CN107022568B - 哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统，所述系统包括表达含有非天然氨基酸的蛋白质的表达载体，所述非天然氨基酸由密码子UAG编码以及含有古甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰‑tRNA合成酶(PylRS)基因的载体，所述系统中还包括包含经突变的eRF1的细胞系。此外，还提供了利用该系统制备定点突变的蛋白的方法。

Description

哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及在哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统以及在哺乳动物细胞中表达蛋白质(例如抗体，糖基化蛋白)的非天然氨基酸的高效多点插入方法。
背景技术
1.基因密码子扩展技术
蛋白质在生物体内承担了高度多样性的功能，包括维持细胞结构稳定性，催化体内化学反应，通过信号传导调节细胞反应，通过免疫系统靶向外源分子等等。蛋白质仅仅用20种天然氨基酸执行了一系列显著功能，仅有的20种天然氨基酸携有的功能基团数量有限，无法满足化学、生物科学研究对蛋白质结构和功能的需求。目前，化学修饰、基因定点突变等蛋白质修饰方法都依赖于20种天然氨基酸本身；其用于修饰改造的功能基团仅有巯基、羟基、羧基、氨基等几种有限基团，功能化方式十分有限，而且很难做到蛋白质的定点修饰。
近年来遗传密码扩展技术发展迅速，利用琥珀终止密码子UAG为有义编码子，通过引入相应的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最终可以将带有特殊功能团的非天然氨基酸定点引入蛋白质中，已成为蛋白质修饰的有力工具。到目前为止，这一技术已经将上百种非天然氨基酸成功地定点表达在蛋白质表面,涉及的非天然 氨基酸包括含有叠氮、炔基、酮基、醛基、烯基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等多样性功能基团，可进行多种生物正交反应，如：点击化学、光敏感、糖基化、光交联等反应。
2.基因密码子扩展技术在真核细胞中的发展
基因密码子扩展技术起源于大肠杆菌E.coli中，将其拓展到真核表达体系中面临的一个挑战是tRNA的转录和加工在原核和真核细胞中存在差异，主要的区别是，E.colitRNA的转录是通过tRNA基因上游的启动子，而真核细胞tRNA基因的转录是通过tRNA序列内部的启动元件A-和B-box，而在E.coli tRNA中加入A-和B-box将会破坏tRNA的活性，因此一大难题就是如何在真核细胞中有效表达原核正交的tRNA，使其正确参与真核细胞的蛋白质翻译过程。第三类RNA聚合酶III启动子(type-3Pol III)的使用可以有效解决以上难题,type-3Pol III负责转录U6,7SK,hY4,hY5和H1核内小RNA。该类启动子转录序列依靠的是启动子自身的启动元件，不需要任何内源性转录元件(例如A-和B-box)存在于下游的编码序列中。以人类U6核内小RNA的启动子为例，启动元件由启动子TATA框的上游、近端序列元素(PSE)和末端序列元素(DSE)组成。另外，type-3Pol III能够转录出具有正确5’末端的tRNA，不需要进一步的转录后加工。因此，目前国际上利用U6/H1启动子转录原核tRNA，在多种真核细胞中，如HEK293细胞，Hela细胞和初级神经元细胞，均证明有效。
3.基因密码子扩展技术在蛋白质药物开发中的应用
非天然氨基酸修饰蛋白应用前景广泛，例如在体蛋白质功能探 针，通过光交联捕捉蛋白-蛋白瞬间作用，协助鉴定结构和新蛋白的组学研究。此外，该技术在蛋白质纯化，材料科学，诊断学，药物筛选，绿色能源等领域也有实际应用价值。我们将突出介绍其在蛋白质药物开发中的应用。
2014年，蛋白质药物市场市值已经超过1610.5亿美元。蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗；与以往的小分子药物相比，蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、靶向性强、有利于临床应用的特点，已成为医药产品中的重要组成部分。除蛋白质本身很强的治疗效果外，针对蛋白质的修饰(如聚合物或者药物偶联)可以改善或者增加新的药代动力学性质。一系列的蛋白质偶联药物已经批准临床使用，包括PEG化修饰蛋白，抗体偶联药物(ADC)，多糖类蛋白结合疫苗。第一代蛋白质偶联技术的缺陷在于对偶联位点的不可控性，所以传统的修饰方法是非定点非定量的，并不适合大规模生产制备的质量控制。因此，现在的研究聚焦于对修饰位点的精确导向。非天然氨基酸修饰技术位点可控的优点，使其很快应用于该领域。以抗体偶联药物为例，将非天然氨基酸引入到抗体的任意位置，在ADC的构建上有以下优势：非天然氨基酸只插入到毒素偶联的特定位置，不影响其他氨基酸残基和二硫键；每个抗体偶联的毒素数目可以被有效调整，而不牺牲同质产品的产率。目前，国际上Allozyme和Ambrx公司都已经在致力于将该技术应用于开发治疗肿瘤的ADC。
4.基因密码子扩展技术应用的瓶颈
