JP4732591B2 - 分枝酵素活性を有するポリペプチド及びそれをコードする核酸 - Google Patents
分枝酵素活性を有するポリペプチド及びそれをコードする核酸 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4732591B2 JP4732591B2 JP2000608726A JP2000608726A JP4732591B2 JP 4732591 B2 JP4732591 B2 JP 4732591B2 JP 2000608726 A JP2000608726 A JP 2000608726A JP 2000608726 A JP2000608726 A JP 2000608726A JP 4732591 B2 JP4732591 B2 JP 4732591B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- nucleic acid
- acid sequence
- seq
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 219
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 213
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 213
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 131
- 108090000344 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 63
- 102000003925 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 75
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 91
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 39
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 39
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 34
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 28
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 241001148570 Rhodothermus marinus Species 0.000 claims description 7
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 5
- 241001148569 Rhodothermus Species 0.000 claims description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 120
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 56
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 44
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 36
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 31
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 27
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 24
- 101150070444 glgB gene Proteins 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 18
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 18
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 17
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 17
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 17
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 16
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 13
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 13
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 12
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 12
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 12
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 11
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 11
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 10
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 9
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 9
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 8
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 7
- 241000221779 Fusarium sambucinum Species 0.000 description 7
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 7
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 7
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 7
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 7
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 7
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 6
- 101000757144 Aspergillus niger Glucoamylase Proteins 0.000 description 6
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 6
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 6
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 5
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 5
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 5
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 5
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 5
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 5
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 5
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 5
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 5
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 5
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 5
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 4
- 241000223198 Humicola Species 0.000 description 4
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 description 4
- 108010028688 Isoamylase Proteins 0.000 description 4
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 4
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 4
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 4
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 4
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 4
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 4
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 4
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 3
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 3
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 3
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 3
- 108010037870 Anthranilate Synthase Proteins 0.000 description 3
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 3
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 3
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 3
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 3
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 description 3
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 3
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 3
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 3
- 241001494489 Thielavia Species 0.000 description 3
- 241000223262 Trichoderma longibrachiatum Species 0.000 description 3
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 3
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 3
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 3
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 3
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 229920002126 Acrylic acid copolymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000743339 Agrostis Species 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101100163849 Arabidopsis thaliana ARS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000690713 Aspergillus niger Alpha-glucosidase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 2
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 2
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 2
- 101000695691 Bacillus licheniformis Beta-lactamase Proteins 0.000 description 2
- 108010029675 Bacillus licheniformis alpha-amylase Proteins 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 2
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical group C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 2
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 2
- 241001112697 Fusarium reticulatum Species 0.000 description 2
- 241000567178 Fusarium venenatum Species 0.000 description 2
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 2
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 101100369308 Geobacillus stearothermophilus nprS gene Proteins 0.000 description 2
- 101100080316 Geobacillus stearothermophilus nprT gene Proteins 0.000 description 2
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 229910017621 MgSO4-7H2O Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000001006 Saccharomyces cerevisiae var diastaticus Nutrition 0.000 description 2
- 244000206963 Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus Species 0.000 description 2
- 241000204893 Saccharomyces douglasii Species 0.000 description 2
- 241001407717 Saccharomyces norbensis Species 0.000 description 2
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 2
- 101100097319 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ala1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000378866 Trichoderma koningii Species 0.000 description 2
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 description 2
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 108010005400 cutinase Proteins 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 108010061330 glucan 1,4-alpha-maltohydrolase Proteins 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 2
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108010020132 microbial serine proteinases Proteins 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920000847 nonoxynol Polymers 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N 0.000 description 1
- VXWBQOJISHAKKM-UHFFFAOYSA-N (4-formylphenyl)boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=C(C=O)C=C1 VXWBQOJISHAKKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEORSVTYLWZQJQ-UHFFFAOYSA-N 2-(2-nonylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=CC=C1OCCO IEORSVTYLWZQJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDAVBNHKLPHGGU-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentadec-2-enoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC=C(C)C(O)=O XDAVBNHKLPHGGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- GUOCOOQWZHQBJI-UHFFFAOYSA-N 4-oct-7-enoxy-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)OCCCCCCC=C GUOCOOQWZHQBJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710146708 Acid alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 229920000310 Alpha glucan Polymers 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920001685 Amylomaize Polymers 0.000 description 1
- 241000534414 Anotopterus nikparini Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101710152845 Arabinogalactan endo-beta-1,4-galactanase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000084703 Arnoldiellina fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000186074 Arthrobacter globiformis Species 0.000 description 1
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 1
- 101000961203 Aspergillus awamori Glucoamylase Proteins 0.000 description 1
- 241000892910 Aspergillus foetidus Species 0.000 description 1
- 241001480052 Aspergillus japonicus Species 0.000 description 1
- 101900127796 Aspergillus oryzae Glucoamylase Proteins 0.000 description 1
- 101900318521 Aspergillus oryzae Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 101000775727 Bacillus amyloliquefaciens Alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- 101900040182 Bacillus subtilis Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 102100030981 Beta-alanine-activating enzyme Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102100032487 Beta-mannosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 241000605900 Butyrivibrio fibrisolvens Species 0.000 description 1
- 101100520142 Caenorhabditis elegans pin-2 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010031396 Catechol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000030523 Catechol oxidase Human genes 0.000 description 1
- 102100037633 Centrin-3 Human genes 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000701248 Chlorella virus Species 0.000 description 1
- 241001517488 Clavus Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000222511 Coprinus Species 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 108010025880 Cyclomaltodextrin glucanotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101100342470 Dictyostelium discoideum pkbA gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710147028 Endo-beta-1,4-galactanase Proteins 0.000 description 1
- 241000178951 Endomyces Species 0.000 description 1
