JP2023531281A - 改善されたアデノ随伴ウイルス遺伝子治療ベクター - Google Patents
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Abstract
「MAAP」は、約13KDaの、新しく発見された天然のアデノ随伴ウイルスタンパク質である。既知のタンパク質に対して相同ではない。AAVプロデューサー細胞を24時間より長く培養する場合、全長MAAPの翻訳を不活性化することにより、トランスフェクトされたプロデューサー細胞の産生率が向上することが分かった。得られるAAVウイルスも、より良質で、より安定している。したがって、我々の知見は、組換えアデノ随伴ウイルス遺伝子治療ベクターの工業的製造を改善する方法を提供する。
Description
関連出願の相互参照
本特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる2020年6月25日に出願された米国仮出願第63/043,837号の利益を主張する。
本特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる2020年6月25日に出願された米国仮出願第63/043,837号の利益を主張する。
背景
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ディペンドウイルス属のパルボウイルスである。ウイルスの複製は、アデノウイルス又はヘルペスウイルス等のヘルパーウイルスで共感染した感染細胞に依存する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ディペンドウイルス属のパルボウイルスである。ウイルスの複製は、アデノウイルス又はヘルペスウイルス等のヘルパーウイルスで共感染した感染細胞に依存する。
AAVは、ヒト及び他の霊長類において広く蔓延している。様々な組織試料から数種の血清型が単離されている。
12種類を超える天然の血清型及び100種類以上のAAVバリアントが単離され、研究され、遺伝子送達ベクターとして応用されている。また遺伝子送達のためのAAVを改善するために新しいバリアントが継続的に作製されている。最も研究されているAAVの中には、ヒト細胞で発見された血清型2型、3型、5型、6型、9型、及び12型、並びに非ヒト霊長類細胞で発見された血清型1型、4型、7型、8型、10型、及び11型がある。国際ウイルス分類委員会(International Committee on Taxonomy of Viruses)は、これらの様々な血清型を、A種及びB種の2つの広範な種へ分類している。A種は、例えば、血清型1型、2型、3型及び4型を包含し、B種は、血清型5型を包含する。AAVは、霊長類に加えて、ウマ、ウシ、トリ、ヘビ、トカゲ、及びヤギ等の他の種からも単離されている。
各血清型は、ある程度の組織特異性を有する。例えば、血清型6型は、ヒト心臓細胞の感染に効率的であり、一方、血清型8型は、ヒトの肝臓細胞及び骨格筋細胞の感染に効率的である。
血清型、したがって組織特異性は、カプシドによって決まる。AAVカプシドタンパク質は、12個の超可変表面領域を含む。ほとんどの可変性は、3畳基部ピーク(three-fold proximal peak)において生じる。
全ての既知の血清型のゲノムは、同様の組織を共通して有している。例えば、血清型2型(AAV2)は、4679塩基のゲノムを有する。AAV2ゲノムには、145塩基のT字型構造の逆位末端反復配列(ITR)が両端で隣接している。ITRは、ゲノム複製、第2鎖合成、カプシド化、及びウイルスゲノムのヒトゲノムへの挿入に必要である。AAV2では、ゲノム複製は、2つの大きなrepタンパク質Rep78及びRep68によって媒介される。小さなrepタンパク質Rep52及びRep40は、事前に形成された空のカプシドにAAVゲノムのポジティブ鎖又はネガティブ鎖のいずれかをパッケージングするために必要である。
cap遺伝子は、3つのカプシドタンパク質VP1、VP2及びVP3を発現する。これは、代替スプライシング、非ATG開始コドンの使用、リーディングフレームの重複を通じて行われる。アセンブリ活性化タンパク質(AAP)は、VP2/3リーディングフレームのフレームシフトを通して発現され、VPタンパク質を核小体へ標的化する。これはカプシドのアセンブリに必要である。
野生型AAVカプシドは、正二十面体であり、60個のVPタンパク質の分子から構成される。野生型カプシドは、VP1:VP2:VP3比が1:1:10である。したがって、一般的にVP3がカプシドの「コア」を形成する。
Hela細胞における野生型アデノウイルス及び野生型AAV(wt-AAV)共感染に関連して検討されたAAVの細胞内区画化は、DNAパッケージングが核質で生じる間、カプシドのアセンブリの開始に核小体が関与することを示唆する。後の段階で、Repタンパク質は核周辺に濃縮される。アセンブリされたAAVカプシドが、核内に、核小体内に、又は核膜の周りにクラスター化してAAPと共局在することを観察することができる。
AAVは、魅力的で有望な遺伝子治療ベクターとして知られている。しかしながら、AAVの完全な治療的利用はいくつかの困難に直面している。例えば、インビトロでの商業的製造環境において、産生されるウイルスの量を向上させるためには、感染及び/又はトランスフェクトされたプロデューサー細胞(producer cell)を少なくとも72時間以上培養することが好ましい。しかし、AAVは製造中に急速に劣化する可能性がある。例えば、ウイルスの多量の収集を確実にするために、感染したプロデューサー細胞を少なくとも72時間培養することが好ましいが、血清型2型及び8型は72時間未満で分解され、したがって、感染性ウイルスの最終収率が低下する。
この低下は、感染後わずか24時間で、プロデューサー細胞からウイルスを収集することによって克服しうる。これにより、完成したウイルスの分解は減少するが、ウイルス複製を時期尚早に停止させることで、生成されるウイルス量も減少する。
Bachmanら、J. Methods Enzymol. 2013; 529: 241～248頁
Ogden P.J.ら、「Comprehensive AAV Capsid Fitness Landscape Reveals A Viral Gene And Enables Machine-Guided Design」、366 Science 1139頁(2019)
Wobus CEら、「Monoclonal Antibodies against the Adeno-Associated Virus Type 2 (AAV-2) Capsid: Epitope Mapping and Identification of Capsid Domains Involved in AAV-2-Cell Interaction and Neutralization of AAV-2 Infection」、74 J. Virol. 9281頁(2000)
したがって、高品質で安定したAAV、特に遺伝子治療のためのAAVを十分な量で調製することができる方法を提供することが当技術分野で必要とされている。
概要
本開示は、以下に好ましい実施形態を示している。しかしながら、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
本開示は、以下に好ましい実施形態を示している。しかしながら、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
一態様では、本開示は、膜結合性アクセサリータンパク質(membrane-associated accessory protein、MAAP)mRNA翻訳開始コドンを不活性化するか又は少なくとも1つの停止コドン(stop codon)を導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止する変異を有するアデノ随伴ウイルスゲノムを提供する。
更なる態様では、本開示は、全長の野生型MAAPの発現を低下させる変異を有するアデノ随伴ウイルスゲノムを提供する。
好ましい実施形態では、VP1の発現が維持される。
更なる態様では、本開示は、MAAP mRNAに転写されるアデノ随伴ウイルスゲノムであって、ゲノムが、MAAP mRNAを野生型MAAP mRNAから変化させる変異を有し、変化が、MAAP翻訳開始コドンを開始コドンではない配列に変化させること、及び、MAAP mRNA内に少なくとも1つの停止コドンを作製することから選択され、前記変異が、前記ゲノムからのVP1の発現を妨げるものではない、アデノ随伴ウイルスゲノムを提供する。
好ましい実施形態では、前記変異は、MAAP翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止する。
好ましい実施形態では、前記変異は、MAAP翻訳開始コドンを不活性化する。
好ましい実施形態では、前記変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9、33、39、47、65、90、100、103、105、106又は110とアラインメントするポリペプチド残基に、少なくとも1つの停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する。
好ましい実施形態では、前記変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9～110、好ましくは残基番号39～103とアラインメントするポリペプチド残基に、少なくとも1つの停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する。
好ましい実施形態では、前記変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9、33、39、47、65、90、100、106又は110とアラインメントするポリペプチド残基に、少なくとも1つの停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する。
好ましい実施形態では、前記変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9、33、39、及び/又は47とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する。
好ましい実施形態では、前記変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9又は残基番号33、39及び47とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する。
好ましい実施形態では、ゲノムは、天然の血清型及び非天然の血清型からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、ゲノムは、血清型1型ゲノム、血清型2型ゲノム、血清型5型ゲノム、血清型6型ゲノム、血清型8型ゲノム、血清型9型ゲノム、血清型10型ゲノム、及び非天然の血清型から選択される。
好ましい実施形態では、ゲノムは、血清型1型ゲノム、血清型2型ゲノム、血清型6型ゲノム、血清型7型ゲノム、血清型8型ゲノム、及び血清型10型ゲノムから選択される。
好ましい実施形態では、ゲノムは、血清型1型、2型、5型、6型、8型又は9型のゲノムを含む。
好ましい実施形態では、ゲノムは、血清型2型、5型、6型又は8型のゲノムを含む。
好ましい実施形態では、ゲノムは、血清型2型のゲノムを含む。
好ましい実施形態では、ゲノムは、非天然の血清型を含む。
好ましい実施形態では、VP1ペプチド配列は、野生型から変化していない。
好ましい実施形態では、VP1ペプチド配列は、保存的変異等の変異を含む。典型的には、VP1ペプチドは、MAAPペプチド配列が停止コドンを含むように変異している箇所に対応する位置で変化している。
好ましい実施形態では、MAAPペプチド配列及びVP1ペプチド配列は、それぞれ野生型に対して少なくとも80%の相同性を有する。
好ましい実施形態では、MAAPペプチド配列及びVP1ペプチド配列は、それぞれ野生型に対して少なくとも90%の相同性を有する。
更なる態様では、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の33個の連続した残基に対して少なくとも50%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しないアデノ随伴ウイルスゲノムが提供される。つまり、AAVゲノムを含有するウイルス粒子、ベクター又はプラスミドは、好適な宿主細胞、つまり、AAVゲノムによりコードされるタンパク質の発現を可能にする宿主細胞に存在する場合、かかるポリペプチドを発現しない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の33個の連続した残基に対して少なくとも50%の同一性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。
更なる態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルスを産生するプロデューサー細胞であって、本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムを含むプロデューサー細胞を提供する。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、真核生物である。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、ヒト細胞を含む。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、酵母細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される。
更なる態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、アデノ随伴ウイルスゲノムを取得すること、次いで、前記ゲノムを細胞内に導入して、本発明のプロデューサー細胞を作製すること、次いで、アデノ随伴ウイルスを産生する前記プロデューサー細胞を培養すること、次いで、前記アデノ随伴ウイルスを収集することを含む方法を提供する。
好ましい実施形態では、前記収集されたアデノ随伴ウイルスは、導入遺伝子を含む。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、物理的カプシド(physical capsid)の総数に対する目的の遺伝子又はゲノムを含有するカプシドの数の比率が、野生型アデノ随伴ウイルスゲノムを含む類似の細胞によって産生される物理的カプシドの総数に対する目的の遺伝子又はゲノムを含有するカプシドの数の比率と少なくとも同じ高さのウイルス調製物を産生する。
好ましい実施形態では、本発明のプロデューサー細胞は、野生型アデノ随伴ウイルスゲノムに感染した類似の細胞が産生するのと少なくとも同じ高さの完全ウイルスカプシド:空ウイルスカプシドの比率を有するウイルスを産生する。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、野生型アデノ随伴ウイルスに感染した類似の細胞と少なくとも同じ多さのウイルスゲノム/mLを有するウイルスを産生する。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、野生型アデノ随伴ウイルスに感染した類似の細胞が産生する数の少なくとも4倍の多さのウイルスゲノム/mLを有するウイルスを産生する。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、野生型アデノ随伴ウイルスに感染した類似の細胞が産生するよりも完全ウイルスカプシド:空ウイルスカプシドの比率が30%高いウイルスを産生する。
更なる態様では、本開示は、MAAP mRNA翻訳開始コドンを不活性化する変異を有するアデノ随伴ウイルスゲノムを提供する。
好ましい実施形態では、前記アデノ随伴ウイルスゲノムは、少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止する少なくとも1つの変異を更に含む。
好ましい実施形態では、前記変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9、33、39、47、65、90、100、103、105、106又は110とアラインメントするポリペプチド残基に、少なくとも1つの停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する。
好ましい実施形態では、前記変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号33、39、及び47とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する。
好ましい実施形態では、ゲノムは、アデノ随伴ウイルス血清型1型、血清型2型、血清型3型、血清型4型、血清型5型、血清型6型、血清型7型、血清型8型、血清型9型、血清型10型、及び非天然の血清型からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、ゲノムは、血清型2型のゲノムを含む。
好ましい実施形態では、ゲノムは、非天然の血清型を含む。
更なる態様では、本開示は、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の33個の連続した残基に対して少なくとも50%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない、アデノ随伴ウイルスゲノムを提供する。
好ましい実施形態では、33個の連続した残基は、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基93～97を含む。
好ましい実施形態では、33個の連続した残基は、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基107～119を含む。
好ましい実施形態では、33個の連続した残基は、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基1～30を含む。
好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基1～33に対して少なくとも60%の相同性を有する任意の配列を含まない。
好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基1～39又は残基1～47に対して少なくとも60%の相同性を有する任意の配列を含まない。
好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも60%の相同性を有する任意の配列を含まない。
好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも70%の相同性を有する任意の配列を含まない。
好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも80%の相同性を有する任意の配列を含まない。
更なる態様では、本開示は、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の15個の連続した残基に対して少なくとも95%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しないアデノ随伴ウイルスゲノムを提供する。
好ましい実施形態では、ゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の17個、好ましくは19個、好ましくは21個の連続した残基に対して少なくとも90%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。
更なる態様では、本開示は、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基番号94～120の任意の10個の連続した残基に対して少なくとも50%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない、アデノ随伴ウイルスゲノムを提供する。
更なる態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、細胞内に本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムを導入してプロデューサー細胞を作製すること、次いで前記プロデューサー細胞を培養してアデノ随伴ウイルスを生成すること、次いで前記アデノ随伴ウイルスを収集することを含む方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、前記方法が、本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムを細胞内に挿入してプロデューサー細胞を作製すること、次いで前記プロデューサー細胞を培養してアデノ随伴ウイルスを生成すること、次いで前記アデノ随伴ウイルスを収集することを含む方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルスを産生するプロデューサー細胞であって、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも50%の相同性を有するポリペプチドを実質的に含まないプロデューサー細胞を提供する。
更なる態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルスを産生するプロデューサー細胞であって、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の15個の連続した残基に対して少なくとも95%の相同性を有するポリペプチドを実質的に含まないプロデューサー細胞を提供する。
更なる態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルスを産生するプロデューサー細胞であって、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基番号94～120の任意の10個の連続した残基に対して少なくとも50%の相同性を有するポリペプチドを実質的に含まないプロデューサー細胞を提供する。
更なる態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルスゲノムを含むプロデューサー細胞であって、アデノ随伴ウイルスを発現することができ、全長の機能性MAAPを実質的に含まないプロデューサー細胞を提供する。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、真核生物である。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、ヒト細胞を含む。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、酵母細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、前記アデノ随伴ウイルスゲノムは、全長の野生型の機能性MAAPの発現を妨げる変異を有する。
好ましい実施形態では、前記プロデューサー細胞は、MAAPに結合し、MAAPの機能を損なう、MAAPへと方向付けられたタンパク質、例えばモノクローナル抗体又はアフィボディを含む。
