JP5210165B2 - 増加したアミノ糖含量を有する植物 - Google Patents
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Description
グルタミン+Fruc−6−P→GlcN−6−P+グルタミン酸。
a)配列番号:7の下に記載のアミノ酸配列(GFAT−2)を有するタンパク質または配列番号:9の下に記載のアミノ酸配列(細菌GFAT)を有するタンパク質をコードする核酸分子;
b)配列が、配列番号:7の下(GFAT−2)または配列番号:9の下(細菌GFAT)に示されるアミノ酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも90%、非常に特に好ましくは少なくとも95%および最も好ましくは少なくとも98%同一であるタンパク質をコードする核酸分子;
c)配列番号:6の下(GFAT−2)または配列番号:8の下(細菌GFAT)または配列番号:10の下(細菌GFAT)に示されるヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含む核酸分子;
d)上記a)またはc)の下に示される核酸配列と、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、特に好ましくは少なくとも90%、非常に特に好ましくは少なくとも95%および最も好ましくは少なくとも98%同一である核酸分子;
e)上記a)またはc)の下に記載の核酸配列の少なくとも1鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子;
f)遺伝暗号の縮重に起因して、ヌクレオチド配列が上記a)またはc)の下に記載の核酸分子の配列と異なる核酸分子および
g)上記a)、b)、c)、d)、e)またはf)に記載の核酸分子の断片、対立遺伝子変異体および/または誘導体である核酸分子。
ハイブリダイゼーションバッファー:
2xSSC;10xデンハート液(Fikoll 400+PEG+BSA;比1:1:1);0.1% SDS;5mM EDTA;50mM Na2HPO4;250μg/mlのニシン精子DNA;50μg/mlのtRNA;
または
25Mリン酸ナトリウムバッファーpH7.2;1mM EDTA;7% SDS
ハイブリダイゼーション温度:
T=65〜68℃
洗浄バッファー:0.1xSSC;0.1% SDS
洗浄温度:T=65〜68℃。
a) グルタミン:フルクトース6−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームII(GFAT−2)の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌グルタミン:フルクトース6−リン酸アミドトランスフェラーゼ(細菌GFAT)の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を植物細胞に導入する工程;
b) 工程a)にしたがって取得された植物細胞から植物を再生する工程;
c) 適切であれば、工程b)に記載の植物を用いて別の植物を作製する工程。
a) 植物細胞を遺伝子改変し、その場合、該遺伝子改変は以下の工程i〜iiを任意の順序で含むか、あるいは以下の工程i〜iiの任意の組み合わせを、個別に、あるいは同時に実行する:
i) グルタミン:フルクトース6−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームII(GFAT−2)の活性を有するタンパク質をコードするか、あるいは細菌グルタミン:フルクトース6−リン酸アミドトランスフェラーゼ(細菌GFAT)の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を植物細胞に導入する工程;
ii) グルコサミノグリカンシンターゼをコードする外来性核酸分子を植物細胞に導入する工程;
b) 以下の工程に記載の遺伝子改変を含む植物細胞から植物を再生する:
i) a)i;
ii) a)ii;
iii) a)iおよびa)ii;
c) 工程:
i) b)iに記載の植物の植物細胞に工程a)iiに記載の遺伝子改変を導入する工程;
ii) b)iiに記載の植物の植物細胞に工程a)iに記載の遺伝子改変を導入する工程;
そして植物を再生する;
d) 適切であれば、工程b)iiiまたはc)iまたはc)iiのいずれかにしたがって取得された植物を用いて別の植物を作製する。
配列番号:1:パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1のヒアルロナンシンターゼをコードする核酸配列。
配列番号:2:パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1のヒアルロナンシンターゼのアミノ酸配列。上記アミノ酸配列は配列番号:1から導き出すことができる。
配列番号:3:パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1のヒアルロナンシンターゼをコードする合成核酸配列。上記配列のコドンは、それらが植物細胞中のコドンの使用に適合するように合成した。上記核酸配列は、配列番号:2の下に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
配列番号:4:マウス由来のGFAT−1の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号:5:マウス由来のGFAT−1の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。上記アミノ酸配列は配列番号:4から導き出すことができる。
配列番号:6:マウス由来のGFAT−2の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号:7:マウス由来のGFAT−2の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。上記アミノ酸配列は配列番号:6から導き出すことができる。
