ES2327944T3 - Metodos y medios para producir hialuronano. - Google Patents
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Abstract
Célula de planta, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico que está integrada de manera estable en su genoma y codifica una hialuronano-sintasa, en donde los codones de las moléculas de ácido nucleico que codifican dicha hialuronano-sintasa están modificados de tal manera que los mismos están adaptados a la frecuencia del uso de los codones de la célula de planta en cuyo genoma se han integrado.
Description
Métodos y medios para producir hialuronano.
La presente invención se refiere a células de
plantas y plantas que sintetizan hialuronano, y a métodos para
producir dichas plantas, así como a métodos para preparar
hialuronano con ayuda de estas células de plantas o plantas.
Adicionalmente, la presente invención se refiere al uso de plantas
para preparar hialuronano y alimentos o piensos que contienen
hialuronano.
El hialuronano es un mucopolisacárido
(glucosaminoglucano) lineal no ramificado existente naturalmente que
está constituido por moléculas alternantes de ácido glucurónico y
N-acetil-glucosamina. El bloque de
construcción básico del hialuronano se compone del disacárido ácido
glucurónico-beta-1,3-N-acetil-glucosamina.
En el hialuronano, estas unidades repetitivas están unidas unas a
otras por enlaces beta-1,4.
En farmacia, se hace uso frecuentemente del
término ácido hialurónico. Dado que el hialuronano está presente en
la mayor parte de los casos como polianión y no como ácido libre, en
lo sucesivo, se utiliza preferiblemente el término hialuronano,
pero debe entenderse que cada término abarca ambas formas
moleculares.
El hialuronano tiene propiedades
físico-químicas inusuales, tales como, por ejemplo
propiedades de poli-electrólito, propiedades
viscoelásticas, una capacidad alta de fijar agua, propiedades de
formación de gel, que, además de otras propiedades del hialuronano,
se describen en un artículo de revisión publicado por Lapcik et
al. (1998), Chemical Reviews 98 (8),
2663-2684). Las propiedades específicas del
hialuronano están determinadas entre otras cosas por el peso
molecular y la distribución de pesos moleculares del hialuronano en
cuestión.
El hialuronano es un componente del tejido
conectivo extracelular y los fluidos corporales de los vertebrados.
En los humanos, el ácido hialurónico es sintetizado por la membrana
celular de todas las células del cuerpo, especialmente células
mesenquimáticas, y está presente ubicuamente en el cuerpo con una
concentración particularmente alta en los tejidos conectivos, la
matriz extracelular, el cordón umbilical, el fluido de las
articulaciones, el tejido cartilaginoso, la piel y el cuerpo vítreo
del ojo (Bernhard Gebauer, 1998,
Inaugural-Dissertation,
Virchow-Klinikum Medizinische Fakultät Charité der
Humboldt Universität zu Berlin; Fraser et al., 1997, Journal
of Internal Medicine 242, 27-33).
Recientemente, se ha encontrado también
hialuronano en organismos animales no vertebrados (moluscos) (Volpi
y Maccari, 2003, Biochemie 85, 619-625).
Adicionalmente, algunas bacterias patógenas
Gram-positivas (Streptococcus grupo A y C) y
bacterias Gram-negativas (Pasteurella)
sintetizan hialuronano como exopolisacáridos que protegen estas
bacterias contra el ataque por el sistema inmunitario de su
hospedador, dado que el hialuronano es una sustancia no
inmunógena.
Virus que infectan algas verdes monocelulares
del género Chlorella, algunas de las cuales están presentes
como endosimbiontes en especies de Paramecium, confieren a
las algas verdes monocelulares la capacidad de sintetizar
hialuronano después de infección por el virus (Graves et al.,
1999, Virology 257, 15-23). Hasta ahora, este es el
único ejemplo del reino sistemático de las plantas en el cual se ha
demostrado la síntesis de hialuronano. Sin embargo, la capacidad
para sintetizar hialuronano no es un rasgo que caracterice las algas
en cuestión. La capacidad de las algas para sintetizar hialuronano
está mediada por una infección con un virus cuyo genoma tiene una
secuencia que codifica hialuronano-sintasa
(DeAngelis, 1997, Sciences 278, 1800-1803).
Adicionalmente, el genoma del virus contiene secuencias que
codifican una
UDP-glucosa-deshidrogenasa
(UDP-Glc-DH) y una
glutamina:fructosa-6-fosfato-amidotransferasa
(GFTA). UDP-Glc-DH cataliza la
síntesis del ácido UDP-glucurónico utilizado como
sustrato para la hialuronano-sintasa. GFTA convierte
el fructosa-6-fosfato en
glucosamina-6-fosfato que es un
metabolito importante en el camino metabólico para la síntesis del
hialuronano. Ambos genes codifican proteínas activas que, al igual
que la hialuronano-sintasa del virus, se transcriben
simultáneamente en la fase precoz de la infección viral (DeAngelis
et al., 1997, Sciences 278, 1800-1803, Graves
et al., 1999, Virology 257, 15-23). Las
plantas no tienen en sí mismas ningún ácido nucleico en su genoma
que codifiquen proteínas que catalicen la síntesis de hialuronano
y, aunque han sido descritos y caracterizados un gran número de
carbohidratos de plantas, hasta ahora no ha sido posible detectar
hialuronano o moléculas afines a hialuronano en plantas no
infectadas (Graves et al., 1997, Virology
257, 15-23).
257, 15-23).
La catálisis de la síntesis del hialuronano es
efectuada por una enzima singular integrada en la membrana o
asociada a la membrana, la hialuronano-sintasa. Las
hialuronano-sintasas que han sido estudiadas hasta
ahora pueden clasificarse en dos grupos:
hialuronano-sintasas de Clase I y
hialuronano-sintasas de Clase II (DeAngelis, 1999,
CMLS, Cellular and Molecular Life Sciences 56,
670-682).
Las hialuronano-sintasas de los
vertebrados se distinguen adicionalmente por las isoenzimas
identificadas. A las diferentes isoenzimas se hace referencia en el
orden de su identificación utilizando números arábigos (por
ejemplo, hsHAS1, hsHAS2, hsHAS3).
Las propiedades inusuales del hialuronano
ofrecen una abundancia de posibilidades para aplicación en diversos
campos tales como, por ejemplo, farmacia, la industria de los
cosméticos, en la producción de alimentos y piensos, en
aplicaciones técnicas (por ejemplo como lubricantes), etc. Las
aplicaciones más importantes en las que está siendo utilizado
actualmente el hialuronano se encuentran en el campo médico y el de
los cosméticos (véase, por ejemplo, Lapcik et al., 1998,
Chemical Reviews 98 (8), 2663-2684, Goa y Benfield,
1994, Drugs 47 (3), 536-566).
En el campo médico, están utilizándose
actualmente productos que contienen hialuronano para el tratamiento
intraarticular de la artrosis, y se utilizan en oftálmica para la
cirugía del ojo. El hialuronano se utiliza también para tratar
trastornos de las articulaciones en los caballos de carreras.
Adicionalmente, el ácido hialurónico es un componente de algunos
rinológicos que, por ejemplo, en la forma de gotas oftálmicas y
productos relacionados con las fosas nasales, sirven para humedecer
las membranas mucosas secas. Soluciones inyectables que contienen
hialuronano se utilizan como analgésicos y antirreumáticos. Parches
que comprenden hialuronano o hialuronano derivatizado se emplean en
la curación de las heridas. Como dermáticos, se utilizan implantes
de gel que contienen hialuronano para la corrección de deformaciones
de la piel en cirugía plástica.
Para aplicaciones farmacológicas, se da
preferencia a la utilización de hialuronano que tiene un peso
molecular alto.
En medicina cosmética, las preparaciones de
hialuronano se encuentran entre los materiales más adecuados de
relleno de la piel. Por inyección de hialuronano, durante un periodo
de tiempo limitado, es posible alisar arrugas o aumentar el volumen
de los labios.
En productos cosméticos, en particular en cremas
y lociones de la piel, se utiliza frecuentemente hialuronano como
humidificador en virtud de su alta capacidad de fijación de
agua.
Posibilidades adicionales de aplicación en el
campo médico y cosmético, tales como, por ejemplo, el uso de
hialuronano como vehículo para compuestos activos que asegura una
liberación controlada del compuesto activo durante un periodo de
tiempo prolongado, como vehículo para compuestos activos que
transporta los compuestos activos de una manera direccionada al
sistema linfático o como compuesto activo que, después de aplicación
como ungüento, asegura que el compuesto activo se mantiene en la
piel durante un periodo de tiempo relativamente largo, se describen
en Lapcik et al. (1998, Chemical Reviews 98 (8),
2663-2684). El uso de derivados de hialuronano en
el campo medicinal requiere esfuerzos de investigación adicionales;
sin embargo, los primeros resultados han revelado ya un gran
potencial (Lapcik et al., 1998, Chemical Reviews 98 (8),
2663-2684).
Adicionalmente, preparaciones que contienen
hialuronano se venden como los denominados nutrientes farmacéuticos
(suplementos alimentarios) que pueden utilizarse también en animales
(por ejemplo perros, caballos) para la profilaxis y el alivio de la
artrosis.
El hialuronano utilizado para propósitos
comerciales se aísla actualmente de tejidos animales (crestas de
gallo) o se prepara por fermentación utilizando cultivos
bacterianos.
El documento US 4.141.973 describe un proceso
para aislamiento de hialuronano a partir de crestas de gallo o
alternativamente de cordones umbilicales. Además de hialuronano, los
tejidos animales (por ejemplo crestas de gallo, cordones
umbilicales) contienen también otros mucopolisacáridos afines a
hialuronano, tales como sulfato de condroitina, sulfato de
dermatano, sulfato de keratano, sulfato de heparano y heparina.
Adicionalmente, los organismos animales contienen proteínas
(hialadherinas) que se fijan específicamente a hialuronano y que
son necesarias para las más diversas funciones en el organismo,
tales como, por ejemplo, la degradación del hialuronano en el
hígado, la función del hialuronano como estructura conductora para
la migración celular, la regulación de la endocitosis, el anclaje
del hialuronano en la superficie celular o la formación de redes de
hialuronano (Turley, 1991, Adv Drug Delivery Rev 7, 257 y sigtes.;
Laurent y Fraser, 1992, FASEB J. 6, 183 y sigtes.; Stamenkovic y
Aruffo, 1993, Methods Enzymol. 245, 195 y sigtes.; Knudson y
Knudson, 1993, FASEB 7, 1233 y sigtes.).
Las cepas de Streptococcus utilizadas
para la producción bacteriana de hialuronano son exclusivamente
bacterias patógenas. Durante el cultivo, además, estas bacterias
producen exotoxinas (pirogénicas) y hemolisinas (estreptolisina,
(en particular alfa- y beta-hemolisina) (Kilian, M.:
Streptococcus and Enterococcus. En: Medical Microbiology.
Greenwood, D.; Slack, RCA; Peutherer, J.F. (compiladores). Capítulo
16. Churchill Livingstone, Edimburgo, Reino Unido: págs.
174-188, 2002, ISBN 0443070776) que se liberan en el
medio de cultivo. Esto hace más difícil la purificación y el
aislamiento del hialuronano preparado con ayuda de cepas de
Streptococcus. En particular para la aplicación
farmacéutica, la presencia de exotoxinas y hemolisinas en la
preparación es un problema.
US 4.801.539 describe la preparación de
hialuronano por fermentación de una cepa bacteriana mutagenizada
(Streptococcus zooedemicus). La cepa bacteriana mutagenizada
utilizada ya no sintetiza beta-hemolisina. El
rendimiento alcanzado era 3,6 g de hialuronano por litro de
cultivo.
EP 0694616 describe un método para cultivar
Streptococcus zooedemicus o Streptococcus equi, donde,
en las condiciones de cultivo empleadas, no se sintetiza cantidad
alguna de estreptolisina pero sí cantidades incrementadas de
hialuronano. El rendimiento alcanzado era 3,5 g de hialuronano por
litro de cultivo.
Durante el cultivo, las cepas de
Streptococcus liberan la enzima hialuronidasa en el medio de
cultivo, como consecuencia del cual, en este sistema de producción,
asimismo, el peso molecular se reduce durante la purificación. El
uso de cepas de Streptococcus
hialuronidasa-negativas o de métodos para la
producción de hialuronano en los que la producción de hialuronidasa
se inhibe durante el cultivo se describe en el documento US
4.782.046. El rendimiento alcanzado era hasta 2,5 g de hialuronano
por litro de cultivo, y el peso molecular medio máximo alcanzado
era 3,8 x 10^{6} Da, con una distribución de pesos moleculares de
2,4 x 10^{6} a 4,0 x 10^{6}.
Los documentos US 20030175902 y WO 03 054163
describen la preparación de hialuronano con ayuda de la expresión
heteróloga de una hialuronano-sintasa de
Streptococcus equisimilis en Bacillus subtilis. Para
conseguir la producción de cantidades suficientes de hialuronano,
además de la expresión heteróloga de una
hialuronano-sintasa, se requiere también la
expresión simultánea de una
UDP-glucosa-deshidrogenasa en las
células del género Bacillus. US 20030175902 y WO 03 054163
no indican la cantidad absoluta de hialuronano obtenida en la
producción con ayuda de Bacillus subtilis. El peso molecular
medio máximo alcanzado era aproximadamente 4,2 x 10^{6}. Sin
embargo, este peso molecular medio se alcanzó únicamente para la
cepa recombinante de Bacillus donde un gen que codificaba el
gen de hialuronano-sintasa de Streptococcus
equisimilis y el gen codificante de la
UDP-glucosa-deshidrogenasa de
Bacillus subtilis se integraban en el genoma de Bacillus
subtilis bajo el control del promotor amyQ,
desactivándose al mismo tiempo el gen cxpY endógeno de
Bacillus subtilis (que codifica una oxidasa del citocromo
P450).
La producción de hialuronano por fermentación de
cepas bacterianas está asociada con costes elevados, dado que las
bacterias tienen que fermentarse en recipientes estériles
herméticamente cerrados en condiciones de cultivo controladas
costosas (véase, por ejemplo, US 4897349). Adicionalmente, la
cantidad de hialuronano que puede producirse por fermentación de
cepas bacterianas está limitada por las instalaciones de producción
presentes en cada caso. En este caso, debe tenerse también en cuenta
que, como consecuencia de las leyes físicas, no pueden construirse
fermentadores para volúmenes de cultivo excesivamente grandes. Puede
hacerse aquí mención particular de la mezcladura homogénea de las
sustancias alimentadas procedentes del exterior (por ejemplo
fuentes de nutrientes esenciales para bacterias, reactivos para
regulación del pH, oxígeno) con el medio de cultivo requerido para
la producción eficiente, que, en fermentadores grandes, puede
asegurarse únicamente con grandes inversiones industriales, en todo
caso.
La purificación del hialuronano a partir de
organismos animales es complicada debido a la presencia, en los
tejidos animales, de otros mucopolisacáridos y proteínas que se
fijan específicamente al hialuronano. En los pacientes, el uso de
preparaciones medicinales que contengan hialuronano contaminadas con
proteínas animales puede dar como resultado reacciones
inmunológicas indeseables del cuerpo (US 4.141.973), en particular
si el paciente es alérgico a proteínas animales (por ejemplo la
clara de huevo de gallina). Adicionalmente, las cantidades
(rendimientos) de hialuronano que pueden obtenerse a partir de
tejidos animales en calidad y pureza satisfactorias son bajas
(cresta de gallo: 0,079% p/p, EP 0144019, US 4.782.046), lo que
requiere el procesamiento de grandes cantidades de tejidos
animales. Un problema adicional en el aislamiento de hialuronano a
partir de tejidos animales consiste en el hecho en que el peso
molecular del hialuronano durante la purificación se reduce dado
que los tejidos animales contienen también una enzima degradante del
hialuronano (hialuronidasa).
Además de las hialuronidasas y exotoxinas
mencionadas, las cepas de Streptococcus producen también
endotoxinas que, cuando están presentes en productos
farmacológicos, plantean riesgos para la salud del paciente. En un
estudio científico, se demostró que incluso los productos
medicinales que contienen hialuronano existentes en el mercado
contienen cantidades detectables de endotoxinas bacterianas (Dick
et al., 2003, Eur J Opthamol. 13 (2),
176-184). Una desventaja adicional del hialuronano
producido con la ayuda de cepas de Streptococcus es el hecho
de que el hialuronano aislado tiene un peso molecular menor que el
hialuronano aislado de crestas de gallo (Lapcik et al.
(1998), Chemical Reviews 98 (8), 2663-84). US
20030134393 describe el uso de una cepa de Streptococcus
para producir hialuronano que sintetiza una cápsula de hialuronano
particularmente pronunciada (superencapsulada). El hialuronano
aislado después de fermentación tenía un peso molecular de 9,1 x
10^{6}. Sin embargo, el rendimiento era solamente 350 mg por
litro.