利用终止密码子编码非天然氨基酸最大的瓶颈是全长蛋白质产率，通常，大肠杆菌表达系统产量仅在1-10mg/L，而哺乳动物细胞表达体系则更低，这极大限制了该项技术在工业生产中的应用。产率有限的一个主要原因是释放因子(RF)会与正交tRNA竞争性识别终止密码子，导致蛋白质翻译提前终止。目前，在大肠杆菌体系有以下几种内源性方法用于提高非天然氨基酸插入效率：1.减少释放因子RF的竞争作用。在原核生物中，RF1负责识别终止密码子UAA和UAG，RF2负责识别终止密码子UAA和UGA，RF3协助两者的功能。2011年，王磊等人(Johnson,D.et al.Nature chemical biology,2011，7：779-786)敲除了大肠杆菌中编码RF1的基因prfA，由于RF1基因被移除会导致大肠杆菌死亡，于是他们过表达了RF2来维持基因工程改造细菌生存，最后获得了一株能高效多点插入UAA的工程菌。但是，在酵母和哺乳动物细胞体系敲除RF1是不可行的，因为真核生物只有一个释放因子eRF1识别三个终止密码子。2.通过文库筛选，进化出正交的核糖体或结构优化的翻译延长因子EF-Tu，使细胞内翻译相关因子与正交tRNA/氨酰tRNA合成酶匹配。但是文库筛选的方法很难直接转移到哺乳动物细胞中。因此，如何实现哺乳动物表达体系的高效多点插入非天然氨基酸依旧是个国际难题。
面对现在哺乳动物细胞体系非天然氨基酸插入效率低的问题，提高非天然氨基酸的插入效率，实现其在哺乳动物细胞中的高效多点插入，将有效促进基因密码子扩展技术在蛋白质药物开发中的应用。
下面以绿色荧光蛋白GFP和HCV病毒包膜E2蛋白为例说明本 发明的技术背景，但是下述内容无论如何都不能理解为其是现有技术的承认，也无论无何都不能认为本发明的仅仅适用于GFP和E2蛋白。
(1)GFP
绿色荧光蛋白GFP是最常用的报告基因，也是指示非天然氨基酸插入的有力工具，其由238个氨基酸组成，其基因序列如SEQ ID NO:1，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。所示。
(2)HCV E2蛋白
丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致，据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。在我国健康人群抗HCV阳性率为0.7％～3.1％，约3800万人。HCV为一有包膜呈球形的正单链RNA病毒。HCV基因组为单股正链RNA，全长约9500碱基。基因组两侧分别为5’和3’非编码区，中间为开放读码框(ORF)，分为结构区和非结构区。结构区包括核心蛋白区(C)和两个包膜蛋白区(E1、E2)，分别编码核心蛋白和包膜蛋白。其中，HCV包膜E2蛋白介导HCV与靶细胞的结合,是涉及HCV感染性的最关键蛋白，也是抗HCV病毒药物开发和疫苗研制的一个重要靶点。E2是一个高度糖基化蛋白，含糖基化位点约11个，因此，只适合在真核细胞(如哺乳动物细胞)表达体系中表达。其基因序列如SEQ ID NO:2所示。氨基酸序列如SEQ IDNO：15所示。
发明内容:
发明人经过对现有技术的思考和研究，利用古甲烷球菌的 tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(mm PylRS)对和绿色荧光蛋白GFP/HCV病毒包膜E2蛋白为模式说明本发明的技术手段。发明人通过优化正交tRNA的表达量和条件性减少释放因子eRF1的竞争作用，来促进终止密码子UAG被tRNA识别。优化正交tRNA的表达量主要是优化tRNA的启动子和优化tRNA/氨酰tRNA合成酶的比例；条件性减少释放因子eRF1主要是利用慢病毒转导技术可诱导过表达对UAG识别能力降低的突变型eRF1蛋白。最终我们实现了非天然氨基酸在哺乳动物细胞中的高效多点插入。
相比于其它方法，本发明的优点可体现在如下中的一个或几个：
1.获得了一个能更好启动原核tRNA的真核启动子。
2.获得了一个高效插入非天然氨基酸的载体。
3.获得了一个经多西环素诱导后，能提高非天然氨基酸插入效率的稳定细胞系。
4.可以在蛋白质任意多个位点引入非天然氨基酸，从而创造可以定点多点特异性修饰的蛋白；
5.利用非天然氨基酸上特有的活性基团，可以实现高效，特异性的修饰目的；
具体地，在本发明的一个具体的实施方案中，提供了引入非天然氨基酸的目的蛋白(例如GFP/E2蛋白)，主要通过四个步骤：(1)构建含有在选定的位点上具有琥珀密码子突变的编码目的蛋白基因的载体，(2)构建并获得pXH-N3质粒，(3)构建并获得稳定细胞系HEK293-XH,(4)将步骤(1)与(2)在HEK293-XH 宿主细胞中共表达，且在培养基中加入多西环素和非天然氨基酸，最后从细胞中获得引入突变的目的蛋白(例如突变型GFP/E2)。
该突变系统的原理在于：突变型的tRNAPyl/PylRS满足下列关系：(1)：突变型的tRNAPyl不能利用宿主细胞的赖氨酰tRNA合成酶，只能被突变型的PylRS酰化；(2)：突变型的PylRS只能酰化tRNAPyl，不能酰化其它tRNA，因此，突变型tRNAPyl和PylRS之间的关系是正交性的，即突变型的PylRS只能酰化突变型tRNAPyl，同时突变型的tRNAPyl只能被突变型的PylRS酰化，也就是说同一质粒中的突变型的tRNAPyl和PylRS是绝对的相互专一的。这种正交性的酶并且是只有这种酶可以把非天然氨基酸酰化到这种正交的tRNA上，并且只能酰化这种tRNA，而不能酰化其它的tRNA。获得的正交赖氨酰tRNA合酶/tRNA系统，使非天然氨基酸(例如NAEK)与琥珀密码子相对应，从而将非天然氨基酸定点引入到目的蛋白中。
更为具体地，本发明提供了：
1.评价非天然氨基酸插入效率的定量体系。要精确评价非天然氨基酸的插入效率，就需要一套能定量测量终止密码子通读效率的系统。发明人把海肾荧光素酶基因renilla和萤火虫荧光素酶基因firefly融合克隆到pGL4载体上，在两者的连接片段上引入琥珀密码子UAG，得到了双报告载体pGL4-2luc-TAG，其序列如SEQ ID NO:3所示。
类似的，将琥珀密码子替换成赭石密码子(UAA)，得到了评价终止密码子UAA通读效率的双报告载体pGL4-2luc-TAA；将琥珀密码子替换成蛋白石密码子(UGA)，得到了评价终止密码子UGA通读效率的双报告载体pGL4-2luc-TGA。
