MXPA01009699A - Polipeptidos que tienen actividad de enzima ramificadora y acidos nucleicos que los codifican. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a los polipeptidos aislados que tienen una actividad de enzima ramificadora y a las secuencias de acidos nucleicos aisladas que codifican los polipeptidos. La invencion tambien se refiere a las construcciones de acidos nucleicos, a los vectores, y a las c.elulas huesped que comprenden las secuencias de acidos nucleicos asi como a los metodos para la produccion y utilizacion de los polipeptidos.

Description

POLIPEPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD DE ENZIMA RAMIFICADORA Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LOS CODIFICAN Antecedentes de la Invención 5 Campo de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una actividad de enzima ramificadora y a las s «ecuencias de los ácidos nucleicos aislados que 10 codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a las construcciones de ácidos nucleicos, vectores, y células huésped que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos, así como a los métodos para producir y a la utilización de los polipéptidos . 15 Descripción del Arte Relacionado La enzima de ramificación (EC 2.4.1.18) denotada aquí posteriormente BE, cataliza la transglicosilación para 20 formar los enlaces alfa-1, 6-glucosídicos (puntos de ramificación) del glicógeno y la amilopectina en los microorganismos, las plantas y los organismos superiores. El glicógeno y la amilopectina son materiales de almidón altamente ramificados utilizados para almacenar energía en 25 Ref.132694 los microorganismos, las plantas o los organismos superiores. No solamente la BE forma una ramificación entre las diferentes moléculas (transferencia intermolecular), sino también cataliza la transferencia de un glucano multi-ramificado a otro sitio sobre la misma molécula (transferencia intramolecular) . Los materiales de fécula altamente ramificados tienen propiedades únicas semejantes a la alta solubilidad, la viscosidad baja y una tendencia menor a la inversión * comparado con el almidón no modificado, lo cual los hace interesantes para su uso en composiciones adhesivas que incluyen la encoladura superficial y el recubrimiento en la industria del papel como se describió en la Patente EP 0 690 170, los aditivos para los alimentos y las bebidas y los agentes de inversión anti-almidón como se describió en la Patente US 4 454 161. Las enzimas de ramificación de varios organismos diferentes han sido aislados y descritos, por ejemplo: la patente US 4 454 161 describe una BE de Bacill us megateri um; Boyer y Preiss, Biochemistry, vol. 16 (16), pp. 3693-3699, 1977, describe una BE de Escherichia coli ; Zevenhuizen, Biochem. Biophys. Acta (81), pp. 608-611, 1964, describe una BE de Arthrobacter globiformis; Walker y Builder, Eur. J. of Biochem., vol. 20 (1), pp. 14-21, 1971, describe una BE de Streptococcus mi tis; Kiel et al., Gene, vol. 78 (1), pp. ^- i.^ 9-18, 1989, describe una BE de la cianobacteria Synechococcus sp. PCC7942; Rumba et al., Journal of Bacteriology, vol. 173 (21), pp. 6732-6741, 1991, describe una BE de Butyrivibrio fibrisol vens; Kiel et al., DNA Sequence, vol. 3 (4), pp. 221-232, 1992, describe una BE de Bacillus caldolyticus . Una característica común de las referencias mencionadas anteriormente es que ninguna de las temperaturas óptimas reportadas son más elevadas que 45 °C. Solamente dos enzimas ramificadoras han sido descritas las cuales están caracterizadas porque tienen una temperatura óptima más elevada: Kiel et al., Molecular & General Genetics, vol. 230 (1-2), pp. 136-144, 1991 (también en EP 0 418 945); a Bacill us stearothermophil us 1503-4R branching enzyme having a temperature optimum of 53 °C; y Takata et al., Applied and Environmental Microbiology, vol. 60 (9), pp. 3096-3104, 1994: a Bacill us stearothermophil us TRBE14 branching enzyme having a temperatura optimum of around 50 °C. A causa de las velocidades de reacción obtenidas a temperaturas más elevadas, es ventajoso industrialmente utilizar enzimas de ramificación con una temperatura elevada óptima. Por medio de esto se puede obtener una capacidad más elevada con la misma cantidad de enzima, y se logra una mejor economía de producción. Además es benéfico llevar a ..* .. * .** '* ~-?* ¡.A *. - . ... . .. .* ,* - r*M --. ,- J ' ?fr-timn cabo el proceso a temperaturas elevadas debido a la prevención de infecciones. Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos mejorados que tengan una actividad de enzima ramificadora y ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos .

Breve Descripción de la Invención " La presente invención se refiere a los polipéptidos aislados que tienen una actividad de enzima ramificadora, y una temperatura óptima de al menos 60 °C. La presente invención también se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos aislados que codifican los polipéptidos y a las construcciones de ácidos nucleicos, a los vectores, y a las células huésped que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos así como a los métodos para producir y utilizar los polipéptidos.

Descripción Detallada de la Invención Polipéptidos que tienen una Actividad de Enzima Ramificadora La "actividad de enzima ramificadora" es la actividad ramificadora del 1, -alfa-glucano el cual cataliza la formación de los enlaces 1, 6-alfa-glucosídicos del ^^^^^^ - '¿* * • - * • i t . .- *A~»£a glicógeno o amilopectina (EC 2.4.1.18). Para los propósitos de la presente invención, la actividad de la enzima de ramificación puede ser determinada de acuerdo con la versión modificada del procedimiento descrito por Takata et al., Applied and Enviromental Microbiology (1994), p. 3097 (ensayo A) , el cual se describe en la sección de Materiales y Métodos aquí bajo el título "actividad de la enzima ramificadora" . En un primer aspecto, la presente invención se * refiere a los polipéptidos aislados que tienen la actividad de la enzima ramificadora, y que tienen una temperatura óptima de al menos 60 °C; preferentemente la temperatura óptima está en el intervalo de 60 °C a 120 °C; más preferentemente la temperatura óptima está en el intervalo de 60 °C a 100 °C; aún más preferentemente la temperatura óptima está en el intervalo de 60 °C a 80 °C; todavía más preferentemente la temperatura óptima está en el intervalo de 60 °C a 70 °C; y aún más preferentemente la temperatura óptima es de 65 °C. En una primera modalidad, los polipéptidos de la presente invención retienen aproximadamente 70% de la actividad relativa en el intervalo de pH 6 a pH 8; preferentemente de manera aproximada 80% de la actividad relativa en el intervalo de pH 6 a pH 7; más preferentemente el pH óptimo es de alrededor de pH 7.

Las condiciones utilizadas para determinar la temperatura y el pH óptimos son aquellas descritas en la sección de Materiales y Métodos de aquí bajo el título de "Actividad de la enzima ramificadora". En una segunda modalidad, los polipéptidos de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de homología con respecto a los aminoácidos 2 a 621 de la SEC ID NO: 2 (es decir el polipéptido maduro) o la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácidos nucleicos contenida en el PT7Blue del plásmido contenido en el DSM 12607 de E. Coli de al menos aproximadamente 65%, preferentemente de al menos aproximadamente 70%, más preferentemente de al menos aproximadamente 80%, aún más preferentemente de al menos aproximadamente 90%, aún más preferentemente de al menos aproximadamente 95%, y todavía más preferentemente de al menos aproximadamente 97%, los cuales tienen una actividad de la enzima de ramificación (aquí posteriormente los "polipéptidos homólogos") . En una modalidad preferida, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos la cual difiere en cinco aminoácidos, preferentemente en cuatro aminoácidos, más preferentemente en tres aminoácidos, aún más preferentemente en dos aminoácidos, y todavía más preferentemente en un aminoácido de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.

Para los propósitos de la presente invención, aos alineaciones de las secuencias y el cálculo de las evaluaciones de la homología se puede hacer utilizando un alineación de Smith-Waterman completo, útil para las alineaciones tanto de las proteínas como del ADN. Las matrices de evaluación de fallas BLOSUM50 y la matriz de identidad son utilizadas para las alineaciones de la proteína y del ADN respectivamente. La penalidad para el primer residuo en un hueco es de -12 para las proteínas y de -16 para el ADN, mientras que la penalidad para los residuos adicionales en un hueco es de -2 para las proteínas y de -4 para el ADN. La alineación se puede hacer con la versión del paquete FASTA v20u6 (W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Seqúense Analysis", PNAS 85:2444-2448, y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183:63-98). Las alineaciones múltiples de las secuencias de las proteínas se pueden hacer utilizando "ClustalW" (Thompson, J. D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). La alineación múltiple de las secuencias de AND se puede hacer utilizando la alineación de las proteínas como un molde o modelo, - ' -- £"^- - . *•. .. . **—- ~ - - - * .". - . • rrfJ*ÍamlÉl* reemplazando los aminoácidos con el codón correspondiente de la secuencia del ADN. Preferentemente, los polipéptidos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o una variante alélica del mismo; o un fragmento del mismo que tiene una actividad de enzima ramificadora. En una modalidad más preferida, el polipéptido de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. En otra modalidad preferida, el polipéptido de la presente invención consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o una variante alélica de la misma; o un fragmento de la misma que tenga una actividad de enzima ramificadora. En otra modalidad preferida, el polipéptido de la presente invención consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. Un fragmento de la SEC ID NO: 2 es un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos delecionados de la terminal de amino y/o de carboxilo de esta secuencia de aminoácidos. Una variante alélica denota cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo sitio cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede conducir a un polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser inactivas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar los polipéptidos que tienen las secuencias .««.-l^^j de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen. En una tercera modalidad, los polipéptidos de la 5 presente invención tienen una actividad de enzima ramificadora, los cuales son codificados por las secuencias de los ácidos nucleicos las cuales se hibridizan bajo condiciones de severidad muy bajas, preferentemente condiciones de severidad bajas, más preferentemente 10 condiciones intermedias de severidad, aún más preferentemente condiciones de severidad intermedias- elevadas, todavía más preferentemente condiciones elevadas de severidad, y aún más preferentemente condiciones de severidad muy elevadas con una sonda de ácidos nucleicos que 15 se hibridiza bajo las mismas condiciones con (i) los nucleótidos de la SEC ID NO:l, (ii) la secuencia de ADNc contenida en los nucleótidos de la SEC ID NO:l, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii), o (iv) una hebra complementaria de (i), (ii), o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. 20 Maniatis, 1989, Mol ecular Cloning, A Labora tory Manual , 2/a. Edición, Cold Spring Harbor, New York) . La subsecuencia de la SEC ID NO:l puede ser de al menos 100 nucleótidos o preferentemente de al menos 200 nucleótidos. Además, la subsecuencia puede codificar un fragmento de polipéptido el 25 cual tiene la actividad de la enzima de ramificación. Los polipéptidos también pueden ser las variantes alélicas o los fragmentos de los polipéptidos que tienen una actividad de la enzima de ramificación. La secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID N0:1 o una subsecuencia de la misma, así como la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o un fragmento de la misma, puede ser utilizada para diseñar una sonda de ácidos nucleicos para identificar y clonar el ADN que codifica los polipéptidos que tienen una actividad de la enzima de ramificación de las cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con los métodos bien conocidos en el arte. En particular, tales sondas pueden ser utilizadas para la hibridación con el ADN genómico o el ADNc del género o especie de interés, siguiendo los procedimientos de manchado de Southern estándares, para identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben ser de al menos 15, preferentemente de al menos 25, y más preferentemente de al menos 35 nucleótidos de longitud. También se pueden utilizar sondas más largas. Se pueden utilizar sondas tanto de ADN como de ARN. Las sondas son etiquetadas típicamente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidina) . Tales sondas están abarcadas por la presente invención. £&^£^^tt| Así, un ADN genómico o la biblioteca del ADNc preparada a partir de tales otros organismos puede ser seleccionado para el ADN el cual se hibridiza con las sondas descritas anteriormente y el cual codifica un polipéptido que tiene la actividad de la enzima ramificadora. El ADN genómico u otro ADN de tales otros organismos puede ser separado por electrofóresis con gel de agarosa o de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado pueden ser transferidos a, e inmovilizados sobre, la nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN el cual sea homólogo con la SEC ID NO:l o una subsecuencia del mismo, el material portador es utilizado en un manchado de Southern. Para los propósitos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de ácidos nucleicos se hibridiza a una sonda de ácidos nucleicos etiquetada que corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEC ID N0:1, su hebra complementaria, o una subsecuencia de la misma, bajo condiciones de severidad muy bajas a muy elevadas. Las moléculas a las cuales la sonda de ácidos nucleicos se hibridiza bajo estas condiciones son detectadas utilizando una película de rayos X. En una modalidad preferida, la sonda de ácidos nucleicos es una secuencia de ácidos nucleicos la cual codifica el polipéptido de la SEC ID NO: 2, o una subsecuencia de la misma. En otra modalidad preferida, la sonda de ácidos nucleicos es la SEC ID N0:1. En otra modalidad preferida, la sonda de ácidos nucleicos es la secuencia de ácidos nucleicos contenida en el plásmido pT7Blue, el cual está contenido en el DSM 12607 de Escherichia coli (véase el Ejemplo 1), en donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido que tiene una actividad de la enzima de ramificación. Para las sondas largas de al menos 100 nucléotidos de longitud, las condiciones de severidad muy bajas a muy elevadas están definidas como de prehibridación y de hibridación a 42 °C en 5X SSPE, 0.3 % de SDS, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sometido a esfuerzo cortante, y ya sea 25% de formamida durante las condiciones de severidad bajas y muy bajas, 35% de formamida para las condiciones de severidad intermedias e intermedias-elevadas, o 50% de formamida para las condiciones de severidad elevadas y muy elevadas, siguiendo los procedimientos de manchado de Southern estándares. Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador finalmente es lavado tres veces durante cada 15 minutos utilizando 2 x SSC, 0.2% de SDS preferentemente a al menos 45 °C (condiciones muy bajas de severidad) , más preferentemente al menos a 50 °C (condiciones de severidad bajas), más preferentemente al J.&L menos a 55 °C (condiciones intermedias de severidad) , más preferentemente al menos a 60 °C (condiciones de severidad intermedias-altas) , aún más preferentemente al menos a 65 °C (condiciones elevadas de severidad) , y todavía más preferentemente al menos a 70 °C (condiciones de severidad muy elevadas) . Para las sondas cortas las cuales son de aproximadamente 15 nucleótidos hasta aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de severidad son definidas como de prehibridación, hibridación, y lavado poshibridación en el intervalo de 5 °C a 10 °C debajo de la Tm calculada utilizando el cálculo de acuerdo con Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en NaCl 0.9 M, Tris-HCl 0.9 M pH 7.6, EDTA 6 mM, 0.5% NP-40, solución de Denhardt IX, pirofosfato de sodio 1 mM, fosfato monobásico de sodio 1 mM, ATP 0.1 mM, y 0.2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo los procedimientos de manchado de Southern estándares. Para las sondas cortas las cuales son de aproximadamente 15 nucleótidos hasta aproximadamente 70 nucléotidos de longitud, el material portador es lavado una vez en 6X SSC más 0.1% SDS durante 15 minutos y dos veces durante cada 15 minutos utilizando 6X SSC en el intervalo de 5 °C a 10 °C debajo de la Tm calculada.