Aunque el hialuronano tiene propiedades
inusuales, debido a su escasez y su elevado precio se utiliza raras
veces, en todo caso, para aplicaciones industriales.
De acuerdo con ello, es un objeto de la presente
invención proporcionar medios y métodos que permiten la provisión
de hialuronano en cantidades y calidad suficientes y que hacen
posible proporcionar hialuronano incluso para aplicaciones
industriales y aplicaciones en el campo de alimentos y piensos.
Este objeto se consigue por las realizaciones
expuestas en las reivindicaciones.
Así pues, la presente invención se refiere a una
célula de planta o una planta, caracterizada porque la misma tiene,
integrada de manera estable en su genoma, una molécula de ácido
nucleico que codifica una hialuronano-sintasa.
La presente invención proporciona también
células de plantas o plantas que sintetizan hialuronano. Una
realización preferida son células de plantas de acuerdo con la
invención o plantas de acuerdo con la invención que sintetizan
hialuronano.
El hialuronano puede aislarse de células de
plantas de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo con la
invención. De acuerdo con ello, las células de plantas de acuerdo
con la invención o las plantas de acuerdo con la invención ofrecen,
comparadas con la técnica anterior, la ventaja de que pueden
cultivarse en grandes áreas para producir hialuronano con costes
reducidos. Esto conduce a la posibilidad de proporcionar hialuronano
en cantidades suficientes incluso para aplicación industrial en la
que no está siendo utilizado actualmente debido a su escasez y su
elevado precio. Los únicos organismos vegetales que han sido
descritos hasta ahora para síntesis de hialuronano, algas del
género Chlorella infectadas con virus, son inadecuados para
producir cantidades relativamente grandes de hialuronano. En la
producción de hialuronano, las algas infectadas con virus tienen la
desventaja de que los genes requeridos para la
hialuronano-sintasa no están integrados de manera
estable en su genoma (Van Etten y Meints, 1999, Annu. Rev.
Microbiol. 53, 447-494), por lo que, para producir
hialuronano, tienen que realizarse infecciones repetidas con el
virus. De acuerdo con ello, no es posible aislar células
individuales de Chlorella que sinteticen continuamente la
calidad y cantidad deseadas de hialuronano. Adicionalmente, en las
algas Chlorella infectadas con virus, el hialuronano se
produce únicamente durante un periodo de tiempo limitado, y como
resultado de la lisis causada por el virus, las algas se destruyen
sólo aproximadamente 8 horas después de la infección (Van Etten
et al., 2002, Arch Virol 147, 1479-1516). En
contraste, la presente invención ofrece la ventaja de que las
plantas o células de plantas de acuerdo con la invención pueden
propagarse de manera ilimitada vegetativa o sexualmente y de que las
mismas producen hialuronano continuamente.
Una ventaja adicional de la presente invención
comparada con la técnica anterior está basada en el hecho de que
las plantas de acuerdo con la invención son organismos autótrofos,
mientras que en la actualidad, se utilizan exclusivamente
organismos heterótrofos para la producción de hialuronano. Como es
sabido, el balance energético de los organismos heterótrofos es
considerablemente menos eficiente que en el caso de los organismos
autótrofos, dando como resultado costes mayores, al menos en la
producción de hialuronano por fermentación.
En el contexto de la presente invención, el
término "hialuronano" debe entenderse con el significado tanto
de un ácido libre (ácido hialurónico) como de la forma de polianión
de una glucosamina lineal que comprende una pluralidad de bloques
de construcción básicos del disacárido ácido
glucurónico-beta-1,3-N-acetil-glucosamina
unido por enlaces beta-1,4.
En el contexto de la presente invención, el
término "hialuronano-sintasa" (EC 2.4.1.212)
debe entenderse con el significado de una proteína que sintetiza
hialuronano a partir de los sustratos ácido
UDP-glucurónico (UDP-GlcA) y
N-acetil-glucosamina
(UDP-GlcNAc). La síntesis del hialuronano está
catalizada de acuerdo con el esquema de reacción siguiente:
nUDP-GlcA +
nUDP-GlcNAc \rightarrow
[GlcA-beta-1,3-GlcNAc]_{n}
+ 2 \
nUDP
Las moléculas de ácido nucleico y secuencias de
proteína correspondientes que codifican
hialuronano-sintasas han sido descritas, entre
otras, para los organismos siguientes: ocHas2 (Oryctolagus
cuniculus) (EMBL AB055978.1, US 20030235893) y ocHas3 de
conejo; paHas1 de babuino (Papio anubis) (EMBL AY463695.1);
xlHasl (EMBL M22249.1, US 20030235893), xlHas2 (DG42) (EMBL
AF168465.1), xlHas3 (EMBL AY302252.1) de rana (Xenopus
laevis); hsHAS1 (EMBL D84424.1, US 20030235893), hsHAS2 (EMBL
U54804.1, US 20030235893), hsHAS3 (EMBL AF232772.1, US 20030235893)
humanas (Homo sapiens); mmHas1 (EMBL D82964.1, US
20030235893), mmHAS2 (EMBL U52524.2, US 20030235893), mmHas3 (EMBL
U86408.2, US 20030235893) de ratón (Mus musculus); btHas2
(EMBL AJ004951.1, US 20030235893) de bovino (Bos taurus);
ggHas2 (EMBL AF106940.1, US 20030235893) de gallina (Gallus
gallus); rnHas1 (EMBL AB097568.1, Itano et al., 2004, J.
Biol. Chem. 279(18) 18679-18678), rnHas2
(EMBL AF008201.1), rnHas 3 (NCBI NM_172319.1, Itano et al.,
2004, J. Biol. Chem. 279(18) 18679-18678) de
rata (Rattus norvegicus); ecHAS2 (EMBL AY056582.1,
GI:23428486) de caballo (Equus caballus); sscHAS2 (NCBI
NM_214053.1, GI:47522921), sscHas 3 (EMBLAB159675) de cerdo (Sus
scrofa); brHasl (EMBL AY437407), brHas2 (EMBL AF190742.1),
brHas3 (EMBL AF190743.1) de pez cebra (Danio rerio);
Pasteurella multocida pmHas (EMBL AF036004.2);
Streptococcus pyogenes spHas (EMBL, L20853.1, L21187.1, US
6,455,304, US 20030235893); Streptococcus equis seHas (EMBL
AF347022.1, AY173078.1), Streptococcus uberis suHasA (EMBL
AJ242946.2, US 20030235893), Streptococcus equisimilis
seqHas (EMBL AF023876.1, US 20030235893); Sulfolobus
solfataricus ssHAS (US 20030235893), Sulfolobus tokodaii
stHas (AP000988.1), Virus Chlorella 1 de Paramecium bursaria,
cvHAS (EMBL U42580.3, PB42580, US 20030235893).
En el contexto de la presente invención, el
término "genoma" debe entenderse con el significado del
material genético completo presente en una célula de planta. Es
sabido por las personas expertas en la técnica que, además del
núcleo, otros compartimientos (por ejemplo plastos, mitocondrias)
contienen también material genético.
En el contexto de la presente invención, el
término "molécula de ácido nucleico integrada de manera
estable" debe entenderse con el significado de la integración de
una molécula de ácido nucleico en el genoma de la planta. Una
molécula de ácido nucleico integrada de manera estable se
caracteriza porque, durante la replicación del sitio de integración
correspondiente, la misma se multiplica junto con las secuencias de
ácido nucleico del hospedador que lindan con el sitio de
integración, por lo que el sitio de integración en la cadena de DNA
replicada está rodeado por las mismas secuencias de ácido nucleico
que en la cadena que sirve como matriz para la replicación.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico está integrada de
manera estable en el genoma del núcleo.
Una integración estable de una molécula de ácido
nucleico en el genoma de una célula de planta o una planta puede
demostrarse por métodos genéticos y/o métodos de biología molecular.
Una integración estable de una molécula de ácido nucleico en el
genoma de una célula de planta o en el genoma de una planta se
caracteriza porque en la progenie que ha heredado dicha molécula de
ácido nucleico, la molécula de ácido nucleico integrada de manera
estable está presente en el mismo entorno genómico que en la
generación parental. La presencia de una integración estable de una
secuencia de ácido nucleico en el genoma de una célula de planta o
en el genoma de una planta puede demostrarse utilizando métodos
conocidos por las personas expertas en la técnica, entre otros
medios con ayuda de análisis por transferencia Southern del análisis
RFL (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Nam et al.,
1989, The Plant Cell 1, 699-705; Leister y Dean,
1993, The Plant Journal 4 (4), 745-750), con
métodos basados en PCR, tales como, por ejemplo el análisis de las
diferencias de longitud en el fragmento amplificado (Amplified
Fragment Length Polymorphism, AFLP) (Castiglioni et al.,
1998, Genetics 149, 2039-2056; Meksem et
al., 2001, Molecular Genetics and Genomics 265,
207-214; Meyer et al., 1998, Molecular and
General Genetics 259, 150-160) o el uso de
fragmentos amplificados escindidos utilizando endonucleasas de
restricción (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences, CAPS)
(Konieczny y Ausubel, 1993, The Plant Journal 4,
403-410; Jarvis et al., 1994, Plant Molecular
Biology 24, 685-687; Bachem et al., 1996, The
Plant Journal 9 (5), 745-753).
Una realización adicional de la presente
invención se refiere a células de plantas de una planta verde
terrestre o plantas verdes terrestres que sintetizan
hialuronano.
En el contexto de la presente invención, el
término "planta verde terrestre (Embriofitas)", debe entenderse
como se define en Strasburger, "Lehrbuch der Botanik" [libro
de texto de Botánica], edición 34ª, Spektrum Akad. Verl., 1999,
(ISBN
3-8274-0779-6).
Una realización preferida de la presente
invención se refiere a células de plantas de acuerdo con la
invención de plantas multicelulares o plantas de acuerdo con la
invención que son organismos multicelulares. De acuerdo con ello,
esta realización se refiere a células de plantas o plantas que no
proceden de plantas monocelulares (protistas) o que no son
protistas.
En una realización adicionalmente preferida, la
presente invención se refiere a células de plantas de acuerdo con
la invención o plantas de acuerdo con la invención en las cuales la
molécula de ácido nucleico que codifica
hialuronano-sintasa se caracteriza porque la misma
codifica una hialuronano-sintasa Clase I.
Las hialuronano-sintasas que han
sido investigadas hasta ahora pueden clasificarse en dos grupos:
hialuronano-sintasas de Clase I y
hialuronano-sintasas de Clase II (DeAngelis 1999,
CMLS, Cellular and Molecular Life Sciences 56,
670-682). Esta clasificación está basada
esencialmente en estudios bioquímicos del mecanismo de reacción y
en el análisis de las secuencias de aminoácidos que codifican las
hialuronano-sintasas en cuestión. La Clase I
incluye entre otras las hialuronano-sintasas de
Streptococcus pyogenes (spHas), Streptococcus
equisimilis (seHas), Virus Chlorella 1 de Paramecium
bursaria (cvHas) y las hialuronano-sintasas
conocidas de los vertebrados (Xenopus laevis, xlHas; Homo
sapiens, hsHAS, Mus musculus (mmHas). Las
hialuronano-sintasas de Clase I tienen una
secuencia de aminoácidos que contiene 417 a 588 aminoácidos. Las
hialuronano-sintasas de Clase I son proteínas que
están integradas en una membrana del citoplasma y tienen múltiples
regiones (cinco a siete) asociadas a la membrana. El alargamiento
del hialuronano con bloques de construcción moleculares adicionales
tiene lugar probablemente en un extremo reductor del polímero.
Moléculas aceptoras adecuadas utilizadas por las
hialuronano-sintasas de Clase I no han sido
descritas hasta ahora.
Hasta la fecha, la
hialuronano-sintasa de Pasteurella es el
único representante conocido de hialuronano-sintasas
de Clase II. Su secuencia de proteínas tiene 972 aminoácidos. Es
una proteína soluble que, en su término C, contiene secuencias de
aminoácidos responsables de la localización en la membrana
citoplásmica (Jing y DeAngelis, 2000, Glycobiology 10,
883-889). La interacción tiene lugar probablemente
por la vía de moléculas asociadas con la membrana citoplásmica. En
el caso de la enzima de Clase II, el hialuronano es sintetizado por
extensión en el extremo no reductor (DeAngelis, 1999, J. Biol.
Chem. 274, 26557-26562). La síntesis de hialuronano
por la enzima de Clase II no requiere una molécula aceptora; sin
embargo, se demostró que se utilizan como aceptor oligómeros de
hialuronano (DP4) y que la velocidad de síntesis se incrementa por
la adición de los aceptores (DeAngelis, 1999, J. Biol. Chem. 274,
26557-26562).
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a células de plantas de acuerdo con la
invención o plantas de acuerdo con la invención en las cuales la
molécula de ácido nucleico que codifica
hialuronano-sintasa se caracteriza porque codifica
una hialuronano-sintasa de vertebrados o una
hialuronano-sintasa viral. Preferiblemente, la
molécula de ácido nucleico que codifica la
hialuronano-sintasa codifica una
hialuronano-sintasa de mamíferos o una
hialuronano-sintasa de un virus que infecta
algas.
Con relación a un virus que infecta algas, la
molécula de ácido nucleico que codifica
hialuronano-sintasa codifica de modo
particularmente preferible una hialuronano-sintasa
de un virus que infecta Chlorella, de modo especialmente
preferible una hialuronano-sintasa de un virus
Chlorella 1 de Paramecium bursaria.
Con relación a la molécula de ácido nucleico que
codifica una hialuronano-sintasa de mamíferos, se da
preferencia a una hialuronano-sintasa humana, en
particular hialuronano-sintasa humana 3.
En una realización preferida adicional, la
presente invención se refiere a células de plantas de acuerdo con
la invención o plantas de acuerdo con la invención en las cuales la
molécula de ácido nucleico que codifica
hialuronano-sintasa se caracteriza porque los
codones de la molécula de ácido nucleico que codifica una
hialuronano-sintasa están modificados comparados
con los codones de la molécula de ácido nucleico que codifica la
hialuronano-sintasa del organismo parental de la
hialuronano-sintasa. De modo particularmente
preferible, los codones de la hialuronano-sintasa
están modificados de tal manera que los mismos están adaptados a la
frecuencia del uso de codones de la célula de planta o la planta en
cuyo genoma se integran los mismos. Debido a la degeneración del
código genético, los aminoácidos pueden ser codificados por uno o
más codones. En diferentes organismos, los codones que codifican un
aminoácido se utilizan a frecuencias diferentes. La adaptación del
codón de una secuencia de ácido nucleico codificante a la
frecuencia de su uso en la célula de planta o en la planta en cuyo
genoma debe integrarse la secuencia a expresar puede contribuir a
una cantidad incrementada de proteína traducida y/o a la estabilidad
del mRNA en cuestión en las células de planta o plantas
particulares. La frecuencia del uso de codones en las células de
plantas o plantas en cuestión puede ser determinada por la persona
experta en la técnica examinando tantas secuencias de ácido
nucleico codificantes del organismo en cuestión como sea posible en
cuanto a la frecuencia con la que se utilizan ciertos codones para
codificar cierto aminoácido. La frecuencia del uso de codones de
ciertos organismos es conocida por las personas expertas en la
técnica, y puede determinarse de una manera simple y rápida
utilizando programas de ordenador. Programas de ordenador adecuados
están accesibles al público y son proporcionados gratuitamente,
entre otros sitios, en Internet (por ejemplo,
http://gcua.schoedl.de/; http://www.kazusa.or.jp/codon/;
http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html). La adaptación
de los codones de una secuencia de ácido nucleico codificante a la
frecuencia de su uso en la célula de la planta o en la planta en
cuyo genoma debe integrarse la secuencia a expresar puede realizarse
por mutagénesis in vitro o, preferiblemente, por síntesis
de novo de la secuencia génica. Métodos para la síntesis
de novo de secuencias de ácido nucleico son conocidos por
las personas expertas en la técnica. Una síntesis de novo
puede llevarse a cabo, por ejemplo, por síntesis inicial de
oligonucleótidos de ácido nucleico individuales, hibridación de
éstos con oligonucleótidos complementarios a los mismos, de tal modo
que formen una doble cadena de DNA, y ligación posterior de los
oligonucleótidos bicatenarios individuales de tal modo que se
obtenga la secuencia de ácido nucleico deseada. La síntesis de
novo de secuencias de ácido nucleico con inclusión de la
adaptación de la frecuencia con la cual se utilizan los codones en
un cierto organismo diana puede solicitarse también de compañías
que ofrecen este servicio (por ejemplo Entelechon GmbH, Regensburg,
Alemania).
