TW201326392A - 一種使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法 - Google Patents

一種使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201326392A
TW201326392A TW100146856A TW100146856A TW201326392A TW 201326392 A TW201326392 A TW 201326392A TW 100146856 A TW100146856 A TW 100146856A TW 100146856 A TW100146856 A TW 100146856A TW 201326392 A TW201326392 A TW 201326392A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
microorganism
carbon sugar
plastid
gene sequence
carbon
Prior art date
Application number
TW100146856A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI432574B (zh
Inventor
Yun-Peng Chao
Chung-Jen Chiang
Hong-Ming Lee
Zei-Wen Wang
Po-Ting Chen
Original Assignee
Univ Feng Chia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Feng Chia filed Critical Univ Feng Chia
Priority to TW100146856A priority Critical patent/TWI432574B/zh
Priority to CN201110448728.7A priority patent/CN103160544B/zh
Priority to CN201410616186.3A priority patent/CN104403983A/zh
Priority to US13/656,654 priority patent/US20130157319A1/en
Publication of TW201326392A publication Critical patent/TW201326392A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI432574B publication Critical patent/TWI432574B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01069—Protein-Npi-phosphohistidine-sugar phosphotransferase (2.7.1.69), i.e. sucrose phosphotransferase system II
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明係關於一種利用微生物醱酵醣類的方法。本發明藉由基因工程的方式，針對目標細菌的醣類代謝相關路徑進行改良，使得目標細菌具備可以同時快速代謝五碳醣與六碳醣的能力，並且達到利用單一菌株即可同時醱酵五碳醣與六碳醣的功能，不僅簡化醱酵的流程，更可以降低醱酵成本、提升醣類醱酵的效能。

Description

一種使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法
本發明係關於一種利用微生物醱酵醣類的方法，尤其是關於一種使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法。
由再生資源來生產替代性能源和取代石油衍生性的化學品是目前國際市場的主流，也是必然的趨勢。再生資源中，尤以植物生質(即木質纖維素)的蘊藏量最豐，而木質纖維素包含纖維素、半纖維素和木質素，其中纖維素和半纖維素經酵素水解後，主要可生成葡萄糖(glucose)和木糖(xylose)，本發明可以將細菌(如：大腸桿菌)改質，經改質後的菌株即具有同時且快速代謝葡萄糖和木糖的能力，並能醱酵轉化生成能源(如：酒精)和其他大宗化學品(如：乳酸)。
習知技術中，常見利用大腸桿菌對醣類進行醱酵的技術，然而此一方法存在著若干尚待解決之問題。大腸桿菌的優勢在於生長快速、培養基成分簡單且易於調配、醱酵過程易於操作、並且可以代謝多種不同的醣類，然而在同時具有多種醣類的生長環境之下，大腸桿菌會優先代謝葡萄糖，待生長環境中的葡萄糖消耗完畢後，才會開始依序代謝其他醣類，因此無法同時代謝不同的醣類，使得整體醣類的代謝速率無法提升，甚至造成非葡萄糖的其他醣類代謝不完全，導致醣類代謝的效率低落。
先前技術利用紫外光、伽瑪射線、亞硝基胍(nitrosoguanidine)等致突變劑使得菌種產生突變，接著透過篩選的方式找出可以同時醱酵五碳醣與六碳醣的菌株，然而此一方法步驟繁瑣，亦非在了解菌種醣類代謝機制的情況下將菌種改良而得到可同時代謝五碳醣與六碳醣的菌株，而是藉由重複篩選的方式摸索尋找可能適合的變種菌株，因此效果較差。
由於大腸桿菌在代謝葡萄糖時所產生的降解產物會抑制其他醣類的代謝路徑，因此有習知技術讓大腸桿菌的磷酸轉移酵素系統產生缺陷，以期降低大腸桿菌代謝葡萄糖時所造成的降解產物抑制效應，希望藉此提高其他醣類的代謝速率。然而，具有缺陷的大腸桿菌雖然可以因此同時代謝葡萄糖與木糖，但是其對於葡萄糖的代謝速率卻明顯降低，反而不利於整體的代謝流程及產物生成效率。
若干先前技術會在醣類醱酵過程中同時採用兩種分別代謝葡萄糖和木糖的菌株，希望能藉由兩種菌株分工的方式達到同時代謝五碳醣與六碳醣的目的。但是這樣的醱酵過程操作不易，必須多次嘗試與調整才能達到最佳的醱酵成效，並且必須事先培養兩種菌株，因此亦會導致整體醱酵成本的增加，並不利於工業生產的應用。
由於必須克服前述習知技術的缺點，例如醱酵成本過高、醱酵速率與效率不佳、醱酵操作程序困難繁複等，因此有必要找到能夠利用易於製備的單一菌株同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，以便改善與簡化醣類醱酵的程序並提升醣類醱酵的效能，藉此提升相關產業界的技術，尤其在生質能源的領域更有其必要性。
人類第四次工業革命的產業實繫於綠色的製程，其中生物產業被視為綠色工業的代表，生物產業有賴於生物技術為基礎，相對於以化石能源為基礎的化學工業，生物技術可有效降低能源的消耗和汙染的排放，尤其生物技術可利用再生資源，達到永續發展和改善環境的目的。再生資源係指以生物質(biomass)為原料，範圍主要包括作物、農林漁牧加工後之廢棄物和工業及都市排放的有機廢棄物，透過生物精煉製程(biorefinery process)可將這些生物質轉化生產替代性能源、取代石油衍生性的產品和新產品，這類新興產業的市場以每年約15%的速率成長，預計2012年的全球總產值可達到1215億美元(Gobina E,2007,report code EGY054A,BCC Research publications)。
再生資源中，尤以木質纖維素(lignocellulose)的蘊藏量最豐，木質纖維素的來源廣泛，但目前被研究可做為醱酵料源的，包括(1)農業殘留物如甘蔗渣、稻稈、榖殼、玉米稈等，(2)非糧食作物，如芒草等，(3)木本生物質，如痲瘋樹等，(4)生物質廢棄物，如蔬菜和水果廢棄物、紙漿廢棄物和都市排放固態廢棄物等(Dietmar P,2006,Biotechnol J. 1:806-814)。一般而言，木質纖維素的組成包含30-60%纖維素(cellulose)、20-40%半纖維素(hemicellulose)和10-30%木質素(lignin)。而纖維素是一種由葡萄糖以β-1,4糖鍵結(glycosidic linkage)的聚合糖，由於其本身分子和分子間的氫鍵鍵結，以致造成結晶區和非結晶區的結構；半纖維素則是一種由六碳糖和五碳糖所構成的具有複雜分支結構的聚合糖，軟木的半纖維素組成分主要是六碳糖如葡萄糖，而硬木的半纖維素組成分主要是五碳糖如木糖(Ganapathy S. et al. 2010,Eng. Life Sci. 10:8-18)。纖維素和半纖維素經水解後，主要可生成葡萄糖和木糖，絕大部分的微生物皆可有效代謝葡萄糖，然僅有少數的微生物可以醱酵木糖，不過代謝效能不彰，以致影響了以木質纖維素為基礎的微生物醱酵精煉製程的工業發展。
相較於其他細菌，大腸桿菌是一株工業實用友善性極高的菌種，它的優勢在於生長快速、培養基質配方簡單、醱酵易操作，尤其大腸桿菌具有代謝多種類糖(包括木糖)的能力，不過當有多種醣類同時存在的環境下，大腸桿菌將優先使用葡萄糖，其他醣類(如木糖)的代謝則受到抑制，待葡萄糖消耗完後，其他醣類再依次代謝，因此遲緩了糖的代謝速率，甚至造成其他醣類代謝的不完全，以致效率不佳。
基於此，本發明技術就是運用代謝工程的技術來改質大腸桿菌，根據大腸桿菌的葡萄糖和木糖代謝路徑，剔除大腸桿菌的ptsG基因，以緩和葡萄糖降解物抑制的現象，再引介Zymomonas mobilis的葡萄糖促進基因(glucose facilitator gene)glf，以增進大腸桿菌的葡萄糖代謝速率，且加強五碳糖磷酸代謝路徑的rpiA、tktA、rpe、talB基因表現，以增加大腸桿菌木醣代謝的速率，最後移除生產其他有機酸的ldhA、frdA、pta、poxB基因，以便移除生成之有機酸對於五碳糖磷酸的回饋抑制作用。整合以上的代謝工程技術，經改質後的單一菌株即能同時代謝葡萄糖和木糖，且葡萄糖和木糖的消耗速率可幾乎達到同步，操作簡易方便，亦可簡化發酵程序，以生產能源(如酒精)和其他大宗化學品(如乳酸)為最佳實施例，可有效提升醱酵產品的生產效能，極具發展前瞻性和潛力。
圖A.　大腸桿菌之葡萄糖和木糖代謝路徑。
本發明係利用基因工程的方式改良大腸桿菌的代謝路徑，使大腸桿菌得以同時且快速地代謝五碳醣與六碳醣，係包含以下步驟：剔除大腸桿菌的ptsG基因，以緩和葡萄糖降解物抑制的現象；引介Zymomonas mobilis的葡萄糖促進基因(glucose facilitator gene)glf，以增進大腸桿菌的葡萄糖代謝速率；引入一起動子以加強五碳醣磷酸代謝路徑的rpiA、tktA、rpe、talB基因表現，藉此增加大腸桿菌木醣代謝的速率；剔除生產其他有機酸的ldhA、frdA、pta、poxB基因，以便移除代謝過程中生成之有機酸對於五碳醣磷酸的回饋抑制作用。
