CN117836421A

CN117836421A - 在昆虫细胞中制备腺相关病毒载体

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Publication number: CN117836421A
Application number: CN202280057354.2A
Authority: CN
Inventors: E·S·巴顿; G·董; P·A·索迪
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2021-06-22
Filing date: 2022-06-20
Publication date: 2024-04-05

Abstract

本公开涉及使用杆状病毒表达载体系统在昆虫细胞中优化大规模生产rAAV载体的组合物和方法。

Description

在昆虫细胞中制备腺相关病毒载体

对序列表的引用

本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式以电子方式提交，并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2022年5月5日，命名为PC072652APCT_Sequence_Listing_ST25.txt，大小为59,346字节。

发明领域

本公开涉及优化在昆虫细胞中重组腺相关病毒(rAAV)载体的生产。特别地，本公开提供了用于生产rAAV载体的组合物和方法，其具有病毒衣壳(帽)蛋白的完整性的改进和所生产的rAAV载体效力的伴随的增加。

发明背景

重组腺相关病毒(rAAV)载体由于其低致病潜力和感染分裂细胞和非分裂细胞的能力，是基因治疗递送的领先平台。最常见的是，rAAV载体在哺乳动物细胞(例如，HEK293细胞、COS细胞、HeLa细胞)中产生。然而，在哺乳动物细胞中大规模生产rAAV载体仍然是一个挑战，并且是在人类中全面实施rAAV载体用于临床的限制因素。

还开发了基于杆状病毒感染昆虫细胞的能力的rAAV载体生产系统(Urabe等2002；Hum.Gene Ther.13:1935-1943；Kotin等US2003/0148506；Kotin等US2004/0197895和Kohlbrenner US2006/0166363)。例如，昆虫细胞被三种不同的重组杆状病毒感染——一种产生AAV复制酶(REP)蛋白，第二种提供产生AAV病毒结构蛋白(VP1、VP2和VP3)的帽功能，第三种杆状病毒包含感兴趣的转基因。这种杆状病毒表达载体(BEV)系统可以在昆虫细胞中产生大量rAAV载体。然而，杆状病毒感染对所得rAAV载体效力的影响尚未详细研究。研究表明，杆状病毒组织蛋白酶(v-CATH)对几种AAV血清型具有活性，导致AAV帽蛋白VP1和VP2的部分降解，并伴随rAAV感染性的降低(Galibert L,Savy A,Dickx Y,Bonnin D,Bertin B,Mushimiyimana I,et al.(2018)Origins of truncated supplementary capsidproteins in rAAV8vectors produced with the baculovirus system.PLoS ONE 13(11):e0207414)。

鉴于BEV系统的上述严重限制，仍然需要开发有效和改进的方法，以允许生产大量强效rAAV颗粒。

发明概述

本文公开并举例说明了使用杆状病毒表达载体系统在昆虫细胞中优化大规模生产rAAV载体的组合物和方法。本领域技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验来确定，许多等同于本文所述的本发明的具体实施方案。这样的等同方案旨在被以下实施方式(E)所涵盖。

E1.一种生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法，包括：

使昆虫细胞与一种或多种重组杆状病毒接触，每种杆状病毒包含异源序列；和

在合适的条件下培养昆虫细胞，培养时间足以产生在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间或另一种AAV血清型的VP1蛋白质中的对应氨基酸之间具有不超过15％的剪切(clipping)的rAAV载体。

E2.一种生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法，包括：

在合适的条件下培养所述昆虫细胞，培养时间足以产生rAAV载体，所述rAAV载体在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切，并且在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的对应氨基酸之间具有上述各自百分比的剪切。

E3.一种提高重组腺相关病毒(AAV)载体体外效力的方法，包括：

优化在合适条件下培养昆虫细胞的时间，使得rAAV载体的体外效力与参考标准相比在10％-500％之间，其中所述参考标准在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间或在另一种AAV血清型的VP1蛋白质中的对应氨基酸之间具有不超过15％的剪切。

E4.一种提高重组腺相关病毒(AAV)载体体外效力的方法，包括：

优化在合适条件下培养昆虫细胞的时间，使得rAAV载体的体外效力与参考标准相比在10％-500％之间，其中所述参考标准在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切，并且在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的对应氨基酸之间具有上述各自百分比的剪切。

E5.根据E1-E4中任一项所述的方法，其中将所述昆虫细胞培养足够的时间以产生rAAV载体，所述rAAV载体在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间以及在对应于Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过75％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的对应氨基酸之间具有不超过75％的剪切。

E6.根据E1-E5中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体与参考标准相比具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200％的体外效力。

E7.E6的方法，其中使用比色测定、显色测定、基于ELISA的测定、定量PCR和/或蛋白质印迹来测量体外效力。

E8.根据E1-E7中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体与参考标准相比具有至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200％的体内效力。

E9.根据E8所述的方法，其中在动物模型中测量所述体内效力。

E10.根据E1-E9中任一项的方法，其中在从昆虫细胞回收rAAV载体之前，将昆虫细胞培养24小时、2天、3天、4天、4.1天、4.2天、4.3天、4.4天、4.5天、4.6天、4.7天、4.8天、4.9天、5天、5.1天、5.2天、5.3天、5.4天、5.5天、6天、7天、8天、9天或10天。

E11.根据E1-E10中任一项所述的方法，其中在从昆虫细胞中回收rAAV载体之前，将昆虫细胞培养至少4.1天但不超过10天。

E12.根据E1-E10中任一项所述的方法，其中在从昆虫细胞中回收rAAV载体之前，将昆虫细胞培养约4天、4.1天、4.2天、4.3天、4.4天、4.5天、4.6天、4.7天、4.8天、4.9天、5天、5.1天、5.2天、5.3天、5.4天或5.5天。

E13.根据E1-E12中任一项所述的方法，其中在从昆虫细胞回收rAAV载体之前将昆虫细胞培养约96小时至约128小时，或在从昆虫细胞回收rAAV载体之前培养约108±5小时。

E14.根据E1-E13中任一项所述的方法，其中在从昆虫细胞回收rAAV载体之前测量的基因组滴度为至少1×10¹⁰个病毒基因组(vg)/ml。

E15.根据E1-E14中任一项所述的方法，其中从昆虫细胞回收rAAV载体后测量的基因组滴度为至少5×10⁹个病毒基因组(vg)/ml。

E16.根据E14或E15所述的方法，其中所述基因组滴度通过定量聚合酶链式反应(qPCR)测量。

E17.根据E1-E16中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞与以下杆状病毒接触：

(i)一种或两种辅助重组杆状病毒，每种杆状病毒包含编码AAV Rep蛋白和/或AAVCap蛋白的异源序列，以及

(iii)载体重组杆状病毒，其包含编码两个AAV末端反向重复序列(ITR)之间的转基因的异源序列。

E18.根据E17所述的方法，其中培养产生rAAV载体的合适条件包括：

(i)培养昆虫细胞的温度，

(ii)与昆虫细胞接触的辅助重组杆状病毒的量，

(iii)与昆虫细胞接触的载体重组杆状病毒载体的量，和/或

(iv)细胞培养基中溶解氧的量，

所述rAAV载体在野生型AAV6的VP1蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切或在野生型AAV6的VP1和VP2蛋白上的氨基酸残基189G和190E之间具有不超过65％的剪切和氨基酸残基115G和116R之间不超过15％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的对应氨基酸之间具有上述各自百分比的剪切。

E19.根据E1-E18中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞在低于37℃的温度下培养。

E20.根据E19所述的方法，其中所述昆虫细胞在约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃或约31℃的温度下培养。

E21.根据E20所述的方法，其中所述昆虫细胞在约28℃的温度下培养。

E22.根据E18-E21中任一项所述的方法，其中与所述昆虫细胞接触的辅助重组杆状病毒的量相对于总培养体积在约0.0022％至约0.0178％体积之间。

E23.根据E18-E22中任一项所述的方法，其中与所述昆虫细胞接触的载体重组杆状病毒的量相对于总培养体积为约0.0022％至约0.0178％体积。

E24.根据E18-E23中任一项所述的方法，其中所述培养基中溶解氧的量为空气饱和度的约20％至约100％。

E25.根据E1-E24中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞在细胞培养基中培养，并且其中所述细胞培养基的体积为至少2L、至少10L、至少250L或至少2000L。

E26.根据E1-E25中任一项所述的方法，其中通过毛细管凝胶电泳(CGE)、质谱法(包括多属性质谱法)和/或蛋白质印迹测定来测量VP1和VP2蛋白的剪切。

E27.根据E1-26中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞、Sf21细胞或Hi5细胞。

E28.根据E1-E27中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞处于悬浮培养中。

E29.根据E1-E27中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞是贴壁的。

E30.根据E1-E29中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞在无血清培养基中生长或维持。

E31.根据E1-E30中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞在滚瓶或扩展滚瓶中生长或维持。

E32.根据E1-E30中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞在生物反应器中生长。

E33.根据E1-E30中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞在袋或瓶中生长。

E34.根据权利要求32所述的方法，其中所述昆虫细胞在WAVE生物反应器中生长。

E35.根据E32所述的方法，其中所述细胞在搅拌釜生物反应器中生长。

E36.根据E17-E35中任一项所述的方法，其中所述转基因编码野生型或功能性变体凝血因子、微小肌养蛋白、C1酯酶抑制剂、铜转运P型ATP酶(ATP7B)、铜锌超氧化物歧化酶1(SOD1)或肌球蛋白结合蛋白C3。

E37.根据E36所述的方法，其中所述野生型或功能性变体凝血因子是因子VII、因子VIII或因子IX。

E38.根据E37所述的方法，其中所述野生型或功能性变体凝血因子是因子VIII。

E39.根据E1-E38中任一项所述的方法，其中所述rAAV是rAAV1、rAAV3a、rAAV3b、rAAV6或rAAV8。

E40.一种组合物，其包含纯化的重组腺相关病毒(rAAV)载体，所述载体在野生型AAV6的VP1蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间或另一种AAV血清型的VP1蛋白质中的相应氨基酸之间具有不超过15％的剪切。

E41.一种组合物，所述组合物包含纯化的重组腺相关病毒(rAAV)载体，所述载体在野生型AAV6的VP1和VP2蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切，并且在氨基酸残基189G和190E之间具有不超过65％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1和VP2蛋白中相应的氨基酸之间具有所述剪切。

E42.E40-E41中任一项的组合物，其中所述rAAV是rAAV1、rAAV3a、rAAV3b、rAAV6或rAAV8。

E43.E40-E42中任一项的组合物，其中所述rAAV载体包含感兴趣的转基因。

E44.E43的组合物，其中所述感兴趣的转基因编码野生型或功能性变体凝血因子、微小肌养蛋白、C1酯酶抑制剂、铜转运P型ATP酶(ATP7B)、铜锌超氧化物歧化酶1(SOD1)或肌球蛋白结合蛋白C3。

E45.E44的组合物，其中所述野生型或功能性变体凝血因子是因子VII、因子VIII或因子IX。

E46.E45的组合物，其中所述野生型或功能性变体凝血因子是因子VIII。

E47.根据E40-E46中任一项所述的组合物，其中所述rAAV载体具有与参考标准相比至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200％的体外效力。

E48.根据E47所述的组合物，其中使用比色测定、显色测定、基于ELISA的测定、定量PCR和/或蛋白质印迹来测量体外效力。

E49.根据E40-E48中任一项所述的组合物，其中所述rAAV载体与参考标准相比具有至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200％的体内效力。

E50.E49的组合物，其中在动物模型中测量体内效力。

E51.E40-E50中任一项的组合物，其中通过毛细管凝胶电泳(CGE)、质谱法(包括多属性质谱法)和/或蛋白质印迹测定来测量VP1和VP2蛋白的剪切。

E52.一种组合物，其包含纯化的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体，所述载体包含编码野生型或功能性变体凝血因子VIII的转基因，所述载体与参考标准相比具有约10％-500％的体外效力，所述参考标准在VP1蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切。

E53.一种组合物，其包含纯化的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体，所述载体包含编码野生型或功能性变体凝血因子VIII的转基因，所述载体与参考标准相比具有约10％-500％的体外效力，所述参考标准在VP1和VP2蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切，并且在氨基酸残基189G和190E之间具有不超过65％的剪切。

E54.一种生产包含凝血因子VIII的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体的方法，所述方法包括：

(i)使Sf9细胞与一种或两种辅助重组杆状病毒接触以及与载体重组杆状病毒接触，每种辅助重组杆状病毒包含编码AAV6 Rep蛋白和/或AAV6 Cap蛋白的异源序列，所述载体重组杆状病毒包含编码两个AAV2末端反向重复序列(ITR)之间的凝血因子VIII的异源序列；和

(ii)在合适的条件下培养所述Sf9细胞108±5小时以产生rAAV6载体，所述rAAV6载体在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切。

E55.一种生产包含凝血因子VIII的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体的方法，所述方法包括：

(ii)在合适的条件下培养所述Sf9细胞108±5小时以产生rAAV6载体，所述rAAV6载体在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切，并且在对应于Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切。

E56.一种生产包含凝血因子VIII的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体的方法，所述方法包括：

(ii)在合适的条件下培养所述Sf9细胞108±5小时，以产生rAAV6载体，所述载体与参考标准相比具有50-150％的体外效力，所述参考标准在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切。

E57.一种生产包含凝血因子VIII的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体的方法，所述方法包括：

(ii)在合适的条件下培养所述Sf9细胞108±5小时，以产生rAAV6载体，所述载体与参考标准相比具有50-150％的体外效力，所述参考标准在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切，并且在对应于Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切。

附图简述

图1显示了阐明在2000L规模下体外效力与感染后批次持续时间之间负相关性的图。

图2显示了阐明体外效力和VP1/VP2衣壳蛋白在氨基酸残基G189和E190之间的剪切之间的反比关系的图。

图3显示了阐明VP1/VP2剪切作为感染后分批持续时间的函数而增加的曲线图。

图4是用于测量FVIII活性的测定法的示意图。

图5是野生型AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV3A(SEQ ID NO:2)、AAV3B(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)和AAV8(SEQ ID NO:5)的比对。

图6描绘了显示体外因子VIII活性与(A)搅拌釜反应器(STR)温度、(B)以空气饱和度的百分比表示的溶解氧的量、(C)辅助重组杆状病毒体积、(D)载体重组杆状病毒体积和(E)感染后的批次持续时间之间的定量关系的图。

详述

使用杆状病毒表达载体(BEV)系统对昆虫细胞中产生的rAAV载体进行的分析表明，rAAV载体的体外效力值与感染后的时间(即，在回收rAAV载体之前昆虫细胞与重组杆状病毒接触后的天数，本文也称为感染后的批次持续时间)之间呈负相关。具体而言，观察到rAAV载体的体外效力随着感染后的时间而降低，特别是在约103小时至163小时之间(参见例如图1)。

为了解这种体外效力变化的原因而进行的进一步研究导致了一种属性——AAV衣壳蛋白(即VP1和VP2蛋白)的剪切形式的鉴定。数据表明，剪切的VP1和VP2蛋白水平与相对体外效力之间呈负相关，其中，随着感染后时间的推移剪切的VP2和VP1蛋白水平增加，体外效力降低。在大规模生产(2000L)和小规模生产(2L、10L或200L)中都观察到剪切的VP1和VP2蛋白随感染后时间推移增加以及伴随的体外效力的降低。

因此，本公开提供了通过优化感染后的时间来生产rAAV载体的方法，使得所生产的rAAV载体具有最低水平的剪切的VP1和VP2蛋白和最大的体外效力。本公开还提供了包含纯化的rAAV载体的组合物，该载体具有最小的剪切的VP1和VP2蛋白和最大的体外效力。

此处使用的章节标题仅用于组织目的，不得解释为限制所述主题。

本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公开文本、UniProtKB登录号，均通过引用的方式并入本文，就好像每个单独的参考文献被明确且单独地指示为通过引用整体并入本文一样。

通过参考以下对本发明的示例性实施方案和其中包括的实施例的详细描述，可以更容易地理解本公开。

在本发明的各方面或实施方案是根据马库什(Markush)组或其他备选分组来描述的情况下，本发明不仅包括作为一个整体列出的整个组，而且包括单独列出的组的每个成员和主组的所有可能的子组，而且还包括没有一个或多个组成员的主组。本发明还设想明确排除所要求保护的发明中的任何组成员中的一个或多个。

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。此处使用的术语仅用于描述具体实施方案，而不旨在限制本发明。如在本发明的说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”也应包括复数形式，除非上下文另有明确指示。

如本文所用，术语“约”或“大约”是指可测量的值，例如(但不限于)剪切的VP1和/或VP2蛋白的量、体外效力、感染后时间、温度、剂量、基因组滴度、辅助重组杆状病毒的量、载体重组杆状病毒的量、生物活性、多核苷酸或多肽序列的长度等，并且意味着包括25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或甚至0.1％的在指定量的任一方向(大于或小于)上的变化，除非另有说明，或除非以其他方式从上下文中显而易见，或者除非这样的数字将超过可能值的100％。

如本文所用，术语“和/或”是指并包括一个或多个相关列出项目的任何和所有可能的组合，以及在备选方案(“或”)中解释时缺乏组合。

如本文所用，术语“腺相关病毒”和/或“AAV”是指具有线性单链DNA基因组的细小病毒及其变体。该术语涵盖所有亚型以及天然存在和重组形式，除非另有要求。野生型基因组包括4681个碱基(Berns和Bohenzky(1987)Advances in Virus Research 32:243-307)，并在每一端包括末端重复序列(例如，末端反向重复序列ITR)，其顺式发挥功能作为DNA复制起点和病毒包装信号。该基因组包括两个大的开放阅读框，分别称为AAV复制(“AAV rep”或“rep”)和衣壳(“AAV-cap”或”cap“或”AAV结构蛋白“)基因。AAV rep和cap在本文中也可以称为AAV“包装基因”。这些基因编码参与病毒基因组复制和包装的病毒蛋白。

