KR20100071769A

KR20100071769A - ＬＰｃｉｎ－Ⅰ펩타이드 또는 ＬＰｃｉｎ－Ⅱ 펩타이드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 펩타이드의 대량생산방법

Info

Publication number: KR20100071769A
Application number: KR1020080130593A
Authority: KR
Inventors: 김용애; 박태준; 최성섭; 김지선
Original assignee: 한국외국어대학교 연구산학협력단
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2010-06-29
Also published as: KR101081814B1

Abstract

LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 펩타이드의 대량생산방법이 제공된다.

이를 통해, 종래에 경제성이 없어 항균제로 활용할 수 없었던 LPcin-Ⅰ펩타이드를 항균제로 상용화하는 것이 가능하다.

나아가, LPcin-Ⅰ펩타이드 및 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 대량으로 수득할 수 있으므로, 미세량만으로는 수행할 수 없었던, 상기 펩타이드들의 3차원 구조를 규명하는데 대단히 유용하다. 이를 통해 LPcin-Ⅰ펩타이드의 아미노산 서열이 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는데도 불구하고 LPcin-Ⅰ펩타이드만이 항균성을 가지는 이유를 NMR 등을 통해 3차원적으로 규명하여 향후 LPcin-Ⅰ펩타이드의 필수 아미노산 서열을 도출하는데 중요한 역할을 담당할 수 있다.

LPcin-Ⅰ펩타이드, LPcin-Ⅱ 펩타이드, 대량생산방법

Description

ＬＰｃｉｎ－Ⅰ펩타이드 또는 ＬＰｃｉｎ－Ⅱ 펩타이드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 펩타이드의 대량생산방법{Recombination expression vector comprising LPcin-Ⅰ or LPcin-Ⅱ peptide and mass-production method of peptide thereof}

본 발명은 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 펩타이드의 대량생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 과발현시킬 수 있는 재조합 발현벡터를 및 이를 이용하여 실제로 펩타이드를 대량생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

생명체에서 분리 동정된 항균 펩타이드에는 시스테인 결합을 갖는 defensins류, 양이온성 선형 나선 구조를 가진 dermicidins 및 cathelicidins, 아미노산 히스티딘을 많이 함유하는 histatins 등이 알려져 있다. 이러한 인간 유래 항균성 펩타이드를 상업적으로 이용할 경우에는 여러가지의 문제점이 있는데 통상적인 방법으로는 저가로 항균성 펩타이드를 생산할 수 없다. 즉 유기 화학적인 합성 방법으로는 대량 생산이 불가능하고, 유전자 조작에 의한 재조합 미생물은 발현된 항균균 펩타이드가 미생물의 성장 장애을 촉발한다. 이러한 점에서 항균 펩타이드의 대량 생산은 유전자 조작 방법 및 항균 펩타이드의 구조적인 특성을 이용한 방법의 개발이 매우 중요하다.

이제까지 발견된 항균 펩타이드는 양극성의 α-헬릭스 구조 및 이황화 결합(intradisulfide bond)으로 안정된 구조를 형성하고 있는 β-시트 구조를 지닌 것들로 크게 구분될 수 있다. 시스테인(cysteine) 잔기를 갖는 항균 펩타이드는 보통 2 내지 8개의 짝수개 시스테인 잔기를 가지며, 이들이 분자내 이황화 결합(disulfide bond)을 형성함으로써 구조를 안정화시키는 경우가 대부분이다.

한편, 항균 펩타이드의 작용기전과 선택성은 세균의 막과 상호 작용하는 방식에 따라 달라진다. 일반적으로 펩타이드는 그람(Gram) 음성 박테리아 표면상의 LPS (lipopolysaccharide)와 작용하여 자가 유도된 수득 과정(selfpromoted uptake pathway)을 통해 받아들여진다. 이 과정의 첫 단계는 펩타이드가 세포 표면의 LPS에 존재하는 2가 양이온의 결합부위에 작용하는 것이며, 두 번째 단계는 세포막으로 삽입되어 채널(channel)을 형성하는 것이다.

첫 번째 단계에서, 펩타이드는 Mn² ⁺나 Mg² ⁺같은 2가 이온보다 적어도 3배 이상 높은 친화력으로 LPS에 결합할 수 있기 때문에, 경쟁적으로 2가 이온들을 대체할 수 있으므로 외막의 정상적인 세포막의 특성을 무너지게 한다. 상기와 같은 방법으로 영향을 받은 세균막은 일시적으로 틈새를 만들게 되어 소수성 물질, 작은 단백질 혹은 항생제들이 통과하게 되며(Piers, K.L. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1994, 38, 2311-2316), 특히 펩타이드 자체를 받아들이는 효과가 증대 된다.

두 번째 단계에서, 펩타이드가 세포막에 삽입되어 채널을 형성하는 과정에 있어서 양이온 펩타이드 자기가 음전하의 세균막과 작용하게 되면 그 다음 작용으로 소수성 부위는 막쪽으로 향하고, 친수성 부위는 채널을 형성하기 위해 안쪽으로 향하게 된다(Hancock, R.E. et al., Adv. Microbial Physiol., 1995, 37, 135-175). 이때 막 전위차가 클 때, 음전하 지질의 양이 많을 때 및 콜레스테롤의 양이 적을수록 채널이 잘 형성되며, 막 구조가 무너져서 세균이 죽게 된다(Falla, T. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 19298-19303). 이에 반해 많은 양의 콜레스테롤과 약간의 음이온 지질을 갖고 있는 진핵 세포의 경우에는 펩타이드가 효과적으로 작용을 하지 못하게 되어 박테리아에 대한 높은 선택적 활성을 갖게 된다.

이러한 원리를 이용하여 구체적으로 종래 항균성 펩타이드를 대량 생산하기 위하여 시도된 여러가지 방법 중 결합 단백질 및 그 발현 방법을 언급한 논문 및 특허에서 살펴보면, 인슈린의 전구체를 베타 갈락 토시데이져에 연결하여 박테리아에서 발현 (Shen,Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 281, 4627 (1984)), 여러 개의 신경 펩타이드 물질 P 와 베타 갈락토시데이져에 연결하여 박테리아에서 발현 (Kempe et al., Gene, 39, 239 (1985)), 알파 인간 atrial natriuretic 펩타이드의 8개를 반복하여 불용성 재조합 융합단백질로써 박테리아에서 발현 (Lennick et al., Gene, 61, 103 (1987)), 클로로람페니콜 아세틸트란스페라제를 이용한 발현 (Dykes et al., Eur. J. Biochem., 174, 411 (1988)), 연어 칼시토닌 및 구루타사이온-S-트란스페라제 를 이용한 발현 (Ray et al., Bio/Technology, 11, 64 (1993)), 인간 디펜신 1 를 구루타사이온-5-트란스페라제에 결합한 발현 (Hancock et al., W094/04688 (PCT/CA93/00342) and Piers et al. (Hancock), Gene, 134, 7 (1993)), 세크로핀 펩타이드를 L-ribulokinase 에 결합한 발현 (Laiet al., USP5,206,154 and Callaway, Lai et al. Antimicrob. Agents & Chemo., 37:1614 (1993)), 인간 파라타이로드 홀몬 펩타이드를 박테리오 파이지 gp55 단백질 에 결합한 발현 (Gramm et al., Bio/Technology, 12:1017 (1994)), 뷰포린 항생 펩타이드를 시스테인 결합을가지는 산성 단백질에 결합한 발현 (Lee, J. et al., Protein Expr. Purif. 12:53-60 (1998), USP 6,183,992), 펩타이드를 유비퀴틴에 결합한 발현 (Pilon et al., Biotechnol. Prog., 13, 374-379 (1997)), 항균성 펩타이드 P2 와 소유래 프로카모신에 연결한 발현 (Haught et al., Biotechnol. Bioengineer., 57, 55-61 (1998)) 등이 있다.

