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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Regulation der Genexpression
und genauer ein Verfahren zur Bestimmung des DNA-Methylierungsstatus
von CpG-Stellen an einem bestimmten Locus.
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Hintergrund
der Erfindung
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In
Eukaryonten höherer
Ordnung ist die DNA nur an Cytosinresten methyliert, welche 5' zu Guanosin in dem
CpG-Dinucleotid vorliegen. Diese Modifikation hat wichtige regulatorische
Effekte auf die Genexpression, insbesondere wenn CpG-reiche Bereiche,
bekannt als CpG-Inseln, beteiligt sind, die in den Promotorregionen
vieler Gene vorkommen. Obwohl praktisch alle Gen-assoziierten Inseln
auf autosomalen Chromosomen vor einer Methylierung geschützt sind,
ist eine übermäßige Methylierung
von CpG-Inseln mit der transkriptionellen Inaktivierung von ausgewählten geprägten Genen
und Genen auf dem inaktiven X-Chromosom von Frauen in Verbindung
gebracht worden. Eine anomale Methylierung von normalerweise unmethylierten CpG-Inseln
ist als ein häufiges
Ereignis bei immortalisierten und transformierten Zellen beschrieben
worden und ist mit der transkriptionellen Inaktivierung von bestimmten
Tumorsuppressorgenen bei menschlichen Krebserkrankungen in Verbindung
gebracht worden.
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Menschliche
Krebszellen enthalten typischerweise somatisch veränderte Genome,
welche durch die Mutation, Amplifikation oder Deletion wichtiger
Gene gekennzeichnet sind. Außerdem
weist die DNA-Matrize menschlicher Krebszellen häufig somatische Veränderungen
hinsichtlich der DNA-Methylierung auf (Fearon E. R. et al., Cell
61 (1990), 759; Jones P. A. et al., Cancer Res. 46 (1986), 461;
Holliday R., Science 238 (1987), 163; De Bustros A. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5693; Jones P. A. et al., Adv. Cancer
Res. 54 (1990), 1; Baylin S. B. et al., Cancer Cells 3 (1991), 383;
Makos M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 1929; Ohtani-Fujita
N. et al., Oncogene 8 (1993), 1063). Jedoch ist die genaue Rolle
einer anomalen DNA-Methylierung bei der Tumorgenese beim Menschen
nicht ermittelt worden. DNA-Methylasen übertragen Methylgruppen von
dem universellen Methylgruppen-Donor S-Adenosylmethionin auf spezifische
Stellen auf der DNA. Mehrere biologische Funktionen sind den methylierten
Basen in der DNA zugeordnet worden. Die am häufigsten ermittelte biologische
Funktion ist der Schutz der DNA vor einer Spaltung durch entsprechende
Restriktionsenzyme. Das Phänomen
der Modifikation durch Restriktion ist bisher nur bei Bakterien
beobachtet worden. Säugerzellen
besitzen jedoch eine andere Methylase, die ausschließlich Cytosinreste,
welche 5'-Nachbarn
von Guanin (CpG) sind, in der DNA methyliert. Durch mehrere Beweisführungen
ist gezeigt worden, dass diese Methylierung eine Rolle bei der Genaktivität, Zelldifferenzierung,
Tumorgenese, X-Chromosomen-Inaktivierung, genomischen Prägung und
anderen wesentlichen biologische Prozessen spielt (Razin A. H. und
Riggs R. D., Hrsg., in DNA Methylation Biochemistry and Biological
Significance, Springer-Verlag, New York, 1984).
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Vor
kurzem ist eine CpG-reiche Region oder "CpG-Insel" bei 17p13.3 identifiziert worden, welche
bei mehreren häufigen
Typen menschlicher Krebsarten anomal hypermethyliert ist (Makos
M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 1929; Makos M.
et al., Cancer Res. 53 (1993), 2715; Makos M. et al., Cancer Res. 53
(1993), 2719). Diese Hypermethylierung stimmt mit dem zeitlichen
Verlauf und der Häufigkeit
von 17p-Verlusten und p53-Mutationen bei Hirn-, Colon- und Nierenkrebs überein.