在野生型AAV病毒中，三个衣壳基因VP1、VP2和VP3在一个开放阅读框内相互重叠，选择性剪接导致VP1、VP2和VP3的产生(Grieger and Samulski(2005)J.Virol.79(15):9933-9944)。单个P40启动子允许所有三种衣壳蛋白分别以约1:1:10的比例表达VP1、VP2、VP3，这补充了AAV衣壳的产生。更具体地说，VP1是全长蛋白，VP2和VP3由于N末端的截短增加而越来越短。一个众所周知的例子是如美国专利号7,906,111中所述的AAV9的衣壳，其中VP1包括SEQ ID NO:123的氨基酸残基1至736，VP2包括SEQ ID NO:123的氨基残基138至736以及VP3包括SEQ ID NO:123的氨基酸残基203至736。如本文所用，术语“AAV衣壳”或“AAV帽”或“帽”是指AAV衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3及其变体和类似物。

至少四种病毒蛋白由AAV rep基因合成，即rep 78、rep 68、rep 52和rep 40，并根据其表观分子量命名。如本文所用，“AAV rep”或“rep”是指AAV复制蛋白rep 78、rep 68、rep 52和/或rep 40，以及其变体和类似物。如本文所用，rep和cap指野生型和重组(例如，修饰的嵌合的等)rep和cap基因以及它们编码的多肽。在一些实施方案中，编码rep的核酸将包含来自一种以上AAV血清型的核苷酸。例如，编码rep的核酸可以包含来自AAV2血清型的核苷酸和来自AA3血清型的核苷酸(Rabinowitz等人(2002)J.Virology 76(2):791-801)。

如本文所用，术语“重组腺相关病毒载体”、“rAAV”和/或“rAAV载体”是指包含载体基因组的AAV，其中野生型AAV病毒基因组的rep和/或cap基因已从病毒基因组中去除，并用不属于或不完全属于AAV来源的多核苷酸序列(例如，与AAV异源的多核苷酸)代替。在典型AAV的rep和/或cap基因已被移除或不存在的情况下(并且侧翼ITR通常衍生自不同血清型的ITR，例如但不限于衣壳不是AAV2的AAV2 ITR)，AAV内的核酸，包括任何ITR和它们之间的任何核酸，被称为“载体基因组”。因此，术语rAAV载体包括rAAV病毒颗粒，其包含衣壳和异源核酸，即自然界中最初不存在于衣壳中的核酸，在本文中也称为“载体基因组”。因此，“rAAV载体基因组”(或“载体基因组”)是指可以但不需要包含在AAV衣壳内的异源多核苷酸序列(包括至少一个ITR，通常但不一定是与原始AAV中存在的原始核酸不相关的ITR)。rAAV载体基因组可以是双链(dsAAV)、单链(ssAAV)和/或自互补的(scAAV)。

如本文所使用的，术语“rAAV载体”、“rAAV病毒颗粒”和/或“rAAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(尽管通常存在AAV的所有衣壳蛋白，例如VP1、VP2和VP3，或其变体)组成并包含载体基因组的AAV衣壳，所述载体基因组包含最初不存在于原始AAV衣壳中的异源核酸序列。这些术语区别于非重组的“AAV病毒颗粒”或“AAV病毒”，其中衣壳含有编码rep和cap基因的病毒基因组，并且如果AAV病毒存在于还包含辅助病毒(如腺病毒和/或单纯疱疹病毒)和/或所需辅助基因的细胞中，则AAV病毒能够复制。因此，rAAV载体颗粒的生产必然包括使用重组DNA技术生产重组载体基因组，例如，该载体基因组包含在衣壳内以形成rAAV载体、rAAV病毒颗粒或rAAV载体颗粒。

AAV的各种血清型的基因组序列，以及末端反向重复序列(ITRs)、rep蛋白和衣壳亚基的序列，都存在于自然界和/或其突变体和变体中，是本领域已知的。这些序列可以在文献或公共数据库(如GenBank)中找到。参见，例如，GenBank登录号NC-002077(AAV-1),AF063497(AAV-1),NC-001401(AAV-2),AF043303(AAV-2),NC-001729(AAV-3),NC_001863(AAV-3B),NC-001829(AAV-4),U89790(AAV-4),NC-006152(AAV-5),AF028704(AAV-6),AF513851(AAV-7),AF513852(AAV-8),和NC-006261(AAV-8)；其公开内容通过引用并入本文。也参见例如Srivistava et al.(1983)J.Virology45:555；Chiorini et al.(1998)J.Virology 71:6823；Chiorini et al.(1999)J.Virology 73:1309；Bantel-Schaal etal.(1999)J.Virology 73:939；Xiao et al.(1999)J.Virology 73:3994；Muramatsu etal.(1996)Virology 221:208；Shade etal.(1986)J.Virol.58:921；Gao et al.(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris et al.(2004)Virology 33:375-383；国际专利公开WO 00/28061、WO99/61601、WO 98/11244；WO 2013/063379，WO 2014/194132，WO 2015/121501；以及美国专利号6,156,303和7,906,111。

如本文所用，术语“改善”是指受试者的疾病、病症或病况、或其症状、或潜在细胞反应的可检测或可测量的改善。可检测或可测量的改善包括对疾病、病症或病况的主观或客观减轻、减少、抑制、阻抑；发生、频率、严重性、进展或持续时间、由疾病、病症或病况引起或相关的并发症的限制或控制、症状的改善或逆转。

如本文所用，术语“编码序列”或“编码核酸”是指编码蛋白质或多肽的核酸序列，并表示当置于适当的调控序列的控制下(可操作地连接)时在体外或体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)为多肽的序列。编码序列的边界通常由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列，甚至合成DNA序列。

如本文所用，术语“嵌合”是指具有来自不同细小病毒，优选不同AAV血清型的衣壳序列的病毒衣壳，如Rabinowitz等人的美国专利号6,491,907中所述，其公开内容通过引用整体并入本文。另见Rabinowitz et al.(2004)J.Virol.78(9):4421-4432。在一些实施方案中，嵌合病毒衣壳是WO 2006/066066中描述的AAV2.5衣壳、WO 2010/093784中描述的AAC2i8、WO 2014/144229中描述的AAM2G9和AAV8G9以及AAV9.45(Pulicherla等人(2011)Molecular Therapy 19(6):10700-1078)、WO 2103/029030中描述的AV-NP4、NP22、NP66、AAV-LK01至AAV-LK019，在WO 205/013133中描述的RHM4-1和RHM15-1至RHM5-6，在WO 2007/120542中描述的AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-DJ/9。

如本文所用，术语“保守取代”是指一种氨基酸被生物学、化学或结构相似的残基取代。生物学相似意味着取代不会破坏生物活性。结构相似意味着氨基酸具有相似长度的侧链，例如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似大小。化学相似性意味着残基具有相同的电荷或都是亲水或疏水的。具体实例包括用疏水性残基取代另一个疏水性残基，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，或用一个极性残基取代另一个，例如用精氨酸取代赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用谷氨酰胺取代天冬酰胺，用丝氨酸取代苏氨酸等。保守取代的具体实例包括疏水性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸相互取代，极性残基相互取代，如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。保守氨基酸取代通常包括，例如，在以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。“保守取代”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的母体氨基酸。

如本文所用，术语“侧接”是指侧翼有其他元件的序列，并表示相对于该序列上游和/或下游(即5'和/或3')存在一个或多个侧翼元件。术语“侧接”并不意味着序列必须是连续的。例如，在编码转基因的核酸和侧翼元件之间可能存在间插序列。一个序列(如转基因)“侧接”两个其他元素(如ITRs)，表明一个元件位于序列的5'处，另一个位于序列的3'处；然而，在它们之间可能存在间插序列。

如本文所用，术语“片段”是指具有包括整体的离散部分但缺乏在整体中发现的一个或多个部分的结构的材料或实体。在一些实施方案中，片段由离散部分组成。在一些实施方案中，片段由整体中发现的特征性结构元件或部分组成或包含该特征性结构元件或部分。在一些实施方案中，聚合物片段包含或由在整个聚合物中发现的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个单体单元(例如氨基酸残基、核苷酸)组成。

如本文所用，术语“功能性”是指一种形式的生物分子，在这种形式中，该生物分子表现出表征其的性质和/或活性。生物分子可以具有两种功能(即双功能的)或多种功能(即多功能的)。

如本文所用，术语“基因”是指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，该多核苷酸在被转录和翻译后能够编码特定的多肽或蛋白质。“基因转移”或“基因递送”是指将外源DNA可靠地插入宿主细胞的方法或系统。这种方法可以导致非整合的转移DNA的瞬时表达、转移的复制子(例如外泌体)的染色体外复制和表达，和/或转移的遗传物质整合到宿主细胞的基因组DNA中。

如本文所用，术语“异源”或“外源”核酸是指插入载体(例如rAAV载体或重组杆状病毒)中的核酸，用于该核酸载体介导的转移/递送到细胞中的目的。异源核酸通常不同于载体(例如AAV、杆状病毒)核酸，也就是说，相对于自然界中发现的病毒(如AAV、杆状病毒)核酸而言，异源核酸是非天然的。一旦转移(例如，转导)或递送到细胞中，载体内包含的异源核酸就可以表达(例如，如果合适，转录和翻译)。或者，包含在载体内的细胞中转移(转导)或递送的异源核酸不需要表达。尽管术语“异源”在本文中并不总是用于提及核酸，但即使在不存在修饰语“异源的”的情况下提及核酸也意在包括异源核酸。例如，异源核酸将是编码野生型或功能性变体凝血因子、微小肌养蛋白、C1酯酶抑制剂、铜转运P型ATP酶(ATP7B)、铜锌超氧化物歧化酶1(SOD1)或肌球蛋白结合蛋白C3的核酸。

如本文所用，术语“同源的”或“同源性”是指在给定区域或部分上共享至少部分同一性的两个或多个参考实体(例如核酸或多肽序列)。例如，当两个肽中的一个氨基酸位置被相同的氨基酸占据时，则肽在该位置是同源的。值得注意的是，同源肽将保留与未修饰的或参考肽相关的活性或功能，并且修饰的肽将通常具有与未修饰序列的氨基酸序列“基本同源”的氨基酸序列。当提及多肽、核酸或其片段时，“实质同源性”或“实质相似性”是指当与另一多肽、核酸(或其互补链)或其片段进行具有适当的插入或缺失的最佳比对时，至少约95％至99％的序列具有序列同一性。两个序列之间的同源性(同一性)的程度可以使用计算机程序或数学算法来确定。这种计算序列同源性(或同一性)百分比的算法通常考虑比较区或区域上的序列空位和错配。下面提供示例性程序和算法。

如本文所用，术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指的是外源核酸已被引入其中的细胞，并包括这种细胞的子代。宿主细胞包括“转染子”、“转化体”、“转化的细胞”和“转导的细胞”，包括原代转染、转化或转导细胞及其衍生的子代，而不考虑传代次数。在一些实施方案中，宿主细胞是用于生产rAAV载体的包装细胞，例如Sf9或Sf21细胞。

如本文所用，术语“同一性”或“同一的”是指聚合物分子之间的整体相关性，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高同一性，则认为它们彼此“基本相同”。

例如，两个核酸或多肽序列的同一性百分比的计算可以通过比对两个序列以达到最佳比较目的来进行(例如，可以在第一序列和第二序列中的一个或两个序列中引入空位以实现最佳比对，并且为了比较目的可以忽略不相同的序列)。在某些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中的相应位置相同的残基(例如核苷酸或氨基酸)占据时，分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数量的函数，考虑到空位的数量和每个空位的长度，需要引入所述空位以实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。

为了确定同一性或同源性百分比，可以使用包括BLAST在内的方法和计算机程序对序列进行比对，BLAST可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上获得。另一种比对算法是FASTA，可在美国威斯康星州麦迪逊的遗传学计算小组(Genetics Computing Group，GCG)包中获得。用于比对的其它技术描述于Methods in Enzymology,vol.266:ComputerMethods for Macromolecular Sequence Analysis(1996),ed.Doolittle,AcademicPress,Inc.。Smith-Waterman是一种允许序列比对中存在空位的算法。参见Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。此外，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可以用于比对序列。参见J.Mol.Biol.48:443-453(1970)。

此外，感兴趣的是使用Smith和Waterman(1981，Advances in AppliedMathematics 2:482-489)的局部同源性算法来确定序列同一性的BestFit程序。空位产生罚分将一般在1到5的范围内，通常在2到4的范围内并且在一些实施方案中将是3。空位扩展罚分将通常在从大约0.01到0.20的范围内，并且在一些情况下将是0.10。该程序具有由要比较的输入序列确定的默认参数。优选地，使用由程序确定的默认参数来确定序列同一性。该程序也可从美国威斯康星州麦迪逊的遗传学计算小组(GCG)软件包中获得。

另一个感兴趣的程序是FastDB算法。FastDB描述于Current Methods inSequence Comparison and Analysis,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,pp.127-149,1988,Alan R.Liss,Inc。序列同一性百分比由FastDB基于以下参数计算：错配罚分：1.00；空位罚分：1.00；空位大小罚分：0.33；加入罚分：30.0。

如本文所用，术语“增加”、“改善”或“减少”、“减小”表示相对于基线测量的值。例如，相对于不是通过本文所述方法产生的rAAV载体的体外效力值，可以测量体外效力的增加或改善。

如本文所用，术语“末端反向重复”、“ITR”、“末端重复”和“TR”是指AAV基因组末端或附近的回文末端重复序列，其主要包括互补、对称排列的序列。这些ITR可以折叠形成T形发夹结构，在DNA复制开始时起引物的作用。它们也是病毒基因组整合到宿主基因组中，从宿主基因组中拯救出来；以及用于将病毒核酸包封成成熟的病毒粒子所需要的。ITRs在顺式中是载体基因组复制及其包装到病毒颗粒中所必需的。“5'ITR”指AAV基因组5'端和/或重组转基因5'的ITR。“3'ITR”指AAV基因组3'端和/或重组转基因3’的ITR。野生型ITR的长度约为145bp。修饰的或重组的ITR可以包括野生型AAV ITR序列的片段或部分。本领域普通技术人员将理解，在连续几轮DNA复制过程中，ITR序列可以互换，使得5’ITR变成3’ITR，反之亦然。在一些实施方案中，至少一种ITR存在于重组载体基因组的5'和/或3'端，使得载体基因组可以被包装到衣壳中以产生包含载体基因组的rAAV载体(本文也称为“rAAV载体颗粒”或“rAAV病毒颗粒”)。

如本文所用，术语“分离的”是指物质或组合物，其1)是人工设计、生产、制备和/或制造的，和/或2)与最初生产时与其相关的至少一种成分分离(无论是在自然界和/或实验环境中)。通常，分离的组合物基本上不含它们在自然界中通常与之结合的一种或多种材料，例如一种或多种蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物和/或细胞膜。术语“分离的”不排除人造组合，例如重组核酸、重组载体基因组(例如rAAV载体基因组)、包装例如包壳载体基因组和药物制剂的rAAV载体颗粒(例如，但不限于，包含AAV6衣壳的rAAV载体颗粒)。术语“分离的”也不排除组合物的替代物理形式，如杂合体/嵌合体、多聚体/寡聚体、修饰(如磷酸化、糖基化、脂质化)、变体或衍生形式，或在宿主细胞中表达的人为形式。

分离的物质或组合物可以与它们最初相关的其它组分的约10％、约20％、约30％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％分离。在一些实施方案中，分离的试剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％的纯。如本文所用，如果物质基本上不含其他成分，则该物质为“纯”物质。在一些实施方案中，如本领域技术人员所理解的，物质在与某些其他组分例如一种或多种载体或赋形剂(例如缓冲剂、溶剂、水等)组合后，仍然可以被认为是“分离的”或甚至“纯的”；在这样的实施方案中，在不包括这样的载体或赋形剂的情况下计算物质的分离百分比或纯度。

如本文所用，术语“核酸序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”可互换地指由磷酸二酯键连接的单体核苷酸组成或包含所述单体核苷酸的任何分子。核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸。核酸序列在本文中以从5’到3’的方向呈现。本公开的核酸序列(即，多核苷酸)可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子，并且是指所有形式的核酸，例如双链分子、单链分子、小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)、微RNA、小干扰RNA或短干扰RNA(siRNA)、反式剪接RNA、反义RNA、信使RNA、转移RNA、核糖体RNA。在多核苷酸是DNA分子的情况下，该分子可以是基因、cDNA、反义分子或任何前述分子的片段。核苷酸在本文中由单个字母代码表示：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。核苷酸序列可以是化学修饰的或人工的。核苷酸序列包括肽核酸(PNA)、吗啉代核酸和锁核酸(LNA)，以及二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些序列中的每一个都通过分子骨架的变化与天然存在的DNA或RNA区分开来。此外，可以使用硫代磷酸酯核苷酸。其他脱氧核苷酸类似物包括甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、N3'-P5'-氨基磷酸酯和低聚核糖核苷酸硫代磷酸酯及其2'-O-烯丙基类似物和2'-O-甲基核糖核苷酸甲基膦酸酯，其可用于本公开的核苷酸序列中。