En una realización preferida adicional, la
presente invención se refiere a células de plantas de acuerdo con
la invención o plantas de acuerdo con la invención en las que la
molécula de ácido nucleico que codifica
hialuronano-sintasa se caracteriza porque la misma
codifica una hialuronano-sintasa que tiene la
secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 4,
SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14,
SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO
24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, SEQ ID
NO 34, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ
ID NO 44, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52,
SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 60 o SEQ ID NO
62. De modo particularmente preferible, la molécula de ácido
nucleico que codifica la hialuronano-sintasa se
caracteriza porque la misma codifica una
hialuronano-sintasa que tiene la secuencia de de
aminoácidos representada en SEQ ID NO 2 o SEQ ID NO 6, de modo
especialmente preferible una hialuronano-sintasa
que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO 4 o
SEQ ID NO 8.
En otra realización preferida adicional, la
presente invención se refiere a células de plantas de acuerdo con
la invención o plantas de acuerdo con la invención en las cuales la
molécula de ácido nucleico que codifica la
hialuronano-sintasa se caracteriza porque comprende
una secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO 1, SEQ ID
NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO
13, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID
NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31, SEQ
ID NO 33, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 41,
SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO
51, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 57, SEQ ID NO 59 o SEQ ID
NO 61. De modo particularmente preferible, la molécula de ácido
nucleico que codifica la hialuronano-sintasa se
caracteriza porque comprende una secuencia de ácido nucleico
representada en SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 5, de modo especialmente
preferible una hialuronano-sintasa que tiene la
secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO 3 o SEQ ID NO
7.
El plásmido IC 341-222, que
comprende una molécula sintética de ácido nucleico que codifica una
hialuronano-sintasa del virus Chlorella de
Paramecium bursaria y el plásmido IC 362-237
que comprende una molécula sintética de ácido nucleico que codifica
una hialuronano-sintasa 3 de Homo sapiens
fueron depositados en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunswick, Alemania, en
fecha 25.08.2004 bajo los números DSM16664 y DSM16665,
respectivamente. La secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID
NO 4 puede derivarse de la región codificante de la secuencia de
ácido nucleico integrada en el plásmido IC 341-222
y codifica una hialuronano-sintasa del virus
Chlorella 1 de Paramecium bursaria. La secuencia de
aminoácidos representada en SEQ ID NO 8 puede derivarse de la región
codificante de la secuencia de DNA integrada en el plásmido IC
362-237 y codifica una
hialuronano-sintasa 3 de Homo sapiens.
De acuerdo con ello, la presente invención se
refiere también a células de plantas de acuerdo con la invención o
plantas de acuerdo con la invención en las cuales la molécula de
ácido nucleico que codifica la hialuronano-sintasa
se caracteriza porque la misma codifica una proteína cuya secuencia
de aminoácidos puede derivarse de la región codificante de la
secuencia de ácido nucleico insertada en el plásmido DSM16664 o
DSM16665.
Están disponibles un gran número de técnicas
para integrar de manera estable moléculas de ácido nucleico en una
célula de planta hospedadora. Estas técnicas incluyen la
transformación de células de plantas con T-DNA
utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
rhizogenes como medios para la transformación, la fusión de
protoplastos, inyección, la electroporación de DNA, la introducción
de DNA utilizando un método biolístico y opciones adicionales
(revisadas en "Transgenic Plants", Leandro ed., Humana Press
2004, ISBN
1-59259-827-7).
El uso de transformación mediada por
agrobacterias de células de plantas ha sido estudiado intensivamente
y se describe con suficiente detalle en EP 120516; Hoekema, en: The
Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V.
Alblasserdam (1985), Capítulo V; Fraley et al., Crit. Rev.
Plant Sci. 4, 1-46 y en An et al. EMBO J. 4,
(1985), 277-287. Para la transformación de la
patata, véase, por ejemplo, Rocha-Sosa et
al., EMBO J. 8, (1989), 29-33, y para la
transformación de plantas de tomate véase, por ejemplo, US
5.565.347.
Se describe también la transformación de plantas
monocotiledóneas utilizando vectores basados en transformación de
Agrobacterium (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22,
(1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6,
(1994) 271-282; Deng et al., Science in
China 33, (1990), 28-34; Wilmink et al.,
Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May et
al., Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner
y Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555;
Ritchie et al., Transgenic Res. 2, (1993),
252-265). Un sistema alternativo para transformar
plantas monocotiledóneas es la transformación que utiliza el método
biolístico (Wan y Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994),
37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11
(1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol.
Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer et al.,
Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631), la
transformación de protoplastos, la electroporación de células
parcialmente permeabilizadas o la introducción de DNA utilizando
fibras de vidrio. En particular, la transformación del maíz ha sido
descrita repetidas veces en la bibliografía (véase, por ejemplo,
W095/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm et al.,
Biotechnology 8, (1990), 833-844;
Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990),
603-618; Koziel et al., Biotechnology 11
(1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl.
Genet. 80, (1990), 721-726).
Transformaciones con éxito de otras especies de
cereales han sido ya descritas también, por ejemplo para la cebada
(Wan y Lemaux, véase arriba; Ritala et al., véase arriba;
Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74) y
para el trigo (Nehra et al., Plant J. 5, (1994),
285-297; Becker et al., 1994, Plant Journal
5, 259-307). Todos los métodos anteriores son
adecuados en el contexto de la presente invención.
Las células de plantas de acuerdo con la
invención y plantas de acuerdo con la invención que tienen una
molécula de ácido nucleico que codifica una
hialuronano-sintasa integrada de manera estable en
su genoma pueden ser identificadas, entre otras cosas, por el hecho
de que las mismas tienen al menos una copia de una molécula de
ácido nucleico que codifica una hialuronano-sintasa
integrada de manera estable en su genoma. Esto puede comprobarse,
por ejemplo, por un análisis mediante transferencia Southern.
Adicionalmente, las células de plantas de
acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con la invención
tienen preferiblemente al menos uno de los rasgos distintivos
siguientes: las células de plantas de acuerdo con la invención o
las plantas de acuerdo con la invención tienen transcritos de las
moléculas de ácido nucleico integradas establemente en el genoma y
que codifican una hialuronano-sintasa. Éstos pueden
identificarse, por ejemplo, por análisis mediante transferencia
Northern o por RT-PCR (Reacción en Cadena de
Polimerasa con Transcripción Inversa). Preferiblemente, las células
de plantas de acuerdo con la invención y las plantas de acuerdo con
la invención contienen una proteína que es codificada por moléculas
de ácido nucleico integradas de manera estable en el genoma que
codifican una hialuronano-sintasa. Esto puede
comprobarse, por ejemplo, por métodos inmunológicos, en particular
por un análisis mediante transferencia Western.
Métodos para preparación de anticuerpos que
reaccionan específicamente con una proteína determinada, es decir
que se fijan específicamente a dicha proteína, son conocidos por las
personas expertas en la técnica (véase, por ejemplo, Lottspeich y
Zorbas (compiladores), 1998, Bioanalytik [Bioanálisis], Spektrum
akad, Verlag, Heidelberg, Berlín, ISBN
3-8274-0041-4).
Algunas compañías (por ejemplo Eurogentec, Bélgica) ofrecen la
preparación de tales anticuerpos como servicio. Anticuerpos que
reconocen específicamente hialuronano-sintasas se
describen, por ejemplo, en Jacobson et al., 2000, Biochem J.
348, 29-35).
Las células de plantas de acuerdo con la
invención o las plantas de acuerdo con la invención que sintetizan
hialuronano pueden identificarse por aislamiento del hialuronano que
es sintetizado por las mismas y comprobación de su estructura.
Dado que los tejidos de plantas tienen la
ventaja de que no contienen hialuronidasas, puede utilizarse un
método de aislamiento simple y rápido para confirmar la presencia de
hialuronano en las células de plantas de acuerdo con la invención o
plantas de acuerdo con la invención. A este fin, se añade agua al
tejido de la planta a examinar y el tejido de la planta se tritura
luego mecánicamente (con ayuda de, por ejemplo, un molino de
cuentas, un mezclador Warring, un extractor de zumo, etc.). En caso
necesario, puede añadirse luego más agua a la suspensión, y los
residuos celulares y componentes insolubles en agua se separan luego
por centrifugación. La presencia de hialuronano en el sobrenadante
obtenido después de la centrifugación puede demostrarse luego
utilizando, por ejemplo, una proteína que se fija específicamente al
hialuronano. Un método para detección de hialuronano con ayuda de
una proteína que se fija específicamente a hialuronano se describe,
por ejemplo, en el documento US 5.019.498. Kits de test (por
ejemplo el kit de test de ácido hialurónico (HA) de Corgenix, Inc.,
Colorado, EE.UU., Proc. NO 029-001) para realización
del método descrito en US 5.019.498 están disponibles
comercialmente (por ejemplo el kit de test de ácido hialurónico (HA)
de Corgenix, Inc., Colorado, EE.UU., Proc. NO
029-001, véase también Métodos Generales, punto 6.).
En paralelo, es posible digerir inicialmente una parte alícuota del
sobrenadante de centrifugación obtenido con una hialuronidasa y
confirmar luego la presencia de hialuronano con ayuda de una
proteína que se fija específicamente a hialuronano, como se ha
descrito arriba. Por la acción de la hialuronidasa en el lote
paralelo, el hialuronano presente en el mismo se degrada, de tal
modo que después de la digestión completa ya no es posible detectar
cantidades significativas de hialuronano.
La presencia de hialuronano en el sobrenadante
de centrifugación puede confirmarse adicionalmente utilizando otros
métodos de análisis, tales como, por ejemplo, IR, NMR o
espectroscopia de masas.
La presente invención proporciona adicionalmente
células de plantas de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo
con la invención caracterizadas por el hecho de que la molécula de
ácido nucleico integrada de manera estable en el genoma de la
planta y que codifica una hialuronano-sintasa está
enlazada a elementos reguladores que inician la transcripción en
las células de plantas (promotores). En una realización preferida,
los promotores son promotores específicos de tejido, de modo
particularmente preferible promotores que inician la transcripción
específicamente en tubérculos, frutos o células de semillas de las
plantas.
Para la expresión de moléculas de ácido nucleico
de acuerdo con la invención que codifican
hialuronano-sintasa, éstas se enlazan
preferiblemente a las secuencias reguladoras de DNA que aseguran la
transcripción en las células de las plantas. Éstas incluyen en
particular promotores. Por regla general, son adecuados para la
expresión todos los promotores activos en células de plantas.
El promotor puede seleccionarse de tal manera
que la expresión tenga lugar constitutivamente o sólo en cierto
tejido, en un momento determinado a lo largo del desarrollo de la
planta o en un momento determinado por factores externos. El
promotor puede ser homólogo o heterólogo, tanto con respecto a la
planta como con respecto a la molécula de ácido nucleico.
Promotores adecuados son, por ejemplo, el
promotor del RNA 35S del virus del mosaico de la coliflor y el
promotor ubiquitina del maíz para expresión constitutiva, el
promotor del gen patatín B33 (Rocha-Sosa et
al., EMBO J. 8, (1989), 23-29) para expresión
específica de tubérculo en las patatas o un promotor específico del
fruto para el tomate, tal como, por ejemplo el promotor
poligalacturonasa (Montgomery et al., 1993, Plant Cell 5,
1049-1062) o el promotor E8 (Metha et al.,
2002, Nature Biotechnol. 20 (6) 613-618), o un
promotor que asegura la expresión únicamente en tejidos
fotosintéticamente activos, por ejemplo el promotor
ST-LS1 (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et
al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) o, para una
expresión específica en el endospermo, el promotor HMWG del trigo,
el promotor USP, el promotor faseolina, promotores de genes de
zeína del maíz (Pedersen et al., Cell 29 (1982),
1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol.
Biol. 15 (1990), 81-93), el promotor glutelina
(Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990),
41-50; Zheng et al., Plant J. 4 (1993),
357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383
(1996), 213-218) o el promotor
contraído-1 (Werr et al., EMBO J. 4 (1985),
1373-1380). Sin embargo, es posible también utilizar
promotores que se activan únicamente en un momento determinado por
factores externos (véase, por ejemplo, WO 9307279). En este caso,
pueden ser particularmente interesantes los promotores de proteínas
de choque térmico, que permiten inducción simple,. Adicionalmente,
puede ser posible utilizar promotores específicos de semillas, tales
como, por ejemplo, el promotor USP de Vicia faba, que
asegura la expresión específica de la semilla en Vicia faba y
otras plantas
(Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467).
(Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467).
El uso de promotores presentes en el genoma de
virus infectantes de algas es también posible para expresión de
secuencias de ácido nucleico en las plantas (Mitra et al.,
1994, Biochem. Biophys Res Commun 204(1),
187-194; Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol Biol
26(1), 85-93, Van Etten et al., 2002,
Arch Virol 147, 1479-1516).
En el contexto de la presente invención, el
término "específico de tejido" debe entenderse con el
significado de la restricción de un rasgo (por ejemplo la
iniciación de la transcripción) predominantemente en cierto
tejido.
En el contexto de la presente invención, los
términos "célula de tubérculo, fruto o semilla" deben
entenderse con el significado de todas las células contenidas en un
tubérculo, fruto y semilla, respectivamente.
Adicionalmente, es posible que esté presente una
secuencia de terminación (señal de poliadenilación), que sirve para
añadir una cola poli-A al transcrito. Se cree que la
cola poli-A tiene una función en la estabilización
de los transcritos. Tales elementos se describen en la bibliografía
(véase Gielen et al., EMBO J. 8 (1989),
23-29) y son intercambiables.
Es también posible que estén presentes
secuencias de intrón entre el promotor y la región codificante.
Tales secuencias de intrón pueden estabilizar la expresión y
conducir a una mayor expresión en las plantas (Callis et
al., 1987, Genes Devel. 1, 1183-1200; Luehrsen y
Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier
et al., 1997; Plant Journal 12(4),
895-899; Rose y Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122
(2), 535-542; Vasil et al., 1989, Plant
Physiol. 91, 1575-1579; XU et al., 2003,
Science in China Series C Vol.46 NO6, 561-569).
Secuencias de intrón adecuadas son, por ejemplo, el primer intrón
del gen sh1 del maíz, el primer intrón del gen 1 de
poli-ubiquitina del maíz, el primer intrón del gen
EPSPS del arroz o uno de los dos primeros intrones del gen PAT1 de
Arabidopsis.
El hecho de que el hialuronano aislado de las
células de plantas de acuerdo con la invención y plantas de acuerdo
con la invención tiene un peso molecular significativamente mayor
que el hialuronano aislado de crestas de gallo es sorprendente. Un
medicamento que comprende hialuronano que tiene un peso molecular
medio de 5 x 10^{6} Da tiene el mayor peso molecular de
hialuronano disponible comercialmente hasta la fecha (Lapcik et
al. (1998), Chemical Reviews 98 (8), 2663-2684).
Adicionalmente, es sorprendente que el hialuronano aislado de
células de plantas de acuerdo con la invención o plantas de acuerdo
con la invención tiene un peso molecular mayor que el hialuronano
de células de E. coli transformadas utilizando la misma
hialuronano-sintasa (virus Chlorella 1 de
Paramecium bursaria) (3 x 10^{6} a 6 x 10^{6} Da,
DeAngelis et al., 1997, Science 278,
1800-1803).
De acuerdo con ello, la invención proporciona
también células de plantas de acuerdo con la invención o plantas de
acuerdo con la invención que sintetizan hialuronano que tiene un
peso molecular medio de al menos 7 x 10^{6} Da.
El peso molecular del hialuronano puede
determinarse utilizando métodos conocidos por las personas expertas
en la técnica (véase, por ejemplo, Hokpusta et al., 2003, Eur
Biophys J 31, 450-456). Preferiblemente, el peso
molecular se determina por cromatografía con permeación de gel
(GPC), de modo particularmente preferido utilizando el método
descrito en Métodos Generales punto 8b).
La presente invención proporciona adicionalmente
plantas que comprenden células de plantas de acuerdo con la
invención. Tales plantas pueden producirse por regeneración a partir
de células de plantas de acuerdo con la invención.
La presente invención se refiere también a
partes procesables o consumibles de plantas de acuerdo con la
invención que comprenden células de plantas de acuerdo con la
invención.
En el contexto de la presente invención, el
término "partes procesables" debe entenderse con el significado
de partes de plantas utilizadas para preparación de alimentos o
piensos, que se utilizan como fuente de materia prima para procesos
industriales, como fuente de materia prima para preparación de
productos farmacéuticos o como fuente de materia prima para
preparación de productos cosméticos. En el contexto de la presente
invención, el término "partes consumibles" debe entenderse con
el significado de partes de plantas que sirven como alimento para
humanos o se utilizan como piensos para animales.
Las plantas de acuerdo con la invención pueden,
en principio, ser plantas de cualquier especie de planta, es decir
tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las mismas son
preferiblemente plantas de cosecha, es decir plantas cultivadas por
el hombre para propósitos de nutrición o para propósitos técnicos,
en particular industriales. Las mismas son preferiblemente plantas
de arroz, tomate o patata.
