KR20120095837A - Crm197 및 그 유도체의 제조를 위한 합성 유전자의 박테리아성 발현 - Google Patents

Crm197 및 그 유도체의 제조를 위한 합성 유전자의 박테리아성 발현 Download PDF

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콘소르지오 인터유니베르시타리오 페르 로 스빌루포 데이 시스테미 아 그란데 인터파세 씨에스지아이
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Abstract

본 발명은 CRM197을 암호화하는 서열인 SEQ ID No. 1을 포함하고, 대장균 내에서 이의 발현이 최적화된 폴리누클레오티드 서열에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 융해 단백질 CRM197-태그를 통해 대장균 내에서 CRM197를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

CRM197 및 그 유도체의 제조를 위한 합성 유전자의 박테리아성 발현 {BACTERIAL EXPRESSION OF AN ARTIFICIAL GENE FOR THE PRODUCTION OF CRM197 AND ITS DERIVATIVES}
본 발명은 합성 유전자 서열에 따른 약리학적 관심 대상인 단백질의 제조분야에 관한 것으로서 상기 서열은 발현 벡터에 삽입되며 이에 상응한 단백질이 유기체 내에서 상기 발현 벡터로 과발현되는 것인 상기 단백질, 및 발현된 단백질의 분리방법에 관한 것이며, 특히, CRM197 전체 및 이의 유도체를 암호화하는 합성 유전자의 구성,`대장균 (Escherichia coli,) 내에서의 CRM197 및 이의 유도체의 발현, 또한 CRM197 단백질의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.
CRM197 단백질 (가교 반응물 197, 58kDa)는 독성이 감소된 단일 돌연변이체 (예, 뉴클레오티드 변이시 52번 위치에 글리신-글루탐산 치환물을 생성하는)를 특징으로 하는 디프테리아 독소(DTx)의 변이물이다 (Uchida T. et al, 1973; Giannini G. et al, 1984). 그럼에도 불구하고, 상기 단백질 CRM197은 디프테리아 독소와 동일한 감염성 및 면역자극성을 유지하며, 보더렐라 페르투시스(Bordetella pertussis), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 코리엔박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus) 및 헤모필루스 B형 인플루엔자 (Haemophilus influenzae type B) 등에 대한 공역 백신의 제조에 널리 이용되고 있다 (WO 93/24148 및 WO 97/00697, WO 02/055105). 야생형 디프테리아 독소와 마찬가지로 CRM197은 두개의 도메인 A 및 B으로 구성되며 이들은 디설파이드 가교에 의해 서로 결합되어 있다. A 도메인 (21 kDa)은 촉매 도메인이며 B 도메인 (37 kDa)은 세포 수용체에 결합되는 하나의 서브도메인 및 위치변경(전위)을 위한 또다른 서브도메인을 포함한다 (Gill D.M. et al, 1971; Uchida T. et al, 1973). DTx와 마찬가지로, CRM197 단백질은 (B 도메인에 의해) 세포 수용체 HB-EGF (헤파린 결합 상피 성장세포)에 결합할 수 있고, 세포내입을 통해 세포 속으로 전위되도록 한다. 엔도섬 (이입소체) 내의 저 pH값에 노출시 막 내의 B 도메인 삽입 및 후속으로 사이토솔 내의 A 도메인 전위에 필수적인 입체구조 변화를 유도한다 (Papini E. et al, 1993; Cabiaux V. et al, 1997). 전위의 필수 조건은 두개의 도메인 즉 A 및 B 사이에 있는 펩티드 결합을 프로테아제를 이용하여 파괴하는 것이다. 디설파이드 브릿지 감소와 더불어 상기와 같은 분해반응을 통해 A 도메인이 탈착되어 반응성을 갖고 이와 동시에, 단일 폴리펩티드로서 합성된 전체 단백질이 비활성화한다 (Gill D.M. et al, 1971).
디프테리아 독소의 A 도메인은 ADP-리보실화 활성을 갖고, 단백질 합성에 수반되는 P-리보스기가 NAD 에서 제2 연장 인자(EF-2)로 전이되는 것에 촉매화 반응한다. 형성되는 착체는 비활성이며 따라서 진핵세포 단백질 합성에 장애를 유발한다 (Honjio T. et al, 1971). 단백질의 세포독성 효과는 또한 A 도메인의 또다른 활성작용, 즉, DNA를 비특이적으로 분해할 수 있음에 기인한다 (Giannini G. et al, 1984). 핵산분해 효소의 활성은 2가 양이온에 의존하며 CRM197 내에서도 유지된다 (Bruce C. et al, 1990; Lee J.W. et al, 2005).
CRM197 및 그외의 비독성 변이체는 항상, 예를 들어, 소정의 박테리오파지에 의해 감염된 코리엔박테리움 디프테리아의 용원성 배양을 이용하여 제조했으며, 이의 게놈에는 디프테리아 독소(DTx)를 암호화하는 독소 유전자의 돌연변이 형태가 함유되어 있다. 디프테리아 독소와 기타 변이체는 소정의 성장 조건하에 배지 내로 분비되며 다음, 여과나 침전으로 회수되고 계속해서 크로마토그래피법에 따라 정제한다 (Cox J., 1975). DTx 및 그 유도체 (CRMs)의 제조에서 초기에 이용된 방법은 고수율을 보장할 수 없으며, 따라서 코리네박테리움의 단일 용원성 균주로부터 CRM197을 생성하는 것은 백신내 공역체로 사용함에 있어 경제성이 떨어진다. CRM197의 생산성을 산업적 규모로 증대하기 위하여, 2중 및 3중 용원성 돌연변이체를 후속 분리하였으며 이들은 2개 혹은 3개의 독소 유전자가 염색체 내에 집적되어 있다 (Rappuoli R. et al, 1983; Rappuoli R., 1983). 1990년, 라푸올리는 DTx로부터 유래된 단백질의 제조방법에 대해 발표하였으며, 이는 염색체 내에 집적된 돌연변이 독소 유전자의 2가지 복제물을 가진 코리네박테리움 균주를 이용하는 것을 특징으로 한다. 수율을 높이기 위한 성장 조건도 설정되어 있다 (배양 배지 (통상 배양액), 철 이온 농도, 성장 온도, 산소 함량 (백분율) 등 (미국 특허 4,925,792, 1990년). CRM197은 고정상이 시작하는 시점까지 로그 성장상 전체에 걸쳐 배양액에 축적되며, 발효 개시후 20시간 정도 지나 정점에 도달한다. 수율의 급격 감소에 대한 또다른 증거로서, 단백질 분해 가능성을 들 수 있다 (미국 특허 4,925,792, 1990년).
발현 효율을 증대시키기 위한 2중 및 3중 용원성 균주의 구성은 노동집약적인 스크리닝 단계를 수반한 장기 공정이라는 점에 유념한다. 고농도 CRM197을 수득하기 위한 또다른 방법은 특이적 플라스미드 pPX3511를 이용하는 것으로서, 상기 플라스미드는 파지 유전자와 CRM197을 플라스미드 pNG-22로 암호화하는 파지 유전자의 융해 결과로 얻은 것이다 (미국 특허 5,614,382, 1995년). 이에 따라, 복수 용원성 박테리아 균주를 선택하지 않아도 유전자의 복제수를 증가시킬 수 있다 (세포당 5 내지 10개). 또한, 파지 b197tox- 에 감염된 코리엔박테리움 균주의 경우에서와 같이, CRM197은 철 함량이 낮은 특정의 배양액에서 발현된다. 박테리아 균주의 유전자 관리에 필요한 시간이 감소함에도 불구하고, CRM197의 유출량은 이중 용원성 유전자를 이용한 경우와 비교시 크게 증가하지 않는다. DTx 혹은 기타 CRM의 제조를 위한 발효 공정은 현재 다수의 특허 문헌에 개시되어 있는데 이들은 모두 C. 디프테리아 배양액을 사용한다. 통상, 온도, 교반 및 폭기 등의 조건을 제어하면서 성장이 진행되며, 또한 배양 20시간 후에 독소 및/또는 그 유도체 생성이 최대가 된다 (Dehottay P.M.H. et al, US2008/0193475; Wolfe H. et al, US2008/0153750).