Eine abgeschaltete Gentranskription in Verbindung mit einer Hypermethylierung
der normalerweise unmethylierten CpG-Inseln in Promotorregionen ist
als ein alternativer Mechanismus zu Mutationen der codierenden Regionen
für die
Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen impliziert worden (Baylin
S. B. et al., Cancer Cells 3 (1991), 383; Jones P. A. und Buckley
J. D., Adv. Cancer Res. 54 (1990), 1–23). Diese Veränderung
ist nun mit dem Verlust der Expression von VHL, einem Nierenkrebs-Tumorsuppressorgen
auf 3p (Herman J. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 9700–9704),
dem Östrogenrezeptor-Gen
auf 6q (Ottaviano Y. L. et al., Cancer Res. 54 (1994), 2552) und
dem H19-Gen auf 11p (Steenman M. J. C. et al., Nature Genetics 7
(1994), 433) in Verbindung gebracht worden.
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In
Eukaryontenzellen erfolgt die Methylierung von Cytosinresten, welche
unmittelbar 5' zu
einem Guanosin vorliegen, überwiegend
in CG-armen Regionen (Bird A., Nature 321 (1986), 209). Im Gegensatz
dazu bleiben einzelne Regionen von CG-Dinucleotiden, bezeichnet
als CpG-Inseln, in normalen Zellen unmethyliert, außer während der
X-Chromosomen-Inaktivierung (Migeon et al., vorstehend) und der
elterlichen spezifischen Prägung
(Li et al., Nature 366 (1993), 362), wobei die Methylierung von
regulatorischen 5'-Regionen
eine transkriptionelle Repression zur Folge haben kann. In einer
kleinen Fraktion von Retinoblastomen ist die de novo-Methylierung des
Rb-Gens nachgewiesen worden (Sakai et al., Am. J. Hum. Genet. 48
(1991), 880), und vor kurzem zeigte eine genauere Analyse des VHL-Gens
eine anomale Methylierung in einer Untergruppe von sporadischen
Nierenzellkarzinomen auf (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 91 (1994), 9700). Die Expression eines Tumorsuppressorgens kann
ebenfalls durch eine de novo-DNA-Methylierung einer normalerweise
5' unmethylierten
CpG-Insel unterbunden werden (Issa et al., Nature Genet. 7 (1994),
536; Herman et al., vorstehend; Merlo et al., Nature Med. 1 (1995),
686; Herman et al., Cancer Res. 56 (1996), 722; Graff et al., Cancer
Res. 55 (1995), 5195; Herman et al., Cancer Res. 55 (1995), 4525).
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Die
meisten der Verfahren, die bis heute zum Nachweis eines methylierten
Cytosins entwickelt wurden, beruhen auf der Spaltung der Phosphodiesterbindung
entlang von Cytosinresten mit Hilfe von entweder methylierungssensitiven
Restriktionsenzymen oder reaktiven Chemikalien wie Hydrazin, welche
zwischen Cytosin und dem 5-Methyl-Derivat davon unterscheiden. Die
Verwendung von methylierungssensitiven Enzymen hat den Nachteil,
dass sie nicht generell anwendbar ist, da nur ein begrenzter Teil
der möglicherweise
methylierten Stellen in dem Genom analysiert werden kann. Protokolle
für eine
genomische Sequenzierung, welche einen 5-MeC-Rest in einer genomischen DNA als eine
Stelle identifizieren, die nicht durch eine der Maxam-Gilbert-Sequenzierungsreaktionen
gespalten werden kann, stellen eine wesentliche Verbesserung gegenüber der
ursprünglichen
genomischen Sequenzierungsmethode dar, aber weisen noch immer Nachteile
auf, wie zum Beispiel die Voraussetzung des Vorhandenseins einer
großen
Menge der genomischen DNA und die Schwierigkeit beim Nachweis einer
Lücke in
einer Sequenzierungsleiter, die Banden unterschiedlicher Intensität enthalten
kann.
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Die
Kartierung von methylierten Regionen in der DNA beruhte überwiegend
auf Southern-Hybridisierungsansätzen,
basierend auf der Unfähigkeit
von methylierungssensitiven Restriktionsenzymen, Sequenzen zu spalten,
die eine oder mehrere methylierte CpG-Stellen enthalten. Diese Methode
ermöglicht
eine Einschätzung
des allgemeinen Methylierungsstatus von CpG-Inseln, einschließlich eine
quantitative Analyse, aber ist relativ unempfindlich, erfordert
große
Mengen einer DNA mit hohem Molekulargewicht und kann nur Informationen über solche
CpG-Stellen vorsehen, welche innerhalb von Sequenzen vorkommen,
die durch methylierungssensitive Restriktionsenzyme erkannt werden.
