqui, "wt" refere-se à plantas nãotransformadas). Valores para diferentes proles de plantas da linhagem 365ES 74, a qual foi usada como uma linhagem de iniciação para a transforma-ção são mostrados por comparação.

Esses resultados mostram que plantas compreendendo umamolécula de ácido nucléico estranha que codifica uma sintase de glicosami-noglicana e codifica uma proteína tendo a atividade de uma Dehidrogenasede UDP-glicose e codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2ou uma GFAT bacteriana sintetizam quantidades consideravelmente maioresde glicosaminoglicana do que plantas compreendendo uma molécula de áci-do nucléico estranha que codifica uma sintase de glicosaminoglicana é codi-fica uma proteína tendo a atividade de uma Dehidrogenase de UDP-glicosee codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-1,

e) Produção de plantas compreendendo uma molécula de ácido nucléicoestranha que codifica uma sintase de hialuronana e uma proteína tendo aatividade de uma GFAT bacteriana

Plantas de batata da linhagem 365 ES 74 (vide exemplo 19 b),compreendendo uma molécula de ácido nucléico que codifica uma sintasede hialuronana foram transformadas novamente usando o método fornecidosob Métodos Gerais, Item 1 com o vetor de expressão de planta IC 398-311compreendendo moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteínatendo a atividade de uma GFAT bacteriana. As linhagens originárias dessatransformação foram denominadas 433 ES.

f) Análise da linhagem 433 ES

Folha e/ou material de tubérculo foi colhido de diferentes plantasde batata da linhagem 433 ES cultivadas no solo em uma estufa e o teor dehialuronana foi determinado conforme descrito sob Métodos Gerais, Item 7.Os seguintes resultados foram obtidos para plantas da linhagem 433 ES:

Planta HA em HA em folhas tubérculo [Mg/g [pg/g FW] FW]433ES1 111,84 126,70433ES3 303,34 203,16433ES4 3142,41 433ES5 312,98 825,96433ES7 1492,94 433ES8 914,03 433ES9 1858,68 433ES 10 357,90 433ES 11 5962,82

Planta HA em HA em folhas tubércu- [Mg/g lo [Mg/g FW] FW]433ES28 1850,99 294,98433ES 30 2512,40 433ES 31 3337,54 433ES 32 1583,60 433ES34 3552,44 433ES 35 5419,43 433ES 36 902,01 433ES 37 829,35 433ES 38 1536,55<table>table see original document page 93</column></row><table>

Tabela 16: Quantidade de hialuronana ("HA" em μς por grama em peso fres-co) medida em folhas e tubérculos de plantas transgênicas independentesda linhagem 433 ES. A coluna 1 refere-se à plantas independentemente ori-ginárias da transformação, da qual material foi colhido (aqui, "wt" refere-se àplantas não transformadas). Valores para diferentes proles de plantas dalinhagem 365 ES 74, a qual foi usada como uma linhagem de iniciação paraa transformação são mostrados por comparação. Os valores para a linha-gem 365 ES 74 correspondem àqueles na Tabela 14, uma vez que toda/s aspíántas foram cultivadas simultaneamente em uma estufa.

Esses resultados mostram que plantas compreendendo molécu-las de ácido nucléico estranhas que codificam uma sintase de glicosamino-glicana e codificam uma proteína tendo a atividade de uma GFAT bacterianasintetizam quantidades consideravelmente maiores de glicosaminoglicana doque plantas tendo apenas moléculas de ácido nucléico estranhas que codifi-cam uma sintase de glicosaminoglicana.22. Sumário dos resultados

Os resultados no Exemplo 16 mostram que plantas compreen-dendo uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo aatividade de uma GFAT bacteriana têm teores consideravelmente aumenta-dos de Derivados de glicosamina N-acetilada comparado com plantas dotipo silvestre não transformadas.

Os resultados no Exemplo 17 mostram que plantas compreen-dendo uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo aatividade de uma GFAT-2 têm teores consideravelmente aumentados deDerivados de glicosamina N-acetilada comparado com plantas do tipo silves-tre não transformadas.

Todas as plantas transformadas descritas no em Exemplo 18têm, além disso, moléculas de ácido nucléico que codificam diferentes iso-formas de uma proteína tendo a atividade de uma GFAT1 em cada caso, amesma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína tendo a ativi-dade de uma Dehidrogenase de UDP-glicose. Conseqüentemente, a dife-rença essencial das plantas transformadas descritas no Exemplo 18 são asdiferentes moléculas de ácido nucléico estranhas que codificam as diferen-tes isoformas de uma proteína tendo a atividade de uma GFAT.

O Exemplo 18 b) mostra que o teor de Derivados de glicosaminaN-acetilada em plantas tendo uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-1 é aumentado ape-nas ligeiramente comparado com plantas não transformadas.

Além disso, pode ser observado a partir do Exemplo 18 d) queplantas compreendendo uma molécula de ácido nucléico estranha que codi-fica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 têm um teor considera-velmente maior de derivados de glicosamina N-acetilada do que plantas dotipo silvestre não transformadas. O teor de Derivados de glicosamina N-acetilada em plantas tendo uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 é também conside-ravelmente maior do que em plantas tendo uma molécula de ácido nucléicoestranha que codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-1.Além disso, pode ser observado a partir dos Exemplos 18 f) e g)que plantas compreendendo uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT bacteriana têm teoresainda aumentados de Derivados de glicosamina N-acetilada do que plantascompreendendo uma molécula de ácido nucléico estranha que codifica umaproteína tendo a atividade de uma GFAT-2.

Os resultados no Exemplo 21 f) mostram çjue plantas compreen-dendo moléculas de ácido nucléico estranhas que codificam uma sintase deglicosaminoglicana e codificam uma proteína tendo a atividade de umaGFAT bacteriana sintetizam quantidades consideravelmente maiores de gli-cosaminoglicana do que plantas tendo apenas moléculas de ácido nucléicoestranhas que codificam uma sintase de glicosaminoglicana.

Assim, pode ser concluído que a quantidade de glicosaminogli-cana sintetizada em plantas pode ser aumentada consideravelmente atravésde geração de plantas as quais, além de moléculas de ácido nucléico estra-nhas que codificam uma sintase de glicosaminoglicana, compreendem adi-cionalmente molécula de ácido nucléico estranhas que codificam uma prote-ína tendo a atividade de uma GFAT bacteriana.

Todas as plantas transformadas, cujos resultados são mostradosnos Exemplos 21 b) e d) têm, além de moléculas de ácido nucléico para dife-rentes isoformas de uma proteína tendo a atividade de uma GFAT1 tambémmoléculas de ácido nucléico estranhas que codificam uma proteína tendo aatividade de uma Dehidrogenase de UDP-glicose e molécula de ácido nu-cléico estranhas que codificam uma sintase de glicosaminoglicana. A dife-rença essencial entre as plantas transformadas cujos resultados são mos-trados nos Exemplos 21 b) e d) consiste, conseqüentemente, nas diferentesmoléculas de ácido nucléico que codificam as diferentes isoformas de umaproteína tendo a atividade de uma GFAT.