配列番号:8:大腸菌由来の細菌GFATの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号:9:大腸菌由来のGFATの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。上記アミノ酸配列は配列番号:8から導き出すことができる。
配列番号:10:大腸菌由来のGFATの活性を有するタンパク質をコードする合成核酸配列。上記配列のコドンは、それらが植物細胞中のコドンの使用に適合するように合成した。上記核酸配列は、配列番号:9の下に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
配列番号:11:パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1のUDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号:12:パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1のUDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。上記アミノ酸配列は配列番号:11から導き出すことができる。
配列番号:13:パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1のUDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする合成核酸配列。上記配列のコドンは、それらが植物細胞中のコドンの使用に適合するように合成した。上記核酸配列は、配列番号:12の下に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
配列番号:14:実施例6で使用された合成オリゴヌクレオチド。
配列番号:15:実施例6で使用された合成オリゴヌクレオチド。
配列番号:16:実施例15で使用された合成オリゴヌクレオチド。
配列番号:17:実施例15で使用された合成オリゴヌクレオチド。
1.ジャガイモ植物の形質転換
アグロバクテリウムを活用してジャガイモ植物を形質転換した。該形質転換はRocha-Sosaら(EMBO J. 8, (1989), 23-29)に記載のように行った。
US 5,565,347に記載の方法にしたがって、アグロバクテリウムを活用してトマト植物を形質転換した。
Hieiら(1994, Plant Journal 6(2), 271-282)に記載の方法にしたがって、コメ植物を形質転換した。
還元末端を有するN−アセチル化グルコサミン誘導体は、ElsonおよびMorgan(1933, J Biochem. 27, 1824)の方法およびReissigら(1955, Biol. Chem. 217, 959-966)の改良された比色定量法と同様に決定した。該比色定量法は色素原III(Muckenschnabelら、1998, Cancer Letters 131, 13-20)とp−ジメチルアミノベンズアルデヒド(DMAB、エールリッヒ試薬)の反応に基づき、該反応によって赤色生成物が生じ、その濃度を光度測定によって決定することができる。
まず、回収された植物材料を細かく砕いた。使用された植物材料の量に基づいて、細かく砕く作業は、実験室の振動ボールミル(MM200(Retsch, Germany製))で30Hzで30秒間、またはWarringブレンダーを最大スピードで約30秒間使用して実行した。一般に、細かく砕かれた植物材料(例えば葉、塊茎またはコメ穀粒)0.5gを、7%過塩素酸、5mM EGTAからなる溶液1mlと混合し、氷上で20分間インキュベートした。次いで該混合物を遠心分離した(16 000xgで5分、4℃)。遠心分離後に得られた上清を取り出し、5M KOH、1M TEAからなる溶液(調節済みpH7.0)を使用して中和し、次いで再び遠心分離した(16 000xgで5分、4℃)。遠心分離の終了後に、上清を取り出し、その容量を決定し、b)の下に記載される方法に使用して、還元末端を有するN−アセチル化グルコサミン誘導体の量を決定した。
0.8M K2B4O7からなる溶液20μl(pH9.6)をa)の下に記載される方法によって得られる植物抽出物100μlに加え、十分に混合した後、95℃で5分間加熱する。混合物を室温に冷却した後、0.7mlのエールリッヒ試薬(濃HCl 12.5 ml中のDMAB 10g、氷酢酸87.5mlからなり、氷酢酸で1:10希釈されている溶液)を混合物に加え、該混合物を再び混合し、37℃でさらに30分間インキュベートする。次いで該混合物を16 000xgで1分間遠心分離し、次いで遠心分離後に得られる上清の光学濃度(OD)を光度計で585nmで決定する。
まず、規定量のN−アセチルグルコサミン6−リン酸を使用して検量線を確立した。この目的を達成するために、b)の下に記載される方法にしたがって、0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mMおよび10mMのN−アセチルグルコサミン6−リン酸を含む溶液のODを決定した。
植物組織中のヒアルロナンの存在を検出し、ヒアルロナン含量を決定するために、植物材料を以下のように精密検査した:200μlの水(脱塩済み、伝導率=18MΩ)を約0.3gの葉または塊茎材料に加え、実験室の振動ボールミル(MM200(Retsch, Germany製))(30Hzで30秒)で該混合物を細かく砕いた。次いでさらに800μlの水(脱塩済み、伝導率=18MΩ)を加え、該混合物を(例えばボルテックスミキサーを使用して)十分に混合した。16 000xgで5分間遠心分離することによって上清から細胞片および不溶性成分を分離した。得られた上清の一定分量を使用して、ヒアルロナンの量を決定した。
