CN108004254A - 疏水蛋白mHGFI基因及表达的蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了疏水蛋白mHGFI基因及表达的蛋白及应用，疏水蛋白mHGFI基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2表示。本发明采用大肠杆菌的表达系统，利用基因工程的方法对原有的灰树花菌(Grifola frondosa)HGFI基因中半胱氨酸进行突变为丝氨酸，获得高表达、表达的疏水蛋白溶解性好以及生产周期短的疏水蛋白mHGFI基因，实验表明，1L的TB培养基可以得到2mg目的蛋白mHGFI。疏水蛋白mHGFI基因表达的蛋白具有与真菌疏水蛋白HGFI相近的双亲性及应用性质。仍然可以作为乳化剂使小油滴在水中稳定存在，并且可以作为分散剂分散石墨烯及碳纳米管，解决疏水性材料修饰问题。

Description

疏水蛋白mHGFI基因及表达的蛋白及应用

技术领域

本发明属于蛋白的基因工程及其性质研究，具体地涉及疏水蛋白突变体生产工艺及其应用。

背景技术

疏水蛋白是由丝状真菌表达的一组小的(100-150个氨基酸)富含半胱氨酸的蛋白质。疏水蛋白是真菌独特的蛋白质，不会出现在其他生物体中。它们以其在物体表面上形成疏水性(防水)涂层的能力而闻名，于1991年首次被发现和分离，并且这些疏水蛋白都在氨基酸链保守位置存在8个半胱氨酸。这类蛋白质具有很高的表面活性，能够通过自组装在两相界面处形成两性蛋白膜，从而改变原介质表面的亲/疏水性。同时疏水蛋白具有广泛的应用性质，疏水蛋白可以作为洗洁产品的成分，改善食品对抗相变的能力并形成稳定的泡沫,还可以用于促进土壤中的污染物降解和应用在石油泄漏后的回收石油过程中；真菌疏水蛋白膜在不同条件下，如宽范围的pH值非常稳定，且可有效防止电极表面的氧化，使亲水性的电活性材料能够结合至电极表面。基于这些优势，真菌疏水蛋白可以作为一种电极基质或作为固定电活性分子至电极表面的材料。

根据亲水模式和理化特性的差异，可将其分为两类：I型和II型。I类单层含有与淀粉样原纤维相同的核心结构，并且对刚果红和硫代黄素T呈阳性。由于I类疏水蛋白形成的单层具有高度有序的结构，单层组装涉及单体的大的结构重排,其自我装配形成的蛋白膜具有高度的不溶解性。即使在100℃水浴时也难溶解于2％SDS(十二烷基硫酸钠)，仅在过氧甲酸和三氟乙酸(TFA)等极少数有机溶剂中解聚和溶解，所以从菌丝上提取I型疏水蛋白(例如HGFI)时还必须要使用强氧化性酸三氟乙酸。同时由于单层组装涉及单体的大的结构重排，对于I型疏水蛋白在两相界面形成双亲性蛋白膜要比II疏水蛋白(例如HFBI，HFBII)有更好的稳定程度。

目前对与疏水蛋白的生产主要利用真菌表达系统(例如毕赤酵母)，但是利用真菌表达系统由于甲醇诱导等步骤使得真菌生产周期长，尤其对于生产疏水蛋白HGFI(Hydrophobin I型)的平皿菌丝，生长周期最多达三周。并且菌丝产量较低，每克干菌丝中仅能提取到HGFI1mg左右。对于原核系统而言(例如大肠杆菌)操作简单，表达量高，但疏水蛋白的表达过程中由于蛋白折叠修饰等过程使得形成包涵体，进而涉及到包涵体的变性和复性操作，更加大了生产成本及生产周期，使得疏水蛋白的大规模生产纯化存在困难

因此，亟需一种可以高表达、表达的疏水蛋白溶解性好以及生产周期短的表达I型疏水蛋白mHGFI的基因。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种疏水蛋白mHGFI基因。

本发明的第二个目的是提供疏水蛋白mHGFI基因表达的I型疏水蛋白mHGFI。

本发明的第三个目的是提供疏水蛋白mHGFI的应用。

本发明的技术方案概述如下：

疏水蛋白mHGFI基因，该基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2表示。

疏水蛋白mHGFI基因表达的蛋白，该蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.4表示。

疏水蛋白mHGFI基因表达的蛋白作为修饰疏水性物质的应用。

本发明的优点：

本发明采用大肠杆菌的表达系统，利用基因工程的方法对原有的灰树花菌(Grifolafrondosa)HGFI基因中半胱氨酸进行突变为丝氨酸，获得高表达、表达的疏水蛋白溶解性好以及生产周期短的疏水蛋白mHGFI基因，实验表明，1L的TB培养基可以得到2mg目的蛋白mHGFI。疏水蛋白mHGFI基因表达的蛋白具有与真菌疏水蛋白HGFI相近的双亲性及应用性质。仍然可以作为乳化剂使小油滴在水中稳定存在，并且可以作为分散剂分散石墨烯及碳纳米管，解决疏水性材料修饰问题。