Preferiblemente, la presente invención se
refiere a plantas de patata de acuerdo con la invención que producen
al menos 29, más preferiblemente al menos 36, de modo
particularmente preferible al menos 46 y de modo especialmente
preferible al menos 68 \mug de hialuronano por gramo de peso
fresco de sus tubérculos. Preferiblemente, la determinación del
contenido de hialuronano de los tubérculos de patata se realiza de
acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 10b).
En una realización preferida adicional, la
presente invención se refiere a plantas de tomate de acuerdo con la
invención que producen al menos 4, más preferiblemente al menos 8,
de modo particularmente preferible al menos 14 y de modo
especialmente preferible al menos 18 \mug de hialuronano por peso
reciente en gramos de sus frutos. Preferiblemente, la determinación
del contenido de hialuronano de los frutos de tomate se realiza de
acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 10e).
La presente invención se refiere también a
material de propagación de plantas de acuerdo con la invención que
comprende una célula de planta de acuerdo con la invención.
En este contexto, el término "material de
propagación" abarca aquellos componentes de la planta que son
adecuados para producción de progenie de una manera vegetativa o
sexual. Adecuados para propagación vegetativa son, por ejemplo,
esquejes, cultivos de callo, rizomas o tubérculos. Otro material de
propagación comprende, por ejemplo, frutos, semillas, plantas de
semillero, protoplastos, cultivos de células, etc. Materiales de
propagación preferidos son tubérculos, frutos o semillas.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a partes cosechables de plantas de plantas de
acuerdo con la invención, tales como frutos, raíces de
almacenamiento, raíces, flores, yemas, brotes, hojas o tallos,
preferiblemente semillas, frutos o tubérculos, en donde estas partes
cosechables comprenden células de plantas de acuerdo con la
invención.
Preferiblemente, la presente invención se
refiere a material de propagación o partes cosechables de plantas
que comprenden hialuronano. De modo particularmente preferible, éste
es material de propagación o partes cosechables de plantas que
sintetizan hialuronano.
Una ventaja adicional de la presente invención
consiste en el hecho de que las partes cosechables, material de
propagación, partes procesables o partes consumibles de las plantas
de acuerdo con la invención comprenden hialuronano. De acuerdo con
ello, éstas no sólo son adecuadas como materias primas a partir de
las cuales es posible aislar hialuronano, sino que pueden
utilizarse también directamente como alimento/pienso o para la
preparación de alimento/pienso que tiene un carácter profiláctico o
terapéutico (por ejemplo, para la profilaxis de la osteoartritis,
US 6.607.745). Así, por ejemplo ya no es necesario añadir a los
denominados nutrientes farmacéuticos hialuronano preparado por
fermentación o aislado de tejidos animales cuando se emplean plantas
de acuerdo con la invención o partes de plantas de acuerdo con la
invención para la preparación de nutrientes farmacéuticos o se
utilizan directamente como alimento/pienso. En virtud de la elevada
capacidad de fijación de agua del hialuronano, las partes
cosechables, el material de propagación, las partes procesables o
las partes consumibles de las plantas de acuerdo con la invención
tienen adicionalmente la ventaja de que se requieren menos
espesantes cuando se prepara alimento/pienso solidificado. Así, por
ejemplo, cuando se prepara jalea, es posible utilizar menos azúcar,
lo cual tiene un efecto positivo adicional sobre la salud. Cuando se
prepara alimento/pienso en el que se requiere eliminar agua de la
materia prima vegetal, la ventaja de utilizar partes cosechables,
material de propagación, partes procesables o partes consumibles de
las plantas de acuerdo con la invención estriba en el hecho de que
tiene que eliminarse menos agua del material de planta en cuestión,
dando como resultado menores costes de producción, y se asegura un
valor nutricional incrementado del alimento/pienso en cuestión por
procesos de preparación más suaves (por ejemplo menos o más breve
aporte de calor). Así, por ejemplo, cuando se prepara ketchup de
tomate, tiene que aportarse menos energía para alcanzar la
consistencia deseada.
La presente invención proporciona adicionalmente
un método para producir una planta que sintetiza hialuronano, en
donde
- a)
- una molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano-sintasa se integra en el genoma de una célula de planta
- b)
- se regenera una planta a partir de células de plantas del paso a); y
- c)
- en caso apropiado, se generan plantas adicionales con ayuda de las plantas del paso b).
\vskip1.000000\baselineskip
La regeneración de las plantas de acuerdo con el
paso b) puede llevarse a cabo por métodos conocidos por las
personas expertas en la técnica (descritos, por ejemplo, en "Plant
Cell Culture Protocols", 1999, editado por R.D. Hall, Humana
Press, ISBN
0-89603-549-2).
La generación de plantas adicionales de acuerdo
con el paso c) del proceso de acuerdo con la invención puede
llevarse a cabo, por ejemplo, por propagación vegetativa (por
ejemplo por la vía de esquejes, tubérculos o cultivo de callo y
regeneración de plantas enteras) o por propagación sexual. En este
caso, la propagación sexual se realiza preferiblemente de manera
controlada, es decir plantas seleccionadas que tienen ciertas
propiedades se cruzan unas con otras y se propagan. La selección se
realiza de una manera tal que las plantas ulteriores generadas de
acuerdo con el paso c) tienen, integrada en el genoma de la planta,
la molécula de ácido nucleico que codifica una
hialuronano-sintasa, y/o sintetizan hialuronano.
En una realización preferida de los métodos de
acuerdo con la invención para preparación de una planta, en un paso
de proceso adicional b)-1, que tiene lugar después
del paso de proceso b), las plantas seleccionadas tienen, integrada
de manera estable en su genoma, una molécula de ácido nucleico que
codifica una hialuronano-sintasa.
En una realización preferida adicional, los
métodos de acuerdo con la invención para producción de una planta
tienen un paso de proceso, que sigue al paso de proceso b) o
b)-1, en el cual se identifican las plantas
sintetizadoras de hialuronano.
En una realización adicional, los métodos de
acuerdo con la invención se utilizan para producir una planta de
acuerdo con la invención.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a métodos de acuerdo con la invención para
producir una planta en los cuales la molécula de ácido nucleico que
codifica una hialuronano-sintasa en el paso a) se
selecciona del grupo constituido por:
- a)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una hialuronano-sintasa de Clase I,
- b)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una hialuronano-sintasa humana o viral,
- c)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una hialuronano-sintasa humana 3 o una hialuronano-sintasa de un virus que infecta algas,
- d)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una hialuronano-sintasa de un virus infectante de Chlorella,
- e)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una hialuronano-sintasa de un virus Chlorella 1 de Paramecium bursaria,
- f)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque los codones de la molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano-sintasa están modificados comparados con los codones de la molécula de ácido nucleico que codifica la hialuronano-sintasa del organismo parental de la hialuronano-sintasa,
- g)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque los codones de la hialuronano-sintasa están modificados de tal manera que los mismos están adaptados a la frecuencia del uso de los codones de la célula de la planta o la planta en cuyo genoma se han integrado,
\newpage
- h)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque las mismas codifican una hialuronano-sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 60 o SEQ ID NO 62,
- i)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una proteína cuya secuencia de aminoácidos puede derivarse de la región codificante de la secuencia de ácido nucleico insertada en el plásmido DSM16664 o DSM16665);
- j)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 57, SEQ ID NO 59 o SEQ ID NO 61,
- k)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de ácido nucleico insertada en el plásmido DSM16664 o DSM16665),
- l)
- moléculas de ácido nucleico, que codifican una hialuronano-sintasa, en las cuales las secuencias de ácido nucleico que codifican la hialuronano-sintasa están enlazadas a elementos reguladores (promotores) que inician la transcripción en las células de las plantas o
- m)
- moléculas de ácido nucleico de acuerdo con j), en donde los promotores son promotores específicos de tejido, de modo particularmente preferible promotores que inician la transcripción específicamente en las células de tubérculo, fruto o semilla de las plantas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida adicional, los
métodos de acuerdo con la invención sirven para producir plantas
que sintetizan hialuronano que tiene un peso molecular medio de al
menos 7 x 10^{6} Da.
La presente invención proporciona también
plantas que pueden obtenerse por métodos de acuerdo con la invención
para producir una planta que sintetiza hialuronano.
Sorprendentemente, se ha encontrado que el
hialuronano aislado de las células de las plantas de acuerdo con la
invención o plantas de acuerdo con la invención tiene una
distribución estrecha de pesos moleculares comparado con el
hialuronano aislado de crestas de gallo o preparado por fermentación
de cepas de Streptococcus.
De acuerdo con ello, la presente invención
proporciona también métodos para preparar hialuronano que comprenden
un paso en el cual se extrae hialuronano de células de las plantas
de acuerdo con la invención, de plantas de acuerdo con la
invención, de material de propagación de acuerdo con la invención,
de partes cosechables de plantas de acuerdo con la invención, de
partes procesables de plantas o de plantas que pueden obtenerse por
el método de acuerdo con la invención. Preferiblemente, dicho método
comprende también el paso en el cual las células de plantas
cultivadas de acuerdo con la invención, las plantas de acuerdo con
la invención, el material de propagación de acuerdo con la
invención, las partes cosechables de plantas de acuerdo con la
invención, o las partes procesables de plantas de acuerdo con la
invención se cosechan antes de la extracción del hialuronano, y de
modo particularmente preferible adicionalmente el paso de cultivo de
las células de las plantas de acuerdo con la invención o las
plantas de acuerdo con la invención antes de la cosecha.
Un método de acuerdo con la invención para
preparar hialuronano se refiere preferiblemente a un método para
preparar hialuronano que tiene un peso molecular medio de al menos 7
x 10^{6} Da.
En contraste con los tejidos bacterianos o
animales, los tejidos de las plantas no tienen hialuronidasas y no
contienen cantidad alguna de hialadherinas. Por lo tanto, como se ha
descrito ya anteriormente, la extracción del hialuronano de los
tejidos de las plantas es posible con ayuda de métodos relativamente
sencillos. En caso requerido, los extractos acuosos, arriba
descritos, de células de plantas o tejidos que contienen hialuronano
pueden purificarse ulteriormente utilizando métodos conocidos por
las personas expertas en la técnica tales como, por ejemplo,
precipitación repetida con etanol. Un método preferido para
purificación de hialuronano se describe en Métodos Generales, punto
5.
La presente invención proporciona también el uso
de células de plantas de acuerdo con la invención, plantas de
acuerdo con la invención, material de propagación de acuerdo con la
invención, partes cosechables de plantas de acuerdo con la
invención, partes procesables de plantas de acuerdo con la invención
o plantas que pueden obtenerse por un método de acuerdo con la
invención para preparación de hialuronano.
\newpage
La presente invención proporciona adicionalmente
composiciones que comprenden células de plantas de acuerdo con la
invención. Las composiciones son preferiblemente alimentos o
piensos, productos farmacéuticos o cosméticos.
En una realización preferida de la presente
invención, las composiciones de acuerdo con la invención son
composiciones que comprenden hialuronano que tiene un peso
molecular medio de al menos 7 x 10^{6} Da.
En una realización preferida adicional de la
presente invención, las composiciones de acuerdo con la invención
comprenden células de plantas de acuerdo con la invención. En este
contexto, es indiferente que las células de las plantas de acuerdo
con la invención estén o no estén fragmentadas cuando se presentan
en las composiciones de acuerdo con la invención.
En una realización preferida adicional de la
presente invención, las composiciones de acuerdo con la invención
comprenden moléculas de ácido nucleico recombinante caracterizadas
porque dichas moléculas de ácido nucleico recombinante comprenden
moléculas de ácido nucleico que codifican una
hialuronano-sintasa.
Como ya se ha mencionado anteriormente, es
posible utilizar partes de plantas de acuerdo con la invención,
plantas de acuerdo con la invención, material de propagación de
acuerdo con la invención, partes cosechables de plantas de acuerdo
con la invención, partes procesables de plantas de acuerdo con la
invención, partes consumibles de plantas de acuerdo con la
invención o plantas que pueden obtenerse por un método de acuerdo
con la invención para preparar alimento o pienso. Sin embargo, es
también posible el uso como materias primas para aplicaciones
industriales, sin que tenga que aislarse el hialuronano. Así, por
ejemplo, las plantas de acuerdo con la invención o partes de
plantas de acuerdo con la invención pueden aplicarse a áreas de
cultivo agrícola para conseguir una fijación incrementada de agua
en el suelo. Adicionalmente, las plantas de acuerdo con la
invención o células de plantas de acuerdo con la invención pueden
utilizarse para preparar agentes secantes (por ejemplo para uso
cuando se transportan artículos sensibles a la humedad) o como
absorbedores de líquidos (por ejemplo en pañales o para la
absorción de líquidos acuosos derramados). Para tales aplicaciones,
es posible utilizar plantas enteras de acuerdo con la invención,
partes de plantas de acuerdo con la invención o plantas trituradas
(por ejemplo molidas) de acuerdo con la invención o partes de
plantas de acuerdo con la invención, según se requiera. Para
aplicaciones en las cuales se utilizan plantas o partes de plantas
molidas son adecuadas partes de plantas que contienen hialuronano,
pero sólo una baja proporción de agua. Éstas son preferiblemente
granos de plantas cereales (maíz, arroz, trigo, centeno, avena,
cebada, sagú o sorgo).
La presente invención proporciona también
métodos para preparar una composición que comprende componentes de
células de plantas de acuerdo con la invención, plantas de acuerdo
con la invención, material de propagación de acuerdo con la
invención, partes cosechables de plantas de acuerdo con la
invención, partes procesables de plantas de acuerdo con la
invención, partes consumibles de plantas de acuerdo con la invención
o plantas que pueden obtenerse por un método de acuerdo con la
invención en donde se utilizan las células de plantas de acuerdo
con la invención, plantas de acuerdo con la invención, material de
propagación de acuerdo con la invención, partes cosechables de
plantas de acuerdo con la invención, partes procesables de plantas
de acuerdo con la invención, partes consumibles de plantas de
acuerdo con la invención o plantas que pueden obtenerse por un
método de acuerdo con la invención. Los métodos para preparar una
composición de acuerdo con la invención son preferiblemente métodos
para preparar alimentos o piensos, métodos para preparar un producto
farmacéutico o métodos para preparar un producto cosmético.
En una realización preferida de la presente
invención, los métodos de acuerdo con la invención para preparar
una composición de acuerdo con la invención se refieren a métodos
para preparar una composición que comprende hialuronano que tiene
un peso molecular medio de al menos 7 x 10^{6} Da.
Métodos para preparación de alimentos o piensos
son conocidos por las personas expertas en la técnica. Métodos para
utilización de plantas de acuerdo con la invención o partes de
plantas de acuerdo con la invención en áreas industriales son
también conocidos por las personas expertas en la técnica e
incluyen, entre otros, trituración o molienda de las plantas de
acuerdo con la invención o partes de plantas de acuerdo con la
invención; sin embargo, aquéllos no se limitan exclusivamente a
éstos últimos. Algunas de las ventajas resultantes de la
utilización de las materias que constituyen el objeto de acuerdo con
la invención para preparación de alimentos/piensos o para uso en
áreas industriales han sido ya descritas anteriormente.
La presente invención se refiere también al uso
de células de plantas de acuerdo con la invención, plantas de
acuerdo con la invención, material de propagación de acuerdo con la
invención, partes cosechables de plantas de acuerdo con la
invención, partes procesables de plantas de acuerdo con la
invención, partes consumibles de plantas de acuerdo con la
invención o plantas que pueden obtenerse por un método de acuerdo
con la invención para producción de una planta de acuerdo con la
invención a fin de preparar una composición que comprende
componentes de células de plantas de acuerdo con la invención,
plantas de acuerdo con la invención, material de propagación de
acuerdo con la invención, partes cosechables de plantas de acuerdo
con la invención, partes procesables de plantas de acuerdo con la
invención, partes consumibles de plantas de acuerdo con la invención
o plantas que pueden obtenerse por un método de acuerdo con la
invención. Se da preferencia al uso de células de plantas de
acuerdo con la invención, plantas de acuerdo con la invención,
material de propagación de acuerdo con la invención, partes
cosechables de plantas de acuerdo con la invención, partes
procesables de plantas de acuerdo con la invención, partes
consumibles de plantas de acuerdo con la invención o de plantas que
pueden obtenerse por un método de acuerdo con la invención para
producción de una planta de acuerdo con la invención para preparar
alimentos o piensos, para preparar un producto farmacéutico o para
preparar un producto cosmético.