因此，本發明之「一種利用微生物醱酵醣類的方法」不但可以增進菌株醱酵植物生質水解產物的速率，亦可簡化醱酵程序，並且有效提升醱酵產品的生成效能，具有國內外市場需求之潛力。
本發明於實施例中所提及之實驗操作方法，優先說明如下：
一般實驗方法與材料
本發明技術中採用的一般實驗方法和DNA選殖(DNA cloning)主要可參考本技藝中所詳知的教科書：Sambrook J,Russell DW,2001,Molecular Cloning：a Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York，其中例如限制酶剪切DNA片段反應(cleavage reaction by restricting enzyme)、使用T4 DNA黏接酶(ligase)黏接DNA片段反應(DNA ligation with T4 DNA ligase)、聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)、瓊脂凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)、硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)和質體轉形(transform)等，這些技術都是熟悉此項技術之人士可根據本身的專業素養來實施。此外、細菌培養液密度是使用分光光度計(V530,Jasco)測量，測定波長為550nm，所得到的吸光值記錄為OD550。蛋白質濃度分析則是使用蛋白質分析試劑(Protein assay Reagent,BioRad Co.)，進行總蛋白質之定量，個別標的之蛋白質則是以影像分析儀(AlphaImagerEP,AlphaInnotech)來分析經凝膠電泳分離之蛋白質加以定量。
細菌及噬菌體染色體(chromosome)、質體(plasmid)和DNA片段的純化則分別使用 Genomic DNA Purification kit(Promega Co.)、High-Speed Plasmid Mini kit(Geneaid Co.)和Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit(Geneaid Co.)等商業純化藥品組。DNA核苷酸定點突變則使用 Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene Co.)、限制酶(Restriction enzyme)購自New England Biolabs以及Fermentas Life Science，T4 DNA黏接酶和Pfu DNA聚合酶(polymerase)購自Promega Co.，聚合酶連鎖反應中所須的引子(primers)委由明欣生物科技公司(台北)及源資生物科技公司(台北)合成。
DNA選殖過程中所使用的中介細胞為大腸桿菌DH5α(Stratagene Co.)、Bw25142(Haldimann and Wanner,2001,J. Bacteriol.,183: 6384-93)與BL21(DE3)(Invitrogen Co.)，細菌以LB營養基(Miller JH,1972,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)培養，而經轉形的菌種則在培養基中添加抗生素培養，抗生素用量如安培西林(ampicillin)為50 μg/mL，康納黴素(kanamicin)為50 μg/mL。
實施例一： 1.　剔除大腸桿菌染色體的ptsG基因：
根據前人的研究，移除ptsG基因產物的功能後，可減緩大腸桿菌中葡萄糖降解物抑制的效應，使得大腸桿菌可以同時利用木糖和葡萄糖。因此，首先剔除大腸桿菌染色體的ptsG基因，其進行步驟如下所述。根據EcoCyc基因體資料庫中ptsG基因周遭的核苷酸序列來合成以下兩個引子：
順向引子1：
(5’-TGGGTGAAACCGGGCTGG)
反向引子2：
(5’-AGCCGTCTGACCACCACG)
使用Wizard Genomic DNA purification kit(Promega Co.)來純化菌株CGSC 9031(E. coli Genetic Stock Center,USA)的染色體，以純化後的染色體為DNA模版(template)，使用上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一段DNA(2.8 kb)，其兩端包含ptsG基因N端及ptsG基因C端的同源區域，而其中間部分則包含一個兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納黴素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化。接著，依照前述之”化學轉形法”，將協助型質體pKD46(Datsenko K.A. and Wanner B. L.,2000,Proc. Natl. Aca. Sci. USA,97:6640-6645)轉形入大腸桿菌亞型B BL21中，得到菌株BL21/pKD46。依照前述之”電穿孔法”，準備菌株BL21/pKD46之勝任細胞，再利用電穿孔法將上述所得之線性DNA送入菌株BL21/pKD46中，隨後以SOC培養基於30℃下培養，同時加入1 mM阿拉伯糖進行誘導生產質體pKD46上的λ-Red基因，以幫助此增幅出來的線性DNA與染色體ptsG基因進行同源重組(homologous recombination)，誘導二小時後，將培養溫度提升到42℃，經二小時後以離心機將細胞離心下來，移除上清液，將細胞塗灑在含有抗康納黴素的LB固態培養基上。隨意挑選生長於固態培養基的菌落，以順向引子3和反向引子4(如下)，使用前述之”原位PCR反應”來確認染色體基因ptsG中所鑲箝的抗康納黴素基因，如圖B中所示，挑選出的菌株可增幅出抗康納黴素基因的DNA片段，然而原生型菌株BL21則無法增幅出抗康納黴素基因的DNA片段。最後選擇其中一株菌株，根據前述之”抗抗生素基因移除法”來移除該菌株染色體上鑲箝的抗康納黴素基因，經溫度誘導協助型質體pCP20產生FLP蛋白質，經作用於兩個FRT位置後，將抗康納黴素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納黴素的LB固態培養基生長的菌株，重新命名為BL-G。
圖B.DNA電泳圖。徑1：原生型菌株BL21；徑2：DNA標準物；徑3：染色體鑲箝抗康納黴素基因的菌株。
順向引子3：
(5’-GATTGAACAAGATGGATTGC)
反向引子4：
(5’-GAAGAACTCGTCAAGAAGGC)
2.建構含有glf基因之重組大腸桿菌菌株：
根據前人的研究報導，ptsG基因缺陷大腸桿菌的葡萄糖消耗速率將大幅降低，另一方面，過去的研究顯示來自Zymomonas mobilis的葡萄糖促進基因(glucose facilitator gene)glf產物可提供大腸桿菌運輸葡萄糖到胞內的功能(Parker C et al.,1995,Mol Microbiol. 15:795-802)，為了設法提升此缺陷菌BL-G的葡萄糖消耗速率，因此將glf基因引介入ptsG基因缺陷大腸桿菌中。建構過程如下，首先根據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫glf的核苷酸序列(GenBank:M60615.1)來合成glf基因引子：
順向引子5：
(5’-TGTCTCTAGAAGCATGCAGGAGGAATCG)
反向引子6：
(5’-AGCAACTCGAGTTACTTCTGGGAGCGCCAC)
上述順向引子被設計含有限制酶XbaI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有XhoI的切割位置(如底線所標示者)。以Z. mobilis之染色體做為DNA模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有glf之片段(1.4kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，使用限制酵素XbaI以及XhoI切割此基因片段；另一方面，利用High-Speed Plasmid Minikit 純化質體pND707(Love CA et al.,1996,Gene,176:49-53)，以限制酵素XbaI以及XhoI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述兩個片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α中，而得到質體pND-glf，如下圖C所示。
圖C.　質體pND-glf圖譜。符號簡寫說明：bla，抗安培西林基因；CI857，抑制子；lambda PR，λPR啟動子；lambda PL，λPL啟動子。
接著，構築鑲嵌式質體(integration plasmid) pHK-glf，根據質體pND-glf的DNA序列，設計以下的引子：
順向引子7：
(5’-AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG)
反向引子8：
(5’-AGCAACTCGAGTTACTTCTGGGAGCGCCAC)
上述順向引子被設計含有限制酶BamHI之切割位置(如底線所標示者)。以質體pND-glf做為DNA模板，並以上述兩個引子進行菌落PCR反應，增幅出一段含有受λPRPL啟動子調控glf之DNA片段(1.8 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，使用限制酵素BamHI以及SmaI切割；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit純化之鑲嵌式質體pHK-Km(Chiang CJ et al.,2008,Biotechnol. Bioeng. 101:985-995)，以限制酵素BamHI以及SmaI切割；接著使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將上述被酵素切割過的DNA片段回收，利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述兩個片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α(pir)中，而得到鑲嵌式質體pHK-glf，質體圖譜如下圖D所示。