한편, 프로테오즈-펩톤은 열에 안정하고 우유에 산-용해성 단백질 부분이고 중요한 기능적 특성을 갖는다. PP3 또는 락토포린(lactoporin, LP)라 불려지는 프로테오즈 펩톤의 3번째 구성성분은 인산화된 당 단백질로써 가장 소수성을 갖는 부분이다. PP3는 프로테오즈-펩톤의 소의 모유의 물리 화학적 특성과 그들의 중요한 생물학적 기능에 대해서 가장 큰 영향력을 갖는다. PP3와 유사한 단백질은 낙타, 라마, 양, 염소 등과 같은 다른 종의 모유에서 특성화되었다. 그러나 PP3는 인간의 모유에서는 발견되지 않았다. 구조적으로 PP3는 적어도 다른 두 개의 N-말단과 C-말단의 도메인을 포함하고 있다. 게다가, N-말단 도메인 (1에서 97번째 잔기)은 대게 음전하를 띄고 몇 개의 post-transductional site를 갖는 반면에 C-말단 도메인 (98에서 135번째 잔기)는 양전하를 띈다.

락토포리신(LPcin-I)은 23개의 아미노산 잔기를 갖는 양친매성(amphipathic) 펩타이드이고, PP3의 카르복시 말단 113에서 135번 아미노산 잔기를 가진다. LPcin-I은 그람(+)와 그람(음성) 박테리아의 성장을 억제하나 200mM 이하의 농도에서는 용혈 작용을 보이지 않는다. 반면에 PP3의 119에서 135번 영역의 아미노산 잔기와 일치하는 LPcin-Ⅱ는 항균 활성을 갖지 않는다. 이는 LPcin-I과 LPcin-Ⅱ가 유사한 전하비와 나선패턴(helical wheel pattern)을 기반으로 한 소수성/친수성 부분이 같다는 점을 볼 때 매우 이례적인 결과이다. 게다가 두 펩타이드 모두 양이온성을 보이고 인산지방질과 상호작용을 갖는다. 그러므로 양 펩타이드는 그 단백질의 3차원적 구조가 유사할 것으로 예상된다. 그럼에도 불구하고 오직 LPcin-I만이 평면의 지방질 이분자층에 침투하여, 상술한 형균제 메커니즘 중 전위 의존성 채널을 형성한다.

결국, LPcin-I 펩타이드와 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 구조적인 차이점을 밝혀내고 항균성이 우수한 LPcin-I 펩타이드를 상용화하기 위해서는 LPcin-I 펩타이드와 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 그람단위로 대량으로 생산할 수 있어야 한다. 그러나 LPcin-I 펩타이드와 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 대량으로 생산할 수 있는 방법은 아직 개시되어 있지 않다.

본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 대량생산하기에 적합한 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두번째 과제는 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 E.coli를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 세번째 과제는 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 E.coli를 배양하고 적절하게 처리하여 Pcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 L당 20㎎ 이상 수득할 수 있는 대량생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫번째 과제를 달성하기 위해서,

a) 혼성 파트너 결합단백질을 코딩하는 유전자 b) 서열번호 1, 2 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅰ펩타이드를 코딩하는 유전자 또는 서열번호 3, 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 코딩하는 유전자가 작동적으로 결합된 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 혼성 파트너 결합단백질은 케토스테로이드 이성질체화효소(KSI)이고, 상기 발현벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 pET31b일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 발현 카세트는 N-말단 또 는 C-말단에 5-7개의 히스티딘 아미노산을 코딩하는 유전자가 연결될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드는 1 ~ 8회 반복될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 두번째 과제를 달성하기 위해서,

상술한 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 세번째 과제를 달성하기 위해서,

1) 상술한 본 발명의 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환하는 단계, 2) 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질을 과발현시키는 단계, 3) 상기 발현된 융합 단백질을 용해하여 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)로 상기 대장균으로부터 회수하는 단계, 4) 상기 불용성 재조합 융합단백질을 Ni-친화성 크로마토그래피로 정제하는 단계, 5) 상기 정제된 불용성 재조합 융합단백질을 산성조건에서 CNBr로 절단하는 단계, 및 6) 상기 절단된 불용성 재조합 융합단백질을 역상(reversed phase) HPLC를 수행하여 LPcin-펩타이드 또는 LPcin- 펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다.

이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.

별도로 설명되어 있지 않다면, 용어 '핵산(nucleic acid)'은 단일- 또는 이중나선 형태에서 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 가리키고, 자연 발생하는 뉴클레오타이드와 비슷한 방식에서 핵산과 결합하는 본래 뉴클레오

타이드의 알려진 유사체들을 포함하며, 특별한 언급이 없는 한, 특정 핵산 서열은 그들의 상보적 서열을 포함한다.

'작동적으로 결합된(operatively linked to)'은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열(예컨대, KSI-L)사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.

세포와 관련하여 사용되는 용어 '재조합(recombinant)'은 세포가 이형의 핵산을 복제하거나 이형의 핵산에 의해 코드화되는 펩타이드 또는 단백질을 발현하는 것을 가리킨다. 또한 재조합 세포는 세포의 본래 형태에서 발견되는 유전자를 발현시킬 수 있으나, 변형된 유전자가 인공적인 방법에 의해 세포로 재도입 되어지기도 한다.

'프로모터'는 원하는 단백질의 유전자가 상기 프로모터의 다운스트림에 융합되었을 때 식물 세포에서 단백질의 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 의미한다. 또한 본 발명의 프로모터는 다른 전사-번역 활성 서열에 결합하여 더욱 변형될 수 있다.

'발현 카세트(expression cassette)'는 그러한 서열에 적합한 호스트에서 구조 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 핵산 요소를 지닌 발생되거나 합성적으로 된 핵산 구조물이다. 발현 카세트는 적어도 프로모터들을 선택적으로 전사 종결 시그널을 포함한다. 일반적으로, 발현 카세트는 전사되는 핵산과 프로모터를 포함한다. 또한 발현에 영향을 주는 추가 요소들로는 여기에 기술된 것과 같이 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 또한 호스트 세포로부터 발현된 단백질의 분비를 지시하는 시그널 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 구조 물을 구성하는 변형된 세포를 선택하기 위해, 선택 마커 유전자를 발현 카세트에 편리하게 포함될 수 있으며, 당업자는 상기 이 벡터 성분이 그것의 기능에 실질적인 영향 없이 변형될 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 발현벡터는 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 대량생산하기에 가장 적합한 발현 카세트를 포함하고 있어, 이를 대장균에 형질전환한 뒤 본 발명의 대량생산방법을 통해 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 정제하는 경우 L당 20 ~ 30㎎ 이상의 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 생산할 수 있다.

