CN1721527A - 具有分支酶活性的多肽及其编码核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有分支酶活性的分离多肽和编码该多肽的分离核酸序列。本发明还涉及含有该核酸序列的核酸结构、载体和宿主细胞，以及制备和应用该多肽的方法。

Description

具有分支酶活性的多肽及其编码核酸
                         发明背景
发明领域
本发明涉及具有分支酶活性的分离多肽和编码该多肽的分离核酸序列。本发明还涉及含有该核酸序列的核酸结构、载体和宿主细胞，以及制备和应用该多肽的方法。
相关领域的描述
在微生物、植物和高等生物中分支酶(EC 2.4.1.18)，下文称作BE，催化转糖基作用形成糖原和支链淀粉的α-1，6-糖苷键(分支点)。糖原和支链淀粉是在微生物、植物和高等生物中用于能量储存的高度分支淀粉物质。BE不仅催化在不同分子之间(分子间转移)形成分支，还催化同一分子上多分支葡聚糖向另一位置的转移(分子内转移)。
与未修饰淀粉相比，高度分支的淀粉物质具有独特的性质，例如高溶解性、低粘度以及较慢的老化趋势，这些性质使得它们可以有利地用于粘合剂组合物中，包括EP 0 690 170所描述的造纸工业中的表面施胶剂和涂层，以及US 4 454 161所描述的食物和饮料添加剂及抗淀粉老化剂。
已经分离并公开了几种不同生物的分支酶，例如：US 4 454 161描述了来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的BE；Boyer和Preiss，生物化学(Biochemistry)，第16卷(16)，第3693-3699页，1997中描述了来自大肠杆菌(Escherichia coli)的BE；Zevenhuizen，Biochem.Biophys.Acta(81)，第608-611页，1964中描述了来自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的BE；Walker和Builder，欧洲生物化学杂志(Eur.J.of Biochem.)，第20卷(1)，第14-21页，1971中描述了来自缓症链球菌(Streptococcus mitis)的BE；Kiel等，基因(Gene)，第78卷(1)，第9-18页，1989，描述了来自蓝藻类细菌聚球蓝细菌属(Synechococcus sp.)PCC7942的BE；Rumbak等，细菌学杂志(Journalof Bacteriology)，第173卷(21)，第6732-6741页，1991中描述了来自溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)的BE；Kiel等，DNA序列(DNA Sequence)，第3卷(4)，第221-232页，1992中描述了来自热溶芽孢杆菌(Bacillus caldolyticus)的BE。
上述参考文献的共同特征是所报道的最适温度均不高于45℃。仅公开了两种具有较高最适温度特性的分支酶：Kiel等，分子和普通遗传学(Molecuar & General Genetics)，第230卷(1-2)，第136-144页，1991(也见EP 0 418 945)：具有53℃最适温度的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)1503-4R分支酶；和Takata等，应用和环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)，第60卷(9)，第3096-3104页，1994：具有大约50℃最适温度的嗜热脂肪芽孢杆菌TRBE14分支酶。
由于在更高的温度下反应速度增加，所以在工业上使用具有高最适温度的分支酶是有利的。籍此采用同样量的酶可以获得更高的生产量，可实现更经济的生产。而且，由于在高温下运作程序可以防止感染，所以是有利的。
本发明的目的是提供具有分支酶活性的改良多肽和编码该多肽的核酸。
                         发明概要
本发明涉及具有分支酶活性和至少60℃的最适温度的分离多肽。
本发明还涉及编码该多肽的分离核酸序列，和含有该核酸序列的核酸结构、载体和宿主细胞，以及制备和应用该多肽的方法。
                         发明详述
具有分支酶活性的多肽
“分支酶活性”是指催化糖原或支链淀粉的α-1，6-糖苷键形成的α-1，4-葡聚糖分支活性(EC 2.4.1.18)。为了本发明的目的，分支酶活性可以根据Takata等(Applied and Enviromental Microbiology(1994)，第3097页(分析A))所述方法的修改版本来确定，这描述在本文中材料和方法部分的标题“分支酶活性”下。
第一方面，本发明涉及最适温度为至少60℃的具有分支酶活性的分离多肽；优选地，该最适温度在60℃-120℃的范围内；更优选该最适温度在60℃-100℃范围内；甚至更优选该最适温度在60℃-80℃范围内；最优选该最适温度在60℃-70℃范围内；甚至最优选该最适温度为65℃。
在第一个实施方案中，本发明的多肽在pH6-pH8范围内保持大约70％的相对活性；优选在pH6-pH7范围内保持大约80％的相对活性；更优选该最适pH为大约pH7。
用于确定最适温度和pH的条件描述于本文材料和方法部分中“分支酶活性”标题下。
在第二个实施方案中，本发明的多肽具有如下氨基酸序列，该序列与SEQ ID NO：2的第2位-第621位氨基酸(即成熟多肽)，或与大肠杆菌DSM 12607中的质粒pT7Blue所包含的核酸序列编码的氨基酸序列有至少约65％、优选至少约70％、更优选至少约80％、甚至更优选至少约90％、最优选至少约95％、甚至最优选至少约97％的同源性，而且该多肽具有分支酶活性(下文称作“同源多肽)。在一个优选的实施方案中，该同源多肽具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相差5个氨基酸、优选4个氨基酸、更优选3个氨基酸、甚至更优选2个氨基酸、最优选1个氨基酸的氨基酸序列。
为了本发明的目的，序列的比对和同源分数的计算可以采用对于蛋白质和DNA比对均有用的完全Smith-Waterman比对来进行。对于蛋白质和DNA的比对分别采用默认计分矩阵BLOSUM50和同一性矩阵。空缺中第一个残基的罚分对于蛋白质是-12，对于DNA是-16；而空缺中额外残基的罚分对于蛋白质是-2，对于DNA是-4。比对可以采用FASTA软件包v20u6版进行(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“用于生物学序列分析的改良工具”，PNAS 85：2444-2448；和W.R.Pearson(1990)，“用FASTP和FASTA进行的快速灵敏序列比较”，酶学方法(Methods in Enzymology)，183：63-98)。蛋白质序列的多序列比对可以采用“ClustalW”来进行(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：通过序列加权、位置特异性空缺罚分和加权矩阵的选择改善渐进性多序列比对的灵敏性，核酸研究(Nucleic Acids Research)22：4673-4680)。采用蛋白质比对作为模板，然后用DNA序列的相应密码子取代氨基酸，则可以进行DNA序列的多序列比对。
优选地，本发明的多肽含有SEQ ID NO：2或其等位变体的氨基酸序列；或具有分支酶活性的它们的片段。在一个更优选的实施方案中，本发明的多肽含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO：2或其等位变体的氨基酸序列；或具有分支酶活性的它们的片段组成。在另一个优选实施方案中，本发明的多肽由SEQID NO：2的氨基酸序列组成。
SEQ ID NO：2的片段是从该氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失了一个或多个氨基酸的多肽。
等位变体是指一个基因占据同一个染色体座位的两个或多个可替代形式中的任意一个。等位变异通过突变自然发生，并可导致种群内的多态现象。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化)，或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是基因的等位变体编码的多肽。
在第三个实施方案中，本发明多肽具有分支酶活性，并且由如下核酸序列编码，该核酸序列可在极低严紧条件，优选低严紧条件，更优选中等严紧条件，更优选中高严紧条件，甚至更优选高严紧条件，最优选极高严紧条件下和在相同条件下与下列序列杂交的核酸探针杂交：(i)SEQID NO.1的核苷酸，(ii)SEQ ID NO.1的核苷酸中包含的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的子序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，ColdSpring Harbor，纽约)。SEQ ID NO：1的子序列可以是至少100个核苷酸，优选至少200个核苷酸。而且，该子序列可以编码具有分支酶活性的多肽片段。该多肽也可以是该多肽的具有分支酶活性的等位变体或片段。
根据本领域熟知的方法，可使用SEQ ID NO.1的核酸序列或其子序列，以及SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其片段，设计核酸探针以从不同属或种的株系鉴定和克隆编码具有分支酶活性的多肽的DNA。具体地，在标准Southern印迹程序之后，可采用该探针与感兴趣的属或种的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和分离其中的相应基因。该探针可比完整序列短得多，但应长至少15个，优选至少25个，更优选至少35个核苷酸。也可以使用更长的探针。既可使用DNA探针，也可使用RNA探针。典型地，为了检测相应基因，对该探针进行标记(例如用32P、3H、36S、生物素或抗生物素蛋白进行标记)。该探针包括在本发明的范围之内。
因此，可以筛选从这些其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库，以获得与上述探针杂交并编码具有分支酶活性的多肽的DNA。来自这些其它生物的基因组或其它DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术分离。可以将来自这些文库的DNA或分离的DNA转移并固定至硝酸纤维素或其它适当的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO.1或其子序列同源的克隆或DNA，将该载体材料用于Southern印迹。对于本发明的目的，杂交是指核酸序列与相应于SEQ ID NO.1中所示核酸序列、其互补链或它们的子序列的标记核酸探针在极低到极高的严紧条件下杂交。用X光胶片检测在这些条件下与该核酸探针杂交的分子。
在一个优选的实施方案中，该核酸探针是编码SEQ ID NO.2之多肽的核酸序列或其子序列。在另一个优选实施方案中，该核酸探针是SEQ IDNO.1。在另一个优选实施方案中，核酸探针是大肠杆菌DSM 12607中的质粒pT7Blue所包含的核酸序列(见实施例1)，其中该核酸序列编码具有分支酶活性的多肽。
对于至少100核苷酸长的长探针，极低到极高严紧条件定义为标准Southern印迹程序之后，在5×SSPE、0.3％SDS、200g/ml剪切的变性鲑精DNA、和或者25％甲酰胺(对于极低和低严紧条件)或者35％甲酰胺(对于中等和中高严紧条件)或者50％甲酰胺(对于高和极高严紧条件)中于42℃进行预杂交和杂交。
对于至少100个核苷酸长的长探针，该载体材料最后用2×SSC、0.2％SDS，优选至少在45℃(极低严紧条件)，更优选至少在50℃(低严紧条件)，更优选至少在55℃(中等严紧条件)，更优选至少在60℃(中高严紧条件)，甚至更优选至少在65℃(高严紧条件)，最优选至少在70℃(极高严紧条件)洗涤三次，每次15分钟。
对于长约15个核苷酸到约70个核苷酸的短探针，严紧条件定义为标准Southern印迹程序后，在使用Bolton和McCarthy(1962，美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)48：1390)的计算方法计算的Tm值以下5℃-10℃，于0.9M NaCl、0.09MTris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％ NP-40、1×Denhardt’s溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA/ml中进行预杂交、杂交和杂交后洗涤。
对于长约15个核苷酸到约70个核苷酸的短探针，该载体材料在计算的Tm以下5℃-10℃于6×SCC加0.1％SDS中洗涤一次，时间15分钟，于6×SSC中洗涤两次，每次15分钟。
在第四个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO.2之氨基酸序列的多肽的含有一或多个氨基酸替代、缺失和/或插入的变体，而且该变体具有BE活性。
该变体多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.2的氨基酸序列可以相差一个或多个氨基酸残基的插入或缺失和/或一个或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基替代。优选地，氨基酸的改变在性质上是较小的，即不显著影响该蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸替换；小的缺失，典型的是1到约30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端突出，如氨基末端的甲硫氨酸残基；不超过约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能而利于纯化的小突出，如聚组氨酸片段、抗原表位或结合域。
保守替代的例子是如下氨基酸组内的替代，这些氨基酸组是：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，芳香族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸替代是本领域已知的，并描述于例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，蛋白质(The Proteins)，Academic Press，纽约。最常发生的交换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly，以及它们的相反替代。
在第五个实施方案中，本发明多肽与具有SEQ ID NO.2之氨基酸序列的多肽有免疫化学同一性或部分免疫化学同一性。免疫化学性质通过用熟知的乌赫特朗尼氏双向免疫扩散(Ouchterlony doubleimmunodiffusion)程序进行免疫交叉反应同一性试验来确定。具体地，根据Harboe和Ingild在N.H.Axelsen，J.Krll和B.Weeks编著的定量免疫电泳手册(A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis)(Blackwell Scientific Publications，1973)第23章中，或Johnstone和Thorpe在实用免疫化学(Immunochemistry inPractice)(Blackwell Scientific Publications，1982)(更具体的见第27-31页)中描述的程序，通过免疫兔(或其它啮齿类动物)制备含有与具有SEQ ID NO.2之氨基酸序列的多肽的表位发生免疫反应或结合的多克隆抗体的抗血清。具有免疫化学同一性的多肽是指当使用特定免疫化学技术时以相同方式如沉淀物的完全融合、相同的沉淀物形态和/或相同的电泳迁移率，与该抗血清反应的多肽。Axelsen，Bock，和Krll在N.H.Axelsen，J.Krll和B.Weeks编著的定量免疫电泳手册(Blackwell Scientific Publications，1973)第10章中对免疫化学同一性作了进一步的解释。具有部分免疫化学同一性的多肽是指当使用特定免疫化学技术时以部分相同方式如沉淀物的部分融合、部分相同的沉淀物形态和/或部分相同的电泳迁移率，与该抗血清反应的多肽。Bock和Axelsen在N.H.Axelsen，J.Krll和B.Weeks编著的定量免疫电泳手册(Blackwell Scientific Publications，1973)第11章中对部分免疫化学同一性作了进一步阐述。