如本文所用，术语“核酸构建体”是指使用重组DNA技术产生的非天然存在的核酸分子(例如，重组核酸)。核酸构建体是单链或双链的核酸分子，其已被修饰以包含核酸序列的片段，所述核酸序列以自然界中未发现的方式组合和排列。核酸构建体可以是“载体”(例如，质粒、rAAV载体基因组、表达载体等)，即设计用于将外源产生的DNA递送到宿主细胞中的核酸分子。

如本文所用，术语“可操作连接”是指具有功能关系的核酸序列(或多肽)元件的连接。当一个核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，它是可操作地连接的。例如，启动子或其他转录调控序列(例如增强子)如果影响编码序列的转录，则可操作地连接到编码序列。在一些实施方案中，可操作连接意味着被连接的核酸序列是连续的。在一些实施方案中，可操作连接并不意味着核酸序列是连续连接的，相反，间插序列在连接的那些核酸序列之间。

如本文所用，术语“药学上可接受的”和“生理上可接受的”是指适用于一种或多种给药途径、体内递送或接触的生物上可接受的制剂，气体、液体或固体，或其混合物。

如本文所用，术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”或“由核酸序列编码”(即，由多核苷酸序列编码，由核苷酸序列编码)指全长天然序列，如天然存在的蛋白质，以及功能子序列、修饰形式或序列变体，只要该自序列、修饰形式或变体保留了天然全长蛋白质的某种程度的功能。在本公开的方法和用途中，这种由核酸序列编码的多肽、蛋白质和肽可以但不要求与内源性蛋白质相同，所述内源性蛋白质在用基因治疗的受试者中是有缺陷的、或其表达不足或有缺陷的。

如本文所用，术语“预防”或“防止”是指特定疾病、病症或病况(例如卡纳万病(Canavan disease))的一个或多个体征或症状的发作延迟和/或频率和/或严重程度降低。在一些实施方案中，在人群基础上评估预防，使得如果在易感疾病、病症或病况的人群中观察到该疾病、病症或者病况的一个或多个体征或症状的发展、频率和/或强度在统计学上显著降低，则认为活性剂“预防”特定疾病、病症或病况。当疾病、病症或病况的发作延迟了预定的一段时间时，可以认为预防是完全的。

如本文所用，术语“重组”是指载体、多核苷酸(例如，重组核酸)、多肽或细胞，其是克隆、限制性或连接步骤(例如，涉及其中包含的多核苷酸或多肽)的各种组合，和/或产生与自然界中发现的产物不同的构建体的其他程序的产物。重组病毒或载体(例如rAAV载体、重组杆状病毒)包含载体基因组，其包含重组核酸(例如包含转基因和一种或多种调控元件的核酸)。所述术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制和原始病毒构建体的子代。

如本文所用，术语“受试者”是指生物体，例如哺乳动物(例如，人类、非人哺乳动物、非人灵长类动物、灵长类动物，实验动物、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、猫、狗)。在一些实施方案中，人类受试者是成人、青少年或儿科受试者。在一些实施方案中，受试者患有或易受疾病、病症或病况的影响。在一些实施方案中，易感受试者易患和/或表现出患疾病、病症或病况的风险增加(与在参考受试者或人群中观察到的平均风险相比)。在一些实施方案中，受试者表现出疾病、病症或病况的一种或多种症状。在一些实施方案中，受试者不表现出特定症状(例如，疾病的临床表现)或疾病、病症或病况的特征。在一些实施方案中，受试者不表现出疾病、病症或病症的任何症状或特征。在一些实施方案中，受试者是人类患者。例如，但不限于，受试者可能患有血友病(例如，血友病A或B)、杜氏肌营养不良(DMD)、威尔逊病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、遗传性血管水肿(HAE)、庞皮病或由MYBPC3突变引起的肥厚型心肌病。

如本文所用，术语“基本上”是指感兴趣特征或性质的全部或接近全部范围或程度的表现的定性条件。本领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行到完全或实现绝对结果。因此，本文使用术语“基本上”来捕捉许多生物和化学现象中固有的潜在的缺乏完整性。

如本文所用，术语“症状减轻”或“减轻症状”是指特定疾病、病症或病况的一个或多个症状在幅度(例如，强度、严重性等)和/或频率上减轻。为了清楚起见，延迟出现特定症状被认为是降低该症状频率的一种形式。

如本文所用，术语“治疗性多肽”是一种肽、多肽或蛋白质(例如，酶、结构蛋白、跨膜蛋白、转运蛋白)，其可以减轻或减少由靶细胞(例如，分离的细胞)或生物体(例如，受试者)中的蛋白缺失或缺陷引起的症状。由转基因编码的治疗性多肽或蛋白质是指给受试者带来益处(例如，纠正遗传缺陷，纠正与表达或功能相关的基因缺陷)的多肽或蛋白质。类似地，“治疗性转基因”是编码治疗性多肽的转基因。在一些实施方案中，在宿主细胞中表达的治疗性多肽是从转基因(即，已被引入宿主细胞的外源核酸)表达的酶。在一些实施方案中，治疗性多肽是野生型或功能性变体凝血因子、微小肌养蛋白、C1酯酶抑制剂、铜转运P型ATP酶(ATP7B)、铜锌超氧化物歧化酶1(SOD1)或肌球蛋白结合蛋白C3。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指施用后产生所需治疗效果的量。在一些实施方案中，该术语是指当根据治疗给药方案施用于患有或易感疾病、病症或病况的人群时足以治疗该疾病、病症或者病况的量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低疾病、病症和/或病况的一种或多种症状的发生率和/或严重程度和/或延迟其发作的量。本领域普通技术人员将理解，术语“治疗有效量”实际上并不要求在特定个体中实现成功的治疗。相反，治疗有效量可以是当施用于需要这种治疗的患者时在大量受试者中提供特定期望的药理学反应的量。

如本文所用，术语“转基因”是指用于递送到宿主细胞、靶细胞或生物体(例如，受试者)和/或在宿主细胞、靶细胞或生物体中表达的任何异源多核苷酸。这种“转基因”可以使用载体(例如rAAV载体、重组杆状病毒)递送到宿主细胞、靶细胞或生物体。转基因可以可操作地连接到控制序列，例如启动子。本领域技术人员将理解，可以基于促进转基因在宿主细胞、靶细胞或生物体中表达的能力来选择表达控制序列。通常，转基因可以可操作地连接到与该转基因在自然界中相关的内源性启动子，但更典型地，该转基因可操作地连接到该转基因在自然中不与之相关的启动子。转基因的一个例子是编码治疗多肽的核酸，例如凝血因子如因子VIII或因子IX，并且示例性启动子是在自然界中与编码因子VIII或IX的核苷酸不可操作连接的启动子。这种非内源性启动子可以包括最小的运甲状腺素蛋白启动子以及本领域已知的许多其它启动子。

可以通过本领域公知的多种技术(包括转染和转导)将感兴趣的核酸引入宿主细胞。

“转染”通常被称为一种在不使用病毒载体的情况下将外源核酸引入细胞的技术。如本文所用，术语“转染”是指在不使用病毒载体的情况下将重组核酸(例如，表达质粒)转移到细胞(例如，宿主细胞)中。导入重组核酸的细胞被称为“转染的细胞”。转染的细胞可以是包含用于产生重组AAV载体的表达质粒/载体的宿主细胞(例如CHO细胞、Pro10细胞、HEK293细胞、Sf9细胞)。在一些实施方案中，转染的细胞(例如，包装细胞)可包含含有转基因的质粒、包含AAV rep基因和AAV cap基因的质粒以及包含辅助基因的质粒。本领域已知许多转染技术，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、阳离子或阴离子脂质体以及与核定位信号结合的脂质体。

如本文所用，术语“转导”是指通过病毒载体将核酸(例如，载体基因组)转移到细胞(例如，rAAV载体转移到靶细胞，或重组杆状病毒将其异源核苷酸转移到昆虫细胞)。通过病毒或病毒载体引入转基因的细胞被称为“转导的细胞”。在一些实施方案中，转导的细胞是分离的细胞，并且转导发生在活体外。在一些实施方案中，转导的细胞是生物体(例如受试者)内的细胞，并且转导发生在体内。转导的细胞可以是已经被重组AAV载体转导的生物体的靶细胞，使得该生物体的靶细胞表达多核苷酸。

可以转导的细胞包括任何组织或器官类型或任何来源(例如中胚层、外胚层或内胚层)的细胞。细胞的非限制性实例包括肝脏(例如，肝细胞、窦状内皮细胞)、胰腺(例如，β-胰岛细胞、外分泌细胞)、肺、中枢或外周神经系统，例如大脑(例如，神经或室管膜细胞、少突胶质细胞)或脊椎、肾脏、眼睛(例如，视网膜)、脾脏、皮肤、胸腺、睾丸、肺、横膈膜、心脏(心脏)、肌肉或腰大肌或肠道(例如，内分泌)，脂肪组织(白色、棕色或米色)、肌肉(如成纤维细胞、肌细胞)、滑膜细胞、软骨细胞、破骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、唾液腺细胞、内耳神经细胞或造血(如血液或淋巴)细胞。其他实例包括干细胞，例如多能或多能祖细胞，其发育或分化为肝脏(例如肝细胞、窦状内皮细胞)、胰腺(例如β-胰岛细胞、外分泌细胞)、肺、中枢或外周神经系统(例如脑(例如神经或室管膜细胞、少突胶质细胞)或脊柱、肾脏、眼睛(例如视网膜)、脾脏、皮肤、胸腺、睾丸、肺、膈肌、心脏(心脏)、肌肉或腰大肌、或肠道(如内分泌)、脂肪组织(白色、棕色或米色)、肌肉(如成纤维细胞、肌细胞)、滑膜细胞、软骨细胞、破骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、唾液腺细胞、内耳神经细胞或造血(如血液或淋巴)细胞。

如本文所使用的，术语“治疗”(treat)、“治疗”(treating)或治疗(treatment)是指部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、延迟发作、降低特定疾病、病症和/或病况的严重性、和/或降低其一种或多种症状、特征和/或原因的发生率的疗法的施用。

如本文所用，术语“载体”是指质粒、病毒(例如rAAV、重组杆状病毒)、黏粒、杆粒或可通过插入或掺入核酸(例如重组核酸)来操纵的其他运载体(vehicle)。载体可用于各种目的，包括例如遗传操作(例如克隆载体)，将核酸引入/转移到细胞中，在细胞中转录或翻译插入的核酸。在一些实施方案中，载体核酸序列至少包含用于在细胞中繁殖的复制起点。在一些实施方案中，载体核酸包括异源核酸序列、表达控制元件(例如启动子、增强子)、选择性标记物(例如抗生素抗性)、聚腺苷(polyA)序列和/或ITR。在一些实施方案中，载体核酸包含AAV Cap表达盒和/或AAV Rep表达盒。在一些实施方案中，当递送到宿主细胞时，核酸序列被增殖。在一些实施方案中，当在体外或体内递送到宿主细胞时，细胞表达由异源核酸序列编码的多肽。在一些实施方案中，当递送到宿主细胞时，将核酸序列或核酸序列的一部分包装到衣壳中。宿主细胞可以是分离的细胞或宿主生物体内的细胞。除了编码多肽或蛋白质的核酸序列(例如，转基因)之外，额外的序列(例如调节序列)可以存在于同一载体内(即，对基因是顺式的)并位于基因侧翼。在一些实施方案中，调节序列可以存在于单独的(例如，第二)载体上，其反式作用以调节基因的表达。质粒载体在本文中可以称为“表达载体”。

在一些实施方案中，载体是昆虫细胞相容性载体(即，载体促进昆虫细胞用异源核酸的转导)。在一些实施方案中，昆虫细胞相容性载体是重组杆状病毒(例如，杆粒穿梭载体(Luckow，V.，et al.，J.Virol.674556-5791993)。重组杆状病毒优选能够在昆虫细胞如Sf9细胞和原核细胞如大肠杆菌中复制。可以使用任何含有BAC复制子的病毒杆状病毒。在一个特定的实施方案中，重组杆状病毒基因组是杆粒。可用于本文所述方法的合适的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾(多衣壳核型多角体病毒(AcMNPV)、家蚕(Bm)NPV、棉铃虫(Hear)NPV)或甜菜夜蛾(Se)MNPV。特别地，重组杆状病毒可以衍生自AcMNPV克隆C6(基因组序列：Genbank登录号NC_001623.1)或E2(Smith&amp；Summers，1979)。

如本文所用，术语“载体基因组”是指被包装或包壳以形成rAAV载体或重组杆状病毒的重组核酸序列。通常，载体基因组包括最初不存在于AAV或杆状病毒中的异源多核苷酸序列，例如转基因、调节元件、ITR。在使用重组质粒构建或制造重组载体(例如rAAV载体)的情况下，载体基因组不包括整个质粒，而是仅包括意在用于由病毒载体递送的序列。重组质粒的这一非载体基因组部分通常被称为“质粒骨架”，它对质粒的克隆、选择和扩增很重要，这是重组病毒载体生产增殖所需的过程，但它本身并没有被包装或包壳到rAAV载体中。

如本文所用，术语“病毒载体”通常指起核酸递送载体作用的病毒颗粒，其包括包装在病毒颗粒(即衣壳)内的载体基因组(例如，包括转基因而不是编码AAV rep和cap的核酸)，并且包括例如慢病毒和细小病毒，包括AAV血清型和变体(例如rAAV载体)。

AAV和rAAV载体

AAV

本公开涉及用于在昆虫细胞中产生rAAV载体的组合物和方法。如上所述，术语“腺相关病毒”和/或“AAV”是指具有线性单链DNA基因组的细小病毒及其变体。该术语涵盖所有亚型以及天然存在和重组形式，除非另有要求。包括AAV在内的细小病毒可用作基因治疗载体，因为它们可以穿透细胞并将核酸(如转基因)引入细胞核。在一些实施方案中，引入的核酸(例如rAAV载体基因组)形成环状多联体，其作为外泌体存在于转导细胞的细胞核中。在一些实施方案中，将转基因插入宿主细胞基因组中的特定位点，例如人类染色体19上的位点。与随机整合相反，位点特异性整合被认为可能导致可预测的长期表达谱。AAV在人类基因组中的插入位点被称为AAVS1。一旦被引入细胞，由核酸编码的多肽就可以被细胞表达。因为AAV与人类中的任何致病性疾病都不相关，所以由AAV递送的核酸可用于表达用于治疗人类受试者的疾病、病症和/或病况的治疗性多肽。

AAV的多种血清型存在于自然界中，迄今为止已从人类中鉴定出至少15种野生型血清型(即AAV1-AAV15)。通过具有在血清学上与其他AAV血清型不同的蛋白质衣壳来区分自然存在的血清型和变体血清型。AAV类型1(AAV1)、AAV类型2(AAV2)、AAV类型3(AAV3)，包括AAV类型3A(AAV3A)和AAV类型3B(AAV3B)、AAV类型4(AAV4)、AAV类型5(AAV5)、AAV类型6(AAV6)、AAV类型7(AAV7)、AAV类型8(AAV8)、AAV类型9(AAV9)、AAV类型10(AAV10)、AAV类型12(AAV12)、AAVrh10、AAVrh74(参见WO 2016/210170)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和羊AAV，以及重组产生的变体(例如，具有插入、缺失和取代等的衣壳变体)，例如称为AAV类型2i8(AAV2i8)、NP4、NP22、NP66、DJ、DJ/8、DJ/9、LK3、RHM4-1等的变体。“灵长类AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV。“牛AAV”指感染牛哺乳动物的AAV等等。血清型的区别是基于与另一种AAV相比，抗体与一种AAV之间缺乏交叉反应性来确定的。这种交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列和抗原决定簇的差异(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。然而，一些天然存在的AAV或人造的AAV突变体(例如，重组AAV)可能与目前已知的任何血清型都没有表现出血清学差异。然后，这些病毒可以被视为相应类型的亚群，或者更简单地说是变异AAV。因此，如本文所用，术语“血清型”是指血清学上不同的病毒，例如AAV，以及血清学上没有不同但可能在给定血清型的亚群或变体内的病毒，如AAV。

Marsic et al.(2014)Molecular Therapy 22(11):1900-1909，特别是补充图1提供了已知AAV血清型衣壳氨基酸序列的综合列表和比对。

AAV的各种血清型的基因组序列，以及天然末端重复序列(ITR)、rep蛋白和衣壳亚基的序列在本领域是已知的。这些序列可以在文献或公共数据库(如GenBank)中找到。参见，例如，GenBank登录号NC_002077(AAV1),AF063497(AAV1),NC_001401(AAV2),AF043303(AAV2),NC_001729(AAV3),NC_001863(AAV3B),NC_001829(AAV4),U89790(AAV4),NC_006152(AAV5),NC_001862(AAV6),AF513851(AAV7),AF513852(AAV8),和NC_006261(AAV8)；其公开内容通过引用并入本文。也参见例如Srivistava et al.(1983)J.Virology 45:555；Chiorini et al.(1998)J.Virology71:6823；Chiorini et al.(1999)J.Virology73:1309；Bantel-Schaal et al.(1999)J.Virology 73:939；Xiao et al.(1999)J.Virology 73:3994；Muramatsu et al.(1996)Virology 221:208；Shade et al.(1986)J.Virol.58:921；Gao et al.(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854；Moris et al.(2004)Virology 33:375-383；国际专利公开WO 00/28061,WO 99/61601,WO 98/11244；WO2013/063379；WO 2014/194132；WO 2015/121501,以及美国专利号6,156,303和美国专利号7,906,111。仅为了说明的目的，野生型AAV2包含AAV的小(20-25nm)二十面体病毒衣壳，其由具有重叠序列的三种蛋白质(VP1、VP2和VP3；总共60种衣壳蛋白质组成AAV衣壳)组成。蛋白质VP1(735a a；Genbank登录号AAC03780)、VP2(598aa；Genbank登录号AAC03778)和VP3(533aa；Genbank登录号AAC03779)以1:1:10的比例存在于衣壳中。也就是说，对于AAVs，VP1是全长蛋白，VP2和VP3是VP1的逐渐缩短的版本，N末端相对于VP1的截短程度增加。