따라서, 대량생산을 통해 경제성을 가지므로 종래에 경제성이 없어 항균제로 활용할 수 없었던 LPcin-Ⅰ펩타이드를 항균제로 상용화하는 것이 가능하다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 a) 혼성 파트너 결합단백질을 코딩하는 유전자 및 b) 서열번호 1, 2 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅰ펩타이드를 코딩하는 유전자 또는 서열번호 3, 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 코딩하는 유전자가 작동적으로 결합된 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현벡터을 제공하는 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같이, LPcin-Ⅰ펩타이드는 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 아미노산 서열부분을 전부 포함하고 있고, 비슷한 전하비 및 나선패턴(helical wheel pattern)을 기반으로 한 소수성/친수성 부분이 같으므로 유사한 항균활성 및 3차원 구조를 가질 것으로 예상된다. 하지만, 실제 항균활성에 있어서, LPcin-Ⅰ펩타이드는 우수한 항균활성을 가지는 반면, LPcin-Ⅱ 펩타이드는 항균활성을 가지지 못한다. 결국, LPcin-I 펩타이드와 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 구조적인 차이점을 밝혀내고 항균성이 우수한 LPcin-I 펩타이드를 상용화하기 위해서는 LPcin-I 펩타이드와 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 그람단위로 대량으로 생산할 수 있어야 한다. 그러나 LPcin-I 펩타이드와 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 대량으로 생산할 수 있는 방법은 아직 개시되어 있지 않다.

이에 본 발명에서는 LPcin-I 펩타이드와 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 대량으로 생산할 수 있는 재조합 발현벡터를 제작하였다. 본 발명의 재조합 발현벡터를 대장균에 형질전환한 뒤 본 발명의 대량생산방법을 통해 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 정제하는 경우 L당 20 ~ 30㎎ 이상의 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 생산할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 발현벡터는 a) 혼성 파트너 결합단백질을 코딩하는 유전자 및 b) 서열번호 1, 2 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅰ펩타이드를 코딩하는 유전자 또는 서열번호 3, 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 코딩하는 유전자가 작동적으로 결합된 발현 카세트를 포함하며, 이를 도 1의 개열지도를 참조하여 설명한다.

먼저, 본 발명의 재조합 발현벡터는 포함된 발현 카세트의 내부에 a) 혼성 파트너 결합단백질을 코딩하는 유전자를 필수적으로 포함한다. 혼성 파트너 결합단백질은 LPcin-Ⅰ 펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드와 결합하여 과발현을 유도하나 실제 항균활성에 기여하지는 않으나 LPcin-Ⅰ 펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 활성을 저해하여 숙주세포가 정상적으로 생장할 수 있는 역할을 수행하는 것으로 본 발명의 LPcin-Ⅰ 펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 대량으로 발현시키기 위해서는 반드시 필요하며 상기 혼성 파트너 결합단백질이 본 발명의 발현 카세트에 포함되지 않는 경우 세포독성으로 인하여 숙주세포가 자라지 못하여 융합단백질의 발현이 거의 불가능하다. 결국 본 발명의 혼성 파트너 결합단백질은 융합단백질을 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion bodies)의 형태로 발현시키므로 세포독성을 최소화하여 LPcin-Ⅰ 펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 대량생산이 가능하도록 보조하는 역할을 수행하는 것이다. 본 발명의 혼성 파트너 결합단백질은 바람직하게는 케토스테로이드 이성질체화효소(KSI)를 사용하는 것이 다른 공지의 혼성 파트너 결합단백질을 사용하는 것에 비하여 LPcin-Ⅰ 펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 대량생산에 매우 유리하다. 한편, KSI는 당업계에 알려진 유전자를 그대로 사용하거나 약간 변형하여 사용할 수 있으나 가장 바람직하게는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 KSI를 사용하며, 이를 코딩하는 핵산의 염기서열은 서열번호 10에 수록되어 있다..

다음, 본 발명의 재조합 발현벡터는 포함된 발현 카세트의 내부에는 상기 혼성 파트너 결합단백질을 코딩하는 유전자와 작동적으로 결합된 b) 서열번호 1, 2 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅰ펩타이드를 코딩하는 유전자 또는 서열번호 3, 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 포함한다. 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 LPcin-Ⅰ 펩타이드는 23개의 아미노산 잔기를 갖는 양친매성(amphipathic) 펩타이드(NTVKE TIKYL KSLFS HAFEV VKT)로서 PP3의 카르복시 말단 113에서 135번 아미노산 잔기와 일치하며 항균활성을 가진다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 것이면 이를 코딩하는 유전자 염기서열은 제한이 없으나 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 유전자 염기서열(AAC ACC GTT AAA GAA ACC ATC AAA TAC CTG AAA AGC CTG TTC TCT CAC GCG TTC GAA GTT GTG AAA ACC)을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서, LPcin-Ⅰ 펩타이드의 과발현을 증대시켜 LPcin-Ⅰ 펩타이드를 대량생산하기 위하여 서열번호 2로 표시되는 항균성 펩타이드(NTVKE TIKYL KSLFS HAFEV VKTGG KKKK)를 사용할 수 있다. 상기 서열번호 2로 표시되는 항균성 펩타이드는 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산의 말단에 6개의 아미노산 잔기(GG KKKK)를 더 포함하는 아미노산 서열로서 상기 서열번호 1로 표시되는 LPcin-Ⅰ 펩타이드에 비하여 보다 많은 융합단백질의 발현을 유도할 수 있어 대량생산에 훨씬 적합하다(실시예 1 이하 참조). 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 것이면 이를 코딩하는 유전자 염기서열은 제한이 없으나 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 유전자 염기서열(AAC ACC GTT AAA GAA ACC ATC AAA TAC CTG AAA AGC CTG TTC TCT CAC GCG TTC GAA GTT GTG AAA ACC GGT GGC AAA AAG AAA AAG)을 사용할 수 있다.

다음, 서열번호 3으로 표시되는 LPcin-Ⅱ 펩타이드(IKYLK SLFSH AFEVV KT)는 PP3의 119에서 135번 영역의 아미노산 잔기와 일치하나 LPcin-Ⅰ 펩타이드와는 달리 항균 활성을 갖지 않는다. 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 것이면 이를 코딩하는 유전자 염기서열은 제한이 없으나 바람직하게는 서열번호 7로 표시되는 유전자 염기서열(ATC AAA TAC CTG AAA AGC CTG TTC TCT CAC GCG TTC GAA GTT GTG AAA ACC)을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서, LPcin-Ⅱ 펩타이드의 과발현을 증대시켜 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 대량생산하기 위하여 서열번호 4로 표시되는 항균성 펩타이드(IKYLK SLFSH AFEVV KTGG KKKK)를 사용할 수 있다. 상기 서열번호 4로 표시되는 항균성 펩타이드는 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산의 말단에 6개의 아미노산 잔기(GG KKKK)를 더 포함하는 신규한 아미노산 서열로서 상기 서열번호 3으로 표시되는 LPcin-Ⅱ 펩타이드에 비하여 보다 많은 융합단백질의 발현을 유도할 수 있어 대량생산에 훨씬 적합하다(실시예 1 이하 참조). 상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 것이면 이를 코딩하는 유전자 염기서열은 제한이 없으나 바람직하게는 서열번호 8로 표시되는 유전자 염기서열(ATC AAA TAC CTG AAA AGC CTG TTC TCT CAC GCG TTC GAA GTT GTG AAA ACC GGT GGC AAA AAG AAA AAG)을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 서열번호 1 ~ 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 코딩하는 유전자가 1 내지 8회 반복되어 있을 수 있다. 이를 통해 본 발명의 재조합 발현벡터의 발현 시 상기 유전자를 많이 반복되므로 보다 많은 LPcin-Ⅰ 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 수득할 수 있는 것이다.