100mlの水(脱塩済み、伝導率=18MΩ)を加えた後、約100グラムの植物材料をWarringブレンダーで最大速度で約30秒間細かく砕いた。植物の比較的大きい部分、例えば塊茎またはトマト果実を単離に使用する場合、それらを前もってカットして約1cm3のサイズの小片にした。次いで茶こし(tea sieve)を使用して細胞片を除去した。分離された細胞片を300mlの水(脱塩済み、伝導率=18MΩ)にもう一度懸濁し、茶こしを使用して再び除去した。得られた2懸濁液(100ml+300ml)をまとめ、13 000xgで15分間遠心分離した。得られた遠心分離上清にNaClを1%の終濃度に達するまで加えた。NaClが溶解した後、2倍容量のエタノールを加え、次いで十分に混合し、−20℃で一晩インキュベートすることによって沈殿させた。次いで混合物を13 000xgで15分間遠心分離した。この遠心分離後に得られた沈降沈殿物を100mlのバッファー(50mM TrisHCl、pH8、1mM CaCl2)に溶解し、次いでプロテイナーゼKを加え、終濃度を100μg/mlにし、該溶液を42℃で2時間インキュベートした。その後、95℃10分間インキュベートした。もう一度、この溶液にNaClを1%の終濃度に達するまで加えた。NaClが溶解した後、2倍容量のエタノールを加え、十分に混合し、−20℃で約96時間インキュベートすることによってさらに沈殿させた。その後、13 000xgで15分間遠心分離した。この遠心分離後に得られた沈降沈殿物を30mlの水(脱塩済み、伝導率=18MΩ)に溶解し、もう一度、NaClを加えて終濃度を1%にした。2倍容量のエタノールを加え、十分に混合し、−20℃で一晩インキュベートすることによって、さらに沈殿させた。続く13 000xgで15分間の遠心分離後に得られた沈殿物を20mlの水(脱塩済み、伝導率=18MΩ)に溶解した。
ヒアルロナンは、市販の検査(ヒアルロン酸(HA)検査キット(Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029-001))を製造元の指示書にしたがって使用して検出した。ここに該指示書は参照により本説明に組み入れられる。検査原理は、ヒアルロナンに特異的に結合するタンパク質(HABP)の有効性に基づく。該検査はELISAと同様に実行する。その場合、呈色反応によって試験サンプル中のヒアルロナン含量が示される。したがって、ヒアルロナンの定量では、測定対象のサンプルを、規定の限界内である濃度で使用すべきであろう(例えば:限界を超えているか、あるいは限界に達していないかに応じて、目的のサンプルを希釈するか、あるいは植物組織からヒアルロナンを抽出するために少量の水しか使用しない)。
GFATの活性を有するタンパク質の活性はRachelら(1996, J. Bacteriol. 178 (8), 2320-2327)に記載のように決定する。
質量分析によってN−アセチル化グルコサミン誘導体を検出するために、一般的方法項目4a)の下に記載のように植物組織を精密検査した。可能な限り塩を含まない抽出物を取得するために、それぞれのサンプルを、質量分析による検査前に、まず−20℃で凍結し、遠心分離(室温で16 000xg)中に解凍した。測定のために、1:1(容量/容量)の割合のメタノール:水混合物で上清を1:20希釈した。
質量範囲50〜700Da。
検出器感度:2000、2050および2100。
1.マウス由来のGFAT−1の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の取得
GFAT−1(グルタミン:フルクトース6−リン酸アミドトランスフェラーゼまたはグルコサミン6−リン酸シンターゼ、EC 2.6.1.16)の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列はBioCat GmbH, Heidelberg, Germanyから購入した(Art. No. MMM1013-65346, cDNAクローン MGC:58262, IMAGE:6742987)。これは、I.M.A.G.E.コンソーシアム(http://image.llnl.gov)が生産し、BioCat GmbHが販売しているクローンである。GFAT−1の活性を有するタンパク質をコードするcDNAをベクターpCMV Sport 6(Invitrogen)にクローニングした。該プラスミドをIC 365−256と命名した。Mus musculus由来のGFAT−1の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列は配列番号:4の下に記載されている。
GFAT−2(グルタミン:フルクトース6−リン酸アミドトランスフェラーゼまたはグルコサミン6−リン酸シンターゼ、EC 2.6.1.16)の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列はInvitrogenから購入した(クローンID 4167189, cDNAクローン MGC:18324, IMAGE:4167189)。これは、I.M.A.G.E.コンソーシアム(http://image.llnl.gov)が生産し、Invitrogenが販売しているクローンである。GFAT−2の活性を有するタンパク質をコードするcDNAをベクターpCMV Sport 6(Invitrogen)にクローニングした。該プラスミドをIC 369−256と命名した。Mus musculus 由来のGFAT−2の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列は配列番号:6の下に記載されている。