重组AAV

如上所述，通过用非天然序列替换全部或部分内源性病毒基因组，将“重组腺相关病毒”或“rAAV”与野生型AAV区分开来。在病毒中掺入非天然序列将病毒载体定义为“重组”载体，因此定义为“rAAV载体”。rAAV载体可以包括编码所需蛋白质或多肽(如凝血因子)的异源多核苷酸(即转基因)。重组载体序列可以被包壳或包装到AAV衣壳中，称为“rAAV载体”、“rAAV载体颗粒”、“rAAV病毒颗粒”或简称“rAAV”。

对于rAAV载体的生产，所需的VP1∶VP2∶VP3的比例在约1:1:1至约1:1:100的范围内，优选在约1:1:2至约1:1:50的范围，更优选在约1:1:5至约1:1:20的范围。尽管所需的VP1∶VP2的比例为1:1，但VP1∶VP2的比例范围可以从1:50到50:1不等。

包含在rAAV载体中的转基因可以侧翼有至少一个，有时是两个AAV末端重复序列(例如，末端反向重复序列(ITR))。ITRs侧翼的转基因(本文也称为“载体基因组”)通常编码感兴趣的多肽或感兴趣的基因(“GOI”)，例如治疗性治疗的靶点(例如，编码凝血因子的核酸，例如用于治疗血友病A或B的因子VIII或因子IX)。向受试者(例如患者)递送或施用rAAV载体为受试者提供编码的蛋白质和肽。因此，rAAV载体可用于转移/递送用于表达的转基因，例如用于治疗各种疾病、病症和病况。

由转基因编码的蛋白质包括治疗性蛋白质。非限制性实例包括凝血因子(例如因子XIII、因子IX、因子X、因子VIII、因子VIIa或蛋白C)、微小肌养蛋白、C1酯酶抑制剂、铜转运P型ATP酶(ATP7B)、铜锌超氧化物歧化酶1(SOD1)、肌球蛋白结合蛋白C3(MYBPC3)、apoE2、精氨琥珀酸合成酶、酸性α-葡糖苷酶、β-葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、CI抑制剂丝氨酸蛋白酶抑制剂、CFTR(囊性纤维化跨膜调节蛋白)、抗体、视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)、红细胞生成素、LDL受体、脂蛋白脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶，β-珠蛋白、α-珠蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶(ADA)、金属转运蛋白(ATP7A或ATP7)、磺酰胺酶、参与溶酶体储存病(ARSA)的酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、β-25葡糖脑苷酯酶、鞘磷脂酶、溶酶体己糖胺酶、支链酮酸脱氢酶、激素、生长因子(例如胰岛素样生长因子1和2、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3和-4、脑源性神经营养因子、神经胶质源性生长因子、转化生长因子α和β等)、细胞因子(例如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-12、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、自杀基因产物(例如单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶、肿瘤坏死因子等)、耐药蛋白(例如对癌症治疗中使用的药物提供耐药性)、肿瘤抑制蛋白(例如p53、Rb、Wt-1、NF1、Von Hippel-Lindau(VHL)、腺瘤性结肠息肉病(APC))、具有免疫调节特性的肽、致耐受性或免疫原性肽或蛋白质Tregitopes、或hCDRl、胰岛素、葡萄糖激酶、鸟苷酸环化酶2D(LCA-GUCY2D)、Rab护送蛋白1(无脉络膜)、LCA5(LCA-Lebercilin)、鸟氨酸酮酸氨基转移酶(环状萎缩)、视网膜裂蛋白1(X-连锁视网膜劈裂症)、USH1C(Usher综合征1C)、X-连锁色素性视网膜炎GTP酶(XLRP)、MERTK(RP的AR形式：色素性视网膜炎)、DFNB 1(Connexin 26耳聋)、ACHM 2、3和4(全色盲)、PKD-1或PKD-2(多囊肾病)，导致溶酶体储存疾病的基因缺陷(例如，硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、组织蛋白酶A、GM2-AP、NPC1、VPC2、鞘酯激活蛋白等)、用于基因组编辑的一种或多种锌指核酸酶或用作基因组编辑的修复模板的供体序列。在一些实施方案中，所述转基因编码因子VIII。在一些实施方案中，所述转基因包含SEQ ID NO:9。

在一些实施方案中，包含在rAAV载体内的转基因在转录时产生转录物。这样的转录物可以是RNA，例如抑制性RNA(RNAi，例如小发夹或短发夹(sh)RNA、微小RNA(miRNA)、小干扰或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。

非限制性实例包括抑制以下基因表达的抑制性核酸：huntington(HTT)基因，一种与齿状核红核苍白球路易体萎缩症相关的基因(例如，萎缩蛋白1，ATN1)；脊髓延髓肌萎缩中X染色体上的雄激素受体、人共济失调蛋白-1、-2、-3和-7，Cav2.1 P/Q电压依赖性钙通道由(CACNA1A)编码、TATA结合蛋白、共济失调蛋白8相反链(也称为ATXN80S)、脊髓小脑性共济失调中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 55kDa调节亚单位Bβ同种型(1、2、3、6、7、8、12、17)、脆性X染色体综合征中的FMRl(脆性X染色体智力迟钝1)、FMR1(脆性X染色体智力迟钝2)或脆性XE智力迟钝中的AF4/FMR2家族成员2；强直性肌营养不良中的肌强直蛋白激酶(MT-PK)；弗氏共济失调中的共济蛋白；肌萎缩侧索硬化症中超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的突变体；参与帕金森病和/或阿尔茨海默病发病机制的基因；载脂蛋白B(APOB)和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)，高胆固醇血症；HIV Tat，在HIV感染中人类免疫缺陷病毒转录基因的反式激活子；HIV TAR、HIV TAR，在HIV感染中人类免疫缺陷病毒反式激活反应元件基因；在HIV感染中C-C趋化因子受体(CCR5)；在RSV感染中的劳斯肉瘤病毒(RSV)核衣壳蛋白，在丙型肝炎病毒感染中肝特异性微小核糖核酸(miR-122)；p53、急性肾损伤或延迟的移植物功能肾移植或肾损伤急性肾衰竭；在复发性或转移性实体恶性肿瘤中的蛋白激酶N3(PKN3)；LMP2，LMP2也称为蛋白酶体亚单位β9型(PSMB 9)，转移性黑色素瘤；LMP7，也称为蛋白酶体亚单位β8型(PSMB 8)，转移性黑色素瘤；MECL1，也称为蛋白酶体亚单位β10型(PSMB 10)，转移性黑色素瘤；实体瘤中的血管内皮生长因子(VEGF)；实体瘤中的驱动蛋白纺锤体蛋白、慢性粒细胞白血病中的凋亡抑制因子B细胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)；实体瘤中的核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)；实体瘤中的弗林蛋白酶；肝肿瘤中的polo样激酶1(PLK1)，丙型肝炎感染中的二酰甘油酰基转移酶1(DGAT1)，家族性腺瘤性息肉病中的β-连环蛋白；β2肾上腺素能受体，青光眼；RTP801/Reddl，也称为DAN损伤诱导型转录物4蛋白(在糖尿病黄斑水肿(DME)或年龄相关性黄斑变性中)；年龄相关性黄斑变性或脉络膜新生血管形成中的血管内皮生长因子受体I(VEGFR1)，非动脉性缺血性视神经病变中的胱天蛋白酶2；先天性甲肥厚中角蛋白6A N17K突变蛋白；流感感染中的甲型流感病毒基因组/基因序列；SARS感染中的严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒基因组/基因序列；呼吸道合胞病毒感染中的呼吸道合胞病毒基因组/基因序列；埃博拉病毒感染中的埃博拉丝状病毒基因组/基因序列；乙型和丙型肝炎感染中的乙型和丙型病毒基因组/基因序列；单纯疱疹病毒(HSV)感染中的HSV基因组/基因序列、柯萨奇病毒B3感染中的柯萨奇病毒B3基因组/基因序列；原发性张力失常中的基因致病性等位基因沉默(等位基因特异性沉默)，如torsin A(TOR1A)，移植中特异性泛I类和HLA等位基因；在常染色体显性遗传性视网膜色素变性(adRP)中的突变视紫红质基因(RHO)；或者所述抑制性核酸与任何前述基因或序列的转录物结合。

rAAV载体基因组通常在取代病毒rep和cap基因的异源核酸序列的顺式中保留145个碱基ITR。这样的ITR对于生产重组AAV载体是必要的；然而，修饰的AAV ITR和包括部分或完全合成序列的非AAV末端重复序列也可以用于此目的。ITR形成发夹结构，并起到例如在感染后作为宿主细胞介导的互补DNA链合成的引物的作用。ITRs也在病毒包装、整合等方面发挥作用。ITR是AAV基因组复制和包装到rAAV载体中顺式所需的唯一AAV病毒元件。rAAV载体基因组任选地包含两个ITR，其通常位于包含异源序列(例如，编码目的基因的转基因，或目的核酸序列，包括但不限于反义和siRNA、CRISPR分子等)的载体基因组的5’端和3’端。5’和3’ITR可以都包括相同的序列，或者每个可以包括不同的序列。AAV ITR可以来自任何AAV，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11或任何其他AAV。在一些实施方案中，ITR来源于AAV2。

本公开的rAAV载体可包含来自AAV血清型(例如，野生型AAV2、其片段或变体)的ITR，该ITR不同于衣壳的血清型(如，AAV1、AAV6、AAV8或Olig001)。这种包含来自一个血清型的至少一个ITR，但包含来自不同血清型的衣壳的rAAV载体可以称为杂交病毒载体(参见美国专利号7172893)。AAV ITR可以包括整个野生型ITR序列，或者是其变体、片段或修饰，但将保留功能性。

在一些实施方案中，rAAV载体基因组是线性的、单链的并且侧翼有AAV ITR。在异源基因的转录和翻译之前，大约4700个核苷酸的单链DNA基因组必须通过DNA聚合酶(例如，转导细胞内的DNA聚合酶)使用自启动ITR之一的游离3'-OH来启动第二链合成，从而转化为双链形式。在一些实施方案中，全长单链载体基因组(即，有义和反义)退火以产生全长双链载体基因组。当携带相反极性(即有义或反义)基因组的多个rAAV载体同时转导同一细胞时，可能会发生这种情况。无论它们是如何产生的，一旦形成双链载体基因组，细胞就可以转录和翻译双链DNA并表达异源基因。

来自rAAV载体的转基因表达的效率可能由于在表达之前需要将单链rAAV基因组(ssAAV)转化为双链DNA而受到阻碍。通过使用自互补AAV基因组(scAAV)来规避这一步骤，所述自互补AAV基因组可以包装反向重复基因组，所述反向重复基因组可以折叠成双链DNA，而不需要DNA合成或多个载体基因组之间的碱基配对(McCarty,(2008)Molec.Therapy16(10):1648-1656；McCarty et al.,(2001)Gene Therapy 8:1248-1254；McCarty et al.,(2003)Gene Therapy 10:2112-2118)。scAAV载体的一个限制是，要包装在衣壳中的独特转基因、调节元件和IRT的大小约为ssAAV载体基因组(即约4900个核苷酸，包括两个ITR)的一半大小(即约2500个核苷酸，其中2200个核苷酸可能是转基因和调节元件，加上约145个核苷酸ITR的两个拷贝)。

scAAV载体基因组是通过使用不包含末端解析位点(TRS)的核酸，或通过从包含载体基因组的载体(例如质粒)的一个rAAV ITR改变TRS，从而防止从该末端开始复制而制备的(参见美国专利号8,784,799)。宿主细胞内的AAV复制在scAAV载体基因组的野生型ITR处开始，并继续通过缺乏或包含改变的末端解析位点的ITR，然后返回基因组以产生互补链。因此，产生的互补性单个核酸分子是自互补性核酸分子，其导致在中间具有突变(未解析)ITR的载体基因组，并且在每一端具有野生型ITR。在一些实施方案中，缺乏TRS或包含改变的TRS的突变体ITR位于载体基因组的5’端。在一些实施方案中，缺乏TRS或包含未被解析(切割)的改变的TRS的突变体ITR位于载体基因组的3'端。

在不希望被理论束缚的情况下，虽然scAAV基因组的两半是互补的，但衣壳内不太可能存在实质性的碱基配对，因为许多碱基与内衣壳的氨基酸残基接触，并且磷酸根骨架朝向中心被隔离(McCarty，Molec.Therapy(2008)16(10):1648-1656)。很可能在解开外壳后，scAAV基因组的两半退火形成dsDNA发夹分子，一端有一个共价封闭的ITR，另一端有两个开放的ITR。ITR位于双链区的侧面，该双链区编码转基因及其顺式调控元件等。

本文所述方法中使用的rAAV载体的病毒衣壳可以来自野生型AAV或变体AAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAVrh74(参见WO2016/210170)、AAV12、AAV2i8、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、RHM4-1(WO 2015/01313的SEQ ID NO:5)、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9,45、AAV2i8、AAV29G、AAV2,8G9、AVV-LK03、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV、蛇AAV、山羊AAV、虾AAV、绵羊AAV及其变体(参见，例如Fields等人，VIROLOGY,，第2卷，第69章(第4版，Lippincott Raven出版社)。衣壳可以衍生自美国专利号7906111中公开的多种AAV血清型；Gao et al.(2004)J.Virol.78:6381；Morris et al.(2004)Virol.33:375；WO 2013/063379；WO 2014/194132；并且包括WO2015/121501中公开的真型AAV(AAV-TT)变体，以及WO 2015/013133中公开的RHM4-1、RHM15-1至RHM15-6及其变体。本领域技术人员将知道，可能还有其他尚未鉴定的AAV变体执行相同或相似的功能。AAV帽蛋白的完整互补体包括VP1、VP2和VP3。包含编码AAV VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF可包含少于AAV帽蛋白的完整互补体，或者可提供AAV帽蛋白质的完整互补体。本领域技术人员将知道，可能还有其他尚未鉴定的AAV变体执行相同或相似的功能。AAV帽蛋白的完整互补体包括VP1、VP2和VP3。包含编码AAV VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF可包含少于AAV帽蛋白的完整互补体，或者可提供AAV帽蛋白质的完整互补体。

在另一个实施方案中，本公开提供了祖先AAV载体用于治疗性体内基因治疗的用途。具体而言，可以从头合成计算机得出的序列，并对其生物活性进行表征。祖先序列的预测和合成，除了组装成rAAV载体之外，还可以使用WO 2015/054653(其内容通过引用并入本文)中描述的方法来完成。值得注意的是，与当代病毒或其部分相比，由祖先病毒序列组装的rAAV载体可能在人类群体中对预先存在的免疫表现出降低的易感性。

在一些实施方案中，包含由衍生自一种以上AAV血清型(例如，野生型AAV血清、变体AAV血清)的核苷酸序列编码的衣壳蛋白的rAAV载体被称为“嵌合载体”或“嵌合衣壳”(参见美国专利号6,491,907，其全部公开内容通过引用并入本文)。在一些实施方案中，嵌合衣壳蛋白由衍生自2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多AAV血清型的核酸序列编码。在一些实施方案中，重组AAV载体包括衍生自例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVrh74、AAVrh10、AAV2i8或其变体的衣壳序列，产生嵌合衣壳蛋白，所述嵌合衣壳蛋白包含来自任何前述AAV血清型的氨基酸的组合(参见Rabinowitz等人(2002)J.Virology 76(2):791-801)。或者，嵌合衣壳可以包含来自一种血清型的VP1、来自不同血清型的VP 2、来自另一种血清型的VP3及其组合的混合物。例如，嵌合病毒衣壳可以包括AAV1帽蛋白或亚基和至少一种AAV2帽蛋白或亚基。嵌合衣壳可以例如包括具有一个或多个B19帽亚基的AAV衣壳，例如AAV帽蛋白或亚基可以被B19帽蛋白或亚基取代。例如，在一个实施方案中，AAV衣壳的VP3亚基可以被B19的VP2亚基取代。

在一些实施方案中，嵌合载体已被工程化以表现出改变的向性或对特定组织或细胞类型的向性。术语“向性”是指病毒优先进入某些细胞或组织类型和/或与细胞表面的优先相互作用，从而促进进入某些细胞或组织类型。AAV向性通常由不同的病毒衣壳蛋白与其同源细胞受体之间的特异性相互作用决定(Lykken et al.(2018)J.Neurodev.Disord.10:16)。优选地，一旦病毒或病毒载体进入细胞，就表达载体基因组(例如rAAV载体基因组)携带的序列(例如异源序列，例如转基因)。

在一些实施方案中，本文所述方法中使用的rAAV载体的病毒衣壳可以来自野生型AAV或变体AAV，例如AAV1、AAV3a、AAV3b、AAV6或AAV8。

在一些实施方案中，rAAV载体可用于治疗或预防疾病、病症或病况。在一些实施方案中，疾病、病症或病况包括(但不限于)血友病(例如，血友病A或B)、杜氏肌营养不良(DMD)、威尔逊病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、遗传性血管水肿(HAE)、庞皮病或由MYBPC3突变引起的肥厚型心肌病。