나아가, 본 발명에 적용되는 서열번호 1 ~ 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 후속되는 NMR 실험 등의 편의성을 위해 비방사성인 안정한 동위원소를 이용하여 표지될 수 있으며, 바람직하게는 ¹⁵N으로 표지될 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 발현벡터 그로부터 발현되는 재조합 펩타이드 또는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 발현 카세트의 내부에 KSI-LPcin-Ⅰ 또는Ⅱ의 5’- 또는 3’-말단의 인접한 위치에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), FLAG, 5 ~ 7x His (hexahistidine), NusA (N utilization substance A) 또는 Trx(Thioredoxin)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 포함될 수 있다. 그러나 가장 바람직하게는 5 ~ 7x His (hexahistidine)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 포함되는 경우에 발현효율을 극대화시킬 수 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고 간단하게 정제될 수 있는 것이다.

상술한 발현 카세트의 주요 구성요소들을 포함하는 발현 프레임의 구체적인 구성은, 결합 단백질인 KSI에 본 발명의 서열번호 1 ~ 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 1회 내지 8회 반복하여 연결하고, 특히 2회 이상 반복하는 경우 각 펩타이드의 중간에는 후술하는 CNBr을 통해 절단할 수 있도록 메치오닌 코돈을 삽입하고 C 말단 부위에 메치오닌 코돈 및 6개의 히스티딘(His)으로된 아미노산을 포함하는 발현 벡터로 이루어진다. (N'- KSI(Met)- 서열번호 1 ~ 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드 중 어느 하나를 1 ~ 8회 반복(각 펩타이드 사이에 Met) - (Met) 6His - C'의 구조).

한편, 본 발명의 재조합 발현벡터는 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는, 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol.,158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 발현벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 바람직한 발현벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322,pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4?λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예:SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 가장 바람직하게는 도 1의 개열지도를 갖는 pET-31b를 사용하는 것이 대량생산에 가장 유리하다.

상술한 본 발명의 재조합 발현벡터가 형질전환되는 숙주세포는 대장균을 사용하는 것이 대량생산에 가장 유리하다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 펩타이드의 대량생산방법은 1) 상술한 본 발명의 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환하는 단계, 2) 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질을 과발현시키는 단계, 3) 상기 발현된 융합 단백질을 용해하여 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)로 상기 대장균으로부터 회수하는 단계, 4) 상기 불용성 재조합 융합단백질을 Ni- 친화성 크로마토그래피로 정제하는 단계, 5) 상기 정제된 불용성 재조합 융합단백질을 산성조건에서 CNBr로 절단하는 단계, 및 6) 상기 절단된 불용성 재조합 융합단백질을 역상 HPLC를 수행하여 LPcin-펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다.

먼저, 1)단계로서 상술한 본 발명의 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환한다. 본 발명의 대량생산방법에 사용되는 재조합 발현벡터는 상술한 내용과 같으므로 그 설명을 대체한다. 한편, 재조합 발현벡터를 숙주세포인 대장균의 내부로 운반하는 방법은, 통상의 방법에 의해 진행될 수 있으며, 상세하게는 CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. etal., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나 한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac.Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

다음, 2)단계로서 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질을 과발현시킨다. 구체적으로, 본 발명의 형질전환된 숙주세포의 배양은 당업계에서 통상적으로 이용되는 배지를 이용하여 실시될 수 있으며, 바람직하게는 LB(Luria-Bertani) 배지 또는 M9 최소배지를 이용하여 형질전환체를 배양할 수 있다. 한편, 상술한 발현 카세트 중 (N'- KSI(Met)- 서열번호 1 ~ 4로 표시되는 펩타이드 중 어느 하나를 1 ~ 8회 반복(각 펩타이드 사이에 Met) - (Met) 6His - C') 부분이 과발현되어 융합단백질로 발현된다. 이 경우 바람직하게는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 발현을 유도할 수 있다.

다음, 3)단계로서 상기 발현된 융합 단백질을 용해하여 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)로 상기 E.coli로부터 회수하는 단계를 거칠 수 있다. 구체적으로, 배양된 숙주세포에서 발현된 융합 단백질을 수득하기 위하여는 상기 숙주세포(대장균)를 파쇄하여야 한다. 파쇄하는 방법은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 핸드 균질기(hand homogenizer), 민싱(mincing), 그라인딩, 블레이드 균질기, 프렌치 프레스, 초음파분쇄, 비드 밀 또는 맨턴-가울린 균질기(Manton-Gaulin homogenizer) 등을 이용하여 실시할 수 있다. 그 뒤 파쇄된 숙주세포로 부터 상기 발현된 융합 단백질이 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)의 형태로 수득된다.

다음, 4)단계로서 상기 용출된 불용성 재조합 융합단백질을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 정제하게 된다. 구체적으로 파쇄된 숙주세포에서는 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)과 세포 파쇄물 등이 혼재되어 있는 데, 이 중 불용성 재조합 융합단백질만을 선별적으로 수득하기 위하여 원심분리 등을 이용하여 불용성 재조합 융합단백질을 용출시킨 후 Ni-친화성 크로마토그래피로 정제하게 되는 것이다. 보다 구체적으로 본 발명의 융합단백질은 C 말단에 6x His에 융합되어 있으므로 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼을 통해 상기 불용성 재조합 융합단백질만을 선별적으로 수득할 수 있으며, 구체적으로 200㎎/L 이상으로 선별적으로 수득할 수 있다.

다음, 5)단계로서 상기 정제된 불용성 재조합 융합단백질을 산성조건에서 CNBr로 절단한다. CNBr로 메치오닌 코돈을 절단하는 것을 특징으로 하는 생산방법을 제공한다. 구체적으로 상기 산성조건은 불용성 재조합 융합단백질의 절단에 유리한 환경을 조성하기 위한 것이며, 보다 바람직하게는 70%의 포름산을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 CNBr을 불용성 재조합 융합단백질을 산성조건으로 처리한 후 CNBr을 통해 화학적 절단이 이루어지게 되는데, 보다 상세하게는 상술한 본 발명의 발현 카세트에서는 각각의 구성요소 사이에 메치오닌 코돈을 삽입되어 있으므로 이를 발현한 후 CNBr을 처리함으로써 손쉽게 절단할 수 있으며, 이러한 내용은 도 4의 레인 7을 통해 불완전하게 쪼개진 단백질 조각의 밴드를 관찰하는 것을 통해 확인될 수 있다.