圖D.質體pHK-glf圖譜。符號簡寫說明：Km，康納黴素抗性基因；R6K origin，大腸桿菌R6K複製源點；HK attP，前嗜菌體(prophage)HK鑲嵌位置；lambda PR，PR啟動子；lambda PL，PL啟動子。
其次，將受λPRPL啟動子調控glf基因鑲箝至ptsG基因缺陷菌株BL-G的染色體上，因此將協助型質體pAH69(Haldimann A and Wanner BL.,2001,J Bacteriol.,183:6384-6393)依照前述之”化學轉形法”轉形進入大腸桿菌菌株BL-G中，得到菌株BL-G/pAH69；接著根據前述之”質體鑲箝細菌染色體法”，將鑲嵌式質體pHK-glf再轉形入菌株BL-G/pAH69中，進行基因鑲箝入菌株染色體，以含有康納黴素的LB固態培養基來篩選菌株。挑選單一菌落，利用順向引子7和反向引子8，使用前述之”原位PCR反應”來確認染色體鑲箝一個glf基因，經挑選出的菌株可增幅出一個受λPRPL啟動子調控glf基因片段(徑3)，如下圖E所示。
圖E. DNA電泳圖。徑1：DNA標準物；徑2：質體pHK-glf；徑3：染色體鑲箝glf基因菌株。
最後，根據前述之”抗抗生素基因移除法”來移除該菌株染色體上鑲箝的抗康納黴素基因，經溫度誘導協助型質體pCP20產生FLP蛋白質，經作用於兩個FRT位置後，將抗康納黴素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納黴素的LB固態培養基生長的菌株，重新命名為BL-Gf。
3.強化大腸桿菌之rpe和tktA基因：
為了增進菌株代謝木糖的速率，因此將強化菌株的五碳糖磷酸代謝路徑中的rpe和tktA基因。其執行流程如下，首先根據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫rpe的核苷酸序列來合成引子：
順向引子9：
(5’-TATACATATGAAACAGTATTTGATTGC)
反向引子10：
(5’-CCTGAATTCAAACTTATTCATGACTTACC)
上述順向引子被設計含有限制酶NdeI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有EcoRI的切割位置(如底線所標示者)。以大腸桿菌BL21之染色體做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有rpe基因之片段(0.7 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素NdeI以及EcoRI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；另一方面，根據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫tktA的核苷酸序列來合成引子：
順向引子11：
(5’-ACGGGAATTCAGGAGGAGTCAAAATG)
反向引子12：
(5’-GGGCCTCGAGTTACAGCAGTTCTTTTC)
上述順向引子被設計含有限制酶EcoRI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有XhoI的切割位置(如底線所標示者)。以大腸桿菌BL21之染色體做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有tktA基因之片段(2.01 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素EcoRI以及XhoI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；同時利用High-Speed Plasmid Mini kit純化質體pND707(Love CA et al.,1996,Gene,176:49-53)，以限制酵素NdeI以及XhoI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述三個DNA片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α中，而得到質體pND-rTA。最後依據質體pND-rTA的DNA序列，設計以下的引子：
順向引子13：
(5’AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG3’)
反向引子14：
(5’-GGGCCTCGAGTTACAGCAGTTCTTTTC)
上述順向引子被設計含有限制酶BamHI之切割位置(如底線所標示者)。以質體pND-rTA做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有受λPRPL啟動子調控rpe-tktA基因之片段(2.7 kb)，以Gel/PCR DNA FragmentsExtraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素BamHI切割；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit純化之鑲嵌式質體pPhi80-Km(Chiang CJ et al.,2008,Biotechnol. Bioeng. 101:985-995)，以限制酵素BamHI以及SmaI切割；接著使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將上述被酵素切割過的DNA片段回收，利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述兩個片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α(pir)中，而得到鑲嵌式質pPhi80-rTA。
圖F.　質體pPhi80-rTA圖譜。符號簡寫說明：Km，康納黴素抗性基因；R6K origin，大腸桿菌R6K複製源點；Phi80 attP，前嗜菌體(prophage)80鑲嵌位置；lambda PR，PR啟動子；lambda PL，PL啟動子。
其次，將受λPRPL啟動子調控rpe-tktA基因鑲箝至步驟2建構之菌株BL-Gf的染色體上，因此將協助型質體pAH123(Haldimann A and Wanner BL.,2001,J Bacteriol.,183:6384-6393)依照前述之”化學轉形法”轉形進入大腸桿菌菌株BL-Gf中，得到菌株BL-Gf/pAH123；接著根據前述之”質體鑲箝細菌染色體法”，將鑲嵌式質體pPhi80-rTA再轉形入菌株BL-Gf/pAH123中，進行基因鑲箝入菌株染色體，以含有康納黴素的LB固態培養基來篩選菌株。挑選單一菌落，利用順向引子13和反向引子14，使用前述之”原位PCR反應”來確認染色體鑲箝一個rpe-tktA基因，經挑選出的菌株可增幅出一個受λPRPL啟動子調控rpe-tktA基因片段(徑3)。
圖G.　DNA電泳圖。徑1：DNA標準物；徑2：質體pPhi80-rTA；徑3：染色體鑲箝rpe-tktA基因菌株。
最後，根據前述之”抗抗生素基因移除法”來移除該菌株染色體上鑲箝的抗康納黴素基因，經溫度誘導協助型質體pCP20產生FLP蛋白質，經作用於兩個FRT位置後，將抗康納黴素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納黴素的LB固態培養基生長的菌株，重新命名為BL21e。
4.　強化大腸桿菌之rpiA和talB基因：
為了增進菌株代謝木糖的速率，因此將強化菌株的五碳糖磷酸代謝路徑中的rpiA和talB基因。其執行流程如下，首先根據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫rpiA的核苷酸序列來合成引子：
順向引子15：
(5’-AATGCCATATGAATTTCATACCACAGGCGAAAC)
反向引子16：
(5’-TGGAGGAATTCCCGTCAGATCATTTCACAATG)
上述順向引子被設計含有限制酶NdeI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有EcoRI的切割位置(如底線所標示者)。以大腸桿菌BL21之染色體做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有rpiA基因之片段(0.7 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素NdeI以及EcoRI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；另一方面，根據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫talB的核苷酸序列來合成引子：
順向引子17：
(5’-TTTGAATTCAGGAGGATACTATCATGACG)
反向引子18：
(5’-CTAACTCGAGGTCGACGTTACAGCAGATCGCCGATC 3’)
上述順向引子被設計含有限制酶EcoRI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有XhoI的切割位置(如底線所標示者)。以大腸桿菌BL21之染色體做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有talB基因之片段(1.0 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素EcoRI以及XhoI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；同時利用High-Speed Plasmid Mini kit純化質體pND707(Love CA et al.,1996,Gene,176:49-53)，以限制酵素NdeI以及XhoI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述三個DNA片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α中，而得到質體pND-rTB。最後依據質體pND-rTB的DNA序列，設計以下的引子：