Las partes de plantas se transforman
frecuentemente en harinas. Ejemplos de partes de plantas a partir de
las cuales se producen harinas son, por ejemplo, tubérculos de
plantas de patata y granos de plantas de cereales. Para producir
harinas a partir de plantas de cereales, los granos que contienen el
endospermo de estas plantas se muelen y se tamizan. En el caso de
otras plantas que no comprenden un endospermo, sino otras partes de
almacenamiento de almidón tales como, por ejemplo, tubérculos o
raíces, la harina se produce frecuentemente por trituración, secado
y molienda subsiguiente de los órganos de almacenamiento en
cuestión. Las células de las plantas de acuerdo con la invención y
plantas de acuerdo con la invención sintetizan hialuronano. Dado
que el hialuronano tiene una capacidad alta de fijación de agua, las
harinas producidas a partir de las células de plantas de acuerdo
con la invención, plantas de acuerdo con la invención, material de
propagación de acuerdo con la invención, partes cosechables de
plantas de acuerdo con la invención, partes procesables de plantas
de acuerdo con la invención, partes consumibles de plantas de
acuerdo con la invención o plantas que pueden obtenerse por un
método de acuerdo con la invención para producción de una planta de
acuerdo con la invención tienen por consiguiente propiedades
modificadas.
La presente invención se refiere por tanto
adicionalmente a harinas que comprenden hialuronano.
Las harinas de acuerdo con la presente invención
se caracterizan preferiblemente por el hecho de que comprenden
células de plantas de acuerdo con la invención. Con respecto a esto,
es indiferente que las células de plantas de acuerdo con la
invención estén fragmentadas o no cuando están presentes en las
harinas de acuerdo con la invención.
Las harinas que pueden obtenerse a partir de las
células de plantas de acuerdo con la invención, plantas de acuerdo
con la invención, material de propagación de acuerdo con la
invención, partes cosechables de plantas de acuerdo con la
invención, partes procesables de plantas de acuerdo con la
invención, partes consumibles de plantas de acuerdo con la
invención o plantas que pueden obtenerse por un método de acuerdo
con la invención para producción de una planta de acuerdo con la
invención son una realización adicional de la presente
invención.
La presente invención se refiere adicionalmente
a harinas que se producen a partir de células de plantas de acuerdo
con la invención, plantas de acuerdo con la invención, material de
propagación de acuerdo con la invención, partes cosechables de
plantas de acuerdo con la invención, partes procesables de plantas
de acuerdo con la invención, partes consumibles de plantas de
acuerdo con la invención o plantas que pueden obtenerse por un
método de acuerdo con la invención para producir una planta de
acuerdo con la invención. Partes preferidas de plantas de acuerdo
con la invención para la producción de harinas de acuerdo con la
invención son tubérculos, raíces de almacenamiento y granos que
contienen endospermo. Preferiblemente, los tubérculos son tubérculos
de plantas de patata y los granos son granos de plantas de la
familia (sistemática) Poáceas; de modo especialmente preferible,
los granos son granos de plantas de arroz, maíz o trigo.
Preferiblemente, la presente invención se
refiere a harinas de acuerdo con la invención que contienen al menos
2, más preferiblemente al menos 4, de modo particularmente
preferible al menos 8 y de modo especialmente preferido al menos 10
\mug de hialuronano por gramo de peso de harina. Preferiblemente,
la determinación del contenido de hialuronano en la harina se
realiza de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 10g).
En el contexto de la presente invención, el
término "harina" debe entenderse con el significado de un polvo
obtenido por molienda de partes de las plantas. En caso apropiado,
las partes de las plantas se secan antes de la molienda y se
trituran y/o tamizan después de la molienda.
Como resultado de la presencia de hialuronano en
las harinas de acuerdo con la invención, las harinas respectivas se
distinguen en particular por su capacidad incrementada de fijación
de agua. Esto es deseado por ejemplo para cierto número de
aplicaciones en las que se procesan harinas en la industria
alimentaria, en particular en la producción de artículos horneados.
Así, las harinas de acuerdo con la invención pueden, v.g., aumentar
la vida útil de los artículos de panadería. Una ventaja adicional de
las harinas de acuerdo con la presente invención es que tiene que
utilizarse menos harina en el caso de que la harina se utilice como
espesante en composiciones de alimentos o piensos.
La presente invención se refiere adicionalmente
a un método para la producción de harinas, que comprende el paso de
moler las células de plantas de acuerdo con la invención, plantas de
acuerdo con la invención, material de propagación de acuerdo con la
invención, partes cosechables de plantas de acuerdo con la
invención, partes procesables de plantas de acuerdo con la
invención, partes consumibles de plantas de acuerdo con la invención
o plantas que pueden obtenerse por un método de acuerdo con la
invención para producir una planta de acuerdo con la invención.
Las harinas pueden producirse por molienda de
partes de las plantas de acuerdo con la invención. Las personas
expertas conocen el modo de producir harinas. Preferiblemente, un
método para la producción de harinas comprende también el paso de
cosechar las plantas o partes de plantas cultivadas y/o el material
de propagación o las partes de almacenamiento de almidón de estas
plantas antes de la molienda, y de modo especialmente preferible
adicionalmente el paso de cultivar plantas de acuerdo con la
invención antes de la recolección.
En una realización adicional de la presente
invención, el método para la producción de harinas comprende el
procesamiento de células de plantas de acuerdo con la invención,
plantas de acuerdo con la invención, material de propagación de
acuerdo con la invención, partes cosechables de plantas de acuerdo
con la invención, partes procesables de plantas de acuerdo con la
invención, partes de plantas consumibles de acuerdo con la invención
o plantas que pueden obtenerse por un método de acuerdo con la
invención para producir una planta de acuerdo con la invención
antes de la molienda.
En este contexto, el procesamiento puede ser por
ejemplo un tratamiento térmico y/o secado. El tratamiento térmico
seguido por secado del material que ha sido sometido a tratamiento
térmico se aplica por ejemplo en la producción de harinas a partir
de raíces de almacenamiento o tubérculos tales como, por ejemplo,
tubérculos de patata antes de la molienda. Las plantas de acuerdo
con la invención, partes de almacenamiento de almidón de plantas de
acuerdo con la invención, material de propagación de acuerdo con la
invención o material cosechable de acuerdo con la invención antes
de la molienda pueden constituir análogamente el procesamiento (sic)
para los propósitos de la presente invención. La eliminación de
tejidos de las plantas tales como, por ejemplo, las cáscaras de los
granos, antes de la molienda, es también un procesamiento previo a
la molienda para los propósitos de la presente invención.
En una realización adicional de la presente
invención, el método para la producción de harinas después de la
molienda comprende un procesamiento del material molido.
Por ejemplo, el material molido puede tamizarse
después de la molienda, verbigracia para producir tipos de harinas
diferentes.
La harina que puede obtenerse por un método para
la producción de harinas de acuerdo con la invención es también una
materialización de la presente invención.
Las harinas de acuerdo con la invención pueden,
en principio, ser harinas obtenidas a partir de cualquier especie
de planta, es decir plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Las
harinas de acuerdo con la invención se obtienen preferiblemente a
partir de plantas de cosecha, es decir plantas cultivadas por el
hombre para propósitos de nutrición o para propósitos técnicos, en
particular industriales. Las mismas son preferiblemente plantas de
arroz o patata.
La presente invención se refiere adicionalmente
al uso de células de plantas de acuerdo con la invención, plantas
de acuerdo con la invención, material de propagación de acuerdo con
la invención, partes cosechables de plantas de acuerdo con la
invención, partes procesables de plantas de acuerdo con la
invención, partes consumibles de plantas de acuerdo con la
invención o plantas que pueden obtenerse por un método de acuerdo
con la invención para producir una planta de acuerdo con la
invención para la producción de harinas.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar medios, tales como, por ejemplo, moléculas de DNA, para
generar células de plantas de acuerdo con la invención y plantas de
acuerdo con la invención que sintetizan hialuronano.
De acuerdo con ello, la presente invención
proporciona adicionalmente moléculas de ácido nucleico recombinante
que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una
hialuronano-sintasa y una secuencia de ácido
nucleico que inicia la transcripción en una célula de planta
(promotor).
En el contexto de la presente invención, el
término "molécula de ácido nucleico recombinante" debe
entenderse con el significado de una molécula de ácido nucleico
que, además de moléculas de ácido nucleico que codifican una
hialuronano-sintasa, contiene secuencias adicionales
que no están presentes naturalmente en una combinación tal como las
que están presentes en los ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo
con la invención. En este caso, las secuencias adicionales
mencionadas pueden ser secuencias cualesquiera; preferiblemente, se
trata de secuencias reguladoras (promotores, señales de
terminación, intensificadores), de modo particularmente preferible
secuencias reguladoras activas en tejidos vegetales y de modo
especialmente preferible secuencias reguladoras específicas de
tejidos que son activas en tejidos de plantas. Métodos para generar
moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con la
invención se conocen por las personas expertas en la técnica e
incluyen métodos de ingeniería genética, tales como, por ejemplo,
enlace de moléculas de ácido nucleico por ligación, recombinación
genética o la síntesis de novo de moléculas de ácido nucleico
(véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 3ª edición (2001) Cold Spring Harbour Laboratory
Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et
al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons; 5ª edición (2002), ISBN: 0471250929).
En una realización preferida, la molécula de
ácido nucleico recombinante comprende un promotor específico de
tubérculo, fruto o semilla.
Una realización adicional de las moléculas de
ácido nucleico recombinante de la presente invención son vectores,
en particular plásmidos, cósmidos, genomas virales, genomas de
bacteriófago y otros vectores utilizados comúnmente en ingeniería
genética que contienen las moléculas de ácido nucleico de acuerdo
con la invención arriba descritas. Estas son preferiblemente
vectores, plásmidos, cósmidos o genomas virales adecuados para
transformar células de plantas. La transformación de células de
plantas o plantas con ayuda de moléculas de ácido nucleico
recombinante de acuerdo con la invención dan como resultado de modo
especialmente preferible la integración estable de una secuencia de
ácido nucleico que codifica hialuronano-sintasa en
el genoma de la célula de la planta y la planta,
respectivamente.
En otras realizaciones, la presente invención se
refiere a moléculas de ácido nucleico recombinante de acuerdo con
la invención en las cuales la secuencia de ácido nucleico que
codifica una hialuronano-sintasa se selecciona del
grupo constituido por:
- a)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una hialuronano-sintasa de Clase I,
- b)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una hialuronano-sintasa humana o viral,
- c)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una hialuronano-sintasa 3 humana o una hialuronano-sintasa de un virus que infecta algas,
- d)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una hialuronano-sintasa de un virus que infecta Chlorella,
- e)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una hialuronano-sintasa de un virus Chlorella 1 de Paramecium bursaria,
- f)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque los codones de la molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano-sintasa están modificados en comparación con los codones de la molécula de ácido nucleico que codifica la hialuronano-sintasa del organismo parental de la hialuronano-sintasa,
- g)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque los codones de la hialuronano-sintasa están modificados de tal manera que los mismos están adaptados a la frecuencia del uso de los codones de la célula de la planta o la planta en cuyo genoma se integran,
- h)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una hialuronano-sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 56, SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 60 O SEQ ID NO 62,
- i)
- moléculas de ácido nucleico, caracterizadas porque codifican una proteína cuya secuencia de aminoácidos puede derivarse de la región codificante de la secuencia de ácido nucleico insertada en el plásmido DSM16664 o DSM16665,
- j)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 57, SEQ ID NO 59 o SEQ ID NO 61, o
- k)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de ácido nucleico insertada en el plásmido DSM1664 o DSM16665.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona también
células de plantas o plantas que contienen moléculas de ácido
nucleico recombinante de acuerdo con la invención.
- SEQ ID NO 1:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa del virus Chlorella 1 de Paramecium bursaria.
- SEQ ID NO 2:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa del virus Chlorella 1 de Paramecium bursaria. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 1.
- SEQ ID NO 3:
- Secuencia sintética de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa del virus Chlorella 1 de Paramecium bursaria. Los codones de la secuencia representada se sintetizaron de tal manera que la misma está adaptada al uso de codones en las células de las plantas.
- SEQ ID NO 4:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa del virus Chlorella 1 de Paramecium bursaria. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 3.
- SEQ ID NO 5:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 3 de Homo sapiens.
- SEQ ID NO 6:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 3 de Homo sapiens. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 5.
- SEQ ID NO 7:
- Secuencia sintética de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 3 de Homo sapiens. Los codones de la secuencia representada se sintetizaron de tal modo que la misma está adaptada al uso de codones en las células de las plantas.
- SEQ ID NO 8:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 3 de Homo sapiens. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 7.
- SEQ ID NO 9:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 1 de Homo sapiens.
- SEQ ID NO 10:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 1 de Homo sapiens. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 9.
- SEQ ID NO 11:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 2 de Homo sapiens.
- SEQ ID NO 12:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 2 de Homo sapiens. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 11.
- SEQ ID NO 13:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 1 de Papio anubis.
- SEQ ID NO 14:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 1 de Papio anubis. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 13.
- SEQ ID NO 15:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 1 de Mus musculus.
- SEQ ID NO 16:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 1 de Mus musculus. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 13.
- SEQ ID NO 17:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 2 de Mus musculus.
- SEQ ID NO 18:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 2 de Mus musculus. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 17.
- SEQ ID NO 19:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 3 de Mus musculus.
- SEQ ID NO 20:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 3 de Mus musculus. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 19.
- SEQ ID NO 21:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 1 de Rattus norvegicus.
- SEQ ID NO 22:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 1 de Rattus norvegicus. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 21.
- SEQ ID NO 23:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 2 de Rattus norvegicus.
- SEQ ID NO 24:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 2 de Rattus norvegicus. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 23.
- SEQ ID NO 25:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 3 de Rattus norvegicus.
- SEQ ID NO 26:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 3 de Rattus norvegicus. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 25.
- SEQ ID NO 27:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 2 de Oryctolagus cuniculus.
- SEQ ID NO 28:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 2 de Oryctolagus cuniculus. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 27.
- SEQ ID NO 29:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 3 de Oryctolagus cuniculus.
- SEQ ID NO 30:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 3 de Oryctolagus cuniculus. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 29.
- SEQ ID NO 31:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 2 de Equus caballus.
- SEQ ID NO 32:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 2 de Equus caballus. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 31.
- SEQ ID NO 33:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 2 de Sus scrofa.
- SEQ ID NO 34:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 2 de Sus scrofa. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 33.
- SEQ ID NO 35:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 3 de Sus scrofa.
- SEQ ID NO 36:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 3 de Sus scrofa. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 35.
- SEQ ID NO 37:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 2 de Bos taurus.
- SEQ ID NO 38:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 2 de Bos taurus. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 37.
- SEQ ID NO 39:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 2 de Gallus gallus.
- SEQ ID NO 40:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 2 de Gallus gallus. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 39.
- SEQ ID NO 41:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 1 de Xenopus laevis.
- SEQ ID NO 42:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 1 de Xenopus laevis. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 41.
- SEQ ID NO 43:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 2 de Xenopus laevis.
- SEQ ID NO 44:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 2 de Xenopus laevis. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 43.
- SEQ ID NO 45:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 3 de Xenopus laevis.
- SEQ ID NO 46:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 3 de Xenopus laevis. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 45.
- SEQ ID NO 47:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa 2 de Danio rerio.
- SEQ ID NO 48:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 2 de Danio rerio. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 47.
- SEQ ID NO 49:
- Secuencia genómica de ácido nucleico, que codifica una hialuronano sintasa 3 de Danio rerio.
- SEQ ID NO 50:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa 3 de Danio rerio. La secuencia de amino-ácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 49.
- SEQ ID NO 51:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa de Pasteurella multocida.
- SEQ ID NO 52:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa de Pasteurella multocida. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 51.
- SEQ ID NO 53:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa de Streptococcus pyogenes.
- SEQ ID NO 54:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa de Streptococcus pyogenes. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 53.
- SEQ ID NO 55:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa de Streptococcus equi.
- SEQ ID NO 56:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa de Streptococcus equi. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 55.
- SEQ ID NO 57:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa de Streptococcus uberis.
- SEQ ID NO 58:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa de Streptococcus uberis. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 57.
- SEQ ID NO 59:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa de Streptococcus equisimilis.
- SEQ ID NO 60:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa de Streptococcus equisimilis. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 59.
- SEQ ID NO 61:
- Secuencia de ácido nucleico, que codifica una hialuronano-sintasa de Sulfolobus tokodaii cepa 7.
- SEQ ID NO 62:
- Secuencia de aminoácidos de una hialuronano-sintasa de Sulfolobus tokodaii cepa 7. La secuencia de aminoácidos representada puede derivarse de SEQ ID NO 61.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1: muestra una línea de calibración y la
ecuación asociada de la línea de regresión utilizada para calcular
el contenido de hialuronano en tejidos de plantas. La línea de
calibración se trazó utilizando el kit de test comercial (kit de
test de ácido hialurónico (HA) de Corgenix, Inc., Colorado, EE.UU.,
Prod. NO 029-001) y las soluciones estándar
contenidas en él.
Fig. 2: muestra la separación de muestras
diferentes que contienen hialuronano utilizando un gel de agarosa.