更なる態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルスゲノムを含むプロデューサー細胞であって、アデノ随伴ウイルスを発現することができ、全長の機能性MAAPを実質的に含まないプロデューサー細胞を提供する。好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスゲノムは、全長の野生型の機能性MAAPの発現を妨げる変異を有する。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、全長の野生型の機能性MAAPの発現を妨げる干渉RNAを含む。好ましい実施形態では、MAAPに結合し、MAAPの機能を損なう、MAAPへと方向付けられたモノクローナル抗体を含む。
更なる態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、アデノ随伴ウイルスを産生する本発明のプロデューサー細胞を培養すること、次いで、前記アデノ随伴ウイルスを収集することを含む方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、本発明の方法によって産生されたアデノ随伴ウイルスを提供する。
更なる態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルス(AAV)の安定性を増加させるか、カプシド完全性を増加させるか、又はカプシド分解を低減する方法であって、本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムをAAVに含めることを含む方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、目的の遺伝子又はゲノムを含有するAAVカプシドの割合を増加させる方法であって、本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムと目的の遺伝子又はゲノムとをAAVに含めることを含む方法を提供する。
更なる態様では、本開示は、AAVを産生するプロデューサー細胞のウイルス力価(ウイルスゲノム/mL)を増加させる方法であって、本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムをAAVに含めること、及びAAVを前記プロデューサー細胞に導入することを含む方法を提供する。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、少なくとも30時間培養される。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、少なくとも36時間、48時間、72時間又は96時間培養される。
更なる態様では、本開示は、AAVを産生するプロデューサー細胞におけるウイルスゲノム又はウイルス粒子の保持を増加させるための方法であって、請求項1から47のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスゲノムをAAVに含めること、及びAAVを前記プロデューサー細胞に導入することを含む方法を提供する。
好ましい実施形態では、方法は、プロデューサー細胞から、好ましくは培地を実質的に含まないように、ウイルスゲノム又はウイルス粒子を収集及び/又は精製することを更に含む。
遺伝子治療の処置のための組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の成功にもかかわらず、大規模製造の限界のため、それらの利用可能性は限られている。VP1/2固有ドメインと同じゲノム領域内のcap遺伝子によってコードされる膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)をコードする最近同定されたORFのバリアントは、ほとんどのAAV血清型の産生率(productivity)の限界への対処に役立つ可能性がある。本明細書では、一部のC末端切断型MAAPバリアントが、VPアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、野生型AAV2産生率の向上及びカプシド分解の低減をもたらすことを示す。更に、マウス分泌型アルカリホスファターゼ(mSeAP)遺伝子をコードするrAAV血清型1型、2型、5型、6型、8型及び9型の産生のために、2つの構造的に異なる例のMAAPバリアントを使用した。実施例2に示されるように、MAAPバリアントは、rAAV産生収率の増加及びrAAVゲノムを含有するカプシドのパーセンテージの増加を全体的にもたらした。細胞又は培地中のベクターの存在は、一部のAAV血清型について変更された。いくつかのAAV血清型のcap遺伝子配列に基づいて、特定の生物学的特性とMAAPの主要なクレードとを結び付けるMAAP系統発生樹を構築した。この系統発生ツールは、特定のMAAPバリアントを使用する場合の特定のカプシドバリアントについて、細胞内及び培地中のベクターの潜在的な産生率向上及び分布の推定を可能にし、更にAAV血清型にわたる多数のこれらの特性の一貫性も合理的に予測する。
我々は、産生量を増やしながら品質のより高いベクターを作る方法を偶然に見出した。我々の新しいアプローチを使用すると、感染から72時間後のウイルス産生を300～400%増加させることができる。得られたウイルスはより安定しており、感染から72時間以後のカプシド分解がより少なく示される。得られたウイルスは、遺伝子治療ベクターとなるように設計されている場合(つまり、組換え体であり、「導入遺伝子」又は治療用外来遺伝子を含む場合)、72時間で改善されたゲノムパッケージングも示す。また、得られた遺伝子治療ベクターは、導入効率(標的細胞における治療用導入遺伝子の発現)を改善すると予測される。
我々の発見は工業的に重要であるが、我々は本質的により学術的又は理論的な研究をしている間にこの発見を見出した。AAVのビリオン特性評価及び全ゲノム解析を行い、非正準(non-canonical)開始コドンでコードされた新規タンパク質を同定し、そのタンパク質が実際に野生型AAVで発現していることを発見した。我々は、この新しいタンパク質を「DS」と名付けた。我々が研究を行っている間、同じタンパク質がOgdenら(2019)によって記載され、彼らは、そのタンパク質を膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)と名付けた。一貫性のために、DSの代わりにMAAPという名称も本明細書において使用する。
我々は、非正準開始コドンの変異が、この新しいタンパク質の不活性化を導くことを見出した。同様に、付随するORFのN末端に複数の停止コドンを導入することも、タンパク質の不活性化を導くことを見出した。
次いで、我々は、この新しいタンパク質を不活性化するための停止コドンを含むように改変されたAAVを、野生型AAVと比較した。感染の24時間後に、wt-AAVは、新しいタンパク質を不活性化するための停止コドンを含むように改変されたウイルスよりも高いウイルス力価を生じることが分かった。これはおそらく驚くことではない。なぜなら、野生型遺伝子がその遺伝子の作動コピーを欠く変異体と比べ、ある種の選択的利点を有することを示唆するからである。
しかしながら、驚くべきことに、感染細胞の培養期間を72時間に延長すると、我々の変異体ヌルウイルスは、wt-AAV2よりも高いウイルスゲノム(vg)力価を生じることが分かった。これは驚くべきことである。なぜなら、野生型遺伝子がその遺伝子の作動コピーを欠く変異体と比べ、有害な選択的不利益を有することを示唆するからである。
更に、我々は、驚くべきことに、我々の変異体(ヌル)ウイルスが、よりロバストなカプシド完全性又は耐久性を示し、経時的なカプシド分解を低減させることを見出した。対照的に、wt-AAVは、免疫ブロッティングで確認できる特定のタンパク質分解断片を示した。
更に、我々は、我々の変異体(ヌル)ウイルスが、得られたカプシド中のVP1及びVP2の相対的濃度の増加を示すことを見出した。
更に、我々は、我々の変異体(ヌル)ウイルスが、野生型AAVよりも感染性が高いと予測する。理論に束縛されることを意図しないが、我々は、変異体ウイルスが、より高いカプシド完全性、特にVP1タンパク質により、感染性がより高いと仮定する。VP1の固有ドメインは、ホスホリパーゼA2ドメイン「PLA2」をコードする。このホスホリパーゼは、感染中のAAVのエンドソーム脱出にとって重要である。
同様に、我々は、我々の変異体(ヌル)ウイルスが、導入遺伝子を含有するように操作された場合、導入遺伝子の発現の向上を生じると予測する。理論に束縛されることを意図しないが、VP1が導入遺伝子を発現のために感染した細胞核に送達し、そして我々の変異体(ヌル)ウイルスはVP1の相対的濃度が増加していることから、我々は、この導入遺伝子の発現の向上を仮定する。
理論に束縛されることを望んでいないが、MAAPのC末端は、MAAPの細胞局在化に関与しうる3つの塩基性アミノ酸リッチ(BR)クラスター、KKIR(MAAP2BR1)、RRKR(MAAP2BR2)及びRNLLRRLREKRGR(MAAP2BR3)を含む。実際、同様のBRクラスターが、AAPの核局在化シグナル(NLS)として機能することが示された。MAAPBR3のほぼ完全な欠失は、核局在が損なわれる根拠を明確に示さなかったので、MAAP2BR1ドメイン及びMAAP2BR2ドメインが依然として膜結合を可能にしている可能性がある。MAAPのC末端における最後の10個のアミノ酸のみの欠失は、VP及びカプシドのレベルを高め、カプシド分解を低下させたが、MAAP2BR3の全体の欠失は、AAV2カプシドの分解を完全に妨げた。プロテアソーム阻害は、AAV感染中に起こり、プロテアーゼ阻害剤の添加は、カプシド抗原提示を妨げ、更に、ウイルス形質導入を増強しうる。更に、AAVカプシドは、酸性条件で自己切断しうることが示されている。またAAVカプシドは、wt-AAV産生中に、プロテアソームに関与する翻訳後修飾(PTM)、例えばユビキチン化、を受ける。これらのPTMは、ユビキチン化及びその後のプロテアソーム分解を介して、宿主細胞防御を開始するか、又は新しいカプシドを下方制御するためのシグナルとして潜在的に使用されうる。細胞分解プロセスに対するMAAPの潜在的な影響に加えて、MAAPのAAV安定化効果は、カプシドが、分解プロセスが行われる細胞内に局在化することを防ぐことによって達成されうる。しかし、24hpt以内に、核からのカプシドの排出に対してMAAPの効果は観察されなかった。したがって、ある特定の実施形態では、本発明のMAAPペプチドは、BRクラスター、特にMAAP2BR3のうちの1つ以上を部分的又は完全に排除する。
したがって、我々は、この新規な野生型タンパク質の発現を不活性化することによって、AAVベクターの工業的産生を増加させる驚くべき方法を見出した。我々はまた、野生型タンパク質の発現を不活性化することによって、AAVウイルスの貯蔵寿命安定性を増加させる驚くべき方法を見出した。我々の知見は、AAVが遺伝子治療ベクターとして治療的に使用されうるため、工業的に価値があるものである。したがって、我々の知見は、AAV遺伝子治療ベクター(例えば、非相補性又は自己相補性AAV、操作されたITRを有するAAV等)を、以前よりも大量、かつより高い安定性で作製する方法を提供する。
野生型タンパク質の発現を不活性化することにより、感染後72時間でのウイルス産生を300～400%増加させることができる。得られたウイルスはより安定しており、感染から72時間以後のカプシド分解が少ないことが示される。得られるウイルスは、野生型と同程度の完全カプシドのパーセンテージを有し、おそらく野生型よりも更に高いパーセンテージの完全カプシドを有する。更に、得られた遺伝子治療ベクターは、導入効率(標的細胞における治療用導入遺伝子の発現)を向上させると予測される。
本明細書において、単語「含む」及びその結合語は、単語の後に続く項目を含む一方、具体的に言及されていない項目を除外しないことを意味するように、その非限定的な意味において使用される。加えて、動詞「～からなる」は、本明細書で定義される化合物又は補足的化合物が、具体的に特定されているもの以外の、本発明の独自の特徴を変更させない前記追加の成分を含んでもよいことを意味する「～から本質的になる」に置き換えられうる。
冠詞「a」、「an」、及び「the」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の1つ又は1つより多く(つまり、少なくとも1つ)を指すように使用される。例として、「(要素(an element)」は、1つの要素又は1つより多くの要素を意味する。例えば、「停止コドン」を要求している請求項は、1つの停止コドン及びいくつかの停止コドンに関すると読める。
「およそ」又は「約」という単語は、数値と関連付けて使用される場合(およそ10、約10)、好ましくは、その値が、その所与の値(10)の10%より大きい又は10%より小さい値でありうることを意味する。
本明細書で使用される場合、特定の値と参照値とに関連して「匹敵(comparable)」という用語は、特定の値が、参照値と同一であるか、又は参照値から最大で10%外れる(より高いか又はより低い)値であることを意味する。
本明細書で使用される場合、「膜結合性アクセサリータンパク質」又は「MAAP」は、任意のAAV血清型のAAV MAAPタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、「野生型MAAP」とは、天然に存在するAAV MAAPを指す。配列番号1～10(図20も参照のこと)は、それぞれ、AAV血清型1～10型の全長の野生型MAAPのアミノ酸配列を示す。これらの血清型のそれぞれのアミノ酸配列は、C末端で高度に保存されている。N末端では、AAV血清型4型(配列番号4)及び血清型5型(配列番号5)の野生型タンパク質は、他の血清型には見られない先行する(leading)15～25アミノ酸残基配列を有する。配列番号11は、これら10種の血清型全ての理論的コンセンサスのための一次アミノ酸配列を示す。好ましい実施形態では、「野生型MAAP」は、配列番号1～11の配列のうちのいずれかから選択される配列である。本明細書で使用される場合、「野生型VP1」は、天然に存在するAAV VP1を指す。
アミノ酸配列又は核酸配列の同一性パーセンテージ又は「配列同一性%」という用語は、本明細書において、2つの配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大の同一性パーセントを達成させた後、参照アミノ酸配列又は核酸配列の残基と同一である残基の、アミノ酸配列又は核酸配列の全長の残基に対するパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列の相同性パーセンテージ又は「相同性%」という用語は、本明細書において、2つの配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大の配列相同性パーセントを達成させた後、参照配列のアミノ酸残基と相同である、特定の配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。この方法は、保存的アミノ酸置換を考慮に入れる。保存的置換は、類似のアミノ酸で置換されるアミノ酸の置換である。アミノ酸は、例えば、サイズ、形状、疎水性、親水性、電荷、等電点、極性、芳香族性等のいくつかの特性において類似しうる。好ましくは、保存的置換は、あるグループ内の1つのアミノ酸と、同じグループ内の別のアミノ酸との交換であり、これらのグループは、以下の通りである:(1)アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びフェニルアラニン、(2)ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、及びアスパラギン、(3)アスパラギン酸及びグルタミン酸、(4)セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びシステイン、並びに(5)グリシン、プロリン、及びアラニン。アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野で周知であり、例えば、「Align 2」が挙げられる。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムも、当技術分野でも周知であり、例えば、BESTFIT、FASTA及びGAPプログラムが挙げられる。これらのプログラムは、製造業者が推奨するデフォルトのパラメータを用いて容易に使用できる。
例えば、請求項において、変異したMAAPが言及される場合、請求項に記載の変異体は、野生型ポリペプチドと同じ長さである必要はないが、その変異体を他の非MAAP AAVポリペプチドと区別するために十分な長さでなければならない。例えば、血清型5型MAAPは、145アミノ酸残基長である。「変異」血清型5型MAAPを要求している請求項は、他の非MAAPタンパク質と区別するために血清型5型MAAPと十分な相同性を有するポリペプチドである限り、145アミノ酸長よりも長いか又はそれよりも短いポリペプチドと読める。対照的に、その請求項は、MAAPではない野生型AAVポリペプチドと区別できないほど短いポリペプチドとは読めないであろう。なぜなら、当業者は、請求項の用語の「MAAP」の範囲内でそのような短いポリペプチドを考えないためである。
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸を含む化合物を指し、互換的に使用される。遺伝子によってコードされるタンパク質又はポリペプチドは、遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に限定されず、タンパク質又はポリペプチドの1つ以上のアミノ酸の翻訳後修飾を含んでもよい。タンパク質及びポリペプチドの配列は、別段の指示がない限り、本明細書において、N末端からC末端まで示される。タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列に関して本明細書で使用される場合、「N末端(N-terminal)」及び「C末端(C-terminal)」という用語は、それぞれ、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列のN末端(N-terminus)及びC末端(C-terminus)に対する相対的位置を指す。「N末端(N-terminus)」及び「C末端(C-terminus)」は、それぞれ、ポリペプチドの最も端にあるアミノ末端及びカルボキシル末端を指す。
本明細書で使用される場合、特定の1又は複数のアミノ酸残基への言及は、好ましくは、配列番号1～11のMAAP配列の配列における対応する数字を有する残基を指す。本明細書で、配列番号11における1つ又は複数の残基、又はMAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号とアラインメントする1つ又は複数の残基に言及する場合、配列番号11のコンセンサス配列における示された1つ又は複数の残基に対応する、AAV血清型1～10型のMAAPアミノ酸配列(配列番号1～10及び図20に示される)のうちの1つにおける1つ又は複数の残基も包含される。したがって、本明細書で使用される場合、「MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号Xとアライメントするポリペプチド残基における変異」は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11のアミノ酸残基番号Xに対応する位置でのMAAPポリペプチドにおける変異として定義される。これは、配列番号11の配列における示される残基番号又は任意のAAV MAAPにおける対応する残基番号、特に配列番号1～10のいずれかの配列を有するMAAP配列における対応する残基番号のいずれかでありうる。特に、AAV血清型1型、2型、5型、6型、8型及び9型、より特にはAAV血清型1型、2型、5型、6型及び8型のMAAPにおける対応する1又は複数の残基が包含される。当業者であれば、例えば、MAAP配列と配列番号11の配列とのアラインメントを行うことによって、配列番号11の特定の残基に対応する、任意のMAAP又は配列番号1～10のうちのいずれかの配列を有するMAAP(それぞれ、AAV1～10のMAAPアミノ酸配列)における残基を決定することが十分に可能である。例えば、一実施形態では、変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号65とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止するものである。当業者に明らかなように、これは、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11のアミノ酸残基数65に対応する位置におけるMAAPポリペプチドの変異を指す。配列番号11の例示的な残基番号65は、配列番号2の残基番号64に対応する。
第1の態様では、MAAP mRNA翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止する変異を有するアデノ随伴ウイルスゲノムが提供される。また全長の野生型MAAPの発現を低下させる変異を有するアデノ随伴ウイルスゲノムも提供される。好ましい実施形態では、VP1の発現が維持される。特に、変異は、VP1の発現を維持するものである。
本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルスゲノム」は、AAV MAAPをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を指す。好ましい実施形態では、AAVゲノム又はAAVベクターは、MAAPをコードする遺伝子を少なくとも含み、特に、全長野生型MAAPの発現を低下させ、膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)mRNA翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は、全長野生型MAAPの翻訳を停止させるための少なくとも1つの停止コドンを導入する変異を有する、MAAPをコードする遺伝子を含む。AAVゲノム又はAAVベクターは、好ましくは、1つ以上の更なるAAV遺伝子をコードする1つ以上のポリヌクレオチド配列を更に含む。特に、MAAPをコードする遺伝子以外の遺伝子は、野生型であってもよいし、1つ以上の変異を含むものでもよい。好ましい実施形態では、AAVゲノムには、AAV逆位末端反復(ITR)が両端で隣接しているAAVポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、AAV発現ベクターによって包含されるか、又はAAV発現ベクターである。したがって、AAVゲノム又はAAV発現ベクターは、好ましくは、膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)mRNA翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止し、全長の野生型MAAPの発現を低下させる変異を含んでいる限り、AAV ITRが隣接している、野生型であるか又は1つ以上の変異を含む少なくとも1つのAAVポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、本発明のAAVゲノムは、好適な宿主細胞に導入された場合にAAVを産生することができる、AAVポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む。或いは、本発明のAAVゲノムは、AAVポリヌクレオチド配列を含む1つ以上の更なるポリヌクレオチド分子、例えば、AAVカプシドタンパク質及び他のAAVヘルパー機能をコードするポリヌクレオチド配列を含むAAVヘルパー構築物と組み合わされる。組み合わされたAAVゲノム及び1つ以上の更なるポリヌクレオチド分子は、好適な宿主細胞に導入された場合に、AAVを産生することができる。
