KR20220024847A

KR20220024847A - 포유류 세포에서 비천연 아미노산 혼입을 위한 향상된 플랫폼

Info

Publication number: KR20220024847A
Application number: KR1020227002220A
Authority: KR
Inventors: 아비셱 채터지; 아비r 채터지; 레이첼 이. 켈레멘; 딜라일라 쥬웰
Original assignee: 트러스티스 오브 보스톤 칼리지
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2022-03-03
Also published as: US20220372467A1; AU2020295571A1; WO2020257668A1; JP2022537960A; EP3987036A1; IL289064A; CA3143506A1; CN114026232A

Abstract

본 발명은 1) 포유류 세포에서 조작된 넌센스-억제 tRNA의 활성을 유의적으로 개선하기 위해 바이러스 보조 유도 진화를 사용하는 능력, 2) 포유류 세포에서 현저히 개선된 Uaa 혼입 효율을 나타내는 고세균성 피롤리실 및 대장균 류실 tRNA의 돌연변이를 제공하는 능력 및 3) 포유류 세포에서 현저하게 개선된 수율로 Uaa를 혼입시키는 재조합 단백질을 발현하기 위해 이들 tRNA를 사용하는 능력을 포함한다.

Description

포유류 세포에서 비천연 아미노산 혼입을 위한 향상된 플랫폼

관련 출원

본 출원은 2019년 6월 21일자로 출원된 미국 가출원 제62/864,570호의 35 U.S.C. § 119(e)에 따른 혜택을 주장하는 것으로, 이 가출원은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

정부 지원

본 발명은 미국국립보건원에서 수여한 R01 GM132471 및 미국국립과학재단에서 수여한 CHE1900375에 따른 정부 지원으로 이루어졌다.

ASCII 텍스트 파일 내 물질의 참조에 의한 원용

본 출원은 다음 ASCII 텍스트 파일에 포함된 서열 목록을 참조에 의해 원용한다:

파일명: 0342_0008WO1_SL.txt; 2020년 6월 19일자로 생성됨, 크기 17,574바이트.

발명의 분야

본 발명은 비천연 아미노산을 부위-특이적으로 혼입하는(incorporating) 포유류 세포에서 단백질을 발현하기 위한 효율적인 플랫폼의 개발에 초점을 맞춘 생물공학 분야에 관한 것이다.

비천연 아미노산(Uaa)의 부위-특이적 혼입은 포유류 세포의 생물학을 조사하고 조작하는데 있어서 많은 잠재력을 가지고 있다. 이 기술의 핵심은 임의의 숙주 상대와 교차-반응하지 않고 관심 Uaa를 충전하도록 조작된 넌센스-억제 아미노아실-tRNA 합성효소(aaRS)/tRNA 페어(pair)이다. 이러한 "직교성(orthogonal)" aaRS/tRNA 페어는 전형적으로 다른 생명 영역에서 숙주 세포로 도입된다. 이종 억제 tRNA는 본래의 것이 아닌 번역 시스템과 직접적으로 상호작용해야 하기 때문에, 새로운 숙주에서 종종 최적의 성능을 나타내지 못한다. 실제로, 여러 연구에서 포유류 세포에서의 Uaa 혼입 효율이, Uaa 혼입의 수용 가능한 효율을 위해 대량으로 과발현되어야 하는, 이종 억제 tRNA의 빈약한 성능에 의해 제한됨이 확인되었다. 이러한 높은 수준의 tRNA 발현은 높은 형질주입 효율을 나타내는 특정 포유류 세포주에 일시적으로 형질주입하여 달성될 수 있지만, 형질주입이 어려운 세포(예를 들어, 1차 세포, 뉴런, 줄기 세포 등)에서 그렇게 하는 것은 어렵다. 게다가, 충분한 넌센스 억제/Uaa 혼입 효율에 도달하기 위해 수백 카피의 tRNA 유전자가 게놈에 삽입되어야 하므로, 이는 안정적인 억제 세포주(게놈에서 조작된 aaRS/tRNA를 발현하는 세포주)의 생성을 매우 어렵게 만든다. 억제 tRNA가 최적 성능을 나타내지 못하는 것을 극복하는 능력은 Uaa 돌연변이 생성 기술의 견고성을 크게 개선하여, Uaa 혼입이 가능하고 같은 단백질의 다수의 부위에 Uaa의 동시 혼입이 가능한 안정적인 억제 세포주의 용이한 생성과 같은 진보된 응용을 촉진할 것이다.

빈약한 tRNA 성능의 기원은 종종 불분명하여, 합리적인 설계로 이러한 성능 문제를 해결하려는 것을 어렵게 만든다. 그러나, 대장균(E. coli)에서 Uaa 혼입을 위한 유도적 진화를 통해 개선된 직교성 억제 tRNA가 빈번하게 생성된다; 대규모 합성 라이브러리에서 활성이면서 직교성 억제 tRNA 돌연변이를 용이하게 풍부화(enrichment)할 수 있는 영리한 선별 시스템이 개발되었다. 포유류 세포에서 유사한 tRNA 진화를 수행하는 능력은 개선된 억제 시스템을 창조하기 위한 매우 큰 잠재력을 갖지만, 현재 사용할 수 있는 적합한 플랫폼이 없다. 독특한 포유류 번역 시스템과의 개선된 상호작용을 기반으로 tRNA 돌연변이를 선별하는 것을 보장하기 위해 포유류 세포에서 이러한 유도적 진화 실험을 수행하는 것은 중요하다.

기존 포유류 세포에서의 유도적 진화 전략은 대부분 세포주에서 표적 유전자의 안정적인 혼입 후 비표적 또는 표적화 무작위 돌연변이 생성을 통해 서열 다양성을 생성하는 것에만 의존한다. 관련된 낮은 돌연변이 빈도는 작은 크기(<100bp)를 감안할 때 tRNA의 진화에 적합하지 않다. 또한, 가장 빈번한 조작 표적인, tRNA의 줄기 영역을 성공적으로 진화시키기 위해서는, 염기쌍을 유지하기 위해 다른 쪽의 매칭 돌연변이가 수반되어야 한다. 이러한 작은 tRNA 유전자 내 풍부한 서열 다양성을 포착하는 것은 합성 부위-침투 돌연변이 라이브러리를 사용해서만 가능하다. 이러한 라이브러리에서 직교성이고 포유류 세포에서 활성인 억제 tRNA 변이체를 풍부화하기 위해, i) 각 세포가 단일 변이체를 받도록 하는, 라이브러리의 조절된 다양성; ii) 활성 tRNA 돌연변이를 풍부화하고 교차-반응성인 것을 제거하는 선별 계획; 및 iii) 생존 돌연변이를 식별하는 능력을 갖는 것이 필요하다. 현재 이러한 기준을 만족하는 선별 시스템은 존재하지 않는다.

비천연 아미노산(Uaa 또는 UAA)을 포유류 단백질에 혼입시키는 상응하는 야생형 억제 tRNA 분자에 비해서 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이/돌연변이 넌센스 억제 tRNA 분자(본 명세서에서 억제 tRNA라고도 함)를 포함하는 조성물; 이들 변이 tRNA를 암호화하는 포유류 세포의 감염에 적합한 발현 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터); 이들 발현 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)를 포함하는 포유류 세포; 본 명세서에 기술된 바이러스-보조 유도 진화 방법을 사용하여 증가된 생물학적 활성을 갖는 억제 tRNA를 생산하는 방법; 비천연 아미노산이 부위-특이적으로 혼입된 단백질을 생산하기 위해 증가된 활성을 갖는 이들 tRNA를 사용하는 방법 및 변이 tRNA를 포함하는 시약 및 이러한 단백질의 생산을 위해 필요한 다른 시약을 함유하는 키트가 본 명세서에 기술된다.

특히, 본 발명의 조성물은 예를 들어 변이 고세균성 또는 세균성 넌센스 억제 tRNA 분자를 포함하고, 여기서 직교성 활성 변이 tRNA는 이의 "야생형" 상응 억제 tRNA에 비해서 다양한 비천연 아미노산(예를 들어, 아미노산 유사체)을 포유류 단백질에 혼입시키는 증가된 활성을 갖는다. 본 명세서에 사용된 용어 "야생형" 상응 tRNA는 Uaa를 부위 특이적 방식으로 관심 단백질에 혼입시키는 증가된 생물학적 활성을 갖는 억제 tRNA 분자의 집단을 생산(선별 및 풍부화)하기 위한 본 명세서에 기술된 바이러스-보조 유도 진화 방법을 거치지 않은 억제 tRNA 분자를 의미한다.

본 발명에 포함되는 변이 tRNA의 활성은 야생형 tRNA보다, 예를 들어 약 2.5 내지 약 200배, 약 2.5 내지 약 150배, 약 2.5 내지 약 100배 약 2.5 내지 약 80배, 약 2.5 내지 약 60배, 약 2.5 내지 약 40배, 약 2.5 내지 약 20배, 약 2.5 내지 약 10배, 약 2.5 내지 약 5배, 약 5 내지 약 200배, 약 5 내지 약 150배, 약 5 내지 약 100배, 약 5 내지 약 80배, 약 5 내지 약 60배, 약 5 내지 약 40배, 약 5 내지 약 20배, 약 5 내지 약 10배, 약 10 내지 약 200배, 약 10 내지 약 150배, 약 10 내지 약 100배, 약 10 내지 약 80배, 약 10 내지 약 60배, 약 10 내지 약 40배, 약 10 내지 약 20배, 약 20 내지 약 200배, 약 20 내지 약 150배, 약 20 내지 약 100배, 약 20 내지 약 80배, 약 20 내지 약 60배, 약 20 내지 약 40배, 약 40 내지 약 200배, 약 40 내지 약 150배, 약 40 내지 약 100배, 약 40 내지 약 80배, 약 40 내지 약 60배, 약 60 내지 약 200배, 약 60 내지 약 150배, 약 60 내지 약 100배, 약 60 내지 약 80배, 약 80 내지 약 200배, 약 80 내지 약 150배, 약 80 내지 약 100배, 약 100 내지 약 200배, 약 100 내지 약 150배 또는 약 150 내지 약 200배 증가된다.

변이 고세균성 tRNA 분자는 예를 들어 메타노사르시나카에아(Methanosarcinacaea) 또는 디설피토박테리움(Desulfitobacterium) 과에서, 특히 메타노사르시나카에아 바르케리(M. barkeri)(Mb), 메타노사르시나카에아 알버스(M. alvus)(Ma), 메타노사르시나카에아 마제이(M. mazei)(Mm) 또는 디설피토박테리움 하프니센스(D. hafnisense)(Dh) 패밀리 중 임의의 것에서 유래된다. 구체적으로, 청구된 발명은 서열번호 1 또는 표 1에 나타낸 바와 같은 변이 tRNA 분자의 전장 서열번호 2 내지 27 중 임의의 것과 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에서 유래된 피롤리실 tRNA(tRNA^Pyl)인 변이 tRNA를 포함한다. 보다 구체적으로, 특정 실시형태에서, 변이 tRNA^Pyl는 서열번호 2 내지 27 또는 전장 서열번호 2 내지 27과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, tRNA^Pyl는 서열번호 1 내지 27 중 어느 하나에 비해서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개를 초과하는 돌연변이(예를 들어, 치환)를 포함한다. 본 명세서에 기술된 변이 고세균-유래 tRNA에 의해 혼입되는데 적합한 비천연 아미노산은 아지도-라이신(AzK)(도 18의 구조 1) 또는 N_ε-아세틸라이신(AcK)(도 18의 구조 2), 또는 도 18에 나타낸 바와 같은 구조 3 내지 6과 같은 임의의 다른 리실 유사체일 수 있다. 추가로, 본 명세서에 기술된 바와 같이(예를 들어, 실시예 9(도 19) 참조), 조작된 피롤리실-tRNA 합성 효소를 사용한, 임의의 다른 Uaa의 혼입 효율이 이들 조작된 tRNA^Pyl 돌연변이의 사용을 통해 향상될 수도 있다.

본 발명의 변이 세균성 tRNA 분자는 예를 들어 대장균 tRNA로부터 유래된 것이다. 구체적으로, 청구된 발명은 서열번호 28로부터 유래된 류실 tRNA(tRNA^Leu)인 변이 tRNA를 포함한다. 구체적으로, 특정 실시형태에서, 변이 tRNA^Leu는 서열번호 29 내지 45 중 어느 하나 또는 서열번호 29 내지 45 중 어느 하나의 전장 서열과 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, tRNA^Leu는 서열번호 28 내지 45 중 어느 하나에 비해서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개를 초과하는 돌연변이(예를 들어, 치환)를 포함한다. 관심 단백질로의 혼입을 위해 임의의 적합한 비천연 아미노산/유사체가 본 명세서에 기술된 방법과 함께 사용될 수 있다. 특히, 본 명세서에 기술된 변이 세균성-유래 tRNA에 의한 혼입에 적합한 비천연 아미노산은 도 18에 나타낸 구조 7 내지 12, 또는 구조 7 내지 12에 구조적 및 기능적으로 유사한 Uaa일 수 있다. 추가로, 본 명세서에 기술된 바와 같이(예를 들어 도 19 참조), 조작된 대장균 류실-tRNA 합성효소를 사용하는 임의의 다른 Uaa의 혼입 효율은 또한 이들 조작된 tRNA^Leu 돌연변이의 사용을 통해 향상될 수 있다.