En la pista A se aplicó hialuronano aislado de cresta de gallo
(Sigma, Prod. NO H5388), en la pista B se aplicó hialuronano
aislado del sobrenadante de cultivo de una fermentación de
Streptococcus sp. (Calbiochem, Prod. NO 385908), en la pista
C se aplicaron extractos de un tubérculo de una planta de tipo
salvaje, aplicaron en la pista D se aplicaron extractos de un
tubérculo de la línea transgénica 365 ES 66, en la pista E se
aplicaron extractos de un tubérculo de la línea transgénica 365 ES
44, y en la pista F se aplicaron extractos de un tubérculo de la
línea transgénica 365 ES 78, que no sintetiza hialuronano.
Fig. 3: espectros ^{1}H-NMR
del extracto de patata de tubérculos de una planta de tipo salvaje
(A), tubérculos de una línea transgénica que sintetiza hialuronano
(B) y de hialuronano aislado de cresta de gallo (Sigma, Prod. NO
H5388).
Fig. 4: cromatograma de extracto de patata de
tubérculos de una planta de tipo salvaje con hialuronano aislado de
cresta de gallo (Sigma, Prod. NO H5388) incorporado (LS1), extracto
de patata de tubérculos de plantas transgénicas que sintetizan
hialuronano (LS2) y extracto de patata digerido con hialuronidasa de
tubérculos de plantas transgénicas que sintetizan hialuronano
(LS3). Lo que se representa es la señal de dispersión de la
luz.
Fig. 5: cromatograma de extracto de patata de
tubérculos de una planta de tipo salvaje con hialuronano aislado de
cresta de gallo (Sigma, Prod. NO H5388) incorporado (Visco 1),
extracto de patata de tubérculos de plantas transgénicas que
sintetizan hialuronano (Visco 2) y extracto de patata digerido con
hialuronidasa de tubérculos de plantas transgénicas que sintetizan
hialuronano (Visco 3). Lo que se representa es la señal del detector
de viscosidad.
Se describen a continuación métodos que pueden
utilizarse en conexión con la presente invención. Estos métodos son
realizaciones específicas; sin embargo, la presente invención no se
limita a estos métodos. Es sabido por las personas expertas en la
técnica que la invención puede llevarse a cabo de la misma manera
modificando los métodos descritos y/o reemplazando métodos
individuales o partes de métodos por métodos alternativos o partes
de métodos alternativas.
Se transformaron plantas de patata con la ayuda
de Agrobacterium, como se describe en
Rocha-Sosa et al. (EMBO J. 8, (1989),
23-29).
Se transformaron plantas de tomate con la ayuda
de Agrobacterium de acuerdo con el método descrito en US
5.565.347.
Se transformaron plantas de arroz por el método
descrito por Hiei et al. (1994, Plant Journal 6(2),
271-282).
Para detectar la presencia de hialuronano y
determinar el contenido de hialuronano en tejidos de plantas, se
trató material de plantas como sigue: Se añadieron 200 \mul de
agua (desmineralizada, conductividad \geq 18 m\Omega) a
aproximadamente 0,3 g de material de tubérculo, y la mezcla se
trituró en un molino de bolas oscilante de laboratorio (MM200, de
Retsch, Alemania) (30 s a 30 Hz). Se añadieron luego 800 \mul
adicionales de agua (desmineralizada, conductividad \geq 18
m\Omega), y la mixtura se mezcló bien (utilizando, por ejemplo,
un mezclador Vortex). Los residuos celulares y los componentes
insolubles se separaron del sobrenadante por centrifugación a
16.000 x g durante 5 minutos.
Se pelaron aproximadamente 100 g de tubérculos,
se cortaron en rodajas de un tamaño de aproximadamente 1 cm^{3}
y, después de adición de 100 ml de agua, desmineralizada,
conductividad \geq 18 m\Omega, se trituraron en un mezclador
Warring a la velocidad máxima durante aproximadamente 30 segundos.
Los residuos celulares se eliminaron luego utilizando un tamiz de
té. Los residuos celulares que se habían separado se suspendieron
de nuevo en 300 ml de agua (desmineralizada, conductividad \geq 18
m\Omega) y se separaron de nuevo utilizando un tamiz de té. Las
dos suspensiones obtenidas (100 ml + 300 ml) se combinaron y se
centrifugaron a 13.000 x g durante 15 minutos. Se añadió NaCl al
sobrenadante de centrifugación obtenido hasta que se hubo alcanzado
una concentración final de 1%. Después que el NaCl hubo pasado a la
solución, se llevó a cabo una precipitación por adición de un
volumen doble de etanol seguido por mezcladura concienzuda e
incubación a -20ºC durante una noche. La mezcla se centrifugó luego
a 13.000 x g durante 15 minutos. El precipitado sedimentado obtenido
después de esta centrifugación se disolvió en 100 ml de tampón
(Tris HCl 50 mM, pH 8, CaCl_{2} 1 mM) y se añadió luego
proteinasa K a una concentración final de 100 \mug/ml, y la
solución se incubó a 42ºC durante 8 horas. Esto fue seguido por 10
minutos de incubación a 95ºC. Una vez más, se añadió NaCl a esta
solución hasta que se hubo alcanzado una concentración final de 1%.
Después que el NaCl hubo pasado a la solución, se llevó a cabo otra
precipitación por adición de un volumen doble de etanol, mezcla
concienzuda e incubación a -20ºC durante aproximadamente 96 horas.
Esto fue seguido por 15 minutos de centrifugación a 13.000 x g. El
precipitado sedimentado obtenido después de esta centrifugación se
disolvió en 30 ml de agua (desmineralizada, conductividad \geq 18
m\Omega), y se añadió una vez más NaCl a una concentración final
de 1%. Por adición de un volumen doble de etanol, mezcladura
concienzuda e incubación a -20ºC durante una noche, se produjo otra
precipitación. El precipitado obtenido después de centrifugación
subsiguiente a 13.000 x g durante 15 minutos se disolvió en 20 ml
de agua (desmineralizada, conductividad \geq 18 m\Omega).
La purificación ulterior se llevó a cabo por
filtración centrífuga. A este fin, se aplicaron en cada caso 5 ml
del precipitado disuelto a un filtro de membrana (Centricon Amicon,
anchura de poro 10.000 NMWL, Prod. NO UCF 8 010 96), y la muestra
se centrifugó a 2200 x g hasta que únicamente quedaban por encima
del filtro aproximadamente 3 ml de la solución. Se añadieron luego
dos veces más, en cada caso 3 ml de agua (desmineralizada,
conductividad \geq 18 m\Omega) a la solución encima de la
membrana y se centrifugaron de nuevo en cada caso en condiciones
idénticas hasta que, al final, quedaban sólo en el filtro
aproximadamente 3 ml de la solución. Las soluciones presentes
todavía sobre la membrana después de la filtración centrífuga se
retiraron, y la membrana se lavó repetidas veces (3 a 5 veces) con
aproximadamente 1,5 ml de agua (desmineralizada, conductividad
\geq 18 m\Omega). Todas las soluciones que estaban presentes
todavía encima de la membrana y las soluciones obtenidas del lavado
se combinaron, se añadido NaCl a una concentración final de 1%;
después que el NaCl hubo pasado a la solución, se añadió un volumen
doble de etanol, se mezcló la muestra y se obtuvo un precipitado
por almacenamiento a -20ºC durante una noche. El precipitado
obtenido después de centrifugación subsiguiente a 13.000 x g
durante 15 minutos se disolvió en 4 ml de agua (desmineralizada,
conductividad \geq 18 m\Omega) y se liofilizó a continuación
(24 horas a una presión de 0,37 mbar, aparato de liofilización
Christ Alpha 1-4 de Christ, Osterode,
Alemania).
Se detectó hialuronano utilizando un test
comercial (kit de test de ácido hialurónico (HA) de Corgenics, Inc.,
Colorado, EE.UU., Prod. NO 029-001) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante, que se incorporan por la presente
en la descripción por referencia. El principio del test está basado
en la disponibilidad de una proteína que se fija específicamente a
hialuronano (HABP) y se lleva a cabo análogamente a un ELISA,
indicando una reacción coloreada el contenido de hialuronano en la
muestra examinada. De acuerdo con ello, para la determinación
cuantitativa de hialuronano, las muestras a medir deben emplearse en
una concentración tal que esté dentro de los límites establecidos
(por ejemplo: dilución de la muestra en cuestión o uso de menos agua
para extracción de hialuronano del tejido de la planta, dependiendo
de si se sobrepasaba o no se alcanzaba un límite).
En lotes paralelos, partes alícuotas de las
muestras a determinar se sometieron inicialmente a digestión con
hialuronidasa y se midieron luego utilizando el test comercial (kit
de test de ácido hialurónico (HA) de Clorgenics, Inc, Colorado,
EE.UU., Prod. NO 5 (0029-0001)). La digestión con
hialuronidasa se llevó a cabo utilizando 400 \mul de extracto de
tubérculo de patata en tampón de hialuronidasa (tampón de fosfato de
potasio 0,1 M, pH 5,3; NaCl 150 mM) por adición de 5 \mug (\sim
3 unidades) de hialuronidasa (hialuronidasa tipo III de Sigma,
Prod. NO H2251) e incubación a 37ºC durante 30 min.
En cada caso, se utilizaron luego todas las
muestras en una dilución de 1:10 para determinar el contenido de
hialuronano.
El análisis por espectroscopia NMR se llevó a
cabo utilizando un espectrómetro DRX 700 a 700 MHz (Bruker Biospin
GMBH D-76287 Rheinstetten/Karlsruhe, Alemania). El
espectrómetro estaba provisto de un cabezal de muestra TXI y se
adaptó a una terminal de trabajo SGI, y se utilizó la versión 3.5
del software XWIN-NMR de Bruker Biospin para
evaluación. Se disolvieron aproximadamente 0,5 mg a 2 mg de la
muestra en 550 \mul de D_{2}O. Se midieron los espectros
^{1}H-NMR utilizando 1024 a 12.000 escaneos, con
un tiempo de relajación de 1 s. Los espectros
^{1}H-NMR se referenciaron a la señal del agua a
4,7 ppm.
Para caracterizar el tamaño del hialuronano
aislado de las plantas, se utilizó un sistema basado en
electroforesis en gel de agarosa, descrito por Lee y Cowman (1994,
Anal Biochem 219, 278-287) o Armstrong y Bell
(2002), Anal. Biochem. 308, 255-264). A este fin,
se aplicaron muestras que contenían hialuronano a un gel de agarosa
que contenía 0,7% de TEA (Tris 40 mM, acetato de sodio 5 mM, EDTA
0,8 mM, pH 7,9) y se separaron en 1 x tampón TEA a 50V durante un
periodo de 3 horas. El gel de agarosa se tiñó luego durante una
noche utilizando 0,005% de "Stains-all"
(3,3'-dietil-9-metil-4,5,4',5'-dibenzo-tiacarbocianina,
Fluka, Prod. NO 85663) en 50% etanol y 50% tampón 1 x TEA, y el gel
se decoloró luego en agua y se escaneó.
A una concentración de 1 mg/ml^{-1}, se
disolvieron las muestras en fase móvil de GPC (NaNO_{3} 0,2 M). A
este fin, las muestras se agitaron inicialmente en un agitador
magnético durante 1 hora y se dejaron luego en reposo a la
temperatura ambiente durante 20 horas para equilibración. Antes de
la medida, se filtraron las muestras a través de un filtro de
membrana de 5 \mum. Las muestras se analizaron luego por GPC,
determinándose el índice de refracción, la dispersión de la luz y
la viscosidad del material eluido. Se utilizaron los instrumentos y
materiales siguientes:
Condiciones GPC:
Instrumentos: Cromatógrafo de Gel PL120 de
Polymer Laboratories, Midas Autosampler from Spark,
- \quad
- detector de dispersión de la luz DAWN-EOS de Wyatt Technology Santa Barbara con \lambda_{0} = 690 nm y 16 detectores en un intervalo de ángulo de 14,9º a 162,9º,
- \quad
- célula de flujo K5,
- \quad
- detector de combinación viscosidad/índice de refracción \eta-1002 (WEG Dr. Bures GmbH & Co (KG).
Columnas: SUPREMA Gel de PSS, Mainz,
Alemania
- \quad
- Precolumna y tres columnas con los intervalos de separación de 300 a 10^{4}; 5\cdot10^{4} a 2\cdot10^{6} y 10^{6} a 10^{8} se conectaron en serie.
Elución: Fase móvil NaNO_{3} 0,2M, caudal 0,8
ml/minuto, temperatura 30ºC, volumen de inyección 500 \mul
Evaluación:
Utilizando los datos obtenidos, se calcularon
los valores dados en los ejemplos. Los datos de dispersión de la
luz se evaluaron utilizando el software ASTRA Software 4.90.08. Las
medidas de viscosidad se realizaron utilizando PSS Win GPC 6.
Las desviaciones estándar se calcularon de
acuerdo con la fórmula siguiente:
Ra \text{í} z
\ cuadrada \ de \ [n \Sigma x^{2}-(\Sigma
x)^{2}/n(n-1)]
en donde x es el valor de la
muestra y n es la suma de muestras utilizadas para la determinación
de la desviación
estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pBinAR es un derivado del plásmido
vector binario pBin19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12:
8711-8721) que se construyó como sigue:
Un fragmento de una longitud de 529 pb que
comprendía los nucleótidos 6909-7437 del promotor
35S del virus del mosaico de la coliflor se aisló como
EcoRI/KpnI del plásmido pDH51 (Pietrzak et al.,
1986, Nucleic Acids Res. 14, 5858) y se ligó entre los sitios de
restricción EcoRI y KpnI del polienlazador de pUC18.
De este modo, se creó el plásmido pUC18-35S.
Utilizando las endonucleasas de restricción Hind III y
PvuII, se aisló un fragmento de una longitud de 192 pb que
incluía la señal de poliadenilación (término 3') del gen de
Octopina-sintasa (gen 3) del
T-DNA del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al.,
1984, EMBO Journal 3, 835-846) (nucleótidos
11.749-11.939) a partir del plásmido pAGV40
(Herrera-Estrella et al., 1983, Nature, 303,
209-213). Después de la adición de enlazadores
SphI al sitio de restricción PvuII, el fragmento se
ligó entre los sitios de restricción SphI y Hind III de
pUC18-35S. Esto dio el plásmido pA7. En este caso,
el polienlazador entero que comprendía el promotor 35S y el
terminador OCS se retiró utilizando EcoRI y Hind III y
se ligó al vector adecuadamente disociado pBin19. Esto dio como
resultado el vector de expresión de plantas pBinAR (Höfgen y
Willmitzer, 1990, Plant Sciences 66, 221-230).
El promotor del gen patatin B33 de Solanum
tuberosum (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO
J. 8, 23-29) se ligó, como fragmento DraI
(nucleótidos -1512-+14), al vector pUC19 escindido con SstI
cuyos extremos se habían hecho romos utilizando
T4-DNA-polimerasa. Esto dio como
resultado el plásmido pUC19-B33. A partir de este
plásmido, se retiró el promotor B33 utilizando EcoRI y
SmaI y se ligó en el vector adecuadamente restringido
pBinAR. Esto dio como resultado el vector de expresión en plantas
pBinB33.
Para facilitar etapas de clonación ulteriores,
se extendió el MCS (Sitio de Clonación Múltiple). A este fin, se
sintetizaron dos oligonucleótidos complementarios, se calentaron a
95ºC durante 5 minutos, se enfriaron lentamente a la temperatura
ambiente para permitir una fijación satisfactoria (reasociación) y
se clonaron en los sitios de restricción SalI y KpnI de pBinB33.
Los oligonucleótidos utilizados para este propósito tenían la
secuencia siguiente:
El plásmido obtenido se designó IR
47-71.
pGSV71 es un derivado del plásmido pGSV7 que se
deriva del vector intermedio pGSV1. pGSV1 es un derivado de
pGSC1700 cuya construcción fue descrita por Cornelissen y
Vanderwiele (Nucleic Acids Research 17, (1989),
19-25). pGSV1 se obtuvo a partir de pGSC1700 por
deleción del gen de resistencia a la carbenicilina y deleción de
las secuencias de T-DNA de la región
TL-DNA del plásmido pTiB6S3.
pGSV7 contiene el origen de replicación del
plásmido pBR322 (Bolivar et al., Gene 2, (1977),
95-113) y el origen de replicación del plásmido
pVS1 de Pseudomonas (Itoh et al., Plasmid 11, (1984),
206). Además, pGSV7 contiene el gen marcador seleccionable
aadA del transposón Tn1331 de Klebsiella pneumoniae
que confiere resistencia a los antibióticos espectinomicina y
estreptomicina (Tolmasky, Plasmid 24 (3), (1990),
218-226; Tolmasky y Crosa, Plasmid 29 (1), (1993),
31-40).