好ましい実施形態では、AAVゲノム又はAAVベクターは、膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)mRNA翻訳開始コドンを不活性化するか又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止する少なくとも1つの変異を有する、野生型であるか又は1つ以上の変異を含む、全てのAAV遺伝子のポリヌクレオチド配列を含む。AAVゲノム又はAAVベクターは、1つ以上の異種ポリヌクレオチド、つまり、野生型AAV遺伝子以外のポリヌクレオチド、例えば導入遺伝子を更に含んでもよい。導入遺伝子の一例は、治療遺伝子である。
AAVゲノム又はAAVベクターは、天然の血清型又は非天然の血清型のいずれかである任意のAAV血清型でありうる。MAAPをコードするcap遺伝子は、各AAV血清型について周知であり、したがって当業者は、本明細書に記載される任意のAAV血清型MAAPの変異型AAVゲノムを調製することが十分に可能である。本明細書の実施例で実証されるように、MAAP変異体は、複数のAAV血清型について調製されており、全ての試験血清型について、本明細書に記載される効果(例えば、24時間を超えて培養した後のより高いウイルス力価、減少したカプシド分解、より高いカプシド完全性及びVPタンパク質完全性)の少なくとも1つが観察された。好ましい実施形態では、AAVゲノム又はAAVベクターは、血清型1ゲノム、血清型2型ゲノム、血清型5型ゲノム、血清型6型ゲノム、血清型8型ゲノム、血清型9型ゲノム、又は非天然の血清型のAAVゲノム又はAAVベクターである。好ましい実施形態では、AAVゲノム又はAAVベクターは、血清型1型、2型、5型、6型、8型及び9型のAAVゲノム又はAAVベクターである。好ましい実施形態では、AAVゲノム又はAAVベクターは、血清型2型、5型、6型又は8型のAAVゲノム又はAAVベクターである。好ましい実施形態では、ゲノム又はベクターは、血清型2型のゲノム又はベクターを含むか、又は血清型2型のゲノム又はベクターである。他の好ましい実施形態では、ゲノム又はベクターは、非天然の血清型のゲノム又はベクターを含む。
本明細書で使用される場合、「全長の野生型MAAPの発現を低減する」とは、好適な宿主細胞での本発明のAAVゲノムを含有するウイルス粒子、ベクター、又はプラスミドによる全長の野生型MAAPの発現レベルが、同じ宿主細胞内での、前記変異を欠くことを除いて本発明のAAVゲノムと同一であるAAVゲノムを含有するウイルス粒子、ベクター、又はプラスミドによる全長の野生型MAAPの発現レベルと比較して、低減されることを意味する。好ましい実施形態では、全長の野生型MAAPの発現は、少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約15%、より好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%低減される。
全長の野生型MAAPの発現を低下させるAAVゲノムにおける変異は、好ましくは、野生型MAAP mRNAと比較して、MAAP mRNAが改変されている変異である。特に、同じAAV血清型の野生型MAAP mRNAと比較して改変されている変異である。
好ましい実施形態では、AAVゲノムにおける変異は、MAAPをコードする遺伝子における変異、特に野生型AAVと比較した変異である。MAAPをコードする遺伝子は、1つ以上のかかる変異を有しうる。好ましい一実施形態では、MAAPをコードする遺伝子は、1つの変異を有する。他の好ましい実施形態では、MAAPをコードする遺伝子は、1個～10個の変異、好ましくは1個～5個の変異、例えば1個、2個、3個、4個又は5個の変異を有する。前記変異は、示された効果を有する任意の種類の変異、例えば、1つ以上のヌクレオチドの置換、付加又は欠失でありうる。好ましい実施形態では、前記変異は、1つ以上のヌクレオチドの置換、より好ましくは、MAAPアミノ酸配列における1つ以上の停止コドンの導入をもたらす1つ以上のヌクレオチドの置換である。
変異は、例えば、部位特異的変異誘発によって導入することができる。部位特異的変異誘発は、当技術分野で周知であり、本発明による変異(例えば、置換、挿入又は欠失)を含む1つ以上の点変異をウイルスポリヌクレオチド又はゲノムに導入するために使用することができる。当業者であれば、本発明による変異を導入することが十分に可能である。図21A～Jは、それぞれ、AAV血清型1～10型について、とりわけMAAP及びVP1をコードするcap 遺伝子の核酸配列を示す。部位特異的変異誘発のための好適な技術は、Sambrook'sら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989))、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates (1992))及びBachmanら、J. Methods Enzymol. 2013; 529: 241～248頁に記載されており、これらの文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
好ましい実施形態では、前記変異は、MAAP mRNA翻訳開始コドンを不活性化するか又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止する。したがって、MAAP mRNAに転写されるアデノ随伴ウイルスゲノムであって、ゲノムが、MAAP mRNAを野生型MAAP mRNAから変化させる変異を有し、変化が、MAAP翻訳開始コドンを開始コドンではない配列に変化させること、MAAP mRNA内に少なくとも1つの停止コドンを作製すること、及びその組合せから選択される、アデノ随伴ウイルスゲノムも提供される。好ましい実施形態では、前記変異は、前記ゲノムからのVP1の発現を妨げない。
好ましい実施形態では、変異は、MAAP(mRNA)翻訳開始コドンを不活性化する、つまり、MAAP翻訳開始コドンが、開始コドンではない配列に変化する。前記翻訳開始コドンは、好適には、非ATG開始コドン、より好適にはCTG開始コドン、例えば、AAV血清型2型のMAAPにおけるロイシン(AAV血清型2型の全長タンパク質のL1)に翻訳される、MAAPをコードする核酸配列中の第1のCTGである。例えば、CTG開始コドンをCGGに変異させ、コドンを潜在的な開始コドンとして不活性化することができる。しかしながら、当業者であれば、開始コドンを不活性化する他の変異を導入することが十分に可能である。
好ましい実施形態では、変異は、少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止する。前記停止コドンは、その導入により、全長の野生型MAAPがもはや翻訳及び/又は発現されなくなる任意の位置で導入されうる。複数の停止コドンを導入してもよい。好ましい実施形態では、1～5個の停止コドンが導入される。好ましい実施形態では、1～3個の停止コドンが導入される。好ましい実施形態では、1個又は3個の停止コドンが導入される。好ましい実施形態では、変異は、少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止するが、VP1の発現を妨げない変異、好ましくは、少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止するが、VP1アミノ酸配列には変異を導入しない変異である。好ましい実施形態では、前記変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9～110とアラインメントするポリペプチド残基に、つまり、配列番号11の配列中の残基番号9～110、又は、任意のMAAPアミノ酸配列中の対応する残基番号、特に配列番号1～10のいずれかの配列中の対応する残基番号におけるポリペプチド残基に、少なくとも1つの停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する。好ましい実施形態では、変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9、33、39、47、65、90、100、103、105、106及び/又は110とアラインメントするポリペプチド残基に少なくとも1つの停止コドンを導入する。好ましい実施形態では、前記変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号39～103とアラインメントするポリペプチド残基に、少なくとも1つの停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する。当業者であれば、配列番号11のコンセンサス配列における示される残基番号に基づいて、天然又は非天然のAAV血清型のいずれかにおける関連する残基番号を同定することが十分に可能である。好ましい実施形態では、変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9、33、39、47、65、90、100、106及び/又は110とアラインメントするポリペプチド残基に少なくとも1つの停止コドンを導入する。好ましい実施形態では、変異は、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9、33、39、及び/又は47とアラインメントするポリペプチド残基に少なくとも1つの停止コドンを導入した。
好ましい実施形態では、変異は、Table 1(表1)、Table 2(表2)、Table 3(表3)に示される変異、又はこれらの変異のいずれかの組合せから選択される変異である。Table 1(表1)、Table 2(表2)及びTable 3(表3)において、変異配列は「MAAP変異」の列に示される。
好ましい実施形態では、VP1の発現は妨げられない。他の好ましい実施形態では、VP1の発現が維持される。
本明細書で使用される場合、「VP1の発現を維持する」及び「VP1の発現を妨げない」とは、好適な宿主細胞内で本発明のAAVゲノムを含有するウイルス粒子、ベクター又はプラスミドがVP1を発現することを意味する。「VP1の発現を維持する」及び「VP1の発現を妨げない」とは、好適な宿主細胞内の本発明のAAVゲノムを含有するかかるウイルス粒子、ベクター又はプラスミドによるVP1の発現レベルが、同一の宿主細胞内の、前記変異がない以外は本発明のAAVゲノムと同一であるAAVゲノムを含有するウイルス粒子、ベクター又はプラスミドによるVP1の発現レベルの少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約100%であることを意味する。好ましい実施形態では、用語「VP1の発現を維持する」とは、好適な宿主細胞内で前記変異を有する本発明のAAVゲノムを含有するウイルス粒子、ベクター又はプラスミドによるVP1の発現が、同一の宿主細胞内の、前記変異がない以外は本発明のAAVゲノムと同一であるAAVゲノムを含有するウイルス粒子、ベクター又はプラスミドによるVP1の発現に匹敵することを意味する。
VP1の発現を維持するか、又はVP1の発現を妨げないことは、例えば、全長の野生型MAAPの発現を低下させるか、MAAP mRNA翻訳開始コドンを不活性化するか又は全長の野生型MAAPの翻訳を停止させるための少なくとも1つの停止コドンを導入するが、VP1アミノ酸配列の変異をもたらさない、変異を導入することによって達成される。或いは、VP1の発現を維持するか、又はVP1の発現を妨げないことは、全長VP1の発現に影響を及ぼさない、VP1アミノ酸配列の変異をもたらす変異を導入することによって達成される。特に、そのような変異は、VP1の機能性にも影響を及ぼさない。好ましい実施形態では、MAAP mRNA翻訳開始コドンを不活性化するか、又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止し、全長の野生型MAAPの発現を低下させる変異は、VP1において停止コドンを導入しない。したがって、好ましい実施形態では、VP1アミノ酸配列は、改変されない。特に、VP1アミノ酸配列は、同じAAV血清型の野生型VP1アミノ酸配列と比較して改変されない。しかしながら、VP1アミノ酸又はペプチド配列は、1つ以上の変異を含んでもよい。例えば、VP1ペプチドは、MAAPペプチド配列が停止コドンを含むように変異している位置に対応する位置で改変される。したがって、一部の実施形態では、VP1アミノ酸配列は、1つ以上の変異を有する。一部の実施形態では、VP1ペプチドにおける1つ以上の変異は、保存的変異である。当業者は、適切な保存的変異を同定又は選択することが十分に可能である。タンパク質又はペプチドの機能に影響を与える可能性が低い保存的アミノ酸変異の例としては、以下が挙げられる:セリンの代わりにアラニン、イソロイシンの代わりにバリン、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸、セリンの代わりにトレオニン、グリシンの代わりにアラニン、トレオニンの代わりにアラニン、アスパラギンの代わりにセリン、バリンの代わりにアラニン、グリシンの代わりにセリン、フェニルアラニンの代わりにチロシン、プロリンの代わりにアラニン、アルギニンの代わりにリジン、アスパラギンの代わりにアスパラギン酸、イソロイシンの代わりにロイシン、バリンの代わりにロイシン、グルタミン酸の代わりにアラニン、グリシンの代わりにアスパラギン酸、及びこれらの逆。好ましくは、保存的置換は、あるグループ内の1つのアミノ酸と、同じグループ内の別のアミノ酸との交換であり、ここで、これらのグループは、以下の通りである:(1)アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びフェニルアラニン:(2)ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、及びアスパラギン;(3)アスパラギン酸及びグルタミン酸;(4)セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びシステイン;並びに(5)グリシン、プロリン、及びアラニン。
好ましい実施形態では、VP1アミノ酸配列は、野生型VP1、特に同じAAV血清型の野生型VP1に対して少なくとも80%の相同性を有する。好ましい実施形態では、VP1アミノ酸配列は、野生型VP1、特に同一のAAV血清型の野生型VP1に対して少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の相同性を有する。
好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の33個の連続した残基に対して少なくとも50%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の33個の連続した残基に対して少なくとも50%の同一性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の33個の連続した残基に対して少なくとも50%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しないアデノ随伴ウイルスゲノムも提供される。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の33個の連続した残基に対して少なくとも50%の同一性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。
好ましい実施形態では、33個の連続した残基は、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基93～97を含む。
好ましい実施形態では、33個の連続した残基は、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基107～119を含む。
好ましい実施形態では、33個の連続した残基は、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基1～30を含む。
好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基1～33と少なくとも60%の相同性を有する任意の配列を含まない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11残基1～33に対して少なくとも60%の同一性を有する任意の配列を含まない。
好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基1～39と少なくとも60%の相同性を有する任意の配列を含まない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11残基1～39に対して少なくとも60%の同一性を有する任意の配列を含まない。
好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基1～47と少なくとも60%の相同性を有する任意の配列を含まない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11残基1～47に対して少なくとも60%の同一性を有する任意の配列を含まない。
好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも60%の相同性を有する任意の配列を含まない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも60%の同一性を有する任意の配列を含まない。
好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも70%の相同性を有する任意の配列を含まない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも70%の同一性を有する任意の配列を含まない。
好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも80%の相同性を有する任意の配列を含まない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも80%の同一性を有する任意の配列を含まない。
好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の15個の連続した残基に対して少なくとも95%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の15個の連続した残基に対して少なくとも95%の同一性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。
好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の17個の連続した残基に対して少なくとも90%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の17個の連続した残基に対して少なくとも90%の同一性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。
好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の19個の連続した残基に対して少なくとも90%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の19個の連続した残基に対して少なくとも90%の同一性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。
好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の21個の連続した残基に対して少なくとも90%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の21個の連続した残基に対して少なくとも90%の同一性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。
好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基番号94～120の任意の10個の連続した残基に対して少なくとも50%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。好ましい実施形態では、AAVゲノムは、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基番号94～120の任意の10個の連続した残基に対して少なくとも50%の同一性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない。
好ましい実施形態では、本発明によるアデノ随伴ウイルスゲノムは、好適なプロデューサー細胞に導入されると、ウイルス産生が増加する。特に、本明細書に記載の、膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)mRNA翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止し、全長の野生型MAAPの発現を低下させる変異を欠くことを除いて本発明のAAVゲノムと同一であるAAVゲノムが導入された同じ宿主細胞によるウイルス産生と比較して、ウイルス産生が増加する。好ましくは、ウイルス産生が少なくとも10%増加する。好ましい実施形態では、ウイルス産生は、少なくとも15%、少なくともより好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約50%増加する。更なる好ましい実施形態では、ウイルス産生は、少なくとも約60%、少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%増加する。
好ましい実施形態では、本発明によるアデノ随伴ウイルスゲノムは、ゲノムを含有するウイルス粒子の感染性が増加している。特に、本明細書に記載の、膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)mRNA翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止し、全長の野生型MAAPの発現を低下させる変異を欠くことを除いて本発明のAAVゲノムと同一であるAAVゲノムを含有するウイルス粒子の感染性と比較して、感染性が増加している。好ましくは、感染性は、少なくとも10%増加している。好ましい実施形態では、感染性は、少なくとも15%、少なくともより好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約50%増加している。更なる好ましい実施形態では、感染性は、少なくとも約60%、少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%増加している。
好ましい実施形態では、本発明によるアデノ随伴ウイルスゲノムは、ゲノムを含有するウイルス粒子の安定性が増加している。特に、本発明によるアデノ随伴ウイルスゲノムは、カプシドの分解を低減し、カプシドの完全性を増加させ、及び/又はVP1タンパク質の完全性を増加させる。特に、本明細書に記載の、膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)mRNA翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止し、全長の野生型MAAPの発現を低下させる変異を欠くことを除いて本発明のAAVゲノムと同一であるAAVゲノムを含有するウイルス粒子の安定性と比較して、安定性が増加している。好ましくは、安定性が少なくとも10%増加している。好ましい実施形態では、安定性は、少なくとも15%、少なくともより好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約50%増加している。更なる好ましい実施形態では、安定性は少なくとも約60%、少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%増加している。