順向引子19：
(5’ AAGGGGGATCCATCTAACACCGTGCGTGTTG3’)
反向引子20：
(5’-CTAACTCGAGGTCGACGTTACAGCAGATCGCCGATC3’)
上述反向引子被設計含有限制酶SalI之切割位置(如底線所標示者)。以質體pND-rTB做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有受λPRPL啟動子調控rpiA-talB基因之片段(1.7 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素SalI切割；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit純化之鑲嵌式質體pLamda-Km(Chiang CJ et al.,2008,Biotechnol. Bioeng. 101:985-995)，以限制酵素SalI以及SmaI切割；接著使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將上述被酵素切割過的DNA片段回收，利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述兩個片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α(pir)中，而得到鑲嵌式質pLam-rTB，質體圖譜如圖H所示。
圖H.質體pLam-rTB圖譜。符號簡寫說明：Km，康納黴素抗性基因；R6K origin，大腸桿菌R6K複製源點；Lambda attP，前嗜菌體(prophage)鑲嵌位置；lambda PR， PR啟動子；lambda PL，PL啟動子。
其次，將受λPRPL啟動子調控rpiA-talB基因鑲箝至步驟3建構之菌株BL21e的染色體上，因此將協助型質體pAH121(Haldimann A and Wanner BL.,2001,J Bacteriol.,183:6384-6393)依照前述之”化學轉形法”轉形進入大腸桿菌菌株BL-Gf中，得到菌株BL21e/pAH121；接著根據前述之”質體鑲箝細菌染色體法”，將鑲嵌式質體pLam-rTB再轉形入菌株BL21e/pAH121中，進行基因鑲箝入菌株染色體，以含有康納黴素的LB固態培養基來篩選菌株。挑選單一菌落，利用順向引子19和反向引子20，使用前述之”原位PCR反應”來確認染色體鑲箝一個rpiA-talB基因，經挑選出的菌株可增幅出一個受λPRPL啟動子調控rpiA-talB基因片段(徑3)。
圖I.　DNA電泳圖。徑1：DNA標準物；徑2：質體pLam-rTB；徑3：染色體鑲箝rpiA-talB基因菌株。
最後，根據前述之”抗抗生素基因移除法”來移除該菌株染色體上鑲箝的抗康納黴素基因，經溫度誘導協助型質體pCP20產生FLP蛋白質，經作用於兩個FRT位置後，將抗康納黴素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納黴素的LB固態培養基生長的菌株，重新命名為BL21e-RB。
5.　剔除大腸桿菌染色體的ldhA、poxB、pta、frdA基因：
大腸桿菌主要進行混合酸醱酵，所生產的混合酸或混合酸相關代謝路徑中生產的中間代謝物，可能產生回饋抑制五碳糖磷酸代謝的作用，為了免除這個抑制機制，因此將混合酸生成代謝路徑中的ldhA、poxB、pta、frdA基因逐一剔除。進行步驟如下：
5.1　根據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫poxB的核苷酸序列來合成以下引子： 順向引子21：
(5’-ATTAGAAGCTTGCAGGGGTGAAACGCATCTG)
反向引子22：
(5’-ATTAGACTAGTGGCTGGGTTGATATCAATC)
上述順向引子被設計含有限制酶HindIII之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有SpeI的切割位置(如底線所標示者)。以大腸桿菌BL21之染色體做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有poxB基因之片段(0.84 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素HindIII以及SpeI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；同時利用High-Speed Plasmid Mini kit純化質體pMCS-5(Mo Bi Tec,Germany)，以限制酵素HindIII以及SpeI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述二個DNA片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α中，而得到質體pMC-pox。再依據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫poxB的核苷酸序列來合成以下引子：
順向引子23：
(5’-ATTAGGAATTCGTGATTGCGGTGGCAATC)
反向引子24：
(5’-ATTAGGTCGACGGTACCAAACTGGCGCAACTGCTG)
上述順向引子被設計含有限制酶EcoRI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有SalI的切割位置(如底線所標示者)。以質體pMC-pox做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一段DNA片段(3.5 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素EcoRI以及SalI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；同時依據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫中質體pKD13(Datsenko K.A. and Wanner B. L.,2000,Proc. Natl. Aca. Sci. USA,97:6640-6645)的核苷酸序列來合成以下引子：
順向引子25：
(5’-TTAGGAATTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)
反向引子26：
(5’-ATTCCGGGGATCCGTCGACC)
上述順向引子被設計含有限制酶EcoRI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有SalI的切割位置(如底線所標示者)。以質體pKD13做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一段包含一個兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納黴素基因片段(1.3 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素EcoRI以及SalI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述二個DNA片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α中，而得到質體pMC-poxKm，質體圖譜如圖J所示。
圖J.　質體pMC-poxKm圖譜。符號簡寫說明：Ap，安培西林抗性基因；ColE1 origin，大腸桿菌ColE1複製源點；poxB-1，poxB基因之N端；poxB-2，poxB基因之C端；Km，康納黴素抗性基因；FRT，FRT位置。
以質體pMC-poxKm做為模板，使用順向引子21和反向引子22進行PCR反應，增幅出一段DNA(1.9 kb)，其兩端包含poxB基因N端及poxB基因C端的同源區域，而其中間部分則包含一個兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納黴素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化。接著，依照前述之”化學轉形法”，將協助型質體pKD46(Datsenko K.A. and Wanner B. L.,2000,Proc. Natl. Aca. Sci. USA,97:6640-6645)轉形入步驟4建構之菌株BL21e-RB中，得到菌株BL21e-RB/pKD46。依照前述之”電穿孔法”，準備菌株BL21e-RB/pKD46之勝任細胞，再利用電穿孔法將上述所得之線性DNA送入菌株BL21e-RB/pKD46中，隨後以SOC培養基於30℃下培養，同時加入1 mM阿拉伯糖進行誘導生產質體pKD46上的λ-Red基因，以幫助此增幅出來的線性DNA與染色體poxB基因進行同源重組(homologous recombination)，誘導二小時後，將培養溫度提升到42℃，經二小時後以離心機將細胞離心下來，移除上清液，將細胞塗灑在含有抗康納黴素的LB固態培養基上。隨意挑選生長於固態培養基的菌落，以順向引子21和反向引子22，使用前述之”原位PCR反應”來確認染色體基因poxB中所鑲箝的抗康納黴素基因，挑選出的菌株可增幅出截斷之poxB基因內鑲箝抗康納黴素基因的DNA片段。最後選擇其中一株菌株，根據前述之”抗抗生素基因移除法”來移除該菌株染色體上鑲箝的抗康納黴素基因，經溫度誘導協助型質體pCP20產生FLP蛋白質，經作用於兩個FRT位置後，將抗康納黴素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納黴素的LB固態培養基生長的菌株，同時以順向引子21和反向引子22，使用前述之”原位PCR反應”來確認抗康納黴素基因移除後所殘留的poxB基因片段(圖K，徑3)，獲得的菌株重新命名為BL-A1。
圖K.　DNA電泳圖。徑1：DNA標準物；徑2：截斷之poxB基因內鑲箝一個康納黴素抗性基因；徑3：康納黴素抗性基因移除後殘留的poxB基因片段。