所述抗体也可以是单克隆抗体。单克隆抗体可根据例如E.Harlow和D.Lane编著的抗体实验室手册(Antibodies，A Laboratory Manual)(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，冷泉港，纽约)中的方法制备和使用。
本发明多肽具有SEQ ID N0.2多肽之分支酶活性的至少20％，优选至少40％，优选至少60％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少100％。
本发明多肽可以获自任何属的微生物。为了本发明的目的，本文中与给定来源相连使用的术语“获自”是指该核酸序列编码的多肽由该来源或已插入了该来源的核酸序列的细胞产生。在一个优选实施方案中，该多肽被分泌于细胞外。
本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)多肽，如Bacillus alkalophilus，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的多肽；或链霉菌属(Streptomyces)多肽，如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌或假单胞菌属(Pseudomonas)的多肽。
本发明的多肽可以是真菌多肽，更优选酵母多肽，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia多肽；更优选丝状真菌多肽如Acremonium、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、Talaromyces、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)多肽。
在一个优选实施方案中，该多肽是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)或Saccharomyces oviformis多肽。
在另一个优选实施方案中，该多肽是如下微生物的多肽：棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulphureum、Fusariumtorulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、Mucor miehei、Myceliophthorathermophila、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichodermakoningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichoderma viride)。
在另一个优选实施方案中，该多肽是Rhodothermus obamensis或海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)的多肽。
在一个更优选的实施方案中，该多肽是Rhodothermus obamensis多肽，最优选大肠杆菌DSM 12607中的质粒pT7Blue所包含的该序列编码区编码的多肽(见实施例1)，例如具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽。
应该理解，对于前面提及的物种，本发明既包括完全和不完全阶段，又包括其它分类学等同物，例如无性型，而不论它们被称为何种种名。本领域技术人员将容易识别出适合等同物。例如，Sako等在国际系统细菌学杂志(International Journal of Systematic Bacteriology)第46卷(4)第1099-1104页(1996)中定义了Rhodothermus obamensis的分类学等同物。
公众可容易地从许多培养物保藏中心获得这些物种的菌株，这些培养物保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSMZ)、日本微生物保藏中心(Japan Collection ofMicroorganisms)(JCM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究机构保藏中心(NRRL)。
而且，采用上述探针可以从其它来源，包括从自然环境(如土壤、堆肥、水等)分离的微生物，鉴定并获得这种多肽。从自然生活环境中分离微生物的技术是本领域熟知的。然后可通过对另一种微生物的基因组或cDNA文库的相似筛选获得该核酸序列。一旦用探针检测到编码多肽的核酸序列，即可利用本领域普通技术人员已知的技术(见例如Sambrook等，1989，同上)分离或克隆该序列。
正如本文所定义的，“分离的”多肽是基本上不含有其它非分支酶多肽的多肽，例如通过SDS-PAGE确定其具有至少约20％的纯度，优选至少约40％的纯度，更优选约60％的纯度，甚至更优选约80％的纯度，最优选约90％的纯度，甚至最优选约95％的纯度。
本发明核酸序列编码的多肽还包括另一个多肽被融合在该多肽或其片段的N端或C端的融合多肽或可切割的融合多肽。融合多肽可以通过将编码另一个多肽的核酸序列(或其部分)与本发明核酸序列(或其部分)融合来制备。制备融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接编码这些多肽的编码序列，以使它们符合阅读框并且使该融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和相同的终止子的控制之下。
核酸序列
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的核酸序列。在一个优选的实施方案中，该核酸序列是SEQ ID NO.1中所示的核酸序列。在另一个更优选的实施方案中，该核酸序列是大肠杆菌DSM 12607中的质粒pT7Blue所包含的该序列(见实施例1)。本发明还包括编码具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽的核酸序列，由于遗传密码的简并性该核酸序列不同于SEQ ID NO.1。本发明还涉及编码具有分支酶活性的SEQ ID NO.2片段的SEQ ID NO.1子序列。
SEQ ID NO.1的子序列是指SEQ ID NO.1所包含的核酸序列，只是已从5’和/或3’末端缺失了一个或多个核苷酸。
本发明还涉及在SEQ ID NO.1的多肽编码序列中含有至少一个突变的突变核酸序列，其中该突变核酸序列编码由SEQ ID NO.2氨基酸序列组成的多肽。
用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或它们的组合。从基因组DNA克隆本发明核酸序列可以通过例如采用实施例1中所示的熟知的聚合酶链式反应(PCR)、或采用抗体筛选表达文库以检测具有共同结构特征的克隆DNA片段来实现。见例如，Innis等，1990，PCR：方法和应用指南(PCR：A Guideto Methods and Application)，Academic Press，纽约。也可以使用其它核酸扩增方法如连接酶链式反应(LCR)、连接的激活转录(ligatedactivated transcription，LAT)和基于核酸序列的扩增(nucleic acidsequence-based amplification，NASBA)。该核酸序列可从红嗜热盐菌属(Rhodothermus)的株系或另一种生物或相关生物克隆，因此，可以是例如该核酸序列多肽编码区的等位变体或种的变体。
本文所用术语“分离的核酸序列”是指基本不含有其它核酸序列的核酸序列，如用琼脂糖电泳确定其具有至少约20％的纯度，优选至少约40％的纯度，更优选至少约60％的纯度，甚至更优选至少约80％的纯度，最优选至少约90％的纯度。例如，可以通过遗传工程中使用的标准克隆程序将该核酸序列从其天然位置重新安置到可以对其进行复制的不同位置上，获得分离的核酸序列。该克隆程序可能涉及：切割和分离包含该多肽编码核酸序列的期望核酸片段、将此片段插入载体分子中，和将该重组载体引入宿主细胞中以便在其中复制产生多个拷贝或克隆的该核酸序列。该核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源的，或它们的任意组合。
本发明还涉及与SEQ ID NO.1的成熟多肽编码序列(即第4到1863位核苷酸)具有至少约65％，优选约70％、优选约80％、更优选约90％、甚至更优选约95％、最优选约97％的同源性程度，并编码活性多肽的核酸序列。为了本发明的目的，两个核酸序列之间的同源性程度采用对于蛋白质和DNA比对均有用的完全Smith-Waterman比对来确定。对于蛋白质和DNA的比对分别采用默认计分矩阵BLOSUM50和同一性矩阵。空缺中第一个残基的罚分对于蛋白质是-12，对于DNA是-16；而空缺中额外残基的罚分对于蛋白质是-2，对于DNA是-4。比对可以采用FASTA软件包v20u6版进行(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“用于生物学序列分析的改良工具”，PNAS 85：2444-2448；和W.R.Pearson(1990)，“用FASTP和FASTA进行的快速灵敏序列比较”，酶学方法(Methods inEnzymology)，183：63-98)。
为了合成与本发明多肽基本相似的多肽，对编码该多肽的核酸序列进行修饰可能是必需的。术语与该多肽“基本相似”是指该多肽的非天然存在形式。这些多肽可以以某种被改造的方式与从其天然来源分离的多肽不同，如比活性、热稳定性或最适pH等不同的变体。可以基于作为SEQID NO.1的多肽编码部分的核酸序列如其子序列；和/或通过导入使得该核酸序列编码的多肽不产生另一种氨基酸序列、又符合用于生产所述酶的宿主生物密码子使用的核苷酸替代；或者通过导入可以造成不同氨基酸序列的核苷酸替代，构建该变体序列。对于核苷酸替代的一般描述，见例如Ford等1991，蛋白表达和纯化(Protein Expression andPurification)2：95-107。
本领域技术人员将明了，这些替代可以在对分子功能而言关键的区域之外产生，并仍导致活性多肽。可根据本领域已知的方法鉴定对于本发明分离核酸序列所编码多肽的活性必需的、并因此优选不进行替代的氨基酸残基，这些方法例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(alanine-scanningmutagenesis)(见例如Cunningham和Wells，1989，科学(Science)244：1081-1085)。在后面的这个技术中，在该分子的每个带正电荷残基的位置上引入突变，并检测所获突变分子的分支酶活性以鉴定对该分子活性而言关键的氨基酸残基。也可以通过分析核磁共振分析、晶体学或光亲和标记等技术所测定的三维结构来确定底物-酶相互作用的位点(见例如de Vos等，1992，科学255：306-312；Smith等，1992，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)。
本发明还涉及编码本发明多肽的分离核酸序列，这些序列可在极低严紧条件下、优选低严紧条件下、更优选中等严紧条件下、更优选中高严紧条件下、甚至更优选高严紧条件下、最优选极高严紧条件下与在相同条件下和SEQ ID NO.1的核酸序列或其互补链杂交的核酸探针杂交；或本文所定义的这些分离核酸序列的等位变体和子序列(Sambrook等，1989，见上)。
本发明还涉及通过如下步骤制备的分离的核酸序列：(a)在极低、低、中等、中高、高或极高的严紧条件下使DNA与(i)SEQ ID NO.1的核苷酸，(ii)在SEQ ID NO.1核苷酸中包含的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的子序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交；和(b)分离该核酸序列。所述子序列优选是至少100个核苷酸的序列，例如编码具有分支酶活性的多肽片段的序列。
制备突变核酸序列的方法
本发明还涉及制备突变核酸序列的方法，该方法包括向SEQ ID NO.1的多肽编码序列或其子序列中引入至少一个突变，其中该突变核酸序列编码由SEQ ID NO.2的氨基酸序列组成的多肽或其具有分支酶活性的片段。
可采用本发明领域已知的任何方法通过定点诱变实现向所述核酸序列引入突变，以将一个核苷酸更换成另一个核苷酸。尤其有用的方法是利用带有目的插入片段的超螺旋双链DNA载体和含有期望突变的两个合成引物的方法。这两个寡核苷酸引物每个均与载体相反链互补，在温度循环过程中依靠Pfu DNA聚合酶进行延伸。通过引物的掺入，产生含有交错切口的突变质粒。在温度循环之后，用对甲基化和半甲基化DNA特异的DpnI处理产物，以消化亲本DNA模板和选择含有突变的合成DNA。也可使用其它本领域已知的方法。
核酸结构
本发明还涉及含有与一个或多个控制序列可操作连接的本发明核酸序列的核酸结构，其中所述控制序列可在适合的宿主细胞中在与该控制序列相容的条件下指导编码序列的表达。表达应理解为包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
“核酸结构”在本文中定义为一种单链或双链核酸分子，该核酸分子可分离自天然存在的基因，或已被修饰而含有以天然不存在的方式联合和并置在一起的核酸片段。当核酸结构含有表达本发明编码序列所需的所有控制序列时，术语“核酸结构”与术语“表达盒”同义。术语“编码序列”在本文中定义为直接规定其蛋白产物的氨基酸序列的核酸序列。编码序列的界限一般由恰好位于mRNA 5’末端开放阅读框上游的核糖体结合位点(原核生物)或ATG起始密码子(真核生物)以及恰好位于mRNA 3’末端开放阅读框下游的转录终止子序列来确定。编码序列可以包括但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
可以通过多种方式操作编码本发明多肽的分离核酸序列，以便为该多肽的表达提供条件。依据表达载体，在核酸序列插入载体之前对其进行操作可能是期望的或是必需的。利用重组DNA方法修饰核酸序列的技术是本领域熟知的。
术语“控制序列”在本文中定义为包括所有对本发明多肽的表达必需或有利的成分。每个控制序列对于编码该多肽的核酸序列而言可以是自身的或是外源的。这些控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少地，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。控制序列可与接头一起提供以便引入特异的限制性位点，利于控制序列与编码多肽的核酸序列编码区连接。术语“可操作地连接”在本文中定义为一种构型，其中控制序列被适当地置于相对该DNA序列之编码序列的一个位置上以致该控制序列指导多肽的表达。
控制序列可以是适合的启动子序列，即由宿主细胞识别用于表达所述核酸序列的一种核酸序列。启动子序列含有介导该多肽表达的转录控制序列。启动子可以是任何在所选宿主细胞中表现出转录活性的核酸序列，包括突变的、截断的和杂合的启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
特别是在细菌宿主细胞中指导本发明核酸结构转录的适合启动子的例子是获自大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶(levansucrase)(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase)基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核生物的β内酰胺酶基因的启动子(Villa-Kamaroff等，1978，美国国家科学院院刊75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，美国国家科学院院刊80：21-25)。更多的启动子描述于《科学美国人》(Scientific American)中的“从重组细菌获得的有用蛋白质(Useful proteins from recombinahtbacteria)”，1980，242：74-94；和Sambrook等，1989，见上。
