CN102577950A - 一种高黄酮含量马棘的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高黄酮含量马棘的培育方法,步骤包括:取马棘的成熟种子为外植体,诱导愈伤组织,继代培养至成倍增殖期,暗条件预培养,进行农杆菌共培养转化,转移到筛选培养基进行3轮筛选,取抗性愈伤组织诱导分化成苗,对抗性植株进行标记基因组织化学染色和筛选基因分子检测,鉴定含目的基因黄酮醇合成酶基因FLS插入序列的分化小苗,对入选的转基因植株进行叶片内黄酮含量检测,选留黄酮含量高于3%的转基因植株,继续种植评价黄酮含量的表达稳定性,繁殖黄酮含量稳定高于3%的优良株系。本发明的高黄酮含量马棘,可以进行黄酮生物提取发展新型保健食品添加剂和营养强化剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种马棘的培育方法,尤其是提高黄酮含量的马棘的培育方法。
背景技术
我国新农村建设的首要任务是不断提高农民收入,发展效益农业是有效途径之一。因此,在继续重视高产、优质和抗病农作物传统育种的同时,发展以功能型为特征的农作物成为育种新方向,有助于提高农产品的附加值,实现效益农业与农民增收有机结合,“以用促种”保障农村经济持续稳定长效机制的形成。
马棘(Indigofera pseudotinctoria Mats)系豆科木蓝属多年生小灌木,具有耐热、耐旱、耐瘠、适应性广的特点,适合绿化荒山、护坡固坎、保持水土,也是牛和羊等草食性动物的优质青饲料。我国为多山、多丘陵的国家,马棘尤其适宜种植于广大贫瘠干旱的堤坡缓地,这对山区生态经济的可持续发展具有重要意义。
生物总黄酮系一大类天然产物,广泛存在于植物界,是许多中草药的有效成分具有如下重要的生理功能:消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。
黄酮醇合成酶基因FLS是黄酮生物合成中关键调控酶,可以二氢黄酮醇为底物,高效调控合成槲皮素、山萘酚、杨梅素等黄酮醇。
发明内容
正是在上述背景下,本发明的目的是提出一种高黄酮含量马棘的培育方法,以获得高黄酮含量马棘,进行类黄酮的开发,用于食品、医药、饲料和化工等领域。
本发明的高黄酮含量马棘的培育方法,包括以下步骤:
1)取马棘的成熟种子为外植体,接种至诱导培养基,在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织;
2)将诱导形成3周的愈伤组织,转移至继代培养基,继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期;
3)将成倍增殖的愈伤组织,在25±1℃避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天;
4)将经过预培养的愈伤组织,在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟,之后弃去菌液,用无菌滤纸吸干,接种于共培养基上,在25±1℃避光的黑暗条件下共培养2天;
5)将上述共培养愈伤组织,洗净、晾干后,转移到筛选培养基,在25±1℃避光的黑暗条件下培养6周,收集新长出的抗性愈伤组织,转移至新的筛选培养基上,再进行连续2轮继代筛选,每隔3周转继1次;
6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织,转移至分化培养基,在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗,对抗性植株进行组织化学染色和分子检测,选留含目的基因插入序列的的转基因植株,所说的目的基因插入序列是指目的基因黄酮醇合成酶基因FLS、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列,目的基因黄酮醇合成酶基因FLS片段长821bp;
7)取入选的转基因植株,田间种植后收获种子,测定叶片内黄酮含量,选留黄酮含量高于3%的转基因植株;
8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系,评价黄酮含量的表达稳定性,繁殖黄酮含量稳定高于3%的优良株系,为培育的高黄酮含量马棘。
本发明中,所说的诱导培养基为N6基本培养基添加2,4-D1.5mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.8。
本发明中,所说的继代培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.8。
本发明中,所说的共培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg、乙酰丁香酮2mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.8。
本发明中,所说的筛选培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg、潮霉素25mg、羧卞200 mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.8。
本发明中,所说的分化培养基为N6基本培养基添加6-BA1.0mg、NAA1mg、KT1.5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.8。
上述的N6基本培养基为KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2·2H2O 166mg、MgSO4·7H2O 185mg、KH2P04 400mg、MnSO4·4H2O 4.4mg、ZnSO4·7H2O 1.5mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、H3BO3 1.6mg、肌醇100mg、烟酸0.5mg、维生素B6 0.5mg、维生素B1 0.5mg和甘氨酸2mg。
本发明中,所说的农杆菌的菌株为EHA105,内含质粒pCAM1305,pCAM1305的T-DNA区域携带目的基因插入序列,包括目的基因黄酮醇合成酶基因FLS、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列。目的基因黄酮醇合成酶基因FLS片段长821bp,与35S和nos终止子共同构成表达框架。菌株为EHA10方便购买或赠送获得,在一般植物遗传实验室均有保存,参见文献吴关庭等,中国农业科学,2005,38(12):2395-2402。
上述的标记基因葡糖苷酸酶基因GUS的组织化学染色方法参见Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletters, 1989, (6): 168-169,筛选基因抗潮霉素基因HPT的分子检测方法参见文献吴关庭等,中国农业科学,2005,38(12):2395-2402。