- 101100385973 Escherichia coli (strain K12) cycA gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 229910005390 FeSO4-7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910005444 FeSO4—7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000234642 Festuca Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 244000307700 Fragaria vesca Species 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 241000145614 Fusarium bactridioides Species 0.000 description 1
- 241000567163 Fusarium cerealis Species 0.000 description 1
- 241000223194 Fusarium culmorum Species 0.000 description 1
- 241000146406 Fusarium heterosporum Species 0.000 description 1
- 241000223192 Fusarium sporotrichioides Species 0.000 description 1
- 101150108358 GLAA gene Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 101100001650 Geobacillus stearothermophilus amyM gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108010073324 Glutaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000009127 Glutaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 102100025591 Glycerate kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000773364 Homo sapiens Beta-alanine-activating enzyme Proteins 0.000 description 1
- 101000880522 Homo sapiens Centrin-3 Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 241001671311 Laurus Species 0.000 description 1
- 101710094902 Legumin Proteins 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- 241000219745 Lupinus Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101150068888 MET3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001344133 Magnaporthe Species 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 108010054377 Mannosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000001696 Mannosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229910017234 MnSO4 H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017237 MnSO4-H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017228 MnSO4—H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- 241000226677 Myceliophthora Species 0.000 description 1
- 241001293484 Mycelis Species 0.000 description 1
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000233892 Neocallimastix Species 0.000 description 1
- 101100022915 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000007981 Ornithine carbamoyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710113020 Ornithine transcarbamylase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100037214 Orotidine 5'-phosphate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010055012 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 241000635201 Pumilus Species 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241000235402 Rhizomucor Species 0.000 description 1
- 101000968489 Rhizomucor miehei Lipase Proteins 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 241000952054 Rhizopus sp. Species 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101900354623 Saccharomyces cerevisiae Galactokinase Proteins 0.000 description 1
- 241000222480 Schizophyllum Species 0.000 description 1
- 101100022918 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) sua1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241001134658 Streptococcus mitis Species 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 241001468239 Streptomyces murinus Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000135402 Synechococcus elongatus PCC 6301 Species 0.000 description 1
- 241000228341 Talaromyces Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- BGRWYDHXPHLNKA-UHFFFAOYSA-N Tetraacetylethylenediamine Chemical compound CC(=O)N(C(C)=O)CCN(C(C)=O)C(C)=O BGRWYDHXPHLNKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101100157012 Thermoanaerobacterium saccharolyticum (strain DSM 8691 / JW/SL-YS485) xynB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000228178 Thermoascus Species 0.000 description 1
- 241000223257 Thermomyces Species 0.000 description 1
- 241001495429 Thielavia terrestris Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000223260 Trichoderma harzianum Species 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000758405 Zoopagomycotina Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 150000008051 alkyl sulfates Chemical class 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010055059 beta-Mannosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 235000012970 cakes Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 101150005799 dagA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 235000011850 desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- GSPKZYJPUDYKPI-UHFFFAOYSA-N diethoxy sulfate Chemical compound CCOOS(=O)(=O)OOCC GSPKZYJPUDYKPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical class [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 238000004851 dishwashing Methods 0.000 description 1
- NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L disodium;4-(4-chloro-2-methylphenoxy)butanoate;4-(2,4-dichlorophenoxy)butanoate Chemical compound [Na+].[Na+].CC1=CC(Cl)=CC=C1OCCCC([O-])=O.[O-]C(=O)CCCOC1=CC=C(Cl)C=C1Cl NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001245 distarch phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000013804 distarch phosphate Nutrition 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000002979 fabric softener Substances 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 206010016531 fetishism Diseases 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 150000003948 formamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108010086476 glycerate kinase Proteins 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 229910052595 hematite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011019 hematite Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEYVWSJAZONVQK-UHFFFAOYSA-N hydroperoxy(oxo)borane Chemical compound OOB=O PEYVWSJAZONVQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003165 hydrotropic effect Effects 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- LIKBJVNGSGBSGK-UHFFFAOYSA-N iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[Fe+3].[Fe+3] LIKBJVNGSGBSGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108010003855 mesentericopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- SNQQPOLDUKLAAF-UHFFFAOYSA-N nonylphenol Chemical class CCCCCCCCCC1=CC=CC=C1O SNQQPOLDUKLAAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 1
- 101150105920 npr gene Proteins 0.000 description 1
- 101150017837 nprM gene Proteins 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 108090000021 oryzin Proteins 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 101150019841 penP gene Proteins 0.000 description 1
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 150000004965 peroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N phencyclidine Chemical compound C1CCCCN1C1(C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000005222 photoaffinity labeling Methods 0.000 description 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 1
- 229920002006 poly(N-vinylimidazole) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920005646 polycarboxylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 108060006613 prolamin Proteins 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 101150108007 prs gene Proteins 0.000 description 1
- 101150086435 prs1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150070305 prsA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 1
- ILVXOBCQQYKLDS-UHFFFAOYSA-N pyridine N-oxide Chemical compound [O-][N+]1=CC=CC=C1 ILVXOBCQQYKLDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052705 radium Inorganic materials 0.000 description 1
- HCWPIIXVSYCSAN-UHFFFAOYSA-N radium atom Chemical compound [Ra] HCWPIIXVSYCSAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- MWNQXXOSWHCCOZ-UHFFFAOYSA-L sodium;oxido carbonate Chemical compound [Na+].[O-]OC([O-])=O MWNQXXOSWHCCOZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000011496 sports drink Nutrition 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 235000011044 succinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 108010075550 termamyl Proteins 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 101150110790 xylB gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007221 ypg medium Substances 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
- 239000004711 α-olefin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12N9/107—1,4-Alpha-glucan branching enzyme (2.4.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01018—1,4-Alpha-glucan branching enzyme (2.4.1.18), i.e. glucan branching enzyme
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
本発明の分野
本発明は分枝酵素活性を有するポリペプチド及びそのポリペプチドをコードする単離した核酸配列に関する。本発明は前記核酸配列を含んで成る核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞並びに前記ポリペプチドを生成し、そして使用するための方法にも関する。
【0002】
関連技術の説明
以降BEと表す分枝酵素(EC2.4.1.18)はグリコシル転移を触媒して、微生物、植物及び高等生物においてグリコーゲン及びアミロペクチンのα−1,6−グリコシド結合(分枝点)を形成せしめる。グリコーゲン及びアミロペクチンは、微生物、植物及び高等生物におけるエネルギー保存に使用される、高度に分枝化した澱粉材料である。BEは異なる分子間で分枝を形成するだけでなく(分子間転移)、複数の分枝化したグルカンの、同一の分子上の別の部位への転移も触媒する(分子内転移)。
【0003】
高度に分枝化した澱粉材料は、末修飾の澱粉と比較して高い溶解性、低粘度及び劣化しにくいという様な独特の特性を持ち、これはEPO 690 170に記載されている様に製紙業における表面のサイジング及びコーティングを含む接着性組成物、US 4 454 161に記載の食品及び飲料添加物並びに抗デンプン劣化剤における使用のために、それらを興味深いものにしている。
【0004】
複数の異なる生物に由来する分枝酵素が単離され、そして開示されてきた:例えば、US 4 454 161はバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)由来のBEを記載し;Boyer and Preiss,Biochemistry,vol.16(16),pp.3693−3699,1977は、エスクリッチャ・コリ(Escherichia coli)由来のBEを記載し;Zeverhuizen,Biochem.Biophys.Acta(81),pp.608−611,1964は、アルスロバクター・グロビホルミス(Arthrobacter globiformis)由来のBEを記載し;Walker and Builder,Eur.J.of Biochem.,vol.20(1),pp14−21,1971は、ストレプトコッカス・ミチス(Streptococcus mitis)由来のBEを記載し;Kiel et al.,Gene,vol.78(1),pp.9−18,1989は、シアノバクテリウム・シネココッカス(Cyanobacterium Synechococcus)種のPCC7942由来のBEを記載し;Rumbak et al.,Journal of Bacteriology,vol.173(21),pp.6732−6741,1991は、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス(Butyrivibrio fibrisolvens)由来のBEを記載し;Kiel et al.,DNA Sequence,vol.3(4),pp.221−232,1992は、バチルス・カルドリチカス(Bacillus caldolyticus)由来のBEを記載している。
【0005】
上文で言及した引用の共通の特徴は、報告された至適温度のいずれも45℃以上ではないことである。わずかに2つの分枝酵素だけが、それより高い至適温度を有すると開示された:Kiel et al.,Molecular & General Genetics,vol.230(1−2),pp.136−144,1991(更にはEP 0 418 945):53℃の至適温度を有するバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus Stearothermophilus)1503−4Rの分枝酵素;及びTakata et.al.,Applied and Environmental Microbiology,vol.60(9),pp.3096−3104,1994:約50℃の至適温度を有するバチルス・ステアロサーモフィルスTRBE14の分枝酵素。
【0006】
高温で増大する反応速度が得られるため、高い至適温度を有する分枝酵素を使用することは、産業上有利である。それによって、より高い能力が同量の酵素で得られ、そしてより良い生産経済が達成される。更に、高温での処理の実施は、感染の予防により有益である。
【0007】
分枝酵素活性を有する改良ポリペプチド及びそのポリペプチドをコードする核酸を提供することが本発明の目的である。
【0008】
本発明の要約
本発明は、分枝酵素活性、及び少なくとも60℃の至適温度を有する単離したポリペプチドに関する。
【0009】
本発明は、前記ポリペプチドをコードする単離した核酸配列並びにその核酸配列を含んで成る核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞、並びに前記ポリペプチドを生成し、そして使用するための方法にも関する。
【0010】
本発明の詳細な説明
分枝酵素活性を有するポリペプチド
「分枝酵素活性」とは、グリコーゲン又はアミロペクチンの1,6−α−グリコシド結合の形成を触媒する1,4−α−グルカン分枝活性である(EC 2.4.1.18)。本発明の目的のために、分枝酵素活性は、本明細書の材料と方法の項目の中の標題「分枝酵素活性」に記載されている、Takata et al.,Applied and Environmental Microbiology(1994),p.3097に記載の方法(アッセイA)の改良版に従い決定され得る。
【0011】
第一の観点において、本発明は分枝酵素活性を有し、そして少なくとも60℃の至適温度を有する単離したポリペプチドに関し;好ましくは、その至適温度は60℃〜120℃の範囲にあり;更に好ましくは、その至適温度は60℃〜100℃の範囲にあり;より更に好ましくは、その至適温度は60℃〜80℃の範囲にあり;最も好ましくは、その至適温度は60℃〜70℃の範囲にあり;そしてより最も好ましくは、その至適温度は65℃である。
【0012】
第一の態様において、本発明のポリペプチドはpH6〜pH8の範囲で約70%の相対的活性を保持し;好ましくはpH6〜pH7の範囲で約80%の相対的活性を保持し;更に好ましくは、至適pHが約pH7である。
【0013】
至適温度及びpHを決定するために使用する条件は、本明細書の材料を方法の項目において「分枝酵素活性」の標題のもと記載されているものである。
【0014】