* ; ' *' •• En una cuarta modalidad, la presente invención se refiere a variantes que tienen la actividad de BE del polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 que comprende una substitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos variables pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 por una inserción o deleción de uno o más residuos de aminoácidos y/o la substitución de uno o más residuos de aminoácidos por diferentes residuos de aminoácidos. Preferentemente, los cambios de los aminoácidos son de una naturaleza menor, es decir substituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente el pliegue y/o la actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos; extensiones amino- o carboxil-terminales pequeñas, tales como un residuo de metionina amino-terminal; un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación por el cambio neto de la carga u otra función, tal como un tracto de poli-histidina, un epítope antigénico o un dominio de unión. Los ejemplos de las substituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y . u.. ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) , y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Las substituciones de aminoácidos las cuales no alteran en general la actividad específica ya son conocidas y se describen, por ejemplo, por H. Neurath y R. L. Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, New York. Los intercambios que ocurren más comúnmente son Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly así como estas mismas a la inversa. En una quinta modalidad, los polipéptidos de la presente invención tienen identidad inmunoquímica o identidad inmunoquímica parcial con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. Las propiedades inmunoquímicas son determinadas por las pruebas de identidad de la reacción cruzada inmunológica por el procedimiento de inmunodifusión doble de Ouchterlony bien conocido. Específicamente, un antisuero que contiene los anticuerpos policlonales los cuales son inmunorreactivos o se unen a los epítopes del polipéptido que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 son preparados inmunizando a los conejos (u otros roedores) de acuerdo con . , . , tt * , , - ,a»A..«^fifctf&i el procedimiento descrito por Harboe e Ingild, en N.H. Axelsen, J. Kroll, y B. Weeks, editores, A Manual of Quanti tative Immunoelectrophoresi s, Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o Johnstone y Torpe, 5 Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (más específicamente las páginas 27-31) . Un polipéptido que tienen identidad inmunoquímica es un polipéptido el cual reacciona con el antisuero de un modo idéntico tal como en la fusión total de los precipitados, 10 una morfología del precipitado idéntica, y/o una movilidad electroforética idéntica utilizando una técnica inmunoquímica específica. Una explicación adicional de identidad inmunoquímica es descrita por Axelsen, Bock, y Kroll, en N.H. Axelsen, J. Kroll, y B. Weeks, editores, A 15 Manual of Quanti tative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 10. Un polipéptido que tiene una identidad inmunoquímica parcial es un polipéptido el cual reacciona con el antisuero de una manera parcialmente idéntica tal como una fusión parcial de los 20 precipitados, una morfología del precipitado parcialmente idéntica, y/o una movilidad electroforética parcialmente idéntica utilizando una técnica inmunoquímica específica. Una explicación adicional de la identidad inmunoquímica parcial es descrita por Bock y Axelsen, en N.H. Axelsen, J. 25 Kroll, y B. Weeks, editores, A Manual of Quanti tative Immunoel ectrophoresi s, Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 11. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden ser 5 preparados y utilizados, por ejemplo, de acuerdo con los métodos de E. Harlow y D. Lañe, editores, 1988, Antibodi es, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York. Los polipéptidos de la presente invención tienen al 10 menos 20%, preferentemente al menos 40%, más preferentemente al menos 60%, aún más preferentemente al menos 80%, aún más preferentemente al menos 90%, y todavía más preferentemente al menos 100% de la actividad de la enzima ramificadora del polipéptido de la SEC ID NO: 2. 15 Un polipéptido de la presente invención puede ser obtenido de microorganismos de cualquier género. Para los propósitos de la presente invención, el término "obtenido de" como se utiliza aquí con relación a una fuente dada significará que el polipéptido codificado por la secuencia 20 de ácidos nucleicos es producido por la fuente o por una célula en la cual la secuencia de ácidos nucleicos de la fuente ha sido insertada. En una modalidad preferida, el polipéptido es secretado extracelularmente. Un polipéptido de la presente invención puede ser 25 un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ÍS ser un polipéptido bacteriano gram positivo tal como un polipéptido de Bacill us, por ejemplo, un polipéptido de Bacill us alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus 5 lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, o Bacillus thuringiensis; o un polipéptido de Streptomyces, por ejemplo un polipéptido de Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; o un polipéptido bacteriano gram 10 negativo, por ejemplo, un polipéptido de E. Coli o de Pseudomonas sp. Un polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido fungoso, y más preferentemente un polipéptido de levadura tal como un polipéptido de Candida, 15 Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia; o más preferentemente un polipéptido fungoso filamentoso tal como un polipéptido de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, 20 Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma . En una modalidad preferida, el polipéptido es un polipéptido de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces 25 cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces ?»JiK¡Éfc»«ijtth»-.. i j..< *.. ..:»_«... , ¿L-,_ -.. * * , * * *.-. ....*. -. ,- .— i . . . ... . > . i ¿u*jM*??* douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otra modalidad preferida el polipéptido es un polipéptido de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, 5 Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus Níger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, 10 Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, 15 Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Tri choderma vi ri de . En otra modalidad preferida, el polipéptido es un polipéptido de Rhodothermus obamensis, o de Rhodothermus 20 marinus. En una modalidad más preferida, el polipéptido es un polipéptido de Rhodothermus obamensis, y más preferentemente el polipéptido de la región de codificación de la secuencia contenida en el plásmido pT7Blue que está 25 contenido en DSM 12607 de Escherichia coli (véase el Ejemplo *ái&Jíi¡m?é?ik?¡?? $t .< * *—"'»-*• 1), por ejemplo, el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. Se sobreentenderá que para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca los estados tanto perfecto como imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, sin considerar el nombre de las especies por las cuales son conocidos las mismas. Aquellos expertos en el arte reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados. Por ejemplo, los equivalentes taxonómicos de Rhodothermus obamensis están definidos por Sako et al., International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 46 (4) pp. 1099-1104 (1996). Las cepas de estas especies están accesibles fácilmente al público en un número de colecciones de cultivos, tales como el American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Japan Collection of Microorganisms (JMC) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) , y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) . Además, tales polipéptidos pueden ser identificados y obtenidos de otras fuentes que incluyen los microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, del suelo, el abono, al agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar los tf*i. * », •* - i U-.-.-U^J^'?J* microorganismos de los habitat naturales son bien conocidos en el arte. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser derivada entonces seleccionando de manera similar una biblioteca genómica o del ADNc de otro microorganismo. Una vez que una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido ha sido detectada con la(s) sonda (s), la secuencia puede ser aislada o clonada utilizando las técnicas las cuales son conocidas por aquellas personas con experiencia ordinaria en el arte (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra). Como se definió aquí, un polipéptido "aislado" es un polipéptido el cual está esencialmente libre de otros polipéptidos de la enzima no ramificadora, por ejemplo, de al menos de aproximadamente 20 % de pureza, preferentemente de al menos de aproximadamente 40 % de pureza, .más preferentemente de aproximadamente 60 % de pureza, aún más preferentemente de aproximadamente 80% de pureza, todavía más preferentemente de aproximadamente 90% de pureza, y aún más preferentemente de aproximadamente 95% de pureza, como se determina por SDS-PAGE. Los polipéptidos codificados por las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención también incluyen los polipéptidos fusionados o los polipéptidos de fusión seg entables en los cuales otro polipéptido está fusionado en el extremo o terminal N o el extremo o terminal C del &*&&<&* 70 polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado es producido fusionando una secuencia de ácidos nucleicos (o una porción de la misma) que codifica otro polipéptido a una secuencia de ácidos nucleicos (o una porción de la misma) de 5 la presente invención. Las técnicas para producir los polipéptidos de fusión ya son conocidos en el arte, e incluyen la unión de las secuencias de codificación que codifican los polipéptidos de modo que los mismos estén en el marco o estructura y que la expresión del polipéptido 10 fusionado está bajo el control del (de los) mismo (s) promotor (es) y el terminador.

Secuencias del Ácidos Nucleicos La presente invención también se refiere a las 15 secuencias de ácidos nucleicos aisladas las cuales codifican un polipéptido de la presente invención. En una modalidad preferida, la secuencia de ácidos nucleicos es descrita en la SEC ID N0:1. En otra modalidad más preferida, la secuencia de ácidos nucleicos es la secuencia contenida en 20 el plásmido pT7Blue que está contenido en DSM 12607 de Escheri chia coli (véase el Ejemplo 1) . La presente invención también abarca las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, la cual difiere de la SEC ID 25 N0:1 en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a las subsecuencias de la SEC ID N0:1 las cuales codifican los fragmentos de la SEC ID NO: 2 que tienen una actividad de la enzima ramificadora. Una subsecuencia de la SEC ID N0:1 es una secuencia 5 de ácidos nucleicos abarcada por la SEC ID N0:1 excepto que uno o más nucleótidos del extremo 5' y/o 3' han sido delecionados. La presente invención también se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos mutantes que comprenden al 10 menos una mutación en la secuencia de codificación del polipéptido de la SEC ID NO:l, en la cual la secuencia de ácidos nucleicos mutantes codifica un polipéptido el cual consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. Las técnicas utilizadas para aislar o clonar una 15 secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido ya son conocidas en el arte e incluyen el aislamiento del ADN genómico, la preparación a partir del ADNc, o una combinación de las mismas. La clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención a partir de tal 20 ADN genómico pueden ser efectuadas, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocida como se muestra en el Ejemplo 1, o la selección de anticuerpos de las bibliotecas de expresión para detectar los fragmentos del ADN clonados con características 25 estructurales compartidas. Véase, por ejemplo, Innis et al., HB=áíáii s- S .1 -¿ - .¿* . 1990, PCR: A Guide to Methods and Applica tion , Academic Press, New York. Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR) , la transcripción activada unida (LAT) y la amplificación a base de la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) , pueden ser utilizados. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser clonada a partir de una cepa de Rhodothermus, u otro organismo o un organismo relacionado y así, por ejemplo, puede ser una variante alélica o la variante de las especies del polipéptido que codifica la región de la secuencia de ácidos nucleicos. El término "secuencia de ácidos nucleicos aislada" como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos la cual está esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, de al menos aproximadamente 20 % de pureza, preferentemente de al menos aproximadamente 40% de pureza, más preferentemente de al menos aproximadamente 60% de pureza, aún más preferentemente de al menos aproximadamente 80% de pureza, y todavía más preferentemente al menos aproximadamente 90% de pureza como se determina por electrofóresis con agarosa. Por ejemplo, una secuencia del ácidos nucleicos aislada puede ser obtenida por procedimientos de clonación estándares utilizados en el diseño genético para volver a establecer la secuencia de ácidos nucleicos a partir de su localización .,>., v natural en un sitio diferente en donde será reproducida. Los precedimientos de clonación pueden involucrar la escisión y el aislamiento de un fragmento de ácidos nucleicos deseado que comprende la secuencia de ácidos nucleicos que codifica 5 el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula del vector, y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped en donde las copias o los clones múltiples de la secuencia de ácidos nucleicos serán replicados. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de 10 origen genómico, de ADNc, de ARN, de origen semisintético, sintético, o cualquier combinación de los mismos. La presente invención también se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos las cuales tienen un grado de homología con respecto a la secuencia de codificación del 15 polipéptido maduro de la SEC ID NO:l (es decir los nucleótidos 4 a 1863) de al menos aproximadamente 65%, preferentemente de aproximadamente 70%, preferentemente de aproximadamente 80%, más preferentemente de aproximadamente 90%, aún más preferentemente de aproximadamente 95%, y 20 todavía más preferentemente de aproximadamente 97% de homología, la cual codifica un polipéptido activo. Para los propósitos de la presente invención, el grado de homología entre las dos secuencias de ácidos nucleicos es determinada utilizando una alineación de Smith-Waterman completa, útil 25 para alineaciones tanto de la proteína como del ADN. Las matrices de evaluación de fallas BLOSUM50 y la matriz de identidad son utilizadas para las alineaciones de las proteínas y del ADN respectivamente. La penalidad para el primer residuo en un hueco es de -12 para las proteínas y de 5 -16 para el ADN, mientras que la penalidad para los residuos adicionales en un hueco es de -2 para las proteínas y de -4 para el ADN. La alineación es a partir de la versión v20u6 del paquete FASTA (W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Análisis", PNAS 10 85:2444-2448, y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Comparison with FASTP y FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98) . La modificación de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente 15 invención puede ser necesaria para la síntesis de los polipéptidos substancialmente similares al polipéptido. El término "substancialmente similar" al polipéptido se refiere a las formas que están presentes de manera no natural del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir en alguna 20 forma diseñada del polipéptido aislado de su fuente natural, por ejemplo las variantes que difieren en una actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo, o semejante. La secuencia de la variante puede ser construida con base en la secuencia de ácidos nucleicos presentada como la parte que 25 codifica el polipéptido de la SEC ID NO:l, por ejemplo, una subsecuencia del mismo, y/o por la introducción de las substituciones de nucleótidos las cuales no ocasionan otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos, sino la que corresponde al uso del codón del organismo huésped propuesto para la producción de la enzima, o por la introducción de las substituciones de los nucleótidos las cuales pueden ocasionar una secuencia de aminoácidos diferentes. Para una descripción general de la substitución de nucleótidos, véase, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expresión and Purification 2: 95-107. Será evidente para aquellos expertos en el arte que tales substituciones se pueden hacer fuera de las regiones críticas para la función de la molécula y todavía conducirán a un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos aislada de la invención, y por lo tanto preferentemente no sometida a substitución, puede se identificada de acuerdo con los procedimientos conocidos en el arte, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis con exploración de alanina (véase, por ejemplo, Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085) . En esta última técnica, las mutaciones son introducidas en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas para verificar la actividad de la enzima ramificadora para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción del substrato-enzima también pueden ser determinados por el 5 análisis de la estructura tridimensional como se determinó por técnicas tales como el análisis de resonancia magnética nuclear, la cristalografía o la etiquetación por fotoafinidad (véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of 10 Molecular Bi ology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64) . La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican un polipéptido de la presente invención, el cual se hibridiza 15 bajo condiciones de severidad muy bajas, preferentemente condiciones de severidad bajas, más preferentemente condiciones de severidad intermedias, más preferentemente condiciones de severidad intermedias-elevadas, aún más preferentemente condiciones de severidad elevadas, y todavía 20 más preferentemente condiciones de severidad muy elevadas con una sonda de ácidos nucleicos la cual se hibridiza bajo las mismas condiciones con la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO:l o su hebra complementaria; o las variantes y subsecuencias alélicas de las mismas (Sambrook et al., 25 1989, supra), como se definió aquí.

La presente invención también se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos aisladas producidas por (a) la hibridación de un ADN bajo condiciones de severidad muy bajas, bajas, intermedias, intermedias-elevadas, elevadas o muy elevadas, con (i) los nucleótidos de la SEC ID N0:1, (ii) la secuencia del ADNc contenida en los nucleótidos de la SEC ID N0:1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii), o (iv) una hebra complementaria de (i), (ii), o (iii); y (b) aislar la secuencia de ácidos nucleicos. La subsecuencia es preferentemente una secuencia de al menos 100 nucleótidos, tal como una secuencia la cual codifica un fragmento de polipéptido el cual tiene una actividad de la enzima ramificadora.

Métodos para Producir Secuencias de Ácidos Nucleicos Mutantes La presente invención se refiere además a los métodos para producir una secuencia de ácidos nucleicos mutante, que comprende introducir al menos una mutación en la secuencia de codificación de los polipéptidos de la SEC ID NO:l o una subsecuencia de la misma, en donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido el cual consiste de la secuencia de aminoácidos de a SEC ID NO: 2 o un fragmento de la misma el cual tenga la actividad de la enzima ramificadora. *u La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido puede ser efectuada por la mutagénesis dirigida al sitio utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos en el arte. Es particularmente útil el procedimiento que utiliza un vector de ADN de doble hebra, superarrollado, con un inserto de interés y dos cebadores sintéticos que contienen la mutación deseada. Los cebadores de los oligonucleótidos, cada uno complementario con las hebras opuestas del vector, se extienden durante la ciclización de la temperatura por medio de la Pfu ADN polimerasa. Durante la incorporación de los cebadores, un plásmido mutado que contiene muescas escalonadas es generado. A continuación de la ciclización de la temperatura, el producto es tratado con Dpnl el cual es específico para el ADN metilado y semimetilado para digerir el molde de ADN original y para seleccionar el ADN sintetizado que contiene la mutación. También se pueden utilizar otros procedimientos conocidos en el arte.

Construcciones de Ácidos Nucleicos La presente invención también se refiere a las construcciones de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención enlazados operativamente a una o más secuencias de control ---X . las cuales dirigen la expresión de la secuencia de codificación en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. La expresión se entenderá que incluye cualquier paso involucrado en la producción de los polipéptidos que incluyen, pero sin estar limitado a, la transcripción, la modificación pos-transcripcional, la traducción, la modificación postraducción, y la secreción. La "construcción de ácidos nucleicos" está definida aquí como una molécula de ácidos nucleicos, ya sea de una sola hebra o de doble hebra, la cual está aislada de un gen que está presente de manera natural o la cual ha sido modificada para contener segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos de una manera que de otra modo no podrían existir en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo con el término de cásete de expresión cuando la construcción de ácidos nucleicos contiene la totalidad de las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia de codificación de la presente invención. El término "secuencia de codificación" está definido aquí como una secuencia de ácidos nucleicos la cual especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto de proteína. Los límites de la secuencia de codificación son determinadas generalmente por un sitio de unión del ribosoma (procariotas) o por el codón de partida de ATG (eucariotas) localizado justo corriente arriba de la estructura de lectura abierta en el extremo 5' del ARNm y una secuencia del terminador de la transcripción localizado justo corriente debajo de la estructura de lectura abierta en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitada al ADN, ADNc, y las secuencias de ácidos nucleicos recombinantes. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser manipulada en una variedad de formas para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de ácidos nucleicos previo a su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias de ácidos nucleicos que utilizan los métodos de ADN recombinante son bien conocidas en el arte. El término "secuencias de control" está definido aquí para incluir todos los componentes los cuales son necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser natural o extranjera para la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no están limitados a, una secuencia directora o delantera, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia del péptido de la señal, y un terminador de la transcripción. En un mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Las 5 secuencias de control pueden ser provistas con enlazadores para el propósito de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la unión de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido. El término 10 "enlazado operativamente" está definido aquí como una configuración en la cual una secuencia de control está colocada apropiadamente en una posición con relación a la secuencia de codificación de la secuencia de ADN de tal modo que la secuencia de control dirija la expresión de un 15 polipéptido. La secuencia de control puede ser una secuencia de promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucleicos la cual es reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia promotora 20 contiene secuencias de control transcripcional las cuales tienen un papel mediador en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos la cual muestra una actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo los promotores mutantes, 25 truncados e híbridos, y puede ser obtenido de los genes que codifican los polipéptidos extracelulares e intracelulares ya sea homólogos o heterólogos con respecto a la célula huésped. Los ejemplos de los promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operon Jac de E. Coli, el gen de agarasa de Streptomyces coelic * olor (dagA) , el gen de levansucrasa de Bacill us subtilis (sacB) , el gen de alfa-amilasa de Bacill us licheniformis (amyL) , el gen de amilasa maltogénica de Bacill us stearothermophil us (amyM) , el gen de alfa-amilasa de Bacill us amyloliquefaciens (amyQ) , el gen de penicilinasa de Bacill us li cheniformis (penP) , los genes de xylA y xylB de Bacill us subtilis, y el gen de beta-lactamasa procariótico (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sci ences USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 : 21-25) . Los promotores adicionales son descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria " en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra. Los ejemplos de los promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped * fungosa filamentosa son los promotores obtenidos de los genes para la TAKA amilasa de Aspergill us oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , la alfa-amilasa neutral de Aspergill us niger, la alfa-amilasa estable en condiciones acidas de Aspergillus niger, la glucoamilasa de Aspergill us niger o Aspergillus awamori (glaA) , la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de Aspergill us orizae, la triosa fosfato isomerasa de Aspergill us orizae, la acetamidasa de Aspergill us nidulans, y la proteasa semejante a la tripsina de Fusari um oxysporum (WO 96/00787), así como el promotor de NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para la alfa-amilasa neutral de Aspergillus niger y la triosa fosfato isomerasa de Aspergill us oryzae) , y los promotores híbridos, truncados, mutantes, de los mismos. En un huésped de levadura, los promotores útiles son obtenidos a partir de los genes para la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), la alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP) , y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para las células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488. La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para hacer terminar la transcripción. La secuencia terminadora está enlazada operativamente al extremo o terminal 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. 5 Se puede utilizar cualquier terminador el cual sea funcional en la célula huésped de elección en la presente invención. Los terminadores preferidos para las células huésped fungosas filamentosas son obtenidos de los genes para la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la glucoamilasa 0 de Aspergill us niger, la antranilato sintasa de Aspergill us nidulans, la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y la proteasa semejante a la tripsina de Fusari um oxysporum. Los terminadores preferidos para las células huésped de levadura son obtenidos de los genes para la 5 enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para las células huésped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, supra . 0 La secuencia de control también puede ser una secuencia directora o delantera adecuada, una región no traducida de un ARNm la cual es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia delantera o directora está enlazada operativamente a la terminal o extremidad 5' de la 5 secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. É.?i**,~j * t * .* i .4..- **'J. .? . . .*¡ í-- ... . . . ** **<-. ... .. .. . *.- ..*** *- . ** *. ... ». . . .* *.- , * . * .^ * * tja¡i^aÉaa Cualquier secuencia directora que es funcional en la célula huésped de elección puede ser utilizada en la presente invención. Las secuencias directoras preferidas para las 5 células huésped fungosas filamentosas son obtenidas de los genes para la TAKA amilasa de Aspergill us oryzae y la triosa fosfato isomerasa de Aspergill us nidulans . Las secuencias directoras adecuadas para las células huésped de levadura son obtenidas de los genes para 10 la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), la 3- fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, el factor alfa de la Saccharomyces cerevisiae, y la alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de (ADH2/GAP) Saccharomyces cerevisiae . 15 La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia enlazada operativamente al extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleicos y la cual, cuando es transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para agregar los residuos 20 de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación la cual es funcional en la célula huésped de elección puede ser utilizada en la presente invención. Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células huésped fungosas filamentosas son obtenidas de 25 los genes de TAKA amilasa de Aspergill us oryzae, la Tfiif^lliltfliiÉÉífrlll lÉitlI l T n - .. ^ ...^. ^ .ii. ... . «_«., , ,.,„» „..* ,.? «. ? ? ,„,Hr, 'M il i ,. -, !, -, i I - l mi 1, I I 1 lffirtEllffii glucoamilasa de Aspergill us niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, la proteasa semejante a la tripsina de Fusari um oxysporum, y la alfa-glucosidasa de Aspergill us niger. Las secuencias de poliadenilación útiles para las células huésped de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990. La secuencia de control también puede ser una región de codificación del péptido de la señal que codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al extremo o terminal amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado hacia la ruta secretoria de la célula. El extremo 5' de la secuencia de codificación de la secuencia de ácidos nucleicos puede contener inherentemente una región de codificación del péptido de la señal enlazado naturalmente en la estructura de lectura de traducción con el segmento de la región de codificación la cual codifica el polipéptido secretado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una región de codificación del péptido de la señal la cual es extraña para la secuencia de codificación. La región de codificación del péptido de la señal extraña puede ser requerida en donde la secuencia de codificación no contenga naturalmente una región de codificación del péptido de la señal. Alternativamente, la región de codificación del péptido de la señal extraña puede *ü . «e±?OSai simplemente reemplazar la región de codificación del péptido de la señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, cualquier región de codificación del péptido de la señal la cual dirija el polipéptido expresado hacia la ruta secretoria de una célula huésped de elección puede ser utilizada en la presente invención. Las regiones de codificación del péptido de la señal efectivas para las células huésped bacterianas son las regiones de codificación del péptido de la señal obtenidas de los genes para la amilasa maltogénica NCIB 11837 de Bacill us, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacill us licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, proteasas neutrales de Bacillus stearothermophil us (nprT, nprS, nprM) , y Bacillus subtilis prsA. Los péptidos de la señal adicionales son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137. Las regiones de codificación del péptido de la señal efectivas para las células huésped fungosas filamentosas son las regiones de codificación del péptido de la señal obtenidas de los genes para la TAKA amilasa de Aspergill us oryzae, amilasa neutral de Aspergill us niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, proteinasa aspártica de Rhi zomucor miehei , celulasa de Humicola insolens, y lipasa de Humicola lanuginosa .

' **L " *a-"i- -*-*• Los péptidos de la señal útiles para las células huésped de levadura son obtenidos de los genes para el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la invertasa de Saccharomyces cerevisiae . Otras regiones de codificación del péptido de la señal útiles se describen por Romanos et al., 1992, supra. La secuencia de control también puede ser una región de codificación del propéptido que codifica para una secuenc *ia de aminoácidos colocada en el extremo o terminal amino de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos) . Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede ser convertido a un polipéptido activo maduro por la segmentación catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región de codificación del propéptido puede ser obtenida de los genes para la proteasa alcalina de Bacill us subtilis (aprE) , proteasa neutral de Bacill us subtilis (nprT) , factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) . En donde las regiones tanto del péptido como el propéptido de la señal están presentes en el extremo amino de un polipéptido, la región del propéptido está colocada a continuación del extremo amino de un polipéptido y la región . '. n . . . . > .. \? i -**?*.rY - . - .*--.. -? *^ .. .» . . «urijOBiBifc del péptido de la señal está colocada a continuación del extremo amino de la región del propéptido. También puede ser deseable agregar secuencias reguladoras las cuales permiten la regulación de la expresión del polipéptido con relación al crecimiento de la célula huésped. Los ejemplos de los sistemas reguladores son aquellos que provocan la expresión del gen que va a ser activada o desactivada en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores de lac, tac, y trp. En la levadura, se puede utilizar el sistema de ADH2 o GAL1. En los hongos filamentosos, el promotor de TAKA alfa-amilasa, el promotor de glucoamilasa de Aspergill us niger, y el promotor de glucoamilasa de Aspergill us oryzae pueden ser utilizado como las secuencias reguladoras. Otros ejemplos de las secuencias reguladoras son aquellas las cuales permiten la amplificación de los genes. En los sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa el cual es amplificado en la presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneina los cuales son amplificados con los metales pesados. En estos casos, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica al polipéptido podrían ser enlazados operativamente con la secuencia reguladora. . , «. ^ ,*,...^^-,.-- *.-. . -*- . **. . .. . . - . „„ «rj^ ^.

Vectores de Expresión La presente invención también se refiere a los vectores de expresión recombinante que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención, un promotor, y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Las diversas secuencias de control y de ácidos nucleicos descritas anteriormente pueden ser unidas conjuntamente para producir un vector de expresión recombinante el cual puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o la substitución de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en tales sitios. Alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser expresadas insertando la secuencia de ácidos nucleicos o una construcción de ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia de codificación está localizada en el vector de modo que la secuencia codificadora sea enlazada operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión. El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) el cual pueda ser sometido contenientemente a los procedimientos del ADN recombinantes y puede originar la expresión de la - .^ -.* .1* .

Ifflili ?f T •• *•"* *• -*--'- - -- L .J. ... . ** *.*-. ...*-.**. . *.. *.- . — .. ..-.. ..-.. .. « - . . .. .1 t t iMii secuencia de ácidos nucleicos. La elección del vector depende típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped dentro de la cual va a ser introducido el vector. Los vectores pueden ser plásmidos circulares lineales o cerrados. El vector puede ser un vector que se replica autónomamente, es decir, un vector el cual existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en la célula huésped, es integrado en el genoma y replicado junto con el (los) cromosoma (s) dentro del (de los) cual (es) ha(n) sido integrados. Además, un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos los cuales contienen conjuntamente el ADN total que va a ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposon, pueden ser utilizados. Los vectores de la presente invención contienen preferentemente uno o más marcadores seleccionables los cuales permiten una selección facilitada de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen, el producto del cual proporciona la resistencia biocida o viral, la resistencia a los metales pesados, la prototrofía a los auxótrofos, y semejantes. Los ejemplos de los marcadores seleccionables bacterianos son los genes dai de Bacill us subtilis o Bacill us licheniformis, o los marcadores los cuales confieren una resistencia antibiótica tales como la resistencia a la ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Los marcadores adecuados para las células huésped de la levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Los marcadores seleccionables para su uso en * una célula huésped fungosa filamentosa incluyen, pero no están limitados a, amdS (acetamidasa) , argB (ornitina carbamoiltransferasa) , bar (fosfinotricina acetiltransferasa) , hygB (higromicin fosfotransferasa) , niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidin-5' -fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) , trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. Son preferidos para su uso en una célula de Aspergill us los genes de amdS y pyrG de Aspergill us nidulans o Aspergill us oryzae y el gen bar de Estreptomyces hygroscopicus . Los vectores de la presente invención contienen preferentemente un (os) elemento (s) que permiten la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

MÍ ^ *. . -* „ . , JaMi&igalía Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede estar basado en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma por la recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de ácidos nucleicos adicionales para dirigir la integración por la recombinación homologa en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de los ácidos nucleicos adicionales hacen posible que el vector sea integrado en el genoma de la célula huésped en una(s) localización (es) precisa (s) en el (los) cromosoma (s) . Para incrementar la probabilidad de integración en un sitio preciso, los elementos de integración deben contener preferentemente un número suficiente de ácidos nucleicos, tales como 100 a 1,500 pares base, preferentemente 400 a 1,500 pares base, y aún más preferentemente 800 a 1,500 pares base, los cuales son altamente homólogos con la secuencia de blanco correspondiente para mejorar la probabilidad de la recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia de blanco en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos de integración pueden ser secuencias de ácidos nucleicos codificantes o no codificantes. Por otra parte, el , ., vector puede ser integrado en el genoma de la célula huésped por la recombinación no homologa. Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación del vector para replicarse autónomamente en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de los orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. Coli, y pUBllO, pE194, pTA1060, y pAMßl que permiten la replicación en Bacill us . Los ejemplos de los orígenes de replicación para su uso en una célula huésped de levadura son el origen de 2 mieras de la replicación, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6. El origen de replicación puede ser uno que tiene una mutación la cual hace su funcionamiento sensible a la temperatura en la célula huésped (véase, por ejemplo, Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433) . Más de una copia de una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención puede ser insertada en la célula huésped para incrementar la producción del producto el gen. Un incremento en el número de copias de la secuencia de ácidos nucleicos puede ser obtenida integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable «u amplificable con la secuencia de ácidos nucleicos en donde las células que contienen las copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo tanto las copias adicionales de la secuencia de ácidos nucleicos, pueden ser seleccionadas para el cultivo de las células en la presencia del agente seleccionable apropiado. Los procedimientos utilizados para unir los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de la expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos para un experto en el arte (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) .

Las Células Huésped La presente invención también se refiere a las células huésped recombinantes, que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, las cuales son utilizadas ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención es introducido en una célula huésped de modo que el vector sea mantenido como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico de autorreplicación como se describió previamente. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula paternal que no es idéntica a la célula paternal debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen que codifica el polipéptido y de su fuente. La célula huésped puede ser un microorganismo unicelar, por ejemplo, un procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota. Las células unicelulares útiles son tales como las bacterias gram positivas que incluyen, pero no están limitadas a, una célula de Bacillus, por ejemplo Bacill us alkalophilus, Bacill us amyloliquefaciens, Bacill us brevis, Bacíllus circulans, Bacillus clausii , Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacill us thuringiensis; o una célula de Streptomices; por ejemplo, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. Coli y Pseudomonas sp. En una modalidad preferida, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacill us lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacill us Subtilis . En otra modalidad preferida, la célula de Bacill us es una de Bacill us alcalofílica . La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana, por ejemplo, puede ser efectuada por transformación del protoplasto (véase, por ejemplo, Chang y Cohén, 1979, Molecular General Geneti cs 168: 111-115), utilizando las células competentes (véase, por ejemplo, ..

Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriol ogy 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Mol ecular Bi ology 56:209-221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278) . La célula huésped puede ser un eucariota, tal como una célula de mamífero, de insecto, de planta, o de hongo. En una modalidad preferida, la célula huésped es una célula fungosa. "Hongos" como se utiliza aquí incluye los filum Ascomicota, Basidiomicota, Chytridiomicota, y Zigomicota (como se definieron por Hawksworth et al., en, Ainsworth and Bisby' s Dictionary of the Fungi , 8/a. Edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) así como Oomicota (como se citó en Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra). En una modalidad más preferida, la célula huésped fungosa es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza aquí incluye levadura ascosporogenosa (Endomicetales) , levadura basidiosporogenosa, y la levadura que pertenece a los Hongos Imperfectos (Blastomicetos) . Puesto que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los propósitos de esta invención, levadura será definida como se describió en Bi ol ogy and Acti vi ties of &- .

Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds., Soc. App. Bacteriol . Symposi um Series No. 9, 1980). En una modalidad aún más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Candida , Hansenula , Kl uyveromices, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces , o Yarrowia . En una modalidad más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis , Sacchaaromyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kl uyveri , Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otra modalidad más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Kl uyveromyces lactis . En otra modalidad más preferida, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica . En otra modalidad más preferida, la célula huésped fungosa es una célula fungosa filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen la totalidad de las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se definió por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos están caracterizados por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosán, mañano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo del carbón es obligadamente aeróbico. En contraste, el crecimiento ..Jéit vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por el brote de un tallo unicelular y el catabolismo del carbón puede ser fermentativo. En una modalidad aún más preferida, la célula huésped fungosa filamentosa es una célula de una especie de, pero no está limitada a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma. En una modalidad más preferida, la célula huésped fungosa filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otra modalidad más preferida, la célula huésped fungosa filamentosa es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Furasium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides , o Fusarium venenatum. En una modalidad aún más preferida, la célula paternal fungosa filamentosa es una célula de Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov.). En otra modalidad más preferida, la célula huésped fungosa filamentosa es una célula de Humicola insolens, Humicola lanuginosa , Mucor ,-jíj L ^ ; ^. ... - : - ^U-^^X^ miehei , Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei , o Trichoderma viride. Las células fungosas pueden ser transformadas por un proceso que involucra la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de las células huésped de Aspergillus se describen en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sci ences USA 81: 1470-1474. Los métodos adecuados para la transformación de las especies de Fusarium se describen por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de Producción La presente invención también se refiere a los métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivar una cepa, la cual en su forma del tipo silvestre es capaz de producir el polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. Preferentemente, la cepa es del género Rhodothermus, y más preferentemente de Rhodothermus obamensis. La presente invención también se refiere a los métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. La presente invención también se refiere a los métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones que conduzcan a la producción del polipéptido, en donde la célula huésped comprende una secuencia de ácidos nucleicos mutante que tiene al menos una mutación en el polipéptido que codifica la región de la SEC ID N0:1, en donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido el cual consiste de los aminoácidos de la SEC ID NO: 2, y (b) recuperar el polipéptido. En los métodos de producción de la presente invención, las células son cultivadas en un medio nutriente .... ?*? t. adecuado para la producción del polipéptido utilizando los métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en frascos con agitación, fermentación en pequeña escala o a gran escala (incluyendo las fermentaciones continuas, por lotes, alimentadas por lotes, o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales, efectuadas en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo se lleva a cabo en un medio nutriente adecuado que comprende las fuentes de carbón y de nitrógeno y las sales inorgánicas, utilizando los procedimientos conocidos en el arte. Los medios adecuados están disponibles de los proveedores comerciales o pueden ser preparados de acuerdo con las composiciones publicadas (por ejemplo, en los catálogos del American Type Culture Collection) . Si el polipéptido es secretado en el medio nutriente, ei polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, el mismo puede ser recuperado de los lisados celulares. Los polipéptidos pueden ser detectados utilizando los métodos conocidos en el arte que son específicos para los polipéptidos . Estos métodos de detección pueden incluir el uso de los anticuerpos específicos, la formación de un producto de enzima, o la desaparición de un substrato de enzima. Por ejemplo, en ensayo de enzima puede ser utilizado i. para determinar la actividad del polipéptido como describió aquí. El polipéptido resultante puede ser recuperado por los métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutriente por los procedimientos convencionales que incluyen, pero no están limitados a, la centrifugación, filtración, extracción, deshidratación por aspersión, evaporación, o precipitación. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados por una variedad de procedimientos conocidos en el arte que incluyen, pero no están limitados a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, por afinidad, hidrofóbica, por cromatoenfocamiento, y por exclusión de tamaño) , procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfocamiento isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo precipitación con sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purifica ci ón , J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) .

Plantas La presente invención también se refiere a una planta transgénica, una parte de la planta, o una célula de la planta la cual ha sido transformada con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene una .y.. actividad de enzima ramificadora de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables . El polipéptido puede ser recuperado de la planta o la parte de la planta . Alternativamente, la planta o la parte de la planta que contiene el polipéptido recombinante puede ser utilizado como tal para mejorar la calidad de un alimento o de la alimentación, por ej emplo, para mej orar el valor nutritivo, la aceptabilidad, y las propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo . La planta transgénica puede ser dicotiledónea (un dicotiledón) o monocotiledónea (un monocotiledón) . Los ej emplos de las plantas monocotiledóneas son las hierbas , tales como las hierbas de las praderas (hierba azul sedosa, Poa ) , hierbas forraj eras tales como del género Festuca, Lolium, hierbas de clima templado, tales como Agrostis, y cereales , por ej emplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo , y maí z ( granos i . Los ej emplos de las plantas dicotiledóneas son el tabaco , las legumbres , tales como lupinos , papa, remolacha, arvej a, haba y soya, y las plantas cruciferas ( familia Brassicaceae ) , tales como la coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo relacionado estrechamente de Arabidopsis thaliana .

Los ejemplos de las partes de la planta son el tallo, el callo, las hojas, la raíz, las frutas, la semillas, y los tubérculos. También los tejidos de las plantas específicos, tales como los cloroplastos, apoplastos, mitocondrias, vacuolas, peroxisomas, y citoplasma se considera que van a ser una parte de la planta. Además, cualquier célula de la planta, cualquiera que sea el tejido original, se considera que va a ser una parte de la planta. También está incluida dentro del alcance de la presente invención la progenie de tales plantas, lad partes de la planta y las células de la planta. La planta o la célula de la planta transgénica que expresa un polipéptido de la presente invención puede ser construida de acuerdo con los métodos conocidos en el arte. Brevemente, la planta o célula de la planta es construida incorporando una o más construcciones de la expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma huésped de la planta y la propagación de ia planta o célula de la planta modificada resultante en una planta o célula de la planta transgénica. Convenientemente, la construcción de ia expresión es una construcción de ácido nucleico la cual comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un poiipéptido de la presente invención enlazado operativamente con las «.La.j secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta o parte de la planta de elección. Además, la construcción de la expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar las células huésped dentro de las cuales la construcción de la expresión ha sido integrada y las secuencias de ADN necesarias para la introducción de la construcción en la planta en cuestión (esta última depende del método de introducción del ADN que va a ser utilizado) . La elección de las secuencias reguladoras, tales como las secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente las secuencias de señalización o de tránsito, es determinada, por ejemplo,' con base en cuando, donde, y cómo se desea que sea expresado el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica para el desarrollo, la etapa o el tejido, y el producto del gen puede ser etiquetado a un tejido o parte de la planta específica tal como las semillas o las hojas. Las secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506. Para la expresión constitutiva, el promotor de 35S- CaMV puede ser utilizado (Franck et al, 1980, Cell 21: 285- 294) . Los promotores específicos para los órganos pueden ser, por ejemplo, un promotor de los tejidos con cavidades nBMfcA.... I i ' . .. t*,t .. itA-í ** -.-H? J- . . . _ , t , , -»^a¡fcMfA*iBÍ para almacenamiento tales como semillas, tubérculos de papa, y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet . 24: 275-303), o de tejidos con cavidades metabólicas tales como los meristemos (Ito et al., 1994, PJant Mol . Biol . 24: 863-878), un promotor específico de las semillas tales como el promotor de glutelina, prolamina, globulina, o albúmina del arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889) , un promotor de Vicia faba de la leguminosa B4 y el gen de proteína de una semilla desconocida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo aceitoso de la semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor de napA de la proteína de almacenamiento de Brassica napus , o cualquier otro promotor específico de la semilla conocido en el arte, por ejemplo, como se describió en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico para la hoja tal como el promotor rbcs del arroz o del tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, el promotor del gen de adenina etiltransferasa del virus de clórela (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Bi ol ogy 26: 85-93), o el promotor del gen de aldP del arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promotor inducible por arrollamiento o envoltura tal como el promotor pin2 de la papa (Xu et al., 1993, Plan t Molecular Biology 22: 573-588). a-tífti..,.

Un elemento mejorador del promotor también puede ser utilizado para lograr la expresión más elevada de la enzima en la planta. Por ejemplo, el elemento mejorador del promotor puede ser un intrón el cual es colocado entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra, describe el uso del primer intrón del gen de actina 1 del arroz para mejorar la expresión. El gen marcador seleccionable y cualesquiera otras partes de la construcción de la expresión pueden ser elegidos de aquellos disponibles en el arte. La construcción de ácidos nucleicos es incorporada en el genoma de la planta de acuerdo con las técnicas convencionales en el arte, incluyendo la transformación mediada con Agrobacterium, la transformación mediada con un virus, la microinyección, el bombardeo de partículas, la transformación biolística, y la electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274). Actualmente, la transferencia de los genes mediada por Agrobacteri um tumefaciens es el método de elección para generar plantas dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, véase Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Mol ecular Bi ology 19: 15-38). Sin embargo, también se puede utilizar para transformar las plantas monocotiledóneas, i .f . . ;_. . . r¿&*áéy?¿ aunque otros métodos de transformación son preferidos generalmente para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar plantas monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas de tungsteno o de oro microscópicas recubiertas con el ADN de transformación) o los callos embriónicos o los embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinión Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674) . Un método alternativo para la transformación de las plantas monocotiledóneas está basado en la transformación de los protoplastos como se describió por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Bi ol ogy 21: 415-428. A continuación de la transformación, los agentes transformantes que tienen incorporado en los mismos la construcción de la expresión son seleccionados y regenerados dentro de las plantas completas de acuerdo con los métodos bien conocidos en el arte. La presente invención también se refiere a los métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivar una planta a una célula de la planta transgénica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene una actividad de enzima ramificadora de la presente invención <*SJ3a&. t . . «.» i » ~ U.i i , . - , -. .. . je*Mi »JBÍ bajo las condiciones que conduce a la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

Composiciones En un aspecto todavía adicional, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferentemente, las composiciones son enriquecidas en un polipéptido de la presente invención. En el presente contexto, el término "enriquecido" indica que la actividad de la enzima ramificadora de la composición ha sido incrementada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de 1.1. La composición puede comprender un polipéptido de la invención como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición de monocomponente. Alternativamente, ia composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples, tales como una a mopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrin glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidogiutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, í¿. enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, o xilanasa. Las composiciones de polipéptidos pueden ser preparadas de acuerdo con los métodos conocidos en el arte y pueden estar en la forma de un líquido o de una composición seca. Por ejemplo, la composición del polipéptido puede estar en la forma de un granulado o de un microgranulado. El polipéptido que va a ser incluido en la composición puede ser estabilizado de acuerdo con los métodos conocidos en el arte. Los ejemplos de los usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención se dan posteriormente. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones bajo las cuales ia composición es utilizada, pueden ser determinadas con base en los métodos conocidos en el arte.

Composiciones Detergentes Las enzimas de ramificación de la invención pueden ser agregadas a, y así pueden llegar a ser un componente, de una composición detergente. La composición detergente de la invención puede ser formulada por ejemplo como una composición detergente para lavar a mano o para lavar a máquina que incluye una composición aditiva para lavandería adecuada para el pre- .U. tratamiento de los tejidos teñidos y una composición ablandadora del tejido agregada en el enjuague, o puede ser formulada como una composición detergente para su uso en operaciones de limpieza de superficies duras caseras, 5 generales, o puede ser formulada para operaciones de lavado de platos a mano o en una máquina. En un aspecto preferido, la invención proporciona un aditivo para detergente que comprende las enzimas de ramificación de la invención. El aditivo del detergente así 10 como la composición detergente pueden comprender una o más de otras enzimas tales como una proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, por ejemplo, una lacasa, y/o una peroxidasa. 15 En general las propiedades de la(s) enzima (s) elegida (s) debe (n) ser compatible (s) con el detergente seleccionado, (es decir de pH óptimo, y con compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima (s) deben estar presentes en cantidades 20 efectivas. Proteasas : Las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefieren las de origen microbiano. Los mutantes diseñados con proteínas o modificados químicamente están incluidos. La proteasa puede 25 ser una serina proteasa o una metalo proteasa, , ».í-*a--le&ll?hWntS^&aB¡.- . . i -. - i. -, -* . . > . , . ..^«a&MBMtS preferentemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa semejante a la tripsina. Los ejemplos de las proteasas alcalinas son las subtilisinas; especialmente aquellas derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279) . Los ejemplos de las proteasas semejantes a la tripsina son la tripsina (por ejemplo de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94/25583. Los ejemplos de las proteasas útiles son las variantes descritas en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946, especialmente las variantes con substituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274. Las enzimas de proteasa disponibles comercialmente, preferidas, incluyen Alcalase™, Savinase™, Primase™, Duralase™, Esperase™, y Kannase™ (Novo Nordisk A/S) , Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect™, Purafect OxP™, FN2™, y FN3™ (Genencor International Inc.).

Lipasas : Las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fungoso. Los mutantes diseñados con proteínas o modificados químicamente están incluidos. Los ejemplos de las lipasas útiles incluyen las lipasas de Humicola (sinónimo Ter omyces) , por ejemplo de H. Lanuginosa ( T. ,Ü, > Lanuginosus) como se describió en EP 258 068 y EP 305 216 o de H. Insolens como se describió en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo de P. Alcaligenes o de P. Seudoalcaligenes (EP 218 272), P. Cepacia (EP 331 376), P. Stutzeri (GB 1,372,034), P. Fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. Wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacill us, por ejemplo de B. Subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. Estearothermophilus (JP 64/744992) o B. Pumil us (WO 91/16422) . Otros ejemplos son las variantes de lipasa tales como aquellas descritas en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14733, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Las enzimas de lipasa disponibles comercialmente preferidas, inclyen Lipolase™, Lipolase Ultra™ y Lipomax™ (Novo Nordisk A/S) . Amilasas : Las amiiasas adecuadas (a y/o ß) incluyen aquellas de origen bacteriano o fungoso. Están incluidos los mutantes diseñados con proteínas o modificados químicamente. Las amilasas incluyen, por ejemplo, las a-amilasas obtenidas de Bacill us , por ejemplo una cepa especial de B. Licheniformis, descrita con mayor detalle en GB 1,296,839.

* \ - Los ejemplos de las amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con substituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444. Las amilasas disponibles comercialmente son Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™ y BAN™ (Novo Nordisk A/S), Rapidase™ y Purastar™ (de Genencor International Inc.). Celulasas : Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen fungoso o bacteriano. Están incluidos los mutantes diseñados con proteínas o modificados químicamente. Las celulasas adecuadas incluyen las celulasas de los géneros Bacill us , Pseudomonas, Humicola, Fusari um, Thielavia, Acremoni um, por ejemplo las celulasas fungosas producidas de Humi cola insol ens , Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,173, US 5,776,757 y WO 89/09259. Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutrales que tienen beneficios para el cuidado del color. Los ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de celulasa tales como aquellas descritas en WO j i s. **?« g. ^ 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299. Las celulasas disponibles comercialmente incluyen Celluzyme™ y Carezyme™ (Novo Nordisk A/S), Clazinase™, y Puradax HA™ (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)™ (Kao Corporation) . Peroxidasas/Qxidasas : Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fungoso. Están incluidos los mutantes diseñados con proteínas o modificados químicamente. Los ejemplos de las peroxidasas útiles incluyen las peroxidasas de Coprinus, por ejemplo de C. cinereus, y las variantes de las mismas como aquellas descritas en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257. Las peroxidasas disponibles comercialmente incluyen Guardzyme™ (Novo Nordisk A/S) . La(s) enzima (s) detergente (s) puede (n) ser incluida (s) en una composición detergente agregando aditivos separados que contienen una o más enzimas, o agregando un aditivo combinado que comprende la totalidad de estas enzimas. Un aditivo detergente de la invención, es decir un aditivo separado o un aditivo combinado, pueden ser formulados por ejemplo como un granulado, un líquido, una suspensión, etc. Las formulaciones aditivas detergentes preferidas son los granulados, en particular los granulados que no forman polvo, particulares, los líquidos, en particular los líquidos estabilizados, o las suspensiones. Los granulados que no forman polvo pueden ser producidos, por ejemplo, como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452 y pueden ser recubiertos opcionalmente por los métodos conocidos en el arte. Los ejemplos de los materiales de recubrimiento cerosos son los productos de poli (óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares promedio de 1000 a 20000; los nonilfenoles etoxilados que tienen desde 16 hasta 50 unidades de óxido de etileno; los alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene desde 12 hasta 20 átomos de carbono y en los cuales existen 15 a 80 unidades de óxido de etileno; los alcoholes grasos; ios ácidos grasos; y los mono- y di- y triglicéridos de los ácidos grasos. Los ejemplos de los materiales de recubrimiento que forman una película, adecuados para la aplicación por técnicas de lecho fluidizado se dan en GB 1483591. Las preparaciones de enzimas líquidas, por ejemplo, pueden ser estabilizadas agregando un polio! cal como el propilenglicol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo con los métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden ser preparadas de acuerdo con el método descrito en EP 238,216. La composición detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una ,.ay. barra, una tableta, un polvo, un granulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, conteniendo típicamente hasta 70% de agua y 0-30% de un solvente orgánico, o no acuoso. La composición detergente comprende uno o más agentes tensioactivos, los cuales pueden ser no iónicos incluyendo semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos. Los agentes tensioactivos están presentes típicamente a un nivel desde 0.1% hasta 60% en peso. Cuando está incluido allí, el detergente usualmente contendrá desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 40% de un agente tensioactivo aniónico tal como alquilbencensulfonato lineal,' alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcansulfonato secundario, éster metílico del ácido graso alfa-sulfo, ácido alquil- o alquenilsuccínico o j abón . Cuando está incluido allí, el detergente usualmente contendrá desde aproximadamente 0.2% hasta aproximadamente 40% de un agente tensioactivo no iónico tai como el etoxilato de alcohol, el etoxilato de nonilfenol, el alquilpoliglicósido, el alquildimetilaminóxido, la monometanol-amida de ácido graso etoxilado, la monoetanolamida de ácido graso, la amida del ácido graso de .Li polihidroxi alquilo, o los derivados de N-acil N-alquilo de la glucosamina ("glucosamidas") . El detergente puede contener 0-65% de un agente constructor o que forma un complejo con el detergente tal como la zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiamintetraacético, ácido dietiltriaminpentaacético, ácido alquil- o alquenilsuccínico, los silicatos solubles o los silicatos estratificados (por ejemplo SKS-6 de Hoechst) . El detergente puede comprender uno o más polímeros.

Los ejemplos son la carboximetilcelulosa, poli (vinilpirrolidona) , poli (etilenglicol) , poli (alcohol vinílico), poli (vinilpiridin-N-óxido) , poli (vinilimidazol) , policarboxilatos tales como los poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de ácido acrílico/metacrilato de laurilo. El detergente puede contener un sistema blanqueador, el cual puede comprender una fuente de H20r tal como perborato o percarbonato, el cual puede ser combinado con un activador del blanqueado que forma un perácido tal como la tetraacetiletilendiamina o nonanoiloxibencensulfonato. Alternativamente, el sistema blanquedor puede comprender los perácidos por ejemplo del tipo de la amida, imida, o sulfona.

La(s) enzima (s) de la composición detergente de la invención pueden ser estabilizadas utilizando los agentes de estabilización convencionales, por ejemplo, un poliol tal como el propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster del borato aromático, o un derivado del ácido fenil borónico, tal como el ácido 4-formilfenil borónico, y la composición puede ser formulada como se describió por ejemplo en WO 92/19709 y WO 92/19708. El detergente también puede contener otros ingredientes detergentes convencionales tales como por ejemplo acondicionadores de los tejidos incluyendo las arcillas, fomentadores de la espuma, supresores de las jabonaduras, agentes anticorrosión, agentes de suspensión de las manchas, agentes de redeposición antimanchado, tintes, bactericidas, abrillantadores ópticos, hidrótropos, inhibidores del empañamiento, o perfumes. Se contempla en el presente que en las composiciones detergentes cualquier enzima, en particular ias enzimas de ramificación de la invención, pueden ser agregadas en una cantidad que corresponde a 0.01-100 mg de la proteína de enzima por litro de licor de lavado, preferentemente 0.05-5 mg de la proteína de enzima por litro del licor de lavado, en particular 0.1-1 mg de la proteína de enzima por litro del licor de lavado.

U, Las enzimas ramif icadoras de la invención pueden ser incorporadas adicionalmente en las formulaciones detergentes descritas en WO 97/07202, la cual es incorporada aquí para referencia . 5 Usos La presente invención también está dirigida a los métodos para utilizar los polipéptido que tienen una actividad de enzima ramificadora. Por ejemplo, los 0 polipéptidos de la invención pueden ser utilizados para la modificación del almidón o del almidón que contiene materiales para mejorar las propiedades de tales materiales. Los ejemplos de los materiales que pueden ser modificados con la BE incluyen el almidón natural (no 5 modificado) de todos los tipos (papa, maíz, trigo), almidones cerosos, almidones con contenido elevado de amilosa, amilosa, amilopectina, almidones modificados químicamente que incluyen dextrinas, almidón convertido, almidón reticulado (fosfato di-almidón), éteres de almidón y 0 esteres de almidón (acetato de almidón, almidón hidroxialquilado, almidón con succinato de octenilo) . La BE de la invención es útil para la modificación de un material semejante al almidón, como se describió anteriormente, para hacer al material modificado más 5 adecuado para sus propósitos propuestos, por ejemplo en la preparación de productos alimenticios como se describió en US 4 454 161, por ejemplo composiciones de alimentación y bebida, composiciones aditivas para los alimentos, preparaciones farmacéuticas, agentes de encoladura, adhesivos, etc. Normalmente los materiales de almidón modificados con la BE tienen una solubilidad elevada, una viscosidad baja y una tendencia menor a la inversión comparado con al almidón no modificado. Estas propiedades pueden ser utilizadas para mejorar las propiedades de los productos alimenticios preparados a partir del material semejante al almidón, especialmente la estabilidad en el almacenamiento de tales productos. Los ejemplos de los productos alimenticios son: pan, dulces, pasteles, bocadillos, tallarines y pastas, comida para bebés, bebidas deportivas, alimentos procesados que son congelados o almacenados en frío y alimentos para mascotas. La modificación enzimática puede ser efectuada ya sea sobre un material semejante ai almidón antes de la adición al producto alimenticio o agregando la enzima al material alimenticio antes o justo después de la cocción, haciendo la modificación directamente en el alimento. Para la encoladura superficial y el recubrimiento del papel, la solubilidad elevada, la viscosidad baja y la buena estabilidad de las soluciones de almidón utilizadas son muy importantes para fabricar el almidón modificado con BE para estas aplicaciones como se muestra en EP 0 690 170. La presente invención es descrita además por los siguientes ej emplos, la cual no debe ser interpretada como limitativa del alcance de la invención .

EJEMPLO 1 Materiales y Métodos El Rhodothermus obamensis (JCM 9785) se obtuvo de Japan Collection of Microorganisms, The Institute of Physical and Chemical Research, Wako, Saitama 351-0198, Japón. Las técnicas de clonación molecular son descritas en J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cl oning, A Labora tory Manual , 2/a. Edición, Cold Spring Harbor, New York. Los siguientes plásmidos/vectores comerciales fueron utilizados: PT7Blue (Invitrogen, Netherlands) PBluescript SK(-) (Stratagene, U.S.A.) PBAD/Myc-HisA (Invitrogen, Netherlands) . Las siguientes cepas fueron utilizadas para la transformación y expresión de las proteínas: TOP10 E. Coli (Invitrogen, Netherlands) lX-4...

DH12S de E. Coli (GIBCO BRL, Life Technologies, E.U.A.) El medio de crecimiento de SB (DIFCO #0123-17-3) está compuesto de: tripton/pepton, 32 g/1; 5 extracto de levadura, 20 g/1; NaCl, 5 g/1; 5N NaOH, 1 ml/l. Las substancias químicas utilizadas como amortiguadores y substratos fueron los productos comerciales 10 de un grado al menos reactivo.

Actividad de la enzima ramifisadora La actividad de la BE se determinó de acuerdo con una versión modificada del procedimiento descrito por Takata 15 et al., Applied and Environmental Microbiology (1994), p. 3097 (ensayo A) : 50 µl de la solución de enzima se mezclan con 50 µl de la solución del substrato y se incuban durante 30 minutos a la temperatura de prueba. La solución del substrato es de 20 amilosa del tipo III al 0.1% disuelta en el amortiguador de Tris 0.1 M. La reacción es terminada por la adición de 2 ml del reactivo de yodo. El reactivo de yodo se hace diariamente a partir de 0.5 ml de la solución en almacenamiento (0.26 g de I2 y 2.6 g de Kl en 10 ml de agua) 25 mezclada con 0.5 ml de HCl 1 N y se diluye hasta 130 ml . La ma ii^^¡ át?? ..?_L mezcla es incubada durante 15 minutos a temperatura ambiente para estabilizar el color. La actividad es medida como la diferencia en ßßo entre la muestra probada y un control en el cual el extracto celular es reemplazado por agua. Una unidad de la actividad de la enzima ramificadora está definida como la cantidad de la enzima que puede reducir la A^o del complejo de amilosa-yodo en 1% por minuto a 60 °C, pH 7.0.

Preparación de una sonda de glgB de R. Obamensis Los cebadores a) (SEC ID NO: 3) y b) (SEC ID NO: 4) fueron diseñados (con base en la alineación de las secuencias de glgB bacterianas reportadas) , preparadas y utilizadas en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el ADN genómico de Rhodothermos obamensis.

SEC ID NO: 3, cebador a) para la PCR (delantero): 5' -GAGCACCCCYTCGACGGCAGTTGG-3' SEC ID NO:4, cebador b) para la PCR (trasero): 5' -CATCCAICCWAKRTTCCA-3' I = inosina K = G o T R = A o G W = A o T u» Y = C o T Los componentes de la reacción fueron mezclados [ADN genómico, 0.1 ng/µl; dNTPs 0.125 mM cada uno; Mg2+, 2.5 mM; cebador, 2 pM cada uno; Taq polimerasa 0.025 U/µl en IX amortiguador (Roche Diagnostics, Japan) ] y sometidas a PCR bajo las siguientes condiciones: Tabla 1. ?l Paso 4 al Paso 6 fueron reoetidos 30 minutos.

La mezcla de la reacción de la PCR fue separada sobre un gel de agarosa y el tamaño esperado de los fragmentos de PCR glgB amplificados fue calculado a partir de los datos de la secuencia de glgB de E. Coli, conduciendo a aproximadamente 580 pb. Estos fragmentos fueron purificados con gel con QIAquick (QIAGEN, Japón), y luego se unió a un vector pT7Blue utilizando el conjunto de unión ver. 2 de Takara (Takara, Japón). La mezcla de unión se purificó con fenol/cloroformo, y luego se transformó en DH12S de E. Coli por electroporación. El plásmido (pMSrad) del agente de transformación obtenido fue verificado por digestión de la enzima de restricción para confirmar el tamaño del inserto de glgB de Rhodothermus obamensis .

Clonación del gen de glgB de R. Obamensis Utilizando el fragmento insertado de PMSra8 como una sonda de glgB de R. Obamensis, se efectuó la hibridación de Southern sobre el ADN genómico digerido del R. Obamensis para seleccionar las enzimas de restricción convenientes para generar los succiones . Un fragmento de BamHl hibridizado de 3.5-kb fue seleccionado para un subclon de glgB . Por lo tanto, ei ADN genómico dei R. C amensis se digirió con BamHl, y el ADN de tamaño fraccionado fue retirado por corte a partir de geies de agarosa y clonados en pBluescript SK(-) . La sub-biblioteca de BamHl se hizo per ia transformación de los clones unidos en ias células ce DH12S de E. Coli . ?l levantamiento de la colonia fue efectuado sobre los agentes de transformación de la sub-biblioteca de BamHl utilizando las membranas Hybond-N* (Amersham Pharmacia Biotech, Japón) , y luego se hibridizó a la sonda de glgB de R. Obamensi s etiquetada ccn DIG. Las colonias positivas fueron seleccionadas y los insertos fueron verificados por PCR. Los plásmidos de las colonias seleccionadas fueron preparados y secuenciados revelando que el fragmento de BamHl de 3.5 kb estuvo omitido de la terminal 5' de glgB (pMSralO) . En consecuencia, otra sub- blioteca hecha del ADN genómico de R. Obamensis digerido doblemente con Kpnl y Salí fue seleccionada con la sonda de glgB de R. Obamensis para recuperar la terminal 5' del glgB de R. Obamensis (pMSra29) . La secuencia total del glgB estructural fue obtenida de pMSralO y pMSra29, y los cebadores de PCR (SEC ID NO: 5 y la SEC ID NO: 6) para la amplificación del gen completo de glgB fueron designados a partir de esta secuencia.

Construcción de los vectores de expresión Utilizando los cebadores c) (SEC ID NO: 5) y d) (SEC ID NO: 6) los cuales incluyen respectivamente un sitio de ia enzima de restricción SspHI y uno de HindI I I, el gen de glgB completo fue amplificado por PCR a partir del ADN genómico de Rhodothermus Obamensis (para evitar las mutaciones durante la reacción de PCR, se utilizó el conjunto Expand High Fidelity de Boehringer Mannheim) . El corte del fragmento amplificado por PCR con BspHI y HindIII permitió la clonación direccional en un vector de pBAD/myc-HisA digerido con Ncol y Hindl l l . El vector pMSra33 resultante a.¿,--produjo la BE de R. Obamensis después de la transformación en TOP10 de E. coli y la inducción con arabinosa.

SEC ID NO: 5, Cebador c) ; cebador de PCR (delantero) para la amplificación del gen de glgB de Rhodothermus Obamensis. Los nucleótidos subrayados introducen el sitio de BspHI: 5' -TTCCTCATGAGCTGGCTCACGGAAGAAGACA-3' SEC ID NO: 6, Cebador D) ; cebador de PCR (trasero) para la amplificación del gen de glgB de Rhodothermus Obamensis . Los nucleótidos subrayados introducen el sitio de HindIII: 5' -GTTTAAAGCTTTTCAGGACGGCTACC-3' Depósito Biológico DSM 12607 El plásmido pT7Blue con el gen de glgB de Rhodothermus Obamensis completo (?EC ID N0:1) también fue transformado en E. coli DH12S, el cual fue depositado en DSMZ como DSM 12607 (descrito en ei Depósito del Material Biológico) .

Expresión de la proteína La BE de R. Obamensis fue expresada heterólogamente en la cepa de E. coli TOP10 transformada con pMSra33. Las células de E. coli fueron incubadas en el medio de SB con 100 µg/ml de ampicilina a 28 °C toda la noche. La arabinosa al 0.0002% fue agregada para la inducción de la expresión. Las células fueron agitadas de manera giratoria por centrifugación y se volvieron a suspender en el amortiguador de fosfato 20 mM (pH 6.0). La cantidad del amortiguador correspondió a 1/20 del medio de crecimiento. Las células fueron sometidas entonces a la acción del sonido y los desechos fueron removidos por centrifugación.

Remoción de la actividad amilolítica endógena del E. coli Removiendo toda la actividad amilolítica endógena del extracto de E. coli, llega a ser posible utilizar el método del yodo (Takata et al., Applied and Environmental Microbiology (1994), p. 3097) para detectar la actividad de BE expresada. En consecuencia se probó si el tratamiento con calor podría ser utilizado para eliminar la actividad amilolítica endógena de la cepa de E. coli huésped con el vector de pBAD/Myc-HisA y ningún inserto de glgB (control negativo) . Los resultados mostraron que un tratamiento de 60 °C/20 minutos fue suficiente para exterminar con calor la actividad amilolítica del fondo medida con el ensayo de amilosa-yodo descrito por Takata et al., en donde no existió actividad detectada.

Purificación parcial de la variante Y397C+L419P de la BE de R . Obamensis La secuenciación de una BE de R. Obamensis expresada reveló que dos cambios comparados con la secuencia de aminoácidos madura de la SEC ID NO: 2 han sido introducidos durante el proceso de PCR: a) Tyr397 se cambió a Cys397 b) Leu419 se cambió a Pro419. Esta variante de BE es denotada aquí posteriormente como "Y397C+L419P".

La BE de R. Obamensis con las substituciones Y397C+L419P expresadas en E. coli fue purificada parcialmente por cromatografía de columna de intercambio iónico e hidroxiapatita. El extracto celular tratado con calor fue dializado y aplicado a Super-Q Toyopearl (22 mm x 200 mm, TOSOH) , luego se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 0.6 M de NaCl en la solución amortiguadora de fosfato de potasio 50 mM (pH 7.4). Las fracciones que tuvieron la actividad de la enzima ramificadora fueron colectadas y aplicadas a la Hidroxiapatita del Tipo I Cerámica de Macro-prep (14 mm x 100 mm, BioRad), luego se eluyen con un gradiente de 5 a 400 mM de fosfato de sodio (pH 6.5) . Las fracciones que muestran la actividad fueron colectadas. Se Jri... mostró una banda principal con una pareja de bandas menores sobre SDS-PAGE con el teñido de azul brillante de Coomassie.

Formación del enlace de ramificación 5 La formación del enlace de ramificación a-1, 6 fue confirmada por la versión modificada del ensayo del enlace de ramificación (BL assay, Takeda et al., Carbohydrate Research, 240 253-260 (1993)). El substrato utilizado fue la amilosa del tipo III al 0.5% (Sigma) disuelta en Tris-HCl 10 100 mM (pH 7.5). El substrato (90 µl) y la solución de la enzima (10 µl) se mezclaron y se incubaron a 60 °C durante 30 minutos, luego la reacción de terminó por ebullición durante 4 minutos. Después de ia adición de 10 µl de amortiguador de acetato 1 M de pH 4.1, ya sea 5 µl de isoamilasa (1 mg/ml, 15 Hayashibara Co . Ltd.) o 5 µl de agua desionizada fueron agregados a la mezcla de la reacción. La misma se incubó a 45 °C durante 45 minutos. A la solución de la reacción se agregaron entonces 460 µl del etanol enfriado con hielo y se mantuvo en hielo durante 10 minutos. Los sacáridos 20 precipitados fueron colectados por centrifugación a 12,000 rpm durante 5 minutos y se secaron con vacío una vez, luego se disolvieron nuevamente en 8 µl de NaOH 1N y 292 µl de agua desionizada. El poder reductor de la solución se midió utilizando el método del ácido 3, 5-dinitrosalicílico 25 modificado (Luchsinger y Cornesky, 1962) . La solución de DNS fue preparada disolviendo 0.05 g del ácido 3,5- dinitrosalicílico en 10 ml de NaOH 2N en primer lugar, luego se agregan 3 g de la sal de Rochelle a la solución, y finalmente el volumen total se ajustó a 15 ml con agua desionizada. La solución de la muestra (0.2-0.3 ml) se mezcló con 0.4 ml de la solución de DNS y se hirvió durante 5 minutos. Después del enfriamiento con agua corriente, se agregan 1.8 ml de agua a la mezcla de la reacción y se mide la absorbencia a 525 nm. La cantidad de los extremos reductores se estimó como equivalente a la cantidad de la glucosa. La muestra purificada parcialmente de Y397C+L419P fue utilizada para la medición de la formación del enlace de ramificación. Como se muestra en la Tabla 5, los extremos reductores fueron producidos con el tratamiento de isoamilasa, que indicó que el enlace de ramificación a-1, 6 fue formado Dor el Y397C+L419P.

Tabla 2 . ?*.

EJEMPLO 2 Efecto de la temperatura y del pH para la variante Y397C+L419P de la BE La temperatura y el pH óptimos fueron evaluados para la variante Y397C+L419P de BE (descrita en el Ej emplo 1 ) . El ensayo utilizado para la medición de la actividad de BE se efectuó como se describió en la sección de Materiales y Métodos . Para evitar la actividad amilolítica endógena del E. coli que expresa ia BE de R.

Obamensis, los extractos celulares fueron precalentados a 60 °C durante al menos 20 minutos y los desechos fueron removidos por centrifugación . El extracto celular precalentado fue sometido entonces a ensayos y se analizó para veri ficar la actividad de BE . En el ensayo de pH óptimo, se utilizaron diferentes amortiguadores para preparar las soluciones de los substratos : pH < 4 citrato de sodio 0 . 1 M 4 < pH < 5 acetato de sodio 0 . 1 M 6 < pH < 10 Tris 0 . 1 M pH > 10 0 . 1 M glisilglicina .

La enzima (Y397C+L419P) fue incubada a la temperatura indicada durante 30 minutos a pH 7.0. La actividad de la enzima ramificadora fue medida como se describió anteriormente. Los experimentos fueron efectuados al menos por triplicado; los valores promedios y las desviaciones estándares son mostrados en la tabla 2 y la tabla 3 posteriormente. Los datos muestran la temperatura óptima de la Y397C+L419P que va a ser de alrededor de 65 °C.

Tabla 3, Tabla 4 Los experimentos de la actividad del pH se hicieron a 60 °C, y la enzima se incubó durante 30 minutos. Los experimentos fueron efectuados al menos por triplicado; los valores promedio y las desviaciones estándares se muestran en la tabla 4 posterior. Los datos indican que la Y397C+L419P tuvo un intervalo de pH amplio óptimo de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 8.

Tabla 5.

EJEMPLO 3 Preparación de ciclo dextrinas por la variante Y397C+L419P de la BE La amilopectina del arroz (Motyl B, Shimada Chemical, Japón) fue tratada con la 3E de R. Cbamensis con las substituciones de Y397C+L419P (descritas en el Ejemplo 1) (400 unidades/g de almidón) en ei amortiguador de Tris-HCl (pH 7) a 50 °C durante 18 horas. Después de remover los desechos por centrifugación a 15,000 rpm durante 10 minutos, se agregan 2 volúmenes de etanol a la solución y la dextrina precipitada fue recuperada y secada. A.proximadamente 67 g de la dextrina se obtuvieron a partir de 100 g de amilopectina de arroz. Si ha ocurrido el enlace de ramificación intramolecular por el tratamiento con la enzima, la dextrina cíclica que es tolerante a la glucoamilasa debe ser obtenida. Un gramo de la dextrina mencionada anteriormente se trató con 1500 unidades de glucoamilasa (Rhi zopus sp. Wako Puré Chemicals, Japón) a pH 4.1, 40 °C durante 18 horas, y la dextrina resultante se recuperó por medio de etanol. Aproximadamente 200 g de dextrina fueron obtenidos. No existió dextrina obtenida con el tratamiento en la presencia de la a-amilasa acida. La dextrina resistente a la glucoamilasa se trató nuevamente solo con la glucoamilasa (0.9 unidades/g de dextrina) o en la combinación de la glucoamilasa y la isoamilasa (0.9 unidades y 29 unidades por g de dextrina, respectivamente) a pH 4.5, 40 °C durante 16 horas. Como resultado, 90% de la dextrina fue recuperada son glucoamilasa solamente, mientras que solo 10% de dextrina permaneció después del tratamiento en la presencia de la isoamilasa. Se indicó que la dextrina cíclica se formó por enlace de ramificación a-1, 6 intramolecular catalizado por Y397C+L419P.

EJEMPLO 4 Expresión de la BE de R. Obamensis en Aspergillus Organismo Huésped El BECh2 de Aspergill us oryzae se describe en la 5 Solicitud de patente Danesa PA 1999 01726. La misma es un muíante de JaL228 (descrito en 098/123000), la cuai es un mutante de IF04177. Transformación de A. Oryze a cepa BECh2 de Aspergill us oryzae fue inoculada en 100 ml del medio de YPG y se incubó a 32 °C durante 16 10 horas con agitación a 80 rpm. Los micelios que se hicieron crecer fueron colectados por filtración seguido por lavado con KCl 0.6 M y se volvieron a suspender en 30 ml de KCl 0.6 M que contiene Glucanex® (disponible de Novo Nordisk) a la concentración de 30 µl/ml. La mezcla se incuba a 32 °C con la 15 agitación a 60 rpm hasta que se forman los protoplastos. Después de la filtración para remover los micelios restantes, los protoplastos fueron colectados por centrifugación y se lavaron con el amortiguador de STC dos veces. Los protoplastos fueron contados con un hematitómetro 20 y se volvieron a suspender en una solución de STC: STPC: DMSO (8:2:0.1) a una concentración final de 1.2 x 107 protoplastos/ml . Aproximadamente 4 µg de ADN fueron agregados a 100 µl de la solución de protoplastos, se mezclaron suavemente y se incubaron sobre hielo durante 30 minutos. Se 25 agregó 1 µl del amortiguador a la mezcla y se incubó a 37 °C :f .- -*&*#&* : durante otros 30 minutos. Después de la adición de 10 ml de agarosa superior de Cove precalentada a 50 °C, la mezcla de la reacción se vierte sobre placas de agar de COVE. Las placas fueron incubadas a 32 °C durante 5 días o hasta que los transformantes aparecieron.

Medios y solución amortiguadora COVE: por litro 342.3 g de sucrosa, 20 ml de solución de la sal de COVE, acetamida 10 mM, CsCl2 15 mM, 30 g de Agar inerte (Difco) Solución de sal de COVE: por litro 26 g de KCl, 26 g de MgS04-7H;0, 76 g de KH2P0¿, 50 ml de metales de traza Cove. Metales de traza de Cove: por litro 0.04 g de 0.4 g de CuS0-5H:0, 1.2 g de FeS04-7H20, 0.7 g de MnS0-H20, 0.7 g de Na2Mo02-2H20, 0.7 g de ZnS0-7H:0. Metales de traza de AMG: por litro 14.3 g de ZnS04-7H20, 2.5 g de CuS0.-5H20, 0.5 g de NiCl2, 13.8 g de FeSO., 8.5 g de MnSO,, 3.0 g de ácido cítrico. YPG: por litro 4 g de extracto de levadura, 1 g de KH;PO¿, 0.5 g de MgSO.-7H20, 5 g de glucosa, pH 6.0. STC: 0.8 M de Sorbitol, 25 mM de Tris pH 8, 25 mM CaCl;. STPC: 40% de PEG4000 en amortiguador de STC. Agarosa superior de Cove: por litro 342.3 g de sucrosa, 20 ml de solución salada de COVE, Acetamida 10 mM, 10 g de agarosa de punto de fusión bajo.

MS-9: por litro 30 g de polvo de soya, 20 g de glicerol, pH 6.0. MDU-2Bp: por litro 45 g de maltosa-lH20, 7 g de extracto de levadura, 12 g de KH2P04, 1 g de MgS04-7H20, 2 g de K2S04, 5 g de Urea, 1 g de NaCl, 0.5 ml de solución de metales de traza de AMG de pH 5.0.

SDS-PAGE y manchado de western La efectrofóresis de poliacrilamida de SDS se llevó a cabo utilizando el gel comercializado de PAGEL AE6000 NPU- 7.5L (7.5%) con el aparato AE-6400 (Atto, Japón) siguiendo el protocolo provisto. La proteína separada en un gel fue transferida a una membrana P para Manchado Clara AE-6665 (Atto, Japón) utilizando el manchado de Horizon (Atto, Japón) . La detección de la proteína se empleó con el Conjunto de Ensayo de Inmuno Manchado (BioRad) .

Construcción de los plasmados de expresión de glgB de R. Obamensis para Aspergillus El gen glgB de R. Obamensis se amplificó a partir del ADN genómico de R. Obamensis utilizando los conjuntos de cebadores de a) y b) , o a) y c) para introducir el sitio Bglll y Xpol de la enzima de restricción en cada extremo. El cebador c) proporciona la secuencia del epítope de c-myc que comprende Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu en el glgB C-terminal . a) 5'-GAAGATCTAT GAGCTGGCTC ACGGAAGAAG ACATCCGGCG CTGGGAAA-3' b) 5'-CCGCTCGAGC TACCCGTGCT CCGGCTCCAG GATGAGGGCG GCCA- 3' c) 5'-CCGCTCGAGC TACAGGTCCT CTTCGGAGAT GAGCTTCTGC TCCCCGTGCT CCCGGCTCCAG GATGAGGGCG GCA-3' Los componentes de la reacción, es decir, 40 ng del ADN cromosómico de R. Obamensis, 300 pmoles de cada cebador, 0.2 mM de dNTPs y 2.6 unidades de la ADN polimerasa del sistema de PCR de Alta Fidelidad Expand® (Boehringer) , fueron mezclados en el amortiguador provisto y sometidos a PCR bajo las siguientes condiciones.

- ? -L -.

Tabla 6. El paso 2 al paso 4 fueron repetidos 10 veces, y el paso 5 al paso 7 fueron repetidos 20 ciclos.

El fragmento de 1.9 Kb amplificado fue purificado con el conjunto de extracción de gel QIA (Qiagen) y después de la digestión con Bglll y Xñol, se ligó o unió en pCaHj483 digerido con Ba Hl y Xhol. El plásmido pCaHj483 tiene el promotor de amilasa neutral de Aspergill us niger, la secuencia delantera de TPI de Aspergill us nidulans, el terminador de glucoamilasa de Aspergill us niger y el gen de amdS de Aspergill us nidulans como un marcador. El plásmido obtenido con el conjunto de cebadores a) y b) fue llamado pIH28 y uno obtenido con el conjunto de cebadores de a) y c) fue designado pIH29.

?A? fe¡a=g& . l u Expresión del glgB de R. Obamensis en A. Oryzae Los plásmidos de expresión, pIH28 y pIH29, fueron digeridos con Notl y los fragmentos de 6 kb resultantes que contienen el cásete de expresión de gigB de R. Obamensis 5 fueron purificados con el conjunto de extracción de gel de QIA. El BECh2 de A. Oryzae fue transformado con cada fragmento y los transformantes de selección positiva fueron aislados. El transformante fue inoculado a 100 ml de MS-9 en 500 ml del recipiente de agitación y se cultivó a 32 °C 10 durante 1 día y 3 ml de cada cultivo fueron transferidos a 100 ml de MDU-2Bp en un recipiente de agitación para el cultivo a 32 °C durante 2-3 días. Las células que se hicieron crecer se cultivaron por centrifugación a 3500 rpm durante 15 minutos. Aproximadamente 0.1 g de las células 15 colectadas se suspendió en 100 µl de 2x conc. del amortiguador de carga de la muestra (Tris-HCl 100 mM (pH 6.8), 200 mM Ditiotreitol, 4% SDS, 0.2% de azul de Bromofenol y 20% de glicerol) y se hirvió durante 5 minutos. Después de la centrifugación a 14000 rpm durante 5 minutos, 20 se aplicaron 10 µi del sobrenadante a un gel de poliacrilamida, y se sometió a electrofóresis en el amortiguador para la corrida o experimento (25 mM Tris, 0.1% SDS, 192 M Glicina) a 20 mA por gel. El gel resultante se tiñó con azul brillante de Coomassie. Los transformantes 25 positivos mostraron la banda de proteína del tamaño esperado ,-.-• *,y' -S ¿32r*¿- ... -rZ-M'-.í * teá*~**.. de gigB de R. Obamensis, 72 kDa. El gel aplicado con el extracto del transformante con la etiqueta c-myc se sometió al manchado de western utilizando el anticuerpo Anti-my'c (Invitrogen) como el anticuerpo primario y el IgG de Antiratón (Sigma) como el anticuerpo secundario. Las señales positivas fueron obtenidas en la posición que corresponde a 72 kDa.

EJEMPLO 5 Ensayo de BE de R. Obamensis y efecto de la temperatura y el Para inactivar ia actividad de la amilasa endógena de la cepa del huésped, el extracto celular fue calentado a 65 °C durante 30 minutos. La actividad fue medida como se describió anteriormente. El perfil de actividad del pH se midió en 65 °C y el perfii de actividad de la temperatura se obtuvo a pH 7. Los experimentos fueron efectuados ya sea por duplicado o por triplicado y los promedios y las desviaciones estándares son mostradas posteriormente. La estabilidad de la temperatura fue medida sobre la BE de R. Obamensis sin la etiqueta de c-myc como sigue: la solución de la enzima que contiene 30-50 unidades/ml (pH u*' á¿ •? , -- *. 7) fue incubada a diferentes temperaturas durante 30 minutos, y luego la actividad de la enzima ramificadora restante fue medida. Los datos indican el pH óptimo y la temperatura óptima de la BE de R. Obamensis que va a ser de alrededor de pH 7 y 65 °C, respectivamente. La presencia de la etiqueta c-myc no afectó el perfil del pH y la temperatura.

Tabla 7.

A.&aüáa....- a i . <i» . 10 15 Tabla 8 20 rV irßÉ?- tHuá? y. i ? . - ,- ..

Tabla 9.

Depósito de Material Biológico Un clon de ?. coli que contiene el gen de BE de Rhodothermus Obamensis insertado en el plásmido pT7Blue (véase ei Ejemplo 1) ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en el Deutsche Sa mlung von Mikrooganismen und Zeilkulturen GmbH !DSMZ), Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig, Alemania, y se le dio el siguiente número de acceso. Depósito Número de Acceso Fecha de Depósito NN049443 DSM 12607 1998-DÍC-23 La cepa ha sido depositada bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante el proceso pendiente de esta solicitud de patente a una ,M > determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas Registradas para que sea autorizada bajo 37 C.F.R. §1.14 y 35 U.S.C. §122. El depósito representa un cultivo substancialmente puro de la cepa depositada. El depósito está disponible cuando se requiera por las leyes de patente extranjeras en países en donde las contrapartes de la presente solicitud, o su progenie son presentadas. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención en derogación de los derechos de patente otorgados por la acción gubernamental. La invención descrita y reivindicada aquí no va a ser limitada en su alcance por las modalidades específicas descritas aquí, puesto que estas modalidades están propuestas como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Cualesquiera modalidades equivalentes están propuestas para que estén dentro del alcance de esta invención. Realmente, varias modificaciones de ia invención además de aquellas mostradas y descritas aquí llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en el arte de la descripción precedente. Tales modificaciones también están propuestas para que estén consideradas dentro dei alcance de las reivindicaciones anexas. En el caso de conflicto, la presente descripción que incluye las definiciones, tomarán el control.

Varias referencias son citadas aquí, las descripciones de las cuales son incorporadas para referencia en su totalidad.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere . i.t !*k Listado de las Secuencias <110> Novo Nordisk A/S <120> Polipéptidos que tienen una actividad de enzima ramificadora y ácidos nucleicos que los codifican. <130> BE de Rhodothermus Obamensis <140> <141> <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1866 <212> ADN <213> Rhodothermus Obamensis <220> <221> CDS <222> :D .. (1866; * A L -U,^^ ^sS(- <220> <221> mat_peptide <222> ( 4 ) . . ( 1863 ) <400> atg age tgg etc acg gaa gaa gac ate cgg cgc tgg gaa age ggt acg 48 Met Ser Trp Leu Thr Glu Glu Asp He Arg Arg Trp Glu Ser Gly Thr 1 c 10 15 c tac gac agt tac cga aag ctg ggc gcc cat ccc gac gac saa ggc 96 Phe Tyr Asp Ser Tyr Ar? Lys Leu Gly Ala KÍS Pro Asp Asp Glu Gly 20 25 30 gtc tgg gcg ccg cat gcc gat ggc atc tcg 5-5 etc 144 T *. *- T *-** Ppe Cys Val Trp Ala Pro His Ala Ásp GÍy Val Ser Val Leu 35 40 45 gga ?cg aac gac tg? aat ccg gag gcc aac ccg ctg gag tac 192 Gl Phe sr. Asp Trp Asn Pro Glu Ala Asr. Pro Leu Glu Arg Tyr 50 55 60 ggc gcc ctg ~?3 gcc ggt tac gta ccg cga gcg cgc ccg cac 240 3- si y Leu Trp Ala Glv Tyr Val Pro Giy Ala Arg Pro Gly HÍS 55 70 75 tac aag tat ccc ate cgc cac ggc ttc tat cag cc gac aac acg 298 T -. *. * - Lys Tyr Arg He Arg His Gly Phe Tyr Gln la Asp Lys Thr 50 85 90 95 gcc ttc ccc atg gag ccg cct acc ggc agt ccc ate gaa 236 .-.c *~ Tyr Ala Phe M Glu Pro Pro Giy Ser Pro He Giu 100 1 ^ =. 110 9" ate a e acg cgg etc ?ac tac acc -35 cac gac 384 .=> - T 1 a Arg Leu Asp Tyr Thr Trp K s Asp Asp 115 120 125 gaa atg cgg ccc ccc aag ggt ccg scc age ctt tac gag ccg stt 432 Me Arg A¿g Aré Lys GÍy Pro Ala Ser Leu Tyr Glu Pro Val .30 0 tac gag gta cat ctg ggc tec tgg cgt — c aaa cc Tyr Glu Val :cc gcc 480 K s Leu Giy Ser T p A e Kis Lys A: 1 4 5 : o Glv gag tec ttc tet tac cgg gag att gcc gag ccg ctg gcc gac tac gtg 528 Glu Ser Phe Ser Tyr Arg Glu He Ala Glu Pro Leu Ala Asp Tyr Val 160 165 170 175 cag gag atg ggc ttc acg cac gtg gag ctg ctg ccc gtc atg gaa cat 576 Gin Glu Met Gly Phe Thr His Val Glu Leu Leu Pro Val Met Glu ?±s 180 185 190 ccc tac tac ggc tec tgg ggc tat cag gtg gtg ggc tac tac gcc cca 624 Pro Tvr Tyr Gly Ser Trp GÍy Tyr Gln Val Val Gly Tyr Tyr Ala Pro 195 200 205 acg ttt cgc tac gga tea ccc cag gac ctg atg tac ctg ate gac tac 672 Tpr Phe Arg Tyr Gly Ser Pro Gin Asp Leu Met Tyr Leu He Asp Tyr 210 215 220 ctg cac cag cgc ggc ate ggc gtc ate etc gac tgg gtc ccg age cac 720 Leu His Gin Arg Gly He Gly Val He Leu Ásp Trp Val Pro Ser His 225 230 235 ttt gcg gcc gat ccc cag gga ctg gtt ttc ttc gac ggg acc acá etc 768 Pr.e Ala Ala ÁSD Pro Glr. Giy Leu Val Phe Phe Asp Giy Thr Thr Leu 240 " 245 250 ' 255 ttc gaa tac gac gat ccc aag atg cgc tat cac cct gac tgg ggt ac? 816 Pr.e Giu Tyr ÁSD ASD Pro Lys Met Arg Tyr His Pro ksp Trp Gly Thr 260 265 ' ' 270 tat gtg ttc gat tac aac aag ccg ggc gta cgc aac ttt ctg att tec S64 Tvr Val ?ne Aso Tyr Asn Lys Pro Giv Val Are Asn Phe Leu lie Ser 275 * 280 ' 235 aac cea ctt ttc tgg etc gaa aag tac cac gtc gac ggg ctg egc gtc 912 .-.s Ala Leu Phe Trp Leu Glu Lys Tyr H = Val Asa Giy Leu Arg Val 290 " 295 " 300 gat gcg gtg gct tet atg etc tac cgg gac tac tea cgc aag gag tgg 960 .-.s Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Arg Asp Tyr Ser Arg Lvs Glu Tro 3C? 310 315 acá ccc aac ate ttc ggc gge cgt gaa aac ctg gag gcc att gat ttc 1003 r.-.r Prc Asn lie Phe Glv Giv Arg Giu Asr. Leu Giu Ala He ÁSD Pr.e 310 225 230 ' 225 at aag aaa tte aac gas acg gtc tac ctg cac ttc ccc gac gee atg 1056 lie Lys '^ys Pne Asn lu Thr Val Tvr Leu H s Phe Pro Giu Ala Met 340 " 345 350 : z gcc gag gag tcg acg gee tgg ccc ccc gtg tcg gcc ccc ace 1104 * r.z __e Ala Glu Giu Ser Thr Ala Trp Pro Giy Val Ser Ala Pro Thr 355 360 365 ac aac aac ggt ctg ggc ttc etc tac aac tgg aac atg ggc tgg atg 1152 -yr Asr. Asn Gly Leu Gly ?ne Leu Tyr Lys Trp Asn Met Giy Tro Met 370 375 " 380 cae gac acg ctg gac tac ate cag cgc gat cce ate tac cgc aag tat 1200 •-•-s Ase Tr.r Leu ASD Tvr He Gln Arg Aso Pro He Tyr Arg Lvs Tvr 385 390 395 cae cac sac gag ctg acc ttc tcg etc tgg tac gcc ttt tcg gag cac 1248 His His Ásp Glu Leu Thr Phe Ser Leu Trp Tyr Ala Phe Ser Giu HÍS 400 405 410 415 tac gtc ctg ccg etc tcg cac gac gag gtg gtg cac ggc aag ggc tcg 1256 Tyr Val Leu Pro Leu Ser His Asp Glu Val Val His Gly Lys Giy Ser 420 425 430 etc tgg ggt aaa atg ccc ggc gac gac tgg cag aag gca gcc aac ttg 1344 Leu Trp Gly Lys Met Pro Gly Asp Asp Trp Gln Lys Ala Ala Asn Leu 435 440 " 445 cgc ctg etc ttt ggc cac atg tgg ggc cat ccg ggc aaa aaa ctg etc 1392 Arg Leu Leu Phe Gly His Met Trp Gly His Pro Giy Lys Lys Leu Leu 450 45*5 460 ttc atg ggc ggc gag ttc ggc cag cac cac gag tgg aac cac gac acg 1440 Phe Met GÍy Gly Glu Phe Giy Gin ti s üxs Giu Trp Asn His ASD Thr 465 - 470 475 cag etc gaa tgg cae ctg ctg gac cag ccc tac cat cga ggt att cag 1488 Gin Leu Giu Trp His Leu Leu Asp Gln Pro Tyr Kis Arg Gly He Gln 480 " 4S5 490 495 ctg tgg gtg tgc gat ctg aac cac etc tac cgt acg aat ceg gcc etc 1536 Leu Trp Val Cys Aso Leu Asn KiS Leu Tyr Arg Thr Asr. Pro Ala Leu 500 505 510 tgg cac gae gga ccg gaa ggg tte gag tgg ate gac tte age gac cgc 1534 Trp H s ASD Gly Pro Giu Giy Phe Glu Tro He ÁSD Phe Ser ÁSD Arg 515 520 " 525 sac cag age gtg ate tgt tac ctg cgc aag aat gee ggc cgc atg ctg 1632 Asp Gl Ser Val He Cvs Tyr Leu Are Lvs Asn Ala GÍy Arg Met Leu 520 ' 535 540 ctg ttc gtg ctg aac ttt acg cce ctg cea cge gag cac tac egc gtg 1680 leu Pr.e Val Leu Asn Pne Tnr Pro Val Pro Ara Glu K s Tvr Aro Val 545 550 ' 555 gge gtg ceg ate ggt gge ccc tgg cac gag ctg ete aac age gac geg 1729 Gly Val Pro He Gly Gly Pro Trp His Glú Val Leu Asn Ser ÁSD Ala 56C 565 570 " 575 gtg gee tac ggc ggg age ggg atg ggc aac ttc g?e cgc gte gag gcg 1776 Val Ala Tyr Gly Giy Ser Gly Met Giy Asn Phe Giy Arg Val Giu Ala 580 " 585 590 gtg cee gag tec tgg cac ggc cgc eee ttc cac tta gag ctg acg ctt 1824 Va. Pro Glu Ser Trp H s Gly A g Pro Pne H s Leu Glu Leu Thr Leu 595 600 605 cc c ccg ctg gcc gcc etc ate ctg gag ceg gag cae ggg tag 1866 Pre Pro Leu Ala Ala Leu He Leu Giu Pro Glu K s Gly 610 615 620 <210> 2 <211> 621 <212> PRT <213> Rhodothermus Obamensis <400> 2 Met Ser Trp Leu Thr Glu Glu Asp He Arg Arg Trp Giu Ser Gly Thr 1 5 10 15 "he Tyr Ase Ser Tyr Arg Lvs Leu Gly Ala His Pro As? Asp Giu Gly " 20 " 25 30 Thr Tro Pne Cys Val Trp Ala Pro Hx= Ala Asp Gly Val Ser Val Leu 35 40 45 Gly Ala Pne Asn Asp Trp Asn Pro Glu Ala A=n Pro Leu Glu Are Tyr 5C 55 60 Glv Gly Giy Leu Tro Ala Gly Tvr Val Pro Gly Ala Arg Pro Giy Hxs 65 70 75 30 Tr.r Tyr Lys Tyr Arg He Arg His Gly Phe Tyr Gln Ala Asp Lys Thr 85 90 95 ASD Pro Tyr Ala Phe Ala Met Giu Pro Pro Thr Giy Ser Pro He Glu 100 105 110 Gly Leu Ala Ser He He Thr Arg Leu Asp Tyr Thr Tro Hxs Asp Asp 115 120 * 125 Giu Trp Met Arg Arg Arg Lys Giy Pre Ala Ser Leu Tyr Glu Pro Val 12C 135 14C Ser He Tyr Glu Val Kis Leu Giy Ser Tro Arg Kis Lvs Arg Pro Giy 145 150 " 155 " i60 Glu Ser P.ne Ser Tyr Arg Glu He Ala Glu Pro Leu Ala Aso Tvr Val 165 ' 170 * 175 Gin Glu Met Gly Phe Thr Kis Val Glu Leu Leu Pro Val Met Glu Hxs 130 185 190 Pro Tyr Tyr Gly Ser Trp Gly Tvr Glr. Val Val Gly Tvr Tyr Ala Pro 193 ' 200 205 Tr.r Pr.e Are Tvr Giy Ser Pro Gin Aso Leu Met Tyr Leu He Aso Tyr 21C 215 * 220 Leu Hxs Gin Arg Giy He Giy Val He Leu Aso Trp Val Pro Ser Hxs 225 230 23*5 240 Pre Ala Ala Asp Pro Gln Gly Leu Val Phe Phe Asp Gly Thr Thr Leu 245 25C 255 Pne Glu Tyr Asp Asp Pro Lys Met Arg Tyr Kis Pro ASD Trp Giy Thr 26*0 " 265 ' " 270 Tyr Val Phe Asp Tyr Asn Lys Pro Gly Val Arg Asn Phe Leu He Ser 275 280 285 Asn Ala Leu Phe Trp Leu Glu Lys Tyr His Val Asp Gly Leu Arg Val 290 295 300 Asp Ala Val Ala Ser Met Leu Tyr Arg Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Trp 305 310 315 320 Thr Pro Asn He Phe Gly Gly Arg Glu Asn Leu Glu Ala He Asp Phe 325 330 335 He Lys Lys Phe Asn Glu Thr Val Tyr Leu His Phe Pro Glu Ala Met 340 345 • 350 Thr He Ala Glu Glu Ser Thr Ala Trp Pro Gly Val Ser Ala Pro Thr 355 360 365 Tyr Asn Asn Glv Leu Giy Phe Leu Tyr Lys Trp Asn Met Giv Trp Met 370 ' 375 380 His Asp Thr Leu Aso Tvr He Gln Arg Asp Pro He Tyr Arg Lys Tyr 385 ' ' 390 395 400 His Kis ASD Glu Leu Thr Phe Ser Leu Trp Tyr Ala Phe Ser Glu Hxs 405 410 415 Tyr Val Leu Pro Leu Ser Hxs Asp Glu Val Val Hxs Gly Lys Giy Ser 420 ' 425 430 Leu Trp Gly Lys Met Pro Giy Asp Asp Trp Gln Lys Ala Ala Asn Leu 425 440 " 445 Arg Leu Leu Phe Gly Kis Met Trp Gly Kis Pro Gly Lys Lys Leu Leu 450 455 " 460 Phe Met Gly Gly Giu Phe Giy Gin Hxs Kis Giu Trp Asn Hxs Aso Thr 465 470 475 " " 430 ^' Trp His Leu Leu Asp Gln Pro Tyr His Arg Giv He Glr. 4S5 490 ' ' 495 . e a_ re Kxs Aso Glv Pro Giu Gly Phe Glu 7:p He ASD Phe Ser Aso Arg 520 525 Ase _;_r. ;- v=l He C s Tyr Leu Arg Lys Asn Ala Giy Are Met Leu 525 ' 54C -e >.-.e Val Leu Asn Phe Tnr Pro Val Pro Arg Giu His Tyr Arg Val 545 550 555 ' 560 Gly Val Pro He Giy Giy Pro Tr? Hxs Glu Val Leu Asn Ser Aso Ala 565 570 Val Ala Tyr Gly Giy Ser Gly Met Gly Asr. Phe Gly Arg Val Glu Ala 580 585 59C Val Pro Glu Ser Trp His Gly Arg Pro Phe Hxs Leu Glu Leu Thr Leu 555 600 605 ?r- ?rc Leu Ala Ala Leu He Leu Giu Pro Glu His Glv =-3 615 620

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como prioridad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polipéptido aislado, caracterizado porque tiene una actividad de enzima ramificadora, y una temperatura óptima de al menos 60 °C.
2. 2. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura óptima está en el intervalo de 60 °C a 120 °C.
3. 3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la temperatura óptima está en el intervalo de 60 °C a 80 °C.
4. 4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la temperatura óptima es de aproximadamente 65 °C.
5. 5. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es de origen bacteriano .
6. 6. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque se deriva de una célula del género Rhodothermus, en particular de las especies R. Obamensi s y de R. marinus. .iu- ..
7. 7. Un polipéptido, caracterizado porque tiene la actividad de enzima ramificadora seleccionada del grupo que consiste de: a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos 65% de homología con la secuencia de aminoácidos madura de la SEC ID NO: 2; b) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos 65 % de homología con la secuencia de aminoácidos de la BE madura codificada por la secuencia de ácidos nucleicos contenida en el plásmido pT7Blue contenida en DH12S de E. Coli , DSM 12607; y c) un polipéptido el cual es codificado por una secuencia de ácidos nucleicos la cual se hibridiza bajo condiciones de severidad bajas con (i) los nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO:l que corresponde a la enzima madura, (ii) la secuencia de ADNc de la SEC ID N0:1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o (iv) una hebra complementaria de (i), (ii) , o (iii) .
8. 8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque tiene la secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos una homología del 80% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. ^_*
9. 9. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos 95% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2.
10. 10. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2, o consiste de un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.
11. 11. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o una variante de la misma que tiene las substituciones Y397C+L419P.
12. 12. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque es codificado por la secuencia de ácidos nucleicos contenida en el plásmido pT7Blue contenido en DH12S de E. coli , DSM 12607.
13. 13. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada, caracterizada porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos, la cual codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
14. 14. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada, caracterizada porque codifica un polipéptido con la actividad de la enzima ramificadora seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de ácidos nucleicos la cual tiene al menos 65% de homología con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la BE de la SEC ID N0:1; b) una secuencia de ácidos nucleicos la cual tiene al menos 65% de homología con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la BE contenida en el plásmido pT7Blue en DH12S de E. coli , DSM 12607; y c) una secuencia de ácidos nucleicos la cual se hibridiza bajo condiciones de severidad bajas con (i) la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID N0:1, (ii) la secuencia del ADNc de la SEC ID N0:1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos, o (iv) . una hebra completamentaria de (i) , (ii) , o (iii) .
15. 15. Una construcción de ácidos nucleicos, caracterizada porque comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las reivindicaciones 13-14 enlazada operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.
16. 16. Un vector de expresión recombinante, caracterizado porque comprende la construcción de ácidos nucleicos de la reivindicación 15. h tá . jdjjj^^