5.2根據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫pta的核苷酸序列來合成以下引子： 順向引子27：
(5’-TGTCCAAGCTTATTATGCTGATCCCTACC)
反向引子28：
(5’-GTTCGACTAGTTTAGAAATGCGCGCGTC)
上述順向引子被設計含有限制酶HindIII之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有SpeI的切割位置(如底線所標示者)。以大腸桿菌BL21之染色體做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有pta基因之片段(0.95 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素HindIII以及SpeI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；同時利用High-Speed Plasmid Mini kit純化質體pMCS-5(Mo Bi Tec,Germany)，以限制酵素HindIII以及SpeI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述二個DNA片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α中，而得到質體pMC-pta。再依據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫pta的核苷酸序列來合成以下引子：
順向引子29：
(5’-ACGATGAATTCCATCAGCACATCTTTCTG)
反向引子30：
(5’-ACCGTGTCGACGGTACCTGATCGCGACTCGTGC)
上述順向引子被設計含有限制酶EcoRI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有SalI的切割位置(如底線所標示者)。以質體pMC-pta做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一段DNA片段(3.5 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素EcoRI以及SalI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；同時依據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫中質體pKD13(Datsenko K.A. and Wanner B. L.,2000,Proc. Natl. Aca. Sci. USA,97:6640-6645)的核苷酸序列來合成以下引子：
順向引子25：
(5’-TTAGGAATTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)
反向引子26：
(5’-ATTCCGGGGATCCGTCGACC)
上述順向引子被設計含有限制酶EcoRI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有SalI的切割位置(如底線所標示者)。以質體pKD13做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一段包含一個兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納黴素基因片段(1.3 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素EcoRI以及SalI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述二個DNA片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α中，而得到質體pMC-ptaKm，質體圖譜如圖L所示。
圖L.　質體pMC-ptaKm圖譜。符號簡寫說明：符號簡寫說明：Ap，安培西林抗性基因；ColE1 origin，大腸桿菌ColE1複製源點；pta-1，pta基因之N端；pta-2，pta基因之C端；Km，康納黴素抗性基因；FRT，FRT位置。
以質體pMC-ptaKm做為模板，使用順向引子29和反向引子30進行PCR反應，增幅出一段DNA(1.9 kb)，其兩端包含pta基因N端及C端的同源區域，而其中間部分則包含一個兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納黴素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化。接著，依照前述之”化學轉形法”，將協助型質體pKD46(Datsenko K.A. and Wanner B. L.,2000,Proc. Natl. Aca. Sci. USA,97:6640-6645)轉形入上述建構之菌株BL-A1中，得到菌株BL-A1/pKD46。依照前述之”電穿孔法”，準備菌株BL-A1/pKD46之勝任細胞，再利用電穿孔法將上述所得之線性DNA送入菌株BL-A1/pKD46中，隨後以SOC培養基於30℃下培養，同時加入1 mM阿拉伯糖進行誘導生產質體pKD46上的λ-Red基因，以幫助此增幅出來的線性DNA與染色體pta基因進行同源重組(homologous recombination)，誘導二小時後，將培養溫度提升到42℃，經二小時後以離心機將細胞離心下來，移除上清液，將細胞塗灑在含有抗康納黴素的LB固態培養基上。隨意挑選生長於固態培養基的菌落，以順向引子29和反向引子30，使用前述之”原位PCR反應”來確認染色體基因pta中所鑲箝的抗康納黴素基因，挑選出的菌株可增幅出截斷之poxB基因內鑲箝抗康納黴素基因的DNA片段。最後選擇其中一株菌株，根據前述之”抗抗生素基因移除法”來移除該菌株染色體上鑲箝的抗康納黴素基因，經溫度誘導協助型質體pCP20產生FLP蛋白質，經作用於兩個FRT位置後，將抗康納黴素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納黴素的LB固態培養基生長的菌株，同時以順向引子21和反向引子22，使用前述之”原位PCR反應”來確認抗康納黴素基因移除後所殘留的poxB基因片段(圖M徑3)，獲得的菌株重新命名為BL-A2。
圖M.　DNA電泳圖。徑1：DNA標準物；徑2：截斷之pta基因內鑲箝一個抗康納黴素抗性基因；徑3：康納黴素抗性基因移除後殘留的pta基因片段。
5.3　根據EcoCyc基因體資料庫中ldhA基因周遭的核苷酸序列來合成以下兩個引子： 順向引子31：
(5’-TCTTATGAAACTCGCCGTTTATAG)
反向引子32：
(5’-TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAG)
使用Wizard Genomic DNA purification kit(Promega Co.)來純化菌株CGSC 9216(E. coli Genetic Stock Center,USA)的染色體，以純化後的染色體為DNA模版(template)，使用上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一段DNA(2.8 kb)，其兩端包含ldhA基因N端及C端的同源區域，而其中間部分則包含一個兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納黴素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化。接著，依照前述之”化學轉形法”，將協助型質體pKD46(Datsenko K.A. and Wanner B. L.,2000,Proc. Natl. Aca. Sci. USA,97:6640-6645)轉形入上述建構之菌株BL-A2中，得到菌株BL-A2/pKD46。依照前述之”電穿孔法”，準備菌株BL-A2/pKD46之勝任細胞，再利用電穿孔法將上述所得之線性DNA送入菌株BL-A2/pKD46中，隨後以SOC培養基於30℃下培養，同時加入1 mM阿拉伯糖進行誘導生產質體pKD46上的λ-Red基因，以幫助此增幅出來的線性DNA與染色體ldhA基因進行同源重組(homologous recombniation)，誘導二小時後，將培養溫度提升到42℃，經二小時後以離心機將細胞離心下來，移除上清液，將細胞塗灑在含有抗康納黴素的LB固態培養基上。隨意挑選生長於固態培養基的菌落，完全依照步驟1的做法，以順向引子3和反向引子4，使用前述之”原位PCR反應”來確認染色體基因ldhA中所鑲箝的抗康納黴素基因。最後選擇其中一株菌株，根據前述之”抗抗生素基因移除法”來移除該菌株染色體上鑲箝的抗康納黴素基因，經溫度誘導協助型質體pCP20產生FLP蛋白質，經作用於兩個FRT位置後，將抗康納黴素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納黴素的LB固態培養基生長的菌株，重新命名為BL-A3。
5.4　根據EcoCyc基因體資料庫中frdA基因周遭的核苷酸序列來合成以下兩個引子： 順向引子33：
(5’-GAAAGTCGACGAATCCCGCCCAGG)
反向引子34：
(5’-CAAGAAAGCTTGTTGATAAGAAAGG)