本発明によるAAVゲノム又はAAVベクターは、好適なプロデューサー細胞内に存在し、かつAAV Rep及びCapタンパク質の存在下にある場合、ウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子内に複製及びパッケージングされうる。したがって、本発明のAAVゲノム又はAAVベクターを含むアデノ随伴ウイルスも提供される。
本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」又は「AAV」とは、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質VP1、VP2、及び/又はVP3、好ましくは、野生型AAVのカプシドタンパク質の全てから構成されるウイルス粒子、及びカプシド形成されたポリヌクレオチドAAVゲノム又はAAVベクターを指す。本発明のAAVは、典型的には、組換えAAVである。好ましい実施形態では、AAVは、非天然AAVである。AAVは、1つ以上の異種ポリヌクレオチド、すなわち、野生型AAVポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子を含みうる。導入遺伝子の一例は、治療遺伝子である。本明細書で使用される「治療遺伝子」とは、細胞内で発現されたときに、発現される細胞、組織又は動物に有益な効果を付与する遺伝子産物を産生する遺伝子を指す。
本発明のAAVは、複製能があってもよく、又は複製能がなくてもよい。「複製能がある」とは、ウイルス又はウイルス粒子が感染性であり、好適な感染細胞内で複製可能であることを意味する。好ましい実施形態では、本発明のAAVは複製能がない。
一部の実施形態では、AAVゲノムは、プロモーター配列、特に宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーター配列に作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含む。プロモーター配列に作動可能に連結されているポリヌクレオチドを指す場合、本明細書で使用される「作動可能に連結されている」とは、ポリヌクレオチド配列がプロモーターと機能的な関係に置かれていることを意味し、つまり、プロモーターが配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーターはポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
好ましい実施形態では、本発明によるアデノ随伴ウイルスは、感染性が増加している。特に、本明細書に記載の、膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)mRNA翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止し、全長の野生型MAAPの発現を低下させる変異を欠くことを除いて本発明のAAVゲノムと同一であるAAVゲノムを含有するAAVの感染性と比較して、感染性が増加している。好ましくは、感染性は、少なくとも10%増加している。好ましい実施形態では、感染性は、少なくとも15%、少なくともより好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約50%増加している。更なる好ましい実施形態では、感染性は、少なくとも約60%、少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%増加している。
好ましい実施形態では、本発明によるアデノ随伴ウイルスは、安定性が増加している。特に、本明細書に記載の、膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)mRNA翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止し、全長の野生型MAAPの発現を低下させる変異を欠くことを除いて本発明のAAVゲノムと同一であるAAVゲノムを含有するAAVの安定性と比較して、安定性が増加している。好ましくは、安定性が少なくとも10%増加している。好ましい実施形態では、安定性は、少なくとも15%、少なくともより好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約50%増加している。更なる好ましい実施形態では、安定性は少なくとも約60%、少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%増加している。
更なる態様では、アデノ随伴ウイルスを産生するプロデューサー細胞であって、本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムを含むプロデューサー細胞が提供される。
更なる態様では、アデノ随伴ウイルスを産生するプロデューサー細胞であって、
(a)MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対する少なくとも50%の相同性、
(b)MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の15個の連続した残基に対する少なくとも95%の相同性、
(c)MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基番号94～120の任意の10個の連続した残基に対する少なくとも50%の相同性
を有するポリペプチドを実質的に含まないプロデューサー細胞が提供される。プロデューサー細胞は、好ましくは、本明細書で上述されるポリペプチドを含まない。
(a)MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対する少なくとも50%の相同性、
(b)MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の15個の連続した残基に対する少なくとも95%の相同性、
(c)MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基番号94～120の任意の10個の連続した残基に対する少なくとも50%の相同性
を有するポリペプチドを実質的に含まないプロデューサー細胞が提供される。プロデューサー細胞は、好ましくは、本明細書で上述されるポリペプチドを含まない。
本明細書で使用される場合、「プロデューサー細胞」は、「宿主細胞」とも呼ばれる。本明細書で使用される「プロデューサー細胞」及び「宿主細胞」という用語は、AAV、特に本発明のAAVによる感染又は形質導入が可能な任意の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「形質導入する」又は「形質導入」は、ウイルス又はウイルスベクターによる細胞への1つ以上のポリヌクレオチドの導入を指す。本明細書で使用される場合、「好適な宿主細胞」という用語は、AAVゲノムを含有するウイルス粒子、ベクター又はプラスミドによって感染された場合に、AAVゲノムによってコードされるタンパク質の発現を可能にする宿主細胞を意味する。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、遺伝子操作されたプロデューサー細胞である。
ウイルス粒子を産生するために細胞又はプロデューサーへAAVゲノム又はベクターを導入又は包含させることは、当業者に周知の、当技術分野における任意の従来の方法によって達成することができる。好ましい実施形態では、細胞又はプロデューサー細胞は、AAVゲノムで形質導入される。例えば、本発明によるAAVゲノムを含むAAV発現ベクターを、AAVカプシドタンパク質、並びに、複製タンパク質及びパッケージタンパク質を含む、感染及び/又は複製に必要な他のAAVヘルパー機能をコードするポリヌクレオチド配列を含むAAVヘルパー構築物と共に、プロデューサー細胞に導入し、続いて、プロデューサー細胞を培養して、AAVを産生することができる。或いは、本発明のAAVゲノムは、ウイルス粒子の感染及び複製に必要な全てのヌクレオチド配列及びタンパク質を含む。好適な方法が本明細書の実施例に記載される。
「プロデューサー細胞」及び「宿主細胞」という用語は、任意の真核細胞又は原核細胞(例えば、大腸菌等の細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、及び昆虫細胞)を包含する。宿主細胞は、インビトロであってもインビボであってもよく、例えば、トランスジェニック動物内に位置していてもよい。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、真核生物である。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、哺乳類である。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、ヒト細胞である。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、酵母細胞及び昆虫細胞から選択される。当業者であれば、アデノ随伴ウイルスを産生するために好適なプロデューサー細胞を選択することが十分に可能である。好適なプロデューサー細胞の一例は、293T細胞である。プロデューサー細胞の他の例としては、限定されないが、HeLa細胞、COS細胞、COS-1細胞、COS-7細胞、HEK293細胞、A549細胞、BHK細胞、BSC-1細胞、BSC-40細胞、Vero細胞、Sf9細胞、Sf-21細胞、Tn-368細胞、BTI-Tn-5B1-4(High-Five)細胞、Saos細胞、C2C12細胞、L細胞、HT1080細胞、HepG2細胞、WEHI細胞、3T3細胞、10T1/2細胞、MDCK細胞、BMT-10細胞、WI38細胞、及び初代哺乳類線維芽細胞、肝細胞又は筋芽細胞が挙げられる。
更なる態様では、アデノ随伴ウイルスゲノムを含むプロデューサー細胞であって、アデノ随伴ウイルスを発現可能であり、全長の機能性MAAPを実質的に含まないプロデューサー細胞が提供される。好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスゲノムは、全長の野生型の機能性MAAPの発現を妨げる変異を有する。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、全長の野生型の機能性MAAPの発現を妨げる干渉RNAを含む。好ましい実施形態では、MAAPに結合し、MAAPの機能を損なう、MAAPへと方向付けられたモノクローナル抗体を含む。
好ましい実施形態では、本発明のプロデューサー細胞は、ウイルス産生が増加する。特に、本明細書に記載の、膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)mRNA翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止し、全長の野生型MAAPの発現を低下させる変異を欠くことを除いて本発明のAAVゲノムと同一であるAAVゲノムが導入された、同じプロデューサー細胞によるウイルス産生と比較して、ウイルス産生が増加する。好ましくは、ウイルス産生が少なくとも10%増加する。好ましい実施形態では、ウイルス産生は、少なくとも15%、少なくともより好ましくは少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約50%増加する。更なる好ましい実施形態では、ウイルス産生は、少なくとも約60%、少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%増加する。
更なる態様では、アデノ随伴ウイルスを作製する方法であって、アデノ随伴ウイルスゲノムを取得すること、次いで、前記ゲノムを細胞内に導入して、本発明のプロデューサー細胞を作製すること、次いで、アデノ随伴ウイルスを作製する前記プロデューサー細胞を培養することを含む方法が提供される。好ましい実施形態では、方法は、前記アデノ随伴ウイルスを収集することを更に含む。好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスゲノムは、本発明によるアデノ随伴ウイルスゲノムである。
更なる態様では、アデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、アデノ随伴ウイルスを産生する、本発明のプロデューサー細胞を培養することを含む方法が提供される。好ましい実施形態では、方法は、前記アデノ随伴ウイルスを収集することを更に含む。
本発明の方法で産生されるアデノ随伴ウイルスは、1つ以上の異種ポリヌクレオチド、つまり、野生型AAVポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子を含みうる。好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルス、特に、収集されたアデノ随伴ウイルスは、導入遺伝子を含む。導入遺伝子の一例は、治療遺伝子である。
好ましい実施形態では、AAVを産生するための本発明の方法は、24時間を超えてプロデューサー細胞を培養すること、特に、AAVが収集される前に、24時間を超えてプロデューサー細胞を培養することを含む。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、少なくとも30時間培養され、特に、AAVが収集される前に、プロデューサー細胞は少なくとも30時間培養される。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、少なくとも36時間培養され、特に、AAVが収集される前に、プロデューサー細胞は少なくとも36時間培養される。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、少なくとも48時間培養され、特に、AAVが収集される前に、プロデューサー細胞は少なくとも48時間培養される。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、少なくとも60時間培養され、特に、AAVが収集される前に、プロデューサー細胞は少なくとも60時間培養される。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、少なくとも72時間培養され、特に、AAVが収集される前に、プロデューサー細胞は少なくとも72時間培養される。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、物理的カプシドの総数に対する目的の遺伝子又はゲノムを含有するカプシドの数の比率が、野生型アデノ随伴ウイルスゲノムを含む類似の細胞によって産生される物理的カプシドの総数に対する目的の遺伝子又はゲノムを含有するカプシドの数の比率と少なくとも同じ高さのウイルス調製物を産生する。好ましい実施形態では、目的のゲノムは、好ましくは、本発明によるAAVゲノムである。好ましい実施形態では、目的の遺伝子は、本発明による、膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)mRNA翻訳開始コドンを不活性化するか又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止する変異を有する、AAV遺伝子、特にMAAP遺伝子である。他の好ましい実施形態では、目的の遺伝子は、異種遺伝子、特に導入遺伝子である。導入遺伝子の一例は、治療遺伝子である。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、野生型アデノ随伴ウイルスゲノムに感染した類似の細胞が産生するのと少なくとも同じ高さの完全ウイルスカプシド:空ウイルスカプシドの比率を有するウイルスを産生する。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、野生型アデノ随伴ウイルスに感染した類似の細胞が産生するよりも完全ウイルスカプシド:空ウイルスカプシドの比率が30%高いウイルスを産生する。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、野生型アデノ随伴ウイルスに感染した類似の細胞と少なくとも同じ多さのウイルスゲノム/mLを有するウイルスを産生する。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、野生型アデノ随伴ウイルスに感染した類似の細胞が産生する数の少なくとも4倍の多さのウイルスゲノム/mLを有するウイルスを産生する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)の安定性を増加させるか、カプシド完全性を増加させるか、又はカプシド分解を低減する方法であって、本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムをAAVに含めることを含む方法が更に提供される。
目的の遺伝子又はゲノムを含有するAAVカプシドの割合を増加させる方法であって、本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムと目的の遺伝子又はゲノムとをAAVに含めることを含む方法が更に提供される。
AAVを産生するプロデューサー細胞のウイルス力価(ウイルスゲノム/mL)を増加させる方法であって、本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムをAAVに含めること、及びAAVをプロデューサー細胞に導入することを含む方法が更に提供される。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、少なくとも30時間培養される。
好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、少なくとも36時間、48時間、72時間又は96時間培養される。
更にAAVを産生するプロデューサー細胞におけるウイルスゲノム又はウイルス粒子の保持を増加させるための方法であって、本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムをAAVに含めること、及びAAVをプロデューサー細胞に導入することを含む方法が更に提供される。好ましい実施形態では、方法は、プロデューサー細胞から、好ましくは培地を実質的に含まないように、ウイルスゲノム又はウイルス粒子を収集及び/又は精製することを更に含む。
アデノ随伴ウイルスを産生するための本発明の方法によって産生されたアデノ随伴ウイルスが更に提供される。好ましい実施形態では、アデノ随伴ウイルスは、本発明によるAAVゲノムを含有するアデノ随伴ウイルスである。本発明のAAVは、典型的には、組換えAAVである。好ましい実施形態では、AAVは、非天然のAAVである。AAVは、1つ以上の異種ポリヌクレオチド、つまり、野生型AAVポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子を含みうる。
明確性及び簡潔な説明を目的として、特徴は、本発明の同一又は別個の態様又は実施形態の一部として本明細書で記載されうる。本発明の範囲が、同じ又は別個の実施形態の一部として本明細書に記載される特徴の全て又は一部の組合せを有する実施形態を含みうることは、当業者によって理解されるであろう。
本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面による本特許又は特許出願発行物のコピーは、申請及び必要な料金の支払により、特許庁から提供される。
(実施例1)
材料及び方法
全長MAAP及び切断されたMAAP
AAVの解析を行い、可能性のある新規ウイルスタンパク質と、その翻訳のためのいくつかの非正準開始コドンを同定した。次に、これら3つの非正準開始コドンのうちの1つが実際に野生型AAVで動作し、新規の野生型タンパク質の翻訳を開始することを見出した。配列番号1～10はそれぞれAAV血清型1～10型の野生型タンパク質の一次アミノ酸配列を示す。これらの血清型のそれぞれのアミノ酸配列は、C末端で高度に保存されている。N末端では、AAV血清型4型(配列番号4)及び血清型5型(配列番号5)の野生型タンパク質は、他の血清型には見られない先行する(leading)15～25アミノ酸残基配列を有する。配列番号11は、これらの10種の血清型全ての理論的コンセンサスのための一次アミノ酸配列を示す。これらのタンパク質をまとめて、及びそれぞれを個別に、「MAAP」と称する(新たに発見された同じタンパク質が、最近、別途、Ogden P.J.ら、「Comprehensive AAV Capsid Fitness Landscape Reveals A Viral Gene And Enables Machine-Guided Design」、366 Science 1139頁(2019)によって記載された。Ogdenらは、この新しく発見されたタンパク質を「膜結合性アクセサリータンパク質」又は「MAAP」として参照している)。
材料及び方法
全長MAAP及び切断されたMAAP
AAVの解析を行い、可能性のある新規ウイルスタンパク質と、その翻訳のためのいくつかの非正準開始コドンを同定した。次に、これら3つの非正準開始コドンのうちの1つが実際に野生型AAVで動作し、新規の野生型タンパク質の翻訳を開始することを見出した。配列番号1～10はそれぞれAAV血清型1～10型の野生型タンパク質の一次アミノ酸配列を示す。これらの血清型のそれぞれのアミノ酸配列は、C末端で高度に保存されている。N末端では、AAV血清型4型(配列番号4)及び血清型5型(配列番号5)の野生型タンパク質は、他の血清型には見られない先行する(leading)15～25アミノ酸残基配列を有する。配列番号11は、これらの10種の血清型全ての理論的コンセンサスのための一次アミノ酸配列を示す。これらのタンパク質をまとめて、及びそれぞれを個別に、「MAAP」と称する(新たに発見された同じタンパク質が、最近、別途、Ogden P.J.ら、「Comprehensive AAV Capsid Fitness Landscape Reveals A Viral Gene And Enables Machine-Guided Design」、366 Science 1139頁(2019)によって記載された。Ogdenらは、この新しく発見されたタンパク質を「膜結合性アクセサリータンパク質」又は「MAAP」として参照している)。
野生型DNA配列は、2つの更なる非正準開始コドンを含む。このうちの1つはAGG(配列番号2の全長ポリペプチド配列のアミノ酸残基13をコードする)である。もう1つは、ACG(配列番号2の全長ポリペプチド配列のアミノ酸残基14をコードする)である。
ウイルス製剤
AAVウイルスの製造は以下のように行った。293T細胞(European Collection of Cell Cultures 293T 番号:12022001)を、2mMのl-グルタミン(Gibco社、25030-024)及びペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco社、15070-063)を添加し、10%ウシ胎児血清(FBS、Thermo Fisher社、10091-148)を補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco社、11965084)中で増殖させた。
AAVウイルスの製造は以下のように行った。293T細胞(European Collection of Cell Cultures 293T 番号:12022001)を、2mMのl-グルタミン(Gibco社、25030-024)及びペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco社、15070-063)を添加し、10%ウシ胎児血清(FBS、Thermo Fisher社、10091-148)を補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco社、11965084)中で増殖させた。