다른 한편, 코리엔박테리움의 대안으로서 박테리아 숙주의 이용에 대한 연구는 제한적이다. 도메인 A 및 B의 발현에 관하여 또한 DTx의 일부 중간체 형태 (A 도메인과 B 도메인 일부가 결합된)에 관련하여 대장균을 대상으로 시험하였다. 이 연구는 독성, 수용체에 대한 결합, 단백질 폴딩 및 안정성 등의 측면에서 주로 A 도메인과 B 도메인 (및 그 일부)의 역할을 세부 평가하기 위한 것이다 (Bishai WR et al, 1987a; Bishai WR et al, 1987b). 융해 단백질로서 생성되는 일부 등 상기 단편은 이들 용해도 및 최종수율 (0.4 내지 10 mg/L 범위, 총 단백질의 약 7%에 해당함)을 평가하는 관점에서, 다양한 프로모터 및 발현 조건을 적용하여 대장균으로부터 발현한 것이다. 1875 bp로 클론화된 단편은 초기 독소 프로모터, 신호서열 및 CRM197을 암호화하는 전신 유전자로 구성된다. 웨스턴 블롯 실험에서 대조군으로 사용되는 상기 클론은 말단혈장 수준으로 발현했을 때의 다른 각종 단편보다 안정한 것으로 보임 반면 단백질의 용해도는 고온에서 세포혈장에 발현시 현저히 감소한다 (Bishai WR et al., 1987b).
자연 독소 프로모터를 이용하여 전체 A 도메인을 발현할 수 있으나 (Leong D.), 대장균내 B 도메인 만의 발현은 이 영역이 극히 불안정하며 태그를 통해 융해시만 발현된다는 점 탓에 매우 복잡한 것으로 입증되었다 (Spilsberg B. et al, 2005).
좀더 구체적으로, 독소와 그 유도체의 이종숙주 제조방법은 최적의 단백질 구성 채택, 전위 감퇴 및 낮은 최종 수율 등 다수의 문제점을 안고 있다. 이상적인 단백질 구성에 대응한 두개의 분자간 디설파이드 (이황화물) 브릿지가 형성되지 않도록 하는 한가지 방책은 수개의 변형 펩티드 유도체로 이루어진 구성, 특히, 펩티드 DTa (CRM197 서열의 처음 185 aa), 펩티드 DTb (세포 수용체에 대한 도메인 결합이 결실된 255a 및 N-말단에 있는 8 aa), 및 기존의 두 펩티드 (440 aa)를 융해시켜 얻은 펩티드 DTaDTb (440 aa) 등을 수반하였다. 이들 단편은 C. 디프테리아 게놈을 이용하여 PCR법으로 합성하였으며 그 후 트립토판 유도계를 파괴하여 대장균 내에서 발현하였다 (Corvaia N. et al., FR 2827606A1 2003).
근래에 CRM197에 대한 관심이 나날이 커지고 있으며 이는, 가용성 형태의 HB-EGF 에 대한 상기 물질의 결합능력에 관련한 잠재적 항암 활성 탓이다 (Mekada et al, US 2006/0270600A1). 항암 기능은 CRM197 뿐만 아니라 DT 독소의 다른 비독성 유도체 (예, 이중 돌연변이체 DT52E148K 또는 융해 단백질 GST-DT) 에도 기여한다. 이들 돌연변이체는 CRM197를 암호화하는 유전자로부터 출발하여 PCR에 의해 구축되었다. 그러나 종래의 문헌에 따르면 전체 CRM197는 35℃에서 16 내지 17시간 동안 C.디프테리아 배양을 통해 생성하였다. 이 CRM197는 황산암모늄을 이용하여 일차 침전을 통해 상청액으로부터 정제하고, 계속해서 3개의 연속 공정에 따라 이온 교환 및 소수성 크로마토그래피법으로 처리하였다 (Mekada et al, US 2006/0270600A1).
따라서, 전체 디프테리아 독소 혹은 CRM197을 대장균 내에서 발현시키는 것은 종래의 문헌으로부터 응용할 수 없는 연구 내용이다.
그러므로, CRM197 (및 그 유도체)를 비용 대비 고수율로 단시간 내에, 특히, 코리네박테리움에 대한 또다른 박테리아 숙주를 이용하여 제조하는 새로운 방법이 필요함은 명백하다.
[정의 및 약어]
CRM197: 가교반응물
DTx: 디프테리아 독소
DTA: 디프테리아 독소 A 도메인
DTB: 디프테리아 독소 B 도메인
EF-2: 제2 연장인자
SDS-PAGE: 황산도데실나트륨-폴리아크릴아미드겔 전기영동
IPTG: 이소프로필-b-D-티오갈락토피라노시드
본 발명은 상술한 문제점을, 대장균 내에서 CRM197의 과발현에 특이적인 합성 폴리누클레오티드 서열 (SEQ ID No. 1)을 통해 해결한다. 이 유전자는 태그 서열과 연계할 수 있으며 이에 따라 대장균 내에서 융해 단백질, CRM197-태그를 발현할 수 있도록 한다. 본 발명은 또한 SEQ ID No. 1 서열을 갖는 플라스미드 및 이 플라스미드의 도입으로 유전자 변형된 대장균의 균주에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 상술한 유전자 변형 대장균으로부터 생성된 재조합 융해 단백질 CRM197-태그에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상술한 바와 같이 유전자 변형된 대장균 내의 발현을 통한 N-말단 태그를 가진 재조합 단백질 CRM197 (도메인 A 및 B)의 제조방법, 또한 이의 정제방법에 관한 것이다. 상기 방법은 또한 자연형 단백질 CRM197를 수득하기 위해 상기 태그를 제거하는 공정을 수반한다.
본 발명은, 미생물 코리엔박테리움 디프테리아를 이용하는 대안으로서, CRM197 단백질 및 유사 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 그러므로 본 발명에 기술된 절차에 따라, 기초 연구 및 의학 치료 분야에서 관심 대상인 단백질을 대량으로 수득할 수 있다. 본 발명은 다음과 같은 장점을 보유한다: i) 미생물, 예를 들어, 산업상 및 약리학적 응용분야를 위한 이종 단백질 발현에 널리 이용되는 대장균 (Escherichia coli)을 사용하고; ii) 상기 대장균의 유전학성은 오랫동안 공지된 것으로서 수많은 대안적 체계 (벡터 및 균주)를 이용하여 발현할 수 있으며; (iii) 비병원성 미생물이고; iv) 고 생물체 수율로 신속히 성장하므로 상기 대장균을 사용하면 제조시간을 단축할 수 있다.
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도 1은 전기영동 실험 결과 (SDS-PAGE 10%)로서, 대장균의 각종 박테리아 배양물의 총 단백질 추출물로부터 수득한 SEQ ID No. 6 (CRM197-태그, 61 kDa)을 가진 단백질에 상응하는 밴드, 예컨대, BL21AI (레인 1, 2, 3, 4) 및 BL21(DE3) (레인 5, 6, 7, 8)을 도시한다. 여기서 배양물은 상이한 유도시간 (1h, 3h 및 하룻밤)을 적용한다. 레인 M: 표준 분자량 마커; 레인 1 및 5: 시료 유도 없음; 레인 2 및 6: 1시간 유도한 시료; 레인 3 및 7: 3시간 유도한 시료; 레인 4 및 8: 하룻밤 유도한 시료;
도 2는 불용성 성분 중에서 단백질 CRM197-태그의 가용화 과정에서 실시된 시험의 결과를 도시한다, 모든 시험은 6 내지 7M의 요소 성분을 함유한 용액을 이용하여 수행했다. 레인 1 및 2: 비유도 배양액(1) 및 유도 배양액(2)에서 얻은 가용성 성분; 레인 3; 표준 분자량 마커; 레인 4: 20℃ 에서의 가용화 용액 및 트윈 20; 레인 5: 20℃ 에서의 가용화 용액 및 트리톤 X-100; 레인 6: 20℃ 에서의 가용화 용액 및 환원제 (β-메르캅토에탄올 20mM); 레인 7: 20℃ 에서의 가용화 용액 및 SDS; 레인 8: 30℃ 에서의 가용화 용액 및 트리톤 X-100; 레인 9: 30℃ 에서의 가용화 용액 및 환원제를 각각 나타낸다;
도 3은 친화성 크로마토그래피 후 나온 다수 성분들의 전기영동 실험 결과를 도시한다. 레인 1: 6 내지 7M의 요소를 이용하여 가용화 한 시료, 프리컬럼; 레인 2: 결합 없이 컬럼을 통과한 것; 레인 3 및 4; 이미다졸 구배로 용리된 1차 성분; 레인 5 내지 10; 용리 피크점의 중심부에 상응하는 성분들을 각각 나타낸다;
도 4는 정제 단계가 가시적으로 확인되는 SDS-PAGE 겔 (10%)을 도시한다. 레인 M: 표준 분자량 마커; 레인 1: 가용성 성분; 레인 2: 요소에 용해된 총 추출물; 레인 3: 친화성 크로마토그래피 후의 시료; 레인 4: 겔 여과 크로마토그래피 후의 시료를 각각 나타낸다;
도 5는 엔테로키나제로 소화처리하기 전 및 후의 CRM197 시료의 전기영동 실험 결과를 도시한다. M: 표준 분자량 마커; 레인 1: 엔테로키나제로 처리하지 않은 CRM197-태그; 레인 2: 24℃에서 20시간 동안 소화시킨 CRM197-태그를 각각 나타내며 상기 시료는 환원제의 존재하에 비등 처리하였다. 가시화 된 밴드는 B 도메인, A 도메인 및 A-태그 도메인에 각각 상응한다 (a, b 및 c)
Giannini G. et al (1984)가 개시한 것으로서, 세포 밖으로 전달하기 위한 자연 신호서열 없이 전체 CRM197에 상응하는 서열은, 레토 소프트웨어를 이용하여 (Entelechon GmbH, 독일) 대장균내 발현에 최적인 폴리누클레오티드 서열 SEQ ID No. 1을 수득하는데 이용했다. 유전자 서열 SEQ ID No. 1은 또한 5' 및 3' 말단 양측에서 올리고누클레오티드 서열과 연결될 수 있으며 이 서열은 태그 폴리펩티드를 암호화 하여 세포질 안정성 및/또는 그 후, 각종 태그 펩티드에 대하여 고친화성인 수지 및 매트릭스를 이용하여, 정제반응을 촉진할 수 있다, 태그 폴리펩티드를 암호화 하는 누클레오티드 서열을 다수 공지되어 있다. 이들 중에서, 6, 8, 10 히스티딘 (H)(His-태그)를 암호화할 서열, 즉, MASMTGGQQMG (T7-태그), NDYKDDDDKC (FLAG-태그), WSHPQFEK (Strep-태그), YPYDVPDYA (HAT-태그), KETAAAKFERQHMDS (S-태그), 및 NEQKLISEEDLC (Myc-그) 등에 관한 누클레오티드 서열이 존재한다.