附图说明

图1为mHGFI蛋白凝胶色谱层析检测实验。

图2为mHGFI蛋白SDS-page胶检测实验。

图3为HGFI及mHGFI蛋白乳化实验。

图4为HGFI及mHGFI蛋白分散碳纳米管材料实验。

图5为HGFI及mHGFI蛋白分散石墨烯材料实验。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

pET-28a为市售。

实验材料：

(1)LB培养基：配制每1L培养基，在1L的一次蒸馏水中加入蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶解后，121℃、0.1MPa灭菌20min。配置固体LB培养基时向培养基内补加1.5％的琼脂粉。

(2)TB培养基：配制每900mL培养基，在900mL的一次蒸馏水中加入蛋白胨12g，酵母粉24g，NaCl 8g，甘油4ml，溶解于2L锥形瓶，121℃、0.1MPa灭菌20min。用90ml去离子水溶解2.31g KH2PO4和12.54g K 2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至100ml，121℃、0.1MPa灭菌20min。等待其两者温度降低到常温，在超净台中将两者混匀至上述2L锥形瓶。

(3)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)

30％丙烯酰胺溶液(100mL)：将30g丙烯酰胺与0.8g的甲叉双丙烯酰胺溶解在100mL的双蒸水中，溶解后放置于4℃棕色瓶内。

1.5M Tris-HCl pH＝8.8缓冲液(1L)：称取181.71g Tris溶解在800mL纯水中，调pH至8.8，定容至1L，室温保存。

0.5M Tris-HCl pH＝6.8缓冲液(500mL)：称取60.57g Tris溶解在400mL纯水中，调pH至6.8，定容至500mL，室温保存。

10％十二烷基硫酸钠(10％SDS)溶液(50mL)：称取5g SDS，加纯水至50mL，室温保存。

10％过硫酸铵(10％APS)溶液(20mL)：称取2g过硫酸铵，加纯水至20mL，每管500μL分装，-20℃保存备用。

表1 12％SDS-PAGE分离胶配制(10mL)

表2SDS-PAGE浓缩胶配制(5mL)

(4)5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(5L)：称取75.5g Tris，470g甘氨酸，25g SDS，加纯水溶解，定容至5L。

(5)6×蛋白上样缓冲液：0.35M pH＝6.8Tris-HCl，10.28％W/V SDS，36％甘油，5％β-巯基乙醇，0.012g/mL溴酚蓝，1mL每管分装，-20℃保存备用。

(6)SDS-PAGE染色液(1L)：考马斯亮蓝R-250 5g，无水乙醇450mL，冰醋酸100mL，水450mL，混匀备用。

(7)SDS-PAGE脱色液：水、无水乙醇、冰醋酸按照6:3:1的比例混合均匀，备用。

(8)1M DTT：首先配制pH5.2、0.01M的乙酸钠溶液20mL，称取3.09g DTT，将其溶解于乙酸钠溶液中，过滤除菌，每管分装成1mL，保存于-20℃备用。

(9)卡那霉素(100mg/mL)：量取250mL双蒸水，121℃高压灭菌20min，25g卡那霉素加入双蒸水中，混匀，每管850μL分装，保存于-20℃。使用时将其稀释1000倍，终浓度为100μg/mL。

(10)异丙基硫代-β-D-半乳糖苷IPTG(1M)：IPTG分子量为238.31，以5g/瓶规格为例。配制1M的IPTG需要的双蒸水的量为21mL，于超净工作台中，将5g的IPTG粉末全部溶解在121℃高压灭菌20min的21mL双蒸水中，混合均匀，每管1000μL分装，保存于-80℃。

(11)5×PBS：700mM NaCl，13.5mM KCl，50mM Na₂HPO₄，9mM KH₂PO₄(pH 7.3)，0.22μm滤膜抽滤，4℃保存备用。

(12)悬菌buffer：1×PBS，0.22μm滤膜抽滤，4℃保存备用。

(13)A液：20mM Tris-HCl pH8.0，0.22μm滤膜抽滤，4℃保存备用。

(14)B液：20mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl，0.22μm滤膜抽滤，4℃保存备用。