El plásmido pGSV71 se obtuvo por clonación de un
gen bar quimérico entre las regiones límite de pGSV7. El gen
bar quimérico contiene la secuencia promotora del virus del mosaico
de la coliflor para iniciación de la transcripción (Odell et
al., Nature 313, (1985), 1480), el gen bar de
Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., Embo J.
6, (1987) 2519-2523) y la región no traducida 3' del
gen nopalina-sintasa del T-DNA de
pTiT37 para terminación de la transcripción y la poliadenilación. El
gen bar confiere tolerancia al herbicida
glufosinato-amonio.
En las posiciones 198-222, el
T-DNA contiene la secuencia del borde derecho del
TL-DNA del plásmido pTiB6S3 (Gielen et al.,
EMBO J. 3, (1984), 835-846). Entre los nucleótidos
223-249, existe una secuencia polienlazadora. Los
nucleótidos 250-1634 contienen la región del
promotor P35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et
al., véase arriba). La secuencia codificante del gen de
resistencia a la fosfinotricina (bar) de Streptomyces
hygroscopicus (Thompson et al., 1987, véase arriba)
está contenida entre los nucleótidos 1635 y 2186. En este caso, los
dos codones terminales del término 5' del gen bar de tipo
salvaje se reemplazaron por los codones ATG y GAC. Entre los
nucleótidos 2187-2205, existe una secuencia
polienlazadora. El fragmento TaqI, que tiene una longitud de
260 pb, del término 3' no traducido del gen de
nopalina-sintasa (3'nos) del T-DNA
del plásmido pTiT37 (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1,
(1982), 561-573) está localizado entre los
nucleótidos 2206 y 2465. Los nucleótidos 2466-2519
contienen una secuencia polienlazadora. La región del borde
izquierdo del TL-DNA de pTiB6S3 (Gielen et
al., EMBO J. 3, (1984), 835-846) está localizada
entre los nucleótidos 2520 y 2544.
El vector pGSV71 se escindió luego utilizando la
enzima PstI y se hizo romo. A partir del vector
pB33-Kan, el promotor B33 y la casete ocs se
escindieron como fragmento EcoRI-HindIII, y el
fragmento se hizo romo rellenando los extremos y se insertó en el
vector pGSV71 que se había escindido utilizando PstI y se
había hecho romo. El vector obtenido (ME4/6) sirvió como vector de
partida para construir ME5/6: con duplicación del sitio de
restricción PstI, se introdujo un oligonucleótido que
comprendía los sitios de restricción EcoRI, PacI,
SpeI, SrfI, SpeI, NotI, PacI y
EcoRI en el sitio de restricción PstI del vector
ME4/6, sitio de restricción que está localizado entre el promotor
B33 y el elemento ocs. El vector de expresión ulterior se
designó ME5/6.
En la continuación, se intercambió un fragmento
BamHI de ME5/6 por un producto PCR que se había extendido
por cierto número de sitios de restricción pero que era idéntico por
lo demás, lo que dio el plásmido pUL1-17.
Utilizando las enzimas de restricción HindIII y PstI,
el promotor B33 presente en pUL1-17 se
escindió y el vector se religó, después que se hubieron hecho romos
los extremos, lo cual dio el vector pML18-56. Este
vector se abrió utilizando MunI y PstI, y se introdujo
un MCS (Sitio de Clonación Múltiple) que tenía extremos cohesivos
correspondientes y se sintetizó utilizando dos oligonucleótidos
reasociados (GAG CTC CTA GGC TCG AGT TAA CAC TAG TAA GCT TAA TTA
AGA TAT CAT TTA CA y AAT TGT AAA TGA TAT CTT AAT TAA GCT TAC TAG TGT
TAA CTC GAG CCT AGG AGC TCT GCA). El plásmido formado de este modo
se designó
pML72-129.
pML72-129.
Una vez más, se introdujo un polienlazador
modificado en el plásmido pML72. A este fin, el plásmido se escindió
utilizando las enzimas de restricción MunI y HpaI y
se ligó utilizando un fragmento de DNA constituido por los dos
oligonucleótidos hibridados MCS neuL1 (AAT TGT AAA TGA TAT CTT AAT
TAA GCT TAC TAG TGT T) y MCS neuL2 (AAC ACT AGT AAG CTT AAT TAA GAT
ATC ATT TAC). El vector resultante se designó
pIR96-123.
Subsiguientemente, un producto PCR
Ecl136II/EcoRV para el promotor globulina del arroz se
ligó en el sitio de restricción EcoRV de IR
96-123, lo que dio el vector base para una expresión
específica del endospermo de genes de diversos orígenes. En lo
sucesivo, se hace referencia a este vector como IR
103-123.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ácido nucleico que codifica una
proteína HAS (hialuronano-sintasa) del virus
Chlorella 1 de Paramecium bursaria, fue sintetizada por
Medigenomix GmbH (Munich, Alemania) y se clonó en el vector pCR2.1
de Invitrogen (Prod. NO K2000-01). El plásmido
obtenido se designó 323-215. La secuencia sintética
de ácido nucleico que codificaba la proteína HAS del virus
Chlorella 1 de Paramecium bursaria se muestra bajo SEQ ID NO
3. La secuencia de ácido nucleico correspondiente aislada
originalmente del virus Chlorella 1 de Paramecium bursaria
se muestra bajo SEQ ID NO 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ácido nucleico que codifica una
proteína HAS-3
(hialuronano-sintasa-3) de Homo
sapiens fue sintetizada por Entelechon GmbH y se clonó en el
vector pCR4Topo de Invitrogen (Prod. NO K4510-20).
El plásmido obtenido se designó IC 361-237. La
secuencia sintética del ácido nucleico que codifica la proteína
HAS-3 de Homo sapiens se muestra SEQ ID NO 7.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente aislada originalmente
de Homo sapiens se muestra bajo SEQ ID NO 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Por digestión de restricción con BamHI y
XhoI, la secuencia codificante de la proteína HAS se aisló
del plásmido IC 323-215 y se clonó en los sitios de
restricción BamHI y XhoI del plásmido IR
47-71. El vector de expresión en plantas obtenido
se designó IC 341-222.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando las endonucleasas de restricción
BamHI y XhoI, la secuencia codificante del gen HAS se
aisló del plásmido IC 361-237 y se clonó en los
sitios de restricción BamHI y XhoI de IR
47-71. El vector de expresión en plantas obtenido
se designó IC 362-237.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando la endonucleasa de restricción
Asp 718I, se escindió el plásmido IC 323-215,
se hicieron romos los extremos utilizando polimerasa Klenow y el
fragmento resultante se escindió luego una vez más utilizando la
endonucleasa de restricción PacI. El fragmento obtenido de
este modo se ligó al plásmido IR 103-123, que se
había escindido utilizando las endonucleasas de restricción
PacI y Ecl136II. El vector de expresión en plantas
obtenido se designó pBA16.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando las endonucleasas de restricción
XhoI y StuI, se escindió el plásmido IC
362-237, y el fragmento obtenido se ligó al
plásmido IR 103-123, que se había escindido
utilizando las endonucleasas de restricción XhoI y
Ecl136II. El vector de expresión en plantas obtenido se
designó pBA13.
\vskip1.000000\baselineskip
En transformaciones independientes, se
transformaron plantas de patata con el vector de expresión en
plantas IC 341-222, que contiene una secuencia de
ácido nucleico codificante de una proteína HAS del virus Chlorella
1 de Paramecium bursaria bajo el control del promotor del gen
patatin B33 de Solanum tuberosum (Rocha-Sosa
et al., 189, EMBO J. 8, 23-29), o con el
vector de expresión en plantas IC 362-237, que
contiene una secuencia de ácido nucleico codificante de una
proteína HAS-3 de Homo sapiens bajo el
control del promotor del gen patatin B33 de Solanum
tuberosum (Rocha-Sosa et al., 1989 EMBO
J. 8, 23-29), utilizando el método dado bajo
Métodos Generales, punto 1. Las plantas transgénicas de patata
obtenidas que se habían transformado con el plásmido IC
341-222 se designaron como 365 ES. Las plantas
transgénicas de patata obtenidas que se habían transformado con el
plásmido IC 362-237 se designaron como 383 ES.
En transformaciones independientes, se
transformaron plantas de tomate con el vector de expresión en
plantas IC 341-222, que contiene una secuencia de
ácido nucleico codificante de una proteína HAS del virus Chlorella
1 de Paramecium bursaria bajo el control del promotor del gen
patatin B33 de Solanum tuberosum (Rocha-Sosa
et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29), o con el
vector de expresión en plantas IC 362-237, que
contiene una secuencia de ácido nucleico codificante de una
proteína HAS-3 de Homo sapiens bajo el
control del promotor del gen patatin B33 de Solanum
tuberosum (Rocha-Sosa et al., 1989 EMBO
J., 8, 23-29) utilizando el método dado bajo
Métodos Generales, punto 2. Las plantas transgénicas de tomate
obtenidas que se habían transformado con el plásmido IC
341-222 se designaron como 367 ES. Se hizo
referencia a las plantas transgénicas de tomate obtenidas que se
habían transformado con el plásmido IC 362-237 como
384 ES.
En transformaciones independientes, se
transformaron plantas de arroz con el vector de expresión en plantas
pBA16, que contiene una secuencia de ácido nucleico codificante de
una proteína HAS del virus Chlorella 1 de Paramecium
bursaria bajo el control del promotor del gen globulina de
Oryza sativa (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39
(8), 885-889), o con el vector de expresión en
plantas pBA13, que contiene una secuencia de ácido nucleico
codificante de una proteína HAS-3 de Homo
sapiens bajo el control del promotor del gen globulina de
Oryza sativa, utilizando el método dado bajo Métodos
Generales, punto 3. Las plantas transgénicas de arroz obtenidas que
se habían transformado con el plásmido pBA16 se designaron como
Os-pBA16. Las plantas transgénicas de arroz
obtenidas que se habían transformado con el plásmido pBA13 se
designaron como Os-pBA13.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó una línea de calibración utilizando
las soluciones estándar incluidas en el kit de test comercial (kit
de test de ácido hialurónico (HA) de Corgenix, Inc., Colorado,
EE.UU., Prod. NO 029-001), de acuerdo con los
métodos descritos por el fabricante. Para determinar la extinción de
1600 ng/ml de hialuronano, se utilizó una cantidad doble, basada en
la cantidad de estándar incluida indicada por el fabricante, que
comprendía 800 ng/ml de hialuronano. En cada caso, se realizaron 3
series de medidas independientes, y se determinó el valor medio
correspondiente. Esto dio la línea de calibración siguiente:
En un invernadero, se cultivaron plantas
individuales de la línea 365 ES en suelo en tiestos de 6 cm. En cada
caso se procesaron aproximadamente 0,3 g de material de tubérculos
de patata de las plantas individuales de acuerdo con el método
descrito en Métodos Generales punto 4. Utilizando el método descrito
en Métodos Generales punto 6, se determinó la cantidad de
hialuronano contenida en los extractos de plantas respectivos, con
la ayuda de la línea de calibración representada en el Ejemplo 10
a) y la Fig. 1. En este caso, el sobrenadante obtenido después de
la centrifugación se utilizó en una dilución de 1:10 para determinar
el contenido de hialuronano. Se obtuvieron los resultados
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
A partir de varias plantas de patata
seleccionadas de la línea 365 ES que se habían cultivado en suelo en
tiestos de 6 cm en un invernadero, se cosechó en cada caso una hoja
y se congeló en nitrógeno líquido. El material de planta se trituró
luego en un molino de cuentas oscilante de laboratorio (modelo
MM200, Retsch, Alemania) y en cada caso se añadieron luego 200
\mul de tampón Tris/HCl, pH 7,5) y la suspensión se mezcló
concienzudamente y se centrifugó después en una centrífuga Eppendorf
de sobremesa a 16.000 x g durante 15 minutos. El sobrenadante
obtenido se utilizó para determinar el contenido de hialuronano, lo
que se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 10 b). Sin
embargo, para la realización de estas medidas no se diluyó el
extracto de hojas. Se obtuvieron los resultados siguientes:
A partir de diversas plantas de tomate
seleccionadas de la línea 367 ES que se habían cultivado en suelo en
un invernadero, se cosechó en cada caso una hoja y se congeló en
nitrógeno líquido. El tratamiento ulterior y la determinación del
contenido de hialuronano se realizaron como se describe en el
Ejemplo 10 b) para hojas de plantas de patata. Se obtuvieron los
resultados siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después de un periodo de crecimiento prolongado,
hojas adicionales de plantas transformadas independientes de la
línea 367 ES se cribaron respecto a la presencia de hialuronano. De
72 plantas originarias de sucesos de transformación independientes
cribadas, se demostró que más del 88% sintetizaban una cantidad
significativa de hialuronano (al menos 0,1 \mug de hialuronano
por g de peso fresco). Para cada planta se determinó la cantidad de
hialuronano en dos a ocho hojas por separado para cada hoja de
acuerdo con el método descrito en Métodos Generales, punto 6. El
valor medio de la cantidad de hialuronano de las plantas
independientes variaba entre 0,1 y 46,8 \mug de hialuronano por g
de peso fresco en las hojas. Los resultados para las plantas
seleccionadas se muestran en la tabla siguiente:
A partir de varias plantas de tomate de la línea
367 ES se cosecharon frutos rojos de plantas que se habían
cultivado en suelo en un invernadero. Se determinó el peso fresco de
cada fruto de tomate individual. Cada fruto se cortó luego en
pequeños trozos y se homogeneizó en un Mezclador Waring. El material
líquido homogeneizado se recogió y se centrifugó durante 5 min a
2200 por g. El material sólido que se acumulaba en la parte superior
del tubo se retiró antes de concentrar la solución de líquido claro
a un volumen de aproximadamente 2 ml utilizando filtración
centrífuga de membrana (Amicon, 10.000 NMWL, Prod. NO UCF8 010 96) a
2200 x g. La concentración de hialuronano del concentrado se
determinó de acuerdo con el método descrito en Métodos Generales,
punto 6.
A partir de 82 plantas independientes de la
línea 367 ES, se demostró que más del 80% sintetizaban una cantidad
significativa de hialuronano (al menos 0,1 \mug de hialuronano por
g de peso fresco) en los frutos. Para cada planta, se determinó por
separado la cantidad de hialuronano en 8 a 10 frutos rojos para cada
fruto. El valor medio de la cantidad de hialuronano de plantas
independientes variaba entre 0,1 y 8,4 \mug de hialuronano por g
de peso fresco en los frutos. Los resultados obtenidos para las
plantas seleccionadas se muestran en la tabla siguiente:
El promotor del gen patatin B33 utilizado para
la expresión de hialuronano-sintasa en las plantas
de patata de la línea 365 ES y en plantas de tomate de la línea 367
ES se activa no sólo en los tubérculos de patata o en los frutos de
tomate, sino también, en presencia de altas concentraciones de
sacarosa, en otros tejidos de las plantas en cuestión. Por
consiguiente, las condiciones satisfactorias de luz reinantes en el
invernadero durante el cultivo de las plantas de patata de la línea
365 ES y las plantas de tomate de la línea 367 ES daban
evidentemente como resultado la expresión de
hialuronano-sintasa incluso en tejido de hoja, y era
posible también por tanto aislar hialuronano a partir de estos
tejidos de las plantas en cuestión. No obstante, la cantidad de
hialuronano que podía aislarse a partir de las hojas era
significativamente menor que la que podía aislarse a partir de los
tubérculos de las plantas en cuestión.
Semillas de arroz inmaduras (5 a 10 días después
de la polinización) producidas por plantas individuales de la línea
OS-pBA16, cultivadas en suelo en el invernadero se
recogieron, se congelaron en nitrógeno líquido y se guardaron a
-80ºC. Se seleccionaron al azar tres granos congelados de cada
planta individual, se exprimió el endospermo, se pesó agregadamente
y se congeló de nuevo en nitrógeno líquido. La muestra se trituró
con un molino de bolas (Modelo MM200, firma Retsch, Alemania). Se
añadieron 100 \mul de agua, y el homogeneizado se mezcló, se
centrifugó (13.000 x g, 5 min) y la concentración de hialuronano de
cada muestra se determinó de acuerdo con el método descrito en
Métodos Generales, punto 6.