마지막으로, 6)단계로서 상기 절단된 불용성 재조합 융합단백질의 조각들을 역상 HPLC를 수행하여 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 회수한다. 그 결과 L당 20 ~ 30㎎ 이상의 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 생산할 수 있다.

한편, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅰ 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅰ은 항균성을 가지므로 이를 함유하는 항균제 및 항진균제로 활용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 항균제 및 항진균제는 임상투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 본 발명의 항균 펩타이드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 항균제의 유효용량은 2∼10 ㎎/㎏ 이고, 바람직하기로는 4∼8 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 ~ 2 회 투여될 수 있다. 본 발명의 항진균제의 유효용량은 2 ~ 8 ㎎/㎏ 이고, 바람직하기로는 4 ~ 16 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 ~ 2회 투여될 수 있다.

본 발명의 항균펩타이드는 항미생물 제제, 항바이러스 제제 및 항진균제로서 광범위하게 사용될 수 있으며, 적용될 수 있는 범위로는 식물, 동물 및 인간에게 널리 해롭게 작용하고 있는 바이러스, 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 곰팡이, 효모 및 원생동물 등에 적용될 수 있다. 본 발명의 항균펩타이드는 단독으로 사용될 수도 있고, 용도에 따라 다른 항생제, 예를 들어 에리스로마이신(erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline), 아지트로마이신(azithromycin), 반코마이신 및 세팔로스포린(cephalosporins) 등과 함께 사용될 수도 있다. 또한, 식품 첨가물, 화장품, 연고 또는 주사제 등의 용도로도 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

< 실시예 1> 재조합 발현벡터의 제작

본 실시예에서는 하기에서 언급된 방법으로 제조한 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-I과 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅱ를 케토스테로이드 아이소머레이져 효소 유전자 다음에 반복하여 연결하고 단백질 정제를 쉽게 할 수 있도록 6개 히스티딘 아미노산 잔기를 포함하는 유전자를 C 말단에 부착하여 형질전환이 이루어지는 것으로서 구체적인 내용은 다음과 같다.

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-I과 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅱ를 구성하는 두 개의 펩타이드를 코딩하는 전방향 및 역방향 프라이머(Intergrated DNA Technologies)를 준비하였다. LPcin-I 전방향 프라이머 염기서열은 AAC ACC GTT AAA GAA ACC ATC AAA TAC CTG AAA AGC CTG TTC TCT CAC GCG TTC GAA GTT GTG AAA ACC GGT GGC AAA AAG AAA AAG ATG이고 역방향 염기서열은 CTT TTT CTT TTT GCC ACC GGT TTT CAC AAC TTC GAA CGC GTG AGA GAA CAG GCT TTT CAG GTA TTT GAT GGT TTC TTT AAC GGT GTT CAT이다. 그리고 LPcin-Ⅱ 전방향 프라이머 염기서열은 ATC AAA TAC CTG AAA AGC CTG TTC TCT CAC GCG TTC GAA GTT GTG AAA ACC GGT GGC AAA AAG AAA AAG ATG이고 역방향 염기서열은 CTT TTT CTT TTT GCC ACC GGT TTT CAC AAC TTC GAA CGC GTG AGA GAA CAG GCT TTT CAG GTA TTT GAT CAT이다. 반복 펩타이드 구성을 만들기 위하서, 전사 가닥의 3' 말단은 3-염기 ATG를 포함하고 단일방향성 end-to-end self ligation을 위한 이중의 적절한 돌출부(overhang)를 만들기 위한 비전사 가닥의 3' 말단은 TAC 신장을 포함하였다.

세 개의 염기의 3'돌출부(overhang)를 갖는 코드화 부위(Coding region)와 일치하는 상보적인 올리고뉴클레오티드는 어닐링된 분자에서 확인할 수 있고. 올리고뉴클레오티드들은 라이게이션을 통해 다중결합 복제(multimeric copy)의 형성을 가능하게 하는 5'인산화가 관찰되었다. 합성된 올리고뉴클레오티드의 서열(서열번호 3, 4)과 그 결과 전사된 아미노산 서열(서열번호 3, 4)은 도 1에서 확인할 수 있다. AlwNI에 의해 탈 인산화된 pET31b(+) 벡터(Novagen, USA)는 정제된 이중나선 DNA들을 삽입하는데 사용되었다. 상보적인 ATG의 돌출부(overhang)을 포함하는 이중가닥의 DNA들은 직렬반복(tandem repeat)를 형성하기 위해 T4 DNA ligase(New England Biolabs, USA)를 사용해서 라이게이션되고, LPcin-I과 LPcin-Ⅱ의 유전자는 도 1의 개열지도에서 보여지는 것과 같이 퓨전 파트너로써 125개의 아미노산 bacterial KSI 유전자의 downstream과 헥사-히스티딘(hexa-histidine) 표지 시퀀스의 upstream에 위치한다. 상기 도 1의 개열지도에서 발현 벡터는 엠피실린 저항성 유전자, 박테리아의 생존 및 복제 유전자, IPTG에 영향을 받는 프로모터/오페론, 리보좀 결합 부위 유전자, KSI 유전자, LPcin-I 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 코딩하는 유전자 및 6개의 히스티딘이 번역되는 유전자들로 구성되어 있다. 이들 재조합된 플라스미드들은 다중 삽입체(multiple insert)의 존재를 확인하기 위한 스크리닝 플라스미드(screening plasmid)들에 대한 형질전환용 대장균(BL21(DE3)pLysS와 mutant BL21(DE3))으로 형질전환을 실시하였다. 플라스미드 DNA들은 Qiaprep miniprep kits(Qiagen, Germany)을 사용하여 정제되고 Xba I과 Xho I (New England Biolabs, USA)로 잘려진다. 반응 생성물은 1.5% 아가로오즈 젤 전기영동에 의해서 분리되고 LPcin-I 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 직렬반복(tandem repeat)을 포함한 올리고뉴클레오티드들은 밴드로 구별된다. 단일 또는 다중 삽입체로 정제된 플라스미드 DNA들은 구성을 확인하기 위해서 염기서열을 확인하였다. 만들어진 pET31b/KSI-(LPcin-I 또는 LPcin-Ⅱ)-His 표지 플라스미드는 IPTG에 의한 유발 배지에서 가장 높은 수율로 혼성 단백질 발현을 결정하기 위해서 몇 개의 대장균에 형질전환이 이루어졌다. 각각의 발현 숙주 세포로부터 혼성단백질의 발현 수준은 12% 트리스-트리신 PAGE 에서 확인하였다.