또한 변이 고세균성 또는 세균성 억제 tRNA를 포함하는 발현 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)로서, 변이 tRNA는 본 명세서에 기술된 바와 같이 이의 야생형 상대 tRNA에 비해서 비천연 아미노산을 포유류 단백질에 혼입시키는 증가된 활성을 갖는 발현 벡터가 본 발명에 포함된다. 본 발명에 적합한 바이러스는 포유류 세포 게놈과 혼입되거나 혼입되지 않는 임의의 바이러스를 포함한다. 이러한 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 배큘로바이러스, 렌티바이러스 및 레트로바이러스를 포함한다. 보다 구체적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 아데노-관련 바이러스의 임의의 혈청형, 특히 아데노-관련 바이러스 제2혈청형이 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명의 발현 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)는 또한 mCherry, GFP 또는 EGFP 또는 다른 적합한 검출 분자와 같은 리포터 유전자를 암호화할 수 있다.

또한 세포 또는 본 명세서에 기술된 발현 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)를 포함하는 세포, 뿐만 아니라 이들 세포의 안정적인 세포주가 본 발명에 포함된다. 특정 실시형태에서, 세포는 포유류 세포이고, 안정적인 포유류 세포는 게놈적으로 혼입된(또는 에피솜적으로 유지되는) 조작된 tRNA를 포함한다.

본 발명의 세포는 세포에서 바이러스 벡터의 바이러스성 복제를 위해 필요한 유전자를 암호화하는 하나 이상의 추가적인 발현 벡터(예를 들어, 플라스미드)를 더 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 세포는 바이러스성 복제를 위해 필수적인 모든 유전적 구성요소를 암호화하는 발현 벡터(예를 들어, 플라스미드)로서, 넌센스 코돈이 단백질 서열에 삽입되어 변이 억제 tRNA의 활성에 의존적으로 바이러스성 복제를 제공하는 발현 벡터를 포함할 수 있다.

일 실시형태에서 필수적인 바이러스성 단백질은, 아데노-관련 바이러스 AAV2 서열번호 46 또는 서열번호 46과 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열과 같은, 비-외피성 바이러스의 VP1 캡시드 단백질(Cap)일 수 있다. 억제 코돈이 캡시드 단백질(예를 들어, TAG-앰버(amber); TAA-오커(ochre) 또는 TGA-오팔(opal))의 선택된 부위에 삽입될 수 있다(Agnew.Chem.Int.Ed. 2016, 55, 10645; Agnew.Chem.Int.Ed 2017, 56, 4234). 본 명세서에 기술된 바와 같이, 아데노-관련 바이러스를 위한 필수적인 바이러스 단백질은 454번 위치에 TAG 코돈을 갖는 Cap일 수 있다. 세포는 동족 Uaa RNA 합성효소(UaaRS) 및 Uaa의 존재 하에서 배양될 수 있다. 일 실시형태에서, UaaRS는 예를 들어 Mb ^PylRS이고 Uaa는 예를 들어 AzK 또는 AcK이다. 다른 실시형태에서, 변이 tRNA는 대장균 류실 tRNA(tRNA^Leu)이고, aaRS는 대장균 LeuRS이고, Uaa는 도 18에 나타난 바와 같은 류신 유사체이다.

또한 야생형 억제 tRNA에 비해서 증가된 생물학적 활성을 갖는 억제 tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법이 본 발명에 포함된다. 포유류 세포에서 바이러스의 복제는 관심 tRNA 변이체의 활성에 의존적인 필수 단백질의 발현을 필요로 한다.

방법은 바이러스 게놈에 관심 억제 tRNA 변이체의 라이브러리를 암호화하는 단계; 낮은 감염다중도(MOI)로 바이러스 벡터로 포유류 숙주 세포 집단을 감염시키고 세포 내 바이러스 복제에 적합한 조건 하에서 세포 집단을 유지하는 단계로서, 포유류 세포에서의 바이러스 복제는 관심 tRNA 변이체의 활성에 의존적인 필수 단백질의 발현을 필요로 하는, 단계; 및 교차-반응성 tRNA 분자를 제거하기 위해 활성 tRNA 변이체를 암호화하는 바이러스 자손을 수확하고 선택적으로 증폭시키는 단계로서, 증가된 생물학적 활성을 갖는 직교성 억제 tRNA 변이체가 회수되는, 단계를 포함한다. 이후 핵산 서열을 결정하고 추가 평가를 하기 위해 증폭된 tRNA 변이체를 시퀀싱할 수 있다. 라이브러리에서 가능한 각 돌연변이의 풍부화를 확인하기 위해 선별 이전 및 이후에 바이러스-암호화 tRNA 라이브러리의 차세대 시퀀싱을 수행할 수 있다. 이 풍부화 인자는 tRNA 활성의 지표로 사용될 수 있고, 가장 풍부화된 tRNA 돌연변이를 구성하고 이들의 활성을 확인하기 위해 시험할 수 있다. 특정 실시형태에서, 개시된 방법이 고려된 방법은 불활성화 tRNA를 보유하는 바이러스보다 활성화 tRNA를 암호화하는 바이러스의 20,000 내지 30,000배 풍부화의 10,000 내지 30,000을 초래한다.

보다 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 관심 넌센스-억제 tRNA의 서열은 라이브러리를 생성하기 위해 무작위화되고 적합한 발현 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)에 암호화된다. tRNA 변이체 라이브러리는 불활성화 tRNA 분자, 활성화 직교성 tRNA 분자 및 활성이지만 교차-반응성인 tRNA 분자를 포함할 것이다.

고려되는 특정한 방법은 수용성 숙주 세포(competent host cell) 집단의 사용을 포함한다. 이러한 세포는 전형적으로 포유류 세포이고, 보다 구체적으로는 불멸화 인간 세포이다. 매우 낮거나 낮은 감염다중도(MOI)로 적합한 숙주 세포를 바이러스 벡터로 감염시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, MOI는 약 0.1 내지 약 15, 약 0.1 내지 약 10, 약 0.1 내지 약 5, 약 0.1 내지 약 3, 약 0.1 내지 1, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 3, 약 3 내지 약 15, 약 3 내지 약 10, 약 3 내지 약 5, 약 5 내지 약 15, 약 5 내지 약 10 또는 약 10 내지 약 15이다. 특정 실시형태에서, MOI는 0.1과 5의 사이이다. 특정 실시형태에서, MOI는 15 미만, 10 미만, 5 미만, 3 미만, 1 미만 또는 0.1 미만이다. 특정 실시형태에서, 변이 tRNA를 암호화하는 단일 바이러스 벡터는 세포에서 필수적인 바이러스 단백질의 발현 및 바이러스 자손의 생산을 위해 필요한 전부이다. 보다 구체적으로, 각 세포는 단일 바이러스-암호화 tRNA 변이체를 수용한다.

세포는 이후(전형적으로 바이러스 감염 몇 시간 이내에) 하나 이상의 발현 벡터(예를 들어, 플라스미드)로 형질주입되며, 여기서 발현 벡터(예를 들어, 플라스미드)는 바이러스 복제에 필수적인 모든 유전적 구성요소를 포함하고, 넌센스 코돈이 단백질 서열에 삽입되어 변이 억제 tRNA의 활성에 의존적으로 바이러스 복제를 제공한다. 일 실시형태에서 필수적인 바이러스 단백질은 454번 위치에 TAG 코돈을 갖는 Cap(서열번호 46)이다. 특정 실시형태에서, 발현 벡터(예를 들어, 플라스미드)는 또한 동족 Uaa RNA 합성효소(UaaRS)를 암호화한다. 예를 들어, 여기서 tRNA 라이브러리는 피롤리실 tRNA(tRNA^Pyl) 라이브러리이고, UaaRS는 Mb ^PylRS이다. 형질주입 시, Uaa가 적절한 농도로 배양 배지에 첨가될 수도 있다. 특정 실시형태에서, Uaa는 AzK이다. 대안적으로, 변이 tRNA는 류실 tRNA(tRNA^Leu)이고, aaRS는 E.coli ^LeuRS이고, Uaa는 AzK 또는 도 18의 구조 7 내지 12 중 어느 하나이다. 바이러스 복제에 필요한 유전적 구성요소를 암호화하는 추가 발현 벡터(예를 들어, 플라스미드)가 본 명세서에 기술된 숙주 세포에 형질주입될 수도 있다.

고려되는 방법에서, 감염/형질주입된 세포를 변이 tRNA의 발현, 필수 바이러스 단백질의 발현 및 바이러스의 복제에 적합한 조건 하에서 Uaa를 함유하는 배지에서 유지(즉, 배양)시킨다. 특정 실시형태에서, 세포를 수확하고 바이러스 자손을 단리하고 추가 풍부화를 거쳐 교차-반응성이지만 활성인 tRNA 분자를 제거하고, 증가된 생물학적 활성을 갖는 직교성 억제 tRNA 변이체를 회수한다. 풍부화된 tRNA 변이체를 시퀀싱하여 이들의 핵산 서열을 얻을 수 있다. 각 tRNA 돌연변이의 풍부도와 선별 시 이들이 어떻게 변하는지를 측정하기 위해 선별 이전 및 이후에 바이러스-암호화 tRNA 라이브러리의 차세대 DNA 시퀀싱을 수행할 수 있다. 선별 시 가장 강하게 풍부화되는 tRNA 돌연변이가 가장 높은 활성을 가질 가능성이 있는 것이다.

본 발명의 방법에서, 활성이며 직교성인 tRNA 변이체만이 Uaa를 필수 바이러스 유전자 단백질에 혼입화하고 세포에서 바이러스 복제를 허용한다. 하지만, 특정 실시형태에서, 활성이고 교차-반응성인 tRNA를 포함하는 바이러스 또한 복제할 수 있으므로, 교차-반응성 tRNA를 암호화하는 바이러스 집단을 제거하고 원하는 tRNA를 암호화하는 바이러스 집단을 풍부화하는 추가적인 단계가 필요하다. 증가된 생물학적 활성을 갖는 tRNA 변이체를 위해 단리된 바이러스 자손을 풍부화할 수 있다. 예를 들어, 단리된 바이러스 자손을 광절단 가능한 링커와 같은 광절단 가능한 모이어티를 통해 부착된 정제 핸들/태그로 화학선택적으로 표지할 수 있다. 일 실시형태에서 이러한 모이어티는 광절단 가능한 DBCO-설포-비오틴 접합체이다. 반응 혼합물은 Uaa 단백질을 포함하는 바이러스, Uaa 단백질이 없는 바이러스, 광절단 가능한 비오틴 표지 및 소광제로서 과량의 Uaa를 함유한다. 비오틴-접합체 표지 바이러스를 스트렙타비딘 코팅된 비드를 사용하여 회수하고 적합한 파장(예를 들어, 365㎚)을 사용하여 바이러스를 비드로부터 용출시킨다. 회수된 비리온은 야생형 억제 tRNA에 비해서 증가된 생물학적 활성을 갖는 관심 억제 tRNA를 포함한다.

회수된 바이러스를 용해시키고, tRNA를 증폭하고, 이들의 핵산 서열을 얻기 위해 시퀀싱할 수 있다. 대안적으로, 회수된 바이러스를 용해시키고, tRNA를 증폭하고, 적합한 벡터를 사용하여 위에 기술된 바와 같이 클로닝할 수 있다. 이후 관심 억제 tRNA의 핵산 서열을 얻기 위한 시퀀싱을 위해 콜로니를 선별할 수 있다. 추가적으로, 각 tRNA 돌연변이의 풍부도와 선별 시 이들이 어떻게 변하는지를 측정하기 위해 선별 이전 및 이후에 바이러스-암호화 tRNA 라이브러리의 차세대 DNA 시퀀싱(예를 들어, Illumina)을 수행할 수 있다. 선별 시 가장 강하게 풍부화되는 tRNA 돌연변이가 가장 높은 활성을 가질 가능성이 있는 것이다. 이후 확인된 돌연변이를 구성하고 시험할 수 있다.

특정 위치에 하나 이상의 아미노산 유사체를 갖는 관심 단백질을 포유류 세포에서 생산하는 방법이 본 발명에 추가로 포함된다. 일 실시형태에서, 방법의 단계들은 성장에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 포유류 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 하나 이상의 선택자 코돈을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고 세포는 또한 선택자 코돈 및 이의 동족 아미노아실-RNA 합성효소를 인식하는 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이 고세균-유래 피롤리실 tRNA를 포함한다. 선택자 코돈에 대한 반응으로 단백질에 하나 이상의 라이신 유사체를 혼입하기에 적합한 조건 하에서 하나 이상의 라이신 유사체와 세포 배양 배지를 접촉시켜(적절한 농도로 첨가하여), 하나 이상의 라이신 유사체를 갖는 관심 단백질(원하는 단백질)을 생산할 수 있다.

일 실시형태에서 변이 tRNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2 내지 27의 전장 서열들 중 임의의 것과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에서 유래된 피롤리실 tRNA(tRNA^Pyl)이다. 특정 실시형태에서, 변이 tRNA^Pyl는 서열번호 2 내지 27 또는 서열번호 2 내지 27의 전장 서열과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함한다. 라이신 유사체는 임의의 리실 유사체일 수 있고, 특히 아지도라이신(AzK) 또는 아세틸라이신(AcK) 또는 도 18의 구조 3 내지 6 중 임의의 구조이다. 추가로, 실시예 9(도 19)에 기술된 바와 같이, 조작된 피롤리실-tRNA 합성효소를 사용한 임의의 다른 Uaa의 혼입 효율 또한 이들 조작된 tRNA^Pyl 돌연변이의 사용을 통해 향상될 수 있다.