유전자 SEQ ID No. 1은 또한 예컨대, 티오레독신 (Trx),`글루타티온-S-트랜스페라제 (GST), 말토스 결합 단백질 (MBP), 셀룰로오스 결합 단백질 (CBP) 등을 암호화 하는 다른 태그 서열과도 연결될 수 있다.
상기 서열은 후속으로 상기 태그를 제거할 수 있는 적절한 효소에 의해 특정의 절단형 인지 서열과 연결될 수 있다. 엔테로키나제, 트롬빈, Xa 인자 혹은 퓨린을 적절히 이용하여 태그를 제거하며 상기 태그의 공지 및 널리 이용되는 절단형 펩티드 서열은 각각 DDDDK, LVPRGS, IE/DGR 및 RXXR 등이다.
한 바람직한 실시예에서, 유전자 SEQ ID No. 1은 폴리-히스티딘 태그를 암호화하는 폴리누클레오티드와 연결된다. 히스-태그 서열은 5' 및 3' 말단 양측에 부가될 수 있다.
다음은 히스-태그 펩티드 서열의 예이다: MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGR, MGSSHHHHHHSSG, MGSSHHHHHHSSGL, MGSGHHHHHH, MGHHHHHHHHHHSSG, MHHHHHHSSG, ALEHHHHHH, AALEHHHHHH.
특정의 바람직한 실시예는 SEQ ID No. 2로서, 이는 84개 누클레오티드로 된 서열이 SEQ ID No. 1 서열의 5' 말단에 부가된 것이며 6개의 히스티딘을 함유한 서열 MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGR 및 엔테로키나제 절단 서열 DDDDK을 암호화한다.
물론 바람직하게는, 개시 및 종결 코돈과 또한 적절한 서열, 특히, 클로닝을 목적으로 사용된 제한 효소의`인지 부위를 암호화하는 서열을 구비함으로써 SEQ ID No. 1 함유 서열이 완성될 수 있다.
SEQ ID No. 1 함유 유전자는 화학적 합성으로 제조되어 적절한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 특정 구현예에서, 합성 서열 SEQ ID No. 1 및 2를 조합법에 따라 합성 제조하여 SEQ ID No. 3 및 5를 각각 완성하였으며 이들 서열은 각각 SEQ ID No. 4 및 6 서열을 갖는 단백질을 암호화한다.
본 발명은 또한 SEQ ID No. 1 서열 및 바람직하게는, 제한 효소 및/또는 프로테아제를 위한 특이적 인지 부위와 태그를 갖는, 상기 서열의 유도체를 포함하는 발현 벡터 (플라스미드)에 관한 것이다.
pET 시리즈의 플라스미드를 바람직하게 이용하여 SEQ ID No. 1 함유의 합성 유전자를 클로닝한다. 특히, pET9a 벡터는 T7 파지의 RNA 폴리머라제 효소에 특이적인 프로모터 T7를 함유한다. 이 폴리머라제는 효능이 탁월하며 (박테리아성 RNA 폴리머라제보다 훨씬 우수함) 특이적이다 (즉 박테리아성 프로모터는 인지하지 않음). pET9a 플라스미드 이외에, 본 발명의 방법에 적절한 pET 시리즈의 기타 벡터들 (Novagen)은 예컨대; pET3a, pET3b, pET3c, pET5a, pET5b, pET5c, pET9b, pET9c, pET12a, pET12b, pET12c, pET17b 등이 있으며 일반적으로 이들 벡터는 모두 강한 파지 T7 프로모터를 구비한다 (예. pRSETA, B 및 C[Novagen], 또한 pTYB1, pTYB2, pTYB3 및 pTYB4 [New England Biolabs]).
클로닝을 목적으로 할 때, NdeI 및 BamHI 을 제한효소로 이용하는 것이 바람직하다.
결과로 나온 구조물을 사용하여 대장균 균주를 변환시킬 수 있다. 이러한 대장균(E. coli) 균주는 각종 유도체, 예컨대, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)(IPTG)나 아라비노스를 추출하는 또다른 유전자 발현 조절계를 특징으로 할 수 있다.
파지 T7의 효소 RNA 폴리머라제에 특이적인 프로모터 T7를 함유하는 pET형 플라스미드를 사용하는 경우, SEQ ID No. 1을 함유한 pET 구조물을 이용하여 변환하기 적합한 대장균 균주는 T7 RNA 폴리머라제 효소를 제공할 수 있는 균주를 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 대장균 B형, 예컨대, ER2566, ER2833, ER3011, ER3012, BL21AITM , BL21(DE3), BL21StarTM(DE3), BL21-Gold(DE3), BL21(DE3)pLys, C41(DE3), C43(DE3), BLR(DE3), B834(DE3 TunerTMDE3); 또는 K-12 유래의 대장균, 예컨대 HMS174(DE3), AD494(DE3), OrigamiTM (DE3), NovaBlue(DE3), RosettaTM (DE3) 등을 포함한다. 박테리아성 균주는 바람직하게는 전기천공으로 변환시키는 것이 바람직하나 그외 다른 공지의 방법도 마찬가지로 적절히 이용할 수 있다.
한 특정의 구현예에서, 각각 SEQ ID No. 1 및 2를 포함하는 SEQ ID No. 3 및 5가 구비된 유전자를 화학적 합성하여 특정의 pET 시리즈 플라스미드에 클로닝했다. 클로닝 및 발현에 이용되는 벡터는 pET9a (Novagen, Darmstadt, 독일)로서 이는 다음과 같은 특성을 확보한 복제원 pBR322를 특징으로 한다: 세포당 다수의 복제; 박테리아성 숙주 내부에 플라스미드를 유지하는 선택적 마커 (카나마이신 내성을 위한 kan 유전자); 클로닝에 적합한 다수의 제한 부위를 포함하는 폴리링커 영역; 및 CRM197의 과발현을 조절하기 위해 유도가능한 특이적 프로모터 등이 있다.