Eine empfindlichere Methode zum Nachweis von Methylierungsmustern
kombiniert die Verwendung von methylierungssensitiven Enzymen und
die Polymerasekettenreaktion (PCR). Nach Spaltung der DNA mit dem
Enzym erfolgt die Amplifikation mittels PCR unter Verwendung von
Primern, welche die Restriktionsstelle umgeben, nur dann, wenn die
Spaltung der DNA durch eine Methylierung verhindert wurde. Ähnlich wie
bei den auf Southern-Verfahren basierenden Ansätzen kann diese Methode lediglich
die CpG-Methylierung an methylierungssensitiven Restriktionsstellen überprüfen. Außerdem muss
die Restriktion der unmethylierten DNA vollständig sein, da eine ungespaltene
DNA durch die PCR amplifiziert wird, wodurch ein falsch positives
Ergebnis für
die Methylierung erhalten wird. Dieser Ansatz ist bei der Untersuchung
von Proben, worin ein hoher Prozentsatz der Allele von Interesse
methyliert ist, wie bei der Untersuchung von geprägten Genen
und inaktivierten Genen auf dem X-Chromosom, nützlich gewesen. Jedoch machen
die Schwierigkeiten im Hinblick auf die Unterscheidung zwischen
einer unvollständigen
Restriktion und einer geringen Zahl von methylierten Allelen diesen
Ansatz für
den Nachweis einer Tumorsuppresssorgen-Hypermethylierung in kleinen
Proben, in denen die methylierten Allele eine kleine Fraktion der
Population darstellen, unzuverlässig.
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Eine
andere Methode, welche die Verwendung von Restriktionsendonucleasen
vermeidet, benutzt eine Bisulfitbehandlung der DNA, um alle unmethylierten
Cytosine zu Uracil umzuwandeln. Die veränderte DNA wird amplifiziert
und sequenziert, um den Methylierungsstatus aller CpG-Stellen nachzuweisen.
Jedoch ist diese Methode technisch schwierig, arbeitsintensiv, beinhaltet
keine Clonierung der amplifizierten Produkte, ist weniger empfindlich
als eine Southern-Analyse und erfordert, dass für einen Nachweis etwa 10% der
Allele methyliert sind.
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Die
Identifizierung der genetischen Veränderungen in einem frühesten Stadium
der Tumorgenese ist ein wichtiger Gesichtspunkt in der molekularen
Krebsforschung. Diagnostische Ansätze auf der Basis der Identifizierung
dieser Veränderungen
ermöglichen
voraussichtlich die Realisierung früher Nachweisstrategien und neuer
Therapieansätze,
wobei der Nachweis dieser frühen
Veränderungen
eine wirksamere Krebsbehandlung zur Folge haben könnte.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
genaue Kartierung von DNA-Methylierungsmustern in CpG-Inseln ist
für das
Verständnis
von verschiedenen biologischen Prozesse wie der Regulation von geprägten Genen,
der X-Chromosomen-Inaktivierung und der Tumorsupressorgen-Abschaltung bei einer
menschlichen Krebserkrankung unerläßlich geworden. Die vorliegende
Erfindung stellt ein Verfahren zur schnellen Einschätzung des
Methylierungsstatus irgendeiner Gruppe von CpG-Stellen innerhalb
einer CpG-Insel unabhängig
von der Verwendung von methylierungssensitiven Restriktionsenzymen
bereit. Trotz der Erkenntnisse der Fachleute im Hinblick auf die
Anwendung der PCR und die Anwendung der Bisulfitmodifikation in
einer unabhängigen
Weise hat bis zu der vorliegenden Erfindung noch niemand Primer
hergestellt, welche für
die Bisulfitreaktion spezifisch waren, so dass die PCR-Reaktion
selbst verwendet wurde, um zwischen der chemisch modifizierten,
methylierten und unmethylierten DNA zu unterscheiden.