第二の態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸2〜621(すなわち、成熟ポリペプチド)に対して、又はE.コリDSM12607に含まれるプラスミドpT7Blueに含まれる核酸配列によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約65%、好ましくは少なくとも約70%、更に好ましくは少なくとも約80%、より更に好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%、より最も好ましくは少なくとも約97%の相同性の値を有する、分枝酵素活性を有するアミノ酸配列を有する(以降、「相同ポリペプチド」と称する)。好ましい態様において、相同ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列と、5つのアミノ酸、好ましくは4つのアミノ酸、更に好ましくは3つのアミノ酸、より更に好ましくは2つのアミノ酸、最も好ましくは1つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。
【0015】
本発明の目的のために、配列のアラインメント及び相同性スコアの計算は、タンパク質及びDNA、その両方のアラインメントに有用な、完全なSmith−Watermanアラインメントを用いて行われ得る。デフォルトスコアリングマトリックス BLOSUM50及び同一性マトリックスは、それぞれタンパク質及びDNAのアラインメントに使用される。ギャップの最初の残基についてのペナルティーは、タンパク質で−12、そしてDNAで−16であり、一方、ギャップの追加の残基についてのペナルティーは、タンパク質で−2、そしてDNAで−4である。アラインメントは、FASTAパッケージの第v20u6版でも行われ得る(W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988),「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」,PNAS 85:2444−2448、及びW.R.Pearson(1990)「Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA」,Methods in Enzymology,183:63−98)。タンパク質配列の複数のアラインメントは、「Clustal W」を用いて行われ得る(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.and Gibson,T.J.(1994)CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,positions−specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Research,22:(1673−4680)。DNA配列の複数のアラインメントは、アミノ酸を、DNA配列に由来する相当するコドンと置き換える鋳型としてタンパク質のアラインメントを用いて行われ得る。
【0016】
好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体;あるいは分枝酵素活性を有するそのフラグメントを含んで成る。更に好ましい態様において、本発明のポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を含んで成る。別の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体;あるいは分枝酵素活性を有するそのフラグメントから成る。別の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列から成る。
【0017】
配列番号2のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ及び/又はカルボキシル末端から欠失した1又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドである。
【0018】
対立変異体とは、同一の染色体の座を占める遺伝子の2又はそれ以上の択一型のいずれかを表す。対立変異は突然変異を介して自然に起こり、そして個体群において多型を生じ得る。遺伝子の突然変異はサイレント(コードされたポリペプチドにおける無変化)であることもあり、又は変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることもある。ポリペプチドの対立変異体は、対立変異体の遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【0019】
第三の態様において、本発明のポリペプチドは、非常に低いストリンジェントな条件、好ましくは低いストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度にストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度−高度にストリンジェントな条件、より更に好ましくは高度にストリンジェントな条件、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件のもと、同一の条件下で(i)配列番号1のヌクレオチド、(ii)配列番号1のヌクレオチドに含まれるcDNA配列、(iii)(i)若しくは(ii)の亜配列、又は(iv)(i),(ii)、若しくは(iii)の相補鎖とハイブリダイズする核酸プローブとハイブリダイズする核酸配列によってコードされる、分枝酵素活性を有する(J.Sambrook,E.F.Fritsh,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor,New York)。配列番号1の亜配列は少なくとも100個のヌクレオチド又は好ましくは少なくとも200個のヌクレオチドであってもよい。更に前記亜配列は、分枝酵素活性を有するポリペプチドフラグメントをコードすることがある。前記ポリペプチドは更に、分枝酵素活性を有するポリペプチドの対立遺伝子変異体又はフラグメントであってもよい。
【0020】
配列番号1の核酸配列又はその亜配列、及び配列番号2のアミノ酸配列又はそのフラグメントは、当業界で公知の方法に従い、異なる属又は種の菌株から分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定し、そしてクローン化するための核酸プローブを設計するために使用されうる。特に、前記プローブは、標準的なサザンブロッティング方法に従い、その中で相当する遺伝子を同定し、そして単離するために、注目の属又は種のゲノム又はcDNAとのハイブリダイゼーションのために使用され得る。前記プローブは全配列よりもかなり短いことがあるが、少なくとも15、好ましくは少なくとも25、及び更に好ましくは少なくとも35ヌクレオチドの長さであるべきである。更に長いプローブも使用することができる。DNA及びRNAプローブ、その両方を使用することができる。前記プローブは、典型的に相当する遺伝子を検出するために標識される(例えば、32P、3H、35S、ビオチン、又はアビジンによる)。前記プローブは本発明に包含される。
【0021】
従って、その様な他の生物から調製したゲノムDNA又はcDNAライブラリーは、上述したプローブとハイブリダイズし、そして分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAのためにスクリーニングされ得る。その様な他の生物由来のゲノム又は他のDNAは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、あるいは他の分離技術によって分離され得る。前記ライブラリー由来のDNA又は分離したDNAは、ニトロセルロース又は他の適当な担体材料上に移され、そして固定化され得る。配列番号1又はその亜配列と相同なクローン又はDNAを同定するために、前記担体材料はサザンブロットに使用される。本発明の目的のためのハイブリダイゼーションは、前記核酸配列が、配列番号1に示した核酸配列、その相補鎖、又はそれらの亜配列に、非常に低いないし非常に高度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを示唆する。前記核酸プローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、X線フィルムを用いて検出される。
【0022】
好ましい態様において、前記核酸プローブは、配列番号2のポリペプチドをコードする核酸配列、又はその亜配列である。別の好ましい態様において、前記核酸プローブは配列番号1である。別の好ましい態様において、前記核酸プローブは、エスケリッチャ・コリ DSM12607に含まれるプラスミドpT7Blueに含まれる核酸配列であり(例1を参照のこと)、この中で、前記核酸配列は分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
【0023】
少なくとも100ヌクレオチドの長さの長いプローブのための、非常に低いないし非常に高度なストリンジェントな条件は、5× SSPE、0.3%SDS、200μg/mlの剪断し、そして変性したサケ精子DNA、並びに非常に低い及び低いストリンジェント性のための25%ホルムアミド、中程度及び中程度−高度にストリンジェント性のための35%ホルムアミド、又は高度及び非常に高度なストリンジェント性のための50%ホルムアミドのいずれかにおける、標準的なサザンブロッティング法に従う42℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。
【0024】
少なくとも100ヌクレオチドの長さのプローブのために、前記担体材料は、最終的に2×SSC、0.2%SDSを用いて、好ましくは少なくとも45℃(非常に低いストリンジェント性)、更に好ましくは少なくとも50℃(低いストリンジェント性)、更に好ましくは少なくとも55℃(中程度のストリンジェント性)、更に好ましくは少なくとも60℃(中程度−高度なストリンジェント性)、より更に好ましくは65℃(高度なストリンジェント性)、及び最も好ましくは少なくとも70℃(非常に高度なストリンジェント性)で、各15分間、3回洗浄される。
【0025】
約15ヌクレオチド〜約70ヌクレオチドの長さの短いプローブのためのストリンジェントな条件は、Bolton及びMcCarthy(1962,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390)に従う計算を用いて算出したTmから5℃〜10℃低い温度で、1ml当たり0.9M NaCl、0.09M Tris−HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5%NP−40,1×デンハルト溶液、1mMピロリン酸ナトリウム、1mM 一塩基リン酸ナトリウム、0.1mM ATP、及び0.2mgの酵母RNAにおいて、標準的なサザンブロッティング法に従うプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及びハイブリダイゼーション後の洗浄として定義される。
【0026】
約15ヌクレオチド〜約70ヌクレオチドの長さの短いプローブのための前記担体材料は、1回、6×SCC+0.1%SDS中で15分間、及び2回、6×SSCを用いて算出したTmより5℃〜10℃低い温度で各15分間洗浄される。
【0027】
第四の態様において、本発明は1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は挿入を含んで成る配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドのBE活性を有する変異体に関する。
【0028】
変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、1又は複数のアミノ酸残基の挿入若しくは欠失によって、及び/又は異なるアミノ酸残基による1又は複数のアミノ酸残基の置換によって、配列番号2のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドと異なることがある。好ましくは、アミノ酸の変化は前記タンパク質の折りたたみ及び/又は活性に有意に影響を与えない保存的なアミノ酸置換;典型的に1〜約30アミノ酸のわずかな欠失;わずかなアミノ又はカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基;最大約20〜25残基の小さいリンカーペプチド;あるいは正電価の変化又は別の機能により精製を容易にするわずかな伸長、例えばポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープ又は結合ドメインという、軽微な性質のものである。
【0029】
保存性置換の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リジン及びヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸(グルタミン及びアスパラギン)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン及びバリン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン)及び小型アミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン)の群内である。一般的には比活性を変えないアミノ酸置換は当業界で既知であり、例えば、H.NeurathとR.L.Hill(1979、「The Proteins」Academic Press,New York)により記載されている。最も普通に発生する交換は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及びAsp/Glyならびにこれらの逆である。
【0030】
第五の態様において、本発明のポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して免疫化学的同一性又は部分的な免疫化学的同一性を有する。免疫化学的特性は、公知のオクタロニー二重免疫拡散法による免疫学的交差反応同定試験によって決定される。具体的には、免疫反応性の、又は配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはその成熟ポリペプチドのエピトープに結合するポリクローナル抗体を含む抗血清は、Harboe and Ingild,In N.H.Axelsen,J.Kroll and B.Weeks,editors,A Manual of Quantative Immunoelectrophoresis,Blackwell Scientific Publications,1973,Chapter 23、又はJohnstone and Thorpe,Immunochemistry in Practice,Blackwell Scientific Publications,1982(更に具体的には27〜31ページ)に記載されている方法に従いウサギ(又は他のげっ歯類)を免疫化することで調製される。免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、同一の様式、例えば沈澱の全体的な融合、同一な沈澱の形態、及び/又は同一な電気泳動の移動度で、特異的な免疫化学的技術を用いて抗血清と反応するポリペプチドである。免疫化学的同一性の更なる説明は、Axelsen,Bock,and Kroll,In N.H.Axelsen,J.Kroll,and B.Weeks,editors,A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,Blackwell Scientific Publications,1973,Chapter 10に記載されている。部分的な免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、部分的に同一な様式、例えば沈澱の部分的融合、部分的に同一な沈澱の形態、及び/又は部分的に同一な電気泳動の移動度で、特異的な免疫化学的技術を用いて抗血清と反応するポリペプチドである。部分的な免疫化学的同一性の更なる説明は、Bock and Axelsen,In N.H.Axelsen,J.Kroll,and B.Weeks,editors,A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,Blackwell Scientific Publications,1973,Chapter 11に記載されている。
【0031】
前記抗体は更に、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、例えばE.Harlow and D.Lane,editors,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New Yorkの方法に従い調製され、そして使用されうる。
【0032】
本発明のポリペプチドは、配列番号2のポリペプチドの少なくとも20%、好ましくは少なくとも40%、更に好ましくは少なくとも60%、より更に好ましくは少なくとも80%、より更に好ましくは少なくとも90%、及び最も好ましくは少なくとも100%の分枝酵素活性を有する。
【0033】
本発明のポリペプチドは、任意の属の微生物から得られる。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、所定の供給源と関連して本明細書中で用いる場合、核酸配列によりコードされるポリペプチドがその供給源により、又は供給源からの核酸が挿入された細胞により生成されることを意味する。好ましい態様において、ポリペプチドは細胞外に分泌される。
【0034】
本発明のポリペプチドは、細菌ポリペプチドである。例えば、ポリペプチドは、グラム陽性細菌ポリペプチド、例えばバチルス属ポリペプチド、例えばバチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バチルス・ラウツス(Bacillus lautus)、バチルス・レンツス(Bacillus lentus)、バチルス・リケミホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)又はバチルス・サーリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)ポリペプチド;あるいはストレプトミセスポリペプチド、例えばストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)又はストレプトミセス・ムリヌス(Streptomyces murinus)ポリペプチド;あるいはグラム陰性細菌ポリペプチド、例えばE.コリ又はシュードモナス種ポリペプチドであり得る。
【0035】
本発明のポリペプチドは、真菌ポリペプチド、更に好ましくは酵母ポリペプチド、例えばカンジダ属(Candida)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)又はヤローウィア属(Yarrowia)ポリペプチド;あるいは更に好ましくは糸状真菌ポリペプチド、例えばアクレモニウム属(Acremonium)、アスペルギルス属(Aspergillus)、オーレオバシジウム属(Aureobasidium)、クリプトコックス属(Cryptococcus)、フィリバシジウム属(Filibasidium)、フザリウム属(Fusarium)、フミコラ属(Humicola)、マグナポルテ属(Magnaporthe)、ムコール属(Mucor)、ミセリオフトラ属(Myceliophthora)、ネオカリマスチクス属(Neocallimastix)、ニューロスポラ属(Neurospora)、ペシロミセス属(Paecilomyces)、ペニシリウム属(Penicillium)、ピロミセス属(Piromyces)、シゾフィルム属(Schizophyllum)、タラロミセス属(Talaromyces)、サーモアスクス属(Thermoascus)、チエラビア属(Thielavia)、トリポクラジウム属(Tolypocladium)又はトリコデルマ属(Trichoderma)ポリペプチドであり得る。
【0036】
好ましい態様において、ポリペプチドは、サッカロミセス属・カースベルゲンシス(Saccharomyces carsbergensis)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ジアスタチクス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロミセス・ドウグラシ(Saccharomyces douglasii)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)又はサッカロミセス・オビホルミス(Saccharomyces oviformis)ポリペプチドである。
【0037】
別の好ましい態様において、ポリペプチドは、アスペルギルス・クレツス(Aspergillus culeatus)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フェチズス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニクス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、フザリウム・バクトリジオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クルックウェレンセ(Fusarium crookwellense)、フザリウム・クルモルム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンジ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レテイキュラツム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・ザムブチヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・ザルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコセキオイデス(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ペニシリウム・パープロゲヌム(purpurogenum)、トリコデルマ・ハージアヌム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギー(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアツム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)又はトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)ポリペプチドである。
【0038】
別の好ましい態様において、ポリペプチドはロドサームス・オバメンシス(Rhodothermus obamensis)、又はロドサームス・マリヌス(Rhodothermus marinus)のポリペプチドである。
【0039】
更に好ましい態様において、ポリペプチドはロドサームス・オバメンシスのポリペプチドであり、そして最も好ましくは、エスケリッチャ・コリ DSM12607に含まれるプラスミドpT7Blueに含まれる配列(例1を参照のこと)のコード領域のポリペプチド、例えば配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【0040】
前記の種に関しては、それらが知られている種名にかかわらず、本発明は完全及び不完全状態、ならびにその他の分類学的等価物、例えば無性世代を含んで成ると理解される。適切な等価物の同一性を、当業者は容易に理解する。例えば、ロドサームス・オバメンシスの分類学的等価物は、Sako et al.,International Journal of Systematic Bacteriology,Vol.46(4) pp.1099−1104(1996)によって定義されている。
【0041】
これらの種の系統は、多数の培養コレクション、American Type Culture Collection(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)、Japan Collection of Microorganism(JCM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center(NRRL)において、一般に容易に入手可能である。
【0042】
更にこのようなポリペプチドは、前記のプローブを用いて、自然(例えば土壌、堆肥、水等)から単離された微生物を含めたその他の供給源から同定され、そして入手され得る。天然生息地から微生物を単離するための技法は、当業界で周知である。次に、別の微生物のゲノム又はcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることにより、核酸配列が得られる。ポリペプチドをコードする核酸配列がプローブにより一旦検出されれば、当業者に既知の技法を用いて、配列を単離又はクローン化し得る(例えば、Sambrook et al.,1989(前記)を参照のこと)。