2.骨架载体pXH,该载体专门用于携带正交赖氨酰tRNA合酶/tRNA，该载体是由PUC19载体改造获得的穿梭载体，具有能在真核细胞中复制、分子量小、自带多克隆位点等优点，其序列如SEQ ID NO:6所示。
3.真核7sk(人源)启动子用于转录tRNA，7sk启动子也是type-3Pol III中的一种，通过比较，我们发现其转录tRNA的效率优于国际上常用的U6或H1启动子。7sk启动子序列如SEQ ID NO:7所示。
4.辅助载体pXH-N3，其序列如SEQ ID NO:8所示。.
其可以较高水平的在哺乳动物细胞中(例如293T细胞)插入非天然氨基酸NAEK。其原理在于：经过优化tRNA启动子后，进一步确定串联tRNApyl的个数，该质粒携带4个串联重复的，以7sk为启动子的突变型tRNAPyl，该tRNAPyl只能识别并携带NAEK这种结构的非天然氨基酸；该质粒同时还携带有只能酰化该tRNAPyl，而不能酰化其它tRNA的突变型PylRS。其中，突变型的tRNAPyl序列如SEQ ID NO:9所示。突变型的PylRS序列如SEQ ID NO:10所示。
5.表达载体pcDNA3.1-GFP/E2,其携带了编码突变型目的蛋白(例如GFP/E2蛋白)的核酸分子。示例性地，SEQ ID NO：1编码的蛋白的第Y39位/K101位/E132位/E172位，或编码SEQ ID NO：2编码的蛋白的第Q26位/M73位/W86位/D150位，或其他对活性及稳定性影响较小的位点的一个或多个氨基酸的密码子被突变为琥珀密码子。
6.表达载体pcDNA3.1-eRF1,其携带了编码突变型人源真核释放因子eRF1的核酸分子。示例性地，所述核酸分子特定位点的某 个氨基酸密码子被突变为其它氨基酸密码子。其中，人源真核释放因子eRF1序列如SEQ ID NO:11所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
7.能提高非天然氨基酸插入效率的eRF1E55R突变体，其中eRF第55位的谷氨酸Glu被突变为精氨酸Arg，尤其是将SEQ ID NO：16所示的真核释放因子eRF1第55位的谷氨酸Glu突变为精氨酸Arg。通过比较发现，将55位的Glu突变成Arg，选择性增加琥珀密码子的通读效率，而较少影响赭石密码子和蛋白石密码子的通读效果最理想，因此，该突变体有利于插入非天然氨基酸。
8.双病毒载体pSD400和pSD31-TetO，其中，pSD400的序列如SEQ ID NO:12所示。pSD31-TetO的序列如SEQ ID NO:13所示。
其组合使用可实现目的蛋白的可诱导表达，其原理利用了目前应用最多的是四环素调节系统，即Tet-on及Tet-off系统。这一系统是根据大肠埃希氏菌属TNl0的四环素抗性操纵子的结构特点构建的，这一抗性操纵子包含一个四环素抑制蛋白(TetR)、一个特异性的DNA结合位点及四环素操纵序列(TetO)。将TetO引入到启动子上，无四环素存在的条件下，TetR呈二聚体状态并与TetO结合，转录不能起始。四环素(tetracycline)或四环素类似物-多西环素(doxycycline)可以与TetR结合使其构象发生改变，从而导致TetR与TetO分离，转录可以起始。将四环素可调控系统与慢病毒载体相结合，使基因的条件性表达和基因敲除都成为可能。其中，pSD400载体携带TetR基因，pSD31-TetO载体携带含有TetO序列的CMV启动子，用于表达目的蛋白(例如eRF1E55R突变体)。
9.稳定细胞系HEK293-XH,该细胞系由双病毒转导获得，通过多西环素可以可诱导表达eRF1E55R突变体，其会和细胞内源性野生型eRF1竞争结合eRF3，从而减少了eRF1-eRF3复合物的形成，降低了eRF1和正交tRNA竞争性识别琥珀密码子的作用。因此，只需要在该稳定细胞系中加入多西环素，就可以提高非天然氨基酸插入效率。
10.定点突变的蛋白，例如GFP/E2，其4个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸为含有叠氮基团的非天然氨基酸Lys-azido(NAEK),后说明均以此非天然氨基酸为例。
Figure BDA0000919329320000101
本系统也适用于含有光交联基团的非天然氨基酸DiZPK。
Figure BDA0000919329320000102
示例性地，所述突变位点选自SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2编码的蛋白中任意一个或多个位点上的氨基酸。优选地，所述突变位点选自：SEQ ID NO:1所示核酸编码的蛋白的第Tyr39位/Lys101位/Glu132位/Glu172位等对活性影响较小的位点；或SEQ ID NO：2所示核酸编码的蛋白的第Gln26位/Met73位/Trp86位/Asp150位等对活性影响较小的位点。
11.定点突变的目的蛋白，其与示于突变前目的蛋白的氨基酸的序列的区别在于第N位的氨基酸被突变为NAEK，所述突变氨基酸在蛋白中的连接方式如下式所示：
Figure BDA0000919329320000111
由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，R1为的第1至第N-1位氨基酸残基，
R2为第N+1位至C末端的氨基酸残基，R4为
Figure BDA0000919329320000112
12.制备含有非天然氨基酸的目的蛋白(例如GFP/E2)的方法，包括步骤：
(1)选择步骤：在目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；