方法和组合物

本公开涉及用于增强昆虫细胞中杆状病毒表达载体(BEV)系统中rAAV载体产生的组合物和方法。如前所述，在剪切的VP1和VP2蛋白水平与相对体外效价之间观察到负相关，其中体外效价随着剪切的VP2和VP1蛋白水平随感染后时间的增加而降低。在大规模生产(2000L)和小规模生产(2L、10L或200L)中都观察到剪切的VP1和VP2蛋白随感染后时间的增加以及伴随的体外效力的降低。

具体而言，鉴定出两种形式的剪切VP1和VP2蛋白。第一个剪切种类对应于野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间蛋白水解切割后残留的C端肽。第二个剪切的种类对应于VP1和VP2氨基酸残基之间蛋白水解切割后残留的C端肽，所述VP1和VP2氨基酸残基对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190。

因此，在一些方面，提供了一种生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法。该方法包括使昆虫细胞与一种或多种重组杆状病毒接触，每种杆状病毒包含异源序列；以及在合适的条件下培养昆虫细胞，培养时间足以产生在野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间或在另一种AAV血清型的VP1蛋白中的相应氨基酸之间具有不超过15％的剪切的rAAV载体。因此，该方法产生rAAV载体，其中不超过15％的病毒衣壳的总VP1蛋白在氨基酸残基Gly115和Arg116之间被剪切。

在一些方面，提供了一种生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法。该方法包括使昆虫细胞与一种或多种重组杆状病毒接触，每种杆状病毒包含异源序列；以及在合适的条件下培养昆虫细胞，培养时间足以产生在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切并且在对应于Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切的rAAV载体，或在另一AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的相应氨基酸具有各自相应剪切的rAAV载体。

本文还公开了提高重组腺相关病毒(AAV)载体体外效力的方法。所述方法包括使昆虫细胞与一种或多种重组杆状病毒接触，每种杆状病毒包含异源序列；以及在合适的条件下优化培养昆虫细胞的时间，使得rAAV载体的体外效力在10％-500％之间，在VP1蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间的剪切不超过15％。

在一些方面，提供了一种提高重组腺相关病毒(AAV)载体体外效力的方法。该方法包括使昆虫细胞与一种或多种重组杆状病毒接触，每种杆状病毒包含异源序列；以及优化在适当条件下培养昆虫细胞的时间，使得rAAV载体的体外效力在10％-500％之间，在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切并且在对应于Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的相应氨基酸具有各自相应剪切。

任何病毒性AAV衣壳(例如，野生型或变体)可用于本文所述的方法中，包括但不限于来自野生型AAV或变体AAV的衣壳，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAVrh74(参见WO2016/210170)、AAV12、AAV2i8、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、RHM4-1(WO 2015/01313的SEQ ID NO:5)、RHM15-1、RHM15-2、RHM15-3/RHM15-5、RHM15-4、RHM15-6、AAV hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9,45、AAV2i8、AAV29G、AAV2,8G9、AVV-LK03、AAV2-TT、AAV2-TT-S312N、AAV3B-S312N、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV、蛇AAV、山羊AAV、虾AAV、绵羊AAV及其变体(参见，例如Fields等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott RavenPublishers)。在一些实施方案中，衣壳衍生自AAV1、AAV3A、AAV3B、AAV6和/或AAV8。在一些实施方案中，衣壳来源于AAV6。

本领域技术人员可以基于各种AAV血清型的衣壳蛋白(VP1和VP2)的氨基酸序列的比较容易地确定，其中“对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基”，以及其中“对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基”将在任何给定AAV血清型的VP1或VP2衣壳蛋白中。还参见图5关于野生型AAV SEQ ID NO:1-5的比对，其提供野生型(天然存在的)血清型AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV3A(SEQ ID NO：2)、AAV3 B(SEQ ID NO:3)、AAV6(SEQ ID NO:4)和AAV8(SEQ ID NO:5)之间和中间的氨基酸位置。

在一些实施方案中，所产生的rAAV载体相对于VP1蛋白的总量在野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间或另一AAV血清型的VP1蛋白中的相应氨基酸之间具有不超过15％、不超过14％、不超过13％、不超过12％、不超过11％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％或不超过1％的剪切。在一些实施方案中，相对于VP1蛋白的总量，所产生的rAAV载体在野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间或在另一种AAV血清型的VP1蛋白中的相应氨基酸之间具有约12％至约15％的剪切。在一些实施方案中，相对于VP1蛋白的总量，所产生的rAAV载体在野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间，或在另一种AAV血清型的VP1蛋白中的相应氨基酸之间具有小于5％的剪切。在一些实施方案中，相对于VP1蛋白的总量，所产生的rAAV载体具有在野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间或另一种AAV血清型的VP1蛋白中的相应氨基酸之间的约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％或约5％的剪切。

在一些实施方案中，相对于VP1和VP2蛋白的总量，产生的rAAV载体在野生型AAV6的VP1和VP2氨基酸残基Gly189和Glu190之间或在另一种AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有不超过65％、不超过60％、不超过55％、不超过50％、不超过45％、不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过5％、不超过4％、不超过2％，或不超过1％的剪切。在一些实施方案中，相对于VP1和VP2蛋白的总量，所产生的rAAV载体在野生型AAV6的VP1和VP2氨基酸残基Gly189和Glu190之间，或在另一种AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有约30％至约60％的剪切。

在一些实施方案中，所产生的rAAV载体在野生型AAV6的VP1和VP2氨基酸残基Gly189和Glu190之间具有不超过40％的剪切，并且在野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间具有不超过2％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。

在一些实施方案中，所产生的rAAV载体在野生型AAV6的VP1和VP2氨基酸残基Gly189和Glu190之间具有不超过48％的剪切，并且在野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间具有不超过2.5％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。

在一些实施方案中，所产生的rAAV载体在野生型AAV6的VP1和VP2氨基酸残基Gly189和Glu190之间具有不超过52％的剪切，并且在野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间具有不超过11％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。

在一些实施方案中，所产生的rAAV载体在野生型AAV6的VP1和VP2氨基酸残基Gly189和Glu190之间具有不超过47％的剪切，并且在野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间具有不超过9％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。

在一些实施方案中，所产生的rAAV载体在野生型AAV6的VP1和VP2氨基酸残基Gly189和Glu190之间具有不超过43％的剪切，并且在野生型AAV6的VP1和VP2氨基酸残基Gly115和Arg116之间具有不超过9％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。

在一些实施方案中，所产生的rAAV载体在野生型AAV6的VP1和VP2氨基酸残基Gly189和Glu190之间具有不超过49％的剪切，并且在野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间具有不超过13％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。

在一些实施方案中，所产生的rAAV载体在野生型AAV6的VP1和VP2氨基酸残基Gly189和Glu190之间具有不超过37％剪切，并且在野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间具有不超过9％的剪切或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。

在一些实施方案中，将昆虫细胞培养足够的时间以产生在VP1和VP2蛋白上具有不超过75％的剪切的rAAV载体(即，对这两种种类观察到的总剪切不超过75％)。在一些实施方案中，所产生的rAAV在VP1和VP2蛋白上具有不超过70％、不超过65％、不超过60％、不超过55％、不超过50％、不超过45％、不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过5％、不超过4％、不超过2％或不超过1％的剪切。在一些实施方案中，所产生的rAAV在VP1和VP2蛋白上具有约35％至约55％的总剪切。

VP1和VP2蛋白上的剪切可以使用本领域公知的测定法来测定，例如但不限于毛细管凝胶电泳(CGE)、质谱法(包括多属性质谱法)和/或蛋白质印迹测定法。例如，基于蛋白水解消化和液相色谱-质谱法(LC-MS)的多属性方法(MAM)允许对产品质量属性进行同时、位点特异性的检测和定量(例如，见Zhang et al.MAbs.2020Jan-Dec；12(1):1783062)。该方法包括样品制备，包括变性、还原、烷基化、缓冲液交换)，然后进行胰蛋白酶消化。然后使用具有浅洗脱梯度的反相液相色谱(HPLC)分离得到的肽以生成肽图谱。HPLC还与高分辨率质谱仪耦合以阐明氨基酸修饰。定制的软件(如MassAnalyzer)可用于处理数据，以执行峰值检测、保留时间比对、峰值识别和量化。

类似地，毛细管凝胶电泳可用于分析衣壳蛋白纯度，其准确度、精密度和灵敏度大大提高(Zhang et al.Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate withLaser-Induced Fluorescence Detection As a Highly Sensitive and QualityControl-Friendly Method for Monitoring Adeno-Associated Virus Capsid ProteinPurity.Hum Gene Ther.2021Jan 22)。

“使昆虫细胞与一种或多种重组杆状病毒接触”包括将一种或几种重组杆状病毒引入到足够接近昆虫细胞的位置，以允许重组杆状病毒转导昆虫细胞。Urabe et al.(HumGene Ther 13:1935-43(2002)),Kotin et al.(US 2004/0197895)和Kohlbrenner(US2006/0166363)已经证明了昆虫细胞使用重组杆状病毒生产rAAV载体的可行性。任何允许AAV复制并可保持在培养物中的昆虫细胞都可用于本文所述的方法。例如，所使用的细胞系可以来自草地贪夜蛾，例如Sf9或Sf21细胞系、果蝇细胞系或蚊子细胞系，例如白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生的细胞系。昆虫细胞用于异源蛋白表达的用途，以及将核酸(例如载体，例如昆虫细胞相容性载体)引入这种细胞的方法和在培养中维持这种细胞的方法，都有很好的文献记载。参见，例如，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,ed.Richard,HumanaPress,NJ(1995)；O'Reilly et al.,BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS,A LABORATORYMANUAL,Oxford Univ.Press(1994)；Samulski et al.,J.Vir.63:3822-8(1989)；Kajigayaet al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing et al.,J.Vir.66:6922-30(1992)；Kirnbauer et al.,Vir.219:37-44(1996)；Zhao et al.,Vir.272:382-93(2000)；和Samulski et al.,U.S.Pat.No.6,204,059。优选的细胞系是草地贪夜蛾Sf9细胞系。

生产重组杆状病毒(例如，经修饰以包含异源核酸的杆状病毒)的方法在本领域是众所周知的，例如但不限于flashBAC、BACPAK6或bac到bac位点特异性转座系统(参见，例如，Kitts et al.(1990)Linearization of baculovirus DNA enhances the recoveryof recombinant virus expression vectors.Nucleic Acids Res.11(19),5667-72；Kitts et al.(1993)A method for producing recombinant baculovirus expressionvectors at high frequency.Biotechniques 14,810；and Anderson et al(1996)Newbaculovirus expression vectors for the purification of recombinant proteinsfrominsect cells.Focus 17,53)。在一些实施方案中，本文所述方法中使用的重组杆状病毒是纯化的重组杆状细胞病毒。在一些实施方案中，本文所述方法中使用的重组杆状病毒是重组杆状病毒感染的昆虫细胞(也称为BIIC)。

重组杆状病毒包含异源序列。异源序列可以包括编码AAV Rep蛋白(例如Rep78/68、Rep52/40)和/或AAV Cap蛋白(如VP1、VP2、VP3)的核酸序列。包含编码AAV Rep和/或AAVCap蛋白的核酸序列的杆状病毒称为辅助重组杆状病毒。异源序列还可以包括编码感兴趣的基因(例如转基因)的核酸序列，所述感兴趣的基因侧翼为两个AAV末端反向重复序列(ITR)。包含编码这种转基因的核酸序列的杆状病毒称为载体重组杆状病毒。

在一些实施方案中，昆虫细胞与三种重组杆状病毒接触——

(i)辅助重组杆状病毒，其包含编码AAV Rep蛋白的异源序列(例如Rep 78、Rep68、Rep 52和/或Rep 40)；

(ii)辅助重组杆状病毒，其包含编码AAV衣壳(帽)蛋白(例如AAV VP1、VP2和/或VP3蛋白)的异源序列；和

(iii)载体重组杆状病毒，其包含编码两侧有两个AAV末端反向重复序列(ITR)(一个在5'端，另一个在3'端)的转基因的异源序列。

在一些实施方案中，昆虫细胞与两种重组杆状病毒接触——

(i)辅助重组杆状病毒，其包含编码AAV Rep蛋白(例如Rep 78、Rep68、Rep 52和/或Rep 40)和AAV衣壳(帽)蛋白(例如AAV VP1、VP2和/或VP3蛋白)的异源序列；和

(ii)载体重组杆状病毒，其包含编码两侧有两个AAV末端反向重复序列(ITR)(一个在5'端，另一个在3'端)的转基因的异源序列。

如上所述，侧接ITRs的转基因通常编码感兴趣的多肽或感兴趣的基因(“GOI”)。由转基因编码的蛋白质包括治疗性蛋白质，例如但不限于凝血因子(例如因子XIII、因子IX、因子X、因子VIII、因子VIIa或蛋白质C)、微小肌养蛋白、C1酯酶抑制剂、铜转运P型ATP酶(ATP7B)、铜锌超氧化物歧化酶1(SOD1)、肌球蛋白结合蛋白C3、apoE2、精氨琥珀酸合酶、酸性α-葡糖苷酶、β-葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、CI抑制剂丝氨酸蛋白酶抑制剂、CFTR(囊性纤维化跨膜调节蛋白)、一种或多种用于基因组编辑的锌指核酸酶或用作基因组编辑的修复模板的供体序列。在一些实施方案中，所述转基因编码因子VIII。在一些实施方案中，因子VIII转基因的侧翼是AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述转基因包含SEQ ID NO:9。

“在合适的条件下培养细胞”是指在细胞培养基和允许生产rAAV载体的环境条件下培养昆虫细胞。合适条件的实例包括但不限于培养细胞的温度、细胞培养基的类型、加入重组杆状病毒的活细胞密度靶点、细胞培养基中溶解氧的量、辅助重组杆状病毒的量和/或方法中使用的载体重组杆状病毒的量。

在一些实施方案中，将昆虫细胞培养足够的时间以允许产生rAAV载体，所述rAAV载体在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间或另一AAV血清型的VP1蛋白中的对应氨基酸之间具有不超过15％的剪切。在一些实施方案中，将昆虫细胞培养足够的时间以允许产生rAAV载体，所述rAAV载体在对应于Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切以及在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切，或另一AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。

在一些实施方案中，足以允许产生在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基或另一AAV血清型的VP1蛋白中的对应氨基酸之间具有不超过15％的剪切的rAAV载体，或足以允许产生在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切且在对应于野生型AAV6和Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基间具有不超过15％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的对应氨基酸具有上述剪切的rAAV载体的时间为24小时、2天、3天，4天、4.1天、4.2天、4.3天、4.4天、4.5天、4.6天、4.7天、4.8天、4.9天、5天、5.1天、5.2天、5.3天、5.4天、5.5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些实施方案中，在从昆虫细胞回收rAAV载体之前，将昆虫细胞培养至少4.1天但不超过10天。在一些实施方案中，在从昆虫细胞回收rAAV载体之前，将昆虫细胞培养约4天、4.1天、4.2天、4.3天、4.4天、4.5天、4.6天、4.7天、4.8天、4.9天、5天、5.1天、5.2天、5.3天、5.4天或5.5天。在一些实施方案中，在从昆虫细胞回收rAAV载体之前，将昆虫细胞培养约96小时至约128小时。在一些实施方案中，在从昆虫细胞回收rAAV载体之前，将昆虫细胞培养约103小时至约163小时。在一些实施方案中，在从昆虫细胞回收rAAV载体之前，将昆虫细胞培养约108±5小时。

足以允许生产rAAV载体的时间(也称为“感染后时间”或“感染后批次持续时间”)是指重组杆状病毒与昆虫细胞接触和从昆虫细胞收获(即回收)rAAV载体之间的时间(即，通过本领域熟知的方法，如但不限于消化、过滤、离心、层析和/或病毒灭活步骤，从昆虫细胞中回收rAAV)。

“体外效力”是指通过本文所述方法产生的rAAV的体外(即在活生物体外)活性的测量。例如，可以根据rAAV载体的感染性、转基因表达和/或由转基因编码的蛋白质的功能来测量体外效力。测量rAAV载体体外效力的测定法在本领域是众所周知的，包括(但不限于)比色测定、显色测定、基于ELISA的测定、定量PCR和/或蛋白质印迹。

在一些实施方案中，使用比色测定法来测量rAAV载体的体外效力。测量包含编码凝血因子、因子VIII的转基因的rAAV载体的体外效力的比色测定的一个实例包括将肝癌细胞暴露于AAV，培养细胞数天，然后使用生色底物来量化收获的培养基中的因子VIII活性(图4)。

本公开提供了用于增加(即，改进、增强和/或优化)所产生的rAAV载体的体外效力的方法。这种体外效力的增加、改善、增强和/或优化可以相对于不是通过本文所述方法产生的rAAV载体的体外效力值来测量的。例如，通过本文所述方法产生的rAAV载体在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切，并且在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基具有不超过15％的剪切，或另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的对应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切，与在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有超过65％的剪切以及在对应于Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有超过15％的剪切，或另一AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切的rAAV载体相比，伴随的体外效力的增加、改善或增强。