在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸结构转录的适合启动子的例子是获自米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)的基因的启动子，以及NA2-tpi启动子(黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因启动子的杂合物)，和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子可从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得。用于酵母宿主细胞的其它有用启动子描述于Romanos等，1992，酵母(Yeast)8：423-488。
该控制序列也可以是适当的转录终止子序列，即被宿主细胞识别以终止转录的序列。该终止子序列与编码所述多肽的核酸序列的3’末端可操作地连接。任何在所选宿主细胞中起作用的终止子都可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子可获自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
用于酵母宿主细胞的优选终止子可获自酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。用于酵母宿主细胞的其它有用的终止子描述于Romanos等，1992，同上。
该控制序列也可以是适当的前导序列，即一段对宿主细胞中的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列与编码所述多肽的核酸序列的5’端可操作地连接。任何在所选宿主细胞中有功能的前导序列都可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列可从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导序列可从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得。
该控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，即一种与所述核酸序列3’末端可操作地连接的、转录时被宿主细胞作为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基(polyadenosine residues)的信号而识别的序列。任何在所选宿主细胞中有作用的聚腺苷酸化序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列可从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因获得。
用于酵母宿主细胞的有用聚腺苷酸化序列描述于Guo和Sherman，1995，分子细胞生物学(Molecular Cellular Biology)15：5983-5990。
该控制序列还可以是编码与多肽氨基末端连接的氨基酸序列、并指导该编码多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。所述核酸序列编码区的5’末端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码该分泌多肽的编码区片段连接的信号肽编码区。或者，编码序列的5’末端可含有对该编码序列而言外源的信号肽编码区。在编码序列并不天然含有信号肽编码区时外源信号肽编码区可能是必需的。或者，为了增强该多肽的分泌，可以简单地用外源信号肽编码区替代天然信号肽编码区。然而，任何指导该表达多肽进入所选宿主细胞分泌途径的信号肽编码区均可用于本发明。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码区。更多的信号肽描述于Simonen和Palva，1993，微生物学评论(MicrobiologicalReviews)57：109-137。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因获得的信号肽编码区。
用于酵母宿主细胞的有用信号肽可以从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶(invertase)的基因获得。其它有用的信号肽编码区描述于Romanos等，1992，同上。
该控制序列还可以是编码位于多肽氨基端的氨基酸序列的前肽编码区。所获得的多肽被称为酶原(proenzyme)或多肽原(有时也叫酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的，但能通过前肽的催化切割或自身催化切割从多肽原转化成成熟活性多肽。该前肽编码区可从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶和Myceliophthorathermophila漆酶(WO 95/33836)的基因获得。
当多肽的氨基端同时存在信号肽和前肽区时，前肽区紧接位于多肽的氨基端，而信号肽区紧接位于前肽区的氨基端。
也可以期望加入允许相对于宿主细胞生长调节所述多肽表达的调节序列。调节系统的例子有那些使基因表达响应化学或物理刺激包括调节化合物的存在而打开或关闭的系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它例子是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些包括在氨甲蝶呤存在时扩增的二氢叶酸还原酶基因和在重金属存在时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码所述多肽的核酸序列将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及含有本发明核酸序列、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。可将以上描述的各种核酸和控制序列连接在一起产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个方便的限制性位点以允许在这些位点插入或替代编码该多肽的核酸序列。或者，可以通过将本发明的核酸序列或含有该序列的核酸结构插入适当的表达载体中来表达该核酸序列。在构建该表达载体时，将该编码序列定位于该载体中，以使该编码序列与适合的表达控制序列可操作地连接。
该重组表达载体可以是任何能够方便地用于重组DNA程序并能使该核酸序列表达的载体(如质粒或病毒)。典型地，载体的选择取决于载体和载体将要导入的宿主细胞之间的相容性。该载体可以是线性或闭合环状质粒。
该载体可以是自主复制型载体，即作为染色体外实体而存在、其复制独立于染色体复制的载体，如质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体。该载体可以含有任何保证自我复制的序列。或者，该载体可以是当导入宿主细胞后整合在基因组中并和它所整合的染色体一起复制的载体。而且，可使用单个载体或质粒，或一起含有待导入宿主细胞基因组中的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。
本发明载体优选含有一个或多个允许方便地选择转化细胞的选择标记。选择标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、相对营养缺陷型的原养型等的基因。细菌选择标记的例子是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的适当标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶(phosphinothricin acetyltransferase))、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶(sulfate adenyltransferase))、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)，以及它们的等同物。优选用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选包含允许该载体稳定整合至宿主细胞基因组中或允许该载体在该细胞中独立于基因组而自主复制的一个或多个元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码所述多肽的核酸序列或用于使该载体通过同源或非同源重组稳定整合至基因组中的任何其它载体元件。或者，该载体可以含有用于通过同源重组指导向宿主细胞基因组中整合的额外核酸序列。这些额外核酸序列使得该载体可以整合至宿主细胞基因组中一条或多条染色体的一个或多个精确位置上。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数目的与相应靶序列高度同源的核酸以增强同源重组的可能性，如100-1,500个碱基对，优选400-1,500个碱基对，最优选800-1,500个碱基对。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的靶序列同源的序列。而且，该整合元件可以是非编码或编码核酸序列。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合至宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，该载体可以进一步包含使载体能在所述宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的例子是允许在大肠杆菌中复制的pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184质粒的复制起点和允许在芽孢杆菌属中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1质粒的复制起点。用于酵母宿主细胞中的复制起点的例子是2μ复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。该复制起点可以含有使该复制起点的功能发挥在宿主细胞中具有温度敏感性的突变(见例如，Ehrlich，1978，美国国家科学院院刊75：1433)。
可在宿主细胞中插入一个以上拷贝的本发明核酸序列，以增加基因产物的产量。该核酸序列拷贝数的增加可以通过如下方法实现：在宿主细胞基因组中至少再整合一个额外拷贝的该序列；或在细胞中包括带有该核酸序列的可扩增选择标记基因，在适当选择剂存在时培养这些细胞，能够选出含有扩增拷贝的选择标记基因、因此也含有额外拷贝的该核酸序列的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(见例如，Sambrook等，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及含有本发明核酸序列的重组宿主细胞，这些细胞可以有利地用于该多肽的重组制备。将含有本发明核酸序列的载体导入宿主细胞中，以使该载体作为前面描述的染色体整合体或自我复制的染色体外载体而存在。术语“宿主细胞”包括任何由于复制过程中发生的突变而与亲代细胞不同的亲代细胞后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是单细胞微生物，如原核生物，或非单细胞微生物，如真核生物。
有用的单细胞细胞是细菌细胞，如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，如Bacillus alkalophilus、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属细胞，如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌和假单胞杆菌属的种。在一个优选实施方案中，该细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的细胞。在另一个优选实施方案中，该芽孢杆菌属细胞是嗜碱性的芽孢杆菌属细胞。
将载体导入至细菌宿主细胞可以通过例如如下方式来实现，即原生质体转化(见例如Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学(MolecularGeneral Genetics)168：111-115)、使用感受态细胞(见例如Young和Spizizin，1961，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志(Journalof Molecular Biology)56：209-221)、电穿孔(见例如Shigekawa和Dower，1988，生物技术(Biotechniques)6：742-751)或接合(见例如Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志169：5771-5278)。
该宿主细胞可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在一个优选的实施方案中，该宿主细胞是真菌细胞。本文所用“真菌”包括phyla Ascomycota，Basidiomycota，Chytridiomycota和Zygomycota(其定义见Hawksworth等，Ainsworth and Bisby’s Dictionaryof The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cabridge，UK)以及Oomycota(见Hawksworth等，1995，同上，等171页)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，见上)。
在一个更优选的实施方案中，该真菌宿主细胞是酵母细胞。这里所用“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担孢子(basidiosporogenous)酵母和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。因为酵母的分类将来可能改变，为了本发明的目的，酵母应按《酵母的生物学和活动》(Biology and Activitiesof Yeast)(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编著，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中的描述来定义。
在一个甚至更优选的实施方案中，该酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或Yarrowia细胞。
在一个最优选实施方案中，该酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母、诺地酵母或Saccharomyces oviformis细胞。在另一个最优选的实施方案中，该酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的实施方案中，该酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。
在另一个更优选的实施方案中，该真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和Oomycota的所有丝状类型(正如Hawksworth等，1995，见上，所定义的)。丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其它复合多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来进行的，碳代谢为专性需氧的。相反，酵母如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽来进行的，而且碳代谢可以通过发酵进行。
在一个甚至更优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是但不限于Acremonium、曲霉属、镰孢霉属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium或木霉属的种的细胞。