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Das
Verfahren der Erfindung beinhaltet die Modifikation der DNA durch
Natriumbisulfit oder ein vergleichbares Reagens, welches alle unmethylierten,
aber nicht methylierte Cytosine zu Uracil umwandelt, und die nachfolgende
Amplifikation mit Primern, welche für methylierte DNA gegenüber unmethylierter
DNA spezifisch sind. Dieses Verfahren einer "methylierungsspezifischen PCR" oder MSP benötigt lediglich
kleine DNA-Mengen, ist empfindlich für 0,1% methylierte Allele eines
bestimmten CpG-Insel-Locus und kann mit DNA, die zum Beispiel aus
in Paraffin eingebetteten Proben extrahiert wurde, durchgeführt werden.
Die MSP eliminiert die falsch positiven Ergebnisse, welche den vorherigen
Ansätzen
auf PCR-Basis innewohnen, die auf einer unterschiedlichen Restriktionsenzymspaltung
beruhten, um methylierte DNA von unmethylierter DNA zu unterscheiden.
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Gemäß einem
bestimmten Aspekt der Erfindung ist die MSP zur Identifizierung
von Hypermethylierungs-Veränderungen
einer Promotorregion, welche mit der transkriptionellen Inaktivierung
von Tumorsuppressorgenen, zum Beispiel p16, p15, E-Cadherin und
VHL, bei einer Neoplasie beim Menschen assoziiert ist, nützlich.
Andere Gene, für
die gezeigt wurde, dass sie methyliert sind, schließen den Östrogenrezeptor,
MDGI, GST-pi, Calcitonin, HIC-1, Endothelin B-Rezeptor, TIMP-2,
06-MGMT, MLH1, MSH2 und GFAP ein. Von diesen ist für den Östrogenrezeptor,
MDGI, GST-pi, Calcitonin, HIC-1, Endothelin-B-Rezeptor, TIMP-2,
06-MGMT und MLH1 mit Hilfe der MSP gezeigt worden, dass sie in neoplastischem
Gewebe verglichen mit normalem Gewebe hypermethyliert sind. Zum
ersten Male liefert die Erfindung den Beweis, dass TIMP-2, ein Gewebeinhibitor
von Metalloproteinasen, in neoplastischem Gewebe verglichen mit
normalem Gewebe hypermethyliert ist.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
die genomische Sequenzierung von p16. Die gezeigte Sequenz besitzt
am unteren Ende des Gels den größten Teil
der 5'-Region, beginnend
bei +175 in Bezug auf den Haupttranskriptionsstartpunkt (Hara et
al., Mol. Cell Biol. 16 (1996), 859). Alle Cytosine in der unmethylierten
Zelllinie H249 sind zu Thymidin umgewandelt worden, während alle
Cs in den CpG-Dinucleotiden in der methylierten Zelllinie H157 als
C verbleiben, was eine Methylierung anzeigt. ] schließt eine
BstUI-Stelle ein,
die bei -59 in Bezug auf den Transnationalstartpunkt in der Genbank-Sequenz U12818 angeordnet
ist (Hussussian et al., Nat. Genet. 8 (1994), 15), welche aber unrichtigerweise
als CGCA in der Sequenz X94154 identifiziert ist (Hara et al., vorstehend).
Diese CGCG-Stelle kennzeichnet die 3'-Stelle des Sense-Primers, welcher für die p16-MSP verwendet wurde.
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2,
Tafel A–E,
zeigt Polyacrylamidgele mit den methylierungsspezifischen PCR-Produkten
von p16. Die für
die Amplifikation verwendeten Primersätze sind bezeichnet als unmethyliert
(U), methyliert (M) oder unmodifiziert/Wildtyp (W). * kennzeichnet
das MspI-Spaltprodukt des Molekulargewichtsmarkers pBR322. Tafel
A zeigt die Amplifikation einer bisulfitbehandelten DNA aus Krebszelllinien
und normalen Lymphocyten und einer unbehandelten DNA (aus der Zelllinie
H249). Tafel B zeigt die Vermischung einer unterschiedlichen Menge
von H157-DNA mit 1 μg
H249-DNA vor der Bisulfitbehandlung zur Abschätzung der Nachweisempfindlichkeit der
MSP für
methylierte Allele. Die modifizierte DNA einer Probe eines primären Lungenkarzinoms
und einer normalen Lunge sind ebenfalls gezeigt. Tafel C zeigt die
Amplifikation mit den in Tabelle 1 beschriebenen Primern p16-U2
(U) und p16-M2 (M). Tafel D zeigt die amplifizierten p16-Produkte
von Tafel C, geschnitten mit BstUI (+) oder nicht geschnitten (–). Tafel
E zeigt die Ergebnisse einer Überprüfung der
regionalen Methylierung von CpG-Inseln mit Hilfe der MSP unter Verwendung
der Sense-Primer p16-U2 (U) und p16-M2 (M), welche methylierungsspezifisch
sind, und eines Antisense-Primers, welcher nicht methylierungsspezifisch
ist.