Entelechon GmbHが合成した、大腸菌由来の細菌GFAT(グルタミン:フルクトース6−リン酸アミドトランスフェラーゼまたはグルコサミン6−リン酸シンターゼ、glms、EC 2.6.1.16)の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列をベクターpCR4Topo(Invitrogen)(Prod. No. K4510-20)にクローニングした。得られたプラスミドをIC 373−256と命名した。大腸菌由来の細菌GFATの活性を有するタンパク質をコードする合成核酸配列は配列番号:10の下に記載されている。大腸菌から最初に単離された対応する核酸配列は配列番号:8の下に記載されている。
Medigenomix GmbH(Munich, Germany)が合成した、パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1のヒアルロナンシンターゼをコードする核酸配列をベクターpCR2.1(Invitrogen)(Prod. No. K2000-01)にクローニングした。得られたプラスミドをIC 323−215と命名した。パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1由来のHASタンパク質をコードする合成核酸配列は配列番号:3の下に記載されている。パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1から最初に単離された対応する核酸配列は配列番号:1の下に記載されている。
Entelechon GmbHが合成した、パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1由来のUDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列をベクターpCR4Topo(Invitrogen)(Prod. No. K4510-20)にクローニングした。得られたプラスミドをIC 339−222と命名した。パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1由来のUDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質をコードする合成核酸配列は配列番号:13の下に記載されている。パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1から最初に単離された対応する核酸配列は配列番号:11の下に記載されている。
プラスミドpBinARはバイナリーベクタープラスミドpBin19(Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711-8721)の誘導体であり、以下のように構築した:
カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターのヌクレオチド6909〜7437を含む529bp断片をプラスミドpDH51(Pietrzakら、1986 Nucleic Acids Res. 14, 5858)からEcoR I/Kpn I断片として単離し、pUC18のポリリンカーのEcoR IおよびKpn I制限部位間にライゲートした。これによりプラスミドpUC18−35Sが得られた。制限エンドヌクレアーゼHind IIIおよびPvu IIを活用して、TiプラスミドpTiACH5(Gielenら、1984, EMBO Journal 3, 835-846)のT−DNAのオクトピンシンターゼ遺伝子(Gen 3)のポリアデニル化シグナル(3’末端)(ヌクレオチド11749〜11939)を含む192bp断片をプラスミドpAGV40(Herrera-Estrellaら、1983 Nature, 303, 209-213)から単離した。Pvu II制限部位にSph Iリンカーを付加した後、pUC18−35SのSph IおよびHind III制限部位間に該断片をライゲートした。これによりプラスミドpA7が得られた。このプラスミドから、35SプロモーターおよびOCSターミネーターを含むポリリンカー全体をEcoR IおよびHind IIIで切り出し、適切にカットされたベクターpBin19にライゲートした。これにより植物発現ベクターpBinARが得られた(HoefgenおよびWillmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230)。
制限エンドヌクレアーゼEcoR IおよびHind IIIを使用して、35Sプロモーター、OCSターミネーターおよびマルチクローニング部位全体を含む断片をプラスミドpA7から切り出し、ベクターpBIBHyg(Becker, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 203)にクローニングした。該ベクターは同制限エンドヌクレアーゼでカットされていた。得られたプラスミドをpBinARHygと命名した。
制限エンドヌクレアーゼXho IおよびHind IIIを使用してプラスミドIR 47−71からOCSターミネーターを含む核酸断片を単離し、ベクターpBlueScript KS(Stratagene製、Prod. No. 212207)にクローニングした。該ベクターは同制限エンドヌクレアーゼでカットされていた。得られたプラスミドをIC 306−204と命名した。
BamH IおよびXho Iでの制限消化によって、ヒアルロナンシンターゼのコード配列を含む核酸分子をプラスミドIC 323−215から単離し、プラスミドIR 47−71のBamH IおよびXho I制限部位にクローニングした。得られた植物発現ベクターをIC 341−222と命名した。
BamH IおよびKpn Iでの制限消化を使用して、パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1由来のUDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード配列を含む核酸分子をプラスミドIC 339−222から単離し、プラスミドpA7にクローニングした。該プラスミドは同制限エンドヌクレアーゼでカットされていた。得られたプラスミドをIC 342−222と命名した。