在一个最优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum细胞。在一个甚至最优选的实施方案中，该丝状真菌亲代细胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)细胞。在另一个最优选的实施方案中，该丝状真菌宿主细胞是Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米黑毛霉、Myceliophthorathermophila、粗糙脉孢菌、产紫青霉、Thielavia terrestris、Trichoderma harzianum、康宁木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉细胞。
可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本质上已知的方式来转化真菌细胞。用于转化曲霉属宿主细胞的适当程序描述于EP 238 023和Yelton等，1984，美国国家科学院院刊81：1470-1474。用于转化镰孢霉属的种的适当方法描述于Malardier等，1989，基因(Gene)78：147-156和WO 96/00787。酵母的转化可采用描述于如下文献中的方法进行：Becker和Guarente，由Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，酵母遗传学和分子生物学指南(Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，Academic Press，Inc.，纽约；Ito等，1983，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)153：163；和Hinnen等，1978，美国国家科学院院刊75：1920。
制备方法
本发明还涉及制备本发明多肽的方法，其包括(a)培养其野生型能产生该多肽的菌株；和(b)回收该多肽。优选地，该菌株是红嗜热盐菌属的，而且更优选是Rhodothermus obamensis。
本发明还涉及制备本发明多肽的方法，其包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收该多肽。
本发明还涉及制备本发明多肽的方法，其包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养宿主细胞，其中该宿主细胞含有在SEQ ID NO.1的成熟多肽编码区中具有至少一个突变的突变核酸序列，其中该突变核酸序列编码由SEQ ID NO.2的氨基酸组成的多肽；和(b)回收该多肽。
在本发明的制备方法中，采用本领域已知的方法在适于产生该多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可通过在适当培养基中、在允许该多肽表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、批式、补料分批或固态发酵)，来培养细胞。该培养在含有碳和氮源以及无机盐的适合营养培养基中采用本领域已知的程序进行。适合的培养基可从商业厂家获得，也可根据(如美国典型培养物保藏中心目录中的)公开的组成制备。如果该多肽分泌至营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。如果该多肽是不分泌的，则可从细胞裂解物中回收。
该多肽可采用该多肽特异的本领域已知方法来检测。这些检测方法可包括特异抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，可按本文所述使用酶方法确定该多肽的活性。
所获得的多肽可以通过本领域已知的方法回收。例如，可通过传统方法，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基中回收所述多肽。
本发明的多肽可通过本领域已知的多种方法来纯化，这些方法包括但不限于层析(如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻层析)、电泳方法(如制备型等电聚焦)、差异溶解度(如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(见例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden编著，VCH Publishers，纽约，1989)。
植物
本发明还涉及已被编码具有分支酶活性的本发明多肽的核酸序列转化以致可以以能回收的量表达和产生该多肽的转基因植物、植物部分或植物细胞。可以从该植物或植物部分回收该多肽。或者，可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改善食物或饲料的品质，如提高营养价值、可口性和流变性质，或破坏抗营养因子。
该转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的例子是草，如草地草(早熟禾属，Poa)，饲料草如羊茅属(festuca)，黑麦草，温带牧草(temperate grass)如剪股颖属(Agrostis)，和谷类植物，如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉米。
双子叶植物的例子是烟草，豆科植物，如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，和十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜、油籽油菜，和亲缘关系密切的模式生物拟南芥菜(Arabidopsisthaliana)。
植物部分的例子是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎。具体的植物组织如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也被认为是植物部分。而且，任何植物细胞，无论何种组织来源，均被认为是植物部分。
这些植物、植物部分和植物细胞的后代也包括在本发明的范围内。
表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可根据本领域已知方法构建。简而言之，该植物或植物细胞通过将一个或多个编码本发明多肽的表达结构引入植物宿主基因组，并将产生的修饰植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞来构建。
简便地讲，该表达结构是包含编码本发明多肽的核酸序列的核酸结构，其中该核酸序列与在所选植物或植物部分中表达该核酸序列所必需的适当调节序列可操作地连接。而且，该表达结构可包含对鉴定已整合了该表达结构的宿主细胞有用的选择标记，和将该结构导入至所述植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的DNA导入方法)。
调节序列如启动子和终止序列以及任选的信号或转移序列的选择取决于例如所期望的该多肽表达的时间、地点以及方式。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，而且该基因产物可被导向特定组织或植物部分如种子或叶。调节序列描述于例如Tague等，1988，植物生理学(PlantPhysiology)86：506。
对于组成型表达，可使用35S-CaMV启动子(Franck等，1980，细胞(Cell)21：285-294)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏沉积组织(storage sink tissue)如种子、马铃薯块茎和果实(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)的启动子，或来自代谢沉积组织如分生组织(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)的启动子，种子特异性启动子如稻的麦谷蛋白、谷醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白或清蛋白启动子(Wu等，1998，植物和细胞生理学(Plant and cellPhysiology)39：885-889)、来自蚕豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4和未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，植物生理学杂志152：708-711)、种子油体蛋白的启动子(Chen等，1998，植物和细胞生理学39：935-941)、Brassica napus的贮藏蛋白napA启动子、或任何其它本领域已知的种子特异性启动子，如WO 91/14772中所描述的。而且，该启动子可以是叶特异性启动子如稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，植物生理学102：991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)26：85-93)，或稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，分子和普通遗传学(Molecular and GeneralGenetics)248：668-674)，或创伤诱导型启动子如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，植物分子生物学22：573-588)。
也可使用启动子的增强子元件实现所述酶在植物中的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是位于该启动子和编码本发明多肽的核酸序列之间的内含子。例如，Xu等，1993，见上，公开了稻肌动蛋白1基因的第一个内含子在增强表达中的用途。
选择标记基因和所述表达结构的任何其它部分均可从本领域现有的选取。
根据本领域已知的传统技术，将所述核酸结构导入植物基因组中，这些技术包括农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、微粒轰击、生物轰击转化和电穿孔(Gasser等，1990，科学244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，自然(Nature)338：274)。
目前，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移是选择用于产生转基因双子叶植物的方法(综述见Hooykas和Schilperoort，1992，植物分子生物学19：15-38)。然而，它也可以用于转化单子叶植物，但是对这些植物通常优选其它转化方法。目前，选择用于产生转基因单子叶植物的方法是对胚胎愈伤组织或发育中的胚胎进行微粒轰击(包被了转化DNA的微型金或钨颗粒)(Christou，1992，植物杂志(Plant Journal)2：275-281；Shimamoto，1994，Currentopinion Biotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology10：668-674)。转化单子叶植物的另一个方法以原生质体转化为基础，这描述于Omirulleh等，1993，植物分子生物学21：415-428。
转化之后，根据本领域熟知的方法，选择其中已导入了所述表达结构的转化体并将其再生成全株。
本发明还涉及制备本发明多肽的方法，其包括(a)在有益于产生该多肽的条件下，培养转基因植物或植物细胞，其中该转基因植物或植物细胞含有编码具有分支酶活性的本发明多肽的核酸序列；和(b)回收该多肽。
组合物
再一方面，本发明涉及含有本发明多肽的组合物。优选地，该组合物富集了本发明多肽。在本文中，术语“富集”指该组合物的分支酶活性按例如1.1的富集因子增加。
该组合物可以含有本发明的多肽作为主要的酶成分，例如单一成分组合物。或者，该组合物可以含有多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、盐过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶(invertase)、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶溶酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转移酶(transglutaminase)或木聚糖酶。
该多肽组合物可以根据本领域的已知方法制备，而且其形式可以是液体组合物或干组合物。例如，该多肽组合物可以是颗粒形式，或微颗粒形式。可以根据本领域的已知方法稳定包括在该组合物中的多肽。
以下给出了关于本发明多肽组合物优选用途的实例。本发明多肽组合物的剂量和该组合物使用的其它情况可以基于本领域已知的方法确定。
去污剂组合物
可以将本发明的分支酶加入去污剂组合物中，并因此成为去污剂组合物的一个成分。
本发明的去污剂组合物可以例如配制成其中包括了适用于污染的纺织物预处理的洗涤添加组合物以及加入了织物软化剂的漂洗组合物的手洗或机洗洗衣去污剂组合物，或配制成用于一般家用硬表面清洁操作的去污剂组合物，或配制成用于餐具的手洗或机洗操作的去污剂组合物。
在一个具体方面，本发明提供含有本发明分支酶的去污添加剂。该去污添加剂以及该去污剂组合物可以含有一或多种其它酶例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或过氧化物酶。
通常，所选酶的性质应与所选的去污剂相适应，(即最适pH、与其它的酶和非酶成分的兼容性，等等)，并且该一种或多种酶应当以有效的量存在。
蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源的蛋白酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。该蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选微生物的碱性蛋白酶，或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶；尤其是来自芽胞杆菌属的枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶Novo，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的胰蛋白酶)和描述于WO 89/06270和WO 94/25583中的镰孢霉属蛋白酶。
有用的蛋白酶的例子是描述于WO 92/19729、WO 98/20115、WO98/20116和WO 98/34946中的变体，尤其是在一个或多个下列位置发生了替代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
优选的商业上可获得的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、和KannaseTM(Novo Nordisk A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、PurafectOxPTM、FN2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。有用的脂肪酶的例子包括来自腐质霉属(同义词Thermomyces)的脂肪酶，例如EP 258 068和EP 305 216中描述的来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶、或WO 96/13580中描述的来自H.insolens的脂肪酶；假单胞菌属(Pseudomonas)的脂肪酶例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP331 376)、司徒茨氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属的菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶；芽胞杆菌属脂肪酶例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993)，Biochemica etBiophysica Acta，1131，253-360)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。
其它例子包括例如描述于WO 92/05249、WO 94/01541、EP407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中的脂肪酶变体。