NdeI 및 BamHI 는 (폴리링커의) 플라스미드 안의 합성 유전자를 클로닝 하기 위한 제한효소로 이용되었으며 서열 형성으로 적절한 배향성 및 위치를 확인하였다. 결과로 얻은 구조물은 여러 대장균 균주를 전기천공을 통해 변환시키는데 이용했고 변환된 콜로니를 페트리 접시 상에서 선별했다 (카나마이신이 부가된 고체 LB 함유). pET9a 벡터에 클로닝된 CRM197 발현에 적절한 박테리아성 균주 중에서, 두개의 B형 대장균 유도체를 선택하며 예를 들어 BL21AI 및 BL21(DE3)이 선택되었다. 양측은 모두, 염색체에 집적된 파지 T7 RNA 폴리머라제를 암호화할 유전자의 복제물을 함유하며 유도성 프로모터에 의해 제어된다. 세포 내에서 이 효소는 프로모터 pT7의 하류에서 클로닝된 합성 유전자 CRM197 혹은 CRM197-태그의 전사를 활성화 할 수 있다. BL21AI 균주는 프로모터 ρBAD에 의해 제어된 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 유전체를 가지며 따라서, 아라비노스를 배양액에 첨가함으로써, 유도반응이 수행된다. BL21(DE3) 균주는 lac 프로모터에 의해 제어된 T7 RNA 폴리머라제 박테리아성 게놈을 함유하는 프로파지 1(DE3)의 박테리아성 게놈을 통합한 결과로 수득되었다. 후자의 경우, 발현계의 캐스캐이드(연쇄반응) 유도작용은 IPTG 즉 락토스 유사체에 의해 활성화된다. pET9a-CRM197 구조물을 이용하여 변환하기에 적합하고 또한 대상 단백질의 발현에 적절한 또다른 대장균 균주는 BL21(DE3)의 유도체, 예컨대 BL21StarTM(DE3), BL21-Gold(DE3), BL21(DE3)pLys, ER2566의 유도체 또한 모든 변형 B 혹은 게놈 내에서 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 유전자의 복제물을 함유하는 K-12 균주 등을 들 수 있다.
변환된 대장균 균주를 선택한 뒤, 상이한 배양액 및 유도 조건하에서 발현 시험을 실시했다. 예비시험의 목적은 박테리아성 단백질 (바람직하게는 최고 약 30 내지 40%)와 비교하여 고농도 단백질 CRM197을 수득할 수 있는 방법을 확인하는 것이다. 고려 대상인 변수는 배양액, 성장 온도 (30℃ 및 37℃), 유도체의 농도, 유도시간 등이었다. 사용된 배양액은 통상의 LB 이나, 고 생물체 생성을 가능하게 하는 기타 다른 농축 배양액도 사용할 수 있다. 재조합 단백질이 과발현되면 산물이 배양액 속으로 분비되며 (특이적 신호 서열이 있을 경우) 또는 세포질에 가용성 형태나 불용성 웅집체 형태로 축적될 수 있다. 단백질의 국소화는 후속의 정제공정에 영향을 미친다. SEQ ID No. 5 (히스-태그 함유)로 표시되는 합성 유전자의 전사로써 수득한 SEQ ID No. 6을 가진 융해 단백질 CRM197-태그의 경우, 단백질은 불용성 형태의 물체 (응집체)로 발현되고, 산업적 생산을 목적으로 한 편리한 방식으로 축적된다. 본 발명에서 기술한 발현 프로토콜은 상기 불용성 형태의 CRM197-태그 축적을 수반하고 또한 가용성 형태로 회수 및 탈변성하여 생물학적으로 활성 형태의 단백질을 수득하는데 수반되는 단계에 대해 개시한다. 더욱이, 본 발명은 두가지의 크로마토그래피 정제 단계와 또한 태그를 제거하기 위한 최종 단계를 포함한다. 가장 적절한 크로마토그래피법을 선택하는 것은, pI (등전점), 아미노산 조성 및 크기 등과 같은 CRM197-태그의 화학적-물리적 특성에 의존한다. 태그를 이용한 융해시 단백질은 태그에 대한 친화성이 큰 특정의 수지를 이용하여 정제할 수 있다 (컬럼 및 뱃치 양측 모두에서). 세포질내 단백질의 안정성을 증대하고 후속의 정제처리를 위하여 태그가 존재하는 것이 유용하다.
그러므로 한가지 측면에서, 본 발명은 SEQ ID No. 1 및 폴리펩티드 태그를 암호화할 단축 서열을 포함하는 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 재조합 융해 단백질 CRM197-태그에 관한 것이다,
SEQ ID No. 2를 포함하는 누클레오티드에 의해 암호화된 서열 SEQ ID No. 6의 재조합 융해 단백질이 특히 바람직하다.
상술한 재조합 융해 단백질 CRM197-태그는 의료 목적, 유방암, 난소암 및 전립선암 등의 종양 치료, 또는 죽상경화반의 감소 등에 응용할 수 있다. 상술한 융해 단백질은 또한,`뉴모코쿠스 헤모필루스 인플루엔자 (Pneumococcus haemophilus influenzae), 메닝고코쿠스 (Meningococcus), 스트헵토코쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 및 기타 병인성 박테리아 등에 대한 백신 용도의 공역 담체 등으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 CRM197-태그 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 이 방법은 상술한 바와 같이 변형된 대장균 균주를 이용하는 것을 포함한다.
상기 방법은:
(i) 상술한 바와 같이 대장균 배양을 통해 단백질의 적절히 유도된 발현;
(ii) (a) 20 내지 50 mM의 트리스-HCl, pH 7.5 내지 8.5, 100 내지 150 mM의 NaCl, 0.5 내지 1.5%의 세제 및 0.5 내지 1.5%의 프로테아제 저해제를 함유하는 완충액에 0 내지 5℃ 에서 5 내지 2.5 시간 동안 교반하에 용리하고,
(b) 고체 잔사 (펠릿)으로부터 상청액을 분리하고,
(c) 트리스-HCl 20 내지 50 mM의 트리스-HCl, 100 내지 150 mM의 NaCl, 0.5 내지 1.5%의 세제 및 5 내지 7 M의 요소를 함유하는 pH 7.5 내지 8.5의 가용화 완충액을 이용하여 10 내지 30℃에서 1.5 내지 2.5 시간 동안 교반하에 전술한 과정에서 얻은 고체 잔사를 처리하고, 및
(d) 고체 잔사로부터 상청액을 분리하며 이 상청액은 가용화된 CRM197-태그 단백질을 함유함으로써 이루어지는 추출 공정; 또한
(iii) (a) 친화성 크로마토그래피나 석출, 및
(b) 분자 배제 크로마토그래피법 (겔 여과) 혹은 음이온 교환 크로마토그래피법에 따른 상기 (ii) 단계로부터 수득한 단백질의 정제 및 탈변성 공정을 포함한다.
SEQ ID No. 2를 포함하는 플라스미드, 예컨대, SEQ ID No. 5를 이용해 대장균을 변형시킨 실시예에서, 재조합 단백질 CRM197-태그는 발현을 가능하게 하고 후속 정제를 촉진하는 6개의 히스티딘 함유의 태그 서열을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 따라 생성되었다. 상기 절차에 따라 수득한 CRM197 및 유사 단백질의 양은 발현 수준을 통제하는 변수들 (배양액, 성장온도, 유도시간 등)을 조절함으로써 변화시킬 수 있다. 적절한 플라스미드를 사용함으로써 BL21AI 혹은 BL21(DE3) 대장균 균주를 변환한 경우, 최고의 발현 조건은 37℃에서의 유도처리 3시간후 (도 1) 달성되며 변환된 균주 BL21AI가 바람직하다. 이러한 조건에서, 발현 수율은 40% 정도로 높은 수준이고 CRM197-태그는 용리 및 가용성 성분의 제거후 남은 불용성 성분의 약 80% 수준에 상응한다. 청구항에 특징적으로, 최적의 성장, 용리 및 회수 조건을 채택한 제조 공정에서, CRM197-태그 발현 수율은 0.5 내지 1 g/L 정도이다.
SEQ ID No. 5를 이용하는 경우, SEQ ID No. 6을 발현하는 재조합 CRM197-태그는 2가 금속 이온 (구리, 니켈 등)에 대한 고친화성을 갖는 6개의 히스티딘이 함유된 28개 아미노산의 태그를 갖는다. 이 특징은, 불용성으로 발현되는 융해 단백질의 정제를 신속히 하기 위해 개발된 것이다, 친화성 크로마토그래피는 또한, 불용성 성분으로부터 CRM197-태그를 수용하기에 필요한 변성화제를 제거하는데 이용할 수 있다. 이 경우, 제거 처리는 점진적으로 행하며 (2단계 역상-구배법) 이에 따라 정확한 단백질 구성을 신속히 채택할 수 있다.