使用Wizard Genomic DNA purification kit(Promega Co.)來純化菌株CGSC 10964(E. coli Genetic Stock Center,USA)的染色體，以純化後的染色體為DNA模版(template)，使用上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一段DNA(3.0 kb)，其兩端包含frdA基因N端及C端的同源區域，而其中間部分則包含一個兩端被FRT位置(sites)鑲夾的抗康納黴素基因，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化。接著，依照前述之”化學轉形法”，將協助型質體pKD46(Datsenko K.A. and Wanner B. L.,2000,Proc. Natl. Aca. Sci. USA,97:6640-6645)轉形入上述建構之菌株BL-A3中，得到菌株BL-A3/pKD46。依照前述之”電穿孔法”，準備菌株BL-A3/pKD46之勝任細胞，再利用電穿孔法將上述所得之線性DNA送入菌株BL-A3/pKD46中，隨後以SOC培養基於30℃下培養，同時加入1 mM阿拉伯糖進行誘導生產質體pKD46上的λ-Red基因，以幫助此增幅出來的線性DNA與染色體frdA基因進行同源重組(homologous recombination)，誘導二小時後，將培養溫度提升到42℃，經二小時後以離心機將細胞離心下來，移除上清液，將細胞塗灑在含有抗康納黴素的LB固態培養基上。隨意挑選生長於固態培養基的菌落，完全依照步驟1的做法，以順向引子3和反向引子4，使用前述之”原位PCR反應”來確認染色體基因ldhA中所鑲箝的抗康納黴素基因。最後選擇其中一株菌株，根據前述之”抗抗生素基因移除法”來移除該菌株染色體上鑲箝的抗康納黴素基因，經溫度誘導協助型質體pCP20產生FLP蛋白質，經作用於兩個FRT位置後，將抗康納黴素基因由菌株染色體上移除，選擇其中一株無法在含有抗康納黴素的LB固態培養基生長的菌株，重新命名為BL-A4。
實施例二：同時醱酵葡萄糖和木糖生產酒精
為了驗證本發明技術所建構的菌株之於葡萄糖和木糖同時醱酵的效能，在此以生產酒精為例，但本發明技術的運用範圍不以此例為限。根據前人研究(Ingram LO et al.,1987,Appl. Environ. Microbiol. 53:2420-2425)，將Zymomonas mobilis pdc、adhII基因引介至大腸桿菌中，可使得大腸桿菌具有生產酒精的能力。
(一)建構質體pND-pet
根據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫Zymomonas mobilis pdc的核苷酸序列來合成引子：
順向引子35：
(5’-TATACATATGAGTTATACTGTCGGTAC)
反向引子36：
(5’-CCATGGATCCTTATCCTCCTCCGAGGAGCTTG)
上述順向引子被設計含有限制酶NdeI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有BamHI的切割位置(如底線所標示者)。以Zymomonas mobilis之染色體做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有pdc基因之片段(1.7 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素NdeI以及BamHI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；另一方面，根據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫Zymomonas mobilis adhII的核苷酸序列來合成引子：
順向引子37：
(5’-ATgTGGATCCAggATATAgCTATGGCTTCTTCAACTTTTTATATTC)
反向引子38：
(5’-AGGACTCGAGTTAGAAAGCGCTCAGGAAGAG)
上述順向引子被設計含有限制酶BamHI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有XhoI的切割位置(如底線所標示者)。以Zymomonas mobilis之染色體做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有adhII基因之片段(1.15kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素BamHI以及XhoI切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；同時利用High-Speed Plasmid Mini kit純化質體pND707(Love CA et al.,1996,Gene,176:49-53)，以限制酵素NdeI以及XhoI切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述三個DNA片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α中，而得到質體pND-pet，質體圖譜如圖N所示。
圖N.　質體pND-pet圖譜。符號簡寫說明：bla，安培西林抗性基因；CI857，抑制子；lambda PR，PR啟動子；lambda PL，PL啟動子。
依照前述之”化學轉形法”，將質體pND-pet逐一轉形入原生型菌株BL21、實施例一中步驟1建構的菌株BL-G、實施例一中步驟2建構的菌株BL-Gf、實施例一中步驟4建構的菌株BL21e-RB、及實施例一中步驟5.4建構的菌株BL-A4中，而依序獲得重組菌株BL21/pND-pet、BL-G/pND-pet、BL-Gf/pND-pet、BL21e-RB/pND-pet、BL-A4/pND-pet。
(二)葡萄糖和木糖醱酵生產酒精
從固態培養基中分別選取重組菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet單一菌落，各培養於含有安培西林抗生素之LB培養液(5 mL)的搖瓶中，以30℃、200 rpm培養隔夜後，接種至含有安培西林抗生素的新鮮LB外加3%葡萄糖與3%木糖培養液(25 mL)中，使得搖瓶中的初始細胞密度達到OD550=2.0，接著於37℃、150 rpm下進行繼代培養，隨著醱酵時間取樣分析，其中葡萄糖、木糖和酒精濃度則依據”一般實驗方法”來測量。醱酵結果如圖9(A)所示，菌株BL21/pND-pet可快速代謝葡萄糖，卻完全無法消耗木糖，當醱酵時間結束後，生產的酒精達1.7%(圖9(B))；相對的是，當大腸桿菌的ptsG基因被剔除時(即重組菌株BL-G/pND-pet)，菌株BL-G/pND-pet可以同時消耗葡萄糖及木糖，不過木糖和葡萄糖的消耗速率皆緩慢(圖O)，當醱酵時間結束後，則可生產2.2%酒精(圖P)。
圖O.　重組菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet之混合糖消耗曲線。符號：(●)菌株BL21/pND-pet之葡萄糖消耗；(○)菌株BL21/pND-pet之木糖消耗；(■)菌株BL-G/pND-pet之葡萄糖消耗；(□)菌株BL-G/pND-pet之木糖消耗。
圖P.　重組菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet醱酵混合糖生產酒精曲線。符號：符號：(●)菌株BL21/pND-pet；(■)菌株BL-G/pND-pet。
依照上述的搖瓶培養方法，以含有3%葡萄糖與3%木糖的LB培養液培養重組菌株BL-Gf/pND-pet和BL21e-RB/pND-pet，並隨著醱酵時間取樣分析，其中葡萄糖、木糖和酒精濃度則依據”一般實驗方法”來測量。醱酵結果如圖Q所示：
圖Q.　重組菌株BL-Gf/pND-pet和BL21e-RB/pND-pet之混合糖消耗曲線。符號：(●)菌株BL-Gf/pND-pet之葡萄糖消耗；(○)菌株BL-Gf/pND-pet之木糖消耗；(■)菌株BL21e-RB/pND-pet之葡萄糖消耗；(□)菌株BL21e-RB/pND-pet之木糖消耗。
當Zymomonas mobilis的葡萄糖促進基因(glucose facilitator gene)glf引介到大腸桿菌中(即菌株BL-Gf/pND-pet)，即可弭補菌株缺乏ptsG基因而導致葡萄糖代謝緩慢的問題，可於14小時內將3%葡萄糖消耗完畢，而於醱酵時間結束後，則只能消耗掉1.8%的木糖，生產的酒精達2.3%(圖R)。此外，進一步加強菌株五碳糖磷酸代謝路徑中的rpiA、tktA、rpe和talB(即菌株BL21e-RB/pND-pet)，其葡萄糖的消耗速率大致與菌株BL-Gf/pND-pet相同，然其木糖消耗速率則增快，當醱酵時間結束後，可以消耗2.3%的木糖，並能生產2.7%酒精(圖R)。
圖R.　重組菌株BL21/pND-pet和BL-G/pND-pet醱酵混合糖生產酒精曲線。符號：符號：(●)菌株BL21/pND-pet；(■)菌株BL-G/pND-pet。
最後，依照上述的搖瓶培養方法，以含有3%葡萄糖與3%木糖的LB培養液培養重組菌株BL-A4/pND-pet，並隨著醱酵時間取樣分析，其中葡萄糖、木糖和酒精濃度則依據”一般實驗方法”來測量。醱酵結果如圖S所示，進一步將大腸桿菌中產生其他有機酸的基因如ldhA、poxB、pta、frdA基因剃除(即菌株BL-A4/pND-pet)後，重組菌株可以十分快速的同時代謝葡萄糖和木糖，並在12小時內將3%葡萄糖消耗完畢，在17小時內將3%木糖消耗完畢；另如圖T所示，當醱酵時間結束後，生產的酒精達2.9%，轉化率高達98%以上。以生產酒精為例，這個結果顯示，基於本發明技術來基因改質的菌株(即菌株BL-A4)，具有同時且快速代謝葡萄糖與木糖的能力。
圖S.　重組菌株BL-A4/pND-pet之混合糖消耗曲線。符號：(●)葡萄糖消耗；(○)木糖消耗。
圖T.　重組菌株BL-A4/pND-pet醱酵混合糖生產酒精曲線。
實施例三：同時醱酵葡萄糖和木糖生產乳酸
為了驗證本發明技術所建構的菌株之於葡萄糖和木糖同時醱酵的效能，在此另以生產乳酸為例，但本發明技術的運用範圍不侷限於此例。
(一)建構質體pTrc-H/D-Ldh
根據美國國家生物科技資訊中心(NCBI)基因體資料庫大腸桿菌ldhA基因的核苷酸序列來合成引子：
順向引子39：
(5’-AGCTCCATGGAACTCGCCGTTTATAGCAC)
反向引子40：
(5’-AGCGAAGCTTAAACCAGTTCGTTCGGGCAG)
上述順向引子被設計含有限制酶NcoI之切割位置(如底線所標示者)，而反向引子設計含有HindIII的切割位置(如底線所標示者)。以大腸桿菌BL21之染色體做為模板，並以上述兩個引子進行PCR反應，增幅出一含有ldhA基因之片段(1 kb)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將增幅之基因片段進行純化後，用限制酵素NcoI以及HindIII切割，再使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收；另一方面，利用High-Speed Plasmid Mini kit純化質體pTrc99A(National Institute of Genetics,Japan)，以限制酵素NcoI以及HindIII切割，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit將酵素切割過的DNA片段回收。接著利用T4黏合酶(T4 ligase)將上述二個DNA片段黏合後，依照前述”一般實驗方法”，將DNA黏合產物轉形入大腸桿菌菌株DH5α中，而得到質體pTrc-H/D-Ldh，質體圖譜如圖U所示。接著依照前述之”化學轉形法”，將質體pTrc-H/D-Ldh轉形入實施例一中步驟5.4建構的菌株BL-A4中，而得到菌株BL-A4/pTrc-H/D-Ldh。