优选的商业上可获得的脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM和LipomaxTM(Novo Nordisk A/S)。
淀粉酶：适合的(α和/或β)淀粉酶包括细菌或真菌来源的淀粉酶。化学修饰的突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。淀粉酶包括，例如，从芽胞杆菌属例如地衣芽孢杆菌的特定菌株中获得的α-淀粉酶，更详细的描述在GB 1,296,839中。
有用的淀粉酶的例子是描述于WO 94/02597、WO94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中的变体，尤其是在一个或多个下列位置发生了替代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
商业上可获得的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(Novo Nordisk A/s)、RapidaseTM和PurastarTM(来自GenencorInternational Inc.)。
纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如由Humicola insolens、Myceliophthorathermophila和尖镰孢产生的真菌纤维素酶，它们公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259。
特别适合的纤维素酶是具有护色功能的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的例子是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其它例子有例如描述于WO94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中的纤维素酶变体。
商业上可获得的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(NovoNordisk A/S)，ClazinaseTM和Puradax HATM(Genencor InternationalInc.)，以及KAC-500(B)TM(Kao公司)。
过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。化学修饰突变体或蛋白质工程突变体也包括在内。有用的过氧化物酶的例子包括来自鬼伞菌属(Coprinus)的过氧化物酶，例如来自灰盖鬼伞(C.Cinereus)的过氧化物酶，和WO93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所描述的它的变体。
商业上可获得的过氧化物酶包括GuardzymeTM(Novo Nordisk A/S)。
可以通过加入含有一或多种酶的独立添加剂，或通过加入含有所有这些酶的组合添加剂，将所述的一种或多种去污剂酶包含在去污剂组合物中。本发明的去污剂添加剂即独立添加剂或组合添加剂，可以被配制成例如颗粒、液体或浆液等等。优选的去污剂添加剂制品是颗粒，尤其是非起尘(non-dusting)颗粒，液体，尤其是稳定的液体，或浆液。
非起尘颗粒可以按例如US 4,106,991和4,661,452中所公开的方法制备，并且可以任选地通过本领域已知方法进行包被。蜡样包被材料的例子是平均分子量为1000到20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚(ethoxylatednonylphenol)；其中醇含有12到20个碳原子并且其中具有15到80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单、二和三甘油酯。适于通过流化床技术应用的薄膜形成包被材料的例子见GB 1483591。液体酶制品可以根据已有技术通过例如加入多元醇例如丙二醇、糖或糖醇，乳酸或硼酸来稳定。可以根据EP 238,216中公开的方法制备受保护的酶。
本发明的去污剂组合物可以是任何方便的形式例如条形、片剂、粉剂、颗粒、糊剂或液体。液体去污剂可以是水性的，典型地含有高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或非水性的。
该去污剂组合物含有一或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子包括半极性表面活性剂，和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。这些表面活性剂典型地按重量计以0.1％到60％的水平存在。
当被包括在内时，该去污剂通常含有大约1％到大约40％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐、α-烯基磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲基酯，烷基-或烯基丁二酸或肥皂。
当被包括在内时，该去污剂通常含有大约0.2％到大约40％的非离子表面活性剂例如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、聚羟基烷基脂肪酸酰胺，或氨基葡糖(“葡糖酰胺”)的N-酰基N-烷基衍生物。
该去污剂可以含有0-65％的洗涤助剂或络合剂例如沸石，二磷酸盐，三磷酸盐，膦酸酯，碳酸盐，柠檬酸盐，次氮基三乙酸，乙二胺四乙酸，二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基丁二酸、可溶性硅酸盐或分层的硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。
该去污剂可以包含一或多种聚合物。例子有羧甲基纤维素，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡啶-N-氧化物)，聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯，马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基异丁烯酸/丙烯酸共聚物。
该去污剂可以含有漂白体系，该漂白体系可以包括H2O2来源物质例如过硼酸盐或过碳酸盐，并且可以与形成过酸的漂白活化剂例如四乙酰乙二胺或壬酰羟苯磺酸盐结合。或者，该漂白体系可以含有例如酰胺、酰亚胺或砜类的过氧酸。
本发明去污剂组合物中的酶可以通过使用常规稳定剂来稳定，例如多元醇例如丙二醇或丙三醇，糖或糖醇，乳酸，硼酸，或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，并且该组合物可以按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述的方法配制。
该去污剂还可以含有其它常规去污成分，例如包括粘土在内的织物调理剂、发泡增效剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、光漂白剂、增溶剂、晦暗抑制剂或香料。
目前正在设想，在该去污剂组合物中可以加入任何酶，尤其是本发明的分支酶，其加入量相当于每升洗涤液中加入0.01-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液中加入0.05-5mg酶蛋白，尤其是每升洗涤液中加入0.1-1mg酶蛋白。
此外还可以将本发明的分支酶加入WO 97/07202中所公开的去污剂制品中，其中WO 97/07202在此以参考文献方式并入。
用途
本发明还指向具有分支酶活性的多肽的使用方法。例如，可以将本发明多肽用于淀粉或含有淀粉的材料的改性，以便改善这些材料的性质。
可以用BE进行改性的材料的例子包括所有类型的天然淀粉(未改性的)(马铃薯、玉米、小麦)、蜡质淀粉、高直链淀粉含量的淀粉、直链淀粉、支链淀粉、化学改性淀粉包括糊精、转化淀粉、交联淀粉(二淀粉磷酸)、淀粉醚、和淀粉酯(淀粉乙酸酯、羟烷基化淀粉、辛烯基-琥珀酸淀粉)。
本发明BE在上述淀粉样材料的改性中是有用的，可以例如在US 4 454161中所公开的诸如食物和饮料组合物的食品、食物添加剂组合物、药物制剂、上浆剂、粘合剂等的制备中，使这些改性材料更好地适合于它们的预期目的。通常经BE改性的淀粉材料比未改性淀粉具有高溶解性、低粘度和较慢的老化趋势。可以用这些性质来改善从淀粉样材料制备的食品的性质，尤其是这些产品的储存稳定性。食品的例子有：面包、甜食、蛋糕、点心、面条和面食、婴儿食品、运动饮料、冷冻或冷藏的加工食品、和宠物食品。可以在加入食品之前独立地对淀粉样材料进行酶学改性，或通过在烹饪之前或烹饪之后立即将该酶加入食物材料中以便在食物中直接对淀粉样材料进行改性。
对于纸的表面上浆剂和涂层，所用淀粉溶液的高溶解性、低粘度和良好的稳定性是非常重要的，这使得相关的BE改性淀粉可以用于这些应用中，见EP 0 690 170所示。
本发明进一步通过以下实施例进行描述，这些实施例不应理解为是对本发明范围的限制。
实施例1
材料和方法
Rhodothermus obamensis(JCM 9785)获自日本微生物保藏中心(Japan Collection of Microorganisms)，物理化学研究所(TheInstitute of Physical and Chemical Research)，Wako，Saitama351-0198，日本。
分子克隆技术描述于J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，Cold Spring Harbor，纽约。
采用了以下商业质粒/载体：
pT7Blue(Invitrogen，荷兰)
pBluescript SK(-)(Stratagen，美国)
pBAD/Myc-HisA(Invitrogen，荷兰)。
以下菌株用于转化和蛋白质表达：
TOP10大肠杆菌(Invitrogen，荷兰)
大肠杆菌DH12S(GIBCO BRL，Life Technologies，美国)
SB生长培养基(DIFCO#0123-17-3)由以下物质组成：
胰蛋白胨/蛋白胨，32g/l；
酵母提取物，20g/l；
NaCl，5g/l；
5N NaOH，1ml/l。
用作缓冲液和底物的化学制品是至少试剂级别的商业产品。
分支酶活性
根据Takata等(应用和环境微生物学(Applied and EnviromentalMicrobiology)(1994)，第3097页，(分析A))所述步骤的修改版本，确定BE活性：
50μl酶溶液与50μl底物溶液混合，然后在测试温度下孵育30分钟。该底物溶液是溶解在0.1M Tris缓冲液中的0.1％III型直链淀粉。通过加入2ml碘试剂终止该反应。通过如下方式每天制备碘试剂：将0.5ml贮存液(10ml水中0.26g I2和2.6g KI)与0.5ml 1N HCl混合并稀释至130ml。将该混合物室温下孵育15分钟以稳定颜色。在A660测量测试样品和其中用水取代了细胞提取物的对照样品之间的活性差异。1个单位分支酶活性定义为60℃、pH7.0时每分钟能够降低该直链淀粉-碘复合物的A660值1％的酶量。
R.obamensis glgB探针的制备
(基于报道的细菌glgB序列的比对)设计并制备引物a)(SEQ ID NO：3)和b)(SEQ ID NO：4)，将其和来自Rhodothermus obamensis的基因组DNA一起用于聚合酶链式反应。
SEQ ID NO：3，PCR引物a)(正向)：
5’-GAGCACCCCYTCGACGGCAGTTGG-3’
SEQ ID NO：4，PCR引物b)(反向)：
5’-CATCCAICCWAKRTTCCA-3’
I＝次黄苷
K＝G或T
R＝A或G
W＝A或T
Y＝C或T
将反应成分混合(1×缓冲液(Roche Diagnostics，日本)中基因组DNA，0.1ng/μl；dNTPs，各0.125mM；Mg2+，2.5mM；引物，各2pM；Taq聚合酶，0.025U/μl)，并按如下条件进行PCR：
  步骤   温度   时间
  1   94℃   5分钟
  2   50℃   45秒
  3   72℃   1分钟
  4   94℃   45秒
  5   50℃   45秒
  6   72℃   1分钟
  7   4℃   无期限
表1.步骤4-步骤6重复30次。
在琼脂糖凝胶上分离该PCR反应混合物，并从大肠杆菌glgB序列数据计算出该扩增的glgB PCR片段的预期大小，结果大约为580bp。用QIAquick(QIAGEN，日本)凝胶纯化这些片段，然后采用Takara的连接试剂盒版本2(Takara，日本)将其连接在pT7Blue载体中。用酚/氯仿纯化该连接混合物，然后通过电穿孔转化大肠杆菌DH12S。通过限制性酶切从所获得的转化体检查质粒(pMSra8)，以验证该Rhodothermusobamensis glgB插入片段的大小。
R.obamensis glgB基因的克隆
采用pMSra8的该插入片段作为R.obamensis glgB的探针，在消化过的R.obamensis基因组DNA上进行Southern杂交，以便选择用于产生亚克隆的方便限制性酶。3.5kb的杂交BamHI片段被选择用于glgB亚克隆。因此，用BamHI消化R.obamensis的基因组DNA，从琼脂糖凝胶上切下经大小分级分离的DNA，并将其克隆至pBluescript SK(-)中。通过用该连接克隆转化大肠杆菌DH12S细胞，产生BamHI亚文库。采用Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia Biotech，日本)，在BamHI亚文库的转化体上进行菌落转移，然后与DIG标记的R.obamensis glgB探针进行杂交。挑取阳性菌落，通过PCR检查插入片段。从所选菌落制备质粒并测序，结果显示该3.5kb BamHI片段缺失了glgB的5’端(pMSra10)。因此，从KpnI和SalI双消化的R.obamensis glgB基因组DNA制备另一个亚文库，用该R.obamensis glgB探针对其进行筛选，以回收R.obamensis glgB的5’端(pMSra29)。从pMSra10和pMSra29获得glgB结构的完整序列，从该序列设计用于扩增该完整glgB基因的PCR引物(SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6)。
表达载体的构建
采用分别包括了BspHI和HindIII限制性酶位点的引物c)(SEQ IDNO：5)和d)(SEQ ID NO：6)，从Rhodothermus obamensis的基因组DNA PCR扩增该完整的glgB基因(为了避免PCR反应过程中的突变，采用Boehringer Mannheim的Expand High Fidelity)。用BspHI和HindIII切割该PCR扩增片段，以允许定向地将其克隆在NcoI和HindIII消化的pBAD/Myc-HisA载体中。转化TOP10大肠杆菌并用阿拉伯糖诱导后，所获的pMSra33载体产生R.obamensis的BE。
SEQ ID NO：5，引物c)；用于扩增Rhodothermus obamensis glgB基因的PCR引物(正向)。带下划线的核苷酸引入BspHI位点：
5’-TTCC TCATGAGCTGGCTCACGGAAGAAGACA-3’
SEQ ID NO：6，引物d)；用于扩增Rhodothermus obamensis glgB基因的PCR引物(反向)。带下划线的核苷酸引入HindIII位点：
5’-GTTTA AAGCTTTTCAGGACGGCTACC-3’
生物学保藏DSM 12607
还将带有完整Rhodothermus obamensis glgB基因(SEQ ID NO：1)的质粒pT7Blue转化至大肠杆菌DH12S中，保藏在DSMZ作为DSM 12607(描述在生物学材料的保藏中)。
蛋白质表达
在pMSra33转化的TOP10大肠杆菌菌株中异源表达R.obamensis的BE。在含有100μg/ml氨苄青霉素的SB培养基中28℃过夜孵育该大肠杆菌细胞。加入0.0002％阿拉伯糖用于诱导表达。通过离心沉淀细胞，并将其重悬在20mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)。缓冲液的量相应于培养基的1/20。然后超声破碎细胞，并通过离心除去碎片。
除去大肠杆菌的内源性淀粉水解活性