관심 대상의 단백질과 결합된 상태의 오염 단백질은 분자 측면에서 서로 상이한 경우 겔 여과 크로마토그래피를 통해 서로 분리할 수 있다. 이와 별도로, CRM197의 pI 값을 알아내어 (5.8 내지 5.9) 이온교환 크로마토그래피를 통해 1차 정제 과정을 수행할 수 있다. 본 발명은 따라서 친화성 크로마토그로피의 후속으로 두가지 상이한 정제방법을 적절히 수반할 수 있다. 재조합 단백질의 최종 수율 및 순도 수준은 어떤 방식을 응용하거나 서로 비슷한 수준이다. 브래드포드 분석법에 따라 단백질을 정량하며 10% 아크릴아미드겔 (SDS-PAGE)에서 가시화 처리한다.
본 발명에 개시된 프로토콜에 따라 수득한 CRM197-태그 단백질 발현 수율은 250±50 mg/L의 배양액 (LB 배지가 담긴 비등급형 플라스크)의 값이다. 상술한 바와 같이, 발효기에서 행해지는 실제의 산업 공정에 있어서, 적절한 성장 배지 및 조건을 취하면 수율이 더 증가한다. 강조할 점은, 본 발명에서 기술한 용리 및 추출방법이 더욱 단순하고 저렴하면서도; 한편으로, 특정 완충액/시약 혹은 특수 시험장비 (세포 용리를 위한 초음파 발생기 등)를 필요로 하지 않고, 실제의 공업적 방법에 적합한 프로토콜 측면을 고려하여, 각각의 공정단계를 설계하였다.
마지막으로, 본 발명은 두가지 목적 즉, CRM197을 발현시키고`안정성 증가 및 정제 반응 촉진 등을 가능하게 하는 목적을 가진 태그를 제거하는 방법에 관한 것이다.
그러므로 본 발명은 CRM197 제조방법에 관한 것이며 이 방법은 상술한 바와 같이 변형된 대장균 균주를 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기의 CRM197 제조방법은 바람직하게는 상술한 바와 같이 융해 단백질 CRM197-태그의 발현 및 후속으로 상기 태그를 적절한 효소에 소화시켜 제거하는 것을 포함한다.
SEQ ID No. 6의 서열을 가진 CRM197-태그의 경우, 태그 제거에 적절한 효소는 엔테로키나제이며 이의 소화반응은 바람직하게는 20 내지 25℃ 에서 18 내지 24시간 동안 또한 바람직하게는 10 내지 20 mM의 트리스-HCl, pH 7.5 내지 8.5, 40 내지 60 mM의 NaCl, 1.5 내지 2.5 mM의 CaCl2 및, 중량 단위로, 0.01 내지 0.03 중량% (w/w) 농도의 효소를 포함하는 완충액 내에서 수행된다.
태그를 제거한 뒤 태그 없는 단백질을 바람직하게는 친화성 크로마토그래피법으로 정제한다.
본 발명에 따른 방법으로 제조한 CRM197 재조합 단백질인 SEQ ID No. 7은 구조와 기능 측면에서 종래의 방법에 따라 제조한 CRM197와 동일하며, 이는 자연형으로 수득되고 따라서 활성적이며 공지의 분야에 이용될 수 있다.
본 발명은 다음과 같은 구체적인 실시구현에 따라 더욱 용이하게 이해할 수 있다.
[서열목록]
SEQ ID No. 1 - 대장균내 발현에 최적화 된 CRM197를 암호화하는 합성 서열
GGTGCCGAT GACGTGGTTG ACTCTTCCAA AAGCTTCGTC ATGGAAAACT TCAGCTCCTA TCACGGCACT AAACCGGGTT ATGTCGACAG CATCCAGAAA GGCATCCAGA AACCGAAATC TGGCACTCAG GGTAACTATG ACGACGACTG GAAAGAGTTC TACTCTACCG ACAACAAATA CGACGCGGCT GGTTATTCTG TGGACAACGA AAACCCGCTG TCTGGTAAAG CTGGTGGTGT TGTTAAAGTG ACCTACCCGG GTCTGACCAA AGTTCTGGCT CTGAAAGTGG ACAACGCCGA AACCATCAAA AAAGAACTGG GTCTGTCTCT GACCGAACCG CTGATGGAAC AGGTAGGTAC CGAGGAATTC ATCAAACGTT TTGGTGATGG TGCGTCCCGT GTTGTACTGT CTCTGCCATT TGCCGAAGGT TCTAGCTCTG TCGAGTACAT CAACAACTGG GAGCAGGCCA AAGCTCTGTC TGTGGAACTG GAAATCAACT TCGAGACCCG TGGTAAACGT GGTCAGGACG CAATGTATGA ATACATGGCA CAGGCTTGCG CGGGTAACCG TGTACGTCGT TCTGTAGGTT CTTCCCTGTC TTGCATCAAC CTGGACTGGG ATGTCATCCG TGACAAAACC AAAACCAAAA TCGAGTCCCT GAAAGAGCAC GGTCCGATCA AAAACAAAAT GAGCGAATCT CCGAACAAAA CGGTCTCTGA GGAAAAAGCG AAACAGTACC TGGAAGAATT CCATCAGACC GCCCTGGAAC ACCCGGAACT GTCTGAACTG AAAACCGTTA CCGGTACTAA CCCGGTTTTC GCAGGTGCTA ACTACGCAGC GTGGGCGGTT AACGTAGCCC AGGTAATCGA TTCCGAAACC GCAGACAACC TGGAAAAAAC GACTGCGGCT CTGTCTATTC TGCCGGGTAT TGGTAGCGTG ATGGGTATTG CAGATGGTGC AGTTCACCAC AACACGGAAG AAATCGTTGC GCAGTCTATC GCTCTGTCTT CTCTGATGGT AGCACAGGCG ATCCCGCTGG TTGGTGAACT GGTTGACATT GGCTTCGCGG CCTACAACTT CGTTGAATCC ATCATCAACC TGTTCCAGGT TGTGCACAAC TCTTACAACC GTCCAGCTTA CTCTCCGGGT CACAAAACCC AGCCGTTCCT GCACGACGGT TATGCGGTTT CTTGGAACAC CGTTGAAGAC AGCATCATCC GTACTGGTTT CCAGGGTGAA TCTGGCCACG ACATCAAAAT CACTGCTGAA AACACCCCGC TGCCGATCGC AGGTGTTCTC CTGCCAACTA TTCCGGGTAA ACTGGACGTG AACAAATCCA AAACGCACAT CTCCGTGAAC GGTCGTAAAA TCCGCATGCG TTGTCGTGCG ATTGATGGTG ACGTTACTTT CTGTCGTCCG AAATCTCCGG TCTACGTAGG TAACGGTGTA CATGCTAACC TCCATGTAGC GTTCCACCGT TCTTCTTCCG AGAAAATCCA CTCCAACGAG ATCTCTAGCG ACTCTATCGG TGTTCTGGGT TACCAGAAAA CCGTTGACCA CACCAAAGTG AACTCCAAAC TCAGCCTGTT CTTCGAAATC AAATCT
SEQ ID No. 2 - 대장균내 CRM197-HisTag를 암호화하는 합성 서열
ATG GGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGAC TGGTGGTCAG CAGATGGGTC GT GATGACGA TGACAAA GGT GCCGATGACG TGGTTGACTC TTCCAAAAGC TTCGTCATGG AAAACTTCAG CTCCTATCAC GGCACTAAAC CGGGTTATGT CGACAGCATC CAGAAAGGCA TCCAGAAACC GAAATCTGGC ACTCAGGGTA ACTATGACGA CGACTGGAAA GAGTTCTACT CTACCGACAA CAAATACGAC GCGGCTGGTT ATTCTGTGGA CAACGAAAAC CCGCTGTCTG GTAAAGCTGG TGGTGTTGTT AAAGTGACCT ACCCGGGTCT GACCAAAGTT CTGGCTCTGA AAGTGGACAA CGCCGAAACC ATCAAAAAAG AACTGGGTCT GTCTCTGACC GAACCGCTGA TGGAACAGGT AGGTACCGAG GAATTCATCA AACGTTTTGG TGATGGTGCG TCCCGTGTTG TACTGTCTCT GCCATTTGCC GAAGGTTCTA GCTCTGTCGA GTACATCAAC AACTGGGAGC AGGCCAAAGC TCTGTCTGTG GAACTGGAAA TCAACTTCGA GACCCGTGGT AAACGTGGTC AGGACGCAAT GTATGAATAC ATGGCACAGG CTTGCGCGGG TAACCGTGTA CGTCGTTCTG TAGGTTCTTC CCTGTCTTGC ATCAACCTGG ACTGGGATGT CATCCGTGAC AAAACCAAAA CCAAAATCGA GTCCCTGAAA GAGCACGGTC CGATCAAAAA CAAAATGAGC GAATCTCCGA ACAAAACGGT CTCTGAGGAA AAAGCGAAAC AGTACCTGGA AGAATTCCAT CAGACCGCCC TGGAACACCC GGAACTGTCT GAACTGAAAA CCGTTACCGG TACTAACCCG GTTTTCGCAG GTGCTAACTA CGCAGCGTGG GCGGTTAACG TAGCCCAGGT AATCGATTCC GAAACCGCAG ACAACCTGGA AAAAACGACT GCGGCTCTGT CTATTCTGCC GGGTATTGGT AGCGTGATGG GTATTGCAGA TGGTGCAGTT CACCACAACA CGGAAGAAAT CGTTGCGCAG TCTATCGCTC TGTCTTCTCT GATGGTAGCA CAGGCGATCC CGCTGGTTGG TGAACTGGTT GACATTGGCT TCGCGGCCTA CAACTTCGTT GAATCCATCA TCAACCTGTT CCAGGTTGTG CACAACTCTT ACAACCGTCC AGCTTACTCT CCGGGTCACA AAACCCAGCC GTTCCTGCAC GACGGTTATG CGGTTTCTTG GAACACCGTT GAAGACAGCA TCATCCGTAC TGGTTTCCAG GGTGAATCTG GCCACGACAT CAAAATCACT GCTGAAAACA CCCCGCTGCC GATCGCAGGT GTTCTCCTGC CAACTATTCC GGGTAAACTG GACGTGAACA AATCCAAAAC GCACATCTCC GTGAACGGTC GTAAAATCCG CATGCGTTGT CGTGCGATTG ATGGTGACGT TACTTTCTGT CGTCCGAAAT CTCCGGTCTA CGTAGGTAAC GGTGTACATG CTAACCTCCA TGTAGCGTTC CACCGTTCTT CTTCCGAGAA AATCCACTCC AACGAGATCT CTAGCGACTC TATCGGTGTT CTGGGTTACC AGAAAACCGT TGACCACACC AAAGTGAACT CCAAACTCAG CCTGTTCTTC GAAATCAAAT CT
밑줄 글씨: 6개의 히스티딘을 함유하는 태그 펩티드를 암호화하는 서열
이탤릭체 및 밑줄 글씨 : 엔테로키나제 (DDDDK)에 의해 인지된 5aa를 암호화하는 15개의 누클레오티드
SEQ ID No. 3 - 대장균내 CRM197 단백질 발현을 위한 합성 서열
CAT ATG GGT GCCGATGACG TGGTTGACTC TTCCAAAAGC TTCGTCATGG AAAACTTCAG CTCCTATCAC GGCACTAAAC CGGGTTATGT CGAiSAGCATC CAGAAAGGCA TCCAGAAACC GAAATCTGGC ACTCAGGGTA ACTATGACGA CGACTGGAAA GAGTTCTACT CTACCGACAA CAAATACSGAC GCGGCTGGTT ATTCTGTGGA CAACGAAAAC CCGCTGTCTG GTAAAGCTGG TGGTGTTGTT AAAGTGACCT ACCCGGGTCT SGACCAAAGTT CTGGCTCTGA AAGTGGACAA CGCCGAAACC ATCAAAAAAG AACTGGGTCT GTCTCTGACC GAACCGCTGA TGGAACAGGT AGGSTACCGAG GAATTCATCA AACGTTTTGG TGATGGTGCG TCCCGTGTTG TACTGTCTCT GCCATTTGCC GAAGGTTCTA GCTCTGTCGA GTACATSCAAC AACTGGGAGC AGGCCAAAGC TCTGTCTGTG GAACTGGAAA TCAACTTCGA GACCCGTGGT AAACGTGGTC AGGACGCAAT GTATGAATAC ATGGCACAGG CTTGCGCGGG TAACCGTGTA CGTCGTTCTG TAGGTTCTTC CCTGTCTTGC ATCAACCTGG ACTGGGATGT CATCCGTGAC AAAACCAAAA CCAAAATCGA GTCCCTGAAA GAGCACGGTC CGATCAAAAA CAAAATGAGC GAATCTCCGA ACAAAACGGT CTCTGAGGAA AAAGCGAAAC AGTACCTGGA AGAATTCCAT CAGACCGCCC TGGAACACCC GGAACTGTCT GAACTGAAAA CCGTTACCGG TACTAACCCG GTTTTCGCAG GTGCTAACTA CGCAGCGTGG GCGGTTAACG TAGCCCAGGT AATCGATTCC GAAACCGCAG ACAACCTGGA AAAAACGACT GCGGCTCTGT CTATTCTGCC GGGTATTGGT AGCGTGATGG GTATTGCAGA TGGTGCAGTT CACCACAACA CGGAAGAAAT CGTTGCGCAG TCTATCGCTC TGTCTTCTCT GATGGTAGCA CAGGCGATCC CGCTGGTTGG TGAACTGGTT GACATTGGCT TCGCGGCCTA CAACTTCGTT GAATCCATCA TCAACCTGTT CCAGGTTGTG CACAACTCTT ACAACCGTCC AGCTTACTCT CCGGGTCACA AAACCCAGCC GTTCCTGCAC GACGGTTATG CGGTTTCTTG GAACACCGTT GAAGACAGCA TCATCCGTAC TGGTTTCCAG GGTGAATCTG GCCACGACAT CAAAATCACT GCTGAAAACA CCCCGCTGCC GATCGCAGGT GTTCTCCTGC CAACTATTCC GGGTAAACTG GACGTGAACA AATCCAAAAC GCACATCTCC GTGAACGGTC GTAAAATCCG CATGCGTTGT CGTGCGATTG ATGGTGACGT TACTTTCTGT CGTCCGAAAT CTCCGGTCTA CGTAGGTAAC GGTGTACATG CTAACCTCCA TGTAGCGTTC CACCGTTCTT CTTCCGAGAA AATCCACTCC AACGAGATCT CTAGCGACTC TATCGGTGTT CTGGGTTACC AGAAAACCGT TGACCACACC AAAGTGAACT CCAAACTCAG CCTGTTCTTC GAAATCAAAT CTTAATGA GG ATCC
굵은 글씨: the NdeI (CATATG) 및 BamHI (GGATCC) 제한부위
밑줄 글씨: 개시 (ATG) 및 종결 (TAA TGA) 코돈
SEQ ID No. 4 - SEQ ID No. 3 으로부터 나온 CRM197 단백질 서열
MGADDVVDSS KSFVMENFSS YHGTKPGYVD SIQKGIQKPK SGTQGNYDDD WKEFYSTDNK YDAAGYSVDN ENPLSGKAGG VVKVTYPGLT KVLALKVDNA ETIKKELGLS LTEPLMEQVG TEEFIKRFGD GASRVVLSLP FAEGSSSVEY INNWEQAKAL SVELEINFET RGKRGQDAMY EYMAQACAGN RVRRSVGSSL SCINLDWDVI RDKTKTKIES LKEHGPIKNK MSESPNKTVS EEKAKQYLEE FHQTALEHPE LSELKTVTGT NPVFAGANYA AWAVNVAQVI DSETADNLEK TTAALSILPG IGSVMGIADG AVHHNTEEIV AQSIALSSLM VAQAIPLVGE LVDIGFAAYN FVESIINLFQ VVHNSYNRPA YSPGHKTQPF LHDGYAVSWN TVEDSIIRTG FQGESGHDIK ITAENTPLPI AGVLLPTIPG KLDVNKSKTH ISVNGRKIRM RCRAIDGDVT FCRPKSPVYV GNGVHANLHV AFHRSSSEKI HSNEISSDSI GVLGYQKTVD HTKVNSKLSL FFEIKS
SEQ ID No. 5 - 대장균내 융해 단백질 CRM197-HisTag 발현을 위한 합성 서열