AAVプラスミド及びアデノウイルスヘルパープラスミドのポリエチレンイミン(PEI)トランスフェクションを、T25フラスコ中の293T細胞(60,000細胞/cm2)に対して行った。PEI Pro(商標)(Polyplus Transfection社、参照番号115-100)/DNA重量比を、無血清DMEM培地中で1:1に維持した。AAV2については、AAV2プラスミド及びアデノウイルスヘルパープラスミドを合計350ng/cm2で1:1の比率で使用した。他のAAV血清型も、AAVプラスミドとヘルパープラスミドとの適切な比率で同様に使用しうる。
非正準開始コドンの相対的頻度を分析するために、最初の非正準開始コドンをCTGからCGGに点変異させ、コドンを潜在的な開始コドンとして不活性化した。
この新しいタンパク質の機能を評価するために、人工的に切断した変異型を作製した。これらの変異の設計は、容易な作業ではなかった。その理由は、同じDNA配列が、宿主細胞へのウイルス侵入及び感染細胞の核へのウイルスゲノムの細胞内送達に重要なウイルスタンパク質であるVP1を発現させるために使用されているためである。したがって、MAAP翻訳を停止させるが、VP1の転写もアミノ酸配列も妨げないコドンを生成する点変異を作る必要があった。我々は、11個の適切な変異部位を同定した。これらの新しい停止コドンは、理論的には、残基番号Q9、S33、S39、S47、S65、E90、L100、W103、W105、L106及びL110のアミノ酸でMAAP(ここでは血清型2型、配列番号2)の翻訳を切り捨てる。以下の表に、試験で使用した様々なプラスミド、MAAP遺伝子に対して行った点変異、及び得られるMAAP及びVP1アミノ酸配列に対するそれらの影響を、より完全に列挙している。
蛍光活性化セルソーティングには、以下のプラスミドを使用した。
ウイルスを、トランスフェクションの24時間及び72時間後に収集した。
ウイルスゲノム力価決定及びAAVカプシドELISA試料のため、Triton-X-100緩衝液(1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Gibco社、参照番号18912-014)中0.5%Triton-X-100(Sigma-Aldrich社、参照番号X100-1L)及び2mM MgCl2(Merck社、参照番号E13980))並びにデナラーゼ(Denarase)(50U/ml、c-Lecta社、参照番号20804-5M)を使用して、ウイルスを収集した。溶解緩衝液を培地に添加し、細胞を37℃で2時間インキュベーションした後、細胞溶解物を収集した。
ウエスタンブロット用に処理した試料については、以下のようにウイルスを収集した。細胞を、Tryple Select(商標)(Gibco社、参照番号12563-011)を使用して分離し、1x PBS(Gibco社、参照番号14190-094)中に懸濁した。細胞を遠心分離(500g、5分)によってペレット化した。細胞ペレットを1x PBSで洗浄し、遠心分離を繰り返した。細胞を、プロテイナーゼ阻害剤カクテル(cOmplete(商標)、Roche社、参照番号1169749800)を含有する放射線免疫沈降アッセイ(RIPA、Thermo Scientific社、参照番号89901)緩衝液中に再懸濁した。試料を氷上で20分間インキュベートし、20,000gで15分間遠心分離した。上清を回収した。
液滴デジタルPCRによるAAV及び混入配列の定量
液滴デジタルPCR(ddPCR)AAVウイルスゲノム(vg)力価を得るために、ウイルスの粗製物を、まずDNaseI(0,01U/μl、Invitrogen社、参照番号18047-019)で処理し、次にプロテイナーゼK(0,1μg/μl、Roche社、参照番号03115879001)で処理し、適切なプライマーを用いたddPCR増幅(QX200、Bio-Rad社)によってウイルス力価を得た。例えば、AAV2では、Rep2-FWD及びRep2-REV用のプライマー、及びプローブRep2-PRBを使用して、AAVレプリカーゼ領域を検出した。
液滴デジタルPCR(ddPCR)AAVウイルスゲノム(vg)力価を得るために、ウイルスの粗製物を、まずDNaseI(0,01U/μl、Invitrogen社、参照番号18047-019)で処理し、次にプロテイナーゼK(0,1μg/μl、Roche社、参照番号03115879001)で処理し、適切なプライマーを用いたddPCR増幅(QX200、Bio-Rad社)によってウイルス力価を得た。例えば、AAV2では、Rep2-FWD及びRep2-REV用のプライマー、及びプローブRep2-PRBを使用して、AAVレプリカーゼ領域を検出した。
AAVプラスミド骨格及びアデノウイルスヘルパープラスミド骨格に由来し、AAVカプシドにパッケージングされた不要な混入DNAのレベルを評価するために、適切なプライマーを使用してddPCRを行った。例えば、プラスミド骨格に存在するカナマイシン耐性遺伝子による混入を検出するために、Kan-FWD及びKan-REV用のプライマー、カナマイシン耐性遺伝子用のプローブKan-PRBを使用した。プライマー(Ad5-E4-FWD;Ad5-E4-REV)及びプローブ(Ad5-E4-PRB)のアデノウイルスE4(Ad5-E4)領域セットを使用して、アデノウイルスヘルパープラスミドを定量した。全てのプライマー及びプローブは、Integreted DNA Technologies社から取り寄せた。
マスターミックス生成のために、プライマー(900nM)及びプローブ(250nM)を、プローブ用2x ddPCRスーパーミックス(dUTPなし、Bio-Rad社、参照番号1863025)及びヌクレアーゼフリー水(Thermo Scientific社、参照番号R0582)中で希釈した。上記の表に、試験で使用したプライマー及びプローブを列挙している。他のプライマー及びプローブを、異なるAAV血清型のため、及び異なる混入物質DNAを探るために、同様に使用してもよい。
ELISA
AAVゲノム含有カプシドの総AAVカプシドに対する比率を決定するために、AAV滴定ELISAキット(Progen社、参照番号 PRATV)を製造業者の指示に従って使用して、ウイルス調製物の連続希釈液に対して、A20カプシドELISAを実施した。
AAVゲノム含有カプシドの総AAVカプシドに対する比率を決定するために、AAV滴定ELISAキット(Progen社、参照番号 PRATV)を製造業者の指示に従って使用して、ウイルス調製物の連続希釈液に対して、A20カプシドELISAを実施した。
MAAP及びAAP抗血清
ポリクローナル抗MAAP抗血清を、免疫化前に担体にコンジュゲートしたペプチドKKIRLLGATSDEQSSRRKRG(配列番号28)(Davids Biotechnologie GmbH社、ドイツ)でウサギを免疫化することによって取得した。
ポリクローナル抗MAAP抗血清を、免疫化前に担体にコンジュゲートしたペプチドKKIRLLGATSDEQSSRRKRG(配列番号28)(Davids Biotechnologie GmbH社、ドイツ)でウサギを免疫化することによって取得した。
ポリクローナル抗AAP抗血清を、免疫化前に担体にコンジュゲートしたペプチドRSTSSRTSSARRIKDASRR(配列番号29)でモルモットを免疫化することによって取得した。抗血清をアフィニティ精製した(Davids Biotechnologie GmbH社、ドイツ)。
ウエスタンブロッティング
試料を、Laemmli試料緩衝液(Bio-Rad社、参照番号1610747)中2-メルカプトエタノール(10%、Sigma-Aldrich社)を使用して変性させた。各試料の一定体積を、Mini-Protean TGXゲル(4～10%、Bio-Rad社)上で走らせた。タンパク質を、0.2μmのPVDF膜(Trans-Blot Turbo Transfer Pack、Bio-Rad社)に移し、選択した一次抗体(表)で一晩染色した。タンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)共役二次抗体で検出し、ChemiDoc(Bio-Rad社)を使用して可視化した。
試料を、Laemmli試料緩衝液(Bio-Rad社、参照番号1610747)中2-メルカプトエタノール(10%、Sigma-Aldrich社)を使用して変性させた。各試料の一定体積を、Mini-Protean TGXゲル(4～10%、Bio-Rad社)上で走らせた。タンパク質を、0.2μmのPVDF膜(Trans-Blot Turbo Transfer Pack、Bio-Rad社)に移し、選択した一次抗体(表)で一晩染色した。タンパク質を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)共役二次抗体で検出し、ChemiDoc(Bio-Rad社)を使用して可視化した。
統計解析
統計学的比較は、一元配置分散分析(ANOVA)を使用して行い、続いて、wt-AAV2参照と他のアッセイされたAAV2との比較を、Dunnetttの多重比較検定を使用して行った。統計学的検定は、GraphPad(商標)ソフトウェア(Prism)を使用して行った。
統計学的比較は、一元配置分散分析(ANOVA)を使用して行い、続いて、wt-AAV2参照と他のアッセイされたAAV2との比較を、Dunnetttの多重比較検定を使用して行った。統計学的検定は、GraphPad(商標)ソフトウェア(Prism)を使用して行った。
結果
MAAP翻訳がCTGコドンで開始する
可能性のある新規のウイルスタンパク質を検出した後、wt AAVのゲノムを分析して、潜在的な非ATG(非正準)開始コドンを同定した。調査により、理論的に翻訳を開始することができる少なくとも3つの異なる非正準トリプレットが明らかになった。これら3つのそれぞれは、正準ATG開始コドンと比較して、1つの塩基のみ異なっている。したがって、それぞれが理論的に翻訳を開始することができる。
MAAP翻訳がCTGコドンで開始する
可能性のある新規のウイルスタンパク質を検出した後、wt AAVのゲノムを分析して、潜在的な非ATG(非正準)開始コドンを同定した。調査により、理論的に翻訳を開始することができる少なくとも3つの異なる非正準トリプレットが明らかになった。これら3つのそれぞれは、正準ATG開始コドンと比較して、1つの塩基のみ異なっている。したがって、それぞれが理論的に翻訳を開始することができる。
我々は、MAAPリーディングフレームにおいて遭遇した最初のCTGが、MAAPの主な翻訳開始コドンであることを見出した。CTGは、MAAP中のロイシン(全長タンパク質のL1)に翻訳される。VP1フレーム(MAAPに対して-1)では、この部位に、P27に翻訳されるCCTがある。
野生型ゲノムの状況で非正準開始コドンの使用頻度を分析するために、MAAPの第1の潜在的な非正準開始コドン(CTG、全長タンパク質のL1)をCGG(R1に翻訳)に変異させた。これにより、その潜在的な開始コドンの機能が消失した。これに応答して、MAAP産生が、ウエスタンブロットで検出不可能なレベルに低下することが分かった。
このようにして、我々は、いくつかの異なる方法で結果を確認した。まず、第1(CTG)及び第2(AGG)の潜在的な非正準開始コドン間に、MAAP-Q9に代えて停止コドンを導入した。これに応答して、MAAPタンパク質産生が、ウエスタンブロットを使用して検出不可能なレベルまで低下することが分かった。
同様に、MAAP-S39に代えて停止コドンを導入した。これに応答して、MAAPタンパク質産生が、ウエスタンブロットを使用して検出不可能なレベルまで低下することが分かった。
同様に、3つの連続した停止コドンを、MAAPのアミノ酸残基S33、S39及びS47に配置した。これに応答して、MAAP産生が、ウエスタンブロットを使用して検出不可能なレベルまで低下することが分かった。
我々の結果は、Ogden(2019)が観察したものとは異なる。彼らの研究では、Ogden(2019)は、MAAP-フラッグタグ融合タンパク質を使用しながら、最初のCTG開始コドンが変異したとき、及びMAAP-Q6に代えて停止コドンを導入した場合のタンパク質発現(おそらく切断形態)を観察した。
我々は更に、野生型MAAPのサイズを、MAAP-L1のCTG開始コドンをATGに変化させた組換えMAAPと比較することによって、又はATGに変更した第2の潜在的な開始コドン(MAAP-R13、AGG)からN末端切断MAAPが発現された場合に、MAAP開始コドンを特徴付けた。ATGに変化させたMAAP-L1から発現したタンパク質と同じ分子量のMAAPが検出されたが、一方で、ATGに変更されたMAAP-R13から発現した組換えN末端切断MAAPは、ウエスタンブロットにおいて、より低い分子量で検出される。
我々はまた、増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)をC末端部分に融合させたMAAP(MAAP-GFP)を作製し、wt-AAV2ゲノムにクローニングした。これは、VP1/2タンパク質の機能的破壊をもたらす。これは、eGFPがcap ORFフレームに挿入されるためである。しかしながら、AAPタンパク質及びVP3タンパク質をコードする能力は保存されているはずである。同様に、Repタンパク質の発現及びp40プロモーターの調節も損なわれないはずである。したがって、eGFPに由来する検出された蛍光は、そのウイルス関連のMAAPタンパク質の産生レベルを反映しているはずである。
wt-AAV2ゲノムから発現したMAAP-GFP融合タンパク質は、アデノウイルス5ヘルパー遺伝子をコードするプラスミドと共トランスフェクトした場合、蛍光強度中央値は30872であった(図1)。MAAP-L1のCTG開始コドンのCGGコドンへ変異させると、蛍光強度は17524となった。図1参照。これは、MAAP-Q39又はMAAP-S47に代えて停止コドンを導入した場合、又はMAAP-S33、-39、-47の3つの位置全てに同時に停止コドンを導入した場合に検出される強度レベルと同様である。MAAP-Q9又はMAAP-S33に代えて停止コドンを導入した場合、蛍光強度のレベルはそれぞれ15896及び15021に低下した。この発現レベルはバックグラウンドレベルを上回ったままであり、停止コドンがリーディングフレームに導入されたときにMAAPタンパク質の異なる位置で翻訳が開始される可能性を示唆しうる。或いは、この発現レベルは、挿入された停止コドンの潜在的なリードスルーを示唆しうる。しかしながら、これらの新しい停止コドンが挿入された場合、ウエスタンブロットを使用してMAAP産生は全く検出できなかったことに留意されたい。
アデノウイルスヘルパープラスミドが存在しない場合、MAAP-GFPの産生レベルは、バックグラウンドレベルを上回って検出された。これは、HEK293T細胞株がアデノウイルスE1遺伝子のコピーを含むためでありうる。E1遺伝子は、AAVプロモーターのためのトランスアクチベーターとして作用している可能性がある。
実験では、野生型MAAPの開始コドンとしてMAAP-L1(CTG)が確認される。L1からのMAAPの翻訳が損なわれるとき、MAAP-GFP産生結果に反映されるように、MAAP-L1の下流、MAAP-R13(AGG)、MAAP-T14(ACG)、又はMAAPタンパク質の更に下流に位置する潜在的な開始コドンを使用して、MAAPのN末端切断バージョンを翻訳しうる。
MAAP産生の動態
MAAPは、cap遺伝子から発現され、おそらくVP2/3発現につながるp40転写産物のスプライシング形態から発現される。リボソームスキャニング機構により、翻訳は、MAAPタンパク質のCTG開始コドン(フレームシフト+1～VP1 orf)で開始し、ACG開始コドンで開始されるVP2翻訳が続き、CTGコドンでのAAP発現(フレームシフト+1～VP1 orf)が続行し、ATGコドンで開始されるVP3タンパク質によって達成されることが見出される。
MAAPは、cap遺伝子から発現され、おそらくVP2/3発現につながるp40転写産物のスプライシング形態から発現される。リボソームスキャニング機構により、翻訳は、MAAPタンパク質のCTG開始コドン(フレームシフト+1～VP1 orf)で開始し、ACG開始コドンで開始されるVP2翻訳が続き、CTGコドンでのAAP発現(フレームシフト+1～VP1 orf)が続行し、ATGコドンで開始されるVP3タンパク質によって達成されることが見出される。
動態実験では、293T細胞におけるWT AAV2産生中のRep78/52、VP、AAP及びMAAPタンパク質の経時的な発現を追跡した。トランスフェクションの6.5時間後に、VP3及びRep52の非常に微弱な発現が検出された。トランスフェクションの12時間後に、AAPを除く全てのAAVタンパク質が検出された。トランスフェクションの13時間後にAAPが検出された。図2参照。更に、タンパク質の発現は徐々に増強され、トランスフェクションの21時間後にプラトーに達した。AAV産生中に、Rep78及び52のアイソフォームのみを検出することができ、Rep 68及び40は検出できなかった。
産生プロセス中に、トランスフェクション後21時間でカプシド分解が開始することも観察された。これは、VPのC末端部分を標的とするProgen B1抗体を使用したウエスタンブロットでVP3タンパク質バンドより低いことで分かる。図2参照。
AAPのC末端領域は、5つの塩基性アミノ酸リッチ(「BR」)クラスターから構成される核及び核小体局在シグナルを示す。これらのBRクラスターのうち4つの任意の組合せは、このタンパク質を核及び核小体に標的化する。
同様に、MAAPのC末端が、KKIR(BR1)、RRKR(BR2)、及びRNLLRRLREKRGR(BR3)の3つのBRクラスターを示すことが分かった。これらは、配列番号2において、それぞれ、残基78～82、94～97及び107～119で示される。したがって、我々は、MAAPタンパク質のC末端部分が、核局在化シグナルを含有しうると結論付けた。
野生型AAVに対するMAAPの効果
MAAPの不活性化及びAAV産生への影響
MAAPをコードする配列の様々な位置における、開始コドンの変異又は停止コドンの導入のいずれかによるMAAPの改変は、トランスフェクションの24時間後のAAV産生率の低下をもたらした。図3参照。このAAV産生率の低下は、MAAP-L1(CTG)をMAAP-R1(CGG)に変更させたときに統計的に有意であり、wt-AAV2で観察された産生率のわずか21%に低下した。MAAP-Q9の代わりに停止コドンを導入した場合、産生率は、wt-AAV2で観察された産生率のわずか39%に低下した。また、MAAP-W103又はMAAP-W105を停止コドンに変異させたAAV変異体について、(それぞれ)野生型の産生率の15%及び20%に低下することも観察された。MAAP-S33-39-S47、MAAP-S65に代えて停止コドンを導入すると、wt-AAV2と比較して、AAV力価の76%及び61%のレベルに減少する傾向が見られた。アミノ酸残基番号90、100、106又は110に代えて停止コドンを導入しても、野生型遺伝子で観察される結果と比べた差異に明確な傾向は得られなかった。図3参照。したがって、トランスフェクションの24時間後、MAAPタンパク質の発現は、MAAP遺伝子が不活性化されるAAV変異体と比較して複製的利点を提供する。我々の結果は、MAAP変異体が力価の低下を示さなかったことを観察したOgden(2019)とは異なる。ただし、Ogdenらは、MAAP変異体が、機能的MAAPポリペプチドによってトランスで補完されない限り、競合に勝っていたことを観察した。この結論は、トランスフェクションの24時間後で、MAAPがwt-AAV2に複製的利点を与えるという我々の観察結果と一致する。
MAAPの不活性化及びAAV産生への影響
MAAPをコードする配列の様々な位置における、開始コドンの変異又は停止コドンの導入のいずれかによるMAAPの改変は、トランスフェクションの24時間後のAAV産生率の低下をもたらした。図3参照。このAAV産生率の低下は、MAAP-L1(CTG)をMAAP-R1(CGG)に変更させたときに統計的に有意であり、wt-AAV2で観察された産生率のわずか21%に低下した。MAAP-Q9の代わりに停止コドンを導入した場合、産生率は、wt-AAV2で観察された産生率のわずか39%に低下した。また、MAAP-W103又はMAAP-W105を停止コドンに変異させたAAV変異体について、(それぞれ)野生型の産生率の15%及び20%に低下することも観察された。MAAP-S33-39-S47、MAAP-S65に代えて停止コドンを導入すると、wt-AAV2と比較して、AAV力価の76%及び61%のレベルに減少する傾向が見られた。アミノ酸残基番号90、100、106又は110に代えて停止コドンを導入しても、野生型遺伝子で観察される結果と比べた差異に明確な傾向は得られなかった。図3参照。したがって、トランスフェクションの24時間後、MAAPタンパク質の発現は、MAAP遺伝子が不活性化されるAAV変異体と比較して複製的利点を提供する。我々の結果は、MAAP変異体が力価の低下を示さなかったことを観察したOgden(2019)とは異なる。ただし、Ogdenらは、MAAP変異体が、機能的MAAPポリペプチドによってトランスで補完されない限り、競合に勝っていたことを観察した。この結論は、トランスフェクションの24時間後で、MAAPがwt-AAV2に複製的利点を与えるという我々の観察結果と一致する。
72時間の時点では、MAAP-W103及びMAAP-W105が停止コドンに置き換えられたMAAP変異体のみが、wt-AAV2と比較してそれぞれ0.75倍及び0.76倍の力価低下を示した。図4参照。しかしながら、驚くべきことに、他の全ての検討されたMAAP変異体について、AAV力価が低下するのではなく改善されたことが見出された。AAV力価のこの驚くべき増加は、MAAP-S33-S39-S47、MAAP-E90、MAAP-L100、MAAP-L106が停止コドンに置き換えられた変異体について有意であり、力価は、wt-AAV2と比較して、それぞれ、3.50倍、4.62倍、3.67倍、4.08倍増加した。したがって、産生時間(すなわち、トランスフェクトされた細胞を培養してウイルスを産生する時間)が24時間を超えて延長されると、MAAPタンパク質の不活性化は、野生型AAVよりも高いAAV力価をもたらす。
次に、我々は、wt-AAVの産生、又はMAAP-S33-S39-S47を停止コドンに変異させたAAV変異体に対する、MAAP過剰産生の効果を検討した。トランスフェクションの24時間後、追加のMAAPがwt-AAV2で発現されたとき、wt-AAV2と比較して、0.67倍のAAV力価低下が観察された。図5の左を参照。72時間の時点で、wt-AAV2と比較して0.36倍の低下が観察された。図6の右を参照。wt-AAV参照細胞に、MAAP発現プラスミドと同様のサイズのプラスミドを添加した場合(MAAP発現プラスミドの添加によって提供される追加のDNA質量を模倣するため)、wt-AAV2参照と比較して、24時間の時点で0.91倍の低下、72時間の時点で0.96倍の低下が観察された。
MAAP-S33-S39-S47を停止コドンに変異させたAAVを作製した場合、wt-AAV2と比較して、24時間の時点ではvg力価が1.66倍増加し、72時間の時点では5.89倍増加した。
MAAP-S33-S39-S47を停止コドンに変異させたAAVにMAAPを添加すると、wt-AAV2と比較して、24時間の時点で同様のvg力価となり、72時間の時点で1.22倍の増加となった。MAAP-S33-S39-S47を停止コドンに変異させて、MAAP発現プラスミドと同様のサイズのプラスミドで補完する場合、力価は、wt-AAV2参照に対して、24時間の時点で同等となり、72時間の時点では3.80倍高くなった。
まとめると、24時間を超える培養期間では、驚くべきことに、MAAPタンパク質の過剰発現がウイルスゲノム(vg)力価の低下をもたらすことが分かった。これは、MAAPが、他のAAVタンパク質、おそらくはAAP又はVPと比較して、化学量論量で必要であることを示唆している。
混入DNAのパッケージング