도 2는 삽입된 유전자 카세트들의 개수를 확인하기 위해 형질전환용 대장균으로부터 추출한 플라스미드의 아가로즈(1.5 %) 젤 전기영동 결과로서 추출한 플라스미드들은 2개의 제한효소(Xba I과 Xho I)로 절단하면 두 개의 조각으로 나뉘게 되고, 이 2개의 조각들은 약 4800개 염기서열의 조각과 약 400~700개의 염기서열을 갖는 KSI 혼성 단백질의 유전자 서열을 의미한다 [(a) 첫번째 레인 - 유전자 염기개수기준; 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11번째 레인은 LPcin-I의 1개의 유전자카세트포함; 7번째 레인은 LPcin-I의 2개의 유전자카세트를 포함. (b) 1번째 레인 - 유전자 염기개수 기준; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12번째 레인은 LPcin-Ⅱ의 한 개 유전자카세트 포함; 8번째 레인은 LPcinⅡ-의 두개 유전자카세트 포함; 10번째 레인은 LPcin-Ⅱ의 3개의 유전자카세트 포함].

<실시예 2> KSI-LPcin-I 또는 KSI-LPcin-Ⅱ 융합단백질의 발현

상기 실시예 1에서 제작된 발현벡터에 대하여 pET31b/KSI-(LPcin-I 또는 LPcin-Ⅱ)-His를 포함하는 돌연변이 대장균 스트레인은 최대의 혼성단백질 발현수율을 보이므로 이를 선택하였다. 단일 콜로니는 카베니실린(AMresco, USA)을 포함하는 LB 배지를 포함하는 플레이트에서 접종하여 사용되고 플레이트는 37에서 배양 하였다. 50ml LB 시작 배지에서 단일 콜로니를 접종한 후 37에서 12 ~ 16시간 정도 배양하였다. 완전히 자란 배양액 10ml를 1L M9 최소 배지에 옮겨 넣은 후 37에서 다시 배양을 실시하였다. NMR 구조 연구를 위해서 균일하게 또는 선택적으로 ¹⁵N 으로 표지된 펩타이드는 M9 최소 배지에서 과발현되었다. 균일하게 15N 표지 된 펩타이드는 1g/L ¹⁵N-표지 ammonium sulfate(Cambridge Isotope Lab, USA)를 첨가한 M9 배지에서 발현되고, 선택적으로 ¹⁵N 로 표지된 펩타이드는 100mg/L의 농도의 선택된 ¹⁵N 표지된 아미노산과 19개의 표지되지 않은 아미노산(Aldrich, USA)을 포함한 M9 배지에서 >200mg/L의 농도로 발현되었다. 600 nm 에서 측정한 흡광도가 0.5~0.6에 도달했을 때, 최종 1mM이 되도록 IPTG(Amresco, USA)를 첨가하였다 그 뒤 16시간 후 혼성 단백질의 발현이 시작되면 4℃에서 30분 동안 6000rpm으로 원심 분리하여 수확한 후 -80℃에서 보관한다. 도 3은 발현전용 대장균들로부터 여러 개 유전자카세트를 포함하는 혼성단백질의 발현 수준을 체크하기 위해 사용한 트리스-트리신 (12 %) 젤전기영동 결과로서 (a)~(e)에서 2~4번째 레인에 대한 발현용 대장균이 BLR(DE3)pLysS이고, 5-7번째 레인은 C41(DE3) 그리고 8-10번째 레인은 C43(DE3)이다. 모든 혼성단백질의 발현 수준은 모든 각각의 발현된 대장균에 대해서 IPTG 유도 전과 유도 후 3시간, 유도 후 16 시간의 밴드세기로 확인할 수 있다[(a) 1개의 유전자카세트를 포함하는 LPcin-I, (b) 2개의 유전자카세트를 포함하는 LPcin-I, (c) 1개의 유전자카세트를 포함하는 LPcin-Ⅱ (d) 2개의 유전자카세트를 포함하는 LPcin- (e) 3개의 유전자카세트를 포함하는 LPcin-Ⅱ].

<실시예 3> 융합단백질의 정제

상기 실시예 2에서 냉동된 세포 펠렛들을 1mg/ml 리소자임(Sigma, USA)를 넣은 100ml의 lysis 버퍼(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 15 % glycerol)에서 현탁하였다. 세포는 3초 동안 short burst 후 과열을 방지하기 위해 10초를 멈추는 13min/cycle로 초음파 파쇄를 3번 사용해서 얼음에서 역학적으로 세포를 용해하였다. 세포 용해액은 4℃에서 30분 동안 13.2krpm으로 원심분리를 수행하였다. 펠렛은 불용성 융합 단백질의 형태로 얻어진다. 이것들은 6M 구아니딘-HCl을 포함하는 90ml의 Ni- binding buffer(20mM Tris, 500mM NaCl, 5mM Imidazole, pH8.0)에서 변성하여 실온에서 용해된다. 잔여의 불용성 불순물을 제거하기 위한 원심분리(13.2krpm, 4, 35분) 후 맑은 상층액은 결합버퍼에 평형화 된 25ml Ni-수지 컬럼에 넣어주었다. 컬럼 볼륨의 4배의 세척버퍼(10 mM Tris, 500 mM NaCl, 16 mM Imidazole, 6 M Guanidine HCl, pH 8.0)를 이용해서 컬럼을 씻어 준다. KSI 혼성 단백질은 4배 볼륨의 용리버퍼(10 mM Tris, 500 mM NaCl, 500mM Imidazole, 6M Guanidine HCl, pH8.0)를 이용해 용출하였다. 구아니딘과 염을 제거하기 위해서, 용출물은 실온에서 탈 이온화된 물에서 투석과정을 실시하였다. 그 뒤 KSI-혼성 단백질의 불용성 침전물은 동결건조하여 수득하였다. 상기 동결 건조된 혼성 단백질을 70% 포름산(Fluka, USA)에서 용해시키고, 상기 혼성단백질부터 KSI와 His₆-표지를 절개하기 위해서 고체의 CNBr(100mg/ml, Sigma, USA)를 첨가하고, KSI, His₆-표지, LPcin-I 또는 LPcin-Ⅱ의 혼합물은 실온에서 적어도 6시간 동안 암실에서 반응시켜 KSI, His₆-표지 및 LPcin-I 펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 혼합물로 정제하였다.

도 4는 혼성 단백질을 CNBr로 처리한 후 12% 트리스-트리신 PAGE의 전기영동 실험결과로서 이를 통해 대량생산단계에서 불용성 혼성 단백질의 상태를 확인할 수 있다[. (a) LPcin-I과 LPcin-Ⅱ의 대량발현과 정제를 보여주는 트리스-트리신(12%) 젤 전기영동 결과. 1번째 레인은 분자량 크기 기준물질; 2번째 레인은 IPTG 유도 전 상태; 3번째 레인은 KSI 혼성 단백질 밴드가 보이는 IPTG 유도 후 상태; 4번째 레인은 리소짐에 의한 세포파괴이후 녹는 부분의 단백질들; 5번째 레인은 세포파괴이후 혼성 단백질을 포함하는 불용성 부분의 단백질들; 6번째 레인은 Ni 친화 컬럼으로부터 용리된 KSI 혼성 단백질; 7번째 레인은 CNBr 절단이후의 단백질과 펩타이드 혼합물].