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3,
Tafel A–E,
zeigt Polyacrylamidgele von MSP-Produkten einer Analyse von mehreren
Genen. Die für
die Amplifikation verwendeten Primersätze sind nicht als unmethyliert
(U), methyliert (M) oder unmodifiziert/Wildtyp (W) bezeichnet. *
kennzeichnet das MspI-Spaltprodukt des Molekulargewichtsmarkers
pBR322, und ** kennzeichnet den 123 bp-Molekulargewichtsmarker.
Alle DNA-Proben wurden mit Bisulfit behandelt, ausgenommen diejenigen,
welche als unbehandelt gekennzeichnet sind. Tafel A zeigt die Ergebnisse
der MSP für
p15. Tafel B zeigt die p15-Produkte,
geschnitten mit BstUI (+) oder nicht geschnitten (–). Tafel
C zeigt die MSP-Produkte
für VHL.
Tafel D zeigt die VHL-Produkte, geschnitten mit BstUI (+) oder nicht
geschnitten (–). Tafel
E zeigt die MSP-Produkte für
E-Cadherin.
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Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine methylierungsspezifische PCR (MSP)
für die
Identifizierung von DNA-Methylierungsmustern bereit. Bei der MSP
wird die PCR-Reaktion selbst dazu verwendet, um zwischen einer modifizierten
methylierten und unmethylierten DNA zu unterscheiden, wodurch die
Empfindlichkeit des Methylierungsnachweises erhöht wird.
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Im
Unterschied zu vorherigen genomischen Sequenzierungsmethoden zur
Identifizierung einer Methylierung unter Verwendung von Amplifikationsprimern,
die so konstruiert sind, dass sie die CpG-Sequenzen spezifisch umgehen,
sind die MSP-Primer
selbst derart konstruiert, dass sie CpG-Stellen spezifisch erkennen, wobei
sie sich die Unterschiede bezüglich
der Methylierung zunutze machen, um spezifische Produkte zu amplifizieren,
welche durch den erfindungsgemäßen Test
identifiziert werden.
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Wie
in den nachstehenden Beispielen veranschaulicht, bietet die MSP
wesentliche Vorteile gegenüber einer
vorherigen PCR oder anderen Verfahren, welche zum Nachweis einer
Methylierung angewendet wurden. Die MSP ist deutlich empfindlicher
als Southern-Analysen, wodurch der Nachweis einer geringen Zahl
von methylierten Allelen und die Untersuchung der DNA von kleinen
Proben erleichtert wird. Die MSP ermöglicht die Untersuchung von
in Paraffin eingebetteten Materialien, welche vorher nicht durch
eine Southern-Analyse untersucht werden konnten. Die MSP erlaubt
auch die Überprüfung aller
CpG-Stellen, nicht nur solcher innerhalb der Sequenzen, welche durch
methylierungssensitive Restriktionsenzyme erkannt werden. Auf diese
Weise wird die Zahl der Stellen, welche beurteilt werden können, deutlich
erhöht,
wodurch eine schnelle Feinkartierung von Methylierungsmustern in
CpG-reichen Regionen ermöglicht
wird. Die MSP eliminiert auch die häufigen falsch positiven Ergebnisse
aufgrund einer partiellen Spaltung durch methylierungssensitive
Enzyme, welche vorherigen PCR-Methoden zum Nachweis der Methylierung
eigen sind. Außerdem
wird mit Hilfe der MSP durch den gleichzeitigen Nachweis von unmethylierten
und methylierten Produkten in einer einzigen Probe die Integrität der DNA
als eine Matrize für
die PCR bestätigt
und eine halbquantitative Beurteilung der Allel-Typen ermöglicht,
welche mit Ergebnissen einer Southern-Analyse korreliert. Ein weiterer
Vorteil ist schließlich,
dass das amplifizierte Produkt durch unterschiedliche Restriktionsmuster
bestätigt
werden kann.