次に、AAVプロデューサープラスミドに由来する混入DNAの、AAVカプシドへのパッケージングに対するMAAPの効果を検討した。まず、ddPCRによって、AAVカプシド中にパッケージングされたカナマイシン耐性遺伝子のレベルを調べた。カナマイシン耐性遺伝子は、アデノウイルス血清型5型ヘルパープラスミド及びAAVゲノムをコードするプラスミドの両方に存在する。wt-AAV産生中、トランスフェクションの24時間後で、wt-AAV2ゲノムパッケージングと比較して、パッケージングされたカナマイシン耐性遺伝子混入が3.77%と測定され、72時間の時点では、このパーセンテージは3.50%となった。図7及び図8を参照のこと。
次に、AAVプロデューサープラスミドに由来する混入DNAの、AAVカプシドへのパッケージングに対するMAAPの効果を検討した。まず、ddPCRによって、AAVカプシド中にパッケージングされたカナマイシン耐性遺伝子のレベルを調べた。カナマイシン耐性遺伝子は、アデノウイルス血清型5型ヘルパープラスミド及びAAVゲノムをコードするプラスミドの両方に存在する。wt-AAV産生中、トランスフェクションの24時間後で、wt-AAV2ゲノムパッケージングと比較して、パッケージングされたカナマイシン耐性遺伝子混入が3.77%と測定され、72時間の時点では、このパーセンテージは3.50%となった。図7及び図8を参照のこと。
MAAP-L1 CTG開始コドンをCGGに改変した場合、又はMAAP-S39、MAAP-W103、MAAP-W105、及びMAAP-L106を停止コドンに改変した場合、カナマイシン遺伝子パッケージングのレベルは有意に増加し、24時間の時点で、それぞれ、wt-AAVと比較して10.31倍、4.92倍、8.78倍、10.70倍、及び4.03倍の増加となった。図7参照。これは、72時間の時点では、wt-AAVと比較して、10.63倍、5.83倍、10.55倍、13.46倍、及び4.65倍の増加となった。図8参照。MAAP-W105を停止コドンに改変した場合に最も高い混入レベルが観察され、WT-AAVと比較して13.46倍増加し、カナマイシン耐性遺伝子パッケージングはAAVゲノムと比較して47.12%であった。図8参照。
MAAP-S33-S39-S47を停止コドンに変異させたAAVであるMAAP-S65、MAAP-E90、MAAP-L100及びMAAP-L110は、24時間及び72時間の両方の時点で、wt-AAV2と比較して、より高いカナマイシンパッケージングの傾向を示した。
wt-AAV産生又はMAAP-S33-S39-S47を停止コドンに変異させたAAVにMAAPを補完的に添加すると、MAAPタンパク質発現を添加しないwt-AAVと比較して、カナマイシン耐性遺伝子パッケージングの増加が観察された。結果を図9及び図10に示す。
抗生物質耐性遺伝子混入が優先的にアデノウイルスヘルパープラスミドに由来するか又はwt-AAV2コードプラスミドに由来するかを調べるために、AAV産生に必要なアデノウイルス5ヘルパー機能をコードするプラスミドに存在するアデノウイルス5 E4遺伝子に由来する混入のレベルを測定した。MAAP-L1 CTG開始コドンをCGGに改変した場合、24時間の時点でアデノウイルス5 E4遺伝子パッケージングにおいてのみ6.37倍の統計的に有意な増加が観察された。図11参照。72時間の時点で、wt-AAV2と比較して、統計的に有意な差は検出されなかった。しかしながら、72時間の時点で、アデノウイルス5 E4遺伝子パッケージングの減少の傾向が観察され、特に、MAAP-S33-S39-S47に代えて停止コドンを導入した変異体、MAAP-S65、MAAP-E90、MAAP-L100又はMAAP-L110では、それぞれ0.43倍、0.32倍、0.53倍、0.31倍、0.44倍であった。図12参照。
結果は、MAAP発現が損なわれるとき、又はAAVゲノムをコードする同じプラスミド骨格に由来するときに、より高いレベルの混入DNAがAAVカプシドにパッケージングされることを示唆する。しかしながら、アデノウイルスヘルパープラスミドからパッケージングされたDNAは、wt-AAVと比較して、特に、MAAP-S33-S39-S47、MAAP-S65、MAAP-E90、MAAP-L100又はMAAP-L110を停止コドンに変異させた場合において、低下する。全体として、我々の結果は、MAAPが、AAVゲノム側に存在するがITRの骨格側には存在しないITR D配列とは独立して、ITR媒介DNAパッケージングに関与しうることを示す。
AAVカプシドに対するMAAPの影響
野生型AAVカプシドは、相対比が約1:1:10のVP1、VP2及びVP3タンパク質から構成される。しかしながら、これらのVPの特異的分解産物は、293細胞及び293T細胞において、トランスフェクションの21時間後から検出される。図2参照。例えば、AAV血清型2型において、VP-1、-2、及び-3は、それぞれ、約87kDa、73kDa、及び61kDaである。3つのVPのそれぞれのC末端に対してモノクローナル抗体を用いてVPの分解を検出した(抗体は、Wobus CEら、「Monoclonal Antibodies against the Adeno-Associated Virus Type 2 (AAV-2) Capsid: Epitope Mapping and Identification of Capsid Domains Involved in AAV-2-Cell Interaction and Neutralization of AAV-2 Infection」、74 J. Virol. 9281頁(2000)に記載されている)。これを用いて、トランスフェクション後21時間以内のVP1、VP2及びVP3の分解を観察した。これらは、図2において、32kDa(図2ダッシュ、図13、図14)、18kDa(図2アスタリスク、図13、図14)、及び14kDa(図2ハッシュ、図13、図14)に観察される。
野生型AAVカプシドは、相対比が約1:1:10のVP1、VP2及びVP3タンパク質から構成される。しかしながら、これらのVPの特異的分解産物は、293細胞及び293T細胞において、トランスフェクションの21時間後から検出される。図2参照。例えば、AAV血清型2型において、VP-1、-2、及び-3は、それぞれ、約87kDa、73kDa、及び61kDaである。3つのVPのそれぞれのC末端に対してモノクローナル抗体を用いてVPの分解を検出した(抗体は、Wobus CEら、「Monoclonal Antibodies against the Adeno-Associated Virus Type 2 (AAV-2) Capsid: Epitope Mapping and Identification of Capsid Domains Involved in AAV-2-Cell Interaction and Neutralization of AAV-2 Infection」、74 J. Virol. 9281頁(2000)に記載されている)。これを用いて、トランスフェクション後21時間以内のVP1、VP2及びVP3の分解を観察した。これらは、図2において、32kDa(図2ダッシュ、図13、図14)、18kDa(図2アスタリスク、図13、図14)、及び14kDa(図2ハッシュ、図13、図14)に観察される。
興味深いことに、MAAP-L110から停止への変異体を除いて、MAAP発現が不活性化された全ての構築物について、32kDa、18kDa、及び14kDaの3つのポリペプチドの消失が観察された(図13、図14)。VP1タンパク質及びVP2タンパク質の量の増加も観察された。このことは、分解生成物が、正確にはVP1及びVP2の分解に由来することを示唆している(図13、図14)。ただし、MAAP-L110を停止コドンに変異させたバリアントは依然として特異的な18kDaのAAVカプシド分解生成物を示したが、wt-AAV2と比較して強度は低かった。これは、MAAPが発現されたときに観察される特定のタンパク質分解活性が、そのC末端部分、より具体的には塩基性アミノ酸リッチ「BR3」ドメイン(配列番号2のアミノ酸残基107～119)と関連しており、BR3ドメインを依然としてコードしている、MAAP-L110から停止への変異体のみが、VPタンパク質分解断片を示したことを示唆する。MAAP-S33-S39-S47が停止コドンに置き換えられたAAV変異体に補完的にMAAPが発現されると、AAVカプシドに対するタンパク質分解活性が回復した。これらのデータは、タンパク質分解ドメインを排除するためにMAAP欠失又はMAAP切断されたゲノムから作製されるウイルス調製物が、野生型ゲノムから作製されるウイルスと物理的に異なることを示す。したがって、ここでの我々の知見は、AAVの収率と、得られるAAVの安定性との両方を増加させる方法を提供する。
空のカプシド(所望のDNAを欠く)対完全カプシド(所望のDNAを保有する)の比率を導出するために、72時間での総AAVカプシドに対するAAVゲノム含有カプシドの比率を分析した。野生型AAV2は、6.91%のAAVゲノム含有カプシドを示した。
MAAP-L1 CTG開始コドンをCGGに改変した場合、又はAAV MAAP-Q9、MAAP-S39、MAAP-W103若しくはMAAP-W105を停止コドンに置き換えた場合、ゲノムを含有するカプシドの減少が観察された。ほぼ全長のMAAPをコードする、AAV MAAP-L106又はMAAP-L110の停止への変異体は、wt-AAV2と比較して、AAVゲノムを含有するAAVカプシドのレベルが同様であった。AAV MAAP-S33-S39-S47を停止に置き換えた場合、又はMAAP-S65、MAAP-E90及びMAAP-L100を停止コドンに変異させた場合、wt-AAV2と比較して、AAVゲノムを含有するカプシドの増加が観察された。より詳細なデータを図15にプロットする。
結論
MAAPの発現は、感染の24時間後のウイルスの複製を改善する。しかしながら、より長い感染時間では、驚くべきことに、MAAP発現がウイルス複製を低下させることが見出された。我々は、24時間を超える感染期間において、野生型MAAP発現を不活性化することが、野生型ゲノムを使用した産生よりも高いウイルス収率をもたらすことを実証した。
MAAPの発現は、感染の24時間後のウイルスの複製を改善する。しかしながら、より長い感染時間では、驚くべきことに、MAAP発現がウイルス複製を低下させることが見出された。我々は、24時間を超える感染期間において、野生型MAAP発現を不活性化することが、野生型ゲノムを使用した産生よりも高いウイルス収率をもたらすことを実証した。
我々はまた、驚くべきことに、MAAPが、ウイルスカプシドタンパク質の分解に影響を与えるようであることを見出した。MAAPは、直接的なタンパク質分解活性を有しうる。或いは、MAAPは、別のタンパク質、又はウイルス若しくは宿主細胞の細胞ゲノムと相互作用して、ウイルスカプシドタンパク質の分解を阻害しうる。或いは、MAAPは、AAVカプシドタンパク質に対する細胞のタンパク質分解又はタンパク質分解活性に影響を及ぼしうる。
我々は、MAAPを除去するか又はそのC末端を切断することが、野生型ゲノムから作製されるウイルスよりも収率が高く、分解に対する抵抗性が高いウイルス調製物を生成することを実証した。
また、MAAPの発現を損なうと、完全ビリオンのパーセンテージが増加することも分かった。したがって、我々は、製造されたウイルスの質を向上させる方法を提供する。これは、ヒト遺伝子治療のベクターの製造において極めて重要である。
我々は、野生型MAAP発現を不活性化することにより、標的細胞により良く形質導入することができるウイルスが産生されると予測する。
本明細書での開示を考慮して、当業者は容易に特定の改変を行いうる。例えば、我々は、基となるDNAに点突然変異を挿入することによって、全長MAAPの翻訳を短縮する。当業者は、例えば、MAAP発現を妨害する干渉RNAをコードするプラスミドをプロデューサー細胞に共トランスフェクトすることにより、同じ目的を達成しうる。或いは、当業者は、MAAPへと方向付けられたモノクローナル抗体でプロデューサー細胞を処理しうる。そのようなアプローチは、おそらくより費用がかかるが、ウイルスゲノムを点突然変異させるのと同じ目的を達成する。したがって、我々の特許の法的範囲は、我々の様々な事例によって定義されるのではなく、添付の法的に正当な特許請求の範囲によって定義されることを意図する。
(実施例2)
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、当初、アデノウイルス産生1の混入物質として発見された。AAV血清型2型は参照モデルと見なされており、二十面体カプシド中にパッケージされた4679塩基のssDNAゲノムをコードする。AAV2ゲノムには、ヘアピン構造のGCリッチDNA領域である逆位末端反復(ITR)が隣接している。ITRは、AAVの大きなRepタンパク質によって認識され、AAVゲノム複製を可能にするだけでなく、部位特異的な方法で宿主染色体DNAに組み込まれる。小さなRepタンパク質は、ゲノムパッケージングに必要である。カプシドは、集団レベルでは約1:1:10の比のVP1、VP2、及びVP3タンパク質で構成され、カプシドあたり合計60個のVPを有する。カプシドのアセンブリ及びVPの核への輸送は、同じくカプシド遺伝子にコードされているがVPとは異なるリーディングフレームにある、アセンブリ活性化タンパク質(AAP)によって媒介される。膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)は、VP1/2独自ドメインもコードする領域内のcap遺伝子上にコードされ、細胞2及び核膜と結合している(実施例1)。MAAPは、wt-AAV2複製を加速する。しかしながら、切断されたC末端MAAPバリアントは、アデノヘルパープラスミドを使用したプラスミドに基づくトランスフェクション産生におけるAAV2産生を増強した。実施例1の結果に基づき、組換え(r)AAV産生に対して有望な関心が持たれる2つのAAV2 MAAPバリアント、つまり、MAAP-S33-S39-S47の停止コドンへの変異体(三重停止変異体とも称する)、及び、MAAP-L100の停止コドンへの変異体を保持した。どちらの変異体も、VP1/2タンパク質配列に影響を及ぼさない。同様のMAAP変異体を、VP1/2アミノ酸配列を改変することなく、組換えAAV血清型1型、2型、5型、6型、8型及び9型をコードするcap遺伝子を用いて作製した。293T細胞株において、ウイルスゲノム(vg)収率は、rAAV5を除く全てのrAAV血清型、特にMAAP-L/S100バリアントをコードするcap遺伝子について改善された。これらの実験では、rAAV6について、最も劇的な産生増加が観察された。MAAPタンパク質の改変はまた、一部のrAAVの分泌プロファイルも変化させ、細胞培養培地中に存在するrAAV6及び8が、細胞内に本質的に維持された。数種のAAV血清型3のMAAPのDNA配列及びタンパク質配列は、ほぼ全てのAAV cap遺伝子が、それらのVP1タンパク質配列に影響を及ぼすことなく、MAAP-S33-S39-S47及びMAAP-L/S-100変異を実施しうることを示した。MAAPの系統発生樹の構築により、AAV血清型の特定の性質に関連付けられうるAAVの2つの主要なクレードが示される。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、当初、アデノウイルス産生1の混入物質として発見された。AAV血清型2型は参照モデルと見なされており、二十面体カプシド中にパッケージされた4679塩基のssDNAゲノムをコードする。AAV2ゲノムには、ヘアピン構造のGCリッチDNA領域である逆位末端反復(ITR)が隣接している。ITRは、AAVの大きなRepタンパク質によって認識され、AAVゲノム複製を可能にするだけでなく、部位特異的な方法で宿主染色体DNAに組み込まれる。小さなRepタンパク質は、ゲノムパッケージングに必要である。カプシドは、集団レベルでは約1:1:10の比のVP1、VP2、及びVP3タンパク質で構成され、カプシドあたり合計60個のVPを有する。カプシドのアセンブリ及びVPの核への輸送は、同じくカプシド遺伝子にコードされているがVPとは異なるリーディングフレームにある、アセンブリ活性化タンパク質(AAP)によって媒介される。膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)は、VP1/2独自ドメインもコードする領域内のcap遺伝子上にコードされ、細胞2及び核膜と結合している(実施例1)。MAAPは、wt-AAV2複製を加速する。しかしながら、切断されたC末端MAAPバリアントは、アデノヘルパープラスミドを使用したプラスミドに基づくトランスフェクション産生におけるAAV2産生を増強した。実施例1の結果に基づき、組換え(r)AAV産生に対して有望な関心が持たれる2つのAAV2 MAAPバリアント、つまり、MAAP-S33-S39-S47の停止コドンへの変異体(三重停止変異体とも称する)、及び、MAAP-L100の停止コドンへの変異体を保持した。どちらの変異体も、VP1/2タンパク質配列に影響を及ぼさない。同様のMAAP変異体を、VP1/2アミノ酸配列を改変することなく、組換えAAV血清型1型、2型、5型、6型、8型及び9型をコードするcap遺伝子を用いて作製した。293T細胞株において、ウイルスゲノム(vg)収率は、rAAV5を除く全てのrAAV血清型、特にMAAP-L/S100バリアントをコードするcap遺伝子について改善された。これらの実験では、rAAV6について、最も劇的な産生増加が観察された。MAAPタンパク質の改変はまた、一部のrAAVの分泌プロファイルも変化させ、細胞培養培地中に存在するrAAV6及び8が、細胞内に本質的に維持された。数種のAAV血清型3のMAAPのDNA配列及びタンパク質配列は、ほぼ全てのAAV cap遺伝子が、それらのVP1タンパク質配列に影響を及ぼすことなく、MAAP-S33-S39-S47及びMAAP-L/S-100変異を実施しうることを示した。MAAPの系統発生樹の構築により、AAV血清型の特定の性質に関連付けられうるAAVの2つの主要なクレードが示される。
材料及び方法
ウイルス製剤
rAAVを実施例1に記載されるように構築した。rAAVベクターを以下のように調製した。293T細胞(European Collection of Cell Cultures 293 T Number:12022001)を、2mMのL-グルタミン(Gibco社、25030-024)及びペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco社 15070-063)を補足し、10%ウシ胎児血清(FBS、Thermo Fisher社 10091-148)を補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco社、11965084)中で増殖させた。rep-capプラスミド、mSeAP-ITRプラスミド及びアデノウイルスヘルパープラスミド(1:1:1比、合計261ng/cm2)のポリエチレンイミン(PEI)トランスフェクションを、6ウェルプレート中の293T細胞(341000細胞/ウェル)に対して行った。或いは、Plasmid Factory社のpDG2、pDP6、pDP5rs及びpDP8プラスミドを、mSeAP-ITRプラスミド(1:1比、合計261ng/cm2)と組み合わせて使用した。PEI Pro(Polyplus Transfection社、参照番号115-100)/DNA重量比を、無血清DMEM培地中で1:1に維持した。トランスフェクションの24時間後に無血清培地を交換した。トランスフェクションの72時間後にrAAVを収集した。ウイルスゲノム力価決定及びrAAVカプシドELISA試料のため、Triton-X-100緩衝液(1xPBS(Gibco社、参照番号18912-014)中0.5%Triton-X-100(Sigma-Aldrich社、参照番号X100-1L)及び2mM MgCl2(Merck社、参照番号E13980))並びにデナラーゼ(50U/ml、c-Lecta社、参照番号20804-5M)を使用して、rAAVを収集した。溶解緩衝液を培地に加え、細胞を37℃で2時間インキュベーションした後、細胞溶解物を収集した。
ウイルス製剤
rAAVを実施例1に記載されるように構築した。rAAVベクターを以下のように調製した。293T細胞(European Collection of Cell Cultures 293 T Number:12022001)を、2mMのL-グルタミン(Gibco社、25030-024)及びペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco社 15070-063)を補足し、10%ウシ胎児血清(FBS、Thermo Fisher社 10091-148)を補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco社、11965084)中で増殖させた。rep-capプラスミド、mSeAP-ITRプラスミド及びアデノウイルスヘルパープラスミド(1:1:1比、合計261ng/cm2)のポリエチレンイミン(PEI)トランスフェクションを、6ウェルプレート中の293T細胞(341000細胞/ウェル)に対して行った。或いは、Plasmid Factory社のpDG2、pDP6、pDP5rs及びpDP8プラスミドを、mSeAP-ITRプラスミド(1:1比、合計261ng/cm2)と組み合わせて使用した。PEI Pro(Polyplus Transfection社、参照番号115-100)/DNA重量比を、無血清DMEM培地中で1:1に維持した。トランスフェクションの24時間後に無血清培地を交換した。トランスフェクションの72時間後にrAAVを収集した。ウイルスゲノム力価決定及びrAAVカプシドELISA試料のため、Triton-X-100緩衝液(1xPBS(Gibco社、参照番号18912-014)中0.5%Triton-X-100(Sigma-Aldrich社、参照番号X100-1L)及び2mM MgCl2(Merck社、参照番号E13980))並びにデナラーゼ(50U/ml、c-Lecta社、参照番号20804-5M)を使用して、rAAVを収集した。溶解緩衝液を培地に加え、細胞を37℃で2時間インキュベーションした後、細胞溶解物を収集した。
液滴デジタルPCRによるrAAVゲノムの定量
液滴デジタル PCR(ddPCR)AAV vg力価を得るために、ウイルスの粗製調製物を、DNaseI(0,01U/μl、Invitrogen社、参照番号18047-019)及びプロテイナーゼK(0,1μg/μl、Roche社、参照番号03115879001)で処理し、プライマー(CMV-FWD[5'-CATGACCTTATGGGACTTTCCT]、CMV-REV[5'-CTATCCACGCCCATTGATGTA])、及びmSeAP発現カセットを駆動するCMVプロモーターを検出するプローブ(CMV-PRB [5'-6-FAM/TCGCACCTG/ZEN/ATTGCCCGACATTAT/IABkFQ)を用いたddPCR増幅(QX200、Bio-Rad社)によってウイルス力価を得た。全てのプライマー及びプローブは、Integreted DNA Technologies社から取り寄せた。マスターミックス生成のために、プライマー(900nM)及びプローブ(250nM)を、プローブ用2x ddPCR Supermix(dUTPなし、BioRad社、参照番号1863025)及びヌクレアーゼフリー水(Thermo Scientific社、参照番号R0582)中で希釈した。
液滴デジタル PCR(ddPCR)AAV vg力価を得るために、ウイルスの粗製調製物を、DNaseI(0,01U/μl、Invitrogen社、参照番号18047-019)及びプロテイナーゼK(0,1μg/μl、Roche社、参照番号03115879001)で処理し、プライマー(CMV-FWD[5'-CATGACCTTATGGGACTTTCCT]、CMV-REV[5'-CTATCCACGCCCATTGATGTA])、及びmSeAP発現カセットを駆動するCMVプロモーターを検出するプローブ(CMV-PRB [5'-6-FAM/TCGCACCTG/ZEN/ATTGCCCGACATTAT/IABkFQ)を用いたddPCR増幅(QX200、Bio-Rad社)によってウイルス力価を得た。全てのプライマー及びプローブは、Integreted DNA Technologies社から取り寄せた。マスターミックス生成のために、プライマー(900nM)及びプローブ(250nM)を、プローブ用2x ddPCR Supermix(dUTPなし、BioRad社、参照番号1863025)及びヌクレアーゼフリー水(Thermo Scientific社、参照番号R0582)中で希釈した。
ELISA
AAVカプシド由来のrAAVゲノムを含有するカプシドの比率を決定するために、最初に、製造者の指示に従ってAAV滴定ELISAキットを使用して、ウイルス調製物の500～10,000の連続希釈物に対してカプシドELISAを行った。rAAV2についてはProgen社 PRAT、rAAV5についてはProgen社 PRAAV5、rAAV6についてはProgen社 PRAAV6、rAAV8についてはProgen社 PRAAV8。次いで、関心対象のゲノムを含有するカプシド対総カプシドの比率を、rAAV vg力価をカプシド力価で割ることによって計算し、パーセンテージとして表した。
AAVカプシド由来のrAAVゲノムを含有するカプシドの比率を決定するために、最初に、製造者の指示に従ってAAV滴定ELISAキットを使用して、ウイルス調製物の500～10,000の連続希釈物に対してカプシドELISAを行った。rAAV2についてはProgen社 PRAT、rAAV5についてはProgen社 PRAAV5、rAAV6についてはProgen社 PRAAV6、rAAV8についてはProgen社 PRAAV8。次いで、関心対象のゲノムを含有するカプシド対総カプシドの比率を、rAAV vg力価をカプシド力価で割ることによって計算し、パーセンテージとして表した。
統計解析
統計解析を、GraphPadソフトウェア(Prism)を使用して行った。図のバーの上に示される有意値は、****(p<0.0001)、***(p<0.001)、**(p<0.01)、*(p<0.05)、又はns(有意ではない)として表される。
統計解析を、GraphPadソフトウェア(Prism)を使用して行った。図のバーの上に示される有意値は、****(p<0.0001)、***(p<0.001)、**(p<0.01)、*(p<0.05)、又はns(有意ではない)として表される。
系統発生解析
GAO及び共同研究者3によって当初使用されていた受託番号AY530553～AY530629のcap遺伝子配列を、MAAP ORFに対してアノテートした。MAAP ORF中に見出されるCTGコドンを、2に見出されるようなMAAPタンパク質の翻訳及びwt-AAV2(本特許出願の実施例1)のために使用する開始コドンとして使用した。アラインメント及び系統発生再構築を、GenomeNet(https://www.genome.jp/tools/ete/)で行われているようなETE3 v3.1.16の「build」機能を使用して行った。アラインメントは、MAFFT v6.861bを使用して、デフォルトオプション7又はMultalin4を用いて行った。系統発生樹は、FastTree v2.1.8を使用してデフォルトのパラメータ8で構築した。iTOL9を用いてグラフィック表示を行った。
GAO及び共同研究者3によって当初使用されていた受託番号AY530553～AY530629のcap遺伝子配列を、MAAP ORFに対してアノテートした。MAAP ORF中に見出されるCTGコドンを、2に見出されるようなMAAPタンパク質の翻訳及びwt-AAV2(本特許出願の実施例1)のために使用する開始コドンとして使用した。アラインメント及び系統発生再構築を、GenomeNet(https://www.genome.jp/tools/ete/)で行われているようなETE3 v3.1.16の「build」機能を使用して行った。アラインメントは、MAFFT v6.861bを使用して、デフォルトオプション7又はMultalin4を用いて行った。系統発生樹は、FastTree v2.1.8を使用してデフォルトのパラメータ8で構築した。iTOL9を用いてグラフィック表示を行った。
結果
MAAPバリアントは、rAAV産生率を向上させる。
mSeAP遺伝子をコードする血清型1型、2型、5型、6型、8型及び9型のrAAVを作製した。cap遺伝子は、それぞれの血清型の野生型(wt)-MAAPか、又はcap遺伝子においてrAAV1、2、6、8及び9について停止に変異したMAAP-S33-S39-S47(AAV5についてMAAP-S59-65-71に相当)をコードした。これらのMAAP変異体は、本明細書においてMAAP三重停止と称する。最後に、MAAP-L100から停止へのバリアントを使用したrAAV2及び9、並びにMAAP-S100から停止へのバリアントを使用したrAAV1、6及び8を作製した。これらのバリアントは本文中でMAAP-L/S-100としばしば称する。MAAP三重停止及びMAAP-L/S-100バリアントを得るためにcap遺伝子に導入された変異は、VP1/2タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさなかった。したがって、本研究において検討した全てのAAV血清型について、VPのアミノ酸配列を改変することなく、MAAP三重停止の変異を導入すること、つまり、MAAP配列におけるS33-S39-S47をコードするコドンに代えて停止コドンを導入すること(AAV5について、これらの変異体はS59-65-71に相当)が可能である。同様に、全てのAAV血清型は、VPアミノ酸配列を改変することなく、停止コドンに変異させたMAAP-L/S-100を有することが可能である。AAV5の場合、同等の変異がMAAP-S123に見られる。AAV hu.28の場合は、MAAP-W100に相当する。
MAAPバリアントは、rAAV産生率を向上させる。
mSeAP遺伝子をコードする血清型1型、2型、5型、6型、8型及び9型のrAAVを作製した。cap遺伝子は、それぞれの血清型の野生型(wt)-MAAPか、又はcap遺伝子においてrAAV1、2、6、8及び9について停止に変異したMAAP-S33-S39-S47(AAV5についてMAAP-S59-65-71に相当)をコードした。これらのMAAP変異体は、本明細書においてMAAP三重停止と称する。最後に、MAAP-L100から停止へのバリアントを使用したrAAV2及び9、並びにMAAP-S100から停止へのバリアントを使用したrAAV1、6及び8を作製した。これらのバリアントは本文中でMAAP-L/S-100としばしば称する。MAAP三重停止及びMAAP-L/S-100バリアントを得るためにcap遺伝子に導入された変異は、VP1/2タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさなかった。したがって、本研究において検討した全てのAAV血清型について、VPのアミノ酸配列を改変することなく、MAAP三重停止の変異を導入すること、つまり、MAAP配列におけるS33-S39-S47をコードするコドンに代えて停止コドンを導入すること(AAV5について、これらの変異体はS59-65-71に相当)が可能である。同様に、全てのAAV血清型は、VPアミノ酸配列を改変することなく、停止コドンに変異させたMAAP-L/S-100を有することが可能である。AAV5の場合、同等の変異がMAAP-S123に見られる。AAV hu.28の場合は、MAAP-W100に相当する。
mSeAPをコードする三重停止rAAV1は、ウイルスゲノム力価(vg)がwt-MAAPの6.02倍に増加し、MAAP-S100バリアントは、7.47倍に増加した(図16及びTable 18(表18))。rAAV2-mSEAPについて、MAAP三重停止は、ウイルスゲノム力価(vg)がwt-MAAPの2.30倍に増加し、MAAP-L100バリアントは、wt-MAAPの3.41増加した(図16及びTable 18(表18))。rAAV6-mSeAPについては、それぞれ6.51倍及び8.20倍であり、AAV8-mSeAPについては、3.60倍及び2.49倍の増加が得られた。AAV9について、バリアントMAAP-S33-S39-S47及びMAAP-L100は、それぞれ、vg力価でwt-MAAP配列の1.21倍及び1.87倍に増加した。rAAV5-mSeAPの場合、同じ改変はvg力価に影響を及ぼさなかった。結論として、MAAP三重停止及びMAAP-L/S-100バリアントをwt-MAAPにわたって使用したときに、rAAV5を除くrAAV1、2、6、8及び9について、rAAV産生率の全体的な増加が観察された。
MAAPバリアントがrAAVゲノムパッケージングに及ぼす影響
我々はまた、全カプシド(完全ウイルス)に対する、目的の導入遺伝子を含有するカプシドのパーセンテージについての上記のMAAP変異の役割も調べ、血清型2型、5型、8型ウイルスをコードする変異体とwt-MAAPとの間で有意差を見出さなかった(図17及びTable 19(表19))。しかしながら、rAAV6は、MAAPバリアントを使用した場合、完全ウイルスのレベルの増加を示した(図17及びTable 19(表19))。wt-MAAPをコードするcap6遺伝子を用いた場合、rAAVゲノムを含有するカプシドは平均67.3%測定され、MAAP-S33-S39-S47バリアント及びMAAP-S100バリアントをコードするcap6遺伝子の場合、それぞれ95.9%及び118.4%測定された。
我々はまた、全カプシド(完全ウイルス)に対する、目的の導入遺伝子を含有するカプシドのパーセンテージについての上記のMAAP変異の役割も調べ、血清型2型、5型、8型ウイルスをコードする変異体とwt-MAAPとの間で有意差を見出さなかった(図17及びTable 19(表19))。しかしながら、rAAV6は、MAAPバリアントを使用した場合、完全ウイルスのレベルの増加を示した(図17及びTable 19(表19))。wt-MAAPをコードするcap6遺伝子を用いた場合、rAAVゲノムを含有するカプシドは平均67.3%測定され、MAAP-S33-S39-S47バリアント及びMAAP-S100バリアントをコードするcap6遺伝子の場合、それぞれ95.9%及び118.4%測定された。
MAAPバリアントはrAAVの排出に影響を与える
次に、異なるrAAV血清型が細胞培養培地にどのように排出されるかを研究し、MAAP三重停止バリアント及びMAAP-L/S100バリアントの両方が、細胞内rAAVと比較して、細胞培地中のrAAV量の顕著な減少をもたらすことを観察した(図18及びTable 20(表20))。rAAV1及び6については、収集前の細胞培養培地中で見られるベクターの割合はそれぞれ84.51%及び49.14%であった。この細胞培養培地中で見られるベクターの割合は、血清型1型について、MAAP三重停止では10.45%、MAAP-S100バリアントでは8.31%に低下し、AAV6の場合についてはそれぞれ7.15%及び5.49%に低下した。rAAV8についても同様の結果が得られ、wt-MAAPでは細胞培養培地中のrAAV8は60.38%となったが、細胞培養物中に存在する組換えAAVについて三重停止バリアントでは11.33%及びMAAP-S100では7.55%となった。培養培地中の改変rAAV2及び5についても割合の有意な低下が観察された。
次に、異なるrAAV血清型が細胞培養培地にどのように排出されるかを研究し、MAAP三重停止バリアント及びMAAP-L/S100バリアントの両方が、細胞内rAAVと比較して、細胞培地中のrAAV量の顕著な減少をもたらすことを観察した(図18及びTable 20(表20))。rAAV1及び6については、収集前の細胞培養培地中で見られるベクターの割合はそれぞれ84.51%及び49.14%であった。この細胞培養培地中で見られるベクターの割合は、血清型1型について、MAAP三重停止では10.45%、MAAP-S100バリアントでは8.31%に低下し、AAV6の場合についてはそれぞれ7.15%及び5.49%に低下した。rAAV8についても同様の結果が得られ、wt-MAAPでは細胞培養培地中のrAAV8は60.38%となったが、細胞培養物中に存在する組換えAAVについて三重停止バリアントでは11.33%及びMAAP-S100では7.55%となった。培養培地中の改変rAAV2及び5についても割合の有意な低下が観察された。
AAV血清型にわたるMAAPの系統発生解析
ヒト及び非ヒト霊長類起源の87種のAAV血清型から、MAAP系統発生樹を構築した(図19)。MAAP配列を、VP1タンパク質配列3に基づいて以前に定義されたAAVの異なるクレードのcap遺伝子から入手した。
ヒト及び非ヒト霊長類起源の87種のAAV血清型から、MAAP系統発生樹を構築した(図19)。MAAP配列を、VP1タンパク質配列3に基づいて以前に定義されたAAVの異なるクレードのcap遺伝子から入手した。
主要な分岐により、AAVは2つの異なる大グループに分割され、更にAAV5によって表される小分岐がある。クレードAは、AAV1、3、4、6、8、9、10、及び全ての非ヒト霊長類AAVによって表される。クレードBは、AAV2及びヒトから単離されたAAV血清型によって表される。AAV5は、単独で別個の小分岐を形成する。興味深いことに、MAAPクレードAのメンバーであるAAV1、6、8及び9は、細胞培養培地中で見出される産生AAVの少なくとも40%によって特徴付けられた。対照的に、クレードBのメンバーであるAAV2は、AAV系統発生MAAP樹の主な別個の小分岐のAAV5の場合のように、細胞培養培地中で見出される組換えAAVゲノム含有カプシドの20%未満であった。したがって、クレードAのAAVは、クレードB及びAAV5のメンバーと比較して、分泌が多いようである。ただし、この最初の結果を確認するためには、クレードBのより多くのメンバーを検討する更なる研究が必要である。
MAAPバリアントをrAAV産生において使用した場合、MAAPクレードA及びBの検討された全てのメンバーがより高いvg力価を示し、AAV5が唯一の例外であった。MAAP-S59-S65-S71バリアントを使用した場合、より高いvg力価は観察されなかった。AAV5 MAAPは、クレードA及びBの多くのAAVメンバーと比較して、他のメンバーを含まない別個の独自のクレードを形成するので、MAAP-S59-S65-S71変異体は異なる生物学的活性を有する可能性がある。しかしながら、最も多様なMAAPを有するため、その改変部位のより徹底的な特性決定により、産生率の向上につながる可能性が依然としてある。
興味深いことに、AAV5 MAAPを除いて、他の全てのMAAPタンパク質が、AAV hu.57を除いて、アラインメントにおけるいかなるギャップも無しにアラインメントする。MAAP配列の開始時に1つのヒスチジンが欠如している(支持ファイルMAAPタンパク質アラインメント)。結果から、AAVファミリー全体にわたってMAAPが高度に保存されていることが示される。アラインメントは、メンバーが高度に関連したタンパク質配列を有している主要なMAAPクレードのA及びBを強調している。我々は、MAAP変異体が、元のVP1アミノ酸配列を改変することなく、他のAAV血清型に転置できるかどうかも解析した。図19に示される検討した全ての血清型について、MAAPクレードBに属するAAV血清型hu.15及びhu.16のcap遺伝子を除き、VP1アミノ酸配列に干渉することなく、MAAP三重停止変異を行うことができた。
Table 18(表18)は、72hptで産生されたrAAVの平均vg.mL1力価、同じカプシド血清型内でのwt-MAAP及びMAAPバリアントで作製されるrAAVに対する倍率差、並びに試験で評価した各実験の複製物(N)を示す。試料は、左から右へ、次の通りである:試料は、左から右へ、次の通りである:rAAV1-mSeAP: 3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47、及びMAAP-S100をコードするRep2-Cap1プラスミドを使用して作製。rAAV2-mSeAP: pDG2(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47、及びMAAP-L100をコードするRep2-Cap2プラスミドを使用して作製。rAAV6-mSeAP: pDP6(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47、及びMAAP-S100をコードするRep2-Cap6プラスミドを使用して作製。rAAV5-mSeAP: pDP5rs(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP及びMAAP-S59-S65-S71をコードするRep2-Cap5プラスミドを使用して作製。rAAV8-mSeAP: pDP8.ape(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47、及びMAAP-S100をコードするRep2-Cap8プラスミドを使用して作製。rAAV9-mSeAP: 3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47及びMAAP-L100をコードするRep2-Cap9プラスミドを使用して作製。
Table 19(表19)は、72hptで産生された各ウイルスについて測定したrAAVゲノム含有カプシドの平均、同じカプシド血清型であるがwt-MAAP又はMAAPバリアントをコードするrAAVに対する倍率差、並びに試験で評価した技術的複製物の量(N)を示す。試料は、左から右へ、次の通りである: rAAV2-mSeAP: pDG2(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47、及びMAAP-L100をコードするRep2-Cap2プラスミドを使用して作製。rAAV6-mSeAP: pDP6(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47、及びMAAP-S100をコードするRep2-Cap6プラスミドを使用して作製。rAAV5-mSeAP: pDP5rs(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP及びMAAP-S59-S65-S71をコードするRep2-Cap5プラスミドを使用して作製。rAAV8-mSeAP: pDP8.ape(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47をコードするRep2-Cap8プラスミドを使用して作製。
Table 20(表20)は、72hptで産生された各ウイルスについて測定した、分泌されたrAAV粒子の平均パーセンテージ、同じ血清型であるがwt-MAAP又はMAAPバリアントを用いて産生されるrAAVに対する倍率差、並びに試験で評価された技術的複製物(N)の量を示す。試料は、左から右へ、次の通りである:rAAV1-mSeAP: 3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47、及びMAAP-S100をコードするRep2-Cap1プラスミドを使用して作製。rAAV2-mSeAP: pDG2(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47を使用して作製。rAAV5-mSeAP: pDP5rs(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP及びMAAP-S59-S65-S71をコードするRep2-Cap5プラスミドを使用して作製。rAAV6-mSeAP: pDP6(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47、及びMAAP-S100をコードするRep2-Cap6プラスミドを使用して作製。rAAV8-mSeAP: pDP8.ape(Plasmid Factory社)、3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47及びMAAP-S100をコードするRep2-Cap8プラスミドを使用して作製。rAAV9-mSeAP: 3-プラスミドシステムを用いて、wt-MAAP、MAAP-S33-S39-S47及びMAAP-L100をコードするRep2-Cap9プラスミドを使用して作製。
結論
遺伝子治療は、典型的には、高用量のベクターを必要とする。この研究で、我々は、AAVのrAAV産生率を向上させる2つのMAAPバリアントの使用を提示する。より高いレベルのrAAVゲノム含有カプシドに基づいて、少なくともrAAV6について品質が改善され、これにより、rAAVベクターの製造能力を向上させることができる。rAAVの産生率及び品質を向上させるためのMAAPバリアントの使用における1つの主要な関心は、これらの変異が、VPアミノ酸配列及びrAAVカプシド特性を改変することなく、cap遺伝子内で実行されうることである。
遺伝子治療は、典型的には、高用量のベクターを必要とする。この研究で、我々は、AAVのrAAV産生率を向上させる2つのMAAPバリアントの使用を提示する。より高いレベルのrAAVゲノム含有カプシドに基づいて、少なくともrAAV6について品質が改善され、これにより、rAAVベクターの製造能力を向上させることができる。rAAVの産生率及び品質を向上させるためのMAAPバリアントの使用における1つの主要な関心は、これらの変異が、VPアミノ酸配列及びrAAVカプシド特性を改変することなく、cap遺伝子内で実行されうることである。
実施例1に基づいて、2つのMAAPバリアントが、ウイルスの産生のための特に望ましい特性を提示することが観察された。VPアミノ酸配列を変化させることなく、MAAP-L100又はMAAP-S33-S39-S47の位置で、MAAP ORF中に早期停止コドンを導入することにより、全カプシドと比較して、カプシド分解の低減、AAV2産生率の向上、及びwt-AAV2ゲノム含有カプシドの比率向上がもたらされた。我々は、これら2つの特定の変異体に焦点を当てたが、他の数種の変異体も同様のAAV2の産生率及び品質の向上をもたらし、所望の場合、ほぼ全てのAAV血清型について、VP1アミノ酸配列を改変することなく、rAAVベクター産生を実行しうる。
この実施例は、rAAV1、2、5、6、8、及び9に焦点を当て、血清型5型を除いてそれらの全てについて、MAAP変異体は、血清型の産生率を向上させた。AAV血清型がMAAP系統発生に基づいて分類される場合、AAV5は、AAV5自身の小分岐の固有の代表として分離される。AAV1、6、8及び9は、非ヒト霊長類AAVを含むクレードAにグループ分けされ、クレードBのグループは、AAV2及びヒト試料から同定された他の血清型を含む。したがって、MAAPがクレードA及びBのメンバーとして分類されるAAV血清型は、MAAPバリアントがcap遺伝子に導入される場合、より高い力価の産生率レベルを示すであろう。MAAPバリアントを使用してrAAVを産生する場合、産生率の最大レベルが1012vg.mL-1の範囲に到達可能になることに加えて、MAAPバリアントを使用する場合の別の興味深い特性は、細胞培養培地又は細胞内のrAAVの分布プロファイルの改変である。異なるrAAV血清型を作製するために使用される全てのMAAPバリアントについて、我々は、rAAVがほぼ排他的に細胞内に残っていることを観察した。MAAPバリアントのこの特性は、AAVの製造及び精製に適用しうる。実際、AAVは、所望であれば、細胞と細胞培養培地との組合せからではなく、細胞のみから収集することができる。rAAVの精製のために細胞のみを処理することは、処理される体積が少なくなるため、製造(精製)コストの低下に関わる。これにより、DNアーゼ等の試薬の使用コストが節約され、細胞培養培地と比較して、規定の緩衝液中でのベクター収集のための細胞溶解を可能にし、使用する溶液量がより少なくなる。最後に、MAAPバリアントの使用は、特にrAAV6について見られるように、目的のゲノムを含有するrAAVカプシドのレベルを向上させる。このことは、空のカプシド及び目的の組換えゲノムを含まないカプシドのレベルを低下させることによって、rAAV安全性プロファイルを改善することにつながりうる。またこれにより、目的のゲノムを含有するカプシドと他のカプシドとの追加の分離工程が不要になりうるため、下流工程におけるいくつかの精製工程を削減しうる。
MAAP ORFをコードする領域におけるcap遺伝子のDNA配列に基づいて、我々が研究した87個のAAV血清型のうち、全てがVPタンパク質配列を改変することなく、MAAP三重停止変異及びMAAP-L/S-100変異を生じることが可能であった。したがって、本明細書の実施例は、全てのAAV血清型に適用可能であると考えられる。
参照例2
1. Atchison, R. W., Casto, B. C. & Hammon, W. M. D. Adenovirus-Associated Virus. Science (80-.). 149, 754-755 (1965).
2. Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S. & Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science (80). 366, 1139-1143 (2019).
3. Gao, G. et al. Clades of Adeno-Associated Viruses Are Widely Disseminated in Human Tissues. J. Virol. 78, 6381-6388 (2004).
4. Corpet, F. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res. 16, 10881-90 (1988).
5. Girod, A. et al. The VP1 capsid protein of adeno-associated virus type 2 is carrying a phospholipase A2 domain required for virus infectivity. J. Gen. Virol. 83, 973-978 (2002).
6. Huerta-Cepas, J., Serra, F. & Bork, P. ETE 3: Reconstruction, Analysis, and Visualization of Phylogenomic Data. Mol. Biol. Evol. (2016). doi:10.1093/molbev/msw046
7. Katoh, K. & Standley, D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: Improvements in performance and usability. Mol. Biol. Evol. (2013). doi:10.1093/molbev/mst010
8. Price, M. N., Dehal, P. S. & Arkin, A. P. Fasttree: Computing large minimum evolution trees with profiles instead of a distance matrix. Mol. Biol. Evol. (2009). doi:10.1093/molbev/msp077
9. Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: an online tool for phylogenetic tree display and annotation. Nucleic Acids Res. (2021). doi:10.1093/nar/gkab301
1. Atchison, R. W., Casto, B. C. & Hammon, W. M. D. Adenovirus-Associated Virus. Science (80-.). 149, 754-755 (1965).
2. Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S. & Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science (80). 366, 1139-1143 (2019).
3. Gao, G. et al. Clades of Adeno-Associated Viruses Are Widely Disseminated in Human Tissues. J. Virol. 78, 6381-6388 (2004).
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5. Girod, A. et al. The VP1 capsid protein of adeno-associated virus type 2 is carrying a phospholipase A2 domain required for virus infectivity. J. Gen. Virol. 83, 973-978 (2002).
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8. Price, M. N., Dehal, P. S. & Arkin, A. P. Fasttree: Computing large minimum evolution trees with profiles instead of a distance matrix. Mol. Biol. Evol. (2009). doi:10.1093/molbev/msp077
9. Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: an online tool for phylogenetic tree display and annotation. Nucleic Acids Res. (2021). doi:10.1093/nar/gkab301
Claims (82)
- 全長の野生型の膜結合性アクセサリータンパク質(MAAP)の発現を低下させるがVP1の発現を維持する変異を有するアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAP mRNAに転写されるアデノ随伴ウイルスゲノムであって、前記ゲノムが、MAAP mRNAを野生型MAAP mRNAから変化させる変異を有し、前記変化が、MAAP翻訳開始コドンを開始コドンではない配列に変化させること及びMAAP mRNA内に少なくとも1つの停止コドンを作製することから選択され、前記変異が、前記ゲノムからのVP1の発現を妨げるものではない、アデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAP mRNA翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止する変異を有するアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記MAAP mRNA翻訳開始コドンを不活性化する変異を有し、少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止する少なくとも1つの変異を更に含む、請求項3に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、前記MAAP翻訳開始コドンを不活性化し、及び/又は少なくとも1つの停止コドンを導入して全長の野生型MAAPの翻訳を停止する、請求項1又は2に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9～110、好ましくは残基番号39～103とアラインメントするポリペプチド残基に、少なくとも1つの停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項1から5のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9、33、39、47、65、90、100、103、105、106又は110とアラインメントするポリペプチド残基に、少なくとも1つの停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号9とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号33とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号39とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号47とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号33、39及び47とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号65とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号90とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号100とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号103とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号105とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号106とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記変異が、MAAPポリペプチドコンセンサス配列の配列番号11の残基番号110とアラインメントするポリペプチド残基に、停止コドンを導入してMAAPポリペプチドの翻訳を停止する、請求項6に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記ゲノムが、天然の血清型及び非天然の血清型からなる群から選択される、請求項1から19のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記ゲノムが、非天然の血清型である、請求項20に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記ゲノムが、天然の血清型である、請求項20に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記ゲノムが、血清型2型ゲノムを含む、請求項22に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記ゲノムが、血清型5型ゲノムを含む、請求項22に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記ゲノムが、血清型6型ゲノム及び血清型8型ゲノムから選択される、請求項22に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記ゲノムが、血清型1型ゲノム及び血清型9型ゲノムから選択される、請求項22に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記ゲノムが、血清型1型ゲノム、血清型2型ゲノム、血清型5型ゲノム、血清型6型ゲノム、血清型8型ゲノム、及び血清型9型ゲノムから選択される、請求項22に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記ゲノムが、非天然の血清型を含む、請求項21に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記VP1ペプチド配列が野生型から変化しない、請求項2から28のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記VP1ペプチド配列が変異を含む、請求項2から28のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記MAAPペプチド配列及びVP1ペプチド配列が、それぞれ野生型に対して少なくとも80%の相同性を有する、請求項2から28のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記MAAPペプチド配列及びVP1ペプチド配列が、それぞれ野生型に対して少なくとも90%の相同性を有する、請求項31に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の33個の連続した残基に対して少なくとも50%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しないアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記33個の連続した残基が、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基93～97を含む、請求項33に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記33個の連続した残基が、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基107～119を含む、請求項33に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- 前記33個の連続した残基が、MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基1～30を含む、請求項33に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基1～33と少なくとも60%の相同性を有する任意の配列を含まない、請求項33に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基1～39と少なくとも60%の相同性を有する任意の配列を含まない、請求項33に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基1～47と少なくとも60%の相同性を有する任意の配列を含まない、請求項33に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも60%の相同性を有する任意の配列を含まない、請求項33に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも70%の相同性を有する任意の配列を含まない、請求項40に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対して少なくとも80%の相同性を有する任意の配列を含まない、請求項40に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の15個の連続した残基に対して少なくとも95%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない、請求項33に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の17個の連続した残基に対して少なくとも90%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない、請求項43に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の19個の連続した残基に対して少なくとも90%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない、請求項43に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の21個の連続した残基に対して少なくとも90%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない、請求項43に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基番号94～120の任意の10個の連続した残基に対して少なくとも50%の相同性を有する一次アミノ酸配列を有するポリペプチドを発現しない、請求項33に記載のアデノ随伴ウイルスゲノム。
- アデノ随伴ウイルスを産生するプロデューサー細胞であって、請求項1から47のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスゲノムを含むプロデューサー細胞。
- 真核生物である、請求項48に記載のプロデューサー細胞。
- 哺乳類である、請求項49に記載のプロデューサー細胞。
- ヒト細胞である、請求項50に記載のプロデューサー細胞。
- 酵母細胞及び昆虫細胞から選択される、請求項49に記載のプロデューサー細胞。
- アデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、アデノ随伴ウイルスゲノムを取得すること、次いで、前記ゲノムを細胞内に導入して、請求項48から52のいずれか一項に記載のプロデューサー細胞を作製すること、次いで、アデノ随伴ウイルスを産生する前記プロデューサー細胞を培養することを含む方法。
- 前記アデノ随伴ウイルスを収集することを更に含み、前記収集されたアデノ随伴ウイルスが導入遺伝子を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞が、物理的カプシドの総数に対する目的の遺伝子又はゲノムを含有するカプシドの数の比率が、野生型アデノ随伴ウイルスゲノムを含む類似の細胞によって産生される物理的カプシドの総数に対する目的の遺伝子又はゲノムを含有するカプシドの数の比率と少なくとも同じ高さのウイルス調製物を産生する、請求項53に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞が、野生型アデノ随伴ウイルスゲノムに感染した類似の細胞が産生するのと少なくとも同じ高さの完全ウイルスカプシド:空ウイルスカプシドの比率を有するウイルスを産生する、請求項53に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞が、野生型アデノ随伴ウイルスに感染した類似の細胞が産生するよりも完全ウイルスカプシド:空ウイルスカプシドの比率が30%高いウイルスを産生する、請求項56に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞が、野生型アデノ随伴ウイルスに感染した類似の細胞と少なくとも同じ多さのウイルスゲノム/mLを有するウイルスを産生する、請求項53に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞が、野生型アデノ随伴ウイルスに感染した類似の細胞が産生する数の少なくとも4倍の多さのウイルスゲノム/mLを有するウイルスを産生する、請求項58に記載の方法。
- 請求項53に記載の方法によって産生されたアデノ随伴ウイルス。
- アデノ随伴ウイルスを産生するプロデューサー細胞であって、
(a)MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の30個の連続した残基に対する少なくとも50%の相同性、
(b)MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の任意の15個の連続した残基に対する少なくとも95%の相同性、
(c)MAAPコンセンサスポリペプチド配列の配列番号11の残基番号94～120の任意の10個の連続した残基に対する少なくとも50%の相同性
を有するポリペプチドを実質的に含まないプロデューサー細胞。 - アデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、アデノ随伴ウイルスを産生する、請求項61に記載のプロデューサー細胞を培養すること、次いで、前記アデノ随伴ウイルスを収集することを含む方法。
- 請求項62に記載の方法によって産生されたアデノ随伴ウイルス。
- アデノ随伴ウイルスゲノムを含むプロデューサー細胞であって、アデノ随伴ウイルスを発現することができ、全長の機能性MAAPを実質的に含まないプロデューサー細胞。
- アデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、請求項64に記載のプロデューサー細胞を培養し、それにより、前記プロデューサー細胞がアデノ随伴ウイルスを産生すること、次いで、前記アデノ随伴ウイルスを収集することを含む方法。
- 請求項65に記載の方法によって産生されたアデノ随伴ウイルス。
- 前記アデノ随伴ウイルスゲノムが、全長の野生型の機能性MAAPの発現を妨げる変異を有する、請求項64に記載のプロデューサー細胞。
- アデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、請求項67に記載のプロデューサー細胞を培養し、それにより、前記プロデューサー細胞が、アデノ随伴ウイルスを産生すること、次いで、前記アデノ随伴ウイルスを収集することを含む方法。
- 請求項68に記載の方法によって産生されたアデノ随伴ウイルス。
- 全長の野生型の機能性MAAPの発現を妨げる干渉RNAを含む、請求項64に記載のプロデューサー細胞。
- アデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、請求項70に記載のプロデューサー細胞を培養し、それにより、前記プロデューサー細胞が、アデノ随伴ウイルスを産生すること、次いで、前記アデノ随伴ウイルスを収集することを含む方法。
- 請求項71に記載の方法によって産生されたアデノ随伴ウイルス。
- MAAPに結合し、MAAPの機能を損なう、MAAPへと方向付けられたタンパク質、例えばモノクローナル抗体又はアフィボディを含む、請求項64に記載のプロデューサー細胞。
- アデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、請求項73に記載のプロデューサー細胞を培養し、そにより、前記プロデューサー細胞が、アデノ随伴ウイルスを産生すること、次いで、前記アデノ随伴ウイルスを収集することを含む方法。
- 請求項71に記載の方法によって産生されたアデノ随伴ウイルス。
- アデノ随伴ウイルス(AAV)の安定性を増加させるか、カプシド完全性を増加させるか、又はカプシド分解を低減する方法であって、請求項1から47のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスゲノムを前記AAVに含めることを含む方法。
- 目的の遺伝子又はゲノムを含有するAAVカプシドの割合を増加させる方法であって、請求項1から47のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスゲノムと前記目的の遺伝子又はゲノムとを前記AAVに含めることを含む方法。
- AAVを産生するプロデューサー細胞のウイルス力価(ウイルスゲノム/mL)を増加させる方法であって、請求項1から47のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスゲノムを前記AAVに含めること、及び前記AAVを前記プロデューサー細胞に導入することを含む方法。
- 前記プロデューサー細胞を少なくとも30時間培養する、請求項53に記載の方法。
- 前記プロデューサー細胞を少なくとも36時間、48時間、72時間又は96時間培養する、請求項79に記載の方法。
- AAVを産生するプロデューサー細胞におけるウイルスゲノム又はウイルス粒子の保持を増加させるための方法であって、請求項1から47のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスゲノムを前記AAVに含めること、及び前記AAVを前記プロデューサー細胞に導入することを含む方法。
- 前記プロデューサー細胞から、好ましくは培地を実質的に含まないように、前記ウイルスゲノム又はウイルス粒子を収集及び/又は精製することを更に含む、請求項81に記載の方法。
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