Os resultados mostrados no Exemplo 21 b) mostram que o teorde glicosaminoglicana em plantas tendo uma molécula de ácido nucléicoestranha que codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 ouque codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT bacteriana é au-mentado consideravelmente comparado com plantas tendo apenas a ativi-dade de uma sintase de glicosaminoglicana.

Os resultados mostrados no Exemplo 21 d) mostram que plantascompreendendo a molécula de ácido nucléico estranha que codifica umaproteína tendo a atividade de uma GFAT-1 contêm uma quantidade ligeira-mente maior de glicosaminoglicana do que plantas tendo apenas a atividadede uma sintase de glicosaminoglicana. Em contraste, o teor de glicosamino-glicana em plantas compreendendo uma molécula de ácido nucléico estra-nha que codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-2 é conside-ravelmente maior do que em plantas tendo uma molécula de ácido nucléicoestranha que codifica uma proteína tendo a atividade de uma GFAT-1. Alémdisso, pode ser observado a partir do Exemplo 21 d) que plantas individuaiscompreendendo uma molécula de ácido nucléico estranha que codifica umaproteína tendo a atividade de uma GFAT bacteriana contêm quantidadesainda maiores de glicosaminoglicana do que plantas tendo uma molécula deácido nucléico estranha que codifica uma proteína tendo a atividade de umaGFAT-2.

Os resultados no Exemplo 20 b) mostram que plantas compre-endendo uma molécula de ácido nucléico estranha que codifica uma proteí-na tendo a atividade de uma Dehidrogenase de UDP-glicose e uma moléculade ácido nucléico que codifica uma proteína tendo a atividade de uma sinta-se de glicosaminoglicana não têm qualquer quantidade estatisticamente au-mentada significativamente de glicosaminoglicana comparado com plantascompreendendo apenas uma molécula de ácido nucléico estranha que codi-fica uma proteína tendo a atividade de uma sintase de glicosaminoglicana.

Para concluir, os- resultados mostrados indicam que aumentosconsideráveis nas quantidades de glicosaminoglicanas em plantas compre-endendo moléculas de ácido nucléico estranhas que codificam uma proteínatendo a atividade de uma Dehidrogenase de UDP-glicose e codificam umaproteína tendo a atividade de uma sintase de glicosaminoglicana tendo aatividade de uma GFAT-2 ou tendo a atividade de uma GFAT bacteriana nãoé em virtude da presença das moléculas de ácido nucléico estranhas tendo aatividade de uma Dehidrogenase de UDP-glicose, mas à presença de molé-culas de ácido nucléico tendo a atividade de uma GFAT-2 ou tendo a ativi-dade de uma GFAT bacteriana.

Uma vez que sintases de hialuronana usadas de uma maneiraexemplificativa como proteínas tendo a atividade de uma sintase de glico-saminoglicana requerem, como substrato, UDP-GIc-NAc e UDP-GIcA, podetambém ser concluído, a partir dos resultados mostrados, que as quantida-des aumentadas de hialuronana (glicosaminoglicana) são em virtude dequantidades aumentadas de Derivados de glicosamina N-acetilada e não àquantidades aumentadas de UDP-GIcA nessas plantas.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

Bayer CropScience GmbH

Plantas tendo um teor aumentado de aminoaçúcares

BCS 06-5010 PCT

EP05090279.0

2005-10-05

US60/725,388

2005-10-11EP06090177.4

2006-09-2217

PatentIn versão 3.31

1707DNA

Vírus 1 Paramecixam bursaria ChlorellaCDS

(1)..(1707)

PB425801995-12-24(50903) . . (52609)1

atg ggt aaa aat ata ate ata atg gtt tcg tgg tac aec ate ata actMet Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr1 5 10 15

tca aat cta ate gcg gtt gga gga gcc tet cta ate ttg gct ccg geaSer Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Alá Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala

20 25 30

att act ggg tat gtt cta cat tgg aat att gct etc tcg aca ate tggIle Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp35