本发明中,所说的黄酮含量检测方法,以芦丁为标样的比色法在波长510nm处测定,参见文献杨美华,卢充伟,匡岩巍,等. 柱色谱-紫外分光光度法测定广金钱草中总黄酮的含量. 中草药, 2004, 35(6): 688~690。
上述的稳定性是指入选马棘中黄酮含量在不同年份间(2年以上)、季节间(2季以上)以及地点间(2个地点以上)的含量变化不显著。
本发明培育的高黄酮含量的马棘,具有以下优点:
本发明首先利用黄酮醇合成酶基因FLS,作为黄酮生物合成中的关键中间调控酶,调控合成槲皮素、山萘酚、杨梅素等黄酮醇,培育出高黄酮含量马棘,进行高效生物提取,发展新型保健食品添加剂和营养强化剂,用于食品、医药饲料和化工等领域。
附图说明
图1是本发明所用的黄酮醇合成酶基因FLS插入序列的载体构建示意图。
具体实施方式
以下通过具体实例进一步说明本发明。
实施例1:
以取马棘品系“ZJJ01”的成熟种子为外植体,接种至诱导培养基,在25±1℃、光强3000勒克斯光条件下诱导形成愈伤组织;
取诱导形成3周的愈伤组织,转移至继代培养基,继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期;
取成倍增殖的愈伤组织,在25±1℃、避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天;
取经过预培养的愈伤组织(约500个培养皿,含5000块以上的愈伤组织),在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟,之后弃去菌液,用无菌滤纸吸干,接种于共培养基上,在25±1℃、避光的黑暗条件下共培养2天;
取上述共培养愈伤组织,洗净、晾干后,转移到筛选培养基,在25±1℃、避光的黑暗条件下培养6周,收集新长出的抗性愈伤组织(约450块愈伤组织),转移至新的筛选培养基上,再进行连续2轮继代筛选,每隔3周转继1次;
取3轮筛选后的抗性愈伤组织(约90块愈伤组织),转移至分化培养基,在25±1℃、光强3000勒克斯光条件下诱导分化成苗83株,对抗性植株进行标记基因GUS组织化学染色和筛选基因HPT分子检测,选留含目的基因黄酮醇合成酶基因FLS插入序列的转基因植株21株(目的基因插入序列的载体构建如图1所示)。
取入选的转基因植株,田间种植后收获种子,进行叶片内黄酮含量检测,选留黄酮含量高于3%的转基因植株9株,继续种植转基因株系;
2008-2010连续3年,分别在浙江杭州、临安、富阳三地三季评价总黄酮含量的表达稳定性,繁殖总黄酮含量稳定高于10%的优良株系,最终培育高黄酮含量马棘4个,T-MJ-1、T-MJ-2、T-MJ-3和T-MJ-4,其叶片内总黄酮含量分别为5.1%、4.6%、3.7%、3.2%,而原马棘的总黄酮含量仅为0.82%。
Claims (7)
1. 一种高黄酮含量马棘的培育方法,包括以下步骤:
1)取马棘的成熟种子为外植体,接种至诱导培养基,在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织;
2)将诱导形成3周的愈伤组织,转移至继代培养基,继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期;
3)将成倍增殖的愈伤组织,在25±1℃避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天;
4)将经过预培养的愈伤组织,在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟,之后弃去菌液,用无菌滤纸吸干,接种于共培养基上,在25±1℃避光的黑暗条件下共培养2天;
5)将上述共培养愈伤组织,洗净、晾干后,转移到筛选培养基,在25±1℃避光的黑暗条件下培养6周,收集新长出的抗性愈伤组织,转移至新的筛选培养基上,再进行连续2轮继代筛选,每隔3周转继1次;
6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织,转移至分化培养基,在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗,对抗性植株进行组织化学染色和分子检测,选留含目的基因插入序列的的转基因植株,所说的目的基因插入序列是指目的基因黄酮醇合成酶基因FLS、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列,目的基因黄酮醇合成酶基因FLS片段长821bp;
7)取入选的转基因植株,田间种植后收获种子,测定叶片内黄酮含量,选留黄酮含量高于3%的转基因植株;
8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系,评价黄酮含量的表达稳定性,繁殖黄酮含量稳定高于3%的优良株系,为培育的高黄酮含量马棘。
2. 根据权利要求1所述的高黄酮含量马棘的培育方法,其特征在于所说的诱导培养基为N6基本培养基添加2,4-D1.5mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.8。
3. 根据权利要求1所述的高黄酮含量马棘的培育方法,其特征在于所说的继代培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.8。
4. 根据权利要求1所述的高黄酮含量马棘的培育方法,其特征在于所说的共培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg、乙酰丁香酮2mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.8。
5. 根据权利要求1所述的高黄酮含量马棘的培育方法,其特征在于所说的筛选培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg、潮霉素25mg、羧卞200 mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.8。
6. 根据权利要求1所述的高黄酮含量马棘的培育方法,其特征在于所说的分化培养基为N6基本培养基添加6-BA1.0mg、NAA1mg、KT1.5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.8。
7. 根据权利要求2-6所述的高黄酮含量马棘的培育方法,其特征在于所说的N6基本培养基为KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2·2H2O 166mg、MgSO4·7H2O 185mg、KH2P04 400mg、MnSO4·4H2O 4.4mg、ZnSO4·7H2O 1.5mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、H3BO3 1.6mg、肌醇100mg、烟酸0.5mg、维生素B6 0.5mg、维生素B1 0.5mg和甘氨酸2mg。
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