CAT ATG GGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGAC TGGTGGTCAG CAGATGGGTC GT GATGACGA TGACAAA GGT GCCGATGACG TGGTTGACTC TTCCAAAAGC TTCGTCATGG AAAACTTCAG CTCCTATCAC GGCACTAAAC CGGGTTATGT CGACAGCATC CAGAAAGGCA TCCAGAAACC GAAATCTGGC ACTCAGGGTA ACTATGACGA CGACTGGAAA GAGTTCTACT CTACCGACAA CAAATACGAC GCGGCTGGTT ATTCTGTGGA CAACGAAAAC CCGCTGTCTG GTAAAGCTGG TGGTGTTGTT AAAGTGACCT ACCCGGGTCT GACCAAAGTT CTGGCTCTGA AAGTGGACAA CGCCGAAACC ATCAAAAAAG AACTGGGTCT GTCTCTGACC GAACCGCTGA TGGAACAGGT AGGTACCGAG GAATTCATCA AACGTTTTGG TGATGGTGCG TCCCGTGTTG TACTGTCTCT GCCATTTGCC GAAGGTTCTA GCTCTGTCGA GTACATCAAC AACTGGGAGC AGGCCAAAGC TCTGTCTGTG GAACTGGAAA TCAACTTCGA GACCCGTGGT AAACGTGGTC AGGACGCAAT GTATGAATAC ATGGCACAGG CTTGCGCGGG TAACCGTGTA CGTCGTTCTG TAGGTTCTTC CCTGTCTTGC ATCAACCTGG ACTGGGATGT CATCCGTGAC AAAACCAAAA CCAAAATCGA GTCCCTGAAA GAGCACGGTC CGATCAAAAA CAAAATGAGC GAATCTCCGA ACAAAACGGT CTCTGAGGAA AAAGCGAAAC AGTACCTGGA AGAATTCCAT CAGACCGCCC TGGAACACCC GGAACTGTCT GAACTGAAAA CCGTTACCGG TACTAACCCG GTTTTCGCAG GTGCTAACTA CGCAGCGTGG GCGGTTAACG TAGCCCAGGT AATCGATTCC GAAACCGCAG ACAACCTGGA AAAAACGACT GCGGCTCTGT CTATTCTGCC GGGTATTGGT AGCGTGATGG GTATTGCAGA TGGTGCAGTT CACCACAACA CGGAAGAAAT CGTTGCGCAG TCTATCGCTC TGTCTTCTCT GATGGTAGCA CAGGCGATCC CGCTGGTTGG TGAACTGGTT GACATTGGCT TCGCGGCCTA CAACTTCGTT GAATCCATCA TCAACCTGTT CCAGGTTGTG CACAACTCTT ACAACCGTCC AGCTTACTCT CCGGGTCACA AAACCCAGCC GTTCCTGCAC GACGGTTATG CGGTTTCTTG GAACACCGTT GAAGACAGCA TCATCCGTAC TGGTTTCCAG GGTGAATCTG GCCACGACAT CAAAATCACT GCTGAAAACA CCCCGCTGCC GATCGCAGGT GTTCTCCTGC CAACTATTCC GGGTAAACTG GACGTGAACA AATCCAAAAC GCACATCTCC GTGAACGGTC GTAAAATCCG CATGCGTTGT CGTGCGATTG ATGGTGACGT TACTTTCTGT CGTCCGAAAT CTCCGGTCTA CGTAGGTAAC GGTGTACATG CTAACCTCCA TGTAGCGTTC CACCGTTCTT CTTCCGAGAA AATCCACTCC AACGAGATCT CTAGCGACTC TATCGGTGTT CTGGGTTACC AGAAAACCGT TGACCACACC AAAGTGAACT CCAAACTCAG CCTGTTCTTC GAAATCAAAT CTTAATGA GG ATCC
굵은 글씨: NdeI (CATATG) 및 BamHI (GGATCC) 제한 부위
밑줄 글씨: 6개의 히스티딘을 함유한 태그 펩티드를 암호화하는 84개의 누클레오티드:
ATG GGTG GTTCTCATCA TCACCATCAT CACGGCATGG CATCTATGAC
TGGTGGTCAG CAGATGGGTC GT GATGACGA TGACAAA
이탤릭체 및 밑줄 글씨; 엔테로키나제 (DDDDK)가 인지한 5 aa를 암호화하는 15개의 누클레오티드..
개시 코돈: ATG'
종결 코돈: TAA TGA
SEQ ID No. 6 - SEQ ID No. 5 로부터 나온 CRM197-HisTag 단백질 서열
MGGSHHHHHH GMASMTGGQQ MGRDDDDK GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS
굵은 글씨: 6개의 히스티딘 (H) 및 엔테로키나제 (DDDDK) 절단 부위를 함유하는 태그 서열 (28 아미노산)
SEQ ID No. 7 - SEQ ID No. 6 으로부터 나온 태그의 제거후의 CRM197 단백질 서열
GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS
실시예
실시예 1 - SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4 유전자의 합성 및 pET9a-CRM197-태그 구조물의 제조
합성 유전자는 올리고누클레오티드를 약 27 내지 43 bp로 (오버랩 영역 10 내지 15 bp 포함) 다수 결합시켜 제조했다. 이 방법을 통상 "조합법" 이라 한다. 특히, 각종 합성 올리고누클레오티드는 말단에서 포스포릴화되어 결합 반응이 이루어지도록 하고 그 뒤 Taq DNA 리가제 효소의 존재하에 등몰량으로 혼합되었다. 상기 효소는 고온 (45 내지 65℃)에서 활성이며, 한 올리고누클레오티드의 제5 위치에 있는 인산염과 또다른 올리고누클레오티드의 제3 위치에 있는 히드록실기 간의 포스포디에스테르 결합의 형성에 대해 촉매 작용한다.
다음, 결합 산물은 PCR 증폭 및, NdeI and BamHI 효소를 이용하여, pET9a 벡터에서 클로닝되었다. 증폭에 이용되는 프라이머는 다음과 같았다:
CRM197 fwd: 5' ggaattCATATGGGTGCCGATGACGTGGTTGA 3'
CRM197 rev: 5' cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAG 3'
CRM197-His fwd: 5' ggaattCATATGGGTGGTTCTCATCATCACCATCA 3'
CRM197-His rev: 5' cgGGATCCTCATTAAGATTTGATTTCGAAGAACAGG 3'
상기 PCR (30회 사이클)은 다음과 같은 양으로 표준 프로토콜에 따라 수행되었다:
3 ㎕ 결합 산물
5 ㎕ dNTPs (4 mM)
5 ㎕ 1 ThermoPol 반응 완충액 10X (New England Biolabs)
2 ㎕ fwd_프라이머 (50 pmol)
2 ㎕ rev_primer (50 pmol)
0.5 ㎕ 벤트 DNA 폴리머라제 (New England Biolabs), 및
32.5 ㎕ 의`물을 첨가하여 총 부피를 50㎕로`만들었다.
SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2를 포함하는 PCR 산물을 정제하여 프라이머, SEQ ID No. 3 and 5 서열의 유전자를 수득하였다.
이와 동시에, 1㎕ 의 pET9a 플라스미드를 동일한 조건에서 (37℃, 2시간) 동일한 효소로 소화시켰다. 마지막으로, 인서트(삽입체)를 1:1 내지 3:1의 벡터비로 이용하여 16℃에서 12 내지 16시간 동안 수행하였다. 상기 반응의 분취물을 이용하여 수용 박테리아 세포를 변환시켰다.
실시예 2 - 박테리아성 균주 및 배양액
BL21AI (Invitrogen) 및 BL21(DE3) 대장균 균주 (Novagen)를 CRM197-태그 (SEQ ID No. 5)의 발현을 위한 숙주로 사용했다.
일반적으로 이용되는 액상 및 고체 (배양) 배지는 클래식 LB 이다 (Luria-Bertani; Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). 적절히 처리된 숙주 균주는 10 ng pET9a-CRM197-태그 구조물 (실시예 1에서 제조됨)을 이용하여 변환시켰다. 표준 프로토콜에 따라 적절한 1 mm 큐벳을 이용하여 1.8 kV (Gene Pulser II, Bio-Rad) 펄스로 전기천공을 수행했다.
전기천공된 세포는 SOC 배지에 넣어 37℃에서 교반하에 45분간 성장시킨 뒤 (Sambrook et alm, 1989), 다시 고체 LB 배지에 옮기고 여기에 카나마이신을 첨가하여 (최종 농도 50 ㎍/mL) 형질전환체를 선택했다. 배양은 일반적으로 호기성 조건에서 37℃ 및 교반하에 수행했다 (180 rpm).