방법의 다른 실시형태에서, 변이 억제 tRNA는 선택자 코돈 및 이의 동족 아미노 아실-RNA 합성효소를 인식하고 선택자 코돈에 대한 반응으로 관심 단백질에 하나 이상의 류신 유사체를 혼입하여, 하나 이상의 류신 유사체를 갖는 단백질을 생산하는, 증가된 생물학적 활성을 갖는 대장균-유래 류실 tRNA이다. 일 실시형태에서, 변이 tRNA는 서열번호 28에서 유래된 류실 tRNA(tRNA^Leu)이다. 특정 실시형태에서, 변이 tRNA^Leu는 서열번호 29 내지 45 중 어느 하나 또는 서열번호 29 내지 45의 전장 서열들 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 본 명세서에 기술된 변이 세균-유래 tRNA에 의한 혼입에 적합한 비천연 아미노산은 도 18에 나타난 구조 7 내지 12일 수 있다. 추가로, 실시예 9(도 19)에 기술된 바와 같이, 조작된 대장균 류실-tRNA 합성효소를 사용한 임의의 다른 Uaa의 혼입 효율 또한 이들 조작된 tRNA^Leu 돌연변이의 사용을 통해 향상될 수 있다.

본 발명의 방법은 세포에서 단백질 또는 펩타이드에 하나 이상의 아지도-라이신(AzK) 또는 아세틸-라이신(AcK) 잔기를 부위-특이적으로 혼입시키는 방법을 더 포함하며, 이 방법은 성장에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 세포는 특정 부위에 하나 이상의 앰버, 오커 또는 오팔 선택자 코돈을 갖는 관심 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하고, 여기서 세포는 선택자 코돈을 인식하는 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이 고세균-유래 피롤리실-tRNA^Pyl를 더 포함하고, 고세균성 Pyl-tRNA 합성효소를 더 포함한다. 이후 단백질 또는 펩타이드의 하나 이상의 선택자 코돈(들) 부위에 하나 이상의 AzK 또는 AcK 잔기가 혼입되기 적합한 조건 하에서 세포 배양 배지를 하나 이상의 AzK 또는 AcK 잔기와 접촉시켜, AzK 또는 AcK 잔기가 하나 이상의 부위-특이적으로 혼입된 관심 단백질 또는 펩타이드를 생산할 수 있다.

일 실시형태에서, 변이 피롤리실 tRNA(tRNA^Pyl)는 서열번호 1에서 유래된다. 예를 들어, 변이 tRNA^Pyl는 서열번호 2 내지 27 또는 서열번호 2 내지 27의 전장 서열들 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함한다. 또한, 예를 들어, 도 18의 구조 1 내지 6을 참조한다.

다른 실시형태에서, 방법은 세포에서 단백질 또는 펩타이드에 하나 이상의 류신 유사체 잔기를 부위-특이적으로 혼입하며, 여기서 세포는 선택자 코돈을 인식하는 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이 대장균-유래 tRNA^Leu를 포함하고, 대장균 Leu-tRNA 합성효소를 더 포함한다. 단백질 또는 펩타이드의 선택자 코돈(들) 부위에 하나 이상의 류신 유사체 잔기를 혼입하기 적합한 조건 하에서 세포 배양 배지를 하나 이상의 류신 유사체 잔기와 접촉시켜, 류신 유사체 잔기가 하나 이상의 부위-특이적으로 혼입된 관심 단백질 또는 펩타이드를 생산할 수 있다.

구체적으로, 특정 실시형태에서, 변이 tRNA는 서열번호 28에서 유래된 류실 tRNA(tRNA^Leu)이다. 예를 들어, 변이 tRNA^Leu는 서열번호 29 내지 45 또는 서열번호 29 내지 45의 전장 서열들 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 본 명세서에 기술된 변이 세균-유래 tRNA에 의한 혼입에 적합한 비천연 아미노산은 도 18에 나타난 구조 7 내지 12일 수 있다. 추가로, 실시예 9(도 19)에 기술된 바와 같이, 조작된 대장균 류실-tRNA 합성효소를 사용한 임의의 다른 Uaa의 혼입 효율 또한 이들 조작된 tRNA^Leu 돌연변이의 사용을 통해 향상될 수 있다.

또한 세포에서 관심 단백질 또는 펩타이드를 생산하는 키트가 본 발명에 포함되며, 여기서 단백질 또는 펩타이드는 하나 이상의 라이신 유사체를 포함하고, 키트는 세포의 관심 핵산의 선택자 코돈을 인식하는 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이 고세균-유래 tRNA^Pyl를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 용기를 포함한다. 구체적으로, 특정 실시형태에서, 변이 tRNA^Pyl는 서열번호 2 내지 27(예를 들어, 도 18의 구조 1 내지 6 참조) 또는 서열번호 2 내지 27의 전장 서열들 중 임의의 것과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함한다. 키트는 고세균 Pyl-tRNA 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 용기를 더 포함할 수 있다. 키트는 아지도라이신(AzK) 또는 아세틸라이신(AcK)와 같은 하나 이상의 라이신 유사체를 더 포함할 수 있다. 키트는 또한 관심 단백질 또는 펩타이드를 생산하기 위한 지침을 포함할 수 있다.

대안적인 실시형태에서, 키트는 세포에서 관심 단백질 또는 펩타이드를 생산하는 것에 관한 것이고, 여기서 단백질 또는 펩타이드는 하나 이상의 류신 유사체를 포함하고, 키트는 세포의 관심 핵산의 선택자 코돈을 인식하는 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이 대장균 유래 tRNA^Leu를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 용기를 포함하고, 여기서 변이 tRNA^Leu는 서열번호 29 내지 45 또는 서열번호 29 내지 45의 전장 서열들 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 중 어느 하나를 포함한다. 키트는 또한 도 18의 구조 7 내지 12와 같은 하나 이상의 류신 유사체 및 대장균 Leu-tRNA 합성효소를 암호화하는 폴리펩타이드 서열을 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 키트는 관심 단백질 또는 펩타이드를 생산하기 위한 지침을 포함할 수 있다.

또한 Uaa 혼입을 위해 안정적으로 혼입된 변이 tRNA-Pyl 또는 tRNA-Leu를 갖는 포유류 세포가 본 발명에 포함된다. 일 실시형태에서, 포유류 세포는 변이 tRNA-Pyl-Leu를 포함하고, 여기서 변이 tRNA-Pyl-Leu의 서열은 서열번호 2 내지 27로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서 Uaa는 구조 1 내지 7 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 피롤리실 잔기이다. 다른 실시형태에서, 세포는 서열번호 29 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 변이 tRNA-Leu을 포함하고, Uaa는 구조 7 내지 12 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 류신 유사체이다.

보다 구체적으로, 본 명세서에는 세포에서 발현된 사전-선택된 단백질(예를 들어, 조기 종결 코돈을 함유하는 유전자에서 발현된 단백질)에 비천연 아미노산을 혼입할 수 있는 변이 억제 tRNA를 암호화하는 250, 200, 150, 100, 75, 50카피 미만의 유전자를 포함하는 조작된 포유류 세포가 포함된다. 세포가 억제 tRNA를 암호화하는 25 내지 250, 25 내지 200, 25 내지 150, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 250, 50 내지 200, 50 내지 150, 50 내지 100, 50 내지 75, 75 내지 250, 75 내지 200, 75 내지 150, 75 내지 100, 100 내지 250, 100 내지 200, 100 내지 150카피의 유전자를 포함할 수 있는 것으로 고려된다. VADER 방식으로 개발된 변이 tRNA를 사용하여 표적 단백질에 아미노산을 혼입시키는 효율이 증가하면, 원하는 단백질 발현 수준을 얻기 위해 세포로 도입해야 하는 tRNA가 야생형 tRNA보다 더 적어진다. 세포에 도입되는 외인성 tRNA의 수가 더 적어지면 숙주 세포의 구조, 기능 또는 생존력에 덜 파괴적인 영향을 미칠 것으로 예상된다.

본 발명은 첨부된 구체적인 설명을 통해 이 분야의 통상의 기술자에게 명확해질 특징 및 이점을 입증한다.

이제 구성 및 부분 조합의 다양한 신규 세부사항을 포함하는 본 발명의 위와 같은 특징 및 다른 특징, 및 다른 이점이 첨부된 도면을 참조로 보다 구체적으로 기술되고 청구범위에 언급될 것이다. 본 발명을 구현하는 특정 방법 및 장치를 본 발명을 제한하는 것이 아닌 예시의 방식으로 나타낸다. 본 발명의 원리 및 특징은 본 발명의 범위를 벗어남 없이 다양하고 수많은 실시형태에서 적용될 수 있다.