De los 37 agregados de semillas, cada uno de los
cuales comprendía 3 semillas inmaduras de plantas independientes de
la línea OS-pBA16, más del 70% demostraron
sintetizar una cantidad significativa de hialuronano (al menos 0,1
\mug de hialuronano por g de peso fresco) en las semillas. La
cantidad de hialuronano en los agregados de semillas preparados a
partir de plantas de arroz independientes variaba entre 0,1 y 15,7
\mug de hialuronano por g de peso fresco. Los resultados para los
agregados de semillas preparadas cada una a partir de plantas
independientes se muestran en la tabla siguiente:
\newpage
Se cosecharon 20-25 semillas
maduras de cada planta transformada. Se eliminaron las cáscaras con
una descascarillad ora (Laboratory Paddy Sheller, Grainman, Miami,
Florida, EE.UU.) y el grano de arroz pardo se molió con un molino
de laboratorio (Cyclotec, molino Sample, Foss, Dinamarca). A
aproximadamente 40 mg de la harina de arroz obtenida de las
semillas agrupadas de cada planta independiente, se añadió 1 ml de
agua, se mezcló la muestra, se centrifugó (13.000 x g, 5 min) y se
determinó la concentración de hialuronano del sobrenadante de cada
muestra de acuerdo con el método descrito en Métodos Generales,
punto 6. Los resultados para las muestras de harina seleccionadas
preparadas a partir de plantas independientes se muestran en la
tabla siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 200 \mul de tampón de
hialuronidasa a aproximadamente 0,1 g de material de tubérculo de
plantas seleccionadas de la línea 365 ES que se habían cultivado
como se describe en el Ejemplo 10 a), y el material se trató como
en Métodos Generales, punto 4. Se retiró luego la mitad del
sobrenadante obtenido por la centrifugación, y se añadió
hialuronidasa. El lote se incubó a 37ºC durante 30 minutos, y la
mezcla de reacción se centrifugó nuevamente después a 16.000 x g
durante 5 minutos (véase Métodos Generales punto 4). El sobrenadante
obtenido de este modo se utilizó para determinación del contenido
de hialuronano. La otra mitad de la solución que se había aislado
de plantas, pero a las que no se había añadido cantidad alguna de
hialuronidasa, se trató de la misma manera. Se obtuvieron los
resultados siguientes:
Aproximadamente 20 g de material de tubérculo de
plantas productoras de hialuronano de la línea 365 ES se pelaron,
se cortaron en trozos de un tamaño aproximado de 1 cm^{3} y,
después de adición de 20 ml de agua (desmineralizada, conductividad
\geq 18 M\Omega), se trituraron en un mezclador Waring a la
velocidad máxima durante aproximadamente 30 segundos. Se eliminaron
luego los residuos celulares utilizando un tamiz de té. Los
residuos celulares eliminados se suspendieron de nuevo en 60 ml de
agua (desmineralizada, conductividad \geq 18 M\Omega) y se
eliminaron de nuevo utilizando un tamiz de té. Las dos suspensiones
obtenidas (50 ml + 60 ml) se combinaron y se centrifugaron a 13.000
x g durante 15 minutos. Se añadió NaCl al sobrenadante de
centrifugación obtenido hasta una concentración final de 1%. Después
que se hubo disuelto el NaCl, se produjo precipitación por adición
de un volumen doble de etanol seguido por mezcladura concienzuda e
incubación a -20ºC durante una noche. La mezcla se centrifugó luego
13.000 x g durante 15 minutos. El precipitado sedimentado obtenido
después de esta centrifugación se disolvió en 10 ml de agua
(desmineralizada, conductividad \geq 18 M\Omega), y una vez
más, se añadió NaCl a una concentración final de 1%. Se llevó a cabo
otra precipitación por adición de un volumen doble de etanol,
mezcla concienzuda e incubación a -20ºC durante una noche. Esto fue
seguido por centrifugación, disolución y reprecipitación en las
condiciones que acaban de describirse. El precipitado obtenido
después de la centrifugación final se disolvió en aproximadamente 1
ml de agua (desmineralizada, conductividad \geq 18 M\Omega) y
se utilizó para el análisis 1H-NMR en las
condiciones dadas en Métodos Generales punto 7. (Véase Fig. 3B)).
En paralelo, se trataron tubérculos de patata de plantas de tipo
salvaje no transformadas de la misma manera que se acaba de
describir, y se sometieron análogamente a un análisis
1H-NMR (véase Fig. 3A)).
Adicionalmente, como sustancia de comparación,
se sometió hialuronano aislado de crestas de gallo (Sigma, Prod. NO
H5388) a un análisis 1H-NMR (véase Fig. 3C)). La
evaluación del análisis 1H-NMR demostró claramente
la presencia de un grupo
NH-C(O)-CH_{3}
característico de
N-acetil-glucosamina en los
extractos de las plantas productoras de hialuronano y en la muestra
de comparación (hialuronano aislado de crestas de gallo), pero no
en los extractos de las plantas de tipo salvaje.
El tratamiento del material de plantas se
realizó como se describe en Métodos Generales punto 4. A este fin,
se trataron aproximadamente 0,5 g de material de tubérculos de
plantas seleccionadas de la línea 365 ES en un total de 600 \mul
de agua (desmineralizada, conductividad \geq 18 M\Omega). El
material de plantas se separó luego por electroforesis en gel de
agarosa y se tiñó de acuerdo con el método descrito en Métodos
Generales, punto 8.a). Una imagen del gel de agarosa obtenido se
muestra en Fig. 2. Las muestras siguientes se aplicaron al gel de
agarosa:
Pista A: aproximadamente 3 \mug de hialuronano
aislado de crestas de gallo (Sigma, Prod. NO H5388)
Pista B: aproximadamente 3 \mug de hialuronano
aislado del sobrenadante de cultivo de una fermentación de
Streptococcus sp. (Calbiochem, Prod. NO 385908)
Pista C: 20 \mul del extracto de un tubérculo
de una planta de tipo salvaje
Pista D: 20 \mul del extracto de un tubérculo
de la línea 365 ES 66
Pista E: 20 \mul del extracto de un tubérculo
de la línea 365 ES 44
Pista F: 20 \mul del extracto de un tubérculo
de la línea 365 ES 78.
\vskip1.000000\baselineskip
Como resulta evidente por la Tabla 2, las líneas
365 ES 66 y 365 ES 74 son plantas que producen hialuronano,
mientras que la línea 365 ES 78 no produce nada de hialuronano. Esto
se confirma por el análisis en gel de agarosa. Adicionalmente, en
el gel de agarosa puede verse que el hialuronano aislado del
material de plantas, en contraste con el hialuronano aislado de
crestas de gallo y en contraste con el hialuronano preparado por
fermentación de especies de Streptococcus, tiene una
distribución de pesos moleculares considerablemente más
estrecha.
Se utilizó material de tubérculo de las plantas
siguientes para aislamiento de hialuronano:
365 ES 2, 365 ES 18, 365 ES 44, 365 ES 58, 365
ES 74, 365 ES 92, 365 ES 4, 365 ES 19, 365 ES 47, 365 ES 59, 365 ES
76, 365 ES 93, 365 ES 5, 365 ES 21, 365 ES 49, 365 ES 60, 365 ES 79,
365 ES 96, 365 ES 6, 365 ES 22, 365 ES 50, 365 ES 61, 365 ES 80,
365 ES 98, 365 ES 23, 365 ES 51, 365 ES 67, 365 ES 81, 365 ES 99,
365 ES 9, 365 ES 33, 365 ES 52, 365 ES 68, 365 ES 84, 365 ES 101,
365 ES 10, 365 ES 41, 365 ES 53, 365 ES 70, 365 ES 85, 365 ES 16,
365 ES 44, 365 ES 57, 365 ES 71, 365 ES 87.
El material de tubérculo originario de estas
plantas se purificó como se describe en Métodos Generales punto 5
(muestra 2).
En paralelo, se trataron tubérculos de patata
(aproximadamente 100 gramos) de plantas de tipo salvaje de la misma
manera pero, antes de la trituración utilizando un mezclador
Warring, se añadieron 5 mg de hialuronano de cresta de gallo
(Sigma, Prod. NO H5388) a los tubérculos pelados y cortados en
cubitos (muestra 1).
Adicionalmente, se digirió parte de la muestra 1
con hialuronidasa (véase Ejemplo 11 a)) antes del análisis GPC
(muestra 3).
El análisis GPC se llevó a cabo como se describe
en Métodos Generales punto 8b). Se obtuvieron los resultados
siguientes:
Los valores para el peso molecular obtenidos
para el hialuronano de crestas de gallo añadido (muestra 1)
coinciden con los valores publicados en la bibliografía (Lapcik
et al., 1998, Chemical Reviews 98(8),
2663-2684).
De acuerdo con ello, los resultados demuestran
inequívocamente que el hialuronano aislado de plantas transgénicas
tiene un peso molecular significativamente mayor que el hialuronano
que se había aislado de crestas de gallo y se trató en condiciones
idénticas.
<110> Bayer CropScience GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos y medios para producir
hialuronano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BCS 04-5015 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/612,344
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-09-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 04090373.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-09-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1707
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Chlorella 1 de Paramecium
bursaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1707)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> PB42580
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1995-12-24
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (50903)..(52609)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Chlorella 1 de Paramecium
bursaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1707
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética que codifica
una proteína Hialurona-sintasa del Virus Chlorella 1
de Paramecium bursaria
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1707)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 568
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética que codifica
una proteína Hialurona-sintasa del Virus Chlorella 1
de Paramecium bursaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1662
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1662)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1662
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética que codifica
una proteína Hialurona-sintasa 3 de Homo
sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1662)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética que codifica
una proteína Hialurona-sintasa 3 de Homo
sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 1632
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1996-08-10
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2003-12-08
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<220>
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2004-08-21
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<309>
1998-11-24
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (545)..(2203)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 552
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1659
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gallus gallus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1659)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> AF106940.1
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1999-12-10
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (563)..(2221)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 552
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gallus gallus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1767
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Xenopus laevis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1767)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> M22249.1
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1989-04-22
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (527)..(2293)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Xenopus laevis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1656
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Xenopus laevis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1656)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 551
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Xenopus laevis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (242)..(242)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El 'Xaa' en la localización 242
representa Val.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (266)..(266)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El 'Xaa' en la localización 266
representa Ile.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1674
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Xenopus laevis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1674)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> AY302252.1
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2003-11-30
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (102)..(1775)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 557
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Xenopus laevis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1659
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Danio rerio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1659)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> AF190742.1
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2000-10-02
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (34)..(1692)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 552
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Danio rerio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2994
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Danio rerio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(633)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1059)..(1160)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2065)..(2991)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1425)..(1425)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1425 = cualquiera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1481)..(1481)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1481= cualquiera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1632)..(1632)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1632 = cualquiera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1834)..(1834)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1834 = cualquiera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2295)..(2295)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2295 = cualquiera
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 554
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Danio rerio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1425)..(1425)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1425 = cualquiera
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1481)..(1481)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1481= cualquiera
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1632)..(1632)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1632 = cualquiera
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1834)..(1834)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1834 = cualquiera
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica mixta
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2295)..(2295)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2295 = cualquiera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2919
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pasteurella multocida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2919)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> AF036004.2
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1998-04-15
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(2919)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 972
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pasteurella multocida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1260)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> L21187.1
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1993-07-23
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (79)..(1338)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus equi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1254)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> AF347022.1
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2002-11-13
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (531)..(1784)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus equi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus uberis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1254)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> AJ242946.2
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1999-07-07
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (23)..(1276)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus uberis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus
equisimilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1254)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> AF023876.1
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
1997-12-04
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(1254)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 417
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus
equisimilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip1.4cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sulfolobus tokodaii str.
7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1248)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> AP000988
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2001-09-17
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (173392)..(174639)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sulfolobus tokodaii str.
7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
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Claims (16)
1. Célula de planta, caracterizada porque
comprende una molécula de ácido nucleico que está integrada de
manera estable en su genoma y codifica una
hialuronano-sintasa, en donde los codones de las
moléculas de ácido nucleico que codifican dicha
hialuronano-sintasa están modificados de tal manera
que los mismos están adaptados a la frecuencia del uso de los
codones de la célula de planta en cuyo genoma se han integrado.
2. Célula de planta de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido
nucleico que codifica una hialuronano-sintasa está
enlazada a promotores específicos de tejido que inician la
transcripción específicamente en células de tubérculo o de
fruto.
3. Planta, que comprende células de planta de
acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
4. Planta de patata que comprende células de
planta caracterizadas porque las células de planta comprenden
una molécula de ácido nucleico que está integrada de manera estable
en su genoma y codifica una hialuronano-sintasa y
que produce al menos 29 \mug de hialuronano por gramo de peso
fresco de sus tubérculos.
5. Planta de tomate que comprende células de
planta caracterizadas porque las células de planta comprenden
una molécula de ácido nucleico que está integrada de manera estable
en su genoma y codifica una hialuronano-sintasa y
que produce al menos 4 \mug de hialuronano por gramo de peso
fresco de sus frutos.
6. Material de propagación de plantas de acuerdo
con una de las reivindicaciones 3, 4 ó 5, que comprende células de
planta de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.
7. Partes cosechables de plantas o plantas de
acuerdo con una de las reivindicaciones 3, 4 ó 5, que comprenden
células de planta de acuerdo con la reivindicación 1 o la
reivindicación 2.
8. Método para preparar una planta que sintetiza
hialuronano, en donde
- a)
- una molécula de ácido nucleico que codifica una hialuronano-sintasa, caracterizada porque los codones de la hialuronano-sintasa están modificados de tal manera que los mismos están adaptados a la frecuencia del uso de los codones de la célula de planta en cuyo genoma se han integrado, está integrada (sic) en el genoma de una célula de planta
- b)
- se regenera una planta a partir de las células de planta del paso a); y
- c)
- en caso apropiado, se generan plantas adicionales con la ayuda de las plantas del paso b).
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9. Método para preparación de hialuronano, que
comprende el paso de la extracción de hialuronano a partir de
células de planta de acuerdo con la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, a partir de plantas de acuerdo con una de las
reivindicaciones 3, 4, y 5, a partir de material de propagación de
acuerdo con la reivindicación 6, o a partir de partes cosechables
de plantas de acuerdo con la reivindicación 7.
10. Uso de una célula de planta de acuerdo con
la reivindicación 1 o la reivindicación 2, una planta de acuerdo
con una de las reivindicaciones 3, 4 ó 5, material de propagación de
acuerdo con la reivindicación 6 o partes cosechables de plantas de
acuerdo con la reivindicación 7 para preparación de hialuronano.
11. Composición que es un alimento, pienso,
producto farmacéutico o cosmético, que comprende células de planta,
en donde la célula de planta se caracteriza porque comprende
una molécula de ácido nucleico que está integrada de manera estable
en su genoma y codifica una hialuronano-sintasa.
12. Método para preparación de una composición
que es un alimento, pienso, producto farmacéutico o cosmético que
comprende componentes de células de planta, caracterizado
porque las células de planta comprenden una molécula de ácido
nucleico que está integrada de manera estable en su genoma y
codifica una hialuronano-sintasa, de plantas que
comprenden células de plantas caracterizadas porque las
células de plantas comprenden una molécula de ácido nucleico que
está integrada de manera estable en su genoma y codifica una
hialuronano-sintasa, de material de propagación que
comprende células de plantas caracterizadas porque las
células de plantas comprenden una molécula de ácido nucleico que
está integrada de manera estable en su genoma y codifica una
hialuronano-sintasa, o de partes cosechables de
plantas que comprenden células de plantas caracterizadas
porque las células de plantas comprenden una molécula de ácido
nucleico que está integrada de manera estable en su genoma y
codifica una hialuronano-sintasa, en donde se
utilizan dichas células de plantas, dichas plantas, dicho material
de propagación o dichas partes cosechables de plantas.
13. Uso de células de plantas de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, de plantas de acuerdo con
las reivindicaciones 3, 4 ó 5, de material de propagación de acuerdo
con la reivindicación 6 o de partes cosechables de plantas de
acuerdo con la reivindicación 7 para preparar una composición que
comprende componentes de células de plantas de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, de plantas de acuerdo con
las reivindicaciones 3, 4 ó 5, de material de propagación de plantas
de acuerdo con la reivindicación 6, o de partes cosechables de
plantas de acuerdo con la reivindicación 7.
14. Una harina que comprende hialuronano,
caracterizada porque la misma comprende células de plantas de
acuerdo con la reivindicación 1 la reivindicación 2.
15. Un método para producir una harina que
comprende el paso de triturar partes de plantas que comprenden
células de plantas, caracterizado porque las células de
plantas comprenden una molécula de ácido nucleico que está
integrada de manera estable en su genoma y codifica una
hialuronano-sintasa, o de material de propagación
de plantas que comprende células de plantas caracterizado
porque las células de plantas comprenden una molécula de ácido
nucleico que está integrada de manera estable en su genoma y
codifica una hialuronano-sintasa o material
cosechable de plantas que comprende células de plantas
caracterizado porque las células de plantas comprenden una
molécula de ácido nucleico que está integrada de manera estable en
su genoma y codifica una hialuronano-sintasa.
16. El uso de una célula de planta de acuerdo
con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o de una planta de
acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, ó 5 o material de propagación
de acuerdo con la reivindicación 6 o material cosechable de acuerdo
con la reivindicación 7 para producir harina.
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