실시예 3 - 발현
13 mM 아라비노스 (BL21AI 균주용) 및 1 mM IPTG (BL21[DE3] 균주)를 배지에 가하여 CRM197-태그, 즉, SEQ ID No. 5의 발현을 유도했다. 변환된 균주를 선택한 뒤, 소량의 용적으로 발현 시험을 실시했다s(10 mL). 단일 콜로니를 1 mL의 LB 배지 (카나마이신 함유)에서 성장시키고 지수성장 단계에 도달할 때까지 새로운 배지로 적절히 교환했다 (분광광도계로 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 확인함). 유도물질을 약 0.5 내지 0.6 OD의 흡광도에서 첨가하여 다양한 시간 (1시간, 3시간 및 15 시간)에 배양을 유도했다. 원심분리하여 세포를 수거한 후 (15분간 4000g) 결과로 나온 세포 펠릿을 용리시켜 전체 단백질을 탈리 방출했다. 용리작용은, 초기에는 시료를 5분간 시료 완충액의 존재하에 (Bio-Rad) 가열하고 각 시료를 20 mL씩 SDS-PAGE 전기영동법으로 (10% 아크릴아미드 이용) 각각 분리했다. 겔은`코마씨 브릴리언트 블루(Comassie brilliant blue) 용액으로 염색하여 단백질 띠를 가시화 했고 또한 CRM197-태그에 상응하는 과발현 띠 (약 61 kDa; 도 1)를 확인할 수 있었다. 상기 띠는 총 단백질의 약`40%가 상기 아크릴아미드 겔에서 가시화 됨을 보여준다.
관심 대상인 단백질의 발현을 확인한 후, 더 많은 양의 배양액 (500 mL)을 이용하고 또한 최적의 조건 (13 mM 아라비노스를 이용하여 3시간 동안 유도함) 하에 후속의 시험을 시행했다.
실시예 4 - 추출
초음파기의 사용 여부와 관계없이 세포를 용리하기 위해, 공지의 조성물로 된 각종 용리액을 조제하고 그 효능을 평가했다. 또한 시료에 대한 용액의 부피비를 변화시켰다.``용리 완충액의 성분들은 다음과 같다: 트리스-HCl, pH 8 (20 내지 50 mM 범위의 농도), NaCl (100 내지 150 mM 범위의 농도), 0.5 내지 1.5% (트리톤 X-100, SDS, 트윈 20) 및 프로테아제 저해제 (예, PMSF 1 mM) 등이었다,
또한 β-메르캅토에탄올이나 DTT (10 내지 50 mM) 같은 환원제의 효과를 평가하였다. 세포 펠릿은 얼음 상에서 2시간 동안 교반하에 용리하였다. 상청액 (가용성 단백질 성분에 해당함)을 원심분리하고 (10,000g, 30분) SDS-PAGE 겔에서 분석하였다 (도 2). 재조합 단백질은 상기 성분 중에서 육안으로 확인할 수 있으며, 이는 응집체 형태로 축적되어 용리후 수득된 펠릿 내에 클러스터화 되어 있기 때문이다. 본 발명은 따라서 가용화 용액을 사용하여 불용성 성분으로부터 CRM197-태그를 회수하는 것을 포함한다 (도 2). 이 용액의 성분들은 다음과 같다: 트리스-HCl, pH 8 (20 내지 50 mM 범위의 농도), NaCl (100 내지 150 mM 범위의 농도), 0.5 내지 1.5%의 세제 (트리톤 X-100, SDS, 트윈 20), 및 6 내지 7 M의 요소 등이다. 응집체를 함유하는 펠릿은 20 내지 30℃ 범위의 온도에서 2시간 동안 교반과 함께 가용화 처리했다. 상청액은 원심분리에 따라 회수 및 SDS-PAGE 겔에서 분석하였다. 여기서 CRM197-태그에 해당하는 띠가 육안으로 확인되었다 (도 2). 요소로 가용화 처리된 시료에서, CRM197-태그에 관련된 띠는 겔에 함유된 단백질의 약 50%에 필적한다.
실시예 5 - 정제
요소로 가용화 처리한 시료 (4℃에서 저장)는, 예비정제 및 요소 제거라는 두가지 목적을 위해 친화성 크로마토그래피법으로 처리했으며 (HiTrap Chelating, GE Healthcare), 이에 따라 컬럼 내의 단백질이 변성하게 된다. 또다른 적절한 변성 방법은 석출로서, 농도가 저하된 요소 (6 내지 7 M 에서 0 M 으로)를 함유한 용액을 이용한다. 크로마토그래피 컬럼은 제조회사의 지침에 따라 내부조절 및 처리하였다. 6-히스티딘 태그를 함유한 CRM197 단백질의 경우, 컬럼은 니켈 이온 (NiSO4, 0.1M)과 함께 착체를 형성하였다. 이 절차는 다음과 같은 3가지 공정을 포함한다: (1) 세제 제거; (2) 2단계 역상구배법을 이용하여 요소를 제거; 또한 (3) 이미다졸 구배 (0 내지 500 mM)로 용출처리. 시료는 저유속 조건하에 (0.5 mL/min) 주입 및 변성하고 이와 더불어 다른 공정들은 유속이 1 mL/min 정도에서 완료되었다. 수득된 최종 성분들은 트리스-HCl pH 8, NaCl, 이미다졸로 된 용액내에 CRM197 단백질을 함유했다 (태그와 함께 융해됨)(도 3은 크로마토그래피 성분들 중 일부를 도시한다).
본 발명은 후속으로 겔 여과 크로마토그래피에 따른 정제공정을 더 포함한다 (Superdex 200 컬럼, GE Healthcare). 상기 공정을 완료하기에 앞서, 한외여과법으로 시료를 농축하고 (Amicon, Millipore) 탈염처리하여 이미다졸을 제거했다 (HiTrap 탈염 컬럼, GE Healthcare). Superdex 컬럼을 50 mM의 트리스-HCl, pH 8, 150 mM의 NaCl을 함유하는 완충액으로 컨디셔닝 처리했다. 해당 성분들을 SDS-PAGE 겔에서 분석하고 순수한 CRM197-태그를 함유한 용액을 채워 농축했다. 도 4는 다양한 CRM197-태그 정제공정을 도시한다.
분자 배제 크로마토그래피법의 또다른 대안으로서, CRM197-태그는 이온교환 크로마토그래피법으로 정제할 수 있다. 이 경우, pH 8의 적절한 완충액으로 컨디셔닝 처리한 음이온 교환 수지를 이용하는 것이 바람직하다.
실시예 6 - 태그 제거
정제에 필요한 6개의 히스티딘 이외에도, 상기 태그 서열 (MGGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDDDDK)은 또한 특이적 프로테아제인 엔테로키나제 (New Englnd BioLabs)에 인지되는 절단 부위, 즉, DDDDK를 포함한다. 순수 재조합 단백질을 태그 (SEQ ID No. 6) 없이 수득하기 위하여, CRM197-태그 (SEQ ID No. 5)를 엔테로키나제로 배양하였다. 22 내지 24℃에서 18 내지 24시간 또한 20 mM의 트리스-HCl, pH 8, 50 mM의 NaCl 및 2 mM의 CaCl2로 이루어진 완충액 내에서, 0.02% (w/w)에 해당하는 양의 효소를 이용하여 소화 반응을 수행했다. 도 5는 소화된 CRM197이 육안으로 확인되는 (레인 2) SDS-PAGE 겔을 도시하며 이는 두 도메인 A 및 B으로 분리된다 (시료는 상기 두 도메인 사이의 디설파이드 브릿지를 붕괴하는 환원제와 함께 비등 처리했다). 프로토콜에는 친화성 크로마토그래피에 의해 태그로부터 CRM197 (태그 없음, SEQ ID No. 6)를 분리하는 후속의 공정을 포함한다 (동일한 컬럼 내에서, 상술한 CRM197-태그의 정제에 사용된 것과 동일한 수지를 이용하여 수행함).
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[서열목록]
서열목록제출서에 첨부하여 제출

Claims (10)

  1. SEQ ID No. 1 서열을 가진 폴리누클레오티드.
  2. 청구항 1에 있어서,
    태그 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 누클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  3. 청구항 2에 있어서,
    태그 서열은 후속으로 태그를 제거할 수 있는 적절한 효소를 이용하여 인지를 위한 적절한 절단 서열과 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 항에 따른 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  5. 대장균 (Escherichia coli) 종류에 속하고 또한 청구항 4에 따른 발현 벡터를 포함하는 유전자 변형된 미생물.
  6. 청구항 2 또는 3에 따른 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 재조합 융해 단백질 CRM197-태그.
  7. 청구항 6에 따른 CRM197-태그 단백질을 제조하는 방법으로서, 이 방법은 청구항 5에 개시된 바와 같이 유전자 변형된 대장균 (Escherichia coli)에서 배양을 통해 발현하는 것을 포함하는 방법.
  8. 청구항 5에 개시된 바와 같이 유전자 변형된 대장균 ((Escherichia coli)에에서 발현을 통해 CRM197 단백질을 제조하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    청구항 6에 따른 단백질을 중간체로 포함하는 것인 제조방법.
  10. 청구항 6에 있어서,
    의료적 용도 혹은 약제학적 조성물의 담체로서 사용되는 것인 재조합 융해 단백질.
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