gga gta tca gctGly Val Ser Ala50

gtt tta ttt tcaVal Leu Phe Ser65

ctc aga cct aagLeu Arg Pro Lys

gga tat cgc gagGly Tyr Arg Glu100

cgt gac tct gátArg Asp Ser Asp115

ggt gat gag gacGly Asp Glu Asp130

tac aat gat aatTyr Asn Asp Asn145

gac aag gaa ggtAsp Lys Glu Gly

gtc ctc cag cctVal Leu Gln Pro180

caa ctt gca aagGln Leu Ala Lys195

age gat acc gtt

40

tat ggt att ttcTyr Gly Ile Phe55

gaa ctg aac aggGlu Leu Asn Arg70

ggt tgg aat gatGly Trp Asn Asp85

gat cct tat atgAsp Pro Tyr Met

tat ggc aac gttTyr Gly Asn Val120

gat gat atg aggAsp Asp Met Arg135

ate aag aag cccIle Lys Lys Pro150

gaa cgc ate gacGlu Arg Ile Asp165

cat cgt gga aaaHis Arg Gly Lys

atg gac ccc agtMet Asp Pro Ser200

ctc gag aag gat

gtt ttt ggg tttVal Phe Gly Phe60

aaa cgt ctt cgcLys Arg Leu Arg75

gtt cgt ttg gctVal Arg Leu Ala90

ttc cag aag tgcPhe Gln Lys Cys105

gcc cgt ctg attAla Arg Leu Ile

atg gct gcc gttMet Ala Ala Val140

gag ttt gtt ctgGlu Phe Val Leu155

tct gat ttc tctSer Asp Phe Ser170

cgg gag tgt cttArg Glu Cys Leu185

gtc aat gct gtcVal Asn Ala Val

gct att ctg gaa

45

ttc ctt gca caaPhe Leu Ala Gln

aag tgg att tctLys Trp Ile Ser80

ι

I

gtg ate att gctVal Ile Ile Ala95

ctc gag tct gtaLeu Glu Ser Val110

tgt gtg att gacCys Val Ile Asp125

tac aag gcg ateTyr Lys Ala Ile

tgt gag tca gacCys Glu Ser Asp160

cgc gac att tgtArg Asp Ile Cys175

tat act ggg tttTyr Thr Gly Phe190

gtt ctg att gacVal Leu Ile Asp205

gtt gta tac ccaSer Asp Thr Val210

ctt gca tgc gatLeu Ala Cys Asp225

tgg aac aca gacTrp Asn Thr Asp

tct gcg ttt tgtSer Ala Phe Cys260

cag tgc gtt gggGln Cys Val Gly275

gag att aag gacGlu Ile Lys Asp290

act tac ggt gacThr Tyr Gly Asp305

aaa aag gtt gtgLys Lys Val Val

acc aat gtg tttThr Asn Val Phe340

tgg tgc cgc gaaTrp Cys Arg Glu355

ttg tct gga attLeu Ser Gly Ile370

Leu Glu Lys Asp215

ccc gag ate caaPro Glu Ile Gln230

act ctt ttg agtThr Leu Leu Ser245

gtg gag agg agtVal Glu Arg Ser

ggg cca ctg ggtGly Pro Leu Gly280

ccc tgg att tccPro Trp Ile Ser295

gac cgc cgg ctaAsp Arg Arg Leu310

ttc act cca tttPhe Thr Pro Phe325

cgg tac ate gttArg Tyr Ile ,Val

att tgg tac accIle Trp Tyr Thr360

tgg ctg gcc tttTrp Leu Ala Phe375

Ala Ile Leu Glu220

gcc gtt gca ggtAla Val Ala Gly235

ctt ctc gtc gctLeu Leu Val Ala250

gcc cag tct tttAla Gln Ser Phe265

gcc tac aag attAla Tyr Lys Ile

cag cgc ttt cttGln Arg Phe Leu300

acc aac gag ateThr Asn Glu Ile315

gct gtt ggt tggAla Val Gly Trp330

cag cag acc cgcGln Gln Thr Arg

i e

345 '

ctc ttc gcc gcg

Leu Phe Ala Ala

gaa tgt ttg tatGlu Cys Leu Tyr380

Val Val Tyr Pro

gag tgt aag attGlu Cys Lys Ile240

tgg cgg tac tatTrp Arg Tyr Tyr255

ttc agg act gttPhe Arg Thr Val270

gat ate att aagAsp Ile Ile Lys285

ggt cag aag tgtGly Gln Lys Cys

ttg atg cgt ggtLeu Met Arg Gly320

tct gac agt ccgSer Asp Ser Pro335

tgg agt aag tcgTrp Ser Lys Ser350

tgg aag cac ggtTrp Lys His Gly365

caa att aca tacGln Ile Thr Tyrttc ttc CtC gtg att tac ctc ttt tct cgc cta gcc gtt gag gcc gac 1200Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp385 390 395 400

cct cgc gcc cag aca gcc acg gtg att gtg age acc acg gtt gea ttg 1248

Pro Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu405 410 415

att aag tgt ggg tat ttt tca ttc cga gcc aag gat att cgg gcg ttt 1296Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe420 425 430

tac ttt gtg ctt tat aca ttt gtt tac ttt ttc tgt atg att ccg gcc 1344Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala435 440 445

agg att act gea atg atg acg ctt tgg gac att ggc tgg ggt act cgc 13 92Arg Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg450 455 460

ggt gga aac gag aag cct tcc gtt ggc acc cgg gtc gct ctg tgg gea 1440Gly Gly Asn Glu Lys Pro Ser Val Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala465 470 475 480

aag caa tat ctc att gea tat atg tgg tgg gcc gcg gtt gtt ggc gct 1488Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala485 490 495

gga gtt tac age ate gtc cat aac tgg atg ttc gat tgg aat tct ctt 1536Gly Val Tyr Ser Ile Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu500 505 510

tct tat cgt ttt gct ttg gtt ggt att tgt tct -tac att gtt ttt att 1584Ser Tyr Arg Phe Ala Leii Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile515 520. 525

gtt att gtg ctg gtg gtt tat ttc acc ggc aaa att acg act tgg aat 1632Val Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn530 535 540

ttc acg aag ctt cag aag gag cta ate gag gat cgc gtt ctg tac gat 1680Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp545 550 555 560

gca act acc aat gct cag tct gtg tgaAla Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val565

<210> 2<211> 568

<212> PRT

<213> Vírus 1 Paramecium bursaria Chlorella

<400> 2

Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr15 10 15

Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala

20 25 30

Ile Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp

35 40 45

Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln

50 55 60

Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser65 70 75 80

Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala

85 90 95

Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser Val

100 105 HO

Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn Val Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp

115 120 125

Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile

130 135 140

Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp145 150 155 160

Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ilè Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys

165 170 175

Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe180 185 190

Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser Val Asn Ala Val Val Leu Ile Asp

195 200 205

Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro

210 215 220

Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile

225 230 235 240

t!

Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr

245 250 255

Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val

260 265 270

Gln Cys Val Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys Ile Asp Ile Ile Lys

275 280 285

Glu Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys

290 295 300

Thr Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly305 310 315 320

Lys Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala Val Gly Trp Ser Asp Ser Pro

325 330 335

Thr Asn Val Phe Arg Tyr Ile Val Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser

340 345 350

Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly

355 360 365

Leu Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr370 ' 375 380 , ·. . '

Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp385 390 395 400

Pro Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu

405 410 415

Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe

420 425 430

Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala435

Arg Ile Thr Ala450

Gly Gly Asn Glu465

Lys Gln Tyr Leu

Gly Val Tyr Ser500

Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile515 520 525

Val Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn

530 535 540

Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp545 550 555 560

Ala Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val565

3

1707DNA

Seqüência Artificial

Seqüência sintética codificando vírus Paramecium bursaria Chlo-rella proteína

3 ,

acattatcat tatggtgtcc tggtacacaa ttattacaag taatctcatc 60

gtgcatctct tattctcgct ccagctatca ctggatatgt tcttcactgg 120

tctcaactat ttggggagtt tccgcatatg gtatttttgt tttcgggttc 180

aggttctgtt ctcagagctc aatcgtaaga gactcaggaa gtggattagc 240

aggggtggaa tgacgttcgt ctcgctgtca ttatcgctgg ctaccgtgaa 300

tgtttcaaaa gtgcttggaa tcagttaggg atagtgatta tggcaacgtc 3 60

tctgtgtgat tgatggagat gaggacgacg atatgaggat ggcagctgtt 420

440

Met Met Thr Leu Trp Asp455

Lys Pro Ser Val Gly Thr470

Ile Ala Tyr Met Trp Trp485 490

Ile Val His Asn Trp Met505

445

Ile Gly Trp Gly Thir Arg460

Arg Val Ala Leu Trp Ala475 480

Ala Ala Val Val Gly Ala495

Phe Asp Trp Asn Ser Leu510

<210><211><212><213><220><223>

<400>

atgggtaagagcagttggtgaacatcgccctttttggctccttagaccaagatccttacagctagactgatataaggcta tctataatga taacattaag aagcctgaat ttgttctttg cgagtctgat 480

gacaaggaag gagaacggat tgattcagat ttctcacgtg atatctgcgt tctccaacct 540

catcgtggga agcgtgaatg tctttataca ggtttccaac tcgccaaaat ggacccatca 600

gtgaacgctg tggttcttat cgatagtgat actgtgctgg aaaaagatgc tatcttggag 660

gttgtttacc ctcttgcctg tgatcctgaa attcaagctg tggctggaga gtgcaagatc 720

tggaacacag atactcttct ttctctgctt gtcgcatgga gatattactc cgcattctgt 780

gtggagagga gcgctcaatc ctttttccgt accgttcaat gcgttggtgg tcctttggga 840

gcttacaaaa ttgatatcat caaggagatt aaggacccat ggattagtca aaggtttctt 900ggtcagaagt gcacttatgg cgatgatcgt agattgacta acgaaatcct tatgaggggc 960aagaaagtcg tttttactcc atttgctgtc ggatggtctg attcacctac aaatgttttc 1020cgttatattg tgcaacaaac acgttggagt aagagctggt gtagggagat ctggtacact 1080ttgttcgctg cttggaagca cgggcttagc ggaatttggc ttgcttttga atgcctttac 1140cagattacat actttttctt ggtgatctat ttgttttcac gtcttgccgt cgaggctgac 1200cctagagcac agáctgcaac tgtgattgtt tctactacag tcgcacttat taagtgtggc 1260tatttcagtt ttagagcaaa agatattaga gccttctatt ttgttttgta cacatttgtt 1320tatttctttt gcatgattcc agctcgtatt accgctatga tgaccttgtg ggacatcgga 1380tggggaacta gaggtggtaa cgaaaagcct tctgtgggaa caagggtggc cctttgggca 1440aaacaatatc tcatcgccta catgtggtgg gccgctgtcg ttggtgccgg agtgtactca 1500atcgttcata actggatgtt tgactggaac tctttgagct atcgtttcgc tcttgtgggt 1560atttgttctt acattgtttt catcgtgatt gtgctcgttg tgtatttcac tggtaaaatc 1620acaacctgga atttcactaa acttcaaaag gaattgattg aagacagggt tctgtatgat 1680gctactacca acgcccagtc agtttaa 1707

<210> 4

<211> 2298

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (150)..(2192)

<300>

<308> BC050762.1

<309> 2005-03-08<313> (150)..(2195)

<400> 4

gagagcgaag cgagcgctga gtcggactgt cgggtctgag ctgtcgcatc ccagagtcct 60ctcattgcca ccaccccggc ccgagctcac cctcgcttct gaagctctcc gcgcgcccga 120cagctcagcc ctcgcccgtg accaacatc atg tgc ggt ata ttt gct tat tta 173

Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu1 5

aat tac cat gtt cct cga aca aga cga gaa ate ttg gag aca cta ate 221

Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg Arg Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile

10 15 20

aaa ggc ctt cag aga ctg gaa tac aga gga tat gat tet gct ggt gtg 269

Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val25 30 35 40

gga ctt gac gga ggc aat gac aaa gac tgg gaa gcc aac gcc tgc aaa 317

Gly Leu Asp Gly Gly Asn Asp Lys Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys

45 50 55

ate cag etc att aag aag aaa gga aaa gtt aag gea ctg gat gaa gaa 3 65

Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly I^ys Val Lys Ala Leu Asp Glu Glu60 65 70

gtt cac aaa caa caa gat atg gac ttg gat ata gaa ttt gat gtg cat 413

Val His Lys Gln Gln Asp Met Asp Leu Asp Ile Glu Phe Asp Val His

75 80 85

ctt gga ata gct cat acc cgt tgg gcg aca cat gga gaa ccc aat cct 461

Leu Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu Pro Asn Pro

90 95 100

gtc aat agt cac ccc cag cgc tet gat aaa aat aat gaa ttc att gtt 509

Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser Asp Lys Asn Asn Glu Phe Ile Val105 110 115 120

att cat aat gga ate ate acc aac tac aaa gac ttg aaa aag ttt ctg 557

Ile His Asn Gly Ile Ile Thir Asn Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu

125 130 135

gaa age aaa ggc tat gac ttt gaa tet gaa aca gac aca gaa acc att 605Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile

140 145 150

gcc aag ctc gtc aag tac atg tat gac aac tgg gag age cag gac gtc 653

Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr Asp Asn Trp Glu Ser Gln Asp Val 155 160 165

agt ttt acc acc ttg gtg gag aga gtt ate caa caa ttg gaa ggc gcc 701

Ser Phe Thr Thr Leu Val Glu Arg Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala

170 175 180

ttt gct ctt gtg ttt aaa agt gtc cat ttt ccc ggg caa gea gtt ggc 749

Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly185 190 195 200

aca agg cga ggt age cct ctc ttg att ggt gtg cgg agt gaa cat aag 797

Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys205 210 215

ctt tet aca gat cac att ccg att ctg tac aga aca ggc aaa gac aag 845

Leu Ser Thr Asp His Ile Pro Ile Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Asp Lys

220 225 230

aaa gga age tgc ggt ctt tcc cgt gtg gac age acg aca tgc ctg ttc 893

Lys Gly Ser Cys Gly Leu Ser Arg Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe 235 240 245

cct gtt gag gaa aag gea gtt gaa tat tac ttt gct tet gat gea agt 941

Pro Val Glu Glu Lys Ala Val Glu Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser

250 255 260

gcc gtg ata gag cac acc aat cgt gtc ate ttt ctg gaa gat gat gat 989

Ala Val Ile Glu His Thr Asn Arg Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp >265 270 275 280

gtt gea gea gtg gtg gat ggc cgt ctc tet ate cac cga att aaa cga 1037

Val Ala Ala Val Val Asp Gly Arg Leu Ser Ile His Arg Ile Lys Arg285 290 295

act gea gga gac cat cct ggc cga gct gtg caa act ctc cag atg gag 1085Thr Ala Gly Asp His Pro Gly Arg Ala Val Gln Thr Leu Gln Met Glu300 305 ' 310CtC cag cag ate atg aag ggc aac ttt agt tca ttt atg cag aag gaa 1133

Leu Gln Gln Ile Met Lys Gly Asn Phe Ser Ser Phe Met Gln Lys Glu

315 320 325

att ttt gag cag cca gaa tet gtt gtg aac aca atg aga gga aga gtc 1181

Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser Val Val Asn Thr Met Arg Gly Arg Val

330 335 340

aat ttt gat gac tac act gtg aat ttg gga ggt ttg aaa gat cac att 1229

Asn Phe Asp Asp Tyr Thr Val Asn Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Ile345 350 355 360

aag gag ate cag cgg tgt cgg cgg ttg att ctt att gct tgt ggc aca 1277

Lys Glu Ile Gln Arg Cys Arg Arg Leu Ile Leu Ile Ala Cys Gly Thr

365 370 375

agt tac cac gct ggt gtg gea acc cgt cag gtc ctg gag gag ctg acc 1325

Ser Tyr His Ala Gly Val Ala Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr380 385 390

gag ctg ccc gtg atg gtg gag ctt gcc agt gac ttc ttg gat aga aac 1373

Glu Leu Pro Val Met Val Glu Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn

395 400 405

act cca gtc ttt cga gat gat gtt tgc ttt ttc att agt caa tca ggc 1421

Thr Pro Val Phe Arg Asp Asp Val Cys Phe Phe Ile Ser Gln Ser Gly410 415 420

gag aca gct gac acc ctg atg gga ctt cgt tac tgt aag gag aga gga 1469Glu Thr Ala Asp Thr Leu Met Gly Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly425 430 435 440

gcc tta act gtg ggg ate aca aat aca gtc ggc agt tçt ata tca agg 1517

1

Ala Leu Thr Val Gly Ile Thr Asn Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg

445 450 455

gag aca gat tgc ggg gtt cat att aat gct ggt cct gag att ggc gtg 1565Glu Thr Asp Cys Gly Val His Ile Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val460 465 470

gcc agt aca aag gea tac acc age cag ttt gtg tcc ctc gtg atg ttt 1613

Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr Ser Gln Phe Val Ser Leu Val Met Phe475 480 485

gct ctc atg atg tgt gat gac agg ate tcc atg caa gag aga cgc aaa 1661Ala Leu Met Met Cys Asp Asp Arg Ile Ser Met Gln Glu Arg Arg Lys

490 495 500

gag ate atg ctc gga ctg aag cga ctg ccg gac ttg att aag gaa gtg 1709Glu Ile Met Leu Gly Leu Lys Arg Leu Pro Asp Leu Ile Lys Glu Val

505 510 515 520

ctg age atg gat gat gaa ate cag aag ctg gcg acg gag ctt tac cac 1757

Leu Ser Met Asp Asp Glu Ile Gln Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His

525 530 535

cag aag tcg gtc ctg ata atg ggg cgg ggc tac cat tat gct aca tgc 1805

Gln Lys Ser Val Leu Ile Met Gly Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys

540 545 550

ctt gaa ggg gct ctg aaa ate aag gag att act tat atg cat tcg gaa 1853

Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu

555 560 565

ggc ate ctt gct ggt gag ctc aag cac ggc cct ctg gcc ttg gtg gac 1901

Gly Ile Leu Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Val Asp

570 575 580

aag ttg atg cct gtc ate atg ate ate atg cga gac cac act tat gcc 1949

Lys Leu Met Pro Val Ile Met Ile Ile Met Arg Asp His Thr Tyr Ala

585 590 595 600

aag tgc cag aac gct ctt cag cag gtg gtt gea cgg cag ggg cgt cca 1997

Lys Cys Gln Asn Ala Leu Gln Gln Val Val Ala Arg Gln Gly Arg Pro

605 .. 610- 615

Ia

gtc gtg ate tgt gat aag gag gat act gag acc Stt aag aat aca aaa 2045Val Val Ile Cys Asp Lys Glu Asp Thr Glu Thr Ile Lys Asn Thr Lys

620 625 630

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Arg Thr Ile Lys Val Pro His Ser Val Asp Cys Leu Gln Gly Ile Leu

635 640 645

agt gtg att ccc ctg cag ctg ctg gct ttc cac ctg gct gtg ctg aga 2141Ser Val Ile Pro Leu Gln Leu Leu Ala Phe His Leu Ala Val Leu Arg

650 655 660

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Glu

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<210> 5

<211> 681<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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Leu Asp Ile Glu Phe Asp Val His Leu Gly Ile Ala Hls Thr Arg Trp

85 " 90 .95

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100 105 110

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115 120 125

Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu s130 135 140Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr145 150 155 160

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165 170 175

Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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260 265 270

Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp Val Ala Ala Val Val Asp Gly Arg

275 280 285

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290 295 300

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Phe Ser Ser Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser Val325 330 335

Val Asn Thr Met Arg Gly Arg Val Asn Phe Asp Asp Tyr Thr Val Asn340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val Glu Leu385 390 395 400Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro Val Phe Arg Asp Asp Val

405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

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Val Asp Cys Leu Gln Gly Ile Leu Ser Val Ile Pro Leu Gln Leu Leu645 650 655Ala Phe His Leu Ala Val Leu Arg Gly Tyr Asp Val Asp Phe Pro Arg

660 665 670

Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu675 680

<210><211><212><213><220><221><222><300><308><309><313><400>

6

2049DNA

Mus musculusCDS

(1) .. (2046)

BC031928 .12003-10-07(51)..(299)6

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85 90 95

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115 120 125

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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340 345 350

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Leu Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Leu Lys Glu Ile Arg Arg Cys Arg

355 360 365

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Arg Leu Ile Val Ile Gly Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Ala Val Ala

370 375 380

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385 390 395 400

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Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro Val Phe Arg Asp Asp405 410 415

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Val Cys Phe Phe Ile Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu Leu420 425 430

gcg ctg cga tac tgt aag gat cga ggt gcg ctg acc gtg ggc ate acc 1344Ala Leu Arg Tyr Cys Lys Asp Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile Thr435 440 445

aac acc gtg ggt age tcc ate tcc cgg gag act gac tgt ggc gtc cac 13 92Asn Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg Glu Thr Asp Cys Gly Val His

450 455 460

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465 470 475 480

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485 490 495

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530 535 540

gga cgg gga tat aac tat gcc aca tgt ctg gaa ggt gcc ttg aaa att 1680Gly Arg Gly Tyr Asn Tyr Ala Thr Cys Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile545 550 555 560

aag gag ata acc tac atg cat tca gaa ggt ate cta gcc gga gag ctg 1728Lys Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu Gly Ile Leu Ala Gly Glu Leu

565 570 575

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cag gtc act gcc cgc cag ggt cgc cca ate ata ctg tgt tcc aag gatGln Val Thr Ala Arg Gln Gly Arg Pro Ile Ile Leu Cys Ser Lys Asp610 615 620

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aga aac cta gcc aag tet gtc act gtg gaa tgaArg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu675 680

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Arg Leu Asp Ser Ser Thr Cys Leu His Ala Val Gly Asp Lys Ala Val

245 250 255

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260 265 270

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275 280 3 285

Lys Leu Ser Ile His Arg Val Lys Arg Ser Ala Thr Asp Asp Pro Ser

290 295 300

Arg Ala Ile Gln Thr Leu Gln Met Glu Leu Gln Gln Ile Met Lys Gly305 310 315 320

Asn Phe Ser Ala Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser325 330 335Val Phe Asn Thr Met Arg Gly Arg Val Asn Phe Glu Thr Asn Thr Val

340 345 350

Leu Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Leu Lys Glu Ile Arg Arg Cys Arg

355 360 365

Arg Leu Ile Val Ile Gly Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Ala Val Ala

370 375 380

Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val Glu

II

385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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485 490 495

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515 520 525

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/ L

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565 570 575

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595 600 605

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610 615 620

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645 650 655

Leu Ser Phe His Leu Ala Val Leu Arg Gly Tyr Asp Val Asp Phe Pro

660 665 670

Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu675 680

<210><211><212><213><220><221><222><3 00><3 08><309><313><400>

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20 25 30

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8

1830DNA

Eschèrichia coliCDS

(1)..(1827)

U00096.22005-09-08(3909862) .. (3911691)835 40 45

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85 90 95

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180 185 190

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ctg tet cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gea gaa gat ttc tet gac 1392

Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp 450 455 460

aaa cat cac gcg ctg ttc ctg ggc cgt ggc gat cag tac cca ate gcg 1440

Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480

ctg gaa ggc gea ttg aag ttg aaa gag ate tet tac att cac gct gaa 1488

Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu

485 490 495

gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat 1536Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp500 505 510

gcc gat atg ccg gtt att gtt %tt gea ccg aac aac gaa ttg ctg gaa 1584Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu

515 520 525

aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg 1632

Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu 530 535 540

tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt age gat aac atg 1680

Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560

cac ate ate gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gea ccg ate ttcHis Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe

565 570 575

tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg ate aaaTyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys

580 585 590

ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gea aaa tcg gtt acg gttGly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Vai.595 600 605

gag taaGlu

<210> 9

<211> 609

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 9

Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile1 5 10 15

Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala

20 25 30

Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg

35 40 45

Leu Gly Lys -Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu

50 55 60

His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu65 70 75 80

Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val

85 90 95

Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu100 105 110Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile

115 120 125

Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu

130 135 140

Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val145 150 155 160

Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly

165 170 175

Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu

195 200 205

Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp

210 ' 215 220

Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln225 230 235 240

Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu

245 250 255

Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile

260 265 270

Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu

275 280 285

Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser

290 295 300

Tyr Asn Ser Gly Met. Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly305 310 315 320

Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser

325 330 335

Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu

340 345 350

Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr355 360 365Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg

370 375 380

Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val385 390 395 400

Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu405 410 415

Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His

420 425 430

Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met

435 440 445

Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp

450 455 460

Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala465 470 475 480

Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu

485 490 495

Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp

500 505 510

Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu

515 520 525

Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu

530 535 540

Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met545 550 555 560

His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Gliji Val Ile Ala Pro Ile Phe

565 570 575

Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys

580 585 590

Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val595 600 605

Glu1830DNA

Seqüência Artificial

30

<210><211><212><213><220>

<223> Seqüência artificial codificando uma proteína de Escherichia

coli contendo a atividae de um GFAT<400> 10

atgtgcggaa ttgttggtgc tatcgcccaa agagacgttg ctgagatttt gttagagggt 60

ctgcgaaggc tagagtatag aggatatgac tccgctggtc tggctgtcgt tgatgctgag 120

ggtcatatga caaggctaag aaggttagga aaggttcaga tgcttgctca ggcagctgag 180

gaacatccat tgcatggagg tactggtatt gcacatacca ggtgggctac tcatggggag 240

ccatcagaag ttaatgctca tccacatgtg agtgagcata tcgttgtagt tcacaatggg 300

ataattgaaa accàcgaacc attgagggaa gagttaaagg caagaggata tacttttgtg 3 60

agtgagactg acactgaggt tattgcacat ttagtgaact gggaactcaa acaggggggc 420

acattgcgtg aggctgtgtt aagagctatt cctcaactta gaggtgçata cggtactgtt 480

attatggatt caagacaccc agatactctc cttgcagcta gatcaggtag tcccttggtc 540

ataggacttg gaatgggtga aaattttatc gctagcgacc aattggcctt attgccagtt 600

acaagacgat ttattttcct tgaagagggc gatattgctg agattactag aaggtctgtg 660

aacatctttg ataagactgg cgctgaggtt aaacgtcagg atatcgagtc taaccttcaa 720

tacgatgctg gtgataaagg aatttacagg cattatatgc aaaaggaaat ttatgaacaa 780

ccaaatgcta tcaaaaacac acttactggc cgtatttctc atggacaggt cgatttaagc 840

gagcttggtc ctaatgcaga cgaactgcta tcaaaagttg agcacataca gatactggca 900

tgcggaacta gttataattc aggaatggtc tctagatact ggttcgaaag cttggcaggt 960

ataccttgtg atgtagagat cgcttctgag tttaggtata gaaagtctgc tgtgcgtaga 1020

aattcattaa tgattacatt atctcaatcc ggagaaacag cagatacact ggctggattg 1080

aggctttcta aggaactcgg atatctgggt tcacttgcta tttgtaatgt accaggttcc 1140

tcattggttc gtgaatcagà tctagcactt atgacaaatg caggaactga aataggtgtg 1200

gcaagtacca aggctttcac aacccaactg accgtacttt taatgttggt agcaaaactc 1260

agtcgattaa aggggctaga tgcatctatc gaacatgata ttgttcacgg gcttcaagct 1320

ctcccttcaa gaattgaaca aatgctttca caagataaga gaatagaggc attggctgaa 13 80

gatttttccg acaaacatca cgcattgttt cttggacgtg gcgatcaata tccaattgca 1440ttggaaggag ctttgaagtt gaaagaaata agttacattc acgcagaagc atatgcagct 1500ggagaactca agcatggtcc tttggcactc atcgacgctg acatgcccgt gatcgtagtg 1560gctcctaata acgaactgct cgaaaagctt aaatcaaata tcgaagaggt tcgagctaga 1620ggaggtcagc tttacgtttt cgctgaacaa gatgctggat tcgtgtcaag cgataatatg ' 1680catataattg aaatgcctca cgttgaagaa gtgattgcac ctatatttta tacagtccca 1740ttgcaacttc tagcttacca tgttgcactt attaaaggaa ctgatgttga tcagcctaga 1800aacctagcaa aatctgtaac agtcgaataa 1830

<210> 11 <211> 1260 <212> DNA <213> Vírus 1 Paramecium bursaria Chlorella <22 0> <221> CDS <222> (62)..(1228) <300> <308> U42580.4 <3 09> 2004-09-20 <313> (291749. ).. (292918) <400> 11 atcaacgtga tttatatttt aaacaaagac cattcacatc tttagtactt aattaattat 60 a atg tca cga ate gea gtc gtt ggt tgt ggt tac gtc gga acc gct tgt 109 Met Ser Arg Ile Ala Val Val Gly Cys Gly Tyr Val Gly Thr Ala Cys 1 5 10 15 gea gta Ctt ctt gct caa aaa aac gaa gtc ate gtg ctt gat att age 157 Ala Val Jr Leu Leu Ala Gln Lys Asn Glu Val Ile Val Leu Asp Ile Ser 20 25 30 gaa gac cgt gtt caa cta ate aag aac aag aag agt cca ate gag gac 205 Glu Asp Arg Val Gln Leu Ile Lys Asn Lys Lys Ser Pro Ile Glu Asp 35 40 45 aag gaa ate gaa gag ttt etc gaa acg aaa gac ctg aac ctg acc gcg 253 Lys Glu Ile Glu Glu Phe Leu Glu Thr Lys Asp Leu Asn Leu Thr Ala 50 55 60acg act gac aagThr Thr Asp Lys65