<실시예 4> LPcin-I 및 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 정제

상기 실시예 3의 KSI, His₆-표지 및 LPcin-I 펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 혼합물에 대하여 C18 컬럼(7.8 X 300 mm, Water)에서 유속 3ml/min에 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)에서 아세트니트릴의 선형구배(linear gradient, 60분 동안 ACN, 5~65%)로 preparative reverse-phase HPLC (Waters Delta 600, USA)를 실시하여 LPcin-I 펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 정제하였다. 흡광도는 220 nm 와 280 nm에서 PDA 디텍터를 통해 확인하였다. 타겟 폴리펩타이드의 순도는 12% 트리스-트리신 PAGE와 NMR 스펙트럼에 의해서 결정하였다.

도 5는 LPcin-I과 LPcin-Ⅱ의 역상 HPLC의 실험결과이다. LPcin-I는 60~65 분에 용출되는 KSI 혼성 파트너가 검출되기 이전인 48~51 분에서 용출되는 반면에 LPcin-Ⅱ는 39-42분에서 용출이 발생한다. 펩타이드의 동질성과 일치성은 도 5b와 d에서 보여지는 것처럼 12% 트리스-트리신 PAGE에 의해서 확인하였다. 그 뒤 높은 수율을 갖고 순수한 균일하게 또는 선택적으로 ¹⁵N으로 표지된 LPcin-I과 LPcin-Ⅱ를 M9 최소 배지 L당 20~30mg의 비율로 수득하였다 [(a) 재조합된 KSI-LPcin-I-His₆ 혼성 단백질의 CNBr 절단이 후 역상 고압크로마토그래피(HPLC). (b) KSI-LPcin-Ⅱ-His₆ 혼성 단백질의 해당 HPLC 분취물의 트리스-트리신 (12 %) 폴리아크릴아미드젤. 1, 2, 3 과 4번째 레인은 각각 1 ~ 4번째 레인의 분취물이다. 48 ~ 51 분에서의 피크는 정제된 재조합 LPcin-I이고 60-65분에서의 피크는 KSI 단백질이다. (c) 재조합된 KSI-LPcin-Ⅱ-His₆ 혼성 단백질의 CNBr 절단이후 역상 고압크로마토그래피. (d) KSI-LPcin-Ⅱ-His₆ 혼성 단백질의 HPLC 분취물의 트리스-트리신 (12 %) 폴리아크릴아미드젤. 1번째 레인에서 6번째 레인은 각각 1에서 6번째 분취물이다. 39-42 분에서의 피크는 정제된 재조합 LPcin-Ⅱ이고 60-65분에서의 피크는 KSI 단백질이다. 모든 크로마토그램은 PDA 검출기에서 220 nm와 280 nm에서 확인함].

<실시예 5> DPC 미셀(micelles)에서 LPcin-I and LPcin-Ⅱ의 ¹H-¹⁵N HSQC NMR 시험

발현된 LPcin-I과 LPcin-Ⅱ 펩타이드의 보전성(integrity)과 그리고 DPC 마이셀에서 올바르게 접힘이 일어나는지 결정하기 위해서 ¹H-¹⁵N HSQC NMR 실험을 실시하였다. 상기 실시예 4에서 획득한 LPcin-I 및 LPcin-Ⅱ 펩타이드는 구배단위(gradient unit)가 장착된 Avance 800 MHz spectrometer (Bruker Biospin, Germany)를 통해 NMR을 측정하였다. 구체적으로 동결 건조된 단백질이 pH4에서 90% H₂O와 10% D₂O을 포함하는 150mM DPC-d₃₈에서 1.0mM이 되도록 준비하였다. ¹H-¹⁵N HSQC(heteronuclear single quantum coherence)의 스펙트럼은 온도를 298 K에서 323 K로 5도씩 증가시켜 가며 확인하였고, 또한 각 온도마다 다른 pH(4.0, 5.0, 5.5)에서도 관찰하였다. 최대의 분해능을 보이는 스펙트럼은 pH 4.0에서 각각 308 K (LPcin-I)과 323 K (LPcin-Ⅱ)에서 획득했다. 그러므로 다음 NMR 실험은 pH 4.0에서 308 K (LPcin-I)과 323 K (LPcin-Ⅱ)에서 수행하였다. ¹H-¹⁵N HSQC 스펙트럼은 인다이렉트 디멘전(indirect dimension)에서 에코-안티에코(echo-antiecho) 방법을 통해 상-민감(phase-sensitive) 모드에서 획득하였다. 물의 공명선은 워터-플립백(water-flip back) 파장과 GARP4 모듈레이션에 의해 얻어지는 ¹⁵N의 디커플링을 이용하여 억제하였다. 스펙트럼은 t1에서 128~256의 증가분(각각8~16번의 스캔)과 t2 도메인에서 1024개의 데이터포인트를 획득하였고, 데이터 진행은 TOPSPIN 1.3 소프트웨어 (Bruker Biospin, Germany)를 사용하여 수행하였다.

도 6(90 % 물과 10 % 중수에서 pH 4.0이며 150mM의 중수소화된 DPC 미셀에서 (a)LPcin-I (308 K)과 (b) LPcin-Ⅱ (323K)의 800MHz 용액상핵자기공명분광기 (Bruker Biospin, Germany) ¹H-¹⁵N HSQC 스펙트럼)은 발현된 LPcin-I과 LPcin-Ⅱ 펩타이드에 대한 ¹H-¹⁵N HSQC NMR 결과이다. 구체적으로 각각의 수소원자와 결합한 질소에 대한 ¹H-¹⁵N 교차피크들의 대부분은 (폴리펩타이드 주사슬에서 한 개의 아미노산당 한 개의 피크로 나타나지만 프롤린과 Asn과 같이 곁사슬에 질소를 갖고 있는 잔기의 경우 예외적인 경우를 보인다) LPcin-I에 대해서는 7.7 ~ 9.0 ppm에서 피크가 나타나고 LPcin-Ⅱ의 경우는 7.8 - 8.7 ppm에서 피크가 나타난다. HSQC의 경우 LPcin-I에 대해서는 pH 4.0이고 323K, LPcin-Ⅱ에 대해서 pH 4.0이고 308K을 유지하는 것이 분석에 유리하였다. 이 조건에서 LPcin-I과 LPcin-Ⅱ 펩타이드에 대한 HSQC 스펙트럼은 도 6에서 보여주는 것처럼 아미드 N-H 신호분산이 잘 되었으며 적절한 펩타이드 단량체의 접힘이 나타낸다. ¹⁵N 112.6 ppm, ¹H 7.02, 7.85 ppm 부근에서 나타나는 Asn 곁사슬의 피크를 이용하여 시험적으로 LPcin-I Asn 113의 곁사슬의 피크를 탐색하였다. LPcin-I은 한 개의 Asn의 곁사슬에서 나타나는 피크를 찾을 수 있었으나 LPcin-Ⅱ에서 찾지 못하였다. 이는 LPcin-I과 LPcin-Ⅱ의 입체적 구조가 일치하지 않는 증거를 제공한다. 한편 도 7은 LPcin-I(Black)과 LPcin-Ⅱ(grey)의 겹쳐진 HSQC 스펙트럼을 보여주는 것으로 이를 통해 LPcin-I과 LPcin-Ⅱ 의 입체적 구조가 일치하지 않음을 다시 한번 확인할 수 있다. 그 결과, 시험적 으로 결정된 LPcin-I과 LPcin-Ⅱ는 생체막과 유사한 DPC 미셀 환경에서 서로 다른 구조를 갖고 그들의 구조적 차이로 인해서 다른 항균 활성을 가지는 것을 알 수 있다.