圖U.　質體pTrc-H/D-ldh圖譜。符號簡寫說明：bla，安培西林抗性基因；pMB1 ori，大腸桿菌pMB1複製源點；lacIQ，抑制子lacI；trc promoter，trc啟動子。
(二)葡萄糖和木糖醱酵生產乳酸
從固態培養基中分別選取重組菌株BL-A4/pTrc-H/D-Ldh單一菌落，培養於含有安培西林抗生素之LB培養液(5 mL)的搖瓶中，以37℃、200 rpm培養隔夜後，接種至含有安培西林抗生素的新鮮LB外加1%葡萄糖與1%木糖培養液(25 mL)中，使得搖瓶中的初始細胞密度達到OD550=0.1，接著於37℃、150 rpm下進行繼代培養，待細胞密度達到OD550=0.3時，加入300 μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)誘導質體pTrc-H/D-Ldh的ldhA基因生產，隨著醱酵時間取樣分析，其中葡萄糖、木糖、乳酸和有機酸濃度則依據”一般實驗方法”來測量。醱酵結果如圖V所示，菌株BL-A4/pTrc-H/D-Ldh可同時代謝葡萄糖和木糖，而生產的乳酸亦隨醱酵時間逐漸累積增加，當醱酵48小時後，可生產約160 mM乳酸，幾乎無其他有機酸的生成。以生產乳酸為例，這個結果顯示，基於本發明技術來基因改質的菌株(即菌株BL-A4)，具有同時且快速代謝葡萄糖與木糖的能力。
圖V.　BL-A4/pTrc-H/D-Ldh之混合糖　醱酵生產乳酸曲線。符號：(●)葡萄糖消耗；(▽)木糖消耗；()乳酸。
圖1為本發明之一種實施方式的流程圖。
圖2為本發明之另一實施方式的流程圖。

Claims (28)

  1. 一種使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，包含下列步驟：A.　剔除一目標微生物中的一葡萄醣輸送酶基因序列；B.　引入一葡萄醣促進基因序列至該目標微生物中；C.　在該目標微生物的至少一五碳醣代謝基因序列上游引入至少一啟動子；以及D.　剔除該目標微生物中的至少一有機酸代謝基因序列。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟A所述之該目標微生物可以是一大腸桿菌(Escherichia coli)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟A所述之該葡萄醣輸送酶基因序列可以是一ptsG基因序列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟B所述之該葡萄醣促進基因序列可以是Zymomonas mobilis的glf(glucosefacilitator gene)基因序列。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟C所述之該至少一五碳醣代謝基因可以是一rpiA、一tktA、一rpe、一talB、或其組合之基因序列。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟D所述之該至少一有機酸代謝基因可以是一ldhA、一pta、一poxB、一frdA、或其組合之基因序列。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟B可以是將該葡萄醣促進基因序列鑲嵌入該目標微生物的染色體上。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中係該葡萄醣促進基因序列植入(incorporate)一個質體中，形成一第一重組型質體，再將該第一重組型質體轉形(transform)至該目標微生物中表現。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中係將該大腸桿菌的該rpiA基因序列植入(incorporate)一個質體中，形成一第二重組型質體，再將該第二重組型質體轉形(transform)至該目標微生物中表現。
  10. 如申請專利範圍第5項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中係將該大腸桿菌的該tktA基因序列植入(incorporate)一個質體中，形成一第三重組型質體，再將該第三重組型質體轉形(transform)至該目標微生物中表現。
  11. 如申請專利範圍第5項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中係將該大腸桿菌的該rpe基因序列植入(incorporate)一個質體中，形成一第四重組型質體，再將該第四重組型質體轉形(transform)至該目標微生物中表現。
  12. 如申請專利範圍第5項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中係將該大腸桿菌的該ta1B基因序列植入(incorporate)一個質體中，形成一第五重組型質體，再將該第五重組型質體轉形(transform)至該目標微生物中表現。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中進一步包含以下步驟：E.　引入可產生一目標產物的基因序列至該目標微生物中，使該目標微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣以產生該目標產物。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中該目標產物可以是醇類、有機酸、雙醣、氫氣、酮類、烷類、或其組合。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟C所述之該至少一啟動子可以是一λPRPL啟動子。
  16. 一種使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，包含下列步驟：A.　剔除一目標微生物中的一ptsG基因序列；B.　引入一glf基因序列至該目標微生物中；C.　在該目標微生物的一rpe與一tktA基因序列上游引入一第一啟動子；D.　在該目標微生物的一rpiA與一talB基因序列上游引入一第二啟動子；E.　剔除該目標微生物中的一1dhA基因序列；F.　剔除該目標微生物中的一pta基因序列；G.　剔除該目標微生物中的一poxB基因序列；以及H.　剔除該目標微生物中的一frdA基因序列。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中該目標微生物可以是一大腸桿菌(Escherichia coli)。
  18. 如申請專利範圍第16項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中所述之五碳醣可以是木醣，所述之六碳醣可以是葡萄糖。
  19. 如申請專利範圍第16項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟C與步驟D所述之該第一啟動子與該第二啟動子可以為一λPRPL啟動子。
  20. 如申請專利範圍第16項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟B中該glf基因序列可以是Zymomonas mobilis的glf基因序列。
  21. 如申請專利範圍第16項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中可以是將Zymomonas mobilis的該glf基因序列鑲嵌入該目標微生物的染色體上。
  22. 如申請專利範圍第16項或第21項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中係將Zymomonas mobilis的該glf基因序列植入(incorporate)一個質體中，形成一第一重組型質體，再將該第一重組型質體轉形(transform)至該目標微生物中表現。
  23. 如申請專利範圍第16項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟D係將該大腸桿菌的該rpiA基因序列植入(incorporate)一個質體中，形成一第二重組型質體，，再將該第二重組型質體轉形(transform)至該目標微生物中表現。
  24. 如申請專利範圍第16項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟C係將該大腸桿菌的該tktA基因序列植入(incorporate)一個質體中，形成一第三重組型質體，再將該第三重組型質體轉形(transform)至該目標微生物中表現。
  25. 如申請專利範圍第16項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟C係將該大腸桿菌的該rpe基因序列植入(incorporate)一個質體中，形成一第四重組型質體，再將該第四重組型質體轉形(transform)至該目標微生物中表現。
  26. 如申請專利範圍第16項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟D係將該大腸桿菌的該ta1B基因序列植入(incorporate)一個質體中，形成一第五重組型質體，再將該第五重組型質體轉形(transform)至該目標微生物中表現。
  27. 如申請專利範圍第16項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中進一步包含以下步驟：I.　引入可產生一目標產物的基因序列至該目標微生物中，使該目標微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣以產生該目標產物。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法，其中步驟I的該目標產物可以是醇類、有機酸、雙醣、氫氣、酮類、烷類、或其組合。