(2)基因突变：将编码对应于(1)中选择的位点的目的蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为琥珀密码子；
(3)表达载体构建：将(2)基因突变步骤得到的突变的目的蛋白的编码序列与合适的真核表达载体(pcDNA3.1)可操作地连接，得到突变序列表达载体；
(4)表达：将(3)得到的突变序列表达载体与项目4中的pXH-N3质粒共同转染项目9中的HEK293-XH宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有NAEK和多西环素的培养基中培养，在适当的时间收集细胞；
(5)提取总蛋白，检测含有非天然氨基酸的目的蛋白(例如GFP/E2)产量；
本发明还提供了一种稳定细胞系HEK293-XH(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所、保藏日期为2015年11月17日、保藏号为CGMCC No：11593的细胞系；其分类命名为人HEK-293T细胞)，其含有本发明确证过的eRF1E55R突变体。示例性地，本发明的稳定细胞系为保藏号为CGMCC No：11593的 细胞系。
附图说明：
图1：质粒pGL4-2luc-TAG图谱
图2：质粒pXH图谱
图3：质粒pXH-N3图谱
图4：质粒pSD31-TetO图谱
图5：tRNA启动子效率的比较
A：构建的携带一拷贝数启动子及tRNA载体示意图；
B：Western Blot验证各类型启动子启动tRNA对非天然氨基酸单点插入效率的影响，从左至右启动子名称分别为：U1,mu6，H1,hu6,7sk；图示7sk启动子相对其余启动子非天然氨基酸插入型蛋白表达效率最高；
C：细胞水平上，绿色荧光蛋白成像验证各启动子非天然氨基酸单点插入效率；与图B结果相符合；
D：不同启动子对双报告载体pGL4-2luc-TAG通读效率的影响，从左至右分别为U1、mu6、H1、hu6、7sk启动子，7sk启动子通读效率最高，与图B/C结果相符合。
图6：pXH-N3载体的优化及构建
A：构建的携带不同拷贝数7sk启动子及tRNA载体示意图；
B：Western Blot和绿色荧光蛋白成像检测串联不同个数7sk启动子及tRNA对非天然氨基酸单点插入效率的影响，从左至右分别为1、2、3、4以及5个7sk-tRNA串联单位，由图可知在7sk启动子下，串联4个tRNA的非天然氨基酸单点插入效率最高；
C：不同拷贝数7sk启动子及tRNA对双报告载体pGL4-2luc-TAG通读效率的影响，从左至右分别为1、2、3、4以及5个7sk-tRNA串联单位，由图可知在7sk启动子下，串联4个tRNA的通读效率最高，与图B结果相符合；
D：Western Blot和绿色荧光蛋白成像检测串联不同个数7sk启动子及tRNA对非天然氨基酸双点插入效率的影响，从左至右分别为1、2、3、4以及5个7sk-tRNA串联单位，由图可知与单点插入一样，串联4个7sk启动子及tRNA的非天然氨基酸双点插入效率最高。
图7：eRF1突变位点的选择
A.原核和真核释放因子的比较；
B.负责识别终止密码子的eRF1N端结构域晶体结构示意图(Song Haiwei etal.Cell,2000，100：311–321)；根据文献报道(Polina Kryuchkova et al.Nucleic AcidsResearch,2013,1–14)，由图所示，选择可能选择性降低TAG识别能力的位点进行突变，主要包括Glu55位，Tyr125位和Asn129位；
C.利用双报告载体pGL4-2luc-TAG/TAA/TGA检测不同eRF1突变体对三个终止密码子TAG/TAA/TGA通读率的影响，从左至右分别为空白组、WT eRF1(野生型)、突变体E55D(55位的谷氨酸突变成天门冬氨酸)、E55A、E55Q、E55R、Y125F、N129P以及E55R/N129P双突变体。由图可知E55R选择性增加TAG通读率效果最理想，基本上不影响TAA/TGA的通读。
图8：不同eRF1突变体对非天然氨基酸插入效率的影响
A.利用双报告载体pGL4-2luc-TAG检测瞬时转染不同eRF1突变体对非天然氨基酸插入效率的影响：从左至右分别为空白组、WT eRF1(野生型)、突变体E55D、E55A、E55Q、E55R、Y125F、N129P、E55R/N129P双突变体以及内参；由图可知E55R增加非天然氨基酸插入效率效果最理想。
B.Western Blot和绿色荧光蛋白成像检测瞬时转染不同eRF1突变体对非天然氨基酸单点插入效率的影响，从左上至右下分别为空白组、E55R/N129P双突变体、突变体E55D、E55A、E55Q、E55R、Y125F以及N129P，由图可知在突变体E55R的非天然氨基酸单点插入效率最高；
C.Western Blot和绿色荧光蛋白成像检测瞬时转染不同eRF1突变体对非天然氨基酸双点插入效率的影响，从左上至右下分别为空白组、E55R/N129P双突变体、突变体E55D、E55A、E55Q、E55R、Y125F以及N129P，由图可知，同单点一致，突变体E55R的非天然氨基酸双点插入效率最高。
图9：可诱导表达目的蛋白双慢病毒系统的构建
A.构建的pSD400(A1)和pSD31-TetO(A2)双慢病毒载体示意图；
B.将目的蛋白E55R或者对照红色荧光蛋白(RFP)克隆到pSD31-TetO病毒载体上，包装病毒，筛选出HEK293-E55R稳定细胞系以及对照细胞系HEK293-RFP；
C.通过对照细胞系HEK293-RFP表达的红色荧光蛋白成像，检测加入多西环素后不同诱导时间对RFP蛋白表达的影响。从左到右分别为诱导0小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时，由图可知随着诱导时间的增加，RFP表达量逐渐增加，诱导72小时后，其表达量比较理想。