본 발명은 항생제 활성을 갖는 LPcin-Ⅰ펩타이드 및 항생제 활성을 갖지 않는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 대량으로 생산할 수 있어 의약산업에 대단히 유용한 발명이다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 재조합 발현벡터의 개열지도이다.

도 2는 삽입된 유전자 카세트들의 개수를 결정하기 위해 형질전환 전용 이콜라이로부터 추출한 플라스미드의 전기영동 실험 결과이다.

도 3은 형질전환된 대장균으로부터 여러 개 유전자카세트를 포함하는 혼성단백질의 발현 수준을 체크하기 위해 사용한 트리스-트리신 (12 %) 젤전기영동 실험 결과이다.

도 4는 LPcin-I과 LPcin-Ⅱ의 대량발현과 정제를 보여주는 트리스-트리신(12%) 젤 전기영동 실험 결과이다.

도 5는 (a)는 재조합된 KSI-LPcin-I-His₆ 혼성 단백질의 CNBr 절단이 후 역상 고압크로마토그래피(HPLC)의 실험결과이고 (b) KSI-LPcin-Ⅱ-His₆ 혼성 단백질의 해당 HPLC 분취물의 Tris-Tricine (12 %) 폴리아크릴아미드젤의 전기영동 실험결과이며, (c)는 재조합된 KSI-LPcin-Ⅱ-His₆ 혼성 단백질의 CNBr 절단이후 역상 고압크로마토그래피의 실험결과이고. (d) KSI-LPcin-Ⅱ-His₆ 혼성 단백질의 HPLC 분취물의 트리스-트리신 (12 %) 폴리아크릴아미드젤의 전기영동 실험결과이다.

도 6은 (a)LPcin-I (308 K)과 (b) LPcin-Ⅱ (323K)에 대한¹H-¹⁵N HSQC 스펙트럼의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은 LPcin-I (검정)과 LPcin-Ⅱ (회색)의 측정치를 겹쳐놓은 ¹H-¹⁵N HSQC 스펙트럼의 결과를 나타내는 그래프이다.

<110> Hankuk University Of Foreign Studies Research and Industry-University Cooperation Foundation <120> Recombination expression vector comprising LPcin-1 or LPcin-2 peptide and mass-production method of peptide thereof <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Bos indicus <400> 1 Asn Thr Val Lys Glu Thr Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His 1 5 10 15 Ala Phe Glu Val Val Lys Thr 20 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Bos indicus <400> 2 Asn Thr Val Lys Glu Thr Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His 1 5 10 15 Ala Phe Glu Val Val Lys Thr Gly Gly Lys Lys Lys Lys 20 25 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Bos indicus <400> 3 Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His Ala Phe Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Thr <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Bos indicus <400> 4 Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His Ala Phe Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Thr Gly Gly Lys Lys Lys Lys 20 <210> 5 <211> 69 <212> DNA <213> Bos indicus <400> 5 aacaccgtta aagaaaccat caaatacctg aaaagcctgt tctctcacgc gttcgaagtt 60 gtgaaaacc 69 <210> 6 <211> 87 <212> DNA <213> Bos indicus <400> 6 aacaccgtta aagaaaccat caaatacctg aaaagcctgt tctctcacgc gttcgaagtt 60 gtgaaaaccg gtggcaaaaa gaaaaag 87 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Bos indicus <400> 7 atcaaatacc tgaaaagcct gttctctcac gcgttcgaag ttgtgaaaac c 51 <210> 8 <211> 69 <212> DNA <213> Bos indicus <400> 8 atcaaatacc tgaaaagcct gttctctcac gcgttcgaag ttgtgaaaac cggtggcaaa 60 aagaaaaag 69 <210> 9 <211> 125 <212> PRT <213> KSI <400> 9 Met His Thr Pro Glu His Ile Thr Ala Val Val Gln Arg Phe Val Ala 1 5 10 15 Ala Leu Asn Ala Gly Asp Leu Asp Gly Ile Val Ala Leu Phe Ala Asp 20 25 30 Asp Ala Thr Val Glu Asp Pro Val Gly Ser Glu Pro Arg Ser Gly Thr 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Glu Phe Tyr Ala Asn Ser Leu Lys Leu Pro Leu Ala 50 55 60 Val Glu Leu Thr Gln Glu Val Arg Ala Val Ala Asn Glu Ala Ala Phe 65 70 75 80 Ala Phe Thr Val Ser Phe Glu Tyr Gln Gly Arg Lys Thr Val Val Ala 85 90 95 Pro Ile Asp His Phe Arg Phe Asn Gly Ala Gly Lys Val Val Ser Ile 100 105 110 Arg Ala Leu Phe Gly Glu Lys Asn Ile His Ala Cys Gln 115 120 125 <210> 10 <211> 372 <212> DNA <213> KSI <400> 10 cataccccag aacacatcac cgccgtggta cagcgctttg tggctgcgct caatgccggc 60 gatctggacg gcatcgtcgc gctgtttgcc gatgacgcca cggtggaaga ccccgtgggt 120 tccgagccca ggtccggtac ggctgcgatt cgtgagtttt acgccaactc gctcaaactg 180 cctttggcgg tggagctgac gcaggaggta cgcgcggtcg ccaacgaagc ggccttcgct 240 ttcaccgtca gcttcgagta tcagggccgc aagaccgtag ttgcgcccat cgatcacttt 300 cgcttcaatg gcgccggcaa ggtggtgagc atccgcgcct tgtttggcga gaagaatatt 360 cacgcatgcc ag 372

Claims

a) 혼성 파트너 결합단백질을 코딩하는 유전자 및 b) 서열번호 1, 2 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅰ펩타이드를 코딩하는 유전자 또는 서열번호 3, 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 코딩하는 유전자가 작동적으로 결합된 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서 상기 혼성 파트너 결합단백질은 케토스테로이드 이성질체화효소(KSI)이고, 상기 발현벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 pET31b인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 발현 카세트는 N-말단 또는 C-말단에 5-7개의 히스티딘 아미노산을 코딩하는 유전자가 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서, 상기 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드는 1 ~ 8회 반복되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균.
1) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환하는 단계;

2) 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질을 과발현시키는 단계;

3) 상기 발현된 융합 단백질을 용해하여 불용성 재조합 융합단백질(Inclusion Bodies)로 상기 대장균으로부터 회수하는 단계;

4) 상기 불용성 재조합 융합단백질을 Ni-친화성 크로마토그래피로 정제하는 단계,

5) 상기 정제된 불용성 재조합 융합단백질을 산성조건에서 CNBr로 절단하는 단계; 및

6) 상기 절단된 불용성 재조합 융합단백질을 역상 HPLC를 수행하여 LPcin-Ⅰ펩타이드 또는 LPcin-Ⅱ 펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 대량생산방법.