【0043】
本明細書中で定義する場合、「単離された」ポリペプチドとは、本質的にその他の非分枝酵素ポリペプチドを含まない、例えば、SDS−PAGEにより決定した場合に、少なくとも約20%純粋な、好ましくは少なくとも約40%純粋な、更に好ましくは約60%純粋な、より更に好ましくは約80%純粋な、最も好ましくは約90%純粋な、そして更には最も好ましくは約95%純粋であるポリペプチドである。
【0044】
本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドは、もう一つのポリペプチドが前記ポリペプチド又はそのフラングメントのN末端又はC末端で融合される融合ポリペプチド又は開裂可能な融合ポリペプチドも含む。融合ポリペプチドは、別のポリペプチドをコードする核酸配列(又はその一部)を本発明の核酸配列(又はその一部)に融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は当業界で既知であり、それらがフレーム内にあり、そして融合ポリペプチドの発現が同一プロモーター及びターミネーターの制御下にあるように、ポリペプチドをコードするコード配列をライゲーションすることを含む。
【0045】
核酸配列
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸配列にも関する。好ましい態様において、核酸配列は配列番号1に記載される。別の更に好ましい態様において、核酸配列はE・コリ DSM12607に含まれるプラスミドpT7Blueに含まれる配列(例1を参照のこと)である。本発明は、遺伝暗号の縮重の点で配列番号1とは異なる配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列も含んで成る。本発明は、分枝酵素活性を有する配列番号2のフラングメントをコードする配列番号1の亜配列にも関する。
【0046】
配列番号1の亜配列は配列番号1に包含される核酸配列であるが、但し5’及び/又は3’末端から1又は複数のヌクレオチドが欠失されている。
【0047】
本発明は、配列番号1のポリペプチドをコードしている配列中に少なくとも1つの変異を含んで成る変異体核酸配列にも関するが、この場合、変異体核酸配列は配列番号2のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする。
【0048】
ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローン化するために用いられる技術は当業界で既知であり、その例としては、例えばゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組合せが挙げられる。このようなゲノムDNAからの本発明の核酸配列のクローン化は、例えば例1に示す様な周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又は共有の構造的特徴でクローン化したDNAフラングメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いることにより実行され得る(例えば、Innis et al.,1990、「PCR:A Guide to Methods and Application」Academic Press、New Yorkを参照のこと)。その他の核酸増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応(LCR)、結合活性化転写(LAT)及び核酸配列を基にした増幅(NASBA)も用い得る。核酸配列は、ロドサームスの菌株、あるいは別の又は関連した生物からクローン化され、したがって、例えば核酸配列のポリペプチドをコードしている領域の対立遺伝子的又は種変異体であり得る。
【0049】
「単離した核酸配列」という用語は、本明細書中で用いる場合は、その他の核酸配列を本質的に含みない、例えばアガロース電気泳動により決定した場合に、少なくとも約20%純粋な、好ましくは少なくとも約40%純粋な、更に好ましくは少なくとも約60%純粋な、より更に好ましくは少なくとも約80%純粋な、最も好ましくは少なくとも約90%純粋である核酸配列を指す。例えば、単離した核酸配列は、その天然の位置からそれが再生成される異なる部位に核酸配列を配置し直すために遺伝子操作に用いられる標準的なクローン化法により得られる。クローン化法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核酸フラングメントの除去及び単離、そのフラングメントのベクター分子への挿入、そして核酸配列の多数のコピー又はクローンが複製される宿主細胞中への組換えベクターの組み込みを含み得る。核酸配列は、ゲノムDNA、cDNA、RNA、半合成、合成起源、又はそれらの任意の組合せのものであり得る。
【0050】
本発明は、少なくとも約65%、好ましくは約70%、好ましくは約80%、更に好ましくは約90%、より更に好ましくは約95%、そして最も好ましくは97%の、活性ポリペプチドをコードする配列番号1の成熟ポリペプチドのコード配列(すなわち、ヌクレオチド4〜1863)とある程度の相同性を有する核酸配列にも関する。本発明の目的のために、2つの核酸配列間の相同性の程度は、タンパク質及びDNA、その両方のアラインメントに有用な、完全なSmith−Watermanアラインメントを用いて決定する。デフォルトスコアリングBLOSUM50及び同一性マトリックスは、それぞれタンパク質及びDNAのアラインメントに使用される。ギャップの最初の残基についてのペナルティーは、タンパク質で−12、そしてDNAで−16であり、一方、ギャップの追加の残基についてのペナルティーは、タンパク質で−2、そしてDNAで−4である。アラインメントはFASTAパッケージの第v20u6版で行う(W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988),Improved Tools for Biological Sequence Analysis,PNAS 85:2444−2448,及びW.R.Pearson(1990)Rapid and sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA,Methods in Enzymology 183:63−98)。
【0051】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の修飾は、本ポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドの合成に必要である。本ポリペプチドと「実質的に類似の」という用語は、非天然形態のポリペプチドを示す。これらのポリペプチドは、何らかの工学処理方法で、その元の供給源から単離されたポリペプチドと異なり、例えば、比活性、熱安定性、至適pHなどで異なる変異体とは異なり得る。変異体配列は、配列番号1の一部をコードするポリペプチドとして示される核酸配列、例えばその亜配列を基礎にして、及び/又は核酸配列によりコードされるポリペプチドの別のアミノ酸配列を生じないが、しかし酵素の生成を意図された宿主生物のコドン使用に対応するヌクレオチド置換の導入により、あるいは異なるアミノ酸配列を生じ得るヌクレオチド置換の導入により構築され得る。ヌクレオチド置換の一般的記載に関しては、例えば、Ford et al.,1991、「Protein Expression and Purification」2:95−107を参照のこと。
【0052】
このような置換は分子の機能に決定的な領域の外側でなすことができ、そして依然として活性なポリペプチドを生じる、ということは当業者には明らかである。本発明の単離した核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に不可欠な、したがって好ましくは置換を受けないアミノ酸残基は、当業界で既知の手法により、例えば部位指定突然変異誘発又はアラニン走査変異誘発により同定され得る(例えば、Cunningham及びWells、1989、「Science」244:1081−1085参照)。後者の技法では、変異は、分子中のあらゆる正に荷電した残基に導入され、その結果生じる変異体分子が分枝酵素活性に関して試験されて、分子の活性に重大であるアミノ酸残基を同定する。基質−酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴分析、結晶学又は光親和性標識のような技法により決定されるような三次元構造の分析により決定され得る(例えば、de Vos et al.,1992、「Science」255:306−312;Smithet al.,1992、「Journal of Molecular Biology」224:899−904;Wlodaver et al.,1992、「FEBS Letters」309:59−64を参照のこと)。
【0053】
本発明はまた、本明細書で定義したように、非常に低いストリンジェントな条件、好ましくは低いストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度にストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度−高度にストリンジェントな条件、より更に好ましくは高度にストリンジェントな条件、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件のもと、同一の条件下で配列番号1の核酸配列若しくはその相補鎖;又はそれらの対立変異体及び亜配列(Sambrook et al.,1989(前記))とハイブリダイズする核酸プローブとハイブリダイズする、本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸配列に関する。
【0054】
本発明はまた、(a)非常に低い、低い、中程度、中程度−高度、高度、又は非常に高度にストリンジェントな条件下で(i)配列番号1のヌクレオチド、(ii)配列番号1のヌクレオチドに含まれるcDNA配列、(iii)(i)若しくは(ii)の亜配列、又は(iv)(i),(ii)、若しくは(iii)の相補鎖とハイブリダイズし;そして(b)その核酸配列を単離することによって生成する単離した核酸配列に関する。亜配列は、好ましくは少なくとも100ヌクレオチドの配列、例えば分枝酵素活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする配列である。
【0055】
変異体核酸配列の生成方法
本発明は更に、配列番号1のポリペプチドのコード配列又はその亜配列に少なくとも1つの変異を導入することを含んで成る変異体核酸配列の生成方法であって、変異体核酸配列が配列番号2のアミノ酸又は分枝酵素活性を有するそのフラングメントから成るポリペプチドをコードする方法に関する。
【0056】
一方のヌクレオチドを他方のヌクレオチドに交換するための、変異の核酸配列への導入は、当業界で既知の任意の方法を用いた部位指定突然変異誘発によりなし遂げ得る。特に有用なのは、注目の挿入物を有する超コイル二本鎖DNAベクターと所望の変異を含む2つの合成プライマーとを用いる手法である。各々がベクターの反対鎖と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Pfu DNAポリメラーゼによって温度周期進行中に伸張する。プライマーの組み込み時に、スタガーニックを含む変異化プラスミドが生成される。温度周期進行後、メチル化及び半メチル化DNAに特異的なDpnIで生成物を処理して親DNA鋳型を消化し、そして変異含有合成DNAを選択する。当業界で既知のその他の手法も用い得る。
【0057】
核酸構築物
本発明は、調節(controll)配列と両立可能な条件下で適切な宿主細胞でのコード配列の発現を指示する1又は複数の調節配列と作用可能に連結した本発明の核酸配列を含んで成る核酸構築物にも関する。発現は、ポリペプチドの生成に関与するあらゆる工程を含むと理解され、その例としては、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌が挙げられるが、これらに限定されない。
【0058】
「核酸構築物」は、天然遺伝子から単離される、あるいはそうでなければ天然には存在しない方法で、結合され、並置される核酸のセグメントを含むよう修飾された一本鎖又は二本鎖の核酸分子と本明細書中では定義される。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要な調節配列をすべて含む場合の発現カセットという用語と同義である。「コード配列」という用語は、そのタンパク質生成物質のアミノ酸配列を直接特定する核酸配列と本明細書中では定義される。コード配列の境界は、一般に、リボソーム結合部位により(原核生物)、又はmRNAの5’末端のオープンリーディングフレームのすぐ上流に位置するATG開始コドンとmRNAの3’末端のオープンリーディングフレームのすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列とにより(真核生物)決定される。コード配列としては、DNA、cDNA及び組換え核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【0059】
本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸配列を種々の方法で操作して、ポリペプチドの発現を提供し得る。それをベクターに挿入する前の核酸配列の操作は、発現ベクターによっては望ましいか又は必要である。組換えDNA法を用いて核酸配列を修飾する技法は、当業界では公知である。
【0060】
「調節配列」という用語は、本発明のポリペプチドの発現に必要な又は有益なすべての成分を含むと本明細書中では定義される。各々の調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然のものであるか又は外来のものであり得る。このような調節配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列及び転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低限度、調節配列は、プロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルを含む。調節配列は、調節配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的のためのリンカーを備え得る。「作用可能に連結される」という用語は、調節配列が、ポリペプチドの発現を指示するように、DNA配列のコード配列に関連する位置に適切におかれる相対的配置と本明細書中では定義される。
【0061】
前記調節配列は、核酸配列の発現のために宿主により認識される核酸配列である適切なプロモーター配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写調節配列を含む。プロモーターは、選択宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列、例えば変異体、切頭型及びハイブリッドプロモーターであり得るし、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
【0062】
特に細菌宿主細胞における本発明の核酸構築物の転写を指示するのに適したプロモーターの例は、E.コリのlacオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)のアガラーゼ遺伝子(dagA)、バチルス・ズブチリスのレバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルス・リヘニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルス・ステアロサーモフィラスのマルトース原性アミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルス・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチルス・リヘニホルミスのペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バチルス・ズブチリスのxylA及びxylB遺伝子及び原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子(Villa−Kamaroffet al.,1978、「Proceedings of theNational Academy of Sciences USA」75:3727−3731)から得られるプロモーター、並びにtacプロモーター(DeBoer et al.,1983、「Proceedings of the National Academy of Sciences USA」80:21−25)である。さらなるプロモーターは、「Scientific American」、1980、242:74−94中の“Usefulproteins from recombinant bacteria”及びSambrooket al.,1989(前記)に記載されている。
【0063】
糸状真菌宿主細胞における本発明の核酸構築物の転写を指示するのに適したプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエのTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定性αアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ(glaA)、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ、アスペルギルス・オリザエのアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエのトリオースホスフェートイソメラーゼ、アスペルギルス・ニズランスのアセトアミダーゼ及びフザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼ(WO96/00787)に関する遺伝子から得られるプロモーター、ならびにNA2−tpiプロモーター(アスペルギルス・ニガーの中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエのトリオースホスフェートイソメラーゼに関する遺伝子からのプロモーターのハイブリッド)、そしてその変異体、切頭型及びハイブリッドプロモーターである。
【0064】
酵母菌宿主では、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ(ENO−1)、サッカロミセス・セレビシエのガラクトキナーゼ(GAL1)、サッカロミセス・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)、及びサッカロミセス・セレビシエの3−ホスホグリセレートキナーゼに関する遺伝子から得られる。酵母菌宿主細胞に対するその他の有用なプロモーターは、Romanoset al.,1992、「Yeast」8:423−488に記載されている。
【0065】
調節配列は、転写を終結するよう宿主細胞に認識される配列である適切な転写ターミネーター配列でもある。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に作用可能に連結される。選択される宿主細胞中で機能性である任意のターミネーターは、本発明に用い得る。
【0066】
糸状真菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリザエのTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニズランスのアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガーのαグルコシダーゼ及びフザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼに関する遺伝子から得られる。
【0067】
酵母菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエのチトクロームC(CYC1)及びサッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼに関する遺伝子から得られる。酵母菌宿主細胞に有用なその他のターミネーターは、Romanos et al.,1992(前記)に記載されている。
【0068】
調節配列は、宿主細胞による翻訳に関して重要なmRNAの非翻訳領域である適切なリーダー配列でもある。リーダー配列は、ペプチドをコードする核酸配列の5’末端に作用可能に連結される。選択される宿主細胞中で機能性である任意のリーダー配列は、本発明に用い得る。
【0069】
糸状真菌宿主細胞に好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエのTAKAアミラーゼ及びアスペルギルス・ニズランスのトリオースホスフェートイソメラーゼに関する遺伝子から得られる。
【0070】
酵母菌宿主細胞にとって適当なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ(ENO−1)、サッカロミセス・セレビシエの3−ホスフェートグリセレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビシエのα因子及びサッカロミセス・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)に関する遺伝子から得られる。
【0071】
調節配列は、核酸配列の3’末端に作用可能に連結される配列であって、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写mRNAに付加するためのシグナルとして宿主細胞に認識されるポリアデニル化配列でもあり得る。選択された宿主細胞中で機能性である任意のポリアデニル化配列は、本発明に用い得る。
【0072】
糸状真菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザエのTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニズランスのアントラニル酸合成酵素、フザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼ及びアスペルギルス・ニガーのαグルコシダーゼに関する遺伝子から得られる。
【0073】
酵母菌宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は、Guo及びSherman、1995、「Molecular Cellular Biology」15:5983−5990に記載されている。
【0074】
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に結合されるアミノ酸配列をコードし、細胞の分泌経路にコードされたペプチドを向けるシグナルペプチドのコード領域でもある。核酸配列のコード配列の5’末端は、分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと、翻訳リーディングフレームで天然に連結したシグナルペプチドのコード領域を固有に含み得る。あるいは、コード配列の5’末端は、コード配列に対して外来性であるシグナルペプチドのコード領域を含み得る。外来性シグナルペプチドのコード領域は、コード配列がシグナルペプチドのコード領域を天然に含まない場合に必要であり得る。あるいは、外来性シグナルペプチドのコード領域は、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然シグナルペプチドのコード領域を単に置換し得る。しかしながら、発現ポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に向ける任意のシグナルペプチドのコード領域は、本発明に用い得る。
【0075】
細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドのコード領域は、バチルス属のNCIB11837マルトース原性アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスのαアミラーゼ、バチルス・リヘニホルミスのズブチリシン、バチルス・リヘニホルミスのβラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスの中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)及びバチルス・ズブチリスのprsAに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドのコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、Simonen及びPalva、1993、「Microbiological Reviews」57:109−137に記載されている。
【0076】
糸状真菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドのコード領域は、アスペルギルス・オリザエのTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ・インソレンスのセルラーゼ及びフミコラ・ラヌギノサのリパーゼに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドのコード領域である。
【0077】
酵母菌宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエのα因子及びサッカロミセス・セレビシエのインベルターゼに関する遺伝子から得られる。その他の有用なシグナルペプチドのコード領域は、Romanos et al.,1992(前記)に記載されている。
【0078】
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドのコード領域でもある。その結果生じるポリペプチドはプロ酵素又はプロポリペプチド(又はいくつかの場合にはチモーゲン)として知られている。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的開裂により成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドのコード領域は、バチルス・ズブチリスのアルカリ性プロテアーゼ(aprE)、バチルス・ズブチリスの中性プロテアーゼ(nprT)、サッカロミセス・セレビシエのα因子、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ及びミセリオフトラ・サーモフィラのラッカーゼ(WO95/33836)に関する遺伝子から得られる。
【0079】
シグナルペプチド及びプロペプチド領域がともにポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【0080】
宿主細胞の増殖に関してポリペプチドの発現の制御(regulation)を可能にする制御配列を付加するのも望ましい。制御系の例は、制御化合物の存在を含めた、化学的又は物理的刺激に対して切り換えられる遺伝子の発現を引き起こすものである。原核生物系における制御系としては、lac、tac及びtrpオペレーター系が挙げられる。酵母菌では、ADH2系又はGAL1系が用いられる。糸状真菌では、TAKAαアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼプロモーター及びアスペルギルス・オリザエのグルコアミラーゼプロモーターが制御配列として用いられる。制御配列のその他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらの例としては、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属を用いて増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、制御配列と作用可能に連結される。
【0081】
発現ベクター
本発明は更に、本発明の核酸配列、プロモーター、ならびに転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターに関する。前記の種々の核酸及び調節配列は、一緒に連結されて、このような部位でのポリペプチドをコードする核酸の挿入又は置換を可能にするために1又は複数の便利な制限部位を含みうる組換え発現ベクターを生成し得る。あるいは、本発明の核酸配列は、発現のための適切なベクター中に核酸配列又はその配列を含んで成る核酸構築物を挿入することにより発現され得る。発現ベクターを作製する場合、コード配列が発現のための適切な調節配列と作用可能に連結されるように、コード配列はベクター内に位置する。
【0082】
組換え発現ベクターは、都合良く組換えDNA法にかけられ得る、そして核酸配列の発現をもたらし得る任意のベクター(例えばプラスミド又はウイルス)であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性によっている。ベクターは、直鎖状又は閉環状プラスミドであり得る。
【0083】
ベクターは、自律的複製ベクター、即ち染色体外存在物として存在するベクターであり、その複製は染色体複製とは無関係で、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体がその例である。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された場合、そのゲノムに組込みされて、それが組込みされた染色体と一緒に複製され得る。更に、宿主細胞のゲノム中に導入される全DNA、又はトランスポゾンを一緒に含む単一ベクター又はプラスミド、あるいは2又はそれ以上のベクター又はプラスミドが用いられる。
【0084】
本発明のベクターは、好ましくは、形質変換した細胞の選択を容易にする1又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その生成物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養素要求株に対する原栄養性等を提供する生成物の遺伝子である。細菌選択マーカーの例は、バチルス・ズブチリス又はバチルス・リヘニホルミスからのdal遺伝子、あるいは抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母菌宿主細胞に適したマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPI及びURA3である。糸状真菌宿主細胞に用いるための選択マーカーとしては、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hygB(ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)、trpC(アントラニル酸合成酵素)、ならびにその等価物が挙げられるが、これらに限定されない。アスペルギルス細胞に用いるのに好ましいのは、アスペルギルス・ニズランス又はアスペルギルス・オリザエのamdS及びpyrG遺伝子、ならびにストレプトミセス・ヒグロスコピクスのbar遺伝子である。
【0085】
本発明のベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノムへのベクターの安定な組込み、又はゲノムと無関係の細胞中でのベクターの自律性複製を可能にする要素を含む。
【0086】
宿主細胞ゲノムへの組込みのために、ベクターは、相同的又は非相同的組換えにより、ペプチドをコードする核酸配列、又はベクターのゲノムへの安定な組込みのためのベクターのその他の任意の要素に依存し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞のゲノムへの、相同的組換えによる組込みを指示するための付加的核酸配列を含み得る。付加的核酸配列は、染色体中の正確な位置でベクターを宿主細胞ゲノムの中へ組込ませ得る。正確な位置での組込みの見込みを増大するために、組込み性要素は、好ましくは、十分な数の核酸、例えば100〜1,500塩基対、好ましくは400〜1,500塩基対、そして最も好ましくは800〜1,500塩基対を含むべきであり、これは対応する標的配列と高度に相同性で、相同的組換えの可能性を増強する。組込み要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同の任意の配列であり得る。更に、組込み要素は、非コード又はコード核酸配列であり得る。他方、ベクターは、非相同的組換えにより、宿主細胞のゲノムに組込まれ得る。
【0087】
自律的複製のために、ベクターは、問題の宿主細胞中でベクターを自律的に複製させ得る複製起点を更に包含し得る。細菌の複製起点の例は、E.コリ中での複製を可能にするプラスミドpBR322、pUC19、pACYC177及びpACYC184、バチルス菌中での複製を可能にするpUB110、pE194、pTA1060及びpAMβ1の複製起点である。酵母菌宿主細胞で用いるための複製起点の例は、2μの複製起点、ARS1、ARS4、ARS1とCEN3の組合せ、ならびにARS4とCEN6の組合せである。複製起点は、宿主細胞中でその機能を温度感受性にする突然変異を有するものである(例えば、Ehrlich)1978、「Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA」75:1433を参照のこと)。
【0088】
本発明の核酸配列の1つより多いコピーを宿主細胞に挿入して、遺伝子生成物の生成が増大され得る。核酸配列のコピー数の増大は、配列の少なくとも1つの付加的コピーを宿主細胞ゲノムに組込むことにより、又は核酸配列を有する増幅性選択マーカー遺伝子を含入することにより得られるが、この場合、選択マーカー遺伝子の増幅コピーを含む細胞と、それによる核酸配列の付加的コピーが、適切な選択可能な作用物質の存在下で細胞を培養することにより選択され得る。
【0089】
本発明の組換え発現ベクターを構築するために前記の要素をライゲーションするために用いられる手法は、当業者には周知である(例えば、Sambrook et al.,1989(前記)を参照のこと)。
【0090】
宿主細胞
本発明は更に、本発明の核酸配列を含んで成り、ポリペプチドの組換え体生成に有益に用いられる組換え宿主細胞に関する。本発明の核酸配列を含んで成るベクターは、ベクターが、前記のように染色体組込み物として、又は自己複製染色体外ベクターとして保持されるように、宿主細胞中に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製中に生じた変異のために親細胞と同一でない親細胞の任意の子孫を含む。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその供給源に大いに依存している。
【0091】
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は非単細胞性微生物、例えば真核生物であり得る。
【0092】
有用な単細胞性細胞は、細菌細胞、例えばグラム陽性細菌で、その例としては、バチルス属細胞、例えばバチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウシ、バチルス・コアギュランス、バチルス・ラウツス、バチルス・レンツス、バチルス・リヘニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・ズブチリス又はバチルス・スリンギエンシス;あるいはストレプトミセス菌細胞、例えばストレプトミセス・リビダンス又はストレプトミセス・ムリヌス;あるいはグラム陰性細菌、例えばE.コリ及びシュードモナス種が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、細菌宿主細胞は、バチルス・レンツス、バチルス・リヘニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィルス、又はバチルス・ズブチリス細胞である。別の好ましい態様において、バチルス菌細胞は、親アルカリ性バチルス菌である。
【0093】
細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、コンピテント細胞(例えば、Young and Spizizin、1961、「Journal of Bacteriology」81:823−829又はDubnau and Davidoff−Abelson、1971、「Journal of Molecular Biology」56:209−221を参照のこと)を用いたプロトプラスト形質変換(例えば、Chang and Cohen、1979、「Molecular General Genetics」168:111−115を参照のこと)、エレクトロポレーション(例えば、Shigekawa and Dower、1988、「Biotechniques」6:742−751を参照のこと)又は接合(例えば、Koehler and Thorne、1987、「Journal of Bacteriology」169:5771−5278を参照のこと)により実行され得る。
【0094】
宿主細胞は、真核生物、例えば哺乳類、昆虫、植物又は真菌細胞であり得る。
【0095】
好ましい態様において、宿主細胞は真菌細胞である。「真菌」とは、本明細書中で用いる場合には、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門及び接合菌門(Hawksworth et al.,「Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi」8版1995,CAB International,University Press,Cambridge,UKによる定義)、ならびに卵菌門(Hawksworth et al.,1995(前記)p171に引用)、そしてすべての糸状胞子真菌(Hawksworth et al.,1995(前記))を含む。
【0096】
更に好ましい態様において、真菌宿主細胞は酵母菌細胞である。「酵母菌」とは、本明細書中で用いる場合には、子嚢胞子形成酵母菌(エンドミケス目)、担子菌形成酵母菌、及び不完全真菌(Blastomycetes)に属する酵母菌が含まれる。酵母菌の分類は将来、変わり得るため、本発明の目的のためには、酵母菌は、Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.及びDavenport,R.R.編「Soc.App.Bacteriol.Symposium Series」No.9,1980)に記載されたように定義する。
【0097】
より更に好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はカンジダ属、ハンセヌラ属、クルイベロミセス属、ピキア属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属又はヤローウィア属の細胞である。
【0098】
最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はサッカロミセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ジアスタチクス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロミセス・ドウグラシ(Saccharomyces douglasii)、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)又はサッカロミセス・オビホルミス細胞である。別の最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)細胞である。別の最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はヤローウイア・リポリチカ細胞である。
【0099】
別の更に好ましい態様において、真菌宿主細胞は糸状真菌細胞である。「糸状真菌」は、真菌門及び卵菌門のすべての糸状形態を含む(Hawksworth et al.,1995(前記)により定義)。糸状真菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複合多糖で構成される菌糸体壁を特徴とする。植物性成長は菌糸伸張により、そして炭素異化作用は無条件に好気性である。これに対比して、酵母菌、例えばサッカロミセス・セレビシエによる植物性成長は、単細胞性葉状体の出芽によるもので、炭素異化は発酵であり得る。
【0100】
より更に好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、例えばアクレモニウム属(Acremonium)、アスペルギルス属、フザリウム属、フミコラ属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、チエラビア属(Thielavia)、トリポクラジウム属又はトリコデルマ属の細胞であるが、これらに限定されない。
【0101】
最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フェチズス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニズランス、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザエ細胞である。別の最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリジオイデス、フザリウム・セレアリス、フザリウム・クルックウェレンセ、フザリウム・クルモルム、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・グラミヌム、フザリウム・ヘテロスポルム、フザリウム・ネグンジ、フザリウム・オキシスポルム、フザリウム・レティキラツム、フザリウム・ロゼウム、フザリウム・ザムブチヌム、フザリウム・ザルコロウム、フザリウム・スポロトリキオイデス、フザリウム・スルフレウム、フザリウム・トルロスム、フザリウム・トリコセキオイデス又はフザリウム・ベネナツム細胞である。より最も好ましい態様において、糸状菌親細胞はフザリウム・ベネナツム(Nierenbergの新種)の細胞である。別の最も好ましい態様において、糸状真菌親細胞は、フミコラ・インソレンス、フミコラ・ラヌギノサ、ムコール・ミエヘイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・パープロゲヌム、シーラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、トリコデルマ・ハージアヌム、トリコデルマ・コニンギー、トリコデルマ・ロンギブラキアツム、トリコデルマ・リーセイ又はトリコデルマ・ビリデ細胞である。
【0102】
真菌細胞は、それ自体既知の方法での、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質変換、及び細胞壁の再生を含んで成る方法により形質変換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質変換に適した手法は、欧州特許第238023号、及びYelton et al.,1984、 「Proceedings of the National Academy of ScienceUSA」 81:1470−1474に記載されている。フザリウム種の形質変換に適した方法は、Malardier et al.,1989、「Gene」78:147−156及びWO96/00787に記載されている。酵母菌は、Becker and Guarente,In Abelson,J.N.and Simon,M.I.編「Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology」Volume 194,pp 182−187,Academic Press,Inc.,New York; Itoet al.,1983、「Journal of Bacteriology」153:163;及びHinnen et al.,1978、「Proceedings of the National Academy of Sciences USA」75:1920に記載された方法を用いて形質変換し得る。
【0103】
生成の方法
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、(a)菌株を、前記ポリペプチドを生成することができるその野生型で培養し;そして(b)そのポリペプチドを回収することを含んで成る方法に関する。好ましくは、前記菌株はロドサームス属のものであり、そして更に好ましくはロドサームス・オバメンシスである。
【0104】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、(a)前記ポリペプチドの生成を助成する条件下で宿主細胞を培養し、(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法に関する。
【0105】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、(a)宿主細胞をポリペプチドの生成を助成する条件下で培養し、ここで、宿主細胞は配列番号1のポリペプチドのコード領域において少なくとも1つの変異を有する変異体核酸配列を含んで成り、ここで、変異体核酸配列は配列番号2のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする、及び(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法に関する。
【0106】
本発明の生成方法において、細胞は、当業界で既知の方法を用いて、そのポリペプチドの生成に適切な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドを発現及び/又は単離させるのに適切な培地及び条件下で実施される、振とうフラスコ培養、実験室又は工業的発酵器における小規模又は大規模発酵(連続、バッチ、フュド バッチ又は固体状態発酵を含む)により培養し得る。培養は当業界で既知の手順を用いて、炭素源及び窒素源、並びに無機塩を含む適切な栄養培地で行なわれる。適切な培地は、商業的な供給者から入手するか、公表された組成(例えば、American Type Culture Collectionカタログ中に)にしたがって調製し得る。ポリペプチドが栄養培地中に分泌されるなら、ペプチドを培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されないなら、細胞溶解物から回収することができる。
【0107】
ポリペプチドは、そのポリペプチドに特異的である、当業界で既知の方法を用いて検出し得る。これらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成又は酵素基質の消失を含み得る。例えば、本明細書に記載したポリペプチドの活性を測定するのに酵素アッセイを用い得る。
【0108】
生じたポリペプチドは当業界で既知の方法で回収し得る。例えば、ポリペプチドは、栄養培地から、遠心、ろ過、抽出、スプレー乾燥、蒸発又は沈澱を含むが、これらに限定されない慣用の手順により回収し得る。
【0109】
本発明のポリペプチドは、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、等電点電気泳動及びサイズ排除)、電気泳動手順(例えば、予備等電点電気泳動)、差溶解度(例えば、硫酸アンモニウム沈澱)、SDS−PAGE又は抽出(例えば、「Protein Purification」J.−C.Jansen and Lars Ryden編、VCH Publishers,New York、1989を参照のこと)を含むが、これらに限定されない、当業界で既知の種々の手順により精製し得る。
【0110】
植物
本発明はまた、回収可能な量でポリペプチドを発現し、かつ、生成するように、本発明の分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列で形質変換された、遺伝子組換え植物、植物の部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチドは植物又は植物の部分から回収し得る。代りに、組み換えポリペプチドを含む植物又は植物部分はそれ自体食品又は飼料の品質を改良するため、例えば、栄養価値、味のよさ及びレオロジー特性を改良するため又は栄養とならない因子を破壊するために用い得る。
【0111】
遺伝子組換え植物は双子葉植物又は単子葉植物であり得る。単子葉植物はイネ科植物、例えば、牧草(イチゴツナギ、イネ科イチゴツナギ属)、飼料イネ科植物、例えば、フェスチュカ(festuca)、ロリウム(lolium)、温和なイネ科植物、例えば、アグロスチス(Agrostis)並びに穀物、例えば、ムギ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、コメ、モロコシ及びメイズ(トウモロコシ)である。
【0112】
双子葉植物の例は、タバコ、まめ科植物、例えば、ルピナス、ジャガイモ、砂糖大根、えんどう、マメ、ダイズ及びアブラナ科の植物(アブラナ科)、例えば、カリフラワー、ナタネ及び密接に関連するモデル生物アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)である。
【0113】
植物の部分の例は茎、カルス、葉、根、果実、種子及び塊茎である。また、特種な植物組織、例えば、葉緑体、アポプラスト(apoplast)、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム及び細胞質は植物の部分と考えられる。更に組織の起原が何であれ、あらゆる植物細胞は植物の部分と考えられる。
【0114】
また、上記植物の子孫、植物部分及び植物細胞は本発明の範囲内に包含される。
【0115】
本発明のポリペプチドを発現する遺伝子組換え植物又は植物細胞は当業界で既知の方法にしたがって構築される。簡単に言うと、本発明のポリペプチドをコードする1又は複数の発現構築物を植物宿主ゲノムに組み込み、得られた変性植物又は植物細胞を遺伝子組換え植物又は植物細胞に伝播することにより、植物又は植物細胞を構築する。