D.通过对照细胞系HEK293-RFP表达的红色荧光蛋白成像，检测加入不同浓度多西环素后诱导对RFP蛋白表达的影响。从左到右多西环素浓度分别为0nm、10nm、25nm、50nm、100nm、1000nm，由图可知随着多西环素浓度的增加，RFP表达量逐渐增加，多西环素浓度为1000nm时，其表达量比较理想。
图10：多西环素诱导稳定细胞系对非天然氨基酸插入效率的影响
A：Western Blot检测不同多西环素诱导HEK293-E55R(左图)或对照组HEK293-RFP稳定细胞系(右图)对非天然氨基酸单点插入效率的影响。从左到右多西环素浓度分别为0nm、10nm、25nm、50nm、100nm、1000nm，由图可知随着多西环素浓度的增加，HEK293-E55R稳定系中全长目的蛋白表达量逐渐增加，多西环素浓度为1000nm时，其表达量是不诱导组的2倍。而与之对比的 HEK293-RFP稳定系全长目的蛋白表达量不受多西环素浓度影响，排除了多西环素本身对非天然氨基酸插入效率的影响。
B：绿色荧光蛋白成像检测不同多西环素诱导HEK293-E55R对非天然氨基酸单点插入效率的影响，与Western Blot结果一致，随着多西环素浓度的增加，HEK293-E55R稳定系中反映GFP蛋白表达量的荧光强度逐渐增加。
C：双报告载体pGL4-2luc-TAG检测不同多西环素诱导HEK293-E55R(左图)或对照组HEK293-RFP稳定细胞系(右图)对非天然氨基酸单点插入效率的影响。从左到右多西环素浓度分别为0nm、10nm、25nm、50nm、100nm、1000nm，由图可知随着多西环素浓度的增加，HEK293-E55R稳定系非天然氨基酸插入效率逐渐增加，多西环素浓度为1000nm时，其效率是不诱导组的2倍，与图A/B结果相吻合。
D：Western Blot和绿色荧光蛋白成像检测不同多西环素诱导HEK293-E55R稳定细胞系对非天然氨基酸双点插入效率的影响。从左到右多西环素浓度分别为0nm、10nm、25nm、50nm、100nm、1000nm，由图可知，与单点一致，随着多西环素浓度的增加，HEK293-E55R稳定系中全长目的蛋白表达量逐渐增加，多西环素浓度为1000nm时，其表达量是不诱导组的4倍。
图11：非天然氨基酸在不同蛋白上的多点(n>3)插入
A：双报告载体pGL4-2luc-TAG检测pXH-N3载体结合多西环素诱导HEK293-E55R稳定细胞系对非天然氨基酸单点插入效率的影响。从图可知，两者结合后，非天然氨基酸单点插入效率接近90％。
B:显示四个琥珀密码子突变位点的GFP晶体结构示意图；
C：Western Blot和绿色荧光蛋白成像检测非天然氨基酸在GFP蛋白上的一至四点插入，从左至右分别为野生型GFP,分别含有1、2、3、4个琥珀密码子的GFP，可以看出，加入多西环素后，GFP表达量随突变位点增多而降低的趋势有所缓解，其中，非天 然氨基酸的四点插入产率大概为野生型的20％。
D:显示四个突变位点的HCV E2晶体结构示意图；
E：Western Blot检测非天然氨基酸在E2蛋白上的一至四点插入，其中，非天然氨基酸的四点插入产率大概为野生型的20％。
为了更好地理解本发明，发明人用实施例对具体试验进行阐述和说明，其中所述实施例仅用于说明，并不限定本发明的保护范围。任何与本发明等价的变体或者实施方案都包括在本发明中。
实施例1：基因载体的构建
(1)双报告质粒的构建及获得
海肾荧光素酶基因renilla作为内参，用肽段GGGGS作为连接片段，融合表达在萤火虫荧光素酶基因firefly的N端，在两者的连接片段上引入琥珀密码子UAG，得到了双报告载体pGL4-2luc-TAG。类似地，将琥珀密码子替换成赭石密码子(UAA)或者蛋白石密码子(UGA)，分别得到了评价终止密码子UAA/UGA通读效率的双报告载体pGL4-2luc-TAA、pGL4-2luc-TGA。
(2)辅助质粒的构建及获得
通过条件的优化及尝试，确定4个tRNA由7sk启动子串联表达为最优，将tRNA合成酶(pheRS)，4个串联的7sk-tRNApyl通过基因亚克隆方法克隆进同一载体(pXH)上，构建并获得pXH-N3辅助载体，该质粒可以表达特异识别非天然氨基酸NAEK的tRNA和tRNA合成酶。
(3)pSD31-TetO质粒的构建及获得
以pcDNA4TM/TO/myc-His A(invitrogen)质粒为模板，经过PCR获得内含两个四环素操作子(2X TetO2)的CMV启动子。将该启动子克隆到抗性改造为潮霉素B(hygromycin B)慢病毒载体psd31-sv40-hygro上，获得pSD31-TetO质粒,其序列如SEQ ID NO:13 所示。
(4)eRF1突变位点的选择和引物设计
根据eRF1的晶体结构,eRF1识别终止密码子的结构域,根据文献报道(PolinaKryuchkova et al.Nucleic Acids Research,2013,1–14)，本发明选择了可能选择性降低琥珀密码子TAG识别能力而不影响其它终止密码子的位点进行突变，主要包括Glu55位，Tyr125位和Asn129位；发明人针对以上位点，设计能够使编码所述氨基酸的密码子突变为其它氨基酸的引物，具体引物如下表所示。
表1：eRF1突变引物列表
突变位点 序列(5’‐3’方向)
eRF1‐E55R‐for gtggcaaaaatgttagcggatcgctttggaactgcatctaac
eRF1‐E55R‐rev gttagatgcagttccaaagcgatccgctaacatttttgccac
eRF1‐E55Q‐for gtggcaaaaatgttagcggatcagtttggaactgcatctaac
eRF1‐E55Q‐rev gttagatgcagttccaaactgatccgctaacatttttgccac
eRF1‐E55A‐for gtggcaaaaatgttagcggatgcctttggaactgcatctaac
eRF1‐E55A‐rev gttagatgcagttccaaaggcatccgctaacatttttgccac
eRF1‐E55D‐for gtggcaaaaatgttagcggatgattttggaactgcatctaac
eRF1‐E55D‐rev gttagatgcagttccaaaatcatccgctaacatttttgccac
eRF1‐Y125F‐for ccaattaatacgtcattgttcttgtgtgacaacaaattccatacagagg
eRF1‐Y125F‐rev cctctgtatggaatttgttgtcacacaagaacaatgacgtattaattgg
eRF1‐N129P‐for cgtcattgtatttgtgtgaccccaaattccatacagaggctc
eRF1‐N129P‐rev gagcctctgtatggaatttggggtcacacaaatacaatgacg
利用定点突变试剂盒(
Figure BDA0000919329320000171
Lightning Site-Directed MutagenesisKits，Catalog#210518)，按说明书操作野生型eRF1表达载体pcDNA3.1-eRF1-WT为模板将eRF1的第E55位，第Y125位和第N129位这几个位点的氨基酸密码子突变为其它氨基酸(序列)，构建得到表达质粒表达载体pcDNA3.1-eRF1,经测序验证突变成功。
(5)GFP/E2突变位点的选择和引物设计
对了证明非天然氨基酸可以实现多点插入，发明人针对GFP的Tyr39位/Lys101位/Glu132位/Glu172位位点，或E2蛋白的Gln26位/Met73位/Trp86位/Asp150位位点进行同时突变，设计能够使编 码所述氨基酸的密码子突变为琥珀密码子的引物，具体引物如下表所示。
表2：GFP突变引物列表
突变位点 序列(5’‐3’方向)
GFP‐Y39‐for ggcgagggcgatgccacctagggcaagctgaccctgaagttc
GFP‐Y39‐rev gaacttcagggtcagcttgccctaggtggcatcgccctcgcc
GFP‐K101‐for gcgcaccatcttcttctaggacgacggcaactacaagaccc
GFP‐K101‐rev gggtcttgtagttgccgtcgtcctagaagaagatggtgcgc
GFP‐E132‐for gggcatcgacttcaagtaggacggcaacatcctggggc
GFP‐E132‐rev gccccaggatgttgccgtcctacttgaagtcgatgccc
GFP‐E172‐for gatccgccacaacatctaggacggcagcgtgcagctc
GFP‐E172‐rev gagctgcacgctgccgtcctagatgttgtggcggatc
表3：E2突变引物列表
突变位点 序列(5’‐3’方向)
E2‐Q26‐for cttagcaccaggcgccaagtagaacatccaactgatcaacac
E2‐Q26‐rev gtgttgatcagttggatgttctacttggcgcctggtgctaag
E2‐M73‐for cttcaggctgccccgagaggtaggccagctgccaacgccttact
E2‐M73‐rev agtaaggcgttggcagctggcctacctctcggggcagcctgaag
E2‐W86‐for ctgattttccccagggctagggccccatcagccatgcc
E2‐W86‐rev ggcatggctgatggggccctagccctggggaaaatcag
E2‐D150‐for cctacaactggggtgaaaattagacggacgtcttcgtcctcaac
E2‐D150‐rev gttgaggacgaagacgtccgtctaattttcaccccagttgtagg
利用定点突变试剂盒(
Figure BDA0000919329320000181
Lightning Site-Directed MutagenesisKits，Catalog#210518)，按说明书操作，以野生型GFP/E2表达载体pcDNA3.1-GFP/E2-WT为模板将表2-表3中位点的氨基酸密码子突变为琥珀终止密码子，构建得到表达质粒(pcDNA3.1-GFP-4TAG、pcDNA3.1-E2-4TAG),经测序验证突变成功。
实施例2：定点突变的GFP/E2的表达和鉴定
本发明中构建pXH-N3质粒中含有源自古甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(pylRS)基因，在表达 细胞中，以琥珀终止密码子(TAG)为有义编码子，能够使非天然氨基酸NAEK掺入到蛋白中，从而造成目的蛋白的定点突变。下面，发明人对NAEK的掺入可能性和突变蛋白质的生产性能进行了检测。
1：非天然氨基酸NAEK的合成和鉴定
非天然氨基酸Lys-azido的化学合成反应式如下
Figure BDA0000919329320000191
如上式所述，将原料1(2-溴乙醇)2.3mL溶于90mL丙酮以及15mL水的混合溶液，加入NaN33.12g，60℃油浴加热回流反应20h。冷却至室温，旋蒸除去丙酮，无水乙醚萃取(30mL×8)，无水Na2SO4干燥，旋蒸除去溶剂得2.62g无色液体产物2。
将产物2(500mg，5.74mmol)加入到三光气(1.70g，5.74mmol)的THF(10ml)溶液中。0℃搅拌反应8h，溶剂蒸干。剩余物在真空下干燥1h，得到无色油状产物3。
将3溶解在1.5ml的THF中并缓慢加入Boc-Lys-OH(1.7g，6.88mmol)的1M NaOH(20ml)/THF(5ml)的溶液中。0℃搅拌反应12h并逐渐升温到室温。重新将反应液冷却到0℃并用0℃的1M的盐酸溶液将反应液pH值调整至2～3。反应液用EtOAc萃取(30mL×5)，有机层用2×100ml的饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥有机层、过滤、旋蒸除去溶剂得到1.65g无色粘稠液体产物4不用进一步纯化。
将4溶于15mL CH2Cl2中，搅拌下缓慢滴加15mL TFA，室温下反应30min后蒸出溶剂，剩余液体产物用5mL甲醇溶解，加 入100mL乙醚，析出大量白色固体沉淀，过滤干燥得到1.38g白色固体终产物5。1H NMR(D2O):δ＝1.22-1.45(m,4H),1.67-1.73(m,2H),2.99(m,2H),3.38(m,2H),3.70(m,1H),4.09(m,2H).13C NMR(D2O):δ＝21.4,28.4,29.6,39.5,53.4,56.2,57.8,116.0(TFA),153.1,162.3(TFA),172.9.HRMS:m/z calcd for C9H17N5O4[M]+:259.1281；found:259.1283，证明得到的Lys-azido结构正确。
2：突变GFP/E2的NAEK多点掺入及鉴定
(1)以携带有4个琥珀密码子的的突变型GFP为例：将实施例1的步骤5获得的pcDNA3.1-GFP-4TAG,以及实施例1的步骤2的pXH-N3以1：2比例混合，再与转染试剂megatrans1.0按1：3比例混合，共同加入HEK293-E55R稳定细胞系中，6小时后换液加入浓度为1mM的NAEK以及多西环素，至细胞于37℃，5％CO2的孵箱中继续培养；
(2)随后对HEK293-E55R稳定细胞系的多西环素诱导时间和诱导浓度等对突变型表达条件进行优化，如图8所示，最终确定1000nm的多西环素诱导72hr后裂解细胞收集蛋白；
3：突变GFP/E2的鉴定
(1)设计对照组，将加入野生型GFP/E2的表达细胞作为对照，做相同转染处理；
(2)收集蛋白，直接加入SDS-PAGE上样缓冲液煮样处理，并做SDS-PAGE电泳及Western Blot分析，对比目的位置蛋白质条带，可明显观察到加入NAEK组表达出与野生型蛋白大小一致的全长GFP/E2，如图7所示。
(3)将突变型GFP通过抗flag标签的beads纯化，考马斯亮蓝染色，将条带进行质谱鉴定，确证GFP的特定位点引入了非天然氨基酸NAEK。
Figure IDA0000919329390000011
Figure IDA0000919329390000021
Figure IDA0000919329390000031
Figure IDA0000919329390000041
Figure IDA0000919329390000051
Figure IDA0000919329390000061
Figure IDA0000919329390000071
Figure IDA0000919329390000081
Figure IDA0000919329390000091
Figure IDA0000919329390000101
Figure IDA0000919329390000111
Figure IDA0000919329390000121
Figure IDA0000919329390000131
Figure IDA0000919329390000141
Figure IDA0000919329390000151
Figure IDA0000919329390000161
Figure IDA0000919329390000171
Figure IDA0000919329390000181
Figure IDA0000919329390000191
Figure IDA0000919329390000201
Figure IDA0000919329390000211
Figure IDA0000919329390000221
Figure IDA0000919329390000231
Figure IDA0000919329390000241
Figure IDA0000919329390000251
Figure IDA0000919329390000261
Figure IDA0000919329390000271
Figure IDA0000919329390000281
Figure IDA0000919329390000291
Figure IDA0000919329390000301
Figure IDA0000919329390000311
Figure IDA0000919329390000321
Figure IDA0000919329390000331
Figure IDA0000919329390000341
Figure IDA0000919329390000351
Figure IDA0000919329390000361

Claims (14)

1.一种 在哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统，其特征在于所述系统包括：
（1）表达含有非天然氨基酸的蛋白质的表达载体，所述非天然氨基酸由密码子UAG编码；
（2）含有古甲烷球菌的tRNA（tRNAPyl ）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶基因（PylRS）的载体，其包含由7sk启动子启动的串联的4个tRNA；
所述系统中还包括包含经突变的eRF1的细胞系；
其中经突变的eRF1是突变体E55R，其中突变前的eRF1氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
2.如权利要求1所述的在哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统，其中7sk启动子的序列如SEQ ID NO:7所示。
3.如权利要求1所述的在哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统，其中含有古甲烷球菌的tRNA（tRNAPyl ）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（PylRS）基因的载体是载体pXH-N3，其序列如SEQ ID NO:8所示。
4.如权利要求1所述的在哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统，其还包括：
含有TetR基因的载体pSD400，其序列如SEQ ID NO:12所示；
含有TetO序列的CMV启动子的载体pSD31-TetO，其序列如SEQ ID NO:13所示。
5.权利要求4所述的在哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统，其中的载体pSD400和/或pSD31-TetO用于诱导表达经突变的eRF1。
6.如权利要求1-5中任一项所述的在哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统，其中所述的细胞系是保藏号为CGMCC No：11593的细胞系HEK293-XH。
7.由权利要求1-6任一项所述的在哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统生产的经定点突变的蛋白，其中1个至4个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所示的NAEK。
8.如权利要求7所述的经定点突变的蛋白，其是经定点突变的GFP，突变位点为GFP任意位点上一个或多个氨基酸。
9.如权利要求7所述的经定点突变的蛋白，其是经定点突变的HCV病毒包膜E2蛋白，突变位点为E2蛋白任意位点上一个或多个氨基酸。
10.如权利要求8所述的经定点突变的蛋白，所述突变位点选自：GFP的Tyr39位、Lys101位、Glu132位或Glu172位。
11.如权利要求9所述的定点突变的蛋白，所述突变位点选自：E2的Gln26位、Met73位、Trp86位或Asp150位。
12.如权利要求7-11中任一项所述的经定点突变的蛋白，其与突变前蛋白的区别在于：第N位的氨基酸被突变为NAEK，第N位氨基酸在蛋白中的连接方式如下式所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，R1为蛋白的第1至第N-1位氨基酸残基，
R2为蛋白的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，R4为
Figure DEST_PATH_IMAGE003
13.编码权利要求7-12中任一项所述的经定点突变的蛋白的核酸分子。
14.制备权利要求7-12中任一项所述的定点突变的蛋白的方法，包括步骤：
（1）在目的蛋白的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个氨基酸位点；
（2）将编码目的蛋白的核酸分子中对应于（1）中选择的氨基酸的密码子突变为琥珀密码子；
（3）将（2）中得到的经突变的目的蛋白的编码核酸分子与合适的载体可操作地连接，得到突变核酸分子表达载体；
（4）构建并获得pXH-N3质粒；
（5）构建并获得稳定细胞系HEK293-XH，所述稳定细胞系经多西环素诱导后能表达eRF1E55R突变体；
（6）将（3）中得到的突变核酸分子表达载体与（4）的pXH-N3质粒共同转染HEK293-XH宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有NAEK和多西环素的培养基中培养，在适当的时间收集细胞；
（7）纯化含有非天然氨基酸的目的蛋白；
（8）任选地，对表达产物进行质谱鉴定和活性检测。
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Homo sapiens cell-line HEK-293 7SK RNA promoter region, complete sequence，GenBank: AY578685.1;Cortinez,G.;《NCBI Genbank database》;20040421;全文 *
Schmied, Wolfgang H.Efficient Multisite Unnatural Amino Acid Incorporation in Mammalian Cells via Optimized Pyrrolysyl tRNA Synthetase/tRNA Expression and Engineered eRF1.《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》.2014,第136卷(第44期), *

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