첨부된 도면에서, 참조 부호는 서로 다른 도면 전체에 걸쳐 같은 부분을 의미한다. 도면은 축적에 맞춰진 것은 아니다; 대신 본 발명의 원리를 설명하는데 중점을 두었다. 특허 또는 출원 파일은 컬러로 제작된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 포함된 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본이 요청 및 필요한 수수료의 지불 시 관청에 의해 제공될 것이다. 도면들 중:
도 1a 내지 도 1b는 VADER 선별 계획을 보여준다. a, 포유류 세포를 낮은 MOI로 tRNA 라이브러리를 암호화하는 AAV2로 감염시킨다. Cap의 TAG-돌연변이, AAV 복제에 필요한 다른 유전적 구성요소 및 동족 aaRS를 암호화하는 플라스미드를 적합한 아지도-Uaa의 존재 하에서 형질주입을 통해 트랜스로(in trans) 제공한다. 활성형 직교성 tRNA 돌연변이는 캡시드에 Uaa를 혼입시키는 패키징된 자손 AAV2의 생성을 촉진하며, 이를 화학선택적 비오틴 접합 이후 스트렙타비딘 풀다운으로 단리한다. b, i) 대장균 tRNA^Tyr 및 EGFP(Tyr-EGFP) 및 ii) tRNA^Pyl 및 mCherry(Pyl-mCherry)를 암호화하는 두 AAV2 벡터를 10⁴:1의 비율로 혼합하고 MbPylRS 및 이의 기질 AzK를 사용하는 VADER 선별 계획에 적용한다. 생존한 집단의 FACS 분석은 30,000배를 초과하는 PylmCherry의 누적 풍부화를 보여준다. 데이터는 평균±s.d.(n=3 독립적 실험)를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2b는 tRNACUA^Pyl의 유도 진화를 보여준다. a, tRNACUA^Pyl의 4개의 서로 다른 라이브러리(A1, A2, T1, T2)를 생성하기 위해 무작위화한 서열을 4가지 다른 색으로 강조하였다. (도 2a는 서열번호 1을 개시함) b, 각 라이브러리의 선별에서 나온 tRNA 서열 분석. c, EGFP-39TAG 리포터를 사용하여 측정된 각각의 고유 완전 염기-쌍 tRNA^Pyl 선별체들에 대한 TAG 억제의 효율. 1mM AzK의 존재 하에서 또는 AzK가 없는 상태에서 pAAV 플라스미드(야생형 mCherry 리포터도 포함)에 암호화된 tRNA를 MbPylRS 및 EGFP-39TAG와 함께 HEK293T 세포에 공동형질주입하였다. 각 tRNA^Pyl 돌연변이에 의해 촉진된 EGFP-39TAG의 발현을 세포가 없는 추출물에서 측정하고, 야생형 mCherry 발현에 상대적으로 정규화하고, 야생형 tRNA^Pyl에 의해 촉진된 리포터 발현의 백분율로 표시하였다. 데이터는 평균±s.d.(n=3 독립적 실험)를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3c는 A2.1 tRNACUA^Pyl의 개선된 효율을 보여준다. a, 야생형(WT) 및 A2.1의 서열. b, 적절한 Uaa의 존재 하에서(+) 그리고 Uaa가 없는 상태에서(-) WT 또는 AcK-선택적 MbPylRS와 함께 WT 또는 A2.1 tRNA를 사용한 EGFP-39TAG의 발현. c, AzK의 존재 하에서 또는 AzK가 없는 상태에서 MbPylRS와 각각 tRNAUCA^Pyl 및 tRNAUUA^Pyl(WT 및 A2.1 돌연변이 모두에 대해)를 사용한 EGFP-39TGA 및 EGFP-39TAA의 발현. EGFP-39TAG의 발현은 HEK293T 세포가 없는 추출물에서 측정하였고 이의 야생형 상대와 비교하여 조사하였다. 데이터는 평균±s.d.(n=3 독립적 실험)를 나타낸다.
도 4a 내지 도 4b는 단일 AAV2-암호화 tRNA 유전자가 TAG-불활성화 캡시드 유전자(Cap)의 발현 및 자손 바이러스의 생산을 촉진할 수 있음을 보여준다. a, 실험 계획. HEK293T 세포를 매우 낮은 MOI로 tRNACUA^Pyl 및 야생형 EGFP 유전자를 암호화하는 AAV2로 감염시키고, 1mM AzK의 존재 하에서 또는 AzK가 없는 상태에서 i) AAV2 Rep 및 Cap-454-TAG 유전자, ii) MbPylRS 및 iii) AdHelper를 암호화하는 플라스미드로 추가 형질주입하였다. Cap의 454번 위치에 AzK를 혼입하고 바이러스를 교란시키지 않는 AAV2를 패키징하는 가능성은 이전에 입증되었다. 1 Cap의 454번 위치 TAG 코돈의 억제는 표면 노출 부위에서 3개의 겹치는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3(총 60카피) 모두에 AzK가 혼입되는 것을 야기한다. Cap-454-TAG를 야생형 Cap로 대체한 같은 실험 또한 수행하였다. 48시간 후, 이들 세포로부터 자손 바이러스를 수확하고 새롭게 접종된 HEK293T 세포를 감염시킨 후 FACS 분석하여 역가 측정하였다. b, Cap-454-TAG를 사용한 경우 자손 바이러스의 AzK-의존적 생산을 관찰하였고(삽입도에서 확대됨); 효율은 야생형 Cap를 대신 사용한 동일한 실험보다 유의적으로 낮았다. 데이터는 평균±s.d.(n=3 독립적 실험)를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 AAV2-454-AzK가 광-절단 가능 DBCO-비오틴 접합체의 생물직교적 부착 후 스트렙타비딘 결합 및 광방출에 의해 단리될 수 있음을 보여준다. a, 광절단 가능 DBCO-비오틴 접합체의 구조. b, AAV2-454-AzK를 서로 다른 농도의 DBCO-비오틴으로 1시간 동안 처리하고, 과량의 AzK를 사용하여 반응을 퀀칭하고, 투석으로 작은 분자를 제거하였다. 스트렙타비딘-아가로스를 사용하여 비오틴-표지된 바이러스를 포획하고, 365㎚ 조사로 방출하였다. 처리 전, 비오틴 변형 후 및 광-방출 후에 바이러스의 감염 역가를 측정(HEK293T 세포를 감염시킨 후 FACS로)하고, 부피 변화에 대해 정규화하였다. 비처리 바이러스와 비교한 감염성을 그래프로 나타내었다. 우리는 낮은 정도의 비오티닐화(5μM 시약에서; 각 비리온은 60 AzK 잔기를 보유함)가 AAV2의 감염성에 영향을 미치지 않지만, 캡시드의 증가된 변형(더 높은 DBCO-비오틴 농도)은 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 또한, 5μM DBCO-비오틴을 사용하여 변형한 바이러스는 스트렙타비딘 수지에서 좋은 효율(약 30%)로 회수되지만, 더 높은 시약 농도를 사용하면 수율이 낮았다. c, 이러한 최적화된 표지/포획 전략을 사용하면, mCherry 리포터를 암호화하는 AAV2-454-AzK를 야생형 캡시드(아자이드 없음)를 갖는 EGFP-암호화 AAV2와의 혼합물로부터 풍부화할 수 있다. 혼합된 바이러스 집단으로 감염시킨 HEK293T 세포의 선별 이전 및 이후의 형광 현미경 이미지를 보여준다.
도 6은 본 연구에 사용된 다양한 tRNA 및 형광 단백질을 함유하는 AAV2 화물의 개략도를 보여준다.
도 7은 혼합된 바이러스 집단(Tyr-EGFP:Pyl-mCherry)으로 감염시킨 세포의 선별 이전, 1단계 이후 및 2단계 이후의 대표적인 현미경 이미지를 보여준다. 각각에 대해 EGFP 및 mCherry 채널에서 병합된 이미지를 보여준다. 이들 실험에 대해 FACS로 측정한 두 바이러스의 비율(Pyl-mCherry:Tyr-EGFP)을 밑에 나타내었다.
도 8a 내지 도 8c는 야생형 tRNA^Pyl 또는 이의 가장 효율적인 진화 돌연변이 A2.1을 사용하여 억제된 넌센스-불활성화 EGFP 리포터를 발현하는 HEK293T 세포의 대표적인 형광 현미경 이미지를 보여준다. a, 1mM AzK의 존재 하에서 또는 AzK가 없는 상태에서 MbPylRS 및 EGFP-39-TAG 리포터와 함께 pAAV 플라스미드에 암호화된(야생형 mCherry 리모터도 암호화) 야생형 또는 A2.1 tRNA^Pyl의 공동-형질주입. mCherry의 발현을 각 실험의 대조군으로 나타내었다. b, 각각 tRNAUCAPyl 및 tRNAUUA^Pyl(야생형 및 A2.1 돌연변이)를 사용한 EGFP- 39TGA 및 EGFP-39TAA의 발현. 1mM AzK의 존재 하에서 또는 AzK가 없는 상태에서 pIDTsmart 벡터에 암호화된 tRNA를 적절한 EGFP 돌연변이 및 MbPylRS와 함께 공동-형질주입하였다. c, 야생형 및 A2.1 tRNA_CUA ^Pyl를 사용하여 EGFP-39TAG에 AcK를 혼입. 5mM AzK의 존재 하에서 또는 AzK가 없는 상태에서 pIDTsmart 벡터에 암호화된 tRNA를 EGFP-39TAG 돌연변이 및 MbPylRS-AcKRS3 돌연변이와 함께 공동-형질주입하였다.
도 9는 4개의 라이브러리 각각에서 선택된 완전 염기-쌍인(G:U 불안정 페어링을 포함) tRNA의 서열을 보여준다. 이들의 활성 특성은 도 2c를 참조. tRNA의 넘버링 방식은 밑에 나타내었다.
도 10a 내지 도 10c는 VADER 선별 계획을 통해 얻은 돌연변이 류실 tRNA의 개선된 활성을 보여준다. a, 야생형 TAG-억제 대장균 류실 tRNA(EcLtR)의 서열(서열번호 47 - 서열번호 28과 동일하지만 U가 아닌 T를 가짐)을 보여준다. b, 본 명세서에 기술된 방법으로 확인된 EcLtR의 개선된 돌연변이 중 하나(EcLtRh1)의 서열(서열번호 48 - 서열번호 30과 동일하지만 U가 아닌 T를 가짐)을 보여준다. c, Uaa를 선택적으로 충전하는 조작된 EcLeuRS 돌연변이와 함께 공동-형질주입된 경우, HEK293T 세포에서 EcLtR 및 EcLtR-h1의 활성을 보여준다. tRNA의 활성을 측정하기 위해 사용된 전장 EGFP-39-TAG 리포터의 발현. EcLtR-h1은 현저히 높은 효율을 보임.
도 11은 야생형 피롤리실 tRNA(서열번호 1)의 서열 및 2차 구조를 보여주며, 생산을 위한 억셉터 스템(acceptor stem)의 각 위치를 표적으로 하는 맞춤형 무작위화를 추가로 보여준다.
도 12는 VADER 선별 계획을 적용했을 때 tRNA 라이브러리에서 각 돌연변이에 대한 풍부화 정도를 특징짓기 위해 차세대 Illumina DNA 시퀀싱(NGS)을 사용한 결과를 보여준다. 결과로 나타나는 풍부화 인자들은 해당 tRNA의 효율을 추정하는데 사용될 수 있다.
도 13은 HEK293T 세포에서 EGFP-39TAG 리포터의 발현을 사용하여 입증된 선별된 tRNA-Pyl 돌연변이의 개선된 활성에 대한 평가 분석 결과를 보여주며(앞서 기술된 바와 같음), 야생형-mCherry 발현과 비교하여 정규화하고, 야생형 tRNA-Pyl에 의해 촉진되는 리포터 발현의 백분율로 표시하였다.
도 14a 내지 도 14b에서 상단(도 14a)은 Weblogo 형식(https://weblogo.berkeley.edu/)에서 120종의 서로 다른 세균성 류실-tRNA의 억셉터 스템 영역의 컴파일 서열을 보여준다. 이 형식에서, 이 tRNA 서열 세트 내 특정 위치에서 발견되는 특정 뉴클레오타이드의 상대적인 풍부도는 해당 문자 코드의 상대적인 높이로 표시된다. 하단(도 14b)은 야생형 대장균 류실-tRNA(서열번호 49/서열번호 28)의 서열 및 2차 구조를 보여주며, 서열 정렬로 설명한 억셉터 스템에서 각 위치를 표적으로 하는 맞춤형 무작위화를 보여준다.
도 15는 HEK293T 세포에서 EGFP-39TAG 리포터의 발현을 사용하여 입증된 선별된 tRNA-Leu 돌연변이의 개선된 활성에 대한 평가 분석 결과를 보여주며(앞서 기술된 바와 같음), 야생형-mCherry 발현과 비교하여 정규화하고, 야생형 tRNA-Leu에 의해 촉진되는 리포터 발현의 백분율로 표시하였다.
도 16a 내지 도 16b는 배큘로바이러스 전달을 통한 tRNA 발현 조절 하에서 WT tRNA-Pyl 및 tRNA-Pyl-2(서열번호 2)의 활성을 비교한 결과를 보여준다. HEK293T 세포에 1의 고정된 MOI로 MbPylRS 및 EGFP-39-TAG를 암호화하는 배큘로바이러스를 형질도입하고, 이와 함께 mCherry 리포터와 WT 또는 조작된(서열번호 2) tRNA-Pyl을 암호화하는 제2배큘로바이러스를 MOI를 증가시키면서(0.3에서 3으로) 형질도입하였다. AzK-없음을 제외한 모든 발현은 MbPylRS에 대한 Uaa 기질인 1mM AzK의 존재 하에서 수행하였다. mCherry의 발현을 하단에 나타내었으며, 여기서 mCherry의 발현은 tRNA-mCherry 바이러스의 증가하는 MOI를 사용함에 따라 선형으로 증가하며 같은 MOI에서의 WT와 조작된 tRNA-Pyl가 유사하다. 상단은 같은 MOI에서 야생형 EGFP를 암호화하는 동일한 바이러스와 비교한 EGFP-39-TAG의 발현을 보여준다. 조작된 tRNA-Pyl은 WT tRNA-Pyl에 비해서 훨씬 낮은 발현 수준(더 낮은 MOI)에서 EGF-39-TAG 발현을 촉진한다.
도 17a 내지 도 17b는 배큘로바이러스 전달을 통한 tRNA 발현 조절 하에서 WT tRNA-Leu 및 tRNA-Leu-30(서열번호 30)의 활성을 비교한 결과를 보여준다. HEK293T 세포에 1의 고정된 MOI로 EcLeuRS 및 EGFP-39-TAG를 암호화하는 배큘로바이러스를 형질도입하고, 이와 함께 mCherry 리포터와 WT 또는 조작된(서열번호 30) tRNA-Leu를 암호화하는 제2배큘로바이러스를 MOI를 증가시키면서(3에서 15로) 형질도입하였다. Uaa-없음 대조군을 제외한 모든 발현은 EcLeuRS에 대한 Uaa 기질인 1mM Cap의 존재 하에서 수행하였다. mCherry 리포터의 발현을 하단에 나타내었으며, 여기서 mCherry의 발현은 tRNA-mCherry 바이러스의 증가하는 MOI를 사용함에 따라 선형으로 증가하며 같은 MOI에서의 WT와 조작된 tRNA-Leu가 유사하다. 상단은 같은 MOI에서 야생형 EGFP를 암호화하는 동일한 바이러스와 비교한 EGFP-39-TAG의 발현을 보여준다. 조작된 tRNA-Leu는 WT tRNA-Leu에 비해서 훨씬 낮은 발현 수준(더 낮은 MOI)에서 EGF-39-TAG 발현을 촉진한다.
도 18은 본 명세서에 기술된 방법에 사용된 Uaa의 구조를 보여준다.
도 19a 내지 도 19b는 도 18에 나타난 다양한 Uaa의 보다 효율적인 혼입을 촉진하는 개선된 tRNA-Pyl(서열번호 2; 상단) 및 tRNA-Leu(서열번호 30; 하단)의 평가 분석 결과를 보여준다.
도 20은 AAV2 VPI 캡시드 단백질의 아미노산 서열(서열번호 46)을 보여준다.

본 발명은 매우 효율적인 활성 직교성 tRNA 변이 분자를 얻기 위한 포유류 세포에서의 tRNA의 바이러스-보조 유도 진화의 새로운 전략을 기술한다. 본 명세서에 기술된 방법으로 생산된 본 명세서에 기술된 바와 같은 tRNA 변이체는 넌센스 코돈 억제의 증가된(향상된) 생물학적 활성과 관심 단백질 내 부위-특이적 방식의 비천연 아미노산 혼입으로 특징지어진다. 이러한 매우 효율적인 tRNA 변이체에 대한 선별 방법은 억제 tRNA의 활성을 인간 바이러스(예를 들어, 아데노-관련 바이러스 또는 AAV)의 복제에 연결한다. 특정 실시형태에서, 방법은 i) 포유류 세포에 조절된 전달을 가능하게 하기 위해 바이러스 게놈에 tRNA 변이체의 라이브러리를 암호화하는 단계; ii) 바이러스 복제가 억제 tRNA의 활성에 의존하도록 하기 위해 필수 바이러스 단백질에 넌센스 코돈을 삽입하여 활성 tRNA 변이체를 암호화하는 비리온의 선택적인 증폭을 가능하게 하는 단계; 및 iii) 새롭게 증폭된 바이러스의 게놈을 단리 및 시퀀싱하여 풍부화된 tRNA 서열을 쉽게 회수할 수 있는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법은 불활성화 tRNA를 암호화하는 AAV 집단에 비해서 약 10,000 내지 50,000배의 범위 및 전형적으로는 약 30,000배 초과의 활성 억제 tRNA를 암호화하는 AAV 집단을 풍부화하는 능력을 구체적으로 입증하고, 따라서 나이브 tRNA 라이브러리에서 활성 돌연변이를 풍부화하기 위한 강력한 선별 계획을 제공한다. 특히, 본 명세서에 기술된 방법으로 확인 및 단리된 변이 tRNA의 활성에서 2.5배 내지 80배의 증가가 있다.

라이브러리에서 각각 가능한 돌연변이/변이체의 풍부화를 평가 및 확인하기 위해 본 명세서에 기술된 VADER 선별 방법의 이전 및 이후에 바이러스-암호화 tRNA 라이브러리의 차세대 시퀀싱(이러한 기술은 이 분야의 기술자들에게 알려져 있음 - 예를 들어, Illumina에서 상업적으로 이용가능한 키트/시약 참조)을 수행할 수 있다.

본 발명의 기술은, 예를 들어 고세균-유래 피롤리실 tRNA 및 대장균 유래 류실 tRNA를 포함하는, 포유류 세포에 Uaa를 혼입하기 위해 통상적으로 사용되는 다른 억제 tRNA를 진화시키기 위해 추가로 적용할 수 있다. 두 tRNA의 합성적 돌연변이 라이브러리의 적용은 포유류 세포에 Uaa를 혼입시키는 상당히 개선된 활성을 나타내는 변이체의 식별을 초래하였다. 돌연변이는 더 낮은 수준으로 발현되는 경우 야생형 상대와 비교하여 특히 개선된 효율을 보여주며, 추가로 향상된 고유의 효율을 확인시켜준다.

본 발명의 결과로, 포유류 세포에 Uaa를 혼입하기 위한 임의의 조작된 억제 tRNA의 효율을 진화시키는 일반적인 전략을 이제 이용할 수 있다. 바이러스 게놈에 tRNA 라이브러리를 암호화하고 생성된 라이브러리를 VADER 선별 계획에 적용하는 것은 활성 tRNA 돌연변이를 암호화하는 것의 선택적인 풍부화를 가능하게 할 것이다.

본 발명의 결과로, 그 활성이 AAV 캡시드 단백질의 발현에 연결될 수 있는 경우, 포유류 세포의 다른 생물학적 부분의 효율을 진화시키기 위해 사용될 수도 있는 방법을 이제 이용할 수 있다. 이러한 생물학적 부분은 프로모터 요소, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 신규 전사 인자, 수용체 단백질(예를 들어, GPCR), 유전자 또는 mRNA 편집 단백질(예를 들어, Cas/CRISPR), 포유류 투-하이브리드 시스템 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본 명세서에 기술된 바와 같은 VADER 선별 계획을 통해 생성되는 돌연변이 억제 tRNA(예를 들어, 피롤리실 및 류실)는 포유류 세포에서 매우 효율적인 Uaa 혼입을 가능하게 한다. 이러한 tRNA 돌연변이체는 포유류 세포에서 Uaa-혼입된 단백질(예를 들어, 항체 및 다른 치료 관련 단백질)의 수율을 개선하기 위해 사용될 수 있다.

VADER 선별 계획을 통해 생성되는 개선된 억제 tRNA(예를 들어, 피롤리실 및 류실)는 포유류 세포 및 조직으로 Uaa 혼입을 위한 유전적 장치를 전달하는 개선된 발현 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 중요하게는, 이들 tRNA가 더 효율적이므로, 게놈당 더 적은 카피의 tRNA 변이체를 암호화하는 것이 필요하다. 현재, (tRNA의 충분히 높은 발현을 달성하기 위해) 많은 tRNA 카피를 포함하는 것은 종종 발현 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)의 게놈 불안정성을 초래한다.

VADER 선별 계획을 통해 생성되는 개선된 억제 tRNA(예를 들어, 피롤리실 및 류실)는 Uaa를 혼입시키는 단백질 발현을 위한 안정적인 세포주를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 현재, 게놈당 많은 수의 tRNA 카피를 암호화해야 하는 요건은 포유류 게놈에 UAA-혼입 장치를 안정적으로 암호화하는 것을 어렵게 만든다. 새로운 tRNA의 증가된 효율은 훨씬 더 적은 카피의 사용을 허용할 것이다.

본 발명은 생물공학 응용을 위한 tRNA 및 다른 생물학적 부분의 활성을 개선할 수 있는 포유류 세포의 독특한 바이러스-보조 유도 플랫폼을 확립한다. 또한 포유류 세포에서 상당히 개선된 활성을 나타내는 억제 tRNA 변이체를 기술한다.

본 발명은 특히 이의 바람직한 실시형태를 참조로 나타내고 기술되지만, 이 분야의 기술자들은 첨부된 청구범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에서의 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

추가 설명없이, 이 분야의 기술자는 위의 설명을 기초로 본 발명을 최대한 활용할 수 있을 것이라고 믿는다. 따라서 다음의 특정 실시형태 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 이해되어야 하며, 어떤 방식으로든 개시내용의 나머지를 제한하는 것은 아니다.

실시예

다음의 실시예는 본 발명의 예시적인 실시형태를 제공하지만 그 범위를 제한하려는 것은 아니다.

본 명세서에 기술된 실시예는 이 분야의 통상의 기술자에게 예시적인 프로토콜로서 이해될 것이다. 이 분야의 통상의 기술자는 아래의 절차를 적절하게 그리고 필요에 따라 변경할 수 있을 것이다.

재료 및 방법

세포 배양. HEK293T 세포(ATCC)를 페니실린/스트렙토마이신(HyClone, 페니실린 100U/㎖ 및 스트렙토마이신 100㎍/㎖의 최종 농도) 및 10% 소 태아 혈청(Corning)이 보충된 고포도당-DMEM(HyClone)에서 37℃ 및 5% CO₂에서 유지시켰다. 아래의 DMEM에 대한 모든 참조는 여기에 기술된 완전 배지를 의미한다.

일반적인 클로닝. 모든 클로닝을 위해, 대장균 TOP10 균주를 형질전환 및 플라스미드 증식을 위해 사용하였고 고체 및 액체 배양을 위해 LB를 사용하였다. 모든 PCR 반응은 Phusion Hot Start II DNA Polymerase(Thermo Scientific)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 제한 효소 및 T4 DNA 리가제는 New England Biolabs(NEB)에서 입수하였다. 모든 DNA 올리고는 Integrated DNA Technologies(IDT)에서 구입하였다. Sanger 시퀀싱은 Eton Bioscience에서 수행하였다.

비천연 아미노산 아지도-라이신(AzK)은 Iris Biotech GMBH(독일)에서 구입하였다. Nε-아세틸라이신(AcK)은 Bachem에서 구입하였다.

AAV(야생형 캡시드)로 모의 및 라이브러리 tRNA의 패키징 및 역가 측정. 다양한 화물을 AAV-2에 패키징하기 위해, 800만개의 HEK293T 세포를 10㎝ 조직 배양 접시에 접종하였다. 다음날, 폴리에틸렌이민(PEI)(Sigma)을 사용하여 각각 8㎍의 적절한 화물 플라스미드(pAAV-ITR-tRNA-형광 단백질), pHelper 및 pAAV-RC2로 세포를 형질주입하였다. 형질주입 24시간 후 배지를 새로운 DMEM으로 교환하였다. 형질주입 72시간 후, 앞서 기술된 바와 같이 세포를 재현탁하고, 펠릿화하고, 동결/해동으로 용해시켰다. PEG 침전으로 바이러스를 농축 및 준-정제하고, FBS를 함유하는 1㎖ DMEM에 재현탁하고 급송 동결시켰다.

실시예에 기술된 서열

실시예 및 응용 전반에 걸쳐 기술된 야생형 및 유래된 서열이 하기 표에 나열되어 있다:

실시예 1: 양성적 선별.

800만개의 HEK293T 세포를 각각 3개의 10㎝ 조직 배양 접시에 접종하였다. 다음날, 겉보기 5의 MOI(실제 MOI는 형질주입 시약인 PEI의 존재 하에서 상당히 감소됨)로 tRNAPyl 라이브러리를 함유하는 바이러스로 세포를 감염시켰다. 감염 4시간 후, PEI를 사용하여 접시당 22㎍의 pHelper 및 10㎍의 pIDTSmart-RC2(T454TAG)-PylRS로 세포를 형질주입하였다. 또한 이 시점에 1mM AzK를 첨가하였다. 형질주입 1일 후 배양 배지를 1mM AzK를 함유하는 신선한 DMEM으로 교체하였다. 형질주입 3일 후 세포를 수확하고 바이러스 단리를 위해 용해시켰다. 배양 배지를 저장하고 투명해진 용해물과 재결합하고 이 혼합물을 500U universal nuclease(Thermo Scientific)로 30분 동안 처리하였다. 앞서 기술된 바와 같이 11% 폴리에틸렌 글리콜(Fisher)을 사용한 PEG 침전으로 바이러스를 회수하고 3㎖ PBS에 재현탁하였다. 12-웰 플레이트에서 소규모 모의 양성 선별을 수행하였다. 웰당 70만개의 세포를 접종하고 다음날 tRNAPyl-mCherry 화물을 함유한 AAV로 감염시켰다. 4시간 후 위의 선별에 대해 기술된 바와 같이 세포를 형질주입하였지만, 형질주입 혼합물 및 AzK는 15배 축소하였다. PEI 단독 웰의 경우, 비슷한 양의 형질주입 시약을 처리하였지만 플라스미드는 처리하지 않았다. 형질주입 다음날 배지를 1mM AzK를 함유하는 신선한 DMEM으로 교환하였다. 형질주입 3일 후 바이러스를 수확하고 상기 선별에 대해 기술된 바와 같이 PEG-침전시켰다. 12-웰 플레이트의 융합 세포를 하나의 모의 선별 웰의 전체 생산량으로 감염시키고 유세포 분석으로 분석하였다.

실시예 2: 음성적 선별.

양성적 선별로부터의 바이러스(3㎖)를 광절단 가능한 DBCO-설포-비오틴(Jena Biosciences)과 혼합하면서 암 조건에서 1시간 동안 5μM의 농도에서 반응시켜 표지하였다. 표지 직후, 과량의 DBCO-비오틴을 AzK(1mM 최종 농도)로 퀀칭하고 반응물을 4℃에서 1ℓ PBS로 Slide-A-Lyzer 100kDa MWCO 장치(Thermo Scientific)를 사용하여 밤새 투석하였다. 투석한 바이러스 혼합물을 3개의 2㎖ 튜브에 나누어 담고 각각 4℃에서 400㎕ 스트렙타비딘 아가로스 수지(Thermo Scientific)와 함께 밤새 교반하였다. 다음날, 각 튜브의 비드를 추가 NaCl을 함유(최종 농도 300mM)하는 1㎖ PBS로 세척 사이에 혼합하여 8회 세척하였다. 최종적으로, 세척된 비드를 8㎖ PBS(300mM NaCl)에 재현탁하고 365㎚ UV 다이오드 어레이(Larson Electronics)를 사용하여 4회의 30초 조사를 통해 조사 사이에 혼합하면서 바이러스를 수지로부터 용출시켰다.

실시예 3: 바이러스 DNA 회수, 증폭 및 클로닝.

Amicon Ultra-4 100kDa MWCO 원심분리형 농축기(Millipore)를 사용하여 용출된 바이러스를 3㎖에서 300㎕로 농축하였다. 바이러스 캡시드 단백질을 변성시키고 DNA를 노출시키기 위해 이 혼합물을 10분 동안 100℃로 가열하였다. 이후 바이러스 DNA를 깨끗이 하고 효모 tRNA(Ambion)를 사용한 에탄올 침전으로 농축하고 50㎕의 최종 부피에 재현탁하였다. 이 혼합물 20㎕를 200㎕ PCR 반응물에 첨가하고 tRNAAmp-F 및 R 프라이머로 증폭하였다. 생성된 DNA를 KpnI 및 NcoI로 소화시키고 본래의 라이브러리 생성과 같은 프로토콜을 사용하여 라이브러리 클로닝 벡터에 클로닝하였다.

실시예 4: Pyl-mCherry 및 Tyr-GFP를 사용한 모의 선별.

도 1에 나타낸 모의 선별은 시작 라이브러리 바이러스가 pAAV-ITR-PytR-mCherry로부터 만들어진 바이러스 대 pAAV-ITR-EcYtR-GFP로부터 만들어진 바이러스의 1:10,000 혼합물인 것을 제외하고, 위와 같은 프로토콜을 따랐다. 바이러스 역가 측정에 대해 기술된 바와 같지만, 여기서 12-웰 플레이트 내 세포는 양성적 또는 음성적 선별 후 200㎕의 바이러스 풀(pool)로 감염된, 유세포 분석으로 모의 선별 결과를 분석하였다. 적색 및 녹색 형광 세포의 수를 세어 바이러스 비율을 결정하였다.

실시예 5: 히트 시퀀싱 및 특성화.

각 라이브러리에 대해, 위에서 생성된 형질전환 플레이트에서 30 내지 50개의 콜로니를 선택하고 Sanger 시퀀싱(Eton Bioscience)을 의뢰하였다. 모든 무작위 염기가 짝을 이루는 모든 서열을 잠재적 히트로 처리하였고, 분석을 위해 이들 tRNA를 pAAV-ITR-PytR-mCherry에 서브클로닝하였다. 초기 히트 분석은 1mM AzK의 존재 및 부재 하에서 0.5㎍의 각 잠재적 히트 pAAV-ITR-PytR-mCherry 플라스미드, pIDTSmart-MbPylRS 및 pAcBac1-GFP(39TAG)로 24-웰 플레이트의 HEK293T 세포를 형질주입하여 수행하였다. 형질주입 2일 후, 세포를 CelLytic M 완충제(Sigma)로 용해하고 Molecular Devices SpectraMax M5 마이크로플레이트 리더 상에서 EGFP 및 mCherry 형광을 측정하였다. 형질주입하지 않은 웰에 대한 값을 빼고, EGFP-형광을 각 웰에 대한 mCherry 형광으로 정규화하였다. 최상의 히트인 Ac2.1(GGG/CCU)를 다른 종결 코돈 및 다른 합성효소 및 Uaa, AcKRS3 및 AcK를 사용한 추가 분석을 위해 선택하였다. 12-웰 플레이트의 HEK293T 세포를 야생형 또는 진화된 tRNA를 함유하는 0.375㎍의 pIDTSmart-PytR, 적절한 합성효소를 함유하는 0.375㎍의 pIDTSmartaaRS 및 하나 또는 두 개의 적절한 종결 코돈을 함유하는 0.75㎍의 pAcBac1-EGFP로 형질주입하였다. 야생형 EGFP 대조군 웰은 pIDTSmart-PytR(TAG, 야생형), pIDTSmart-MbPylRS 및 pAcBac1-EGFP(야생형)를 같은 비율로 사용하였다. 형질주입 2일 후, 세포를 용해하고 마이크로플레이트 리더로 EGFP 형광을 측정하였다. 형질주입하지 않은 웰의 값을 뺐다.

실시예 6: 맞춤형-무작위화 돌연변이 라이브러리를 사용한 피롤리실-tRNA의 추가 진화.

제1세대 VADER 실험에서, 작은 돌연변이 라이브러리를 생성하기 위해 1회에 tRNA의 짧은 부분(1회에 3 염기쌍)만을 무작위화하였고, 선별에 적용하였다. 이는 개선된 돌연변이의 식별로 이어졌지만, 우리는 더 큰 서열 공간을 무작위화하고 선별하는 능력이 더 효율적인 돌연변이의 식별로 이어질 수 있다고 추측하였다. 그러나, tRNA의 더 큰 부분을 무작위화하는 것은 라이브러리의 크기를 기하급수적으로 증가시킨다. 예를 들어, 스템 영역에서 하나의 추가 염기쌍을 무작위화하는 것은 라이브러리 구성원의 수를 16배 증가시킨다. 기술적인 한계 때문에, 모든 가능한 돌연변이의 완전한 범위를 보장하면서, 10⁵보다 더 큰 라이브러리 크기를 처리하기 위해 우리의 VADER 플랫폼을 사용하는 것은 현재는 어렵다. 이러한 크기 한계는 활성을 조작하기 위해 tRNA의 스템 영역에서 4개를 초과하지 않는 염기쌍을 완전 무작위화하도록 제한한다. 그러나, tRNA-스템 영역의 염기쌍을 완전히 무작위화하는 경우, 생성되는 돌연변이 16개 중 6개만이 여전히 스템 영역의 안정성에 필수적인 염기쌍 상호작용(A:T, G:C 또는 G:U)을 유지할 수 있다. 염기쌍을 형성할 수 없는 돌연변이의 대부분은 tRNA의 중간에 짝을 이루지 않는 '거품'을 생성하며, 이는 전형적으로 tRNA 성능을 위태롭게 한다. 각 염기쌍이 원하는 염기쌍 서열로만 무작위화되는 tRNA 라이브러리를 합성하는 다른 방법이 고려되었다. 이러한 접근방식은 최근 DNA 합성 기술의 발전을 활용하여, 상당한 길이(300 뉴클레오타이드 까지)의 많은 수의 고유 DNA 올리고뉴클레오타이드의 합성을 가능하게 한다. 이는, 각 라이브러리 구성원의 각 위치를 지정할 수 있는, 전체 tRNA 유전자를 암호화하는 DNA 라이브러리의 합성을 가능하게 하여, 염기쌍을 이루는 돌연변이 만을 포함하고 그렇지 않은 것은 피하는 것을 가능하게 한다.

TWIST bioscience의 DNA 합성 서비스를 사용하여, 도 11에 나타낸 바와 같이, 억셉터 스템의 6개 염기쌍이 염기쌍 서열의 원하는 조합으로 무작위화된, 피롤리실-tRNA 라이브러리를 생성하였다. 생성한 라이브러리를 AAV2에 패키징하고 위에 기술된 바와 같은 VADER 선별 계획에 이중으로 적용하였다. VADER 선별에 적용하기 전 및 후에 차세대 시퀀싱을 위한 Illumina 플랫폼을 사용하여 AAV2-패키징 라이브러리를 시퀀싱하였다(도 12). 선별 단계 이전 및 이후의 풍부도를 사용하여 각 돌연변이의 풍부화를 계산하고 풍부화의 정도를 기초로 돌연변이를 순위화하였다. 선별에서 가장 높은 풍부화 정도를 나타낸 돌연변이를 재합성하고 이전에 기술된 바와 같이 EGFP-39-TAG 발현 분석을 사용하여 이의 활성을 벤치마킹하였다(도 13). 도 13에 나타낸 바와 같이, 26종의 tRNA-Pyl 돌연변이가 야생형 tRNA-Pyl에 비해서 적어도 250% 더 높은 활성을 나타내었고, 활성이 가장 높은 돌연변이는 WT-tRNA-Pyl에 비해서 540%의 활성을 나타내었다.

실시예 7: 포유류 세포에서의 향상된 넌센스 억제 활성을 위한 대장균 류실-tRNA의 진화.

포유류 세포에서의 tRNA 활성을 조작하기 위한 VADER 선별 계획의 적용은 피롤리실 tRNA만으로 제한되지 않는다. 이는 포유류 세포의 Uaa 혼입에 적합한 다른 tRNA의 활성을 개선하기 위해서도 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 VADER 방식을, 포유류 세포의 Uaa 혼입을 위해 이전에 사용되었던(J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 14306; Biochemistry 2018, 57, 441) 동족 대장균 류실-tRNA 합성효소(EcLeuRS)와 함께, 대장균 류실 tRNA(tRNA-Leu)의 활성을 개선하기 위해서도 사용하였다. tRNA-Pyl 상에서 본 명세서에 기술된 작업을 통해 나타난 바와 같이, 억셉터 스템의 조작은, 이 영역이 번역 시스템의 많은 구성요소와 연결되기 때문에, 종종 매우 매력적이다. '스마트' 라이브러리를 설계하기 위해, 120종의 알려진 세균성 tRNA 서열을 정렬하여 억셉터 스템의 공통 서열을 생성하였다(도 14). 이 공통 서열은 억셉터 스템의 어느 부분이 tRNA-aaRS 상호작용에 중요할 수 있고(동일성 요소), 어떤 영역이 변경을 위한 자리를 제공하는지를 예측하기 위한 가이드로 사용될 수 있다. 이러한 접근방식을 기초로, tRNA-Leu 억셉터 줄기의 맞춤형-무작위화 라이브러리(도 14)를 설계하였다. 이 라이브러리를 AAV2에 패키징하고 위에 기술된 바와 같이 VADER 선별 계획에 적용하였다. 아지도-함유(아지도-변형) Uaa AzK를 충전시킬 수 있는 앞서 개발된 다중특이적 EcLeuRS 돌연변이(Biochemistry 2018, 57, 441)를 tRNA 돌연변이를 충전하기 위해 VADER 계획에 사용하였다. 위에 기술된 바와 같이, 차세대 Illumina DNA 시퀀싱을 사용하여 선별 이전 및 이후에 각 라이브러리 구성원의 풍부화를 측정하고, 가장 풍부화를 나타내는 하나를 재합성하고 앞서 기술된 EGFP-39-TAG 리포터 발현 분석을 사용하여 특성화하였다. 도 15에 나타난 바와 같이, 17종의 tRNA-Leu 돌연변이가 야생형 tRNA-Leu에 비해서 적어도 1,000% 더 높은 활성을 나타냈고, 가장 높은 활성의 돌연변이는 WT-tRNA-Leu에 비해서 약 13,000% 향상된 활성을 나타내었다. WT-tRNA-Leu를 포함하는 이들 tRNA 서열은 안티코돈 루프의 첫 번째 뉴클레오타이드인 33번 위치에 U를 포함한다. 이 U에서 C로의 돌연변이는 전형적으로 넌센스 억제 안티코돈을 위한 더 좋은 상황을 제공하기 때문에 향상된 넌센스 억제 활성을 생성할 수 있다. 이 경우인지 확인하기 위해, 29번 돌연변이(서열번호 29)의 33번째 U를 C로 돌연변이시켜 30번 돌연변이(서열번호 30)를 생성하였다. 실제로, 이 돌연변이는 29번에 비해서 상당히 개선된 억제 활성을 나타내었다(도 15). 이러한 돌연변이를 다른 확인된 tRNA-Leu 돌연변이(서열번호 31 내지 45)에 도입하면 이들 활성의 추가 개선 또한 이루어질 것이다.

실시예 8: 조작된 tRNA 돌연변이는 발현 수준이 제한적으로 조절될 때 야생형 상대와 비교하여 추가 개선을 나타낸다.

지금까지, 모든 tRNA 활성의 평가는 포유류 세포에 tRNA, aaRS 및 리포터를 암호화하는 플라스미드의 일시적인 형질주입으로 수행하였다. 포유류 세포 배양의 일시적인 형질주입은 조절되지 않고 이질적인 수준의 DNA 전달을 초래하여, 다른 세포는 그렇지 않지만, 세포의 일부가 매우 높은 수준으로 관련 플라스미드를 받아들이고 과발현한다는 것이 잘 알려져 있다. 결과적인 암호화 tRNA 및 aaRS의 과발현은 이들의 빈약한 고유 활성을 보정하여 이들 고유 효율의 추정치를 부풀릴 수 있다(ACS Synth. Biol. 2017, 6, 13). 결과로서, 일시적 형질주입에 의한 두 개의 서로 다른 Uaa 혼입 시스템을 비교하면 더 약한 시스템의 효율이 과대평가된 정확하지 않은 추정치를 얻을 수 있음이 본 명세서에 기술된 바와 같이 추가로 입증된다. 일시적-형질주입 분석을 사용하여 관찰된 효율의 차이는 야생형 상대와 비교하여 다른 tRNA 돌연변이의 고유 효율의 실제 개선 정도를 과소평가할 수 있다고 추측되었다.

이러한 어려움을 극복하기 위해, 포유류 세포에 이식유전자의 조절되고 보다 동질적인 전달을 가능하게 하는 이전에 개발된 배큘로바이러스 벡터(ACS Synth. Biol. 2017, 6, 13)를 사용하였다. 이식유전자의 발현 수준은 바이러스-대-세포 비율을 체계적으로 변경하여 간단하게 조절할 수 있다. 이러한 전달 시스템을 사용하여, 넓은 스펙트럼의 서로 다른 발현 수준에 걸쳐 Uaa 혼입에 대한 두 개의 서로 다른 유전적 시스템을 비교하는 것이 가능하며, 이는 고유 성능의 차이를 보다 정확하게 나타낸다. 이러한 접근방식을 사용하여 조작된 tRNA-Pyl 및 tRNA-Leu 돌연변이의 활성을 이들의 야생형 상대와 비교하기 위해, 야생형 mCherry 리포터 및 WT tRNA-Pyl, WT-tRNA-Leu, tRNA-Pyl-2(서열번호 2) 또는 tRNA-Leu-30(서열번호 30)의 4종의 tRNA 중 하나를 암호화하는 배큘로바이러스 벡터를 제작하였다. EGFP-39-TAG 리포터뿐만 아니라 필요한 aaRS(tRNA-Pyl에 대한 MbPylRS 또는 tRNA-Leu에 대한 EcLeuRS)를 전달하기 위해 제2배큘로바이러스를 개발하였다. HEK293T 세포에 1의 고정된 MOI(감염 다중도 또는 세포당 첨가되는 감염성 바이러스 입자의 수)로 aaRS/EGFP-39-TAG 배큘로바이러스를 형질도입하고, 이와 함께 야생형 또는 조작된 tRNA 바이러스를 MOI를 증가시키면서(0.3에서 15로) 형질도입하였다. 세포가 없는 추출물에서 mCherry(tRNA-배큘로바이러스가 원하는 수준으로 전달되었는지를 확인) 및 EGFP-39-TAG(TAG에 대한 Uaa 혼입 효율을 표시)의 특징적인 형광을 사용하여 이들의 발현을 형질주입 후 48시간 동안 기록하였다. 도 16에 나타난 바와 같이, 조작된 tRNA-Pyl는 WT tRNA-Pyl와 비교하여 훨씬 더 낮은 발현 수준(더 낮은 MOI)에서 EGF-39-TAG 발현을 촉진한다. 예를 들어, WT tRNA-Pyl 바이러스를 1 MOI로 사용한 경우, EGFP-39-TAG 발현은 야생형 EGFP 대조군에 대해 단지 0.5%이지만, 조작된 tRNA-Pyl(서열번호 2)를 암호화하는 바이러스는 같은 MOI에서 9.3%의 EGFP-39-TAG 발현을 제공하며, 이는 발현 수준에서 후자의 효율이 18배 초과로 더 높다는 것을 나타낸다. 더 높은 3의 MOI에서, 조작된 tRNA는 야생형에 비해서 약 14배 더 높은 활성을 보여, 더 높은 발현이 고유 활성에서의 진정한 차이를 과소평가할 수 있음을 강조한다. 우리는 또한 같은 방식으로 야생형 tRNA-Leu와 이의 조작된 상대 중 하나(서열번호 30)의 활성을 비교하였다. 도 17에 나타난 바와 같이, 조작된 tRNA는 실험한 가장 높은 MOI(15)에서 거의 29배의 개선된 EGFP-39-TAG 발현을 제공한다. tRNA가 더 낮은 수준으로 발현된 경우, 차이는 더 극명하였다; 예를 들어, MOI 5에서, WT tRNA-Leu는 검출 가능한 EGFP-39-TAG 발현을 제공하지 않지만, tRNA-Leu-30은 야생형 리포터에 비해서 16% 수준의 발현을 허용한다. 조작된 tRNA가 더 낮은 발현 수준에서 상당히 더 높은 효율을 제공하는 것은 높은 Uaa 혼입 효율을 제공하는 게놈적으로 혼입된 aaRS/tRNA를 갖는 안정한 포유류 세포주의 생성을 훨씬 더 쉽게 만들 것이기 때문에, 매우 중요하다.

실시예 9: 조작된 tRNA 돌연변이는 많은 Uaa를 보다 효율적인 혼입한다.

이론에 얽매임없이, 비록 조작된 tRNA의 개선된 활성이 완전히 이해되지는 않지만, 이들이, 다른 생명 영역에서 차용된, 야생형 상대보다 포유류 번역 시스템과 훨씬 더 잘 연결될 가능성이 있다. 따라서, 이들 tRNA의 개선된 활성은 이의 동족 aaRS의 조작된 돌연변이에 의해 혼입될 수 있는 모든 Uaa의 더 효율적인 혼입을 가능하게 할 것이다. 이러한 가설을 입증하기 위해, 조작된 MbPylRSI(구조 1 내지 6; 도 18) 또는 EcLeuRS(구조 7 내지 12; 도 18)를 사용하여 혼입될 수 있는 몇몇 Uaa에 대한 혼입 효율을 상술한 EGFP-39-TAG 발현 분석을 사용하여 평가하였다. 실제로, 이들 각각의 Uaa는 2종의 조작된 tRNA에 의해 야생형 상대와 비교하여 훨씬 더 높은 효율로 리포터에 혼입되었다(도 19).

본 발명은 특히 이의 바람직한 실시형태를 참조로 나타내고 기술되었지만, 이 분야의 기술자들은 첨부된 청구범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에서의 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> TRUSTEES OF BOSTON COLLEGE <120> ENHANCED PLATFORMS FOR UNNATURAL AMINO ACID INCORPORATION IN MAMMALIAN CELLS <130> 0342.0008WO1 <140> PCT/US2020/038766 <141> 2020-06-19 <150> US 62/864,570 <151> 2019-06-21 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 1 ggaaaccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggguuuccgc ca 72 <210> 2 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 2 gggcggcuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggcugcccgc ca 72 <210> 3 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 3 gggugacuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gguugcccgc ca 72 <210> 4 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 4 ggggggcuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggcuccccgc ca 72 <210> 5 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 5 gggcggcuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gguugcccgc ca 72 <210> 6 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 6 gggcgccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gggcgcccgc ca 72 <210> 7 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 7 ggggagguga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gccuccccgc ca 72 <210> 8 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 8 ggggaccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggguccccgc ca 72 <210> 9 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 9 ggccggguga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gccuggccgc ca 72 <210> 10 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 10 ggggaccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggguccucgc ca 72 <210> 11 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 11 ggggcccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggggucccgc ca 72 <210> 12 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 12 gggggccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gggcucccgc ca 72 <210> 13 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 13 gggguccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gggaucccgc ca 72 <210> 14 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 14 ggggaccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggguucccgc ca 72 <210> 15 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 15 ggggagguga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gucuucccgc ca 72 <210> 16 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 16 ggggggguga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gcccccucgc ca 72 <210> 17 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 17 ggugggguga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gcccuaccgc ca 72 <210> 18 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 18 gggggucuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggacucccgc ca 72 <210> 19 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 19 gggucccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggggguccgc ca 72 <210> 20 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 20 ggggaccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggguucucgc ca 72 <210> 21 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 21 gggcggcuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggccgcccgc ca 72 <210> 22 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 22 gagcaccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gggugcucgc ca 72 <210> 23 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 23 ggggggguga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gcccccccgc ca 72 <210> 24 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 24 gaggggguga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 gcccccucgc ca 72 <210> 25 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 25 gggagccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggguucccgc ca 72 <210> 26 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 26 gggagccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggguucccgc ca 72 <210> 27 <211> 72 <212> RNA <213> Methanosarcina barkeri <400> 27 gaggaccuga ucauguagau cgaacggacu cuaaauccgu ucagccgggu uagauucccg 60 ggguucucgc ca 72 <210> 28 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 28 gcccggaugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgcuccg gguacca 87 <210> 29 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 29 gcccggaugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgcuccg ggcacca 87 <210> 30 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 30 gcccggaugg uggaaucggu agacacaagg gacucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgcuccg ggcacca 87 <210> 31 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 31 gggcgugugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgccgcg cccacca 87 <210> 32 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 32 gggcgcgugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgccgcg cccacca 87 <210> 33 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 33 gggcaugugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgccaug cccacca 87 <210> 34 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 34 gggcacgugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgccgug cccacca 87 <210> 35 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 35 gggggugugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgccgcc cccacca 87 <210> 36 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 36 gggggcgugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgccguc cccacca 87 <210> 37 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 37 ggggaugugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgccguc cccacca 87 <210> 38 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 38 ggggacgugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgccguc cccacca 87 <210> 39 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 39 gcccguaugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgcugcg ggcacca 87 <210> 40 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 40 gggauagugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgccuau cccacca 87 <210> 41 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 41 gggcaugugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgccgug cccacca 87 <210> 42 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 42 gggcagaugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgcucug cccacca 87 <210> 43 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 43 gggcguaugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgcugcg cccacca 87 <210> 44 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 44 gggcaagugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgccuug cccacca 87 <210> 45 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 45 gcacacaugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgcugug ugcacca 87 <210> 46 <211> 735 <212> PRT <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 46 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 47 <211> 87 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 47 gcccggatgg tggaatcggt agacacaagg gattctaaat ccctcggcgt tcgcgctgtg 60 cgggttcaag tcccgctccg ggtacca 87 <210> 48 <211> 87 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 48 gcccggatgg tggaatcggt agacacaagg gactctaaat ccctcggcgt tcgcgctgtg 60 cgggttcaag tcccgctccg ggcacca 87 <210> 49 <211> 87 <212> RNA <213> Escherichia coli <400> 49 gcccggaugg uggaaucggu agacacaagg gauucuaaau cccucggcgu ucgcgcugug 60 cggguucaag ucccgguccg gguacca 87

Claims

변이 고세균성 또는 세균성 억제 tRNA를 포함하는 조성물로서,
상기 변이 tRNA는 이의 야생형 상대 tRNA에 비해서 비천연 아미노산을 포유류 단백질에 혼입(incorporate)시키는 증가된 활성을 갖는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 변이 tRNA의 활성이 상기 야생형 상대 tRNA보다 약 2.5 내지 80배 증가된, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변이 고세균성 tRNA는 메타노사르시나카에아(Methanosarcinacaea) 또는 디설피토박테리움(Desulfitobacterium) 과에서 유래되는, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 변이 고세균성 tRNA는 메타노사르시나카에아 바르케리(M. barkeri)(Mb), 메타노사르시나카에아 알버스(M. alvus)(Ma), 메타노사르시나카에아 마제이(M. mazei)(Mm) 또는 디설피토박테리움 하프니센스(D. hafnisense)(Dh)로 이루어진 군에서 선택되는, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 변이 tRNA는 서열번호 1에서 유래된 피롤리실 tRNA(tRNA^Pyl)인, 조성물.
제5항에 있어서, 상기 변이 tRNA^Pyl는 서열번호 2 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 서열 또는 서열번호 2 내지 27 중 임의의 전장 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변이 세균성 tRNA는 대장균(E. coli) tRNA에서 유래되는, 조성물.
제7항에 있어서, 상기 변이 tRNA는 서열번호 28에서 유래된 류실 tRNA(tRNA^Leu)인, 조성물.
제8항에 있어서, 상기 변이 tRNA^Leu는 서열번호 29 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 서열 또는 서열번호 29 내지 45 중 임의의 전장 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 구조 1 내지 6 중 임의의 것에 따르는, 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 구조 7 내지 12 중 임의의 것에 따르는, 조성물.
변이 고세균성 또는 세균성 억제 tRNA를 포함하는 바이러스 벡터로서, 상기 변이 tRNA는 이의 야생형 상대 tRNA에 비해서 비천연 아미노산을 포유류 단백질에 혼입시키는 증가된 활성을 갖는, 바이러스 벡터.
제12항에 있어서, 상기 변이 tRNA의 활성이 상기 야생형 상대 tRNA보다 약 2.5 내지 80배 증가된, 바이러스 벡터.
제13항에 있어서, 상기 변이 고세균성 tRNA는 메타노사르시나카에아(Methanosarcinacaea) 또는 디설피토박테리움(Desulfitobacterium) 과에서 유래되는, 바이러스 벡터.
제14항에 있어서, 상기 변이 고세균성 tRNA는 메타노사르시나카에아 바르케리(M. barkeri)(Mb), 메타노사르시나카에아 알버스(M. alvus)(Ma), 메타노사르시나카에아 마제이(M. mazei)(Mm) 또는 디설피토박테리움 하프니센스(D. hafnisense)(Dh)로 이루어진 군에서 선택되는, 바이러스 벡터.
제15항에 있어서, 상기 변이 tRNA는 서열번호 1에서 유래된 피롤리실 tRNA(tRNA^Pyl)인, 바이러스 벡터.
제16항에 있어서, 상기 변이 tRNA^Pyl는 서열번호 2 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 서열 또는 서열번호 2 내지 27 중 임의의 전장 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
제12항에 있어서, 상기 변이 세균성 tRNA는 대장균 tRNA에서 유래되는, 바이러스 벡터.
제18항에 있어서, 상기 변이 tRNA는 서열번호 28에서 유래된 류실 tRNA(tRNA^Leu)인, 바이러스 벡터.
제19항에 있어서, 상기 변이 tRNA^Leu는 서열번호 29 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 서열 또는 서열번호 29 내지 45 중 임의의 전장 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 구조 1 내지 6 중 임의의 것에 따르는, 바이러스 벡터.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 구조 7 내지 12 중 임의의 것에 따르는, 바이러스 벡터.
제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노-관련 바이러스(AAV)인, 바이러스 벡터.
제12항 내지 제23항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터를 포함하는, 세포.
제24항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 세포.
제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 세포는,
a) 바이러스 복제에 필수적인 단백질로서, 넌센스 코돈이 상기 단백질 서열에 삽입되어 바이러스 복제를 상기 변이 억제 tRNA의 활성에 의존적으로 만드는, 상기 단백질;
b) 동족 Uaa RNA 합성효소(UaaRS); 및
c) 바이러스 복제에 필요한 유전적 구성요소
를 암호화하는 플라스미드를 더 포함하는, 포유류 세포.
제26항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스이고 상기 필수 바이러스 단백질은 Cap(서열번호 46)의 TAG-돌연변이인, 포유류 세포.
제27항에 있어서, 상기 동족 aaRS는 Mb ^PylRS이고 상기 Uaa는 구조 1 내지 6 중 어느 하나인, 포유류 세포.
제26항에 있어서, 상기 동족 aaRS는 E.coli ^LeuRS이고 상기 Uaa는 구조 7 내지 12 중 어느 하나인, 포유류 세포.
야생형 억제 tRNA에 비해서 증가된 생물학적 활성을 갖는 관심 직교성 억제(orthogonal suppressor) tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법으로서,
a) 바이러스 게놈에 관심 억제 tRNA 변이체의 라이브러리를 암호화하는 단계;
b) 낮은 감염다중도(MOI)로 바이러스 벡터로 포유류 숙주 세포 집단을 감염시키고 세포 내 바이러스 복제에 적합한 조건 하에서 상기 세포 집단을 유지하는 단계로서, 상기 포유류 세포에서의 바이러스 복제는 상기 관심 tRNA 변이체의 활성에 의존적인 필수 단백질의 발현을 필요로 하는, 상기 세포 집단을 유지하는 단계; 및
c) 교차-반응성 tRNA 분자를 제거하기 위해 활성 tRNA 변이체를 암호화하는 바이러스 자손을 수확하고 선택적으로 증폭시키는 단계로서, 증가된 생물학적 활성을 갖는 직교성 억제 tRNA 변이체가 회수되는, 상기 증폭시키는 단계
를 포함하는, 직교성 억제 tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법.
야생형 억제 tRNA에 비해서 증가된 생물학적 활성을 갖는 관심 직교성 억제 tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법으로서,
포유류 세포에서의 상기 바이러스의 복제는 상기 관심 tRNA 변이체의 활성에 의존적인 필수 단백질의 발현을 필요로 하고, 상기 방법은,
a) 바이러스 게놈에 억제 tRNA 변이체의 라이브러리를 암호화하는 단계;
b) 낮은 감염다중도(MOI)로 바이러스 벡터로 포유류 숙주 세포 집단을 감염시키는 단계;
c) 이후 상기 포유류 숙주 세포 집단을 플라스미드로 형질주입하는 단계로서, 상기 플라스미드는,
i) 바이러스 복제에 필수적인 단백질로서, 넌센스 코돈이 상기 단백질 서열에 삽입되어 바이러스 복제를 상기 변이 억제 tRNA의 활성에 의존적으로 만드는, 상기 단백질;
ii) 동족 Uaa RNA 합성효소(UaaRS); 및
iii) 바이러스 복제에 필요한 유전적 구성요소
를 포함하는, 상기 형질주입하는 단계;
d) 실질적으로 동시에 적합한 비천연 아미노산을 배양 배지에 첨가하는 단계;
e) 상기 바이러스의 복제에 적합한 조건 하에서 상기 배지에서 감염/형질주입된 세포를 유지하는 단계;
f) 상기 세포를 수확하고 바이러스 자손을 단리하는 단계;
g) 단계 f)에서 단리된 상기 바이러스를 광절단 가능한 링커를 통해 부착된 정제 핸들로 표지하는 단계;
h) 풍부화를 통해 표지된 바이러스를 회수한 후 적합한 파장의 조사를 사용하여 방출하는 단계;
i) 회수된 바이러스를 용해하고 용해물에 함유된 tRNA 변이체를 증폭시키는 단계로서, 증가된 생물학적 활성을 갖는 직교성 억제 tRNA 변이체가 회수되는, 상기 tRNA 변이체를 증폭시키는 단계
를 포함하는, 직교성 억제 tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 라이브러리의 억제 tRNA 변이체를 상기 바이러스로 암호화하기 전에 시퀀싱하는, 직교성 억제 tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 관심 억제 tRNA의 핵산 서열을 얻기 위해 상기 증폭된 tRNA를 시퀀싱하는 단계를 더 포함하는, 직교성 억제 tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노 관련 바이러스인, 직교성 억제 tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 필수 바이러스 단백질은 아데노 관련 바이러스의 캡시드 단백질(CAP)(서열번호 46)이고 상기 단백질의 454번 위치에 종결 코돈을 포함하도록 돌연변이된, 직교성 억제 tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 단지 단일 비리온이 숙주 포유류 세포를 감염시키는, 직교성 억제 tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 tRNA 라이브러리는 피롤리실 tRNA(tRNA^Pyl) 라이브러리이고 상기 UaaRS는 Mb ^PylRS이고 상기 Uaa는 구조 1 내지 6 중 어느 하나인, 직교성 억제 tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 변이 tRNA는 류실 tRNA(tRNA^Leu)이고, 상기 aaRS는 E.coli ^LeuRS이고 상기 Uaa는 구조 7 내지 12 중 어느 하나인, 직교성 억제 tRNA 변이체의 바이러스-보조 유도 진화 방법.
특정 위치에 하나 이상의 아미노산 유사체를 갖는 단백질을 포유류 세포에서 생산하는 방법으로서,
a. 성장에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 상기 포유류 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 하나 이상의 선택자 코돈을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 세포는 상기 선택자 코돈을 인식하는 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이 고세균-유래 피롤리실 tRNA 및 이의 동족 아미노아실-RNA 합성효소를 더 포함하는, 상기 포유류 세포를 배양하는 단계; 및
b. 상기 세포 배양 배지를 하나 이상의 라이신 유사체와 접촉시키는 단계로서, 상기 선택자 코돈에 반응하여 상기 하나 이상의 라이신 유사체를 상기 단백질에 혼입시키는데 적합한 조건 하에서 접촉시켜, 하나 이상의 라이신 유사체를 갖는 단백질을 생산하는, 상기 접촉시키는 단계
를 포함하는, 특정 위치에 하나 이상의 아미노산 유사체를 갖는 단백질을 포유류 세포에서 생산하는 방법.
제39항에 있어서, 상기 변이 tRNA는 서열번호 1에서 유래된 피롤리실 tRNA(tRNA^Pyl)인, 특정 위치에 하나 이상의 아미노산 유사체를 갖는 단백질을 포유류 세포에서 생산하는 방법.
제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 변이 tRNA^Pyl는 서열번호 2 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 서열 또는 서열번호 2 내지 27 중 임의의 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제41항에 있어서, 상기 라이신 유사체는 구조 1 내지 6 중 임의의 것인, 특정 위치에 하나 이상의 아미노산 유사체를 갖는 단백질을 포유류 세포에서 생산하는 방법.
특정 위치에 하나 이상의 아미노산 유사체를 갖는 단백질을 포유류 세포에서 생산하는 방법으로서,
a. 성장에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 상기 포유류 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 하나 이상의 선택자 코돈을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 세포는 상기 선택자 코돈을 인식하는 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이 대장균-유래 류실 tRNA 및 이의 동족 아미노아실-RNA 합성효소를 더 포함하는, 상기 포유류 세포를 배양하는 단계; 및
b. 상기 세포 배양 배지를 하나 이상의 류신 유사체와 접촉시키는 단계로서, 상기 선택자 코돈에 반응하여 상기 하나 이상의 류신 유사체를 상기 단백질에 혼입시키는데 적합한 조건 하에서 접촉시켜, 하나 이상의 류신 유사체를 갖는 단백질을 생산하는, 상기 접촉시키는 단계
를 포함하는, 특정 위치에 하나 이상의 아미노산 유사체를 갖는 단백질을 포유류 세포에서 생산하는 방법.
제43항에 있어서, 상기 변이 tRNA는 서열번호 28에서 유래된 류실 tRNA(tRNA^Leu)인, 특정 위치에 하나 이상의 아미노산 유사체를 갖는 단백질을 포유류 세포에서 생산하는 방법.
제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 변이 tRNA^Leu는 서열번호 29 내지 45 중 어느 하나 또는 서열번호 29 내지 45 중 임의의 전장 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 특정 위치에 하나 이상의 아미노산 유사체를 갖는 단백질을 포유류 세포에서 생산하는 방법.
제45항에 있어서, 상기 류신 유사체는 구조 7 내지 12 중 임의의 것인, 특정 위치에 하나 이상의 아미노산 유사체를 갖는 단백질을 포유류 세포에서 생산하는 방법.
세포에서 하나 이상의 피롤리실 잔기를 단백질 또는 펩타이드에 부위-특이적으로 혼입시키는 방법으로서,
a. 성장에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 특정 부위에 하나 이상의 앰버, 오커 또는 오팔 선택자 코돈을 갖는 관심 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 세포는 상기 선택자 코돈을 인식하는 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이 고세균-유래 피롤리실 tRNA^Pyl를 포함하고, 고세균 PylRNA 합성효소를 더 포함하는, 상기 세포를 배양하는 단계;
b. 상기 세포 배양 배지를 하나 이상의 피롤리실 잔기와 접촉시키는 단계로서, 상기 하나 이상의 피롤리실 잔기를 상기 단백질 또는 펩타이드의 상기 선택자 코돈(들)의 부위에 혼입시키는데 적합한 조건 하에서 접촉시켜, 하나 이상의 부위-특이적으로 혼입된 피롤리실 잔기를 갖는 관심 상기 단백질 또는 펩타이드를 생산하는, 상기 접촉시키는 단계
를 포함하는, 하나 이상의 피롤리실 잔기를 단백질 또는 펩타이드에 부위-특이적으로 혼입시키는 방법.
제47항에 있어서, 상기 변이 피롤리실 tRNA(tRNA^Pyl)는 서열번호 1에서 유래된, 하나 이상의 피롤리실 잔기를 단백질 또는 펩타이드에 부위-특이적으로 혼입시키는 방법.
제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 변이 tRNA^Pyl는 서열번호 2 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 서열 또는 서열번호 2 내지 27 중 임의의 전장 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 하나 이상의 피롤리실 잔기를 단백질 또는 펩타이드에 부위-특이적으로 혼입시키는 방법.
제49항에 있어서, 상기 피롤리실 잔기는 구조 1 내지 6 중 임의의 것인, 하나 이상의 피롤리실 잔기를 단백질 또는 펩타이드에 부위-특이적으로 혼입시키는 방법.
세포에서 하나 이상의 류신 유사체 잔기를 단백질 또는 펩타이드에 부위-특이적으로 혼입시키는 방법으로서,
a. 성장에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 특정 부위에 하나 이상의 앰버, 오커 또는 오팔 선택자 코돈을 갖는 관심 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 세포는 상기 선택자 코돈을 인식하는 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이 대장균-유래 tRNA^Leu를 더 포함하고, 대장균 LeuRNA 합성효소를 더 포함하는, 상기 세포를 배양하는 단계;
b. 상기 세포 배양 배지를 하나 이상의 류신 유사체 잔기와 접촉시키는 단계로서, 상기 하나 이상의 류신 유사체 잔기를 상기 단백질 또는 펩타이드의 상기 선택자 코돈(들)의 부위에 혼입시키는데 적합한 조건 하에서 접촉시켜, 하나 이상의 부위-특이적으로 혼입된 류신 유사체 잔기를 갖는 관심 상기 단백질 또는 펩타이드를 생산하는, 상기 접촉시키는 단계
를 포함하는, 하나 이상의 류신 유사체 잔기를 단백질 또는 펩타이드에 부위-특이적으로 혼입시키는 방법.
제51항에 있어서, 상기 변이 tRNA는 서열번호 28에서 유래된 류실 tRNA(tRNA^Leu)인, 하나 이상의 류신 유사체 잔기를 단백질 또는 펩타이드에 부위-특이적으로 혼입시키는 방법.
제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 변이 tRNA^Leu는 서열번호 29 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 서열 또는 서열번호 29 내지 45 중 임의의 전장 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 하나 이상의 류신 유사체 잔기를 단백질 또는 펩타이드에 부위-특이적으로 혼입시키는 방법.
제53항에 있어서, 상기 류신 유사체 잔기는 구조 7 내지 12 중 임의의 것인, 하나 이상의 류신 유사체 잔기를 단백질 또는 펩타이드에 부위-특이적으로 혼입시키는 방법.
세포에서 관심 단백질 또는 펩타이드를 생산하기 위한 키트로서, 상기 단백질 또는 펩타이드는 하나 이상의 라이신 유사체를 포함하고, 상기 키트는
a. 세포 내 관심 핵산에서 선택자 코돈을 인식하는 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이 고세균-유래 tRNA^Pyl를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 용기로서, 상기 변이 tRNA^Pyl는 서열번호 2 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 서열 또는 서열번호 2 내지 27 중 임의의 전장 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 용기; 및
b. 고세균 Pyl-tRNA 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 용기
를 포함하는, 키트.
제55항에 있어서, 상기 키트는 하나 이상의 라이신 유사체를 더 포함하는, 키트.
제56항에 있어서, 상기 라이신 유사체는 구조 1 내지 7 중 임의의 것에 따른 유사체인, 키트.
제57항에 있어서, 상기 키트는 상기 관심 단백질 또는 펩타이드를 생산하기 위한 설명서를 더 포함하는, 키트.
세포에서 관심 단백질 또는 펩타이드를 생산하기 위한 키트로서,
상기 단백질 또는 펩타이드는 하나 이상의 류신 유사체를 포함하고, 상기 키트는
a. 세포 내 관심 핵산에서 선택자 코돈을 인식하는 증가된 생물학적 활성을 갖는 변이 대장균-유래 tRNA^Leu를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 용기로서, 상기 변이 tRNA^Leu는 서열번호 29 내지 45 중 어느 하나 또는 서열번호 29 내지 45 중 어느 하나의 전장 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 용기; 및
b. 대장균 Leu-tRNA 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 용기
를 포함하는, 키트.
제59항에 있어서, 상기 키트는 구조 7 내지 12 중 임의의 것에 따른 하나 이상의 류신 유사체를 더 포함하는, 키트.
제60항에 있어서, 상기 키트는 상기 관심 단백질 또는 펩타이드를 생산하기 위한 설명서를 더 포함하는, 키트.
Uaa 혼입을 위한 안정적으로 혼입된 변이 tRNA-Pyl 또는 tRNA-Leu을 갖는, 포유류 세포.
제62항에 있어서, 상기 변이 tRNA-Pyl-Leu는 서열번호 2 내지 27로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 Uaa는 피롤리실 잔기인, 포유류 세포.
제63항에 있어서, 상기 피롤리실 잔기는 구조 1 내지 7 중 임의의 것인, 포유류 세포.
제62항에 있어서, 상기 변이 tRNA-Leu은 서열번호 29 내지 45로 이루어진 군에서 선택되고 상기 Uaa는 류신 유사체인, 포유류 세포.
제65항에 있어서, 상기 류신 유사체는 구조 7 내지 12 중 임의의 것인, 포유류 세포.
비천연 아미노산을 관심 단백질에 혼입할 수 있는 변이 억제 tRNA를 암호화하는 250, 200, 150, 100, 75, 50카피 미만의 유전자를 포함하는, 조작된 포유류 세포.
제67항에 있어서, 상기 세포는 상기 억제 tRNA를 암호화하는 25 내지 250, 25 내지 200, 25 내지 150, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 250, 50 내지 200, 50 내지 150, 50 내지 100, 50 내지 75, 75 내지 250, 75 내지 200, 75 내지 150, 75 내지 100, 100 내지 250, 100 내지 200, 100 내지 150카피의 유전자를 포함하는, 조작된 포유류 세포.
제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 변이 tRNA-Pyl-Leu는 서열번호 2 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 것이고, 상기 Uaa는 피롤리실 잔기인, 조작된 포유류 세포.
제69항에 있어서, 상기 피롤리실 잔기는 구조 1 내지 7 중 임의의 것인, 조작된 포유류 세포.
제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 변이 tRNA-Leu는 서열번호 29 내지 45로 이루어진 군에서 선택된 것이고 상기 Uaa는 류신 유사체인, 조작된 포유류 세포.
제71항에 있어서, 상기 류신 유사체는 구조 7 내지 12 중 임의의 것인, 조작된 포유류 세포.