【0116】
便利には、発現構築物は、選択された植物又は植物の部分中で核酸配列の発現に必要な適当な制御配列に作用可能に連結した、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物である。更に、発現構築物は、発現構築物が組み込まれた宿主細胞及び問題の植物への構築物の導入に必要なDNA配列(後者は用いられるDNA導入方法に依存する)を同定するのに有用な選択マーカーを含むことができる。
【0117】
制御配列、例えば、プロモーター配列及びターミネーター配列並びに任意にシグナル配列又はトランジット配列の選択は、例えば、ポリペプチドをいつ、どこで、どのように発現させることを望むかに基づいて決定される。例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は構成的もしくは誘導的でもよく、又は発達上、段階もしくは組織特異的でよく、そして、遺伝子産物は特定の組織又は植物の部分、例えば、種子又は葉を標的とすることができる。制御配列は、例えば、Tague et al.,1988,「Plant Physiology」86: 506に記載されている。
【0118】
構成的発現のために、35S−CaMVプロモーターを用い得る(Franck etal.,「Cell」21:285−294、1980年)。器官特異的プロモーターは、例えば、貯蔵シンク組織、例えば、種子、ジャガイモ塊茎及び果実(Edwards及びCoruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275−303)又は代謝シンク組織、例えば、分裂組織(Itoet al.,1994,Plant Mol.Biol.24: 863−878)からのプロモーター、種子特異的プロモーター、例えば、コメからのグルテリン、プロラミン、グロブリン又はアルブミンプロモーター(Wu et al.,1998,Plant and Cell Physiology 39:885−889)、レグミンB4からのVicia fabaプロモーター及びVrcia fabaからの未知の種子タンパク質遺伝子(Conradet al.,「Journal ofPlant Physiology」152:708−711、1998年)、種子油体タンパク質からのプロモーター(Chen et al.,「Plant and Cell Physiology」39:935−941、1998年)、ブラッシカ・ナプス(Brassica napus)からの貯蔵タンパク質napAプロモーター又は当業界で既知のあらゆる他の種子特異的プロモーター、例えば、WO91/14772号記載のものであり得る。更に、プロモーターは葉特異的プロモーター、例えば、コメ又はトマトからのrbcsプロモーター(Kyozuka et al.,「Plant Physiology」102:991−1000、1993年)、クロレラウィルス アデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター(Mitra and Higgins,1994,「Plant Molecular Biology」26:85−93)又はコメからのaldP遺伝子プロモーター(Kagaya et al.,1995,「Molecular and General Genetics」248:668−674)又は傷誘導性プロモーター、例えば、ジャガイモpin2プロモーター(Xu et al.,1993,「Plant Molecular Biology」22:573−588)であり得る。
【0119】
プロモーターエンハンサー因子も植物中の酵素の高い発現を達成するのに用い得る。例えば、プロモーターエンハンサー因子は、プロモーターと本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に位置するイントロンであってもよい。例えば、Xu et al.,1993(上記)は、コメアクチン1遺伝子の第1イントロンを、発現を増強するのに用いることを開示している。
【0120】
選択マーカー遺伝子及び発現構築物のあらゆる他の部分は当業界で利用し得るものから選択し得る。
【0121】
核酸構築物は、アグロバクテリウムを介する形質変換、ウィルスを介する形質変換、マイクロインジェクション、粒子衝撃(bombardment)、微粒子銃形質変換及びエレクトロポレーションを含んで成る、当業界で既知の慣用の技術にしたがって、植物ゲノムに組み込まれる(Gasser et al.,1990,「Science」244: 1293、Potrykus,1990, 「Bio/Technology」8: 535、Shimamoto et al.,1989,Nature」338:274)。
【0122】
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介する遺伝子導入は遺伝子組換え双子葉植物を発生させるための一般に好まれる方法である(概説のために、Hooykas and Schilperoort,1992,「Plant Molecular Biology」19:15−38を参照のこと)。それは単子葉植物を形質変換するのにも使用され得るが、これらの植物を形質変換するために、他の形質転換法が一般に好ましい。現在、遺伝子組換え単子葉植物を生じさせるために一般的に好まれる方法は胚芽のカルス又は発育中の胚芽の粒子衝撃(形質変換するDNAで被覆された超小型の金又はタングステン粒子)である(Christou,1992,「Plant Journal」2: 275−281、Shimamoto,1994,「Current Opinion Biotechnology」5: 158−162、Vasil et al.,1992,「Bio/Technology」10:667−674)。単子葉植物のための他の方法は、Omirulleh et al.,1993,「Plant Molecular Biology」21:415−428に記載された、プロトプラスト形質変換に基づく。
【0123】
形質変換後、発現構築物を組み込んだ形質変換体は、当業界で公知の方法にしたがって、選択され、そして植物全体へと再生される。
【0124】
本発明はまた、(a)ポリペプチドの生成を助成する条件下で、本発明の分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る遺伝子組換え植物又は植物細胞を培養し;そして(b)そのポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成する方法にも関する。
【0125】
組成物
なお、さらなる観点においては、本発明は本発明のポリペプチドを含んで成る組成物に関する。好ましくは、前記組成物は本発明のポリペプチドが濃縮されている。本文脈においては、用語「濃縮された」は組成物の分枝酵素活性が、例えば、1.1の濃縮率で増加したことを示す。
【0126】
前記組成物は主要酵素成分、例えば、単成分組成物として本発明のポリペプチドを含んでよい。あるいは、前記組成物は、複数の酵素活性、例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼを含んで成ることもある。
【0127】
前記ポリペプチド組成物は、当業界で既知の方法にしたがって製造することができ、液体又は乾燥組成物の形でよい。例えば、ポリペプチド組成物は顆粒状物又は微顆粒状物の形でよい。組成物に包含されるポリペプチドは当業界で既知の方法にしたがって安定化し得る。
【0128】
本発明のポリペプチド組成物の好ましい使用の例を下記に示す。本発明のポリペプチド組成物の投与量及び組成物を用いる他の条件は当業界で既知の方法に基づいて決定し得る。
【0129】
洗剤組成物
本発明の分枝酵素は洗剤組成物に加えられてもよく、そしてその結果、その成分となり得る。
【0130】
本発明の洗剤組成物は、汚れた織物の前処理に適した洗濯用添加剤組成物及びリンスを加えた織物柔軟剤組成物を含む、手洗い又は洗濯機洗剤組成物として調製され、あるいは通常の塗装面の洗浄作業における使用のための洗剤組成物として調製され、あるいは手洗い又は機械の食器洗い作業のために調製され得る。
【0131】
具体的な観点において、本発明は、本発明の分枝酵素を含んで成る洗剤添加物を提供する。前記洗剤添加物及び洗剤組成物は、1又は複数の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、及び/又はペルオキシダーゼを含んで成ることもある。
【0132】
通常、選択した酵素の特性は選択した洗剤との適合性があるべきであり(すなわち、他の酵素的かつ非酵素的成分との適合性がある至適pHなど)、そして前記酵素は有効量で存在すべきである。
【0133】
プロテアーゼ:
適当なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを含む。微生物起源が好ましい。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理した変異体が含まれる。前記プロテアーゼはセリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性の微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであってもよい。アルカリ性プロテアーゼの例にはズブチリシンであり、これは特にバチルス属に由来するものであり、例えばズブチリシンNovo、ズブチリシンCarlsberg、ズブチリシン309、ズブチリシン147及びズブチリシン168(WO89/06279に記載)である。トリプシン様プロテアーゼの例は、WO89/06270及びWO94/25583に記載のトリプシン(例えばブタ及びウシ起源のもの)及びフザリウム属のプロテアーゼである。
【0134】
有用なプロテアーゼの例は、WO92/19729,WO98/20115,WO98/20116、及びWO98/34946に記載の変異体であり、特に1又は複数の以下の位置:27,36,57,76,87,97,101,104,120,123,167,170,194,206,218,222,224,235及び274において置換を有する変異体である。
【0135】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、Alcalase(商標)、Savinase(商標)、Primase(商標)、Duralase(商標)、Esperase(商標)、及びKannase(商標)(Novo Nordisk A/S)、Maxatase(商標)、Maxacal(商標)、Maxapem(商標)、Properase(商標)、Purafect(商標)、Purafect OxP(商標)、FN2(商標)、及びFN3(商標)(Genecor International Inc.)を含む。
【0136】
リパーゼ:
適当なリパーゼは細菌又は菌起源のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理された変異体が含まれる。有用なリパーゼの例は、フミコラ(異名サーモミセス(Thermomyces))属由来、例えばEP 258 068及びEP 305 216に記載のH.ラヌギノサ(T.ラヌギノサス(lanuginosus))由来又はWO96/13580に記載のH.インソレンス由来のリパーゼ、シュードモナス属のリパーゼ、例えばP.アルカリジェネス(alcaligenes)若しくはP.シュードアルカリジェネス(pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、P.セパシア(cepacia)(EP 331 376)、P.スタットゼリ(stutzeri)(GB 1,372,034)、P.フルオレセンス(fluorescens)、シュードモナスSP.菌株SD7O5(WO95/06720及びWO96/27002)、P.ウィスコンシネンシス(wisconsinensis)(WO96/12012)由来のもの;バチルスのリパーゼ、例えばB.ズブチリス(subtilis)(Dartois et al.,Biochemica et Biophysica Acta,1131:253−360,1993)、B.ステアロサーモフィルス(JP64/744992)若しくはB.プミルス(pumilus)(WO91/16422)由来のものを含む。
【0137】
他の例は、リパーゼ変異体、例えばWO92/05249,WO94/01541,EP 407 225,EP 260 105,WO95/35381,WO96/00292,WO95/30744,WO94/25578,WO95/14783,WO95/22615,WO97/04079及びWO97/07202に記載のものを含む。
【0138】
好ましい市販のリパーゼ酵素はLipolase(商標)及びLipolase Ultra(商標)及びLipomax(商標)(Novo Nordisk A/S)を含む。
【0139】
アミラーゼ:
適当なアミラーゼ(α及び/又はβ)は、細菌又は菌起源のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理された変異体が含まれる。アミラーゼは、例えばバチルス属から得たα−アミラーゼ、例えばB.リケミホルミスの特別な菌株のアミラーゼを含み、これはGB 1,296,839で更に詳細に説明されている。
【0140】
有用なアミラーゼの例は、WO94/02597,WO94/18314,WO96/23873、及びWO97/43424に記載の変異体であり、特に1又は複数の以下の位置:15,23,105,106,124,128,133,154,156,181,188,190,197,202,208,209,243,264,304,305,391,408、及び444において置換を有する変異体である。
【0141】
市販のアミラーゼには、Duramyl(商標)、Termamyl(商標)、Fungamyl(商標)及びBAN(商標)(Novo Nordisk A/S)、Rapidase(商標)及びPurastar(商標)(Genecor International Inc.)がある。
【0142】
セルラーゼ:
適当なセルラーゼは、細菌又は菌起源のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理された変異体が含まれる。適当なセルラーゼは、バチルス、シュードモナス、フミコラ、フザリウム、チエラビア、アクレモニウム属由来のセルラーゼ、例えばUS 4,435,307,US 5,648,263,US 5,691,178,US 5,776,757及びWO89/09259に開示されている、フミコラ・インソレンス、マイセリオフトラ・サーモフィラ及びフサリウム・オキシスポルムから生成される菌のセルラーゼを含む。
【0143】
特に適当なセルラーゼは、色の保護の利点を有するアルカリ性又は中性セルラーゼである。その様なセルラーゼの例は、EP 0 495 257,EP 0 531 372,WO96/11262,WO96/29397,WO98/08940に記載のセルラーゼである。他の例はセルラーゼ変異体、例えばWO94/07998,EP 0 531 315,US 5,457,046,US 5,686,593,US 5,763,254,WO95/24471,WO98/12307及びPCT/DK98/00299に記載されているものである。
【0144】
市販のセルラーゼは、Celluzyme(商標)、及びCarezyme(商標)(Novo Nordisk A/S)、Clazinase(商標)、及びPuradax HA(商標)(Genecor InternationalInc.)、並びにKAC−500(B)(商標)(Kao Corporation)を含む。
【0145】
ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ:
適当なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌又は菌起源のものを含む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理された変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例は、コプリヌス(Coprinus)属由来、例えばC.シネレウス(Cinereus)由来のペルオキシダーゼ、並びにWO93/24618,WO95/10602、及びWO98/15257に記載のそれらの変異体を含む。
【0146】
市販のペルオキシダーゼは、Guardzyme(商標)(Novo Nordisk A/S)を含む。
【0147】
洗剤酵素は、1又は複数の酵素を含む別々の添加物を加えることによって、あるいはこれらの酵素の全てを含んで成る複合型の添加物を加えることによって洗剤組成物に含めることもできる。本発明の洗剤添加物、すなわち別々の添加物又は複合型の添加物は、例えば顆粒、液体、スラリー等として調製され得る。好ましい洗剤添加物の形態は顆粒、特に無粉塵顆粒、液体、特に安定化液体、又はスラリーである。
【0148】
無粉塵顆粒は、例えばUS 4,106,991及び4,661,452に開示されている様に製造することができ、そして任意に当業者に既知の方法によってコーティングされることもある。ロウ性コーティング材料の例は、1000〜20000の平均分子量を有するポリエチレンオキシド生成物(ポリエチレングリコール、PEG);16〜50のエチレンオキシド単位を有する、エトキシル化したノニルフェノール;アルコールが12〜20の炭素原子を含み、そして15〜80のエチレンオキシド単位が存在する、エトキシル化した脂肪アルコール;脂肪アルコール:脂肪酸;並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。流動床技術による適当な模形成コーティング材料の例は、英国特許第1483591号において与えられている。液体酵素調製物は、例えば確立された方法に従い、多価アルコール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を加えることによって安定することができる。他の酵素安定化剤は当業界で公知である。保護された酵素を、欧州特許第238,216号に開示された方法に従い調製することができる。
【0149】
本発明の洗剤組成物は都合の良い形態、例えば粉末、顆粒、ペースト又は液体として存在することができる。液体洗剤は最大70%の水及び0〜30%の有機溶媒を典型的に含む、水性であるか、又は非水性のものであってもよい。
【0150】
前記洗剤組成物は、半極性及び/又は陰イオン性及び/又は陽イオン性及び/又は両性であってもよい、1又は複数の界面活性剤を含んで成る。
【0151】
前記組成物に含まれる場合、前記洗剤は通常、約1%〜約40%の直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩(脂肪酸アルコール硫酸塩)、アルコールエトキシ硫酸塩、第2級アルカンスルホン酸塩、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル又はアルケニルコハク酸、又はセッケンを含むであろう。
【0152】
前記組成物に含まれる場合、前記洗剤は通常、約0.2%〜約40%の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシラート、ノニルフェノールエトキシラート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化した脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド又はグルコサミンのN−アシルN−アルキル誘導体(glucamide)を含むだろう。
【0153】
前記洗剤は、0〜65%の洗浄性ビルダー又は錯化剤、例えばゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩(例えばHoechst社のSKS−6)を含むことがある。
【0154】
前記洗剤は1又は複数のポリマーを含んで成ることがある。例は、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピリジン−N−オキシド、ポリビニルイミダゾール、ポリカルボキシラート、例えばポリアクリラート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー、及びラウリルメタクリル酸/アクリル酸コポリマーである。
【0155】
前記洗剤は漂白系を含むことがあり、これはH2O2源、例えば過ホウ酸又は過炭酸を含んで成ることもでき、これは過酸を形成する漂白活性剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩と組み合わされることもある。あるいは、前記漂白系は、例えばアミド、イミド、又はスルホン型の過酸化物を含んで成ることもある。
【0156】
本発明の洗剤組成物の酵素は、常用の安定化剤を用いて安定化することができ、例えばプロピレングリコール若しくはグリセロールなどの多価アルコール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は例えば芳香族ホウ酸エステルなどのホウ酸誘導体、例えば4−ホルミルフェニルボロン酸であり、そして前記組成物を例えばWO92/19709及びWO92/19708に記載されている様に調製することができる。
【0157】
前記洗剤はまた、他の常用の洗剤成分、例えば粘土を含む繊維調節剤、泡増幅剤、石けん水抑制剤、防食剤、汚れの懸濁剤、抗−汚れ再沈着剤、染料、殺菌剤、光増白剤、屈水性誘発物質、変色阻害剤、又は香料などを含むことができる。
【0158】
現時点で、洗剤組成物において、いずれかの酵素、特に本発明の分枝酵素は、洗浄液1L当たり0.01〜100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液1L当たり0.05〜5mgの酵素タンパク質、特に洗浄液1L当たり0.1〜1mgの酵素タンパク質に相当する量で加えられ得ると考えられている。
【0159】
本発明の分枝酵素は、引用によって本明細書に組み入れられる、WO97/07202に開示されている洗剤調製物に追加として組み入れられ得る。
【0160】
使用
本発明はまた、分枝酵素活性を有するポリペプチドを用いる方法を述べる。例えば、本発明のポリペプチドは、デンプン又はデンプン含有材料の修飾のために使用され、その結果その様な材料の特性が向上し得る。
【0161】
分枝酵素で修飾され得る材料の例は全ての型(ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ)の天然デンプン(未修飾型)、ロウ性デンプン、高アミロースデンプン、アミロース、アミロペクチン、デキストリンを含む化学的に修飾されたデンプン変換型デンプン、架橋型デンプン(ジスターチホスフェート)、デンプンエーテル及びデンプンエステル(酢酸デンプン、ヒドロキシアルキル化デンプン、オクテニルコハク酸デンプン)を含む。
【0162】
本発明の分枝酵素は、上述した様なデンプン様材料の修飾にとって有用であり、その結果、修飾された材料は、その意図される目的のために、例えばUS 4 454 161に記載の様な食品生成物、例えば食品及び飲料組成物、食品添加物組成物、医薬製剤、サイジング剤、接着剤等の製造において一層適したものとなる。通常、分枝酵素で修飾した材料は、未修飾のデンプンと比較して高い溶解性、低い粘度及び老化しにくい傾向を有する。これらの特性は、デンプン様材料から調製した食品生成物の特性、特にその様な生成物の保存安定性を改良するために使用され得る。食品生成物の例は、パン、デザート、ケーキ、スナック菓子、ヌードル及びパスタ、ベビーフード、スポーツ飲料、冷凍又は冷蔵加工食品及びペットフードである。酵素的修飾は、食品生成物への添加前にデンプン様材料上で別々に、又は料理の前若しくは直後に酵素を食品材料に加え、食品を直接修飾することによって、そのいずれかで行われ得る。
【0163】
紙の表面のサイジング及びコーティングのために使用するデンプン溶液の高い溶解性、低い粘性及び良好な安定性は、EP 0 690 170に示した様なこれらの利用に、分枝酵素修飾型デンプンを関連づけるのに非常に重要である。
【0164】
本発明は以下の例によって更に説明されるが、これは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0165】
例1
材料と方法
ロドサームス・オバメンシス(JCM 9785)は、理化学研究所微生物系統保存施設(日本国埼玉県和光市(351−0198))から入手した。
【0166】
分子クローニング技術は、J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor,New Yorkに記載されている。
【0167】
以下の市販のプラスミド/ベクターを使用した:
pT7Blue(Invitrogen、オランダ)
pBluescript SK(−)(Stratagene、アメリカ)
pBAD/Myc−HisA(Invitrogen、オランダ)
【0168】
以下の菌株は、形質転換及びタンパク質の発現に使用した:
TOP10 E.コリ(Invitrogen、オランダ)
E.コリ DH12S(GIBCO BRL,Life Technologies、アメリカ)
【0169】
SB増殖培地(DIFCO ♯ 0123−17−3)は、トリプトン/ペプトン、32g/L;酵母抽出物、20g/L;NaCl、5g/L;5N NaOH、1ml/Lから構成されている。
【0170】
緩衝液及び基質として使用した化学薬品は、少なくとも試薬等級の市販の製品であった。