如上所述，在本文所述的实施例中，数据证明了剪切的VP1/VP2蛋白水平与相对体外效力之间的负相关，其中体外效力随着剪切的VP2/VP2水平随感染后时间的增加而降低。在大规模生产(2000L)和小规模生产(2L、10L或200L)中都观察到剪切的VP1和VP2蛋白随感染后时间的增加以及伴随的体外效力的降低。观察到的剪切的VP1和VP2蛋白对应于两种形式——第一种剪切的种类对应于野生型AAV6的VP1氨基酸残基Gly115和Arg116之间蛋白水解切割后残留的C端肽，而第二个剪切种类对应于VP1和VP2氨基酸残基对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190之间蛋白水解切割后残留的C端肽。

文献(Zádori Z,Szelei J,Lacoste MC,Li Y,Gariépy S,Raymond P,Allaire M,Nabi IR,Tijssen P.A viral phospholipase A2 is required for parvovirusinfectivity.Dev Cell.2001；1(2):291-302；Girod A,Wobus CE,Zádori Z,Ried M,LeikeK,Tijssen P,Kleinschmidt JA,Hallek M.The VP1 capsid protein of adeno-associated virus type 2is carrying a phospholipase A2 domain required forvirus infectivity.J Gen Virol.2002；83(Pt 5):973-978.doi:10.1099/0022-1317-83-5-973)已经证明VP1蛋白对于AAV的感染性和体外效力是关键的，并且与野生型AAV相比，杆状病毒表达系统自然产生低水平的VP1。因此，剪切的VP1蛋白水平的看似微小的差异可能对体外效力产生重大影响。

VP1蛋白在感染性中的作用在AAV基因组的遗传分析早期就被认识到；缺乏VP1 N-末端区域的突变体产生正常水平的DNA复制和包壳，但低的病毒感染性(Hermonat PL,etal.Genetics of adeno-associated virus:isolation and preliminarycharacterization of adeno-associated virus type 2mutants.J Virol.1984；51(2):329-39)。VP1和VP2的N末端区域通常内化在AAV衣壳中，在2倍对称轴的内表面形成电子密集的球状结构(Kronenberg S,et al.Aconformational change in the adeno-associated virus type 2capsid leads to the exposure of hidden VP1 N termini.JVirol.2005；79(9):5296-303)。为了响应热休克，或与通过内体-溶酶体系统运输相关的酸化，这些N-末端延伸被挤出衣壳5倍对称轴处的孔，并展示在衣壳外部，以在病毒感染中执行基本功能。

AAV VP1 N-末端独特区最显著的特征是磷脂酶A2结构域(PLA2)，跨越氨基酸(aa)45-103，存在于所有细小病毒中。这种磷脂酶活性对于在病毒附着和内化到靶细胞中之后的内体逃逸是必需的(Zádori Z,et al.A viral phospholipase A2 is required forparvovirus infectivity.Dev Cell.2001；1(2):291-302；Girod A,et al.The VP1capsid protein of adeno-associated virus type 2is carrying a phospholipase A2domain required for virus infectivity.J Gen Virol.2002；83(Pt 5):973-978.)。

在AAV VP1 PLA2结构域内具有突变或缺失的衣壳保留附着到靶细胞和内化的能力，但对基因表达有缺陷(Girod A,et al.The VP1 capsid protein of adeno-associated virus type 2is carrying a phospholipase A2 domain required forvirus infectivity.J Gen Virol.2002；83(Pt 5):973-978)。在AAV6的氨基酸115和/或氨基酸189处的VP1蛋白的切割将导致磷脂酶A2结构域(PLA2)的损失，并由此导致感染性的损失。

除了PLA2结构域的关键功能之外，VP1和VP2 N-末端区域内的三簇碱性氨基酸已被证明对衣壳转运到细胞核中是必需的(Grieger JC,Snowdy S,Samulski RJ.Separatebasic region motifs within the adeno-associated virus capsid proteins areessential for infectivity and assembly.J Virol.2006；80(11):5199-210)。VP1的碱性区(BR)1(120QAKKRVL126)(SEQ ID NO:6)或BR2(140PGKKRPV146)(SEQ ID NO:7)的丢失分别使AAV的感染性降低4倍和10倍。存在于VP1和VP2的N-末端区域中的BR3(166PARKRLN172),(SEQ ID NO:8)的丢失导致载体感染性的完全丧失。这些关键区域在AAV血清型1至11中是保守的，并且由于AAV6的氨基酸115和116和/或氨基酸189和190之间的剪切而从裂解产物中的VP1和VP2中丢失，因此将导致体外效力降低。

虽然由于在氨基酸189处的切割而导致的VP1/VP2 N-末端区域的缺失被预测会降低感染性和转导效率，但预计它不会改变细胞类型和组织向性，这是由VP3公共区域内的表面可变区基序所控制的。大多数AAV血清型的主要细胞受体是聚糖，包括硫酸乙酰肝素、唾液酸或半乳糖，其结合与衣壳3倍对称轴相关的VP3可变区(Albright BH,Simon KE,PillaiM,Devlin GW,Asokan A.Modulation of Sialic Acid Dependence Influences theCentral Nervous System Transduction Profile of Adeno-associated Viruses.JVirol.2019；93(11)；Zhang R,Cao L,Cui M,Sun Z,Hu M,Zhang R,Stuart W,Zhao X,YangZ,Li X,Sun Y,Li S,Ding W,Lou Z,Rao Z.Adeno-associated virus 2bound to itscellular receptor AAVR.Nat Microbiol.2019；4(4):675-682)。

VP1和VP2的N-末端区域在感染的细胞附着阶段保留在衣壳内部，不参与这些相互作用。类似地，最近鉴定的大多数AAV血清型常见的次级受体AAVR和GPR108，也结合与三重对称轴相关的衣壳的外部结构元件(Albright BH,Simon KE,Pillai M,Devlin GW,AsokanA.Modulation of Sialic Acid Dependence Influences the Central Nervous SystemTransduction Profile of Adeno-associated Viruses.J Virol.2019；93(11)；Zhang R,Cao L,Cui M,Sun Z,Hu M,Zhang R,Stuart W,Zhao X,Yang Z,Li X,Sun Y,Li S,Ding W,Lou Z,Rao Z.Adeno-associated virus 2bound to its cellular receptor AAVR.NatMicrobiol.2019；4(4):675-682；Huang LY,Patel A,Ng R,Miller EB,Halder S,McKennaR,Asokan A,Agbandje-McKenna M.Characterization of the Adeno-Associated Virus1and 6Sialic Acid Binding Site.J Virol.2016；90(11):5219-5230)。

与VP3常见区域相比，结构紊乱的VP1和VP2 N-末端区域的存在或不存在通常对衣壳在3倍轴上的结构特征没有贡献(Agbandje-McKenna M,Kleinschmidt J.AAV capsidstructure and cell interactions.Methods Mol Biol.2011；807:47-92)。

虽然在氨基酸Gly189/Glu190处的剪切已在文献中作为杆状病毒组织蛋白酶(v-CATH)蛋白酶的切割位点发表(Galibert L,Savy A,Dickx Y,Bonnin D,Bertin B,Mushimiyimana I,van Oers MM,Merten OW.Origins of truncated supplementarycapsid proteins in rAAV8 vectors produced with the baculovirus system.PLoSOne.2018；13(11):e0207414)，但是在位置Gly115/Arg116处的剪切是未知的。此外，虽然Galibert等人(2018)和其他人(US2019/0054158)提出了防止rAAV载体感染性丧失的潜在解决方案，但没有认识到感染后的批次持续时间(即感染后的时间)会影响VP1/VP2的剪切和效力。

如上所述，可以根据rAAV载体的感染性、转基因表达和/或由转基因编码的蛋白质的功能来测量体外效力。因此，可以根据rAAV载体的感染性、转基因表达(例如通过定量PCR测定)或蛋白质功能(例如通过蛋白质印迹、基于Elisa的测定、比色测定或显色测定)来测量体外效力。在一些实施方案中，使用参考标准测定体外效力。例如，通过本文所述方法生产的任意选择批次的rAAV载体的体外效力值可以指定为参考标准，并设定为100％活性。通过本文所述方法生产的其他批次rAAV载体的体外效力可计算为相对于该参考标准的百分比。在一些实施方案中，未通过本文所述方法生产的任意选择批次的rAAV载体的体外效力值可指定为参考标准并设定为100％活性。通过本文所述方法生产的其他批次rAAV载体的体外效力可计算为相对于该参考标准的百分比。

在一些实施方案中，通过本文所述方法生产的rAAV载体与参考标准相比具有10％-500％的体外效力。在一些实施方案中，rAAV载体与参考标准相比具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200％的体外效力。在一些实施方案中，与参考标准相比，rAAV载体具有约50％至约150％的体外效力。在一些实施方案中，与参考标准相比，rAAV载体具有约70％至约130％的体外效力。在一些实施方案中，使用上文所述和图4所示的比色测定法测定体外效力。

在一些实施方案中，rAAV载体与参考标准相比，具有至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200％的体内效力。

“体内效力”是指通过本文所述方法产生的rAAV的体内(即活生物体内)活性的测量。体内效力可以在动物模型中测量。例如，可以根据rAAV载体的感染性、转基因表达和/或由转基因编码的蛋白质的功能来测量体内效力。测量rAAV载体体外效力的测定法在本领域是众所周知的，包括(但不限于)比色测定、显色测定、基于ELISA的测定、定量PCR和/或蛋白质印迹。

通常，通过测量衣壳蛋白或AAV基因组的量来确定产生的rAAV载体的量。然而，由于存在不包含整个载体基因组的空衣壳，优选基于病毒基因组(即基因组滴度)的定量。rAAV载体的临床给药通常基于每毫升载体基因组(vg)滴度，并且可以使用本领域已知的几种方法来确定，例如但不限于点印迹杂交(Samulski,R.J.,Chang,L.S.,and Shenk,T.(1989).Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses:normalintegration does not require viral gene expression.J.Virol.63,3822–3828)和Southern印迹(McCarty,M.(1946).Purification and properties ofdesoxyribonuclease isolated from beef pancreas.J.Gen.Physiol.29,123–139)，其不受构建体末端区二级结构的影响；紫外分光光度法(Sommer,J.M.,Smith,P.H.,Parthasarathy,S.,Isaacs,J.,Vijay,S.,Kieran,J.,et al.(2003).Quantification ofadeno-associated virus particles and empty capsids by optical densitymeasurement.Mol.Ther.7,122–128)和基于PicoGreen的荧光法(Piedra,J.,Ontiveros,M.,Miravet,S.,Penalva,C.,Monfar,M.,and Chillon,M.(2015).Development of arapid,robust,and universal picogreen-based method to titer adeno-associatedvectors.Hum.Gene Ther.Methods 26,35–42),ELISA Sondhi,D.,Peterson,D.A.,Giannaris,E.L.,Sanders,C.T.,Mendez,B.S.,De,B.,et al.(2005)。AAV2介导的CLN2基因转移到啮齿类动物和非人灵长类动物的大脑导致与LINCL治疗相容的长期TPP-I表达。GeneTher.12,1618–1632),和定量实时PCR(qPCR)(D’Costa,S.,Blouin,V.,Broucque,F.,Penaud-Budloo,M.,A.,Perez,I.C.,et al.(2016).Practical utilization ofrecombinant AAV vector reference standards:focus on vector genomes titrationby free ITR qPCR.Mol.Ther.Methods Clin.Dev.3:16019)。

在一些实施方案中，在从昆虫细胞回收rAAV载体之前测量的基因组滴度为至少1×10¹⁰个病毒基因组(vg)/ml。在一些实施方案中，在从昆虫细胞回收rAAV载体之前测量的基因组滴度为至少1×10¹⁰ _,2×10¹⁰,3×10¹⁰,4×10¹⁰,5×10¹⁰,6×10¹⁰,7×10¹⁰,8×10¹⁰,9×10¹⁰,或1×10¹¹个病毒基因组(vg)/ml。在一些实施方案中，在从昆虫细胞回收rAAV载体之前测量的基因组滴度为至少8×10¹⁰个病毒基因组(vg)/ml。

在一些实施方案中，从昆虫细胞回收rAAV载体后测量的基因组滴度为至少5×10⁹个病毒基因组(vg)/ml。在一些实施方案中，从昆虫细胞回收rAAV载体后测量的基因组滴度为至少5×10⁹,6×10⁹,7×10⁹,8×10⁹,9×10⁹,1×10¹⁰,2×10¹⁰,3×10¹⁰,4×10¹⁰,5×10¹⁰,6×10¹⁰,7×10¹⁰,8×10¹⁰,9×10¹⁰,或1×10¹¹个病毒基因组(vg)/ml。在一些实施方案中，从昆虫细胞回收rAAV载体后测量的基因组滴度为至少4×10¹⁰个病毒基因组(vg)/ml。

在一些实施方案中，通过定量聚合酶链式反应(qPCR)测量基因组滴度。

在本文描述的方法中，昆虫细胞在合适的条件和时间下培养，所述条件和时间允许产生在野生型AAV6的VP1蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切的rAAV载体或在VP1和VP2蛋白上的氨基酸残基189G和190E之间具有不超过65％的剪切和在氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切，或另一AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的相应氨基酸中所述剪切的rAAV载体。如上所述，合适的条件包括但不限于培养细胞的温度、细胞培养基的类型、加入重组杆状病毒的活细胞密度靶标、培养基中溶解氧的量、辅助重组杆状病毒量和/或方法中使用的载体重组杆状病毒的量。

特别地，确定昆虫细胞培养的温度、载体重组杆状病毒的量和溶解氧的量对体外效力有显著影响。一般来说，昆虫细胞的培养温度和载体重组杆状病毒的量与相对体外效力呈负相关，其中体外效力随着培养温度和载体重组杆状病毒量的增加而降低。溶解氧的量似乎与体外效力呈正相关，即体外效力随着溶解氧量的增加而增加。

在一些实施方案中，昆虫细胞在低于37℃的温度下培养。在一些实施方案中，昆虫细胞在低于30℃的温度下培养。在一些实施方案中，昆虫细胞在26℃和30℃之间的温度下培养。在一些实施方案中，昆虫细胞在27℃和29℃之间的温度下培养。在一些实施方案中，昆虫细胞在约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃或约31℃的温度下培养。在一些实施方案中，昆虫细胞在约27-28℃的温度下培养。在一些实施方案中，昆虫细胞在约28℃的温度下培养。

在一些实施方案中，与昆虫细胞接触的辅助重组杆状病毒的量相对于总培养体积在约0.0022-约0.0178％体积之间。在一些实施方案中，与昆虫细胞接触的辅助重组杆状病毒的量相对于总培养体积为约0.01％体积。

在一些实施方案中，与昆虫细胞接触的载体重组杆状病毒的量相对于总培养体积在约0.0022-约0.0178％体积之间。在一些实施方案中，与昆虫细胞接触的载体重组杆状病毒的量相对于总培养体积为约0.01％体积。

在一些实施方案中，辅助重组杆状病毒和/或载体重组杆状病毒是重组杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的形式。在一些实施方案中，纯化辅助重组杆状病毒和/或载体重组杆状病毒(即，从昆虫细胞中分离重组杆状病毒)。

在一些实施方案中，培养基中溶解氧的量为空气饱和度的约20％至约100％。溶解氧可以通过荧光传感器、光学探针或极谱探针进行测量，并以空气饱和度的百分比表示。在一些实施方案中，培养基中溶解氧的量为约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。在一些实施方案中，培养基中溶解氧的量在空气饱和度的约40％至50％之间。

在一些实施方案中，与昆虫细胞接触的载体重组杆状病毒的量相对于总培养体积为约0.01％体积。与昆虫细胞接触的辅助重组杆状病毒的量相对于总培养体积为约0.01％体积。培养基中溶解氧的量在空气饱和度的约40％至50％之间。昆虫细胞在约26-28℃的温度下培养约108±5小时，然后从昆虫细胞中回收rAAV载体。

昆虫细胞可以在任何合适的细胞培养基中培养，例如Sf-900 III SFM(ThermoFisher)、ExpiSf CD培养基(ThermoFisher)和Grace培养基(Sigma-Aldrich)。昆虫细胞可以在小于2L、至少2L、至少10L、至少250L或至少2000L的体积中培养。

任何能够产生rAAV载体的昆虫细胞都可以用于本文所述的方法。在一些实施方案中，昆虫细胞是草地贪夜蛾，例如Sf9或Sf21细胞系、果蝇细胞系或蚊子细胞系，例如白纹伊蚊衍生的细胞系。优选的细胞系是草地贪夜蛾Sf9细胞系。

昆虫细胞可以在悬浮培养物中生长，或者可以是贴壁的。在一些实施方案中，昆虫细胞在无血清培养基中生长或维持。在一些实施方案中，昆虫细胞在滚瓶或扩展滚瓶中生长或保持。在一些实施方案中，昆虫细胞在生物反应器中生长。在一些实施方案中，昆虫细胞在袋或瓶中生长。在一些实施方案中，昆虫细胞在WAVE生物反应器中生长。在一些实施方案中，昆虫细胞在搅拌釜生物反应器中生长。

如上所述，任何野生型或变体血清型的rAAV载体都可以通过本文所述的方法产生。通过本文所述的方法产生的rAAV载体的实例包括但不限于rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV3A、rAAV3B、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAVrh10、rAAVrh74、rAAV12、rAAV2i8、rAAV1.1、rAAV2.5、rAAV6.1、rAAV6.3.1、rAAV9.45、rAAV hu.26、rAAV1.1、rAAV2.5、rAAV6.1、rAAV6.3.1、rAAV2i8、rAAV29G、rAVV-LK03、rAAV2-TT、rAAV2-TT-S312N、和rAAV3B-S312N。在一些实施方案中，rAAV载体是rAAV1、rAAV3A、rAAV3B、rAAV6和/或rAAV8。在一些实施方案中，rAAV载体是rAAV6。

在一些实施方案中，rAAV载体包含PF-07055480(本文也称为“SB-525”)。PF-07055480/SB-525载体是rAAV2/6载体，其包含AAV6衣壳和AAV2 ITR序列，AAV2 ITR序列侧接连接到TTRm启动子的野生型或突变的Serpin1增强子，所述TTRm启动子可操作地连接到编码FVIII的多核苷酸(例如SEQ ID NO:9)。示例性载体序列在例如WO 2017/074526中进行了描述。示例性AAV2 5’ITR是:

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO:10)。

示例性AAV2 3’ITR是:

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG(SEQ ID NO:11)。

SEQ ID NO:12显示具有信号肽的人FVIII氨基酸序列:

MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY。

SEQ ID NO:12的信号肽部分是MQIELSCFFLCLLRFCFS(SEQ ID NO:13)，其在蛋白质分泌时被切割掉。

在一些实施方案中，示例性SERPIN1增强子是：

GGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGATCACCCCAGTTACCGGAGGAGCAAACAGGGACTAAGTTCACACGCGTGGTACC(SEQ ID NO:14)。

示例性TTRm启动子是：

GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTG(SEQ ID NO:15)。

FVIII的示例性编码序列是：

ATGCAGATCGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTGTTGAGATTCTGCTTCAGCGCCACC

AGGAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAGCTGAGCTGGGACTACATGCAGTCTGACCTGGGGGAG

CTGCCTGTGGATGCCAGGTTCCCCCCCAGAGTGCCCAAGAGCTTCCCCTTCAACACCTCTGTG

GTGTACAAGAAGACCCTGTTTGTGGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATTGCCAAGCCCAGG

CCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGCCCCACCATCCAGGCTGAGGTGTATGACACTGTGGTGATC

ACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGGGTGAGCTACTGGAAG

GCCTCTGAGGGGGCTGAGTATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAGAAGGAGGATGACAAGGTG

TTCCCTGGGGGCAGCCACACCTATGTGTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGCCCCATGGCCTCT

GACCCCCTGTGCCTGACCTACAGCTACCTGAGCCATGTGGACCTGGTGAAGGACCTGAACTCT

GGCCTGATTGGGGCCCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCAAGGAGAAGACCCAGACC

CTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTTGCTGTGTTTGATGAGGGCAAGAGCTGGCACTCTGAAACC

AAGAACAGCCTGATGCAGGACAGGGATGCTGCCTCTGCCAGGGCCTGGCCCAAGATGCACACT

GTGAATGGCTATGTGAACAGGAGCCTGCCTGGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAGTCTGTGTAC

TGGCATGTGATTGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCATCTTCCTGGAGGGCCACACC

TTCCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCCTGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACTGCC

CAGACCCTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTCCTGCTGTTCTGCCACATCAGCAGCCACCAGCAT

GATGGCATGGAGGCCTATGTGAAGGTGGACAGCTGCCCTGAGGAGCCCCAGCTGAGGATGAAG

AACAATGAGGAGGCTGAGGACTATGATGATGACCTGACTGACTCTGAGATGGATGTGGTGAGG

TTTGATGATGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAGCACCCCAAG

ACCTGGGTGCACTACATTGCTGCTGAGGAGGAGGACTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCC

CCTGATGACAGGAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGAGGATTGGCAGGAAG

TACAAGAAGGTCAGGTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACCAGGGAGGCCATCCAG

CATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCCTGCTGTATGGGGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATC

TTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAACATCTACCCCCATGGCATCACTGATGTGAGGCCC

CTGTACAGCAGGAGGCTGCCCAAGGGGGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCCATCCTGCCTGGG

GAGATCTTCAAGTACAAGTGGACTGTGACTGTGGAGGATGGCCCCACCAAGTCTGACCCCAGG

TGCCTGACCAGATACTACAGCAGCTTTGTGAACATGGAGAGGGACCTGGCCTCTGGCCTGATT

GGCCCCCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCTGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGAC

AAGAGGAATGTGATCCTGTTCTCTGTGTTTGATGAGAACAGGAGCTGGTACCTGACTGAGAAC

ATCCAGAGGTTCCTGCCCAACCCTGCTGGGGTGCAGCTGGAGGACCCTGAGTTCCAGGCCAGC

AACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTGTTTGACAGCCTGCAGCTGTCTGTGTGCCTGCAT

GAGGTGGCCTACTGGTACATCCTGAGCATTGGGGCCCAGACTGACTTCCTGTCTGTGTTCTTC

TCTGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTATGAGGACACCCTGACCCTGTTCCCCTTCTCT

GGGGAGACTGTGTTCATGAGCATGGAGAACCCTGGCCTGTGGATTCTGGGCTGCCACAACTCT

GACTTCAGGAACAGGGGCATGACTGCCCTGCTGAAAGTCTCCAGCTGTGACAAGAACACTGGG

GACTACTATGAGGACAGCTATGAGGACATCTCTGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATT

GAGCCCAGGAGCTTCAGCCAGAATCCACCCGTCCTTAAGCGCCATCAGCGCGAGATCACCAGG

ACCACCCTGCAGTCTGACCAGGAGGAGATTGACTATGATGACACCATCTCTGTGGAGATGAAG

AAGGAGGACTTTGACATCTACGACGAGGACGAGAACCAGAGCCCCAGGAGCTTCCAGAAGAAG

ACCAGGCACTACTTCATTGCTGCTGTGGAGAGGCTGTGGGACTATGGCATGAGCAGCAGCCCC

CATGTGCTGAGGAACAGGGCCCAGTCTGGCTCTGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTGGTGTTCCAG

GAGTTCACTGATGGCAGCTTCACCCAGCCCCTGTACAGAGGGGAGCTGAATGAGCACCTGGGC

CTGCTGGGCCCCTACATCAGGGCTGAGGTGGAGGACAACATCATGGTGACCTTCAGGAACCAG

GCCAGCAGGCCCTACAGCTTCTACAGCAGCCTGATCAGCTATGAGGAGGACCAGAGGCAGGGG

GCTGAGCCCAGGAAGAACTTTGTGAAGCCCAATGAAACCAAGACCTACTTCTGGAAGGTGCAG

CACCACATGGCCCCCACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCTGATGTG

GACCTGGAGAAGGATGTGCACTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAACACC

CTGAACCCTGCCCATGGCAGGCAGGTGACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCTTCACCATCTTT

GATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACTGAGAACATGGAGAGGAACTGCAGGGCCCCCTGCAAC

ATCCAGATGGAGGACCCCACCTTCAAGGAGAACTACAGGTTCCATGCCATCAATGGCTACATC

ATGGACACCCTGCCTGGCCTGGTGATGGCCCAGGACCAGAGGATCAGGTGGTACCTGCTGAGC

ATGGGCAGCAATGAGAACATCCACAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTGTTCACTGTGAGGAAG

AAGGAGGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTACCCTGGGGTGTTTGAGACTGTGGAGATG

CTGCCCAGCAAGGCTGGCATCTGGAGGGTGGAGTGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCTGGC

ATGAGCACCCTGTTCCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACCCCCCTGGGCATGGCCTCTGGC

CACATCAGGGACTTCCAGATCACTGCCTCTGGCCAGTATGGCCAGTGGGCCCCCAAGCTGGCC

AGGCTGCACTACTCTGGCAGCATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTCAGCTGGATCAAG

GTGGACCTGCTGGCCCCCATGATCATCCATGGCATCAAGACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTC

AGCAGCCTGTACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAGTGGCAGACC

TACAGGGGCAACAGCACTGGCACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAATGTGGACAGCTCTGGCATC

AAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCCAGATACATCAGGCTGCACCCCACCCACTAC

AGCATCAGGAGCACCCTGAGGATGGAGCTGATGGGCTGTGACCTGAACAGCTGCAGCATGCCC

CTGGGCATGGAGAGCAAGGCCATCTCTGATGCCCAGATCACTGCCAGCAGCTACTTCACCAAC

ATGTTTGCCACCTGGAGCCCCAGCAAGGCCAGGCTGCATCTGCAGGGCAGGAGCAATGCCTGG

AGGCCCCAGGTCAACAACCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAGACCATGAAGGTG

ACTGGGGTGACCACCCAGGGGGTGAAGAGCCTGCTGACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTG

ATCAGCAGCAGCCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAGAATGGCAAGGTGAAGGTG

TTCCAGGGCAACCAGGACAGCTTCACCCCTGTGGTGAACAGCCTGGACCCCCCCCTGCTGACCAGATACCTGAGGATTCACCCCCAGAGCTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACCTGTACTGA(SEQ ID NO:16)。

侧翼为末端反向重复序列的表达盒的示例性序列是：

GCGGCCTAAGCTTGGAACCATTGCCACCTTCAGGGGGAGGCTGCTGGTGA-50

ATATTAACCAAGATCACCCCAGTTACCGGAGGAGCAAACAGGGACTAAGT-100

TCACACGCGTGGTACCGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCG-150

ATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTACTTATTC-200

TCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGC-250

TTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCT-300

TCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGAAGAGGTAAGG-350

GTTTAAGTTATCGTTAGTTCGTGCACCATTAATGTTTAATTACCTGGAGC-400

ACCTGCCTGAAATCATTTTTTTTTCAGGTTGGCTAGTATGCAGATCGAGC-450

TCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTGTTGAGATTCTGCTTCAGCGCCACC-500

AGGAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAGCTGAGCTGGGACTACATGCAGTC-550

TGACCTGGGGGAGCTGCCTGTGGATGCCAGGTTCCCCCCCAGAGTGCCCA-600

AGAGCTTCCCCTTCAACACCTCTGTGGTGTACAAGAAGACCCTGTTTGTG-650

GAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCCCCCTGGAT-700

GGGCCTGCTGGGCCCCACCATCCAGGCTGAGGTGTATGACACTGTGGTGA-750

TCACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGG-800

GTGAGCTACTGGAAGGCCTCTGAGGGGGCTGAGTATGATGACCAGACCAG-850

CCAGAGGGAGAAGGAGGATGACAAGGTGTTCCCTGGGGGCAGCCACACCT-900

ATGTGTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGCCCCATGGCCTCTGACCCCCTG-950

TGCCTGACCTACAGCTACCTGAGCCATGTGGACCTGGTGAAGGACCTGAA-1000

CTCTGGCCTGATTGGGGCCCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCA-1050

AGGAGAAGACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTTGCTGTGTTT-1100

GATGAGGGCAAGAGCTGGCACTCTGAAACCAAGAACAGCCTGATGCAGGA-1150

CAGGGATGCTGCCTCTGCCAGGGCCTGGCCCAAGATGCACACTGTGAATG-1200

GCTATGTGAACAGGAGCCTGCCTGGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAGTCT-1250

GTGTACTGGCATGTGATTGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCAT-1300

CTTCCTGGAGGGCCACACCTTCCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCC-1350

TGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACTGCCCAGACCCTGCTGATGGAC-1400

CTGGGCCAGTTCCTGCTGTTCTGCCACATCAGCAGCCACCAGCATGATGG-1450

CATGGAGGCCTATGTGAAGGTGGACAGCTGCCCTGAGGAGCCCCAGCTGA-1500

GGATGAAGAACAATGAGGAGGCTGAGGACTATGATGATGACCTGACTGAC-1550

TCTGAGATGGATGTGGTGAGGTTTGATGATGACAACAGCCCCAGCTTCAT-1600

CCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACA-1650

TTGCTGCTGAGGAGGAGGACTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCCCCT-1700

GATGACAGGAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGAGGAT-1750

TGGCAGGAAGTACAAGAAGGTCAGGTTCATGGCCTACACTGATGAAACCT-1800

TCAAGACCAGGGAGGCCATCCAGCATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCCTG-1850

CTGTATGGGGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGC-1900

CAGCAGGCCCTACAACATCTACCCCCATGGCATCACTGATGTGAGGCCCC–1950

TGTACAGCAGGAGGCTGCCCAAGGGGGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCC-2000

ATCCTGCCTGGGGAGATCTTCAAGTACAAGTGGACTGTGACTGTGGAGGA-2050

TGGCCCCACCAAGTCTGACCCCAGGTGCCTGACCAGATACTACAGCAGCT-2100

TTGTGAACATGGAGAGGGACCTGGCCTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTG-2150

ATCTGCTACAAGGAGTCTGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGA-2200

CAAGAGGAATGTGATCCTGTTCTCTGTGTTTGATGAGAACAGGAGCTGGT-2250

ACCTGACTGAGAACATCCAGAGGTTCCTGCCCAACCCTGCTGGGGTGCAG-2300

CTGGAGGACCCTGAGTTCCAGGCCAGCAACATCATGCACAGCATCAATGG-2350

CTATGTGTTTGACAGCCTGCAGCTGTCTGTGTGCCTGCATGAGGTGGCCT-2400

ACTGGTACATCCTGAGCATTGGGGCCCAGACTGACTTCCTGTCTGTGTTC-2450

TTCTCTGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTATGAGGACACCCTGAC-2500

CCTGTTCCCCTTCTCTGGGGAGACTGTGTTCATGAGCATGGAGAACCCTG-2550

GCCTGTGGATTCTGGGCTGCCACAACTCTGACTTCAGGAACAGGGGCATG-2600

ACTGCCCTGCTGAAAGTCTCCAGCTGTGACAAGAACACTGGGGACTACTA-2650

TGAGGACAGCTATGAGGACATCTCTGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATG-2700

CCATTGAGCCCAGGAGCTTCAGCCAGAATCCACCCGTCCTTAAGCGCCAT-2750

CAGCGCGAGATCACCAGGACCACCCTGCAGTCTGACCAGGAGGAGATTGA-2800

CTATGATGACACCATCTCTGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTTGACATCT-2850

ACGACGAGGACGAGAACCAGAGCCCCAGGAGCTTCCAGAAGAAGACCAGG-2900

CACTACTTCATTGCTGCTGTGGAGAGGCTGTGGGACTATGGCATGAGCAG-2950

CAGCCCCCATGTGCTGAGGAACAGGGCCCAGTCTGGCTCTGTGCCCCAGT-3000

TCAAGAAGGTGGTGTTCCAGGAGTTCACTGATGGCAGCTTCACCCAGCCC-3050

CTGTACAGAGGGGAGCTGAATGAGCACCTGGGCCTGCTGGGCCCCTACAT-3100

CAGGGCTGAGGTGGAGGACAACATCATGGTGACCTTCAGGAACCAGGCCA-3150

GCAGGCCCTACAGCTTCTACAGCAGCCTGATCAGCTATGAGGAGGACCAG-3200

AGGCAGGGGGCTGAGCCCAGGAAGAACTTTGTGAAGCCCAATGAAACCAA-3250

GACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCCACCAAGGATGAGT-3300

TTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGAT-3350

GTGCACTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAACACCCT-3400

GAACCCTGCCCATGGCAGGCAGGTGACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCT-3450

TCACCATCTTTGATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACTGAGAACATGGAG-3500

AGGAACTGCAGGGCCCCCTGCAACATCCAGATGGAGGACCCCACCTTCAA-3550

GGAGAACTACAGGTTCCATGCCATCAATGGCTACATCATGGACACCCTGC-3600

CTGGCCTGGTGATGGCCCAGGACCAGAGGATCAGGTGGTACCTGCTGAGC-3650

ATGGGCAGCAATGAGAACATCCACAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTGTT-3700

CACTGTGAGGAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTACC-3750

CTGGGGTGTTTGAGACTGTGGAGATGCTGCCCAGCAAGGCTGGCATCTGG-3800

AGGGTGGAGTGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCTGGCATGAGCACCCT-3850

GTTCCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACCCCCCTGGGCATGGCCTCTG-3900

GCCACATCAGGGACTTCCAGATCACTGCCTCTGGCCAGTATGGCCAGTGG-3950

GCCCCCAAGCTGGCCAGGCTGCACTACTCTGGCAGCATCAATGCCTGGAG-4000

CACCAAGGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCCATGA-4050

TCATCCATGGCATCAAGACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCAGCAGCCTG-4100

TACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAGTGGCA-4150

GACCTACAGGGGCAACAGCACTGGCACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAATG-4200

TGGACAGCTCTGGCATCAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCC-4250

AGATACATCAGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCAGGAGCACCCTGAG-4300

GATGGAGCTGATGGGCTGTGACCTGAACAGCTGCAGCATGCCCCTGGGCA-4350

TGGAGAGCAAGGCCATCTCTGATGCCCAGATCACTGCCAGCAGCTACTTC-4400

ACCAACATGTTTGCCACCTGGAGCCCCAGCAAGGCCAGGCTGCATCTGCA-4450

GGGCAGGAGCAATGCCTGGAGGCCCCAGGTCAACAACCCCAAGGAGTGGC-4500

TGCAGGTGGACTTCCAGAAGACCATGAAGGTGACTGGGGTGACCACCCAG-4550

GGGGTGAAGAGCCTGCTGACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATCAG-4600

CAGCAGCCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAGAATGGCAAGG-4650

TGAAGGTGTTCCAGGGCAACCAGGACAGCTTCACCCCTGTGGTGAACAGC-4700

CTGGACCCCCCCCTGCTGACCAGATACCTGAGGATTCACCCCCAGAGCTG-4750

GGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGG-4800

ACCTGTACTGAGGATCCAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGT-4850

GTTGGTTTTTTGTGTGTTTTCCTGTAACGATCGGGCTCGAGCGC

(SEQ ID NO:9)。

SEQ ID NO:9包含(从5’至3’)绝缘体(间隔区)序列Ins1(SEQ ID NO:9的nt 14-32)、Serpin1增强子CRMSBS2(SEQ ID NO:9的nt 33-104)，反甲状腺素最小启动子TTRm(SEQID NO:9的nt 117-339)、SBR内含子3(SEQ ID NO：9的nt 340-432)、FVIII编码序列hF8-BDD(SEQ ID NO:9的438-4811)、SPA51合成多聚A序列(SEQ ID NO:9的nt 4818-4868)和绝缘体序列Ins3(SEQ ID NO:9的nt4869-4885)，如PCT公开号WO 2017/074526中所述。

在一些实施方案中，提供了生产包含凝血因子VIII的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体的方法。该方法包括(i)使Sf9细胞与一种或两种辅助性重组杆状病毒接触，每种辅助性重组杆状病毒包含编码AAV6 Rep蛋白和/或AAV6 Cap蛋白的异源序列，以及与载体重组杆状病毒接触，所述载体重组杆状病毒包含编码两个AAV2末端反向重复序列(ITR)之间的凝血因子VIII的异源序列；和ii)在合适的条件下培养Sf9细胞108±5小时，以产生在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切的rAAV6载体。

在一些实施方案中，提供了生产包含凝血因子VIII的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体的方法。该方法包括(i)使Sf9细胞与一种或两种辅助性重组杆状病毒接触，每种辅助性重组杆状病毒包含编码AAV6 Rep蛋白和/或AAV6 Cap蛋白的异源序列，以及与载体重组杆状病毒接触，所述载体重组杆状毒体包含编码两个AAV2末端反向重复序列(ITR)之间的凝血因子VIII的异源序列；和(ii)在合适的条件下培养Sf9细胞108±5小时，以产生rAAV6载体，其在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切，并且在对应于Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切。

在一些实施方案中，提供了生产包含凝血因子VIII的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体的方法。该方法包括(i)使Sf9细胞与一种或两种辅助性重组杆状病毒接触，每种辅助性重组杆状病毒包含编码AAV6 Rep蛋白和/或AAV6 Cap蛋白的异源序列，以及与载体重组杆状病毒接触，所述载体重组杆状毒体包含编码两个AAV2末端反向重复序列(ITR)之间的凝血因子VIII的异源序列；和(ii)在合适的条件下培养Sf9细胞108±5小时，以产生rAAV6载体，该载体的体外效力与参考标准相比在50-150％之间，所述参考标准在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间的剪切不超过15％。

在一些实施方案中，提供了生产包含凝血因子VIII的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体的方法。该方法包括(i)使Sf9细胞与一种或两种辅助性重组杆状病毒接触，每种辅助性重组杆状病毒包含编码AAV6 Rep蛋白和/或AAV6 Cap蛋白的异源序列，以及与载体重组杆状病毒接触，所述载体重组杆状毒体包含编码两个AAV2末端反向重复序列(ITR)之间的凝血因子VIII的异源序列；和(ii)在合适的条件下培养所述Sf9细胞108±5小时以产生rAAV6载体，所述载体具有与参考标准相比在50-150％之间的体外效力，其中所述参考标准在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切，并且在对应于Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切。

此外，本文公开了包含纯化的重组腺相关病毒(rAAV)载体的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含rAAV载体，所述rAAV载体在野生型AAV6的VP1蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间或另一AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有不超过15％的剪切。在一些实施方案中，所述组合物包含rAAV载体，所述rAAV载体在野生型AAV6的VP1和VP2蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切，并且在氨基酸残基189G和190E之间具有不超过65％的剪切，或者在另一AAV血清型的VP1或VP2蛋白中相应的氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。VP1和VP2蛋白上的剪切可以通过毛细管凝胶电泳(CGE)、质谱(包括多属性质谱)和/或蛋白质印迹测定来测量。

如本文所公开的，rAAV载体可以是任何野生型或变体血清型，包括但不限于rAAV1、rAAV3a、rAAV3b、rAAV6或rAAV8。在一些实施方案中，rAAV载体包含编码治疗多肽的转基因，所述治疗多肽例如但不限于野生型或功能性变体凝血因子、微小肌养蛋白、C1酯酶抑制剂、铜转运P型ATP酶(ATP7B)、铜锌超氧化物歧化酶1(SOD1)或肌球蛋白结合蛋白C3。在一些实施方案中，野生型功能性变体凝血因子是因子VII、因子VIII或因子IX。在一些实施方案中，野生型或功能性变体凝血因子是因子VIII。

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含与参考标准相比体外效力为至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200的rAAV载体。如本文所述，可以使用比色测定法、显色测定法或基于ELISA的测定法来测量体外效力。

在一些实施方案中，本文所述的组合物包含具有与参考标准相比体内效力为至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200％的rAAV载体。体内效力可以在动物模型中测量。

在一些方面，提供了包含纯化的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体的组合物。rAAV载体包含编码野生型或功能性变体凝血因子VIII的转基因，其与参考标准相比具有约10％-500％的体外效力，所述参考标准在VP1蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切。

在一些方面，提供了包含纯化的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体的组合物。rAAV载体包含编码野生型或功能性变体凝血因子VIII的转基因，其与参考标准相比具有约10％-500％的体外效力，所述参考标准在VP1和VP2蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切，在氨基酸残基189G和190E之间具有不超过65％的剪切。

在一些实施方案中，本文所述的组合物是药物组合物。药物组合物可包含纯化的重组腺相关病毒(rAAV)载体，其在VP1蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切，或rAAV载体，其在野生型AAV6的VP1和VP2蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切且在氨基酸残基189G和190E之间具有不超过65％的剪切，或在另一种AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切，以及药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的rAAV6载体和药学上可接受的载体，所述载体包含编码因子VIII的核酸序列(例如，SEQ ID NO:9)。rAAV6载体在VP1蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切，或者rAAV6载体，其在野生型AAV6的VP1和VP2蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切，并且在氨基酸残基189G和190E之间具有不超过65％的剪切，或在另一种AAV血清型的VP1和VP2蛋白中的相应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂、赋形剂和/或其他药物。药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂、赋形剂或其他药物是在生物学上或在其他方面不是不希望的，例如，该材料可以给药于受试者而不会引起超过该材料的有利生物效应的不希望的生物效应。

任何合适的药学上可接受的载体或赋形剂都可用于制备本发明的药物组合物(参见例如Remington the Science and Practice of Pharmacy，Alfonso R.Gennaro(编辑)Mack Publishing Company，1997年4月)。

药物组合物通常是无菌的、无热原的并且在制造和储存条件下是稳定的。药物组合物可以配制为溶液(例如，水、盐水、葡萄糖溶液、缓冲溶液或其他药物无菌流体)、微乳液、脂质体或其他适合于容纳高产物(例如，病毒载体颗粒、微粒或纳米颗粒)浓度的有序结构。在一些实施方案中，将包含本公开的rAAV载体的药物组合物配制在水或缓冲盐水溶液中。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可以保持适当的流动性，例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，在分散的情况下通过保持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂。在一些实施方案中，可能优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可注射组合物的长时间吸附可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来实现。在一些实施方案中，本公开的rAAV载体可以在控释制剂中给药，例如在包括缓释聚合物或保护产品免受快速释放的其他载体的组合物中给药(包括植入物和微胶囊化递送系统)。

在一些实施方案中，本公开的药物组合物是肠胃外药物组合物，包括适用于静脉内、动脉内、皮下、皮内、腹膜内、肌内、关节内、脑实质内(IP)、鞘内(IT)、脑室内(ICV)和/或小脑延髓池内(ICM)给药的组合物。在一些实施方案中，配制包含rAAV载体的药物组合物用于通过IV注射施用，所述rAAV载体包含编码因子VIII的经修饰的核酸。

等同方案

前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践本公开。上述描述和实施例详细描述了本公开的某些示例性实施方案。然而，应当理解，无论前述内容在文本中表现得多么详细，本公开可以以多种方式实践，并且本公开应当根据所附权利要求及其任何等同方案来解释。

在此引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中引用的参考文献，在其尚未引用的范围内，通过引用的方式全部并入本文。

实施例

参照以下实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅用于说明目的，除非另有规定，否则不旨在进行限制。因此，本发明不应以任何方式被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文所提供的教导而变得明显的任何和所有变型。

实施例1：体外效力和感染后批次持续时间之间的关系

使用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中产生rAAV载体，称为PF-07055480(本文也称为“SB-525”)。将来自细胞库的细胞扩增到2000L生产生物反应器中，然后用携带rep、cap(辅助主杆状病毒感染的昆虫细胞或MBIIC)和侧翼为末端反向重复序列的因子VIII基因(载体主杆状病毒病毒感染的昆虫细胞或MBIIC)的重组杆状病毒共感染。细胞培养过程在生产生物反应器中持续几天，直到收获，然后消化、过滤和纯化以产生药物物质。

然后通过包括病毒感染性、基因表达和蛋白质功能的体外效价测定来测试药物样品(图4)。简言之，将肝癌细胞暴露于AAV，允许其培养数天，然后使用发色底物来量化收获的培养基中的因子VIII活性。

图1中的结果表明，在103小时至163小时的观察范围内，体外效力随着感染后(即，与重组杆状病毒接触后)的批次持续时间而降低。

在2L生物反应器中进行的小规模实验中证实了该结果，如在实施例3中描述的图6中详细说明的。

实施例2：鉴定VP1和VP2剪切可能是体外效力降低的根本原因

由于观察到的体外效价的变化，进行了额外的研究，以从过程和分析的角度了解体外效力值变化的潜在驱动因素。质谱(MS)研究鉴定了一个似乎与体外效力相关的属性。该属性是VP1/VP2蛋白的一种剪切形式，使用同时评估多个属性的LC/MS–肽映射方法(称为多属性方法或MAM)进行量化。这种被剪切的种类已被鉴定为在VP1和VP2蛋白上的氨基酸残基¹⁸⁹G和¹⁹⁰E之间进行蛋白水解切割后残留的C末端肽。来自VP1或VP2的N-末端肽是不可检测的，并且被认为在制造过程中被清除。如图2和表1所示，数据显示了剪切的VP1/VP2蛋白水平与相对效力之间的负相关性。

表1：感染后批次持续时间和所选产品质量属性的汇总数据

数据证明了剪切的VP1/VP2蛋白水平与相对体外效力之间的负相关，其中体外效力随着剪切的VP2/VP2水平的增加而降低。

实施例3：细胞培养温度、溶解氧、重组杆状病毒的量和感染后的批次持续时间对体外效力的影响

在2L生物反应器中构建并执行统计学设计的实验，以确定rAAV载体PF-07055480(本文也称为“SB-525”)生产中有影响的工艺参数。特别是，在本实验中研究了工艺参数，包括生产生物反应器中的细胞培养温度、溶解氧水平、重组杆状病毒的量和感染后的批次持续时间对rAAV载体属性(包括体外效力)的影响。

简言之，将Sf9细胞连续传代并扩增以接种2L生产生物反应器。在达到目标细胞密度后，加入以主杆状病毒感染的昆虫细胞(MBIIC)形式保存的重组杆状病毒以启动AAV的产生。培养持续一段确定的时间，之后收获、澄清和部分纯化。收集部分纯化的AAV产物的体外效力数据。

基于实验数据，在本实施例中总结了这些参数与体外效力之间的预测关系。

实验设计与数据分析

中心复合设计是响应表面建模的常用设计之一，它允许估计因子相互作用和二次项。本研究采用分辨率为V的最小分数阶乘设计。在划分为几个区块的总共60次运行中研究了6个因素。

考虑到软件(设计专家)建议的模型、不匹配、调整后的R²以及其他模型诊断(包括数值和视觉诊断)，进行了模型构建和模型简化。模型拟合还包括残差图、实际图与预测图的检查以及数据转换的考虑。p值的显著性水平截止值选择为0.05。

在从2L生物反应器的部分纯化材料测量的体外效力值与从2000L生物反应器生产的原料药的体外效力值中观察到一致的偏移量，因此，建立了线性回归模型来转换以下模型中的数据，以反映原料药的预期值。

实验设计和数据分析在版本11.0.6.0的Design Expert软件中进行。

体外效力结果

如图6所示，该研究证实了感染后的批次持续时间与效力之间的负相关，因为效力作为批次持续时间的函数而降低。对于载体MBIC添加体积相对于培养体积的比率和体外效力也观察到负相关。观察到辅助MBIC添加体积相对于培养体积的比率和体外效力的正相关。观察到温度的二次效应，而效力的最佳温度在27-28摄氏度之间，并且效力随着温度偏离最佳温度而降低。观察到溶解氧与体外效力呈正相关。

等同方案

前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本公开。上述描述和实施例详细描述了本公开的某些示例性实施方案。然而，应当理解，无论前述内容在文本中表现得多么详细，本公开可以以多种方式实施，并且本公开应当根据所附权利要求及其任何等同方案来解释。

Claims

1.一种提高重组腺相关病毒(AAV)载体体外效力的方法，包括：

优化在合适条件下培养昆虫细胞的时间，使得rAAV载体的体外效力与参考标准相比在10％-500％之间，其中所述参考标准在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切，并且在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的对应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。

2.权利要求1所述的方法，其中所述rAAV载体在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有约30％到约60％的剪切，并且在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过5％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的对应氨基酸之间具有所述各自百分比的剪切。

3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中通过毛细管凝胶电泳(CGE)、质谱法(包括多属性质谱法)和/或蛋白质印迹测定法来测量VP1和VP2蛋白上的剪切。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中与参考标准相比，所述rAAV载体的体外效力在50％和150％之间。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中使用比色测定、显色测定、基于ELISA的测定、定量PCR和/或蛋白质印迹来测量体外效力。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中在从昆虫细胞回收rAAV载体之前将昆虫细胞培养约96小时至约128小时，或在从昆虫细胞回收rAAV载体之前将昆虫细胞培养约108±5小时。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞与以下杆状病毒接触：

(i)一种或两种辅助重组杆状病毒，每种杆状病毒包含编码AAV Rep蛋白和/或AAV Cap蛋白的异源序列，以及

8.权利要求7的方法，其中培养产生rAAV载体的昆虫细胞的合适条件包括：

(i)培养昆虫细胞的温度，

(ii)与昆虫细胞接触的辅助重组杆状病毒的量，

(iii)与昆虫细胞接触的载体重组杆状病毒载体的量，和/或

(iv)细胞培养基中溶解氧的量，

所述rAAV载体在野生型AAV6的VP1蛋白上的氨基酸残基189G和190E之间具有不超过65％的剪切和氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的对应氨基酸之间具有上述各自百分比的剪切。

9.权利要求8所述的方法，其中所述昆虫细胞在约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃或约31℃的温度下培养。

10.权利要求8-9中任一项的方法，其中与昆虫细胞接触的辅助重组杆状病毒的量相对于总培养体积在约0.0022％至约0.0178％体积之间。

11.权利要求8-10中任一项的方法，其中与昆虫细胞接触的载体重组杆状病毒的量相对于总培养体积在约0.0022％至约0.0178％体积之间。

12.权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述培养基中溶解氧的量为空气饱和度的约20％至约100％。

13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞、Sf21细胞或Hi5细胞。

14.权利要求7-13中任一项的方法，其中所述转基因编码野生型或功能性变体凝血因子、微小肌养蛋白、C1酯酶抑制剂、铜转运P型ATP酶(ATP7B)、铜锌超氧化物歧化酶1(SOD1)或肌球蛋白结合蛋白C3。

15.权利要求14所述的方法，其中所述野生型或功能性变体凝血因子是因子VII、因子VIII或因子IX。

16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述rAAV是rAAV1、rAAV3a、rAAV3b、rAAV6或rAAV8。

17.一种生产包含凝血因子VIII的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体的方法，所述方法包括：

(ii)在合适的条件下培养所述Sf9细胞108±5小时以产生rAAV6载体，所述载体与参考标准相比具有50-150％的体外效力，所述参考标准在对应于野生型AAV6的Gly189和Glu190的VP1和VP2氨基酸残基之间具有不超过65％的剪切，并且在对应于野生型AAV6的Gly115和Arg116的VP1氨基酸残基之间具有不超过15％的剪切。

18.权利要求17所述的方法，其中

(i)昆虫细胞在约28℃的温度下培养，

(ii)与昆虫细胞接触的载体重组杆状病毒的量相对于总培养体积在约0.0022％至约0.0178％体积之间，

(iii)与昆虫细胞接触的辅助重组杆状病毒的量相对于总培养体积在约0.0022％至约0.0178％体积之间，以及

(iv)培养基中溶解氧的量为空气饱和度的约20％至约100％。

19.一种组合物，其包含纯化的重组腺相关病毒(rAAV)载体，其在野生型AAV6的VP1和VP2蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切并且在氨基酸残基189G和190E之间具有不超过65％的剪切，或在另一AAV血清型的VP1蛋白和VP2蛋白中的对应氨基酸之间具有上述各自百分比的剪切。

20.一种组合物，其包含纯化的重组腺相关病毒6(rAAV6)载体，所述载体包含编码野生型或功能性变体凝血因子VIII的转基因，所述载体与参考标准相比具有约50％-150％的体外效力，所述参考标准在VP1和VP2蛋白上的氨基酸残基115G和116R之间具有不超过15％的剪切，以及在氨基酸残基189G和190E之间具有不超过65％的剪切。