通过去除大肠杆菌提取物中的所有内源性淀粉水解活性，即可采用碘方法(Takata等，应用和环境微生物学(1994)，第3097页)检测表达的BE活性。因此，对带有pBAD/Myc-HisA载体但不含glgB插入片段的宿主大肠杆菌菌株(阴性对照)，测试是否能够采用热处理除去其内源性淀粉水解活性。结果显示，60℃/2分钟处理足以热处死背景淀粉水解活性，即采用Takata等所述的直链淀粉分析测量时没有检测到活性。
R.obamensis BE变体Y397C+L419P的部分纯化
对表达的R.obamensis BE进行测序，结果显示与SEQ ID NO：2的成熟氨基酸序列比较在PCR过程中引入了两个变化：
a)Tyr397变为Cys397
b)Leu419变为Pro419。
该BE变体在下文中称作“Y397C+L419P”。
通过离子交换和羟基磷灰石柱层析，部分纯化大肠杆菌表达的带有替代Y397C+L419P的R.obamensis BE。对经热处理的细胞提取物进行透析并施加于Super-Q Toyopeal(22mm×200mm，TOSOH)上，然后用50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中的0-0.6M NaCl线性梯度进行洗脱。收集具有分支酶活性的组分，并施加在I型Macro-prep Ceramic羟基磷灰石(14mm×100mm，BioRad)上，然后用5-400mM磷酸钠(pH 6.5)梯度进行洗脱。收集表现出活性的组分。在用考马斯亮兰染色的SDS-PAGE上其表现出一条主带和几条弱带。
分支键的形成
通过分支键分析(BL分析，Takeda等，糖研究(CarbohydrateResearch)，240，253-260(1993))的修改版本，验证α-1，6-分支键的形成。所用底物是溶解在100mM Tris-HCl(pH 7.5)中的0.5％III型直链淀粉(Sigma)。将该底物(90μl)和酶溶液(10μl)混合，并60℃孵育30分钟，然后通过煮沸4分钟终止该反应。加入10μl 1M乙酸盐缓冲液(pH 4.1)后，向反应混合物中加入或5μl异淀粉酶(1mg/ml，Hayashibara Co.Ltd.)或5μl去离子水。将其于45℃孵育45分钟。然后在该反应溶液中加入460μl冰冷的乙醇，置于冰上10分钟。12,000rpm离心5分钟收获沉淀的糖类，并进行一次真空干燥，然后将其再次溶解在8μl 1N NaOH和292μl去离子水中。采用修改的3，5-二硝基水杨酸(dinitrosalycylic acid)(DNS)方法(Luchsinger和Cornesky，1962)，测量该溶液的还原能力。DNS溶液的制备方式是：将0.05g 3，5-二硝基水杨酸首先溶解在10ml 2N NaOH中，然后向该溶液中加入3g Rochelle盐，最后用去离子水将总体积调节至15ml。将样品溶液(0.2-0.3ml)与0.4ml DNS溶液混合并煮沸5分钟。流水冷却后，在该反应化合物中加入1.8ml水，并测量525nm处的光吸收。估计还原末端的量等价于葡萄糖的量。采用Y397C+L419P的部分纯化样品测量分支键的形成。按表5所示，用异淀粉酶处理产生还原末端，这指示由Y397C+L419P形成了α-1，6-分支键。
  实验序号   异淀粉酶处理  还原末端(μmol)
  实验1   +  0.43
  无  0
  实验2   +  0.17
  无  0.04
表2。
实施例2
温度和pH对BE变体Y397C+L419P的影响
评价BE变体Y397C+L419P(描述于实施例1中)的最适温度和pH。
用于BE活性测量的分析试验按材料和方法中的所述进行。为了避免来自表达R.obamensis BE的大肠杆菌的内源性淀粉水解活性，将细胞提取物在60℃预处理至少20分钟，并通过离心去除碎片。然后将该预处理细胞提取物用于分析试验并分析BE活性。
在最适pH分析试验中，采用不同的缓冲液制备底物溶液：
pH＜4            0.1M柠檬酸钠
4＜pH＜6         0.1M乙酸钠
6＜pH＜10        0.1M Tris
pH＞10           0.1M glysyl甘氨酸。
在指定温度、pH7.0时孵育酶(Y397C+L419P)30分钟。按以上所述测量分支酶活性。这些实验至少重复进行3次；以下表2和表3中显示了平均值和标准差。
该数据显示Y397C+L419P的最适温度为大约65℃。
  温度(℃)   相对活性(％)Y397C+L419P
  30   39+/-4
  40   61+/-3
  50   64+/-8
  55   93+/-4
  60   93+/-4
  65   97+/-3
  68   94+/-4
  70   78+/-3
  72   57+/-2
  75   54+/-7
  80   12+/-6
  90   9+/-3
表3
  温度(℃)   剩余活性(％)Y397C+L419P
  60   99+/-1
  65   100+/-0
  70   103+/-3
  75   82+/-1
  80   2+/-3
  85   2+/-3
  90   ND
表4
在60℃进行pH活性实验，并将酶孵育30分钟。这些实验至少重复进行3次；下表4显示了平均值和标准差。该数据说明，Y397C+L419P具有大约pH5-大约pH8的广泛最适pH。
  pH   相对活性(％)Y397C+L419P
  5.3   43+/-3
  6.3   91+/-1
  6.7   98+/-3
  7.6   73+/-3
  9.0   21+/-1
  9.3   15+/-2
表5.
实施例3
通过BE变体Y397C+L419P制备环化糊精
在Tris-HCl缓冲液(pH7)中于50℃用(400单位/g淀粉)带有Y397C+L419P替代的R.obamensis BE(描述于实施例1)处理水稻的支链淀粉(Motyl B，Shimada Chemical，日本)。通过15,000rpm离心10分钟去除碎片后，在该溶液中加入2倍体积的乙醇，然后回收并干燥沉淀的糊精。从100g水稻支链淀粉获得大约67g糊精。如果分子内分支键是通过酶处理产生的，则应获得耐受葡糖淀粉酶的环化糊精。于pH4.1、40℃用1500单位葡糖淀粉酶(Rhizopus sp.Wako Pure Chemicals，日本)处理1g上述糊精18个小时，然后通过乙醇回收所产生的糊精。获得大约200mg糊精。当存在酸性α-淀粉酶时进行处理，没有获得糊精。再次仅用葡糖淀粉酶(0.9单位/g糊精)或用葡糖淀粉酶和异淀粉酶(分别为每g糊精0.9单位和29单位)的组合，于pH4.5、40℃处理葡糖淀粉酶抗性糊精16个小时。结果，单独采用葡糖淀粉酶回收了90％的糊精，而在存在异淀粉酶时处理后仅保留10％的糊精。这说明该环化糊精是通过Y397C+L419P催化产生的分子内α-1，6分支键形成的。
实施例4
R.obamensis在曲霉属中的表达
宿主生物
米曲霉BECh2描述于丹麦专利申请PA 1999 01726中。它是JaL228(描述于WO98/123000)的突变体，而JaL228是IFO4177的突变体。
米曲霉的转化
将米曲霉菌株BECh2接种在100ml YPG培养基中，并于80rpm振荡下32℃孵育16个小时。通过过滤收集成熟菌丝体，之后用0.6M KCl进行洗涤并重新悬浮在含有30μl/ml Glucanex(可从Novo Nordisk)的30ml 0.6M KCl中。在60rpm振荡下32℃孵育该混合物，直到形成原生质体。在过滤除去剩余的菌丝体之后，通过离心收集原生质体，并用STC缓冲液洗涤两次。用血细胞计数器计数这些原生质体，并重悬在STC∶STPC∶DMSO(8∶2∶0.1)溶液中，终浓度为1.2×107个原生质体/ml。在100μl原生质体溶液中加入大约4μg DNA，轻柔混合并于冰上孵育30分钟。在该混合物中加入1μl STPC缓冲液，然后于37℃再孵育30分钟。加入50℃预热的10ml Cove顶层琼脂糖后，将该反应缓和物铺在COVE琼脂板上。将这些平板在32℃孵育5天，或直到转化体出现。
培养基和缓冲溶液
COVE：每升342.3g蔗糖、20ml COVE盐溶液、10ml 1M乙酰胺、15mM CsCl2、30g纯净琼脂(Difco)
COVE盐溶液：每升26g KCl、26g MgSO4·7H2O、76g KH2PO4、50ml COVE痕量金属。
COVE痕量金属溶液：每升0.04g NaB4O7·10H2O、0.4g CuSO4·5H2O、1.2gFeSO4·7H2O、0.7g MnSO4·H2O、0.7g Na2MoO2·2H2O、0.7g ZnSO4·7H2O。
AMG痕量金属：每升14.3g ZnSO4·7H2O、2.5g CuSO4·5H2O、0.5g NiCl2、13.8g FeSO4、8.5g MnSO4、3.0g柠檬酸。
YPG：每升4g酵母提取物、1g KH2PO4、0.5g MnSO4·7H2O、5g葡萄糖，pH 6.0。
STC：0.8M山梨糖醇、25mM Tris pH 8、25mM CaCl2。
STPC：STC缓冲液中的40％PEG 4000。
Cove顶层琼脂糖：每升342.3g蔗糖、20ml COVE盐溶液、10mM乙酰胺、10g低熔点琼脂糖。
MS-9：每升30g大豆粉、20g甘油、pH 6.0。
MDU-2Bp：每升45g麦芽糖·1H2O、7g酵母提取物、12g KH2PO4、1gMgSO4·7H2O、2g K2SO4、5g尿素、1g NaCl、0.5ml AMG痕量金属溶液，pH 5.0。
SDS-PAGE和Western印迹
采用商业化凝胶PAGEL AE6000NPU-7.5L(7.5T％)和AE-6400装置(Atto，日本)，按所提供的程序进行SDS聚丙烯酰胺电泳。采用AE-6677水平印迹装置(Atto，日本)将凝胶上分离的蛋白质转移至Clear印迹膜-P AE-6665(Atto，日本)上。蛋白质的检测采用Immuno Blot Assay试剂盒(BioRad)。
构建用于曲霉属的R.obamensis glgB表达质粒
采用引物对a)和b)、或a)和c)从R.obamensis基因组DNA扩增R.obamensis glgB基因，以在各末端引入限制性酶位点BglII和XhoI。引物c)在glgB的C端给出c-myc表位序列，该序列包含Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu。
a)5’-GAAGATCTAT GAGCTGGCTC ACGGAAGAAG ACATCCGGCG CTGGGAAA-3’
b)5’-CCGCTCGAGC TACCCGTGCT CCGGCTCCAG GATGAGGGCG GCCA-3’
c)5’-CCGCTCGAGC TACAGGTCCT CTTCGGAGAT GAGCTTCTGC TCCCCGTGCT
  CCGGCTCCAG GATGAGGGCG GCCA-3’
在所给的缓冲液中混合反应成分，即40ng R.obamensis染色体DNA、每种引物各300pmol、0.2mM dNTPs和ExpandTM High Fidelity PCR系统的2.6个单位DNA聚合物(Boehringer)，然后按如下条件进行PCR。
  步骤   温度   时间
  1   94℃   2分钟
  2   94℃   15秒
  3   55℃   30秒
  4   72℃   90秒
  5   94℃   15秒
  6   55℃   30秒
  7   72℃   90+20秒/循环
  8   72℃   7分钟
表6.步骤2-步骤4重复10次，步骤5-步骤7重复20次。
采用QIA凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化该扩增的1.9kb片段，经BglII和XhoI消化后，将其连接在BamHI和XhoI消化的pCaHj483中。质粒pCaHj483具有黑曲霉中性淀粉酶的启动子、构巢曲霉的TPI前导序列、黑曲霉葡糖淀粉酶的终止子和作为标记的构巢曲霉amdS基因。采用a)和b)引物对获得的质粒命名为pIH28，而用a)和c)引物对获得的质粒命名为pIH29。
R.obamensis glgB在米曲霉中的表达
用NotI消化表达质粒pIH28和pIH29，然后所获的6kb含有R.obamensis glgB表达盒的片段用QIA凝胶提取试剂盒进行纯化。用各片段转化米曲霉BECh2，然后分离选择的阳性转化体。将转化体接种在含有100ml MS-9的500ml摇瓶中，32℃培养1天，然后将各培养物3ml转移至含有100ml MDU-2Bp的摇瓶中，32℃培养2-3天。3500rpm离心15分钟收获生长细胞。将大约0.1g的收集细胞悬浮在100μl 2倍浓度的样品上样缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 6.8)、200mM二硫苏糖醇、4％SDS、0.2％溴酚兰和20％甘油)中，煮沸5分钟。14000rpm离心5分钟后，将10μl上清液施用于聚丙烯酰胺凝胶上，在电泳缓冲液(25mM Tris，0.1％SDS，192mM甘氨酸)中以每块凝胶20mA进行电泳。获得的凝胶用考马斯亮兰染色。阳性转化体表现出72kDa预期大小的R.obamensis glgB蛋白条带。采用抗myc抗体(Invitrogen)作为一抗而抗鼠IgG(Sigma)作为二抗，对带有c-myc标记的转化体提取物的电泳凝胶进行western印迹。在相应于72kDa的位置获得了阳性信号。
实施例5
R.obamensis BE分析以及温度和pH的影响
为了失活宿主菌株的内源性淀粉酶活性，将细胞提取物在65℃加热30分钟。按前述方法测量活性。
在65℃测量pH活性分布图，在pH7获得温度活性分布图。重复进行这些实验2次或3次，以下显示了平均值和标准差。
测量不带c-myc标记的R.obamensis BE的温度稳定性；将含有30-50单位/ml的酶溶液(pH7)在不同的温度下孵育30分钟，然后测量剩余的分支酶活性。
该数据显示，R.obamensis BE的最适pH和最适温度分别是大约pH 7和65℃。c-myc标记的存在并不影响该pH和温度分布图。
  pH   相对活性(％)BE1-5(有/无myc标记)   相对活性(％)BBe28(有标记)
  2.4   8+/-1   6+/-2
  3.0   7+/-2   7+/-2
  4.0   10+/-1   8+/-1
  5.2   74+/-8   67+/-1
  6.3   87+/-2   77+/-5
  7.1   97+/-1   97+/-3
  7.8   93+/-1   89+/-4
  8.6   88+/-1   81+/-1
  9.5   83+/-4   75+/-1
  10.6   12+/-2   16+/-1
表7.
  温度(℃)   相对活性(％)BE1-5(有/无myc标记)   相对活性(％)BBe28(有标记)
  30   4+/-1   1+/-4
  40   11+/-1   6+/-1
  50   35+/-1   24+/-0
  55   60+/-5   50+/-0
  60   80+/-1   71+/-1
  63   92+/-3   88+/-2
  65   96+/-4   94+/-4
  68   93+/-3   90+/-4
  70   87+/-2   86+/-1
  73   75+/-1   73+/-2
  75   59+/-5   59+/-2
  80   17+/-1   12+/-2
表8.
  温度(℃)   剩余活性(％)R.obamensis BE
  60   95+/-5
  65   95+/-5
  70   88+/-3
  75   91+/-3
  80   91+/-2
  85   83+/-1
  90   13+/-3
表9.
生物材料的保藏
含有插入在质粒pT7Blue中的Rhodothermus obamensis BE基因的大肠杆菌克隆(实施例1)已根据布达佩斯条约，保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，并给予了如下保藏号：
保藏物          保藏号              保藏日期
NN049443        DSM 12607           1998年12月23日
这些菌株在如下条件下保藏，即确保在本专利申请未决期间由专利和商标局局长依照37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授权的人可获得该培养物。该保藏物代表该保藏菌株基本上纯的培养物。如果在本主题申请的等同申请或其派生申请提出的国家该外国专利法要求，可以获得该保藏物。但是，应当理解，可获得保藏物并不构成以损失政府法令所授予专利权利而实施本主题发明的许可。
本文描述和要求保护的本发明的范围并不被本文公开的具体实施方案限制，因为这些实施方案旨在用作本发明几个方面的举例说明。任何等同的实施方案都包括在本发明的范围中。实际上，从前面的描述来看，除了本文给出和描述的之外本发明的各种修改将为本领域技术人员所明了。这些修改也包括在所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，包括定义在内的本公开将优先。
本文引用了各种参考文献，它们的公开以参考文献的方式完整地并入本文。
                                      序列表
<110>Novo Nordisk A/S
<120>具有分支酶活性的多肽及其编码核酸
<130>Rhodothermus obamensis BE
<140>
<141>
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1866
<212>DNA
<213>Rhodothermus obamensis
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1866)
<220>
<221>成熟肽
<222>(4)..(1863)
<400>1
atg agc tgg ctc acg gaa gaa gac atc cgg cgc tgg gaa agc ggt acg    48
Met Ser Trp Leu Thr Glu Glu Asp Ile Arg Arg Trp Glu Ser Gly Thr
 -1   1               5              10                      15
ttc tac gac agt tac cga aag ctg ggc gcc cat ccc gac gac gaa ggc    96
Phe Tyr Asp Ser Tyr Arg Lys Leu Gly Ala His Pro Asp Asp Glu Gly
                 20                  25                  30
acc tgg ttc tgc gtc tgg gcg ccg cat gcc gat ggc gtc tcg gtg ctc    144
Thr Trp Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala Asp Gly Val Ser Val Leu
             35                  40                  45
gga gcg ttc aac gac tgg aat ccg gag gcc aac ccg ctg gag cgc tac    192
Gly Ala Phe Asn Asp Trp Asn Pro Glu Ala Asn Pro Leu Glu Arg Tyr
         50                  55                  60
ggc ggc ggc ctg tgg gcc ggt tac gta ccg gga gcg cgc ccg ggc cac    240
Gly Gly Gly Leu Trp Ala Gly Tyr Val Pro Gly Ala Arg Pro Gly His
     65                  70                  75
acc tac aag tat cgc atc cgg cac ggc ttc tat cag gcc gac aag acg    288
Thr Tyr Lys Tyr Arg Ile Arg His Gly Phe Tyr Gln Ala Asp Lys Thr
 80                  85                  90                  95
gat ccc tac gcc ttc gcc atg gag ccg cct acc ggc agt ccc atc gaa    336
Asp Pro Tyr Ala Phe Ala Met Glu Pro Pro Thr Gly Ser Pro Ile Glu
                100             105                     110
ggg ctg gcc tcc atc atc acg cgg ctc gac tac acc tgg cac gac gac    384
Gly Leu Ala Ser Ile Ile Thr Arg Leu Asp Tyr Thr Trp His Asp Asp
            115                 120                 125
gaa tgg atg cgg cgc cgg aag ggt ccg gcc agc ctt tac gag ccg gtt    432
Glu Trp Met Arg Arg Arg Lys Gly Pro Ala Ser Leu Tyr Glu Pro Val
        130                 135                 140
tcc atc tac gag gta cat ctg ggc tcc tgg cgt cac aaa cgg ccc ggc    480
Ser Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg His Lys Arg Pro Gly
    145                 150                 155
gag tcc ttc tct tac cgg gag att gcc gag ccg ctg gcc gac tac gtg    528
Glu Ser Phe Ser Tyr Arg Glu Ile Ala Glu Pro Leu Ala Asp Tyr Val
160                 165                 170                 175
cag gag atg ggc ttc acg cac gtg gag ctg ctg ccc gtc atg gaa cat    576
Gln Glu Met Gly Phe Thr His Val Glu Leu Leu Pro Val Met Glu His
                180                 185                 190
ccc tac tac ggc tcc tgg ggc tat cag gtg gtg ggc tac tac gcc cca    624
Pro Tyr Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Val Val Gly Tyr Tyr Ala Pro
            195                 200                 205
acg ttt cgc tac gga tca ccc cag gac ctg atg tac ctg atc gac tac    672
Thr Phe Arg Tyr Gly Ser Pro Gln Asp Leu Met Tyr Leu Ile Asp Tyr
        210                 215                 220
ctg cac cag cgc ggc atc ggc gtc atc ctc gac tgg gtc ccg agc cac    720
Leu His Gln Arg Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp Val Pro Ser His
    225                 230                 235
ttt gcg gcc gat ccc cag gga ctg gtt ttc ttc gac ggg acc aca ctc    768
Phe Ala Ala Asp Pro Gln Gly Leu Val Phe Phe Asp Gly Thr Thr Leu
240                 245                 250                 255
ttc gaa tac gac gat ccc aag atg cgc tat cac cct gac tgg ggt acg    816
Phe Glu Tyr Asp Asp Pro Lys Met Arg Tyr His Pro Asp Trp Gly Thr
                260                 265                 270
tat gtg ttc gat tac aac aag ccg ggc gta cgc aac ttt ctg att tcc    864
Tyr Val Phe Asp Tyr Ash Lys Pro Gly Val Arg Asn Phe Leu Ile Ser
            275                 280                 285
aac gca ctt ttc tgg ctc gaa aag tac cac gtc gac ggg ctg cgc gtc    912
Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Lys Tyr His Val Asp Gly Leu Arg Val
        290                 295                 300
gat gcg gtg gct tct atg ctc tac cgg gac tac tca cgc aag gag tgg    960
Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Arg Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Trp
    305                 310                 315
aca ccc aac atc ttc ggc ggc cgt gaa aac ctg gag gcc att gat ttc    1008
Thr Pro Asn Ile Phe Gly Gly Arg Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Phe
320                     325             330                 335
atc aag aaa ttc aac gaa acg gtc tac ctg cac ttc ccc gag gcc atg    1056
Ile Lys Lys Phe Asn Glu Thr Val Tyr Leu His Phe Pro Glu Ala Met
                340                 345                 350
acg atc gcc gag gag tcg acg gcc tgg ccc ggc gtg tcg gcc ccc acc    1104
Thr Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Gly Val Ser Ala Pro Thr
            355                 360                 365
tac aac aac ggt ctg ggc ttc ctc tac aag tgg aac atg ggc tgg atg    1152
Tyr Asn Asn Gly Leu Gly Phe Leu Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met
        370                 375                 380
cac gac acg ctg gac tac atc cag cgc gat ccc atc tac cgc aag tat    1200
His Asp Thr Leu Asp Tyr Ile Gln Arg Asp Pro Ile Tyr Arg Lys Tyr
    385                 390                 395
cac cac gac gag ctg acc ttc tcg ctc tgg tac gcc ttt tcg gag cae    1248
His His Asp Glu Leu Thr Phe Ser Leu Trp Tyr Ala Phe Ser Glu His
400                 405                 410                 415
tac gtc ctg ccg ctc tcg cac gac gag gtg gtg cac ggc aag ggc tcg    1296
Tyr Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Gly Ser
                420                 425                 430
ctc tgg ggt aaa atg ccc ggc gac gac tgg cag aag gca gcc aac ttg    1344
Leu Trp Gly Lys Met Pro Gly Asp Asp Trp Gln Lys Ala Ala Asn Leu
            435                 440                 445
cgc ctg ctc ttt ggc cac atg tgg ggc cat ccg ggc aaa aaa ctg ctc    1392
Arg Leu Leu Phe Gly His Met Trp Gly His Pro Gly Lys Lys Leu Leu
        450                 455                 460
ttc atg ggc ggc gag ttc ggc cag cac cac gag tgg aac cac gac acg    1440
Phe Met Gly Gly Glu Phe Gly Gln His His Glu Trp Asn His Asp Thr
    465                 470                 475
cag ctc gaa tgg cac ctg ctg gac cag ccc tac cat cga ggt att cag    1488
Gln Leu Glu Trp His Leu Leu Asp Gln Pro Tyr His Arg Gly Ile Gln
480                 485                 490                 495
ctg tgg gtg tgc gat ctg aac cac ctc tac cgt acg aat ccg gcc ctc    1536
Leu Trp Val Cys Asp Leu Asn His Leu Tyr Arg Thr Asn Pro Ala Leu
                500                 505                 510
tgg cac gac gga ccg gaa ggg ttc gag tgg atc gac ttc agc gac cgc    1584
Trp His Asp Gly Pro Glu Gly Phe Glu Trp Ile Asp Phe Ser Asp Arg
            515                 520                 525
gac cag agc gtg atc tgt tac ctg cgc aag aat gcc ggc cgc atg ctg    1632
Asp Gln Ser Val Ile Cys Tyr Leu Arg Lys Asn Ala Gly Arg Met Leu
        530                 535                 540
ctg ttc gtg ctg aac ttt acg ccc gtg cca cgc gag cac tac cgc gtg    1680
Leu Phe Val Leu Asn Phe Thr Pro Val Pro Arg Glu His Tyr Arg Val
    545                 550                 555
ggc gtg ccg atc ggt ggc ccc tgg cac gag gtg ctc aac agc gac gcg    1728
Gly Val Pro Ile Gly Gly Pro Trp His Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala
560                 565                 570                 575
gtg gcc tac ggc ggg agc ggg atg ggc aac ttc ggc cgc gtc gag gcg    1776
Val Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Met Gly Asn Phe Gly Arg Val Glu Ala
                580                 585                 590
gtg ccc gag tcc tgg cac ggc cgc ccc ttc cac tta gag ctg acg ctt    1824
Val Pro Glu Ser Trp His Gly Arg Pro Phe His Leu Glu Leu Thr Leu
            595                 600                 605
ccc ccg ctg gcc gcc ctc atc ctg gag ccg gag cac ggg tag            1866
Pro Pro Leu Ala Ala Leu Ile Leu Glu Pro Glu His Gly
        610                 615                 620
<210>2
<211>621
<212>PRT
<213>Rhodothermus obamensis
<400>2
Met Ser Trp Leu Thr Glu Glu Asp Ile Arg Arg Trp Glu Ser Gly Thr
  1               5                  10                  15
Phe Tyr Asp Ser Tyr Arg Lys Leu Gly Ala His Pro Asp Asp Glu Gly
            20                  25                  30
Thr Trp Phe Cys Val Trp Ala Pro His Ala Asp Gly Val Ser Val Leu
        35                  40                  45
Gly Ala Phe Asn Asp Trp Asn Pro Glu Ala Asn Pro Leu Glu Arg Tyr
    50                  55                  60
Gly Gly Gly Leu Trp Ala Gly Tyr Val Pro Gly Ala Arg Pro Gly His
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Lys Tyr Arg Ile Arg His Gly Phe Tyr Gln Ala Asp Lys Thr
                85                  90                  95
Asp Pro Tyr Ala Phe Ala Met Glu Pro Pro Thr Gly Ser Pro Ile Glu
            100                 105                 110
Gly Leu Ala Ser Ile Ile Thr Arg Leu Asp Tyr Thr Trp His Asp Asp
        115                 120                 125
Glu Trp Met Arg Arg Arg Lys Gly Pro Ala Ser Leu Tyr Glu Pro Val
    130                 135                 140
Ser Ile Tyr Glu Val His Leu Gly Ser Trp Arg His Lys Arg Pro Gly
145                 150                 155                 160
Glu Ser Phe Ser Tyr Arg Glu Ile Ala Glu Pro Leu Ala Asp Tyr Val
                165                 170                 175
Gln Glu Met Gly Phe Thr His Val Glu Leu Leu Pro Val Met Glu His
            180                 185                 190
Pro Tyr Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr Gln Val Val Gly Tyr Tyr Ala Pro
        195                 200                 205
Thr Phe Arg Tyr Gly Ser Pro Gln Asp Leu Met Tyr Leu Ile Asp Tyr
    210                 215                 220
Leu His Gln Arg Gly Ile Gly Val Ile Leu Asp Trp Val Pro Ser His
225                 230                 235                 240
Phe Ala Ala Asp Pro Gln Gly Leu Val Phe Phe Asp Gly Thr Thr Leu
                245                 250                 255
Phe Glu Tyr Asp Asp Pro Lys Met Arg Tyr His Pro Asp Trp Gly Thr
            260                 265                 270
Tyr Val Phe Asp Tyr Asn Lys Pro Gly Val Arg Asn Phe Leu Ile Ser
        275                 280                 285
Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Lys Tyr His Val Asp Gly Leu Arg Val
    290                 295                 300
Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Arg Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Trp
305                 310                 315                 320
Thr Pro Asn Ile Phe Gly Gly Arg Glu Asr Leu Glu Ala Ile Asp Phe
                325                 330                 335
Ile Lys Lys Phe Asn Glu Thr Val Tyr Leu His Phe Pro Glu Ala Met
            340                 345                 350
Thr Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Gly Val Ser Ala Pro Thr
        355                 360                 365
Tyr Asn Asn Gly Leu Gly Phe Leu Tyr Lys Trp Asn Met Gly Trp Met
    370                 375                 380
His Asp Thr Leu Asp Tyr Ile Gln Arg Asp Pro Ile Tyr Arg Lys Tyr
385                 390                 395                 400
His His Asp Glu Leu Thr Phe Ser Leu Trp Tyr Ala Phe Ser Glu His
                405                 410                 415
Tyr Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Gly Ser
            420                 425                 430
Leu Trp Gly Lys Met Pro Gly Asp Asp Trp Gln Lys Ala Ala Asn Leu
        435                 440                 445
Arg Leu Leu Phe Gly His Met Trp Gly His Pro Gly Lys Lys Leu Leu
    450                 455                 460
Phe Met Gly Gly Glu Phe Gly Gln His His Glu Trp Asn His Asp Thr
465                 470                 475                 480
Gln Leu Glu Trp His Leu Leu Asp Gln Pro Tyr His Arg Gly Ile Gln
                485                 490                 495
Leu Trp Val Cys Asp Leu Asn His Leu Tyr Arg Thr Asr Pro Ala Leu
            500                 505                 510
Trp His Asp Gly Pro Glu Gly Phe Glu Trp Ile Asp Phe Ser Asp Arg
        515                 520                 525
Asp Gln Ser Val Ile Cys Tyr Leu Arg Lys Asr Ala Gly Arg Met Leu
    530                 535                 540
Leu Phe Val Leu Asn Phe Thr Pro Val Pro Arg Glu His Tyr Arg Val
545                 550                 555                 560
Gly Val Pro Ile Gly Gly Pro Trp His Glu Val Leu Asn Ser Asp Ala
                565                 570                 575
Val Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Met Gly Asn Phe Gly Arg Val Glu Ala
            580                 585                 590
Val Pro Glu Ser Trp His Gly Arg Pro Phe His Leu Glu Leu Thr Leu
        595                 600                 605
Pro Pro Leu Ala Ala Leu Ile Leu Glu Pro Glu His Gly
    610                 615                 620

Claims (20)

1.具有分支酶活性和至少60℃的最适温度的分离的多肽。
2.根据权利要求1的多肽，其中该最适温度是在60℃-120℃的范围内。
3.根据权利要求2的多肽，其中该最适温度是在60℃-80℃的范围内。
4.根据权利要求3的多肽，其中该最适温度为大约65℃。
5.权利要求1的多肽，其是细菌来源的。
6.权利要求5的多肽，其来源于红嗜热盐菌属的细胞，尤其是R.obamensis和海洋红嗜热盐菌的细胞。
7.具有分支酶活性的多肽，其选自：
a)具有与SEQ ID NO：2的成熟氨基酸序列有至少65％同源性的氨基酸序列的多肽；
b)具有与大肠杆菌DH12S，DSM 12607中质粒pT7Blue所含核酸序列编码的成熟BE氨基酸序列有至少65％同源性的氨基酸序列的多肽；和
c)由在低严紧条件下与如下序列杂交的核酸序列编码的多肽：(i)SEQID NO：1核酸序列的相应于该成熟酶的核苷酸，(ii)SEQ ID NO：1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的子序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链。
8.权利要求7的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列。
9.权利要求8的多肽，其具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列有至少95％同源性的氨基酸序列。
10.权利要求7的多肽，其含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或由SEQ IDNO：2的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的片段组成。
11.权利要求10的多肽，其由SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或其具有Y397C+L419P替代的变体组成。
12.权利要求7的多肽，其由大肠杆菌DH12S，DSM 12607中的质粒pT7Blue所含的核酸序列编码。
13.分离的核酸序列，其含有编码权利要求1-12之任意一项的多肽的核酸序列。
14.编码具有分支酶活性的多肽的分离核酸序列，其选自：
a)与SEQ ID NO：1的BE编码核酸序列有至少65％同源性的核酸序列；
b)与大肠杆菌DH12S，DSM 12607中的质粒pT7Blue所含的BE编码核酸序列有至少65％同源性的核酸序列；和
c)在低严紧条件下与下列序列杂交的核酸序列：(i)SEQ ID NO：1的核酸序列，(ii)SEQ ID NO：1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的子序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链。
15.含有权利要求13-14之任意一项的核酸序列的核酸结构，其中该核酸序列与指导该多肽在适合的表达宿主中产生的一个或多个控制序列可操作地连接。
16.含有权利要求15的核酸结构的重组表达载体。
17.含有权利要求16的核酸结构的重组宿主细胞。
18.用于制备权利要求1-12之任意一项的多肽的方法，包括(a)在适于产生该多肽的条件下培养根据权利要求17的宿主细胞；和(b)回收该多肽。
19.根据权利要求1-12之任意一项的多肽、或根据权利要求15的核酸序列所编码的多肽在淀粉样材料的改性中的用途。
20.含有根据权利要求1-12之任意一项的多肽和表面活性剂的去污剂组合物。
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