gca acc ccg actAla Thr Pro Thr

tct gtg gaa aacSer Val Glu Asn100

cca act ate gtgPro Thr Ile Val

115 'gtt cgt gag caaVal Arg Glu Gln130

ctg cgt gaa ggtLeu Arg Glu Gly145

ate gta gga gatIle Val Gly Asp

gtt gaa ggt tctVal Glu Gly Ser180

cgc gaa gcc gagArg Glu Ala Glu195

cga gtt gca tacArg Val Ala Tyr210

atg aat gcg aaaMet Asn Ala Lys

gtt ctt gca tacVal Leu Ala Tyr70

gac tat gac gtgAsp Tyr Asp Val85

gtc att ggg gacVal Ile Gly Asp

att aaa tct accIle Lys Ser Thr120

ttc gac tac caaPhe Asp Tyr Gln135

aga gcc ttg tatArg Ala Leu Tyr150

gat tcc ccc attAsp Ser Pro Ile165

aaa act ccg cttLys Thr Pro Leu

gcc gtc aaa ctaAla Val Lys Leu200

ttc àac gaa ctaPhe Asn Glu Leu215

gaa ate att gatGlu Ile Ile Asp

gaa aac gcc gaaGlu Asn Ala Glu75

gtt act agg tatVal Thr Arg Tyr90

gtg ate aaa aatVal Ile Lys Asn105

ate ccc att ggaIle Pro Ile Gly

aat ate att ttcAsn Ile Ile Phe140

gat aat ctc tacAsp Asn Leu Tyr155

gcg ctt aag ttcAla Leu Lys Phe170

gcc cct gtc ctgAla Pro Val Leu185

ttc tct aac acgPhe Ser Asn Thr

gat aca ttc gcaAsp Thr Phe Ala220

ggt gtg act ctgGly Val Thr Leu

ttt gtc ate atePhe Val Ile Ile80

ttt aac acg aaaPhe Asn Thr Lys95

aca cag acc catThr Gln Thr His110

ttt gtt gat aagPhe Val Asp Lys125

tcc cca gaa tttSer Pro Glu Phe

cca tcc cgt atePro Ser Arg Ile160

gca aac ctt ctcAla Asn Leu Leu175

acg atg gga actThr Met Gly Thr190

tat ctt gca atgTyr Leu Ala Met205

atg tct cac ggtMet Ser His Gly

gag cct cgc attGlu Pro Arg Ile225 230 235 240

ggt cag ggg tac tca aac cct tcg ttc ggt tat gga gct tat tgc ttt 829

Gly Gln Gly Tyr Ser Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Ala Tyr Cys Phe245 250 255

cca aag gat acg aag caa ctg ctg gct aat ttc gag gga gtg cct caa 877

Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Phe Glu Gly Val Pro Gln

260 265 270

gat ate ate gga gea att gta gaa tca aat gag act cgc aag gaa gtg 925

Asp Ile Ile Gly Ala Ile Val Glu Ser Asn Glu Thr Arg Lys Glu Val

275 280 285

att gtg agt gaa gta gaa aat cgt ttc ccc acg act gtt ggt gtg tat 973

Ile Val Ser Glu Val Glu Asn Arg Phe Pro Thr Thr Val Gly Val Tyr

290 295 300

aag ctc gcc gct aaa gcg ggt tet gat aat ttt cgg agt tet gea att 1021

Lys Leu Ala Ala Lys Ala Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ser Ser Ala Ile

305 310 315 320

gta gac ata atg gag cga ctt gea aac aag ggt tat cac att aag att 1069

Val Asp Ile Met Glu Arg Leu Ala Asn Lys Gly Tyr His Ile Lys Ile

325 330 335

ttc gaa cca act gtg gaa caa ttc gaa aac ttt gaa gtt gat aac aac 1117

Phe Glu Pro Thr Val Glu Gln Phe Glu Asn Phe Glu Val Asp Asn Asn

340 345 350

ctg aca aca ttt gcg act gag age gat gta att ate gea aac aga gtt 1165

Leu Thr Thr Phe Ala Thr Glu Ser Asp Val Ile Ile Ala Asn Arg Val

355 360 3.55

ccc gtt gaa cat cgc att ctc ttt ggt aaa aaa tta ate aca cgt gat 1213Pro Val Glu His Arg Ile Leu Phe Gly Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asp

370 375 380

gta tat ggc gat aac taaaatgttt tcaatatgat gttgttaatg at 1260

Val Tyr Gly Asp Asn

385

<210> 12<211> 389<212> PRT<213> Vírus 1 Paramecium bursaria Chlorella<400> 12

Met Ser Arg Ile Ala Val Val Gly Cys Gly Tyr Val Gly Thr Ala Cys1 5 10 15

Ala Val Leu Leu Ala Gln Lys Asn Glu Val Ile Val Leu Asp Ile Ser20 25 30

Glu Asp Arg Val Gln Leu Ile Lys Asn Lys Lys Ser Pro Ile Glu Asp35 40 45

Lys Glu Ile Glu Glu Phe Leu Glu Thr Lys Asp Leu Asn Leu Thr Ala50 55 60

Thr Thr Asp Lys Val Leu Ala Tyr Glu Asn Ala Glu Phe Val Ile Ile65 '70 75 80

Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asp Val Val Thr Arg Tyr Phe Asn Thr Lys85 90 95

Ser Val Glu Asn Val Ile Gly Asp Val Ile Lys Asn Thr Gln Thr His100 105 110

Pro Thr Ile Val Ile Lys Ser Thr Ile Pro Ile Gly Phe Val Asp Lys115 120 125

Val Arg Glu Gln Phe Asp Tyr Gln Asn Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe130 135 140

Leu Arg Glu Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile145 150 155 160

Ile Val Gly Asp Asp Ser Pro Ile^.Ala Leu Lys Phe Ala Asn Leu Leu ,165 170 175

Val Glu Gly Ser Lys Thr Pro Leu Ala Pro Val Leu Thr Met Gly Thr180 185 190

Arg Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Met195 200 205

Arg Val Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Phe Ala Met Ser His Gly210 215 220Met Asn Ala Lys Glu Ile Ile Asp Gly Val Thr Leu Glu Pro Arg Ile225 230 235 240

Gly Gln Gly Tyr Ser Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Ala Tyr Cys Phe

245 250 255

Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Phe Glu Gly Val Pro Gln260 265 270

Asp Ile Ile Gly Ala Ile Val Glu Ser Asn Glu Thr Arg Lys Glu Val

275 280 285

Ile Val Ser Glu Val Glu Asn Arg Phe Pro Thr Thr Val Gly Val Tyr

290 295 300

Lys Leu Ala Ala Lys Ala Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ser Ser Ala Ile305 310 315 320

Val Asp Ile Met Glu Arg Leu Ala Asn Lys Gly Tyr His Ile Lys Ile

325 330 335

Phe Glu Pro Thr Val Glu Gln Phe Glu Asn Phe Glu Val Asp Asn Asn

340 345 350

Leu Thr Thr Phe Ala Thr Glu Ser Asp Val Ile Ile Ala Asn Arg Val

355 360 365

Pro Val Glu His Arg Ile Leu Phe Gly Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asp

370 375 380

Val Tyr Gly Asp Asn385

<210> 13

<211> 1170

<212> DN£, ·

<213> Seqüência Artiricial

<220>

<223> Seqüência artificial codificando uma proteína do vírus Parameei-

um bursaria Chlorella contendo a atividade de um UDP-Glc-DH<400> 13

atgtctcgca tagctgttgt aagatgtggc tatgtgggaa ctgcatgtgc ggttctactt 60

gctcaaaaga acgaagttat tgtgcttgat attagtgaag accgtgttca acttattaag 120aacaagaagt ctcctattga ggataaggaa atcgaagagt tcttggaaac aaaggatctt 180aatcttactg cgactacaga taaggttctt gcctacgaga acgctgagtt tgtgataatc 240gctacaccaa ccgattacga cgttgtgact cgatatttca ataccaaatc cgtggaaaac 300gttataggag atgttatcaa gaacactcaa acccacccta ctatcgtcat caagtccaca 360attcccatcg gtttcgttga taaggtcaga gagcagtttg attatcaaaa cattatcttc 420tcacctgagt tcttaaggga gggtcgtgct ctctacgata atttgtatcc gtcccgtatt 480atcgttggcg acgattctcc tatcgctctc aagttcgcaa atctcttagt tgagggtagt 540aagacccctt tggctcctgt tttgacaatg ggaaccagag aagcagaagc tgtcaagcta 600ttctctaata cctaccttgc catgagggta gcatacttta acgaacttga tacatttgct 660atgtcgcatg gtatgaatgc caaggagatt atagatggtg tcactttaga gcccaggatc 720ggtcaaggat attctaaccc atcattcggc tatggagctt actgctttcc taaggacact 780aagcagttgc tggcaaactt cgagggagtt cctcaagaca tcataggcgc tattgtggag 840tcaaacgaaa caaggaaaga ggtgatagtt agtgaggtag agaatcgttt cccaacgacá 900gtcggtgttt acáaactggc agctaaagct ggtagcgata acttcaggtc aagtgctatt 960gtcgacatca tggaacgcct ggctaacaaa ggttaccaca ttaagatctt tgagccaact 1020gtagagcagt tcgaaaattt cgaagttgac aataacttga caacgtttgc tactgagtca 1080gacgttatta tcgcaaatcg tgtccctgtg gaacatagaa tcctatttgg aaagaagctc 1140attaccagag atgtttacgg tgataattaa 1170

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo sintético

<400> 14

tcgacaggcc tggatcctta attaaactag tctcgaggag ctcggtac 48

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo sintético<400> 15

cgagctcctc gagactagtt taattaagga tccaggcctg

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo sintético

<400> 16

aaaaactagt tctacatcgg cttaggtgta gcaacacg

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Oligonucleotídeo sintético

<400> 17

aaaagatatc tgttgttgga ttctactact atgcttcaa

Claims (14)

1. Planta ou célula de planta tendo um teor de Derivados de gli-cosamina N-acetilada de pelo menos 2 μmols por grama em peso fresco.

2. Planta ou célula de planta tendo um teor dè glicosaminoglica-na de pelo menos 300 μg de glicosaminoglicana por grama em peso fresco.

3. Parte de uma planta de acordo com a reivindicação 1, tendoum teor de Derivados de glicosamina N-acetilada de pelo menos 2 μιτιοίε porgrama em peso fresco.

4. Parte de uma planta de acordo com a reivindicação 2, tendoum teor de glicosaminoglicana de pelo menos 300 μg de glicosaminoglicanapor grama em peso fresco.

5. Material de propagação de acordo com a reivindicação 1, ten-do um teor de Derivados de glicosamina N-acetilada de pelo menos 2 μmolspor grama em peso fresco.

6. Material de propagação de plantas de acordo com a reivindi-cação 2, tendo um teor de glicosaminoglicana de pelo menos 300 μg de gli-cosaminoglicana por grama em peso fresco.

7. Processo para a produção de uma planta genéticamente mo-dificada o qual compreende as seguintes etapas:a) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína tendo a atividade de a glutamina: amidotransferase de-6-fosfato de frutose de isoforma Il (GFAT-2) ou que codifica uma proteínatendo a atividade de uma glutamina: amidotransferase de 6-fosfato de fruto-se bacteriana em uma célula de planta;b) regeneração de uma plantada partir de células de planta obti-das de acordo com a etapa a);c) se apropriado, geração de outras plantas com o auxílio dasplantas de acordo com a etapa b).

8. Processo para produção de uma planta a qual sintetiza glico-saminoglicana, em que:a) uma célula de planta é genéticamente modificada, onde amodificação genética compreende as etapas i a ii em qualquer ordem ourealização de quaisquer combinações das etapas i a ii a seguir individual ousimultaneamente:i) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína tendo a atividade de uma glutamina: amidotransferasede 6-fosfato de frutose de isoforma Il (GFAT-2) ou que codifica uma proteínatendo a atividade de uma glutamina: amidotransferase de 6-fosfato de fruto-se bacteriana (GFAT bacteriana) em uma célula de planta;ii) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma sintase de glicosaminoglicana em uma célula de planta;b) uma planta é regenerada a partir das células de planta com-preendendo a modificação genética de acordo com as Etapas:i) a) iii) a) iiiii) a) i e a) ii,c) introdução, em células de planta, de uma planta de acordocom a Etapa:i) b) i uma modificação genética de acordo com a Etapa a) ii,ii) b) ii uma modificação genética de acordo com a Etapa a) i,e regeneração de uma planta;d) se apropriado, geração de outras plantas com o auxílio dasplantas obtidas de acordo com qualquer uma das Etapas b) iii ou c) i ou c) ii.

9. Uso de moléculas de ácido nucléico que codificam uma prote-ína tendo a atividade de uma glutamina: amidotransferase de 6-fosfato defrutose de isoforma Il (GFAT-2) ou codificam uma proteína tendo a atividadede uma glutamina:am]dotransferase de 6-fosfato de. frutose bacteriana(GFAT bacteriana) para o preparo de uma planta genéticamente modificada.

10. Processo para a produção de glicosaminoglicana, o qualcompreende a Etapa da extração de glicosaminoglicanas de células de plan-ta como definidas na reivindicação 2, de partes de planta como definidas nareivindicação 4 ou de material de propagação como definidas na reivindicação 6.

11. Composição compreendendo células de planta genéticamen-te modificadas como definidas na reivindicação 1 ou 2.

12. Farinha obtenível de plantas como definidas na reivindicação-1 ou 2, de partes de plantas como definidas na reivindicação 3 ou 4 ou dematerial de propagação como definidas na reivindicação 5 ou 6.

13. Processo para produção de farinha o qual compreende aEtapa de trituração de partes de planta como definidas na reivindicação 3 ou-4 ou de material de propagação como definidas na reivindicação 5 ou 6.

14. Uso de plantas como definidas na reivindicação 1 ou 2, departes de plantas como definidas na reivindicação 3 ou 4 ou de material de-10 propagação como definidas na reivindicação 5 ou 6 para a produção de fari-nha.