TW100146856A 2011-12-16 2011-12-16 一種使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法 TWI432574B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW100146856A TWI432574B (zh) 2011-12-16 2011-12-16 一種使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法
CN201110448728.7A CN103160544B (zh) 2011-12-16 2011-12-28 一种使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法
CN201410616186.3A CN104403983A (zh) 2011-12-16 2011-12-28 一种使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法
US13/656,654 US20130157319A1 (en) 2011-12-16 2012-10-19 Method for Simultaneous Fermentation of Pentose and Hexose

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW100146856A TWI432574B (zh) 2011-12-16 2011-12-16 一種使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201326392A true TW201326392A (zh) 2013-07-01
TWI432574B TWI432574B (zh) 2014-04-01

Family

ID=48584078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100146856A TWI432574B (zh) 2011-12-16 2011-12-16 一種使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20130157319A1 (zh)
CN (2) CN103160544B (zh)
TW (1) TWI432574B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10301653B2 (en) * 2015-07-06 2019-05-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Microorganisms that co-consume glucose with non-glucose carbohydrates and methods of use
CN105062938A (zh) * 2015-07-17 2015-11-18 湖北工业大学 一种可同步利用五碳糖和六碳糖发酵产d-乳酸的工程菌及其构建和应用
CN113278567A (zh) * 2020-02-20 2021-08-20 杭州立丞生物科技有限公司 可改善菌株以提升生产重组蛋白质的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4568644A (en) * 1981-12-10 1986-02-04 Massachusetts Institute Of Technology Fermentation method producing ethanol
EP0688364A4 (en) * 1993-03-09 1997-10-15 Abbott Lab ENZYMES PRODUCED BY GENETIC ENGINEERING AND CONJUGATES OF SAID ENZYMES FOR DIAGNOSTIC ANALYSIS
CN101429488A (zh) * 2007-11-08 2009-05-13 中国农业科学院生物技术研究所 大肠杆菌乙醇发酵工程菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103160544A (zh) 2013-06-19
US20130157319A1 (en) 2013-06-20
TWI432574B (zh) 2014-04-01
CN104403983A (zh) 2015-03-11
CN103160544B (zh) 2015-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5346808B2 (ja) エタノール産生のためのキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のキシリトール合成変異体
JP5185940B2 (ja) キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のキシリトール合成変異体を使用するエタノール産生
JP5232156B2 (ja) 糖アルコールの存在下でキシロースを含有する混合糖類の発酵における改善されたエタノール産生
US5514583A (en) Recombinant zymomonas for pentose fermentation
Yomano et al. Deletion of methylglyoxal synthase gene (mgsA) increased sugar co-metabolism in ethanol-producing Escherichia coli
CN101970671B (zh) 在包含浓缩糖和乙酸盐的培养基中具有改进的乙醇产量的发酵单胞菌属
US20080090283A1 (en) Ethanol resistant and furfural resistant strains of E. coli FBR5 for production of ethanol from cellulosic biomass
US9803221B2 (en) Engineering microorganisms to increase ethanol production by metabolic redirection
US20090286294A1 (en) Methods and Compositions for Improving the Production of Fuels in Microorganisms
JP2013545491A (ja) バイオマス加水分解物培地中でのキシロース資化性ザイモモナス・モビリスによるエタノール産生の向上
CN110358720B (zh) 一种生产异丁醇的运动发酵单胞菌重组菌株、构建方法及其应用
Xia et al. Contribution of cellulose synthesis, formation of fibrils and their entanglement to the self‐flocculation of Zymomonas mobilis
NZ571490A (en) Enhancement of microbial ethanol production
Panahi et al. Engineered bacteria for valorizing lignocellulosic biomass into bioethanol
CA2500741C (en) Glucose transport mutants for production of biomaterial
TWI432574B (zh) 一種使微生物可同時醱酵五碳醣與六碳醣的方法
US20240093247A1 (en) Genetically engineered strain of zymomonas mobilis and uses thereof
US20180245034A1 (en) Biomass with bioengineered microorganism such as yeast, associated organic compounds, and related methods
US8563283B2 (en) Strains of Escherichia coli modified by metabolic engineering to produce chemical compounds from hydrolyzed lignocellulose, pentoses, hexoses and other carbon sources
CN115851569A (zh) 利用非粮生物质联产乳酸和乙醇的运动发酵单胞菌及应用
CN111979167B (zh) 一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用
DE102021101004B3 (de) Verfahren zur Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat oder L-Threonin unter Nutzung eines mikrobiellen Stoffwechselweges
KR101543845B1 (ko) L-갈락토스 대사능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 l-갈락토스를 함유하는 바이오매스로부터 바이오에탄올을 제조하는 방법
KR102253701B1 (ko) 하이브리드형 해당 경로
Inohara et al. A First Marine Vibrio Biocatalyst to Produce Ethanol from Alginate, which is a Rich Polysaccharide in Brown Macroalgal Biomass

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees