JPWO2018139634A1 - アデノ随伴ウイルス(aav)キャプシドタンパク質の変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドタンパク質の変異体であって、該変異体は野生型のAAVキャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比べてPLA2ドメインに少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、当該アミノ酸置換は、AAV2 VP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
(1)3位のアラニン、
(2)6位のチロシン、
(3)68位のアラニン、
(4)87位のアスパラギン酸、
(5)91位のロイシン、
(6)149位のセリン、
(7)150位のプロリン、および
(8)156位のセリン
からなる群より選択される1以上の位置、またはAAV2以外のAAVのVP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記(1)〜(8)に対応する1以上の位置にある、AAVキャプシドタンパク質の変異体、
[2]アミノ酸置換が、AAV2 VP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
(1)3位のアラニンからトレオニンへの置換(A3T)、
(2)6位のチロシンからヒスチジンへの置換(Y6H)、
(3)68位のアラニンからバリンへの置換(A68V)、
(4)87位のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換(D87N)、
(5)91位のロイシンからプロリンへの置換(L91P)、
(6)149位のセリンからチロシンへの置換(S149Y)、
(7)150位のプロリンからヒスチジンへの置換(P150H)、および
(8)156位のセリンからチロシンへの置換(S156Y)
からなる群より選択される1以上のアミノ酸置換、またはAAV2以外のAAVのVP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記(1)〜(8)に対応する1以上のアミノ酸置換である、[1]に記載のAAVキャプシドタンパク質の変異体、
[3]アミノ酸置換が、AAV2 VP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
(1)3位のアラニンからトレオニンへの置換(A3T)、
(2)6位のチロシンからヒスチジンへの置換(Y6H)、および
(3)68位のアラニンからバリンへの置換(A68V)
からなる群より選択される1以上のアミノ酸置換、またはAAV2以外のAAVのVP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記(1)〜(3)に対応する1以上のアミノ酸置換である、[1]に記載のAAVキャプシドタンパク質の変異体、
[4]AAV2キャプシドタンパク質の変異体である、[1]〜[3]のいずれかに記載の変異体、
[5][1]〜[4]のいずれかに記載のAAVキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸、
[6][5]に記載の核酸を含む細胞、
[7][6]に記載の細胞を培養して組換えAAV粒子を産生させる工程を包含する、組換えAAV粒子の製造方法、
[8]AAV Repタンパク質をコードする核酸、AAV粒子形成に必要なアデノウイルス由来要素をコードする核酸およびAAVゲノムDNAの塩基配列を有する核酸をさらに含む[6]に記載の細胞を培養する工程を包含する、[7]に記載の組換えAAV粒子の製造方法、
[9][1]〜[4]のいずれかに記載のAAVキャプシドタンパク質の変異体を含む組換えAAV粒子、
[10][9]に記載の組換えAAV粒子を含む組成物、および
[11][9]に記載の組換えAAV粒子を標的細胞に接触させる工程を含む、標的細胞への遺伝子導入方法
に関する。
(I)AAVキャプシドタンパク質の変異体
本発明のAAVキャプシドタンパク質の変異体は、AAVキャプシドタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも1つのアミノ酸が別のアミノ酸に置換されることにより、作製される。当該AAVキャプシドタンパク質の変異体を利用することにより、高効率で標的細胞に遺伝子を導入し、該細胞内で該遺伝子を強く発現させることができる。
本発明は、AAVキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸を提供する。本発明の核酸は、前記(I)のAAVキャプシドタンパク質の変異体をコードする。本発明の核酸は、AAVキャプシドタンパク質をコードする核酸(cap遺伝子)の核酸配列において少なくとも1つの塩基が別の塩基に置換されることにより、作製される。
本発明はまた、本発明の核酸、具体的には前記(II)の組換えDNAを含む細胞、例えば単離された細胞を提供する。単離された細胞は、例えばインビトロで維持されている細胞株である。本発明の細胞は、以下に説明するように本発明の組換えAAV粒子の製造に有用である。本発明の細胞がウイルス粒子を製造するために使用される場合、該細胞は「ウイルス産生細胞」と称される(パッケージング細胞、又はプロデューサー細胞と称されることもある)。本発明の細胞は、前記(II)記載の本発明の組換えDNAがゲノムに組み込まれても良く、AAVキャプシドタンパク質変異体を一過性に発現するように前記の組換えDNAが細胞内に保持されていても良い。
本発明の組換えAAV粒子は、AAVキャプシドタンパク質の変異体を含む組換えAAV粒子である。当該組換えAAV粒子は、前記(III)に記載される細胞により製造することができる。本発明の組換えAAV粒子は、標的細胞への遺伝子導入に有用である。本発明の組換えAAV粒子により導入された遺伝子は、前記標的細胞で強く発現される。
精製された本発明の組換えAAV粒子は、遺伝子治療やその他の目的で、所望の異種ポリヌクレオチドの標的細胞への送達のために使用される。一般にAAV粒子は、インビボ又はインビトロのいずれかで標的細胞へ所望の遺伝子を導入させる。インビトロで遺伝子導入する場合、生体より取得された細胞にAAV粒子を接触させる。この細胞を生体に移植することもできる。細胞を生体に移植する場合は、薬学的組成物として製剤化し、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内投与などの様々な技術が利用できる。インビボで遺伝子導入する場合は、AAV粒子を薬学的組成物として製剤化し、一般に非経口投与する(例えば、筋肉内、皮下、腫瘍内、経皮、髄腔内などの投与経路に投与する)。AAV粒子を含む薬学的組成物は、薬剤として許容される担体、及び必要に応じて他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝液、担体、アジュバント、希釈液などを含む。
老齢のコモンマーモセット(10歳以上、衰弱死)の脳、心臓及び骨格筋からそれぞれゲノムDNAを採取した。各ゲノムDNA、pAd5(Agilent Technologies社製)、pSV3neo−LargeT及びpE1Δ55(WO2012/144446)を293EB細胞にトランスフェクションし、細胞を培養した。細胞を回収し、細胞の溶解物(lysate)を調製した。該溶解物とアデノウイルス5型(Ad5)とを293細胞にトランスフェクションし、細胞を培養した。細胞を回収し、細胞の溶解物を調製した。該溶解物を鋳型として、AAVの保存性の高い領域に設計したプライマーセット、及びTks Gflex(商標) DNA polymerase(タカラバイオ社製)を用いて、98℃で10秒、61℃で15秒を1サイクルとした50サイクルでPCRを行った。PCR増幅産物をアガロースゲルにロードして電気泳動したところ、脳由来ゲノムDNAをトランスフェクションした293EB細胞に由来するサンプルから、AAVに対応する増幅産物のバンドが確認された(図1)。該バンドから抽出したDNA断片をクローニングし、その核酸配列を決定した。その結果、複数のマーモセットAAVクローンが得られた。
AAV2のVP1のアミノ酸配列(配列番号2)と、実施例1で決定したマーモセットAAVのVP1のアミノ酸配列とを比較したところ、AAV2のVP1のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸が11箇所で見出された(A3T、Y6H、A68V、D87N、L91P、S149Y、P150H、S156Y、Y444F、Y500F、Y730F)。
AAV2のcap遺伝子に変異を導入し、VP1のアミノ酸配列の一部がマーモセットAAVのVP1に由来するアミノ酸配列に置換された2種類のAAV2変異体、すなわちAAV2(A68V)とAAV2(A3T/Y6H/A68V)とを作製した。各AAV2変異体のVP1について、それをコードするcap遺伝子の核酸配列と、VP1全長のアミノ酸配列とを表1に示す。
pAAV−Ad−ACG2(配列番号7)はAAV2のrep遺伝子とAAV2のcap遺伝子とを含むパッケージングプラスミドである。pAAV−Ad−ACG2を鋳型として、mutant−1Fプライマー(配列番号8)とmutant−1Rプライマー(配列番号9)、及びPrimeSTAR(登録商標) Mutagenesis Basal Kit(タカラバイオ社製)を使用して、キットに付属の説明書に従ってPCRを行うことにより、パッケージングプラスミド変異体であるpAAV−Ad−ACG2(A68V)を作製した。本変異体プラスミド上にあるcap遺伝子はVP1コード領域に配列番号3に示される塩基配列を含んでいる。さらに、上記pAAV−Ad−ACG2(A68V)を鋳型として、mutant−2Fプライマー(配列番号10)とmutant−2Rプライマー(配列番号11)とを使用して、同様にPCRを行うことにより、pAAV−Ad−ACG2(A3T/Y6H/A68V)を更に作製した。本変異体プラスミド上にあるcap遺伝子はVP1コード領域に配列番号5に示される塩基配列を含んでいる。
実施例3−(1)で作製したそれぞれのパッケージングプラスミド変異体、ヘルパープラスミド(pHelper Vector、タカラバイオ社製)、及びベクタープラスミド(pAAV−CB−EGFP、配列番号12)を、Polyethylenimine(コスモバイオ社製)を用いたトランスフェクション法で、293EB細胞に導入した。293EB細胞を、1/100容量のGlutaMax(Gibco社製)を含むDMEM培地中で37℃、5%CO2で3日間培養した。
実施例3−(2)で培養した293EB細胞と培養上清とから、それぞれAAV2変異体を精製した。すなわち、293EB細胞からは、AAVpro(登録商標) Purification Kit (All Serotypes)(タカラバイオ社製)を用いて、キットに付属の説明書に従って、AAV2変異体を精製した。一方、培養上清からは、AAVpro(登録商標) Concentrator(タカラバイオ社製)を用いて、キットに付属の説明書に従って、AAV2変異体を精製した。293EB細胞から精製したAAV2変異体と培養上清から精製したAAV2変異体とを混合し、以下の実験に用いた。なお、2種のAAV2変異体はそれぞれAAV2(A68V)、AAV2(A3T/Y6H/A68V)と命名した。
実施例3−(3)で得られたAAV2変異体の溶液5μL、リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 84.5μL、20mM MgCl2 10μL、250U/μL Benzonase 0.5μLを混合し、室温で1時間インキュベートし、遊離のゲノムDNAやプラスミドDNAを分解した。次に、PBS 100μLを加えた後、DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen社製)を用いて、キットに付属の説明書に従って、AAVのゲノムDNAを精製した。このAAVのゲノムDNAを鋳型として、ITR−Fプライマー(配列番号13)とITR−Rプライマー(配列番号14)、及びSYBR(登録商標) Premix DimerEraser(商標) (Perfect Real Time)(タカラバイオ社製)を使用して、キットに添付の説明書に従い、定量的PCRを行った。一方、標準品として、制限酵素SacIで消化し、線状化したベクタープラスミドを用いた同条件での定量的PCRを実施し、検量線を作成した。こうして、実施例3−(3)で得られたAAV2変異体のゲノム力価を測定した。
実施例3−(3)で得られたそれぞれのAAV2変異体を、CHO−K1細胞(2x104cell)に対して5x105g.c./cellで感染させた(n=3)。また、対照として野生型のAAV2を同じ条件でCHO−K1細胞に感染させた。これらのCHO−K1細胞をコラーゲンでコーティングされた96ウェルプレート上で、37℃、5%CO2で48時間培養した後、EGFPの発現を蛍光顕微鏡で観察した(図2)。
SEQ ID NO: 2: AAV2 VP1のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 3: AAV2 VP1(A68V)をコードする核酸配列
SEQ ID NO: 4: AAV2 VP1(A68V)のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 5: AAV2 VP1(A3T/Y6H/A68V)をコードする核酸配列
SEQ ID NO: 6: AAV2 VP1(A3T/Y6H/A68V)のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 7: pAAV−Ad−ACG2の核酸配列
SEQ ID NO: 8: mutant−1Fプライマーの核酸配列
SEQ ID NO: 9: mutant−1Rプライマーの核酸配列
SEQ ID NO: 10: mutant−2Fプライマーの核酸配列
SEQ ID NO: 11: mutant−2Rプライマーの核酸配列
SEQ ID NO: 12: pAAV−CB−EGFPの核酸配列
SEQ ID NO: 13: ITR−Fプライマーの核酸配列
SEQ ID NO: 14: ITR−Rプライマーの核酸配列
SEQ ID NO: 15: hamster−actin−Fプライマーの核酸配列
SEQ ID NO: 16: hamster−actin−Rプライマーの核酸配列
SEQ ID NO: 17: EGFP−Fプライマーの核酸配列
SEQ ID NO: 18: EGFP−Rプライマーの核酸配列
Claims (11)
- アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドタンパク質の変異体であって、該変異体は野生型のAAVキャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比べてPLA2ドメインに少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、当該アミノ酸置換は、AAV2 VP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
(1)3位のアラニン、
(2)6位のチロシン、
(3)68位のアラニン、
(4)87位のアスパラギン酸、
(5)91位のロイシン、
(6)149位のセリン、
(7)150位のプロリン、および
(8)156位のセリン
からなる群より選択される1以上の位置、またはAAV2以外のAAVのVP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記(1)〜(8)に対応する1以上の位置にある、AAVキャプシドタンパク質の変異体。 - アミノ酸置換が、AAV2 VP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
(1)3位のアラニンからトレオニンへの置換(A3T)、
(2)6位のチロシンからヒスチジンへの置換(Y6H)、
(3)68位のアラニンからバリンへの置換(A68V)、
(4)87位のアスパラギン酸からアスパラギンへの置換(D87N)、
(5)91位のロイシンからプロリンへの置換(L91P)、
(6)149位のセリンからチロシンへの置換(S149Y)、
(7)150位のプロリンからヒスチジンへの置換(P150H)、および
(8)156位のセリンからチロシンへの置換(S156Y)
からなる群より選択される1以上のアミノ酸置換、またはAAV2以外のAAVのVP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記(1)〜(8)に対応する1以上のアミノ酸置換である、請求項1に記載のAAVキャプシドタンパク質の変異体。 - アミノ酸置換が、AAV2 VP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における
(1)3位のアラニンからトレオニンへの置換(A3T)、
(2)6位のチロシンからヒスチジンへの置換(Y6H)、および
(3)68位のアラニンからバリンへの置換(A68V)
からなる群より選択される1以上のアミノ酸置換、またはAAV2以外のAAVのVP1キャプシドタンパク質のアミノ酸配列における上記(1)〜(3)に対応する1以上のアミノ酸置換である、請求項1に記載のAAVキャプシドタンパク質の変異体。 - AAV2キャプシドタンパク質の変異体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の変異体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のAAVキャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸。
- 請求項5に記載の核酸を含む細胞。
- 請求項6に記載の細胞を培養して組換えAAV粒子を産生させる工程を包含する、組換えAAV粒子の製造方法。
- AAV Repタンパク質をコードする核酸、AAV粒子形成に必要なアデノウイルス由来要素をコードする核酸およびAAVゲノムDNAの塩基配列を有する核酸をさらに含む請求項6に記載の細胞を培養する工程を包含する、請求項7に記載の組換えAAV粒子の製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のAAVキャプシドタンパク質の変異体を含む組換えAAV粒子。
- 請求項9に記載の組換えAAV粒子を含む組成物。
- 請求項9に記載の組換えAAV粒子を標的細胞に接触させる工程を含む、標的細胞への遺伝子導入方法。
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