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Die
einzige Technik, welche eine direktere Analyse als die MSP für die meisten
CpG-Stellen innerhalb einer definierten Region vorsehen kann, ist
die genomische Sequenzierung. Jedoch kann die MSP ähnliche Informationen
bereitstellen und besitzt die folgenden Vorteile. Erstens ist die
MSP viel einfacher und setzt weniger voraus als eine genomische
Sequenzierung, wobei eine typische PCR- und Gel-Analyse 4 bis 6
Stunden erfordert. Im Gegensatz dazu kann die genomische Sequenzierung,
Amplifikation, Clonierung und nachfolgende Sequenzierung Tage in
Anspruch nehmen. Die MSP umgeht auch die Verwendung teuerer Sequenzierungsreagenzien
und den Einsatz von Radioaktivität.
Diese beiden Faktoren machen die MSP für die Analyse einer großen Zahl
von Proben besser geeignet. Drittens ermöglicht die Verwendung einer
PCR als Schritt für die
Unterscheidung einer methylierten DNA von einer unmethylierten DNA
bei der MSP eine wesentliche Erhöhung
der Empfindlichkeit des Methylierungsnachweises. Falls beispielsweise keine
Clonierung vor der genomischen Sequenzierung der DNA durchgeführt wird,
können
weniger als 10% methylierte DNA nicht vor dem Hintergrund einer
unmethylierten DNA nachgewiesen werden (Myohanen et al., vorstehend).
Die Verwendung einer PCR und einer Clonierung ermöglicht einen
empfindlichen Nachweis von Methylierungsmustern in sehr kleinen
DNA-Mengen mit Hilfe der genomischen Sequenzierung (Frommer et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 1827; Clark et al., Nucleic
Acids Research 22 (1994), 2990). Dies bedeutet jedoch in der Praxis,
dass eine Analyse mittels Sequenzierung von 10 Clonen zum Nachweis
einer Methylierung von 10% und von 100 Clonen zum Nachweis einer
Methylierung von 1% erforderlich wäre, und zum Erreichen des Empfindlichkeitswerts,
welcher durch die Erfinder mit Hilfe der MSP nachgewiesen wurde
(1:1000), wäre
die Sequenzierung von 1000 einzelnen Clonen erforderlich.
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In
einer ersten Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer methyliertes CpG
enthaltenden Nucleinsäure
bereit, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Nucleinsäure enthaltenden
Probe mit einem Agens, welches unmethyliertes Cytosin modifiziert,
das Amplifizieren der CpG-enthaltenden Nucleinsäure in der Probe mit Hilfe
von CpG-spezifischen Oligonucleotidprimern, wobei die Oligonucleotidprimer
zwischen einer modifizierten methylierten und einer nicht-methylierten
Nucleinsäure
unterscheiden, und den Nachweis der methylierten Nucleinsäure umfasst.
Es ist selbstverständlich,
dass der Amplifikationsschritt, obwohl wahlweise, in dem bevorzugten
Verfahren der Erfindung bevorzugt wird. Das Verfahren der Erfindung
basiert auf der PCR-Reaktion selbst, um zwischen einer modifizierten
(z.B. chemisch modifizierten) methylierten DNA und einer unmethylierten
DNA zu unterscheiden.
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Der
Begriff "modifiziert", wie hierin verwendet,
bedeutet die Umwandlung eines unmethylierten Cytosins in ein anderes
Nucleotid, wodurch das unmethylierte von dem methylierten Cytosin
unterschieden wird. Vorzugsweise modifiziert das Agens unmethyliertes
Cytosin zu Uracil. Vorzugsweise ist das Agens, welches zur Modifikation
von unmethyliertem Cytosin verwendet wird, Natriumbisulfit; jedoch
können
andere Mittel, welche in ähnlicher
Weise unmethyliertes Cytosin, aber nicht methyliertes Cytosin modifizieren,
ebenfalls in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden. Natriumbisulfit
(NaHSO3) reagiert leicht mit der 5,6-Doppelbindung
von Cytosin, aber kaum mