CN108624546B - 一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，以消除内源质粒的解淀粉芽孢杆菌为宿主菌，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS插入pNX01载体的Spe I和Not I酶切位点之间得到重组质粒，再将重组质粒导入宿主菌中，即得。本发明还公开了所述构建方法构建得到的重组解淀粉芽孢杆菌及其在发酵产γ‑聚谷氨酸中的应用。本发明将发酵生产γ‑PGA和聚谷氨酸降解酶过程相偶联，实现一步发酵直接获取低分子量γ‑PGA和聚谷氨酸降解酶两种产物，在产高分子γ‑PGA的过程中，γ‑PGA被同时分泌到胞外的聚谷氨酸降解酶水解，避免了外源添加降解酶的繁琐，简化了生产工艺，一步发酵合成低分子聚谷氨酸。
Description
技术领域
本发明涉及解淀粉芽孢杆菌，具体涉及一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由D/L-谷氨酸单体通过γ-谷氨酰胺键聚合而成的一类均聚氨基酸，其独特的分子结构赋予其优良的理化性质，如水溶性、生物相溶性、生物可降解性及可食用性等等，目前已被广泛用于食品、农业、化妆品、医药、水处理等多个领域。γ-PGA作为一种谷氨酸聚合物，分子量是影响其生物学性能的重要参数，不同的用途对γ-PGA分子量的需求不同。近年来研究发现，低分子的聚谷氨酸(Mw<500kDa)具有独特的生理学性质，尤其在化妆品及医药领域体现出更大的优势。研究表明，低分子量的γ-PGA更易渗透肌肤底层，发挥保湿、维持肌肤弹性、美白肤色及促进营养成分吸收等功效；分子量在20-60kDa的γ-PGA作为药物载体，更易使药物渗透到达作用位点，与药物结合形成稳定结构，从而提高药物作用效果。由此可见，低分子量γ-PGA具有广阔的应用前景。
随着对小分子γ-PGA的研究以及应用的兴起，近年来，国内外开始重视对低分子量γ-PGA的制备研究。目前，γ-PGA的降解方法主要有物理降解、化学降解和生物酶降解。物理降解方法主要有高温、机械剪切力、超声波、紫外辐射等，制备的γ-PGA分子量范围分布较广，稳定性不佳；化学降解方法主要是通过添加酸(HCl)或碱(NaOH)水解γ-PGA，虽然水解效率高，但是外源引入化学试剂，影响γ-PGA的性质，对产品的纯化增加难度，并且易对环境造成污染；生物酶法是利用聚谷氨酸降解酶特异性地作用于γ-PGA的γ-谷氨酰胺键，使其键断裂而发生降解，反应条件较为温和，但是需要额外制备大量的聚谷氨酸降解酶以及控制反应条件，目前商品化的聚谷氨酸降解酶较少且价格昂贵，不适用于工业化制备小分子γ-PGA。因此，现在迫切需要找到一种适用于γ-PGA的降解方法。
随着日益加剧的能源危机与环境污染问题，开发可持续再生的非粮生物质能源是满足现代工业化生产需求的必经之路。菊芋作为一种新型的廉价非粮作物，抗逆性极强，可种植于沙漠、滩涂、盐碱荒地等边际性土地，缓解了我国耕地面积匮乏的现状；并且其茎块中富含大量的菊粉，经水解后主要转化为果糖，可作为发酵与生物转化的碳源，目前已被广泛用于乙醇、乳酸及2，3-丁二醇等产物的工业化制备。然而，目前大多数生物过程无法实现直接利用菊粉进行相关产物的合成，均需经过预水解或外源菊粉酶的协助，极大增加了工业化生产成本。因此，挖掘可直接高效利用菊粉的微生物体系，对于众多高附加值产物的合成意义重大。
发明内容
发明目的：为了解决现有生物酶法制备小分子γ-PGA使用的聚谷氨酸降解酶较少且价格昂贵的问题，本发明第一方面提供了一种重组解淀粉芽孢杆菌，可分泌聚谷氨酸降解酶并用于生产低分子量聚谷氨酸；本发明第二方面提供了重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，本发明第三方面提供了重组解淀粉芽孢杆菌的应用。
技术方案：本发明所述一种重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，以消除内源质粒的解淀粉芽孢杆菌为宿主菌，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS插入pNX01载体的Spe I和Not I酶切位点之间得到重组质粒，再将重组质粒导入宿主菌中，即得。
优选地，所述宿主菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NB，其由解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346消除内源质粒p2Sip得到，NB可直接利用菊粉粗提液，在不添加谷氨酸的情况下合成分子量1000-2000kDa的γ-聚谷氨酸。其中，解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346的菌株号为NX-2S，已公开于中国专利2016107050833中，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏日期为2016年6月23日。
其中，内源质粒的消除方法如下：基于质粒不相容原理，将内源质粒p2Sip的复制起始位点ori及复制蛋白rep连入温度敏感型质粒pKSV7，构成重组质粒pKSV7-ori-rep，将其电转化入解淀粉芽孢杆菌NX-2S，经30℃培养12h传代数次后，内源质粒p2Sip丢失，再经过42℃培养12h传代数次后，重组质粒pKSV7-ori-rep丢失，得到出发宿主菌株解淀粉芽孢杆菌NB。
优选地，所述聚谷氨酸降解酶基因pgdS来源于芽孢杆菌属(Bacillus)、漆斑菌属(Myrothecium)或极小单胞菌属(Pusillimonas)。
更优选地，所述聚谷氨酸降解酶基因pgdS来源于B.subtilis NX-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
优选地，所述pNX01载体由载体骨架1、载体骨架2和载体骨架3依次连接得到，所述载体骨架1包括依次连接的大肠杆菌复制原点ori-177和氨苄青霉素筛选标记Amp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述载体骨架2包括依次连接的解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M2016346内源质粒的复制蛋白rep和氯霉素筛选标记Cm，其中氯霉素筛选标记Cm的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，复制蛋白rep的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，载体骨架2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述载体骨架3包括依次连接的启动子、多克隆位点MCS和淀粉酶的终止子Tamy，所述多克隆位点MCS从上游到下游依次包括酶切位点Spe I、EcoR I、SalI、Bgl II和Not I，其中多克隆位点MCS的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，淀粉酶的终止子Tamy的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地，所述载体骨架3中的启动子为组成型启动子或诱导型启动子，所述组成型启动子为P43启动子、PHpaⅡ启动子、Pveg启动子或Pbdh启动子，所述诱导型启动子为Pxyl启动子或Pgrac启动子。
更优选地，所述载体骨架3中的启动子为Pxyl启动子，Pxyl启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述载体骨架3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
具体地，一种重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
A、构建pNX01载体：
a1以质粒pHY300PLK为模板通过PCR扩增得到载体骨架1；
引物ori-F：5’--3’的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，
引物Amp-R:5’--3’的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
a2以解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346的内源质粒p2Sip为模板通过PCR扩增得到复制蛋白rep，以质粒pKSV7为模板通过PCR扩增得到氯霉素筛选标记Cm，以复制蛋白rep和氯霉素筛选标记Cm为模板进行重叠延伸PCR，得到载体骨架2；
其中，PCR扩增复制蛋白rep使用的引物如下：
引物rep-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，引物rep-R的核苷酸序列如SEQ IDNO:13所示；
PCR扩增氯霉素筛选标记Cm使用的引物如下：
引物Cm-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，引物Cm-R的核苷酸序列如SEQ IDNO:15所示；
重叠延伸PCR使用的引物如下：rep-F/Cm-R；
a3以B.subtilis 168的基因组为模板通过PCR扩增得到Pxyl启动子，以解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346的基因组为模板扩增得到淀粉酶的终止子Tamy，以Pxyl启动子和淀粉酶的终止子Tamy为模板进行重叠延伸PCR，得到载体骨架3；
其中，启动子Pxyl上游融有酶切位点Sma I，便于后期启动子的更换；终止子Tamy下游含有酶切位点Xba I，便于后期更换。
其中，PCR扩增Pxyl启动子使用的引物如下：
引物Pxyl-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；引物Pxyl-R的核苷酸序列如SEQID NO:17所示；
PCR扩增淀粉酶的终止子Tamy使用的引物如下：
引物Tamy-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，引物Tamy-R的核苷酸序列如SEQID NO:19所示；
重叠延伸PCR使用的引物如下：Pxyl-F和Tamy-R；多克隆位点MCS的序列已融合设计在引物Pxyl-F和Tamy-R中。
a4将步骤a1得到的载体骨架1、步骤a2得到的载体骨架2和步骤a3得到的载体骨架3利用多片段一步克隆法依次连接，得到pNX01载体；
B、构建重组质粒pNX01-pgdS：以B.subtilis NX-2基因组为模板通过PCR扩增得到聚谷氨酸降解酶基因pgdS，其上下游分别引入酶切位点Spe I、Not I；将步骤A得到的pNX01载体进行Spe I、Not I双酶切，利用一步克隆的方法，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS和双酶切得到的质粒连接，得到重组质粒pNX01-pgdS；
其中，PCR扩增得到聚谷氨酸降解酶基因pgdS的引物如下：引物PgdS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，引物PgdS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
C、构建重组解淀粉芽孢杆菌：将步骤B得到的重组质粒pNX01-pgdS转化至大肠杆菌E.coli GM2163中进行去甲基化，再将去甲基化的重组质粒pNX01-pgdS转化至宿主菌中，即得。
本发明第二方面提供上述构建方法构建得到的重组解淀粉芽孢杆菌。该菌株被命名为B.amyloliquefaciens NB(PgdS)，可分泌表达聚谷氨酸降解酶并用于生产低分子量的γ-聚谷氨酸。
本发明第三方面提供所述重组解淀粉芽孢杆菌在发酵产γ-聚谷氨酸中的应用。
其中，发酵培养基的配方如下：菊粉粗提液30-80g/L，硫酸铵1-10g/L，三水合磷酸氢二钾5-30g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L，无水硫酸镁0.1-5g/L，一水硫酸锰0.01-0.1g/L；在30-40℃发酵培养第0-24h时，添加5-20g/L的木糖诱导聚谷氨酸降解酶基因的表达，控制发酵培养时间为48-100h；通过控制木糖的浓度和木糖的添加时间控制聚谷氨酸降解酶基因pgdS的表达量，获取不同分子量范围的小分子γ-聚谷氨酸。
菊粉粗提液的制备方法如下：取菊芋块茎洗净，切片，并在80℃电加热恒温干燥箱干燥7小时；再利用破碎机将干燥的菊芋片切碎，并通过40目网筛获得粗菊芋粉末；将菊芋粉末置于80℃下热水提取90min，然后在115℃消毒20min，冷却至室温，再通过过滤得到菊粉粗提液；利用蒽酮比色法测定菊粉粗提液中的总糖浓度，然后将其作为碳源接种和发酵。
优选地，发酵温度为32℃，发酵时间为96h。
优选地，发酵第12h，(1)当添加木糖浓度0≤C木糖≤5g/L时，γ-聚谷氨酸的分子量范围大约为640kDa≤Mw≤1600kDa；(2)当添加木糖浓度5＜C木糖≤10g/L时，γ-聚谷氨酸的分子量范围大约为390kDa≤Mw＜750kDa；(3)当添加木糖浓度10＜C木糖≤15g/L时，γ-聚谷氨酸的分子量范围大约为20kDa≤Mw＜480kDa；(4)当添加木糖浓度15＜C木糖≤20g/L时，γ-聚谷氨酸的分子量范围大约为30kDa＜Mw≤350kDa。
优选地，添加木糖浓度为15g/L，(1)当添加时间为第0≤t≤6h时，γ-聚谷氨酸的分子量范围大约为410kDa≤Mw≤650kDa；当添加时间为第6＜t≤12h时，γ-聚谷氨酸的分子量范围大约为20kDa≤Mw＜490kDa；当添加时间为第12＜t≤18h时，γ-聚谷氨酸的分子量范围大约为30kDa＜Mw≤380kDa；当添加时间为第18＜t≤24h时，γ-聚谷氨酸的分子量范围大约为310kDa＜Mw≤550kDa。
优选地，当添加木糖浓度为15g/L、添加时间为发酵第12h时，γ-聚谷氨酸的分子量为20-30kDa。
发酵液中聚谷氨酸分离纯化后可用于食品、医药、化妆品和临床等用途。
有益效果：本发明利用重组解淀粉芽孢杆菌生产低分子量聚谷氨酸，与其他工艺相比，该发明具有非常大的应用优势。第一，本发明使用的宿主菌可以直接利用菊粉粗提液，在不添加谷氨酸的情况下合成γ-PGA，大大节约了生产成本，适用于工业化生产；并且与枯草芽孢杆菌相比，解淀粉芽孢杆菌高效分泌外源蛋白的能力更强，更适合作为蛋白表达宿主菌；第二，本发明将发酵生产γ-PGA和聚谷氨酸降解酶过程相偶联，实现一步发酵直接获取低分子量γ-PGA和聚谷氨酸降解酶两种产物，在产高分子γ-PGA的过程中，γ-PGA被同时分泌到胞外的聚谷氨酸降解酶水解，避免了外源添加降解酶的繁琐，简化了生产工艺，一步发酵合成低分子聚谷氨酸；第三，本发明表达聚谷氨酸降解酶的过程，降低了发酵液稠度，增加了溶氧，使得γ-PGA的产量提高；第四、聚谷氨酸降解酶表达量越高，重组解淀粉芽孢杆菌所产γ-PGA的分子量越小，产量相应提高；聚谷氨酸降解酶的表达量可采用对启动子的诱导强度和诱导时间进行调整，通过控制诱导剂的浓度、诱导时间控制聚谷氨酸降解酶的表达量，来获取分子量为20-16000kDa的小分子聚谷氨酸，易于纯化回收。基于应用分析，本发明的方法对于工业化生产小分子聚谷氨酸具有巨大的经济和社会效益。
附图说明
图1为重组质粒pNX01-pgdS的构建过程；
图2为在发酵第12h采用不同浓度的木糖诱导聚谷氨酸降解酶的表达对γ-PGA分子量的影响(a)、对γ-PGA产量的影响(b)及对发酵液溶氧的影响(c)；0，未添加诱导剂；1：木糖诱导浓度为5g/L；2：木糖诱导浓度为10g/L；3：木糖诱导浓度为15g/L；4：木糖诱导浓度为20g/L；
图3为采用15g/L的木糖在不同发酵时间诱导聚谷氨酸降解酶表达对γ-PGA分子量的影响(a)、对γ-PGA产量的影响(b)及对发酵液溶氧的影响(c)：0，未添加诱导剂；1：第6h诱导；2：第12h诱导；3：第18h诱导；4：第24h诱导；
图4重组菌B.amyloliquefaciens NB(pNX01-pgdS)发酵96h后γ-PGA提纯产物的液相色谱图：(a)未添加诱导剂；(b)发酵第12h添加15g/L木糖。
具体实施方式
重组解淀粉芽孢杆菌构建过程中使用的材料来源如下：
所有引物及DNA序列均由金斯瑞生物科技有限公司合成；
所有质粒及DNA片段测序工作均由金斯瑞生物科技有限公司测序完成；
质粒的提取选用Axygen公司提供的质粒小量DNA提取试剂盒(AP-MN-P-250G)进行抽提；
DNA片段的回收选用Axygen公司提供的DNA凝胶回收试剂盒(AP-MN-P-250G)进行回收；
细菌基因组的提取选用天根生化科技有限公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)进行抽提；
DNA片段PCR选用爱必梦生物科技有限公司的Kodaq 2X PCR MasterMix with dye高保真酶进行PCR；
用于一步克隆连接的连接酶选用诺维赞生物科技有限公司的连接酶(ClonExpress II One Step Cloning Kit、ClonExpress MultiS One Step CloningKit)；
限制性内切酶选用宝日医生物科技有限公司的限制性内切酶。
实施例1质粒pNX01的构建
(1)构建载体骨架Frag1
以穿梭质粒pHY300PLK(TaKaRa Code No.3060)为模板，获取大肠杆菌的复制原点ori-177和氨苄青霉素筛选标记(如SEQ ID NO:1)，用引物ori-F：5’--3’(如SEQ ID NO:10)和Amp-R:5’--3’(如SEQ ID NO:11)进行PCR扩增，反应条件见表1，利用Axygen公司提供的DNA凝胶回收试剂盒(AP-MN-P-250G)回收片段，获得载体骨架Frag1。
表1 Frag1的PCR反应体系及反应条件
(2)构建载体骨架Frag2
根据已测定B.amyloliquefaciens NX-2S(解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346)内源质粒的复制蛋白序列(如SEQ ID NO:2所示)，分别设计引物rep-F：(如SEQ ID NO:12)和rep-R：(如SEQ ID NO:13)，利用Axygen公司提供的质粒小量DNA提取试剂盒(AP-MN-P-250G)抽提的内源质粒p2Sip为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，获取复制蛋白rep片段，反应条件见表2。
表2 复制蛋白rep片段的PCR反应体系及反应条件
以穿梭质粒pKSV7(武汉淼灵生物科技有限公司No.L2944)为模板，获取氯霉素筛选标记(如SEQ ID NO:3)，用引物Cm-F：(如SEQ ID NO:14)和Cm-R(如SEQ ID NO:15)进行PCR扩增，获得氯霉素筛选标记Cm片段，反应条件见表3。
表3 氯霉素筛选标记Cm片段的PCR反应体系及反应条件
以获取的氯霉素筛选标记片段Cm和解淀粉芽孢杆菌复制蛋白rep片段为模板，利用引物rep-F/Cm-R进行重叠延伸PCR，获得载体骨架2，序列如SEQ ID NO:4，反应条件见表4。
表4 重叠延伸PCR扩增的反应体系及反应条件
(3)构建载体骨架Frag3
根据已经公布的B.subtilis 168(CGMCC No.13496)的基因组序列(NC_000964.3)，分别设计引物Pxyl-F：(如SEQ ID NO:16)和Pxyl-R：(如SEQ ID NO:17)，使用天根生化科技有限公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取基因组，以提取的基因组为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，获取Pxyl片段(如SEQ IDNO:5)，反应条件见表5。
表5 Pxyl片段的PCR反应体系及反应条件
根据已经公布的解淀粉芽孢杆菌的基因组序列(NC_014551.1)，分别设计引物Tamy-F：(如SEQ ID NO:18)和Tamy-R：(如SEQ ID NO:19)，使用使用天根生化科技有限公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取基因组，以提取B.amyloliquefaciens NB的基因组为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，获取Tamy片段(如SEQ ID NO:6)，反应条件见表6。
表6 Tamy片段的PCR反应体系及反应条件
多克隆位点MCS的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，从上游到下游依次包括酶切位点Spe I、EcoR I、Sal I、Bgl II和Not I，该段序列已融合设计在引物Pxyl-F和Tamy-R中，引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。
以获取的木糖诱导型启动子Pxyl片段及淀粉酶终止子Tamy片段为模板，利用引物Pxyl-F和Tamy-R进行重叠延伸PCR扩增，获得载体骨架3，序列如SEQ ID NO:8，反应条件见表7。
表7 重叠延伸PCR扩增的反应体系及反应条件
(4)连接载体骨架1、2和3
根据同源重组的原理，采用多片段一步克隆的方法，连接三个片段Frag1、Frag2和Frag3，按照片段摩尔浓度比例添加连接体系(见表8)，于37℃水浴30min，冰浴2min，然后42℃热激45-90s转化进入E.coli DH5a感受态细胞(Vazyme No.C502-02/03)，复苏1h后涂布到LB固体培养基(含100mg/mL氨苄青霉素)上，37℃过夜培养12h。挑取4-6个转化子转接到含有100mg/mL氨苄抗生素的小黑瓶中，37℃摇床200rpm培养8h，保存菌种后剩余的细胞液离心收集菌体，利用Axygen公司提供的质粒小量DNA提取试剂盒(AP-MN-P-250G)抽提质粒，进行测序验证，验证正确的质粒即为pNX01。
表8 多片段一步克隆的反应体系
实施例2重组质粒pNX01-pgdS的构建
聚谷氨酸降解酶基因PgdS来源于枯草芽孢杆菌B.subtilis NX-2，根据已经公布的B.subtilis NX-2(CGMCC No.0833)的聚谷氨酸降解酶序列，分别设计引物PgdS-F：(如SEQ ID NO:20)和PgdS-R：(如SEQ ID NO:21)，使用天根生化科技有限公司提供的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取基因组，以提取的基因组为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序(PCR反应条件见表9)，获取pgdS基因片段，其核苷酸序列如SEQID NO:9所示。
表9 聚谷氨酸降解酶基因PgdS的PCR反应体系及反应条件
将质粒pNX01用Spe I和Not I双酶切，酶切体系及反应条件见表10；
表10 质粒pNX01酶切反应体系及反应条件
利用Axygen公司提供的DNA凝胶回收试剂盒(AP-MN-P-250G)回收片段，跑胶确定浓度。采用单片段一步克隆的方法，将片段pgdS和酶切载体pNX01按一定比例添加，以和多片段一步克隆同样的方法进行连接，反应体系见表11，重组质粒的构建流程见图1。挑取转化子进行PCR、酶切验证，验证正确后再进行测序，序列比对正确的质粒即为pNX01-pgdS。
表11 单片段一步克隆的反应体系
实施例3重组质粒pNX01-pgdS的预处理--去甲基化
将测序比对正确的重组质粒pNX01-pgdS与E.coli GM2163(上海浩然生物科技有限公司No.M0099)(感受态混匀，以和实施例1步骤(4)中相同的热激转化方法使质粒转化进入GM2163中，挑取转化子再次进行酶切验证，验证正确的质粒由于没有BamH I位点，规避了解淀粉芽孢杆菌限制修复系统的识别切割，可直接作为待电转质粒。
实施例4解淀粉芽孢杆菌的转化方法
用接种环沾取冻存的解淀粉芽孢杆菌NB菌液，在LB平板上划线，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养12h。取1mL接种至含100mL感受态培养基的三角摇瓶中，37℃培养至OD600值达到0.5-0.7。将培养物分装至预冷的50mL离心管中，冰浴20min，使细胞停止生长。接着在4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。倒掉上清，加入适量的电转缓冲液，用枪吹打均匀，4℃，8000rpm离心10min，重复该步骤2次。以适量感受态细胞悬浮液重悬细胞，分装100μL/管。每管加入100μg去甲基化dCm-、dam-的重组质粒pNX01-pgdS混合均匀，将混合物转接入预冷的无菌电转杯。以2.5-2.8kV，4ms的电转参数电击。电击后，迅速向电转杯加入600μL复苏培养基，混合均匀后，转入预冷的1.5mL离心管，37℃振荡培养2h复苏。8000rpm离心5min，除去大部分上清液，剩下菌液混合均匀，涂布于含有相应抗生素的筛选平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，得到重组菌B.amyloliquefaciens NB(pNX01-pgdS)。
使用的培养基配方如下：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L；
LB平板：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉2g/L；
感受态培养基：LB培养基+山梨醇(0.5M)；
电转缓冲液：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％(v/v)甘油；
感受态细胞悬浮液：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％(v/v)甘油，14％(w/w)PEG-6000；
复苏培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，山梨醇0.5M，甘露醇0.38M；
筛选平板：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉2g/L，氯霉素Cm 5mg/mL。
实施例5重组菌B.amyloliquefaciens NB(pNX01-pgdS)的3L发酵罐发酵
挑取重组菌B.amyloliquefaciens NB(pNX01-pgdS)单克隆子接种于50mL含有5mg/mL氯霉素Cm的LB培养基中，200rpm，37℃过夜培养。12h后，以接种量6％(v/v)转接于3L的发酵罐(发酵培养基的装液量1.35L)，置于200rpm，32℃开始培养，以此起点设为第0h，持续培养96h。当发酵第12h时，分别加入浓度为0g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L的木糖进行诱导；同时，分别在第0h、6h、12h、18h、24h添加15g/L的木糖开始诱导。以两种方式控制聚谷氨酸降解酶PgdS的分泌表达量，获得不同分子量的γ-PGA。收集发酵液，检测聚谷氨酸的分子量及产量的变化，同时实时监测发酵体系溶氧值的变化。
发酵培养基配方如下：菊粉粗提液70g/L，硫酸铵6g/L，三水合磷酸氢二钾20g/L，磷酸二氢钾2g/L，无水硫酸镁0.4-1g/L，一水硫酸锰0.02g/L。
考察在发酵第12h加入不同浓度的木糖诱导剂对聚谷氨酸的产量、分子量及发酵液溶氧量的影响，结果如图2所示：随着木糖浓度的增加，发酵终点聚谷氨酸分子量逐渐减小，添加0g/L、5g/L、10g/L、15g/L木糖得到的分子量分别为1400-1600kDa、640-750kDa、390-480kDa和20-30kDa，但当浓度达到20g/L时，分子量反而有所上升，为300-350kDa；同时对聚谷氨酸的产量测定，发现未添加木糖时，聚谷氨酸的产量最低，约为9.38±0.38g/L，而添加15g/L木糖后，聚谷氨酸产量最高，达到12.21±0.21g/L；并且从发酵液溶氧曲线可看出，不添加木糖诱导聚谷氨酸降解酶表达时，聚谷氨酸分子量较大，使得发酵液粘稠度增加，致使溶氧急剧减少，当发酵40h时，溶氧基本为0，严重限制了聚谷氨酸的进一步合成，而添加木糖诱导剂后，后期发酵液溶氧值均处于较高水平(20-45％)，解除了低溶氧对菌体生长及聚谷氨酸合成的抑制效应。以上结果说明在一定范围内提高诱导剂浓度可提高聚谷氨酸降解酶的表达量，有助于γ-PGA的降解，使得发酵液溶氧值保持一定水平，利于聚谷氨酸的进一步合成；而过高浓度的诱导剂对菌体有抑制作用，进而降低聚谷氨酸降解酶的表达量。
考察在不同发酵时间添加15g/L木糖对聚谷氨酸的产量、分子量以及发酵液溶氧量的影响，结果如图3所示：在0-12h之间添加诱导剂，发酵末期聚谷氨酸分子量随诱导时间的推移而逐渐降低，12-24h之间添加诱导剂，分子量又有所增加；对应聚谷氨酸产量与发酵液溶氧值与上述规律相同：聚谷氨酸分子量越小，溶氧值越大，产量越高。以上结果说明聚谷氨酸降解酶的诱导表达适宜在12h左右，过早诱导使得产酶与菌体生长相互竞争能量；过晚诱导，菌体产酶活力降低，对聚谷氨酸的水解均不利，因此最适宜在菌体生长的对数中后期诱导降解酶的表达。
以上结果说明，本发明技术采用基因工程技术，在基因转录水平上调控聚谷氨酸降解酶的表达水平，可以精确地控制特定分子量在20-1600kDa范围内的发酵生产。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种重组解淀粉芽孢杆菌及其构建方法和应用.
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1675
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttccatagg ctccgccccc tgacaagcat cacgaaatct gacgctcaaa tcagtggtgg 60
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggcggctc cctcgtgcgc 120
tctcctgttc ctgcctttcg gtttaccggt gtcattccgc tgttatggcc gcgtttgtct 180
cattccacgc ctgacactca gttccgggta ggcagttcgc tccaagctgg actgtatgca 240
cgaacccccc gttcagtccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 300
cccggaaaga catgcaaaag caccactggc agcagccact ggtaattgat ttagaggagt 360
tagtcttgaa gtcatgcgcc ggttaaggct aaactgaaag gacaagtttt ggtgactgcg 420
ctcctgcaag ccagttacct cggttcaaag agttggtagc tcagagaacc ttcgaaaaac 480
ctccctgcaa ggcggttttt tcgttttcag agcaagagat tacgcgcaga ccaaaacgat 540
ctcaagaaga tcatcttatt aaggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 600
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 660
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 720
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 780
tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 840
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 900
gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 960
gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 1020
ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 1080
cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 1140
tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 1200
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 1260
agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 1320
cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 1380
aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 1440
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 1500
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 1560
gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 1620
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcg 1675
<210> 2
<211> 1867
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgagggttct ttttttttta ggcagtgatg cgattttggc gtgagtcaac ggtaaccgga 60
ccgtagggag gattaaggag ttgactcgct cagcgccacc cgaacccttt cagcactcaa 120
acaaacccgt ttgtttgacg ccaaccggcg agggagcccc ccgaagatgc ggggggttgg 180
ggggattgaa tgctggcatc caacggccgt ccgttggtgg gtttgggcaa agcccaagaa 240
ctgttgcaag gctcgttgag aataaagaat gcttttcagg atgcttagaa tcgtttctga 300
gagcttcaaa taaaaaagat gaccttttat agggggaagc tcttaaaatt gaatgtaggg 360
gcatttaaac acgtttaaaa ataaaaaaag cagactcttt agagtccgcc ttgttatttt 420
taacccagtg ctccattttc ggctgtttgg aaatcttttg agatgccgaa ccatccattt 480
tcttttgttc catgaaaaaa gtgcttttgg atgcttaaaa aggctttttc gtataaaaaa 540
agccgatttt tgaaaaaaaa aatctccccc cctgcggggg aagaatggtt ttgatctttg 600
ggttttaggt tttaaaaaaa gccggctgtt ttcagccggc tttttttcga ttttggcgga 660
gccgaaatcg ggtcttttct tatcttgata ctatatagaa acatctcaag gcgaaaaaat 720
agtaatcagc ccttgtctgt caagggttat aggtgttttt gacaggtaaa aactccatct 780
gctattatta aagtgccaac caaaataata gaacgctaga aaactagctc agagggagtt 840
ttttatcatg tattcaactg aaaatgatta tatcatcctt gaggacaaga ccgcaacagg 900
taaaaagcgg gattggaaag ggaaaaagag acgggcaaat cttatggcag agcattatga 960
agctttacag agtaaaactg gtgtacctta ctatggcaaa aaagctgaga aattgtgcag 1020
ttgtgcagaa tgtcttaaac gaaagagaga cccggagacg ggcaaactaa agctatatca 1080
agcccagttc tgtaaagtga ggttatgccc gatgtgtgcg tggcgaaggt cgttaaaaat 1140
tgcttatcac aataagttga ttgttgagga agcgaatcgg cagtatggct gcaggtggat 1200
ttttctcaca cttacagttc gtaatgtaga tggcgatgga ttaaaaccta tgattgctga 1260
catgatgaaa ggatggaatc gtctttttgg ttataaacga gtcaaggaag ctactttagg 1320
ttatttcaga gcgttagaga ttactaaaaa caatgaagaa aatacatatc atccacattt 1380
tcatgtgttg ttgcctgtaa agaggaatta ttttggcaag aattacatca agcagacaga 1440
atggacaagc ttatggaaaa gagcaatgaa attggattac acgccgattg tcgatattcg 1500
tcgagtgaaa ggtaaagcca aggttgatgc ggagcagatt gaagatgaag taagggaagc 1560
gatgatggaa caaaaagctg ttcttgaaat ctctaaatat ccagtcaaag ataccgatgt 1620
tgtgcggggc aataaggtga cggaagataa tctgaacacg gtattttatt tggatgatgc 1680
actggctgcc cgtagattga tcgggtacgg cggcatttta aaagagatac ataaagagct 1740
gaatcttggt gatgcggagg acggcgatct tgttaagatt gaggaagaag atgacgatgt 1800
tgcgaatggt gcatttgagg tcatggctta ctggcatcca ggcattaaga attacataat 1860
caaatag 1867
<210> 3
<211> 1059
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttttaatgtg gtcttttatt cttcaactaa agcacccatt agttcaacaa acgaaaattg 60
gataaagtgg gatattttta aaatatatat ttatgttaca gtaatattga cttttaaaaa 120
aggattgatt ctaatgaaga aagcagacaa gtaagcctcc taaattcact ttagataaaa 180
atttaggagg catatcaaat gaactttaat aaaattgatt tagacaattg gaagagaaaa 240
gagatattta atcattattt gaaccaacaa acgactttta gtataaccac agaaattgat 300
attagtgttt tataccgaaa cataaaacaa gaaggatata aattttaccc tgcatttatt 360
ttcttagtga caagggtgat aaactcaaat acagctttta gaactggtta caatagcgac 420
ggagagttag gttattggga taagttagag ccactttata caatttttga tggtgtatct 480
aaaacattct ctggtatttg gactcctgta aagaatgact tcaaagagtt ttatgattta 540
tacctttctg atgtagagaa atataatggt tcggggaaat tgtttcccaa aacacctata 600
cctgaaaatg ctttttctct ttctattatt ccatggactt catttactgg gtttaactta 660
aatatcaata ataatagtaa ttaccttcta cccattatta cagcaggaaa attcattaat 720
aaaggtaatt caatatattt accgctatct ttacaggtac atcattctgt ttgtgatggt 780
tatcatgcag gattgtttat gaactctatt caggaattgt cagataggcc taatgactgg 840
cttttataat atgagataat gccgactgta ctttttacag tcggttttct aacgatacat 900
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<211> 2926
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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ccgtagggag gattaaggag ttgactcgct cagcgccacc cgaacccttt cagcactcaa 120
acaaacccgt ttgtttgacg ccaaccggcg agggagcccc ccgaagatgc ggggggttgg 180
ggggattgaa tgctggcatc caacggccgt ccgttggtgg gtttgggcaa agcccaagaa 240
ctgttgcaag gctcgttgag aataaagaat gcttttcagg atgcttagaa tcgtttctga 300
gagcttcaaa taaaaaagat gaccttttat agggggaagc tcttaaaatt gaatgtaggg 360
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taacccagtg ctccattttc ggctgtttgg aaatcttttg agatgccgaa ccatccattt 480
tcttttgttc catgaaaaaa gtgcttttgg atgcttaaaa aggctttttc gtataaaaaa 540
agccgatttt tgaaaaaaaa aatctccccc cctgcggggg aagaatggtt ttgatctttg 600
ggttttaggt tttaaaaaaa gccggctgtt ttcagccggc tttttttcga ttttggcgga 660
gccgaaatcg ggtcttttct tatcttgata ctatatagaa acatctcaag gcgaaaaaat 720
agtaatcagc ccttgtctgt caagggttat aggtgttttt gacaggtaaa aactccatct 780
gctattatta aagtgccaac caaaataata gaacgctaga aaactagctc agagggagtt 840
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caaatagttt taatgtggtc ttttattctt caactaaagc acccattagt tcaacaaacg 1920
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acctatacct gaaaatgctt tttctctttc tattattcca tggacttcat ttactgggtt 2520
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aaaggagcga tttacatatg agttatgcag tttgtagaat gcaaaa 2926
<210> 5
<211> 1402
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccgggttac attgtaatca tgtccagaaa atgatcaatc acaatggagg acattcctaa 60
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tatgctattt cttaaaatta cggcttgtgg gttgaaagta tttagaatat tggtaaggcc 240
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tacctgtgat gagacagttg atttatttaa tccagtcatt tcagataatt ttgctcttga 1080
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<212> DNA
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<400> 6
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<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
actagtgaat tcgtcgacag atctgcggcc gc 32
<210> 8
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccgggttac attgtaatca tgtccagaaa atgatcaatc acaatggagg acattcctaa 60
tgccggtgca ttctgtccta aggaagatgg caataattca tagctattgc ctaattggga 120
ataaaccctt gatgatactt cacttctcat tgaatttaaa accataggat gcgattcaat 180
tatgctattt cttaaaatta cggcttgtgg gttgaaagta tttagaatat tggtaaggcc 240
tattcctaaa tagaatccaa aattttgtaa tgcatttaag gttccgatat cattcagatg 300
ggcgaggttt atgatatctt gataggacag ttttttctct ttggtctgaa gagattttaa 360
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accattaaag tctattgtca tatgtcccat ttctccagag aagccgctta ctcctctata 480
taaatgattg ttgataataa caccgatccc tattcctgtg ctgatactta cgtaaataat 540
gttatcgtga ttttttgcag ctccaaatac tttttctcca tatgcgccag catttgcctc 600
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tctccagttg gagttcggag tgaaaacaat tttttgatct ttatcaatga gtccaggcac 720
gcaaatacct ataccaataa gcccgtacgg agattggggc atttgcgtaa taaagtgatg 780
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aacatagtac atagcgaatc ttccctttat tatatctaat gtgttcataa aaaactaaaa 1260
aaaatattga aaatactgac gaggttatat aagatgaaaa taagttagtt tgtttaaaca 1320
acaaactaat aggtgatgta cttactatat gaaataaaat gcatctgtat ttgaatgaat 1380
ttatttttaa gggggaaatc acactagtga attcgtcgac agatctgcgg ccgcggtaat 1440
aaaaaaacac ctccaagctg agtgcgggta tcagcttgga ggtgcgttta ttttttcagc 1500
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttccaatta tgacaaaagc ggagattgcg gaagctgata catcatcaga attgattgtc 120
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tattggaagg ataaatacgc aggaagtata cgggtgcaat aa 1242
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aggtgttttt ttattaccgc ggccgcttat tgcacccgta tact 44
Claims (5)
1.一种重组解淀粉芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，以消除内源质粒的解淀粉芽孢杆菌为宿主菌，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS插入pNX01载体的Spe I和Not I酶切位点之间得到重组质粒，再将重组质粒导入宿主菌中，即得；
所述宿主菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NB，其由解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346消除内源质粒p2Sip得到；
所述聚谷氨酸降解酶基因pgdS的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
所述pNX01载体由载体骨架1、载体骨架2和载体骨架3依次连接得到，所述载体骨架1包括依次连接的大肠杆菌复制原点ori-177和氨苄青霉素筛选标记Amp，载体骨架1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述载体骨架2包括依次连接的解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M2016346内源质粒的复制蛋白rep和氯霉素筛选标记Cm，载体骨架2的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示；所述载体骨架3包括依次连接的启动子、多克隆位点MCS和淀粉酶的终止子Tamy，所述多克隆位点MCS从上游到下游依次包括酶切位点Spe I、EcoR I、Sal I、Bgl II和NotI；
所述载体骨架3中的启动子为Pxyl启动子，所述Pxyl启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示，所述载体骨架3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、构建pNX01载体：
a1以穿梭质粒pHY300PLK为模板通过PCR扩增得到载体骨架1；
a2以解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346的内源质粒p2Sip为模板通过PCR扩增得到复制蛋白rep，以穿梭质粒pKSV7为模板通过PCR扩增得到氯霉素筛选标记Cm，以复制蛋白rep和氯霉素筛选标记Cm为模板进行重叠延伸PCR，得到载体骨架2；
a3以B.subtilis 168的基因组为模板通过PCR扩增得到Pxyl启动子，以解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016346的基因组为模板扩增得到淀粉酶的终止子Tamy，以Pxyl启动子和淀粉酶的终止子Tamy为模板进行重叠延伸PCR，多克隆位点MCS的序列融合设计在引物Pxyl-F和Tamy-R中，得到载体骨架3；
a4将载体骨架1、载体骨架2和载体骨架3利用多片段一步克隆法依次连接，得到pNX01载体；
B、构建重组质粒pNX01-pgdS：以B.subtilis NX-2基因组为模板通过PCR扩增得到聚谷氨酸降解酶基因pgdS，其上下游分别引入酶切位点Spe I、Not I；将步骤A得到的pNX01载体进行Spe I、Not I双酶切，利用一步克隆的方法，将聚谷氨酸降解酶基因pgdS和双酶切得到的质粒连接，得到重组质粒pNX01-pgdS；
C、构建重组解淀粉芽孢杆菌：将步骤B得到的重组质粒pNX01-pgdS转化至大肠杆菌E.coli GM2163中进行去甲基化dam-、dCm-，再将去甲基化的重组质粒pNX01-pgdS转化至宿主菌中，即得。
3.权利要求1-2任意一项所述构建方法构建得到的重组解淀粉芽孢杆菌。
4.权利要求3所述重组解淀粉芽孢杆菌在发酵产γ-聚谷氨酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基的配方如下：菊粉粗提液30-80g/L，硫酸铵1-10g/L，三水合磷酸氢二钾5-30g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L，无水硫酸镁0.1-5g/L，一水硫酸锰0.01-0.1g/L；在30-40℃发酵培养第0-24h时，添加5-20g/L的木糖诱导聚谷氨酸降解酶基因pgdS的表达，控制发酵培养时间为48-100h；通过控制木糖的浓度和木糖的添加时间控制聚谷氨酸降解酶基因pgdS的表达量，获取不同分子量范围的小分子γ-聚谷氨酸。
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