实施例1pET-28a-mHGFI的构建：

(1)通过化学合成方法将原有的灰树花菌(Grifola frondosa)丝HGFI基因(SEQID NO.1)中所有的半胱氨酸突变为丝氨酸，得到mHGFI基因(SEQ ID NO.2)，将mHGFI基因插到pMV中得到含mHGFI基因的pMV-mHGFI质粒模板，所述pMV-mHGFI的核苷酸序列是SEQIDNO.3所示。

(2)从pMV-mHGFI核苷酸序列上剪下如SEQ ID NO.2所示的mHGFI基因：

a)酶切体系

b)条件

i.目的基因酶切1h，37℃。

ii.质粒酶切了2h，37℃。

iii.酶切后80℃灭活5min。

(3)将如SEQ ID NO.2所示的mHGFI基因连接在pET-28a中,得到pET-28a-mHGFI；得到pET-28a-mHGFI经测序，验证结果表明突变成功，HGFI突变体基因为mHGFI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(4)将质粒pET-28a-mHGFI转入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中并涂布于LB(含50μg/mL的Kana)平板。37℃培养8h后，挑单菌落放入含有1μL/mL Kana的LB培养液中培养4h，取出600μL菌液加入400μL 50％甘油中，放入-80℃冰箱中保存。

得到mHGFI表达菌株。

(5)将mHGFI的表达菌株进行传代培养，诱导其产生如SEQ ID NO.4所示目的蛋白(mHGFI)，并分离提纯目的蛋白。

(6)取5μL pET-28a-mHGF表达菌株于含有5mL LB培养液的试管中，加入5μL Kana(50mg/ml)。摇床中37℃，220rpm培养10h。将菌液倒入含有1L TB培养液的2L锥形瓶中，加入500μL Kana(50mg/ml)。37℃，220rpm在摇床中培养5h，待菌液变浑浊后16℃，220rpm降温1h，然后加入700μL IPTG(1mol/L)诱导大肠杆菌产生目的蛋白。16℃，220rpm过夜培养12h。将菌液4000rpm，16℃离心20min，弃上清，将沉淀的大肠杆菌用药匙转移到烧杯中。并用1×PBS重悬。

(6)将大肠杆菌用高压破菌机破碎，再用超声破菌机破碎15min，用高速离心机4℃，18000rpm离心30min，取上清倒入镍柱，孵育1.5h后加入300mL咪唑20mM洗去杂蛋白，用20mL咪唑350mM洗脱目的蛋白。

(7)用3kDa的浓缩管盛装洗脱下来的蛋白质溶液，在离心机中4℃，3400rpm离心，并用pH8.0的缓冲液进行换液。得到含50mM氯化钠的tris缓冲体系的5ml蛋白溶液。

(8)5ml蛋白溶液经过Akta HiTrap Q阴离子交换层析系统纯化，收集洗脱峰至3kD的浓缩管，再次浓缩至500μl，经过Akta Hiload 75凝胶过滤层析系统纯化得到蛋白性质均一的溶液。结果如图1，横坐标为A液流经柱子的体积ml，纵坐标为215nm吸收值，在67.7ml出现一个高度对称的单峰，其出峰位置与分子量吻合。

通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳对收集的蛋白液体进行，按照收集的出峰位置，依次在上样孔中注入16μL的蛋白样品，电压设为140V，进行浓缩胶和分离胶的电泳，当显示溴酚蓝指示剂跑到分离胶的底部时，停止电泳；电泳结束后，将胶置于干净的盒子中，用双蒸水冲洗，然后加入考马斯亮蓝染液，染色10min，染色完毕后，然后加入双蒸水，置于微波炉中，中火微波15-20s，清洗数次，直至退去凝胶的考马斯亮蓝蓝色背景，观察到清晰的蛋白质条带；

(9)由电泳图(图2)可知：经离子交换和凝胶过滤系统纯化后，在10kDa-15kDa之间，出现一条纯净的特异性蛋白条带，其分子量与疏水蛋白mHGFI的分子量相吻合，表明mHGFI疏水蛋白纯化成功。

(10)再次将收集洗脱后的蛋白溶液进行浓缩至500μl进行脱盐处理得到水溶液下的目的蛋白，再次浓缩到500μl装置5ml塑料管，放置冷冻干燥机干燥8h，称重。1L的TB培养基可以得到2mg目的蛋白mHGFI。

(11)称取1mg野生型HGFI蛋白(SEQ ID NO.5)和mHGFI，用灭菌的ddH2O配置成1mg/ml的蛋白溶液(避免任何形式的气泡与震荡，防止蛋白聚集)。水浴超声30s，若发现蛋白溶液有白色膜状物质，说明蛋白聚集。

蛋白形成母液后，长时间不用可放于-80℃冻存，短时间使用可放于4℃保存，并用封口膜封住。

(12)分别配制HGFI及mHGFI溶液0.1mg/ml，加入食品级豆油，使得最终油水混合物比例为8：100，同时取超纯水及0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的油水混合物作为对照，经过2min涡旋混合后，在超声清洗仪中最大功率条件下超声30min，将超声处理后的油水混合物在室温放置观察3小时及3天后分散稳定情况，对不同蛋白溶液形成的乳状液进行拍照，结果如图3所示。

通过乳化结果可知，观察3小时及3天后的油水界面，HGFI及mHGFI分散液仍处于稳定的混合均一状态，然而对照组水及BSA均出现明显的分层状态。说明突变后的mHGFI与野生型的HGFI保持同样的改变油水界面性质的能力，将疏水性界面包装后稳定分散在亲水环境中。

(13)分别称量碳纳米管及石墨烯0.33mg、1mg，蛋白溶液稀释为1ml，浓度为0.2mg/ml，将碳纳米管与石墨烯分别溶解于上述稀释的溶液中至1.5ml EP管中，并取水溶解的碳纳米管及石墨烯作为对照。冰浴超声6小时，并且每个20min上下颠倒，使之混匀。静置观察3小时及3天后分散稳定情况，结果如图4(碳纳米管)、图5(石墨烯)所示。

通过分散结果可知，观察3小时及3天后的分散体系，HGFI及mHGFI仍处于稳定的混合均一状态，并且溶液呈现稳定柔滑状态，然而对照组水已经在3小时出现明显的分层状态。说明突变后的mHGFI与野生型的HGFI保持同样的改变材料等疏水性物质界面性质的能力，将疏水性界面包装后稳定分散在亲水环境中。

序列表

<110> 天津大学

<120> 疏水蛋白mHGFI基因及表达的蛋白及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 252

<212> DNA

<213> 灰树花菌(Grifola frondosa)

<400> 1

caacagtgca ccactggcca gctccagtgc tgcgagtcta cctccactgc gaacgacccg 60

gccaccagcg agctcctcgg tctgatcggc gtcgtcatct ctgatgtcga cgcactcgtc 120

ggtctcacct gctcgccgat ctccgtcatc ggcgttggca gtggctctgc gtgcaccgcg 180

aacccagtgt gctgtgactc gtcgcccatt ggtggactcg tctccatcgg atgtgttccg 240

gttaacgtct ga 252

<210> 2

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caacagtcta ccactggcca gctccagtct tctgagtcta cctccactgc gaacgacccg 60

gccaccagcg agctcctcgg tctgatcggc gtcgtcatct ctgatgtcga cgcactcgtc 120

ggtctcacct cttcgccgat ctccgtcatc ggcgttggca gtggctctgc gtctaccgcg 180

aacccagtgt cttctgactc gtcgcccatt ggtggactcg tctccatcgg atctgttccg 240

gttaacgtct ga 252

<210> 3

<211> 2359

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 60

gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 120

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taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 1140

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gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 1320

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ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 1500

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ggacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 1620

gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 1680

agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca tcgctacagg 1740

catcgtggta tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 1800

aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgcg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 1860

gatcgttgtc agaagtaagt tggccgccgt gttatcactc atggttatgg cagcactaca 1920

taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 1980

caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 2040

ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 2100

ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 2160

tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 2220

aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 2280

actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 2340

catatttgaa tgtatttag 2359

<210> 4

<211> 83

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Gln Ser Thr Thr Gly Gln Leu Gln Ser Ser Glu Ser Thr Ser Thr

1 5 10 15

Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val

20 25 30

Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Ser Ser Pro Ile Ser

35 40 45

Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Ser Thr Ala Asn Pro Val Ser

50 55 60

Ser Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Ser Val Pro

65 70 75 80

Val Asn Val

<210> 5

<211> 83

<212> PRT

<213> 灰树花菌(Grifola frondosa)

<400> 5

Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr

1 5 10 15

Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val

20 25 30

Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser

35 40 45

Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys

50 55 60

Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro

65 70 75 80

Val Asn Val

Claims (3)

1.疏水蛋白mHGFI基因，其特征是所述基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2表示。

2.疏水蛋白mHGFI基因表达的蛋白，其特征是所述蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.4表示。

3.疏水蛋白mHGFI基因表达的蛋白作为修饰疏水性物质的应用。