Eco RIを使用する制限消化によってIC 317−204から単離された、B33プロモーターおよびOCSターミネーターを含む核酸断片をプラスミドIC 349−222のEco RI制限部位にクローニングした。ここに、ヘッドトゥヘッド配向(head-to-head orientation)のプロモーター(25SおよびB33)が確保された。得られたベクターをIC 354−222と命名した。
マウス由来のGFAT−2の活性を有するタンパク質のコード配列を含む核酸断片をIC 369−256からXho IおよびEco RVでの制限消化によって単離し、プラスミドIC 354−222にクローニングした。該プラスミドはXho IおよびEcl 136 IIでカットされていた。得られた植物発現ベクターをIC 372−256と命名した。
大腸菌由来のGFATの活性を有するタンパク質のコード配列を含む核酸断片をIC 373−256からXho IおよびEco RVでの制限消化によって単離し、プラスミドIC 354−222にクローニングした。該プラスミドはXho IおよびEcl 136 IIでカットされていた。得られた植物発現ベクターをIC 375−271と命名した。
Ecl 136 IおよびXho Iでの制限消化によって、大腸菌由来の細菌GFATの活性を有するタンパク質のコード配列をプラスミドIC 373−256から単離し、ベクターpBinAR HygのSma IおよびSal I制限部位にライゲートした。得られた植物発現ベクターをIC 398−311と命名した。
コメ(Oryza sativa, 品種M202)の葉から単離されたゲノムDNAを使用し、DNAポリメラーゼ(Expand High Fidelity PCR Systems, Roche Prod. No.: 1732641)を使用するPCRによって、コメ由来のプロラミンプロモーターのDNA(EMBL アクセッションNO D63901, Shaら、1996, Biosci. Biotech. Biochem. 60, 335-337, Wuら、1998. Plant Cell Physiol. 39(8), 885-889)を単離した。このPCR反応から得られたアンプリコンを、TAクローニングキット(Invitrogen Prod. No.: KNM2040-01)を使用してベクターpCR2.1にクローニングした。得られたプラスミドをMI 4−154と命名した。
製造元が指定する条件およびバッファーならびに50ngのトータルDNAを使用した。
0.83μM dNTPミックス
0.25μM プライマーprol−F1
工程1 94℃ 15秒
工程2 60℃ 15秒
工程3 72℃ 45秒
a)ジャガイモ植物の形質転換
ジャガイモ植物(品種Desiree)を、一般的方法項目1に記載の方法によって、植物発現ベクターIC 398−311を使用して形質転換した。該ベクターは大腸菌由来の細菌GFATの活性を有するタンパク質のコード核酸配列をジャガイモ(Solanum tuberosum)由来のパタチン遺伝子B33のプロモーター(Rocha-Sosaら、1989, EMBO J. 8, 23-29)のコントロール下に含む。プラスミドIC 398−311で形質転換されて得られたトランスジェニック系統を432 ESと命名した。
温室で6cm鉢の土壌中で系統432 ESの植物を栽培した。各事例で、個々の植物から回収された約0.3g〜0.8gの葉材料を一般的方法項目4の下に記載の方法にしたがって精密検査し、N−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。増加したN−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する個々の植物に関して、以下の結果が得られた:
a)コメ植物の形質転換
一般的方法項目3の下に記載の方法にしたがって、植物発現ベクターIC 386−299でコメ植物(変種M202)を形質転換した。該ベクターはマウス由来のGFAT−2の活性を有するタンパク質のコード核酸配列を13kDaプロラミンポリペプチドのプロモーターのコントロール下に含む。プラスミドIC 386−299で形質転換されて得られたトランスジェニック系統をGAOS0788と命名した。
プラスミドIC 386−299での形質転換に由来する、系統GAOS0788の独立した植物を温室の土壌中で栽培した。各植物から、約20〜25個の成熟種子(穀粒)を回収し、殻むき器(dehusker)(Laboratory Paddy sheller, Grainman, Miami, Florida, USA)で殻を除去し、各系統の約7個の褐色コメ種子(プール)を実験室の振動ボールミル(MM200(Retsch, Germany)、30Hzで30秒間)で細かく砕き、穀粉を得た。そして、一般的方法項目4の下に記載の方法を使用して、N−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。増加したN−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する個々の植物に関して、以下の結果が得られた:
実施例b)で回収された種子は、形質転換後に直接得られた植物に由来し、ゆえに該植物は、目的のT−DNAのそれぞれの組み込み部位に関して異型接合性であった。したがって、メンデルの法則の遺伝の結果、分析された種子プールは、種々の量の目的のT−DNAを含む種子を含有した。形質転換によって組み込まれたT−DNAを全く有さない個々の種子がそれぞれのプールに存在する可能性もあった。ゆえに、系統GAOS0788−02401の植物および系統GAOS0788−00501の植物由来の、単一の、個々の褐色種子を、それらのN−アセチル化グルコサミン誘導体の含量に関して、一般的方法項目4の下に記載の方法によってそれぞれ調査した。以下の結果を得た:
a)GFAT−1の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含むトマト植物の生産
一般的方法項目2の下に記載の方法によって、植物発現ベクターIC 376−271でトマト植物(品種Moneymaker)を形質転換した。該ベクターは、UDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列およびGFAT−1の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む。プラスミド376−271で形質転換されて得られたトランスジェニック系統を420 ESと命名した。UDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質は、UDP−グルコースからのUDP−GlcAの合成を触媒する。GlcNAcに加えて、いくつかのグルコサミノグリカンシンターゼ、例えばヒアルロナンシンターゼは基質としてUDP−GlcAを必要とする。
温室で鉢の水栽培(hydroculture)中で系統420 ESの植物を栽培した。各事例で、個々の植物から回収された約5gの植物材料を一般的方法項目4の下に記載の方法を使用して精密検査し、N−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。ここに、植物ごとに、各精密検査サンプルに関して複数の独立した測定を実行した。個々の植物に関して以下の結果を得た:
一般的方法項目2の下に記載の方法によって、植物発現ベクターIC 372−256でトマト植物(品種Moneymaker)を形質転換した。該ベクターは、UDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列およびGFAT−2の活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む。プラスミドIC 372−256で形質転換されて得られたトランスジェニック系統を421 ESと命名した。
温室で鉢の水栽培中で系統421 ESの植物を栽培した。各事例で、個々の植物から回収された約5gの植物材料を一般的方法項目4の下に記載の方法を使用して精密検査し、N−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。ここに、植物ごとに、各精密検査サンプルに関して複数の独立した測定を実行した。個々の植物に関して以下の結果を得た:
一般的方法項目2の下に記載の方法によって、植物発現ベクターIC 375−271でトマト植物(品種Moneymaker)を形質転換した。該ベクターは、UDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列および細菌GFATの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を含む。プラスミドIC 375−271で形質転換されて得られたトランスジェニック系統を422 ESと命名した。
温室で鉢の水栽培中で系統422 ESの植物を栽培した。各事例で、個々の植物から回収された約5gの植物材料を一般的方法項目4の下に記載の方法を使用して精密検査し、N−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。ここに、植物ごとに、各精密検査サンプルに関して複数の独立した測定を実行した。個々の植物に関して以下の結果を得た:
系統420 ES、421 ESおよび422 ESの選択植物から成熟果実を回収した。個々の植物の種々のホールトマト果実を回収し、一般的方法項目4の下に記載の方法を使用して精密検査し、N−アセチル化グルコサミン誘導体の含量を決定した。ここで、植物の異なる果実に関して独立した測定を実行した。個々の植物に関して以下の結果を得た:
名称422 ES 13を有する植物の個々の異なる果実の抽出物を、一般的方法項目9の下に記載の方法にしたがって質量分析によって、N−アセチル化グルコサミン誘導体の存在に関して調査した。以下の結果を得た:
増加したN−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する植物が、増加したグルコサミノグリカン含量を有する植物を生産するために好適であるかどうかを決定するために、まず、グルコサミノグリカンシンターゼ(ヒアルロナンシンターゼ)を発現する植物を作製した。
それぞれ一般的方法項目1(ジャガイモ植物)および一般的方法項目2(トマト植物)の下に記載の方法を使用し、植物発現ベクターIC 341−222で、ジャガイモ植物(品種Desiree)およびトマト植物(品種Moneymaker)を形質転換した。該ベクターは、パラメシウム ブルサリアクロレラウイルス1由来のヒアルロナンシンターゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列を、Solanum tuberosum由来のパタチン遺伝子B33のプロモーター(Rocha-Sosaら、1989, EMBO J. 8, 23-29)のコントロール下に含む。プラスミドIC 341−222で形質転換されて得られたトランスジェニック系統をそれぞれ365 ES(ジャガイモ植物)および367 ES(トマト植物)と命名した。
温室で6cm鉢の土壌中で系統365 ESの個々の植物を栽培した。各事例で、一般的方法項目5の下に記載の方法を使用して個々の植物のジャガイモ塊茎の約0.3gの材料を精密検査した。一般的方法項目7の下に記載の方法を使用して、それぞれの植物抽出物中に存在するヒアルロナンの量を決定した。ここで、遠心分離後に得られた上清を1:10希釈して、ヒアルロナン含量を決定した。選択植物に関して以下の結果を得た:
温室で土壌中で栽培された系統367 ESの異なる選択トマト植物から、各事例で1葉を回収し、液体窒素中で凍結した。さらなる精密検査およびヒアルロナン含量の決定は、ジャガイモ植物の塊茎に関して実施例19b)に記載のように実行した。以下の結果を得た:
いくつかのグルコサミノグリカンシンターゼ(例えばヒアルロナンシンターゼ)は基質としてN−アセチル化グルコサミン誘導体およびUDP−GlcAを必要とする。したがって、発明者らは、まず、UDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質の増加した活性およびヒアルロナンシンターゼの活性を有するタンパク質の増加した活性を有する植物を作製した。
一般的方法項目1の下に記載の方法を使用して、植物発現ベクターIC 349−222で、系統365 ES 74のジャガイモ植物(実施例19b)を参照されたい)を形質転換した。該ベクターは、UDP−グルコースデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列を35Sプロモーターのコントロール下に含む。プラスミドIC 349−222で形質転換されて得られたトランスジェニック系統を423 ESと命名した。
温室で6cm鉢の土壌中で系統423 ESの植物を栽培した。各事例で、個々の植物から回収された約0.3g〜0.8gの葉材料を一般的方法項目5の下に記載の方法を使用して精密検査し、一般的方法項目7の下に記載の方法を使用してヒアルロナンの含量を決定した。増加したN−アセチルグルコサミン誘導体含量を有する個々の植物に関して、以下の結果を得た:
a)増加量のグルコサミノグリカンを合成するトマト植物の生産
一般的方法項目2の下に記載の方法を使用して、植物発現ベクターIC 372−256またはIC 375−271で、ヒアルロナンシンターゼをコードする核酸分子を有する系統367 ES 25のトマト植物(実施例19c)を参照されたい)を再び形質転換した。該ベクターは、GFATの活性を有するタンパク質の異なるアイソフォームをコードする核酸分子を含む。
温室で土壌中で栽培された系統399 ESおよび405 ESの異なるトマト植物から成熟果実を回収し、一般的方法項目7の下に記載のようにヒアルロナン含量を決定した。以下の結果を得た:
一般的方法項目1の下に記載の方法を使用して、植物発現ベクターIC 376−271、IC 372−256またはIC 375−271で、ヒアルロナンシンターゼをコードする核酸分子を含む系統365 ES 74のジャガイモ植物(実施例19b)を参照されたい)を再び形質転換した。該ベクターは、GFATの活性を有するタンパク質の異なるアイソフォームをコードする核酸分子を含む。
温室で土壌中で栽培された系統396 ES(GFAT−2)、404 ES(細菌GFAT)および409 ES(GFAT−1)の異なるジャガイモ植物から葉および/または塊茎材料を回収し、一般的方法項目7の下に記載のようにヒアルロナン含量を決定した。系統409 ESの植物に関して以下の結果を得た:
一般的方法項目1の下に記載の方法を使用して、植物発現ベクターIC 398−311で、ヒアルロナンシンターゼをコードする核酸分子を含む系統365 ES 74のジャガイモ植物(実施例19b)を参照されたい)を再び形質転換した。該ベクターは、細菌GFATの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む。この形質転換から得られた系統を433 ESと命名した。
温室で土壌中で栽培された系統433 ESの異なるジャガイモ植物から葉および/または塊茎材料を回収し、一般的方法項目7の下に記載のようにヒアルロナン含量を決定した。系統433 ESの植物に関して以下の結果を得た:
実施例16の結果は、細菌GFATの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む植物が、形質転換されていない野生型植物と比較して、かなり増加したN−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有することを示す。
Claims (10)
- 新鮮重量1グラムあたり少なくとも2μmolのN−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する遺伝子改変植物細胞または植物であって、ここで前記遺伝子改変植物細胞および植物は、GFAT−2の活性を有するタンパク質をコードするかまたは細菌GFATの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を有し、前記外来性核酸分子は、以下:
a)配列番号:7の下に記載のアミノ酸配列(GFAT−2)を有するタンパク質または配列番号:9の下に記載のアミノ酸配列(細菌GFAT)を有するタンパク質をコードする核酸分子;
b)配列が、配列番号:7の下(GFAT−2)または配列番号:9の下(細菌GFAT)に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるタンパク質をコードする核酸分子;
c)配列番号:6の下(GFAT−2)または配列番号:8の下(細菌GFAT)または配列番号:10の下(細菌GFAT)に示されるヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含む核酸分子;
d)上記a)またはc)の下に示される核酸配列と少なくとも90%同一である核酸分子;
e)上記a)またはc)の下に記載の核酸配列の少なくとも1鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子、ここで、ストリンジェントな条件は、以下
ハイブリダイゼーションバッファー:2xSSC;10xデンハート液(Fik
oll 400+PEG+BSA;比1:1:1);0.1% SDS;5
mM EDTA;50mM Na2HPO4;250μg/mlのニシン精子DNA
;50μg/mlのtRNA;
または
25Mリン酸ナトリウムバッファーpH7.2;1mM EDTA;7% S
DS
ハイブリダイゼーション温度:T=65〜68℃
洗浄バッファー:0.1xSSC;0.1% SDS
洗浄温度:T=65〜68℃
の条件を有する;
f)遺伝暗号の縮重に起因して、ヌクレオチド配列が上記a)またはc)の下に記載の核酸分子の配列と異なる核酸分子;
からなる群から選択される、遺伝子改変植物細胞または植物。 - 新鮮重量1グラムあたり少なくとも2μmolのN−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する、請求項1で特許請求される植物の部分。
- 新鮮重量1グラムあたり少なくとも2μmolのN−アセチル化グルコサミン誘導体含量を有する、請求項1で特許請求される植物の繁殖用材料。
- 遺伝子改変植物を生産するための方法であって、以下の工程:
A) グルタミン:フルクトース6−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームII(GFAT−2)の活性を有するタンパク質をコードするか、または細菌グルタミン:フルクトース6−リン酸アミドトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来性核酸分子を植物細胞に導入する工程;
ここで、前記外来性核酸分子は、以下:
a)配列番号:7の下に記載のアミノ酸配列(GFAT−2)を有するタンパク質
または配列番号:9の下に記載のアミノ酸配列(細菌GFAT)を有するタン
パク質をコードする核酸分子;
b)配列が、配列番号:7の下(GFAT−2)または配列番号:9の下(細菌G
FAT)に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるタンパク質を
コードする核酸分子;
c)配列番号:6の下(GFAT−2)または配列番号:8の下(細菌GFAT)
または配列番号:10の下(細菌GFAT)に示されるヌクレオチド配列また
はそれに相補的な配列を含む核酸分子;
d)上記a)またはc)の下に示される核酸配列と少なくとも90%同一である核
酸分子;
e)上記a)またはc)の下に記載の核酸配列の少なくとも1鎖とストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズする核酸分子、ここで、ストリンジェントな条件
は、以下
ハイブリダイゼーションバッファー:2xSSC;10xデンハート液(
Fikoll 400+PEG+BSA;比1:1:1);0.1
% SDS;5mM EDTA;50mM Na2HPO4;250μg/m
lのニシン精子DNA;50μg/mlのtRNA;
または
25Mリン酸ナトリウムバッファーpH7.2;1mM EDTA;7
% SDS
ハイブリダイゼーション温度:T=65〜68℃
洗浄バッファー:0.1xSSC;0.1% SDS
洗浄温度:T=65〜68℃である;
の条件を有する;
f)遺伝暗号の縮重に起因して、ヌクレオチド配列が上記a)またはc)の下に記載
の核酸分子の配列と異なる核酸分子;
からなる群から選択される;
B) 工程A)にしたがって取得された植物細胞から植物を再生する工程;
を含む方法。 - 工程B)に記載の植物を用いて別の植物を作製することをさらに含む、請求項4記載の方法。
- グルタミン:フルクトース6−リン酸アミドトランスフェラーゼのアイソフォームII(GFAT−2)の活性を有するタンパク質をコードするか、または細菌グルタミン:フルクトース6−リン酸アミドトランスフェラーゼ(細菌GFAT)の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の使用であって、ここで、前記核酸分子は、以下:
a)配列番号:7の下に記載のアミノ酸配列(GFAT−2)を有するタンパク質
または配列番号:9の下に記載のアミノ酸配列(細菌GFAT)を有するタン
パク質をコードする核酸分子;
b)配列が、配列番号:7の下(GFAT−2)または配列番号:9の下(細菌G
FAT)に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるタンパク質を
コードする核酸分子;
c)配列番号:6の下(GFAT−2)または配列番号:8の下(細菌GFAT)
または配列番号:10の下(細菌GFAT)に示されるヌクレオチド配列また
はそれに相補的な配列を含む核酸分子;
d)上記a)またはc)の下に示される核酸配列と少なくとも90%同一である核
酸分子;
e)上記a)またはc)の下に記載の核酸配列の少なくとも1鎖とストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズする核酸分子、ここで、ストリンジェントな条件
は、以下
ハイブリダイゼーションバッファー:2xSSC;10xデンハート液(
Fikoll 400+PEG+BSA;比1:1:1);0.1
% SDS;5mM EDTA;50mM Na2HPO4;250μg/m
lのニシン精子DNA;50μg/mlのtRNA;
または
25Mリン酸ナトリウムバッファーpH7.2;1mM EDTA;7
% SDS
ハイブリダイゼーション温度:T=65〜68℃
洗浄バッファー:0.1xSSC;0.1% SDS
洗浄温度:T=65〜68℃である;
の条件を有する;
f)遺伝暗号の縮重に起因して、ヌクレオチド配列が上記a)またはc)の下に記載
の核酸分子の配列と異なる核酸分子;
からなる群から選択される、遺伝子改変植物を製造するための使用。 - 請求項1で特許請求される遺伝子改変植物細胞を含む組成物。
- 請求項1で特許請求される植物から、請求項2で特許請求される植物の部分から、または請求項3で特許請求される繁殖用材料から取得可能な穀粉。
- 穀粉を生産するための方法であって、請求項2で特許請求される植物の部分または請求項3で特許請求される繁殖用材料を粉砕する工程を含む方法。
- 請求項1で特許請求される植物、請求項2で特許請求される植物の部分または請求項3 で特許請求される繁殖用材料の使用であって、穀粉を生産するための使用。
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