【0171】
分枝酵素活性
分枝酵素活性は、Takata et al.,Applied and Environmental Microbiology(1994),p.3097(assay A)に記載されている方法の改良版に従い決定した:50μlの酵素溶液を50μlの基質溶液で混合し、そして試験温度で30分間インキュベートする。基質溶液は、0.1M Tris緩衝液に溶解した0.1%のIII型アミロースである。反応は、2mlのヨウ素試薬の添加によって決定する。ヨウ素試薬は、0.5mlの1N HClと混合した0.5mlの保存液(0.26gのI2及び2.6gのKI/10mlの水)から毎日作り、そして130mlに希釈する。混合物は、色を安定化するために室温で15分間インキュベートする。活性は、試験する試料と、細胞抽出物を水で置換したコントロールとの間のA660の差異として測定する。1ユニットの分枝酵素活性は、60℃、pH7.0で1分当たり1%ずつアミロースーヨウ素複合体のA660を低下させ得る酵素量として定義される。
【0172】
R.オバメンシスglgBプローブの調製
プライマーa)(配列番号3)及びb)(配列番号4)を設計し(報告されている細菌のglgB配列のアラインメントに基づく)、調製し、ロドサームス・オバメンシス由来のゲノムDNAとのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において使用した。
【0173】
配列番号3、PCRプライマーa)(上流):
5′−GAGCACCCCYTCGACGGCAGTTGG−3′
【0174】
配列番号4、PCRプレイマーb)(下流):
5′−CATCCAICCWAKRTTCCA−3′
【0175】
I=イノシン
K=G又はT
R=A又はG
W=A又はT
Y=C又はT
【0176】
反応成分を混合し〔1×緩衝液(Roche Diagnostics,Japan)中、ゲノムDNA、0.1ng/μl;dNTP各0.125mM;Mg2+、2.5mM;プライマー、各2pM;Taqポリメラーゼ0.025U/μl〕、そして以下の条件下でのPCRに適用した:
【表1】
【0177】
PCR反応混合物をアガロースゲル上で分離し、そして増幅したPCRフラグメントの予想されるサイズをE.コリglgBの配列データから計算し、約550bpとした。これらのフラグメントをQIAquick(QIAGEN,Japan)でゲル精製し、そして次に、Takaraライゲーションキットバージョン2(Takara,Japan)を用いてpT7Blueベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物をフェノール/クロロホルムで精製し、そして次にエレクトロポレーションによってE.コリDH12Sを形質転換した。得られた形質転換体由来のプラスミド(pMSra8)を制限酵素で調べ、ロドサームス・オバメンシスglgBのインサートのサイズを確認した。
【0178】
R.オバメンシスglgB遺伝子のクローニング
R.オバメンシスglgBプローブとして、pMSra8の挿入フラグメントを用いて、サザンハイブリダイゼーションをR.オバメンシス由来のゲノムDNA上で行い、サブクローンを生成するのに便利な制限酵素を選択した。3.5kbのハイブリダイズしたBamHIフラグメントをglgBのサブクローンのために選択した。その結果、R.オバメンシスのゲノムDNAをBamHIで消化し、そしてサイズごとに分画したDNAをアガロースゲルから切り出し、そしてpBluescript SK(−)にクローン化した。BamHIのサブライブラリーは、ライゲーションしたクローンがE.コリDH12S細胞を形質転換することによって行われた。コロニーの拾い上げは、Hybond−N+膜(Amersham Pharmacia Biotech,Japan)を用いて、BamHIのサブライブラリーの形質転換体上で行い、そして次にDIG標識したR.オバメンシスglgBプローブにハイブリダイズした。ポジティブコロニーを突き、そしてインサートをPCRで調べた。選択したコロニー由来のプラスミドを調製し、そして配列決定することによって3.5kbのBamHIフラグメントがglgB(pMSra10)の5′末端を失っていることが明らかになった。従って、Kpnl及びSalIで2回消化したR.オバメンシスのゲノムDNAから作製した別のサブライブラリーを、R.オバメンシスglgBプローブでスクリーニングし、R.オバメンシスglgB(pMSra29)の5′末端を回収した。構造glgBの全配列は、pMSra10及びpMSra29から入手し、そして全glgB遺伝子の増幅のためのPCRプライマー(配列番号5及び配列番号6)をこの配列から設計した。
【0179】
発現ベクターの構築
それぞれBspHI及びHindIIIの制限酵素部位を含むプライマーc)(配列番号5)及びd)(配列番号6)を用いて、全glgB遺伝子をロドサームス・オバメンシスのゲノムDNAからPCR増幅した(PCR反応の間の変異を避けるために、Boehringer MannheimのExpand High Fidelityを使用した)。BspHI及びHindIIIにするPCR増幅したフラグメントの切り出しは、NcoI及びHindIIIで消化したpBAD/Myc−HisAへの一方向のクローニングを可能にした。生じたベクターpMSra33は、TOP10 E.コリにおける形質転換及びアラビノースによる誘導後にR.オバメンシスの分枝酵素を生成した。
【0180】
配列番号5、プライマーc);ロドサームス・オバメンシスglgB遺伝子の増幅のためのプライマー(上流)。下線を引いたヌクレオチドが、BspHI部位を導入する
5′−TTCCTCATGAGCTGGCTCACGGAAGAAGACA−3′
【0181】
配列番号6、プライマーd);ロドサームス・オバメンシスglgB遺伝子の増幅のためのPCRプライマー(下流)。下線を引いたヌクレオチドがHindIII部位を導入する:
5′−GTTTAAAGCTTTTCAGGACGGCTACC−3′
【0182】
生物学的寄託DSM 12607
完全なロドサームス・オバメンシスglgB遺伝子を有するプラスミドpT7Blue(配列番号1)も、E.コリ DH12Sを形質転換させ、これはDSM 12607としてDSMZに寄託された(生物学的材料の寄託に記載)。
【0183】
タンパク質の発現
R.オバメンシスの分枝酵素は、pMSra33で形質転換したTOP10
E.コリの菌株において異種的に発現した。前記E.コリの細胞は、100μg/mlのアンピシリンを有するSB培地で、28℃で一晩インキュベートした。0.0002%のアラビノースを発現の誘導のために加えた。細胞は遠心によって遠心沈澱し、そして20mMのリン酸緩衝液(pH6.0)中で再懸濁した。緩衝液の量は、増殖培地の1/20に相当する。次に、細胞を超音波処理し、そして細片を遠心によって除去した。
【0184】
E.コリからの内因性アミロース分解活性の除去
E.コリの抽出物から全ての内因性アミロース分解酵素活性を除去することによって、発現した分枝酵素活性を検出するために、ヨウ素法(Takata et al.,Applied and Environmental Microbiology(1994),p.3097)を使用することが可能になる。従って、pBAD/Myc−HisAベクターを有し、そしてglgBのインサートを持たない(ネガティブコントロール)宿主E.コリの菌株から、内因性のアミロース分解活性を除くために熱処理が使用できるかどうかを試験した。結果は、60℃/20分の処理が、Takata等によって記述されたアミロースーヨウ素アッセイで測定されるバックグラウンドのアミロース分解活性を熱で消滅させるのに十分であり、この中で活性は検出されなかったことを示した。
【0185】
R.オバメンシスの分枝酵素変異体Y397C+L419Pの部分精製
発現したR.オバメンシスの分枝酵素の配列決定は、配列番号2の成熟アミノ酸配列と比較して、2つの変化がPCR反応の間に導入されたことを明らかにした:
a)Tyr397はCys397へと変化した。
b)Leu419はPro419へと変化した。
この分枝酵素変異体は、以降「Y397C+L419P」と表す。
【0186】
E.コリで発現した、置換Y397C+L419Pを有するR.オバメンシスの分枝酵素はイオン交換及びハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーによって部分的に精製した。熱処理した細胞抽出物を透析し、そしてSuper−Q Toyopeal(22mm×200mm、TOSOH)にかけ、続いて0〜0.6M NaCl/50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.4)の直線勾配で溶出した。分枝酵素活性を有する画分を回収し、そしてMacro−prep Ceramic Hydroxyapatite Type I(14mm×100mm、BioRad)にかけ、続いて5〜400mMリン酸ナトリウム(pH6.5)の勾配で溶出した。活性を示す画分を回収した。それは、クーマシーブリリアントブルー染色によるSDS−PAGE上で、わずかなバンドと一緒に、1つの主要なバンドを示した。
【0187】
分枝結合の形成
α−1,6−分枝結合の形成は、分枝結合アッセイの改良版(BL assay,Takeda et al.,Carbohydrate Research,240 253−260(1993))によって確認した。
使用した基質は、100mM Tris−HCl(pH7.5)に溶解した0.5%のIII型アミロース(Sigma)である。基質(90μl)及び酵素溶液(10μl)を混合し、そして60℃で30分間インキュベートし、続いて反応を4分間の煮沸によって停止させた。10μlの1M酢酸緩衝液(pH4.1)の添加後、5μlのイソアミラーゼ(1mg/ml、Hayashibara Co.Ltd.)又は5μlの脱イオン水のいずれかを反応混合物に加えた。それを45℃で45分間インキュベートした。続いて、反応液を460μlの氷冷エタノールに加え、そして氷上で10分間保持した、沈澱した糖を12,000rpmで5分間の遠心によって回収し、そして一旦真空で乾燥させ、続いて8μlの1N NaOH及び292μlの脱イオン水中で再び溶解した。溶液の還元力は、改良型の3,5−ジニトロサリチル酸(DNS)法(Luchsinger and Cornesky,1962)を用いて測定した。DNS溶液は、最初に10mlの2N NaOHに0.05gの3,5−ジニトロサリチル酸を溶解し、続いて3gのロッシェル塩を溶液に加え、そして最後に全量を脱イオン水で15mlに調整することで調製した。試料溶液(0.2〜0.3ml)を0.4mlのDNS溶液と混合し、そして5分間煮沸した。流水による冷却の後、1.8mlの水を反応混合物に加え、そして525nmでの吸光度を測定した。還元末端の量は、グルコース量に等しいとして推定した。部分的に精製したY397C+L419Pの試料は、分枝結合の形成の測定のために使用した。表5に示す様に、還元末端はイソアミラーゼ処理によって生成し、示したα−1,6分枝結合はY397C+L419Pによって形成した。
【表2】
【0188】
例2
分枝酵素変異体Y397C+L419Pについての温度及びpHの効果
至適温度及びpHを、分枝酵素変異体Y397C+L419Pについて評価した(例1に記載)。
【0189】
分枝酵素活性測定に使用したアッセイは、材料と方法に記載した様に行った。R.オバメンシスの分枝酵素を発現しているE.コリ由来の内因性アミロース分解活性を避けるために、細胞抽出物は60℃で少なくとも20分間、あらかじめ加熱し、そして細片は遠心によって除去した。続いて、あらかじめ加熱した細胞抽出物をアッセイにかけ、そして分枝酵素活性について解析した。
【0190】
至適pHアッセイにおいて、異なる緩衝液を使用して基質溶液を調製した:
pH<4 0.1M クエン酸ナトリウム
4<pH<6 0.1M 酢酸ナトリウム
6<pH<10 0.1M Tris
pH>10 0.1M グリシルグリシン
【0191】
酵素(Y397C+L419P)を、指示温度で30分間、pH7.0でインキュベートした。分枝酵素活性は上述の様に測定した。実験は少なくとも三回一組で行った;平均値及び標準偏差を以下の表2及び表3に示す。
【0192】
データは、Y397C+L419Pの至適温度が約65℃であることを示している。
【表3】
【表4】
【0193】
pHの活性実験は60℃で行い、そして酵素を30分間インキュベートした。実験は少なくとも三回一組で行い;平均値及び標準偏差は以下の表4に示す。データは、Y397C+L419Pが約pH5〜約pH8の広範な至適pHを有することを示している。
【表5】
【0194】
例3
分枝酵素変異体Y397C+L419Pによるシクロデキストリンの調製
コメアミロペクチン(Motyl B,Shimada Chemical,Japan)を、Tris−HCl緩衝液(pH7)中の、置換Y397C+L419Pを有するR.オバメンシスの分枝酵素(例1に記載)(400ユニット/g デンプン)で、50℃で18時間処理した。15,000rpmでの10分間の遠心による細片の除去後、2倍量のエタノールを溶液に加え、そして沈澱したデキストリンを回収し、そして乾燥させた。約67gのデキストリンを、100gのコメアミロペクチンから得た。分子内分枝結合が酵素処理によって起きたならば、グルコアミラーゼに耐性があるシクロデキストリンが得られるはずである。1gの上述したデキストリンを、1500ユニットのグルコアミラーゼ(リゾパス(Rhizopus種、Wako PureChemicals,Japan))で、pH4.1、40℃で18時間処理し、そして生じたデキストリンをエタノールによって回収した。約200mgのデキストリンを得た。酸α−アミラーゼの存在下での処理によって、デキストリンは得られなかった。グルコアミラーゼ耐性デキストリンは、グルコアミラーゼ単独(0.9ユニット/gデキストリン)又はグルコアミラーゼとイソアミラーゼの組合わせ(それぞれ0.9ユニット及び29ユニット/gデキストリン)を用いて、pH4.5、40℃で16時間再び処理した。その結果、90%のデキストリンがグルコアミラーゼ単独で回収され、一方、わずかに10%のデキストリンが、イソアミラーゼの存在下での処理後に残った。これは、環状デキストリンがY397C+L419Pによって触媒される分子内α−1,6−分枝結合によって形成したことを示した。
【0195】
例4
アスペルギルスにおけるR.オバメンシスの発現
宿主生物
アスペルギルス・オリザエBECh2は、デンマーク特許出願PA 1999 01726に記載されている。これは、IFO4177の変異体である、JaL228の変異体(WO98/123000に記載)である。
【0196】
A.オリザエの形質転換
アスペルギルス・オリザエの菌株BECh2を100mlのYPG培地に接種し、そして80rpmで撹拌しながら32℃で16時間インキュベートした。生育した菌糸を濾過によって回収し、0.6M KClで洗浄し、そしてGlucanex(商標)(Novo Nordiskより入手可)を30μl/mlの濃度で含む30mlの0.6M KCl中で再懸濁した。混合物は、プロトプラストが形成するまで、60rpmで撹拌しながら32℃でインキュベートした。残った菌糸を除去するための濾過後、プロトプラストを遠心によって回収し、そしてSTC緩衝液で2回洗浄した。プロトプラストはヘマタイトメーター(hematitometer)で計数し、そしてSTC:STPC:DMSOの溶液(8:2:0.1)中で1.2×107プロトプラスト/mlの最終濃度に再懸濁した。約4μgのDNAを100μlのプロトプラストに加え、穏やかに混合し、そして氷上で30分間インキュベートした。1μlのSTPC緩衝液を混合物に加え、そして37℃で更に30分間インキュベートした。50℃であらかじめ暖めた10mlのCoveのトップアガロースの添加後、反応混合物をCOVEのアガープレートに注いだ。プレートは、32℃で5日間又は形質転換体が出現するまでインキュベートした。
【0197】
培地及び緩衝溶液
COVE:1L当たり、342.3gのスクロース、20mlのCOVE塩溶液、10mMのアセトアミド、15mMのCsCl2、30gのアガーノーブル(Difco)。
COVE塩溶液:1L当たり、26gのKCl、26gのMgSO4・7H2O、76gのKH2PO4、50mlのCove微量金属。
Cove微量金属:1L当たり、0.04gのNaB4O7−10H2O、0.4gのCuSO4−5H2O、1.2gのFeSO4−7H2O、0.7gのMnSO4−H2O、0.7gのNa2MoO2−2H2O、0.7gのZnSO4−7H2O。
AMG微量金属:1L当たり、14.3gのZnSO4−7H2O、2.5gのCuSO4−5H2O、0.5gのNiCl2、13.8gのFeSO4、8.5gのMnSO4、3.0gのクエン酸。
YPG:1L当たり、4gの酵母抽出物、1gのKH2PO4、0.5gのMgSO4−7H2O、5gのグルコース、pH6.0。
STC:0.8Mソルビトール、25mM Tris pH8、25mM CaCl2。
STPC:40% PEG4000/STC緩衝液。
Coveトップアガロース:1L当たり、342.3gのスクロース、20mlのCOVE塩溶液、10mMのアセトアミド、10gの低融点アガロース。
MS−9:1L当たり30gのダイズ粉末、20gのグリセロール、pH6.0。MDU−2Bp:1L当たり、45gのマルトース−1H2O、7gの酵母抽出物、12gのKH2PO4、1gのMgSO4−7H2O、2gのK2SO4、5gの尿素、1gのNaCl、0.5mlのAMG微量金属溶液pH5.0。
【0198】
SDS−PAGE及びウェスタンブロッティング
SDSポリアクリルアミド電気泳動は、市販のゲルPAGEL AE6000 NPU−7.5L(7.5T%)を、装置AE−6400(Atto,Japan)と一緒に用い、提供されたプロトコールに従い行った。ゲルにおいて分離したタンパク質は、AE−6677 Horizon blot(Atto,Japan)を用いて、Clear Blot membrane−P AE−6655(Atto,Japan)にトランスファーした。タンパク質の検出は、Immuno Blot Assay Kit(BioRad)を用いて行った。
【0199】
アスペルギルスのためのR.オバメンシスglgBの発現プラスミドの構築
R.オバメンシスglgB遺伝子は、各末端に制限酵素部位BgIII及びXhoIを導入するために、プライマーセットa)及びb)、又はa)及びc)を用いて、R.オバメンシスのゲノムDNAから増幅した。プライマーc)は、C末端のglgBにおいてGlu−Gln−Lys−Leu−Ile−Ser−Glu−Glu−Asp−Leuを含んで成るc−mycエピトープの配列を与える。
【0200】
反応成分、すなわち40ngのR.オバメンシスの染色体DNA、Expand(商標)High Fidelity PCR System(Boehringer)の300pmolの各プライマー、0.2mMのdNTP及び2.6ユニットのDNAポリメラーゼを、提供されている緩衝液中で混合し、そして以下の条件下でPCRにかけた。
【表6】
【0201】
増幅した1.9kbのフラグメントをQIA gel extraction kit(Qiagen)で精製し、そしてBglII及びXhoIでの消化後、それをBamHI及びXhoIで消化したpCaHj483にライゲーションした。プラスミドpCaHj483は、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニジュランスのTPIリーダー配列、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼターミネーター及びマーカーとしてアスペルギルス・ニジュランスのamdS遺伝子を有する。プライマーセットa)及びb)で得られたプラスミドはpIH28と命名され、そしてプライマーセットa)及びc)で得られたものをpIH29と表した。
【0202】
A.オリザエにおけるR.オバメンシスglgBの発現
発現プラスミド、pIH28及びpIH29をNotIで消化し、そして生じたR.オバメンシスglgBの発現カセットを含む6kbのフラグメントをQIA gel extraction kitを用いて精製した。A.オリザエBECh2は各フラグメントで形質転換され、そして選択のポジティブな形質転換体を単離した。形質転換体は500mlの振とうフラスコ中の100mlのMS−9に接種し、そして32℃で1日間培養し、そして3mlの各培養物を振とうフラスコ中の100mlのMDU−2Bpに移し、32℃で2〜3日間培養した。増殖した細胞は3500rpmで15分間の遠心によって採集した。約0.1gの回収した細胞を、100μlの2倍濃度の試料添加緩衝液(100mM Tris−HCl(pH6.8)、200mMのジチオスレイトール、4% SDS、0.2%のブロモフェノールブルー及び20%グリセロール)中で懸濁し、そして5分間煮沸した。14000rpmで5分間の遠心後、10μlの上清をポリアクリルアミドゲルに載せ、そしてランニング緩衝液(25mM Tris、0.1% SDS、192mMグリシン)中での、ゲル当たり20mAの電気泳動にかけた。そのゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。ポジティブな形質転換体は、R.オバメンシスglgBの予想されるサイズ、72kDaのタンパク質のバンドを示した。c−mycタグを有する形質転換体の抽出物を載せたゲルは、一次抗体として抗myc抗体(invitrogen)及び二次抗体として抗マウスIgG(sigma)を用いてウェスタンブロッティングにかけた。ポジティブなシグナルは、72kDaに相当する位置で得られた。
【0203】
例5
R.オバメンシスの分枝酵素アッセイ並びに温度及びpHの効果
宿主菌株由来の内因性アミラーゼ活性を不活性化するために、細胞抽出物を68℃で30分加熱した。活性は上述の様に測定した。
【0204】
pHの活性プロファイルは65℃で測定し、そして温度の活性プロファイルはpH7で得た。実験は二回一組又は三回一組のいずれかで行い、そして平均及び標準偏差を以下に示す。
【0205】
温度安定性は、次の様にc−mycタグ無しの、R.オバメンシスの分枝酵素上で測定した;30〜50ユニット/ml(pH7)を含む酵素溶液を異なる温度で30分間インキュベートし、そして続いて残りの分枝酵素活性を測定した。
【0206】
データは、R.オバメンシスの分枝酵素の至適pH及び温度がそれぞれ約pH7及び65℃であることを示唆している。c−mycタグの存在は、pH及び温度のプロファイルに影響を与えなかった。
【表7】
【表8】
【表9】
【0207】
生物学的材料の寄託
プラスミドpT7Blue内に挿入されたロドサームス・オバメンシス由来の分枝酵素遺伝子(例1を参照のこと)を含むE.コリのクローンは、ブダペスト条約の名のもと、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)(Mascheroder Weg 1b,D−38124 Braunschweig,Germany)に寄託され、そして次の寄託番号が与えられた:
寄託 寄託番号 寄託日
NMO49443 DSM12607 1998年12月23日
【0208】
前記菌株は、米国特許法施行規則第1.14条及び米国特許法第122条のもとでそれらを名付けるために、特許商標庁長官によって決定されるものにとって、この特許出願の審査の間、前記培養物の入手が可能であることを保証する条件のもとで寄託された。前記寄託は、寄託した菌株の実質的に純粋な培養物を表す。前記寄託は、従属する出願の対応物、又はその孫が提出されている国の外国特許法によって必要とされる場合に入手可能である。しかし、寄託の入手可能性が、政府の指令によって付与される特許権の減損における従属発明を実施する許可を構成しないと理解すべきである。
【0209】
本明細書に記載され、そして請求された発明が、本明細書で開示した具体的な態様によって範囲を限定されないのは、これらの態様が本発明の複数の観点の例示として意図されているためである。いずれかの等しい態様が、本発明の範囲内であることが意図されている。実際、本明細書に示し、そして記載したものに加えて、本発明の様々な変更が前述の説明から当業者に明らかとなるだろう。その様な変更は更に、特許請求の範囲に含まれることも意図されている。抵触する場合、定義を含む本開示が調節するだろう。
【0210】
様々な引用を本明細書に列記しており、これらの開示は引用によってそれら全体が組み入れられる。
【配列表】
Claims (24)
- 分枝酵素活性及び少なくとも60℃の至適温度を有する単離したポリペプチドであって、
a)配列番号2の成熟アミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチド;
b)(i)前記成熟酵素に相当する配列番号1の核酸配列のヌクレオチド、(ii)配列番号1のcDNA配列、又は(iii)(i)若しくは(ii)の相補鎖と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるポリペプチド、
から成る群から選択される、ポリペプチド。 - N末端又はC末端に別のポリペプチドが融合されている、請求項1に記載のポリペプチドを含んで成る、単離したポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列、又は配列番号2のアミノ酸配列と5個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列、から成る、請求項1に記載のポリペプチド。
- E.コリ(coli)DH12S,DSM12607に含まれるプラスミドpT7Blueに含まれる核酸配列によってコードされる、成熟分枝酵素のアミノ酸配列から成る、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列から成る、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列から成る、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列から成る、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列又は置換Y397C+L419Pを有するその変異体から成る、請求項7に記載のポリペプチド。
- E.コリ DH12S,DSM12607に含まれるプラスミドpT7Blueに含まれる核酸配列によってコードされる、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記至適温度が60℃〜120℃の範囲にある、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記至適温度が60℃〜80℃の範囲にある、請求項10に記載のポリペプチド。
- 前記至適温度が65℃である、請求項11に記載のポリペプチド。
- 細菌起源の、請求項1に記載のポリペプチド。
- ロドサームス(Rhodo thermus )属の種の細胞に由来する、請求項13に記載のポリペプチド。
- R.オバメンシス(obamensis )及びR.マリヌス(marinus )の細胞に由来する、請求項14に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、核酸配列を含んで成る単離した核酸。
- 分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離した核酸であって:
a)配列番号1の核酸配列と少なくとも90%の同一性を有する核酸配列;
b)(i)配列番号1の核酸配列、(ii)配列番号1のcDNA配列、又は(iii)(i)若しくは(ii)の相補鎖と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、
から成る群から選択される核酸。 - E.コリ(coli)DH12S,DSM12607に含まれるプラスミドpT7Blueに含まれる、分枝酵素をコードする核酸配列から成る、請求項17に記載の核酸。
- 適当な発現宿主において前記ポリペプチドの生成を指示する1又は複数の調節配列と作用可能に連結している、請求項16〜18のいずれか1項に記載の核酸を含んで成る核酸構築物。
- 請求項19に記載の核酸構築物を含んで成る組換え発現ベクター。
- 請求項19に記載の核酸構築物を含んで成る組換え宿主細胞。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、(a)前記ポリペプチドの生成に適した条件下で請求項21に記載の宿主細胞を培養し;そして(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
- デンプン様材料を修飾するための、請求項1〜15のいずれか1項に記載の、又は請求項19に記載の核酸配列によってコードされるポリペプチドの使用。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載のポリペプチド及び界面活性剤を含んで成る洗剤組成物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK199900431 | 1999-03-29 | ||
DKPA199900431 | 1999-03-29 | ||
DKPA199900431 | 1999-03-29 | ||
PCT/DK2000/000152 WO2000058445A1 (en) | 1999-03-29 | 2000-03-29 | Polypeptides having branching enzyme activity and nucleic acids encoding same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002539822A JP2002539822A (ja) | 2002-11-26 |
JP4732591B2 true JP4732591B2 (ja) | 2011-07-27 |
Family
ID=8093457
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000608726A Expired - Fee Related JP4732591B2 (ja) | 1999-03-29 | 2000-03-29 | 分枝酵素活性を有するポリペプチド及びそれをコードする核酸 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6608018B1 (ja) |
EP (1) | EP1165759B1 (ja) |
JP (1) | JP4732591B2 (ja) |
KR (1) | KR100716042B1 (ja) |
CN (2) | CN1211483C (ja) |
AT (1) | ATE450603T1 (ja) |
AU (1) | AU779814B2 (ja) |
BR (1) | BR0009393A (ja) |
CA (1) | CA2367999C (ja) |
DE (1) | DE60043428D1 (ja) |
DK (1) | DK1165759T3 (ja) |
MX (1) | MXPA01009699A (ja) |
WO (1) | WO2000058445A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020058318A (ja) * | 2018-10-12 | 2020-04-16 | 物産フードサイエンス株式会社 | ドウまたはドウ加熱食品における分枝酵素の新規用途 |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003232182A1 (en) * | 2002-06-17 | 2003-12-31 | Novozymes A/S | Methods for producing dextrins using enzymes |
US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
AU2003286128A1 (en) * | 2002-12-05 | 2004-06-23 | Novozymes A/S | Expression of polypeptides in filamentous fungi |
AU2004252186B8 (en) | 2003-06-30 | 2010-06-24 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Wheat with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products derived therefrom |
AU2004317306B2 (en) | 2003-11-21 | 2010-09-02 | Pelican Technology Holdings, Inc. | Improved expression systems with Sec-system secretion |
JP2008507294A (ja) | 2004-07-26 | 2008-03-13 | ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド | 菌株遺伝子操作による改善されたタンパク質発現のための方法 |
JP4086312B2 (ja) * | 2004-09-30 | 2008-05-14 | 江崎グリコ株式会社 | グリコーゲンの製造方法 |
EP1743693B1 (en) * | 2005-07-12 | 2017-03-29 | Coöperatie Avebe U.A. | Emulsifier |
JP4862759B2 (ja) | 2006-06-30 | 2012-01-25 | 味の素株式会社 | 澱粉含有食品の製造方法及び澱粉含有食品改質用の酵素製剤 |
MX2009003467A (es) * | 2006-10-06 | 2009-04-14 | Danisco Us Inc Genencor Div | Composiciones enzimaticas libres de celulasa y celulas hospederas para producir las mismas. |
EP2108047B1 (en) | 2007-01-31 | 2012-10-24 | Pfenex Inc. | Bacterial leader sequences for increased expression |
US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
EP2142651B1 (en) | 2007-04-27 | 2013-05-22 | Pfenex Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
EP2285965A1 (en) * | 2008-03-31 | 2011-02-23 | Pfenex Inc | A design for rapidly cloning one or more polypeptide chains into an expression system |
EP2455436B1 (de) | 2010-11-15 | 2018-09-12 | Agrana Stärke GmbH | Klebstoffzusammensetzung auf Stärkebasis |
DK2866582T3 (en) * | 2012-06-27 | 2019-01-14 | Novozymes As | Method of cooking rice |
KR20160029731A (ko) | 2013-03-12 | 2016-03-15 | 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 | 변형된 뮐러관 억제 물질(mis) 단백질 및 질환 치료를 위한 그 용도 |
WO2015089321A2 (en) | 2013-12-11 | 2015-06-18 | The General Hospital Corporation | Use of mullerian inhibiting substance (mis) proteins for contraception and ovarian reserve preservation |
CN103789281B (zh) * | 2014-02-18 | 2016-04-13 | 中国农业大学 | 一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用 |
CN107105677A (zh) * | 2015-01-16 | 2017-08-29 | 诺维信公司 | 用来改进烘焙品的可切片性的方法 |
CN110099928B (zh) | 2016-12-27 | 2022-02-25 | 江崎格力高株式会社 | 消化速度缓慢的高分子葡聚糖 |
KR102288395B1 (ko) * | 2021-01-15 | 2021-08-10 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 1,4-알파-글루칸-분지 효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4454161A (en) | 1981-02-07 | 1984-06-12 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for the production of branching enzyme, and a method for improving the qualities of food products therewith |
US4971723A (en) | 1988-10-14 | 1990-11-20 | National Starch And Chemical Investment Holding Corporation | Partially debranched starches and enzymatic process for preparing the starches |
NL8902128A (nl) * | 1989-08-23 | 1991-03-18 | Avebe Coop Verkoop Prod | Vertakkingsenzym en gebruik daarvan. |
US5015577A (en) * | 1989-08-29 | 1991-05-14 | Board Of Regents, The University Of Texas System | DNA encoding hyaluronate synthase |
AU630308B2 (en) | 1990-11-19 | 1992-10-22 | National Starch And Chemical Investment Holding Corporation | Short chain amylose as a replacement for fats in foods |
DE69112350T2 (de) | 1990-11-19 | 1996-02-08 | Nat Starch Chem Invest | Entzweigte Stärken enthaltende kosmetische Mittel. |
DK175391D0 (da) * | 1991-10-18 | 1991-10-18 | Novo Nordisk As | Nye enzymer |
JPH0662881A (ja) | 1992-06-25 | 1994-03-08 | Natl Sci Council | 澱粉およびタンパク質を含有する材料から酵素的方法によって高マルトースシロップおよび高タンパク質副生成物を製造する方法 |
JPH07213287A (ja) * | 1993-11-04 | 1995-08-15 | Ezaki Glico Co Ltd | 耐熱性ブランチングエンザイム遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性ブランチングエンザイム。 |
NL9401090A (nl) | 1994-06-29 | 1996-02-01 | Avebe Coop Verkoop Prod | Werkwijze voor het oppervlaktelijmen of strijken van papier. |
JP3107358B2 (ja) | 1994-09-13 | 2000-11-06 | 江崎グリコ株式会社 | 環状構造を有するグルカンおよびその製造方法 |
DE69625873T2 (de) | 1995-10-27 | 2003-12-24 | Amersham Biosciences Corp., Piscataway | Thermostabile, alkalische Phosphatase aus Rhodothermus Marinus |
SE513209C2 (sv) * | 1995-11-29 | 2000-07-31 | Lars Rask | Förfarande för produktion av transgena potatisar med ökad eller minskad grad av förgrening av amylopektinstärkelse |
JP2987685B2 (ja) | 1996-01-18 | 1999-12-06 | 農林水産省食品総合研究所長 | 新規なグルコシル(α1→6)分岐水解酵素、該酵素の製造方法および利用方法 |
NL1002275C2 (nl) | 1996-02-07 | 1997-08-08 | Have D J Van Der Bv | Modificatie van polysacchariden. |
CN1216902A (zh) * | 1996-05-02 | 1999-05-19 | 诺沃挪第克公司 | 分支酶在烘烤中的用途 |
DE69834403T2 (de) * | 1997-07-02 | 2007-04-19 | Novozymes A/S | Verfahren zur umwandlung von stärke mittels hitzestabilen isoamylasen aus sulfolobus |
-
2000
- 2000-03-29 MX MXPA01009699A patent/MXPA01009699A/es unknown
- 2000-03-29 CA CA2367999A patent/CA2367999C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-29 AU AU34197/00A patent/AU779814B2/en not_active Ceased
- 2000-03-29 BR BR0009393-9A patent/BR0009393A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-03-29 KR KR1020017012558A patent/KR100716042B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-03-29 AT AT00912419T patent/ATE450603T1/de active
- 2000-03-29 CN CNB008056951A patent/CN1211483C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-29 US US09/537,120 patent/US6608018B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-29 DE DE60043428T patent/DE60043428D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-29 DK DK00912419.9T patent/DK1165759T3/da active
- 2000-03-29 JP JP2000608726A patent/JP4732591B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-29 CN CN200510074333.XA patent/CN1721527B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-29 EP EP00912419A patent/EP1165759B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-29 WO PCT/DK2000/000152 patent/WO2000058445A1/en not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-05-26 US US11/441,834 patent/US7919271B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020058318A (ja) * | 2018-10-12 | 2020-04-16 | 物産フードサイエンス株式会社 | ドウまたはドウ加熱食品における分枝酵素の新規用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE450603T1 (de) | 2009-12-15 |
AU3419700A (en) | 2000-10-16 |
KR20010110483A (ko) | 2001-12-13 |
WO2000058445A1 (en) | 2000-10-05 |
JP2002539822A (ja) | 2002-11-26 |
DE60043428D1 (de) | 2010-01-14 |
CN1211483C (zh) | 2005-07-20 |
US7919271B2 (en) | 2011-04-05 |
BR0009393A (pt) | 2002-01-08 |
MXPA01009699A (es) | 2002-05-14 |
CA2367999C (en) | 2015-10-27 |
CN1721527B (zh) | 2016-05-18 |
DK1165759T3 (da) | 2010-04-19 |
EP1165759A1 (en) | 2002-01-02 |
EP1165759B1 (en) | 2009-12-02 |
CN1721527A (zh) | 2006-01-18 |
US6608018B1 (en) | 2003-08-19 |
CA2367999A1 (en) | 2000-10-05 |
CN1347451A (zh) | 2002-05-01 |
AU779814B2 (en) | 2005-02-10 |
KR100716042B1 (ko) | 2007-05-08 |
US20070015679A1 (en) | 2007-01-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7919271B2 (en) | Nucleic acid encoding branching enzyme | |
US6506585B2 (en) | Polypeptides having haloperoxidase activity | |
US6503508B2 (en) | Polypeptides having haloperoxidase activity | |
US20070118930A1 (en) | Polypeptides having cellobiase activity and polynucleotides encoding same | |
WO2001079464A2 (en) | Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity | |
WO2001079463A2 (en) | Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity | |
US7279315B2 (en) | Polypeptides having glucanotransferase activity and nucleic acids encoding same | |
WO2000075296A1 (en) | Novel glucoamylase | |
US6509181B1 (en) | Polypeptides having haloperoxide activity | |
EP1226236B1 (en) | Polypeptides having glucanotransferase activity and nucleic acids encoding same | |
US6410292B1 (en) | Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity | |
US6511835B1 (en) | Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity | |
US6410291B1 (en) | Polypeptides having haloperoxidase activity | |
EP1214424A2 (en) | Agrotis segetum alpha-amylase |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070327 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100302 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100601 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100608 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100827 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101019 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110209 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20110222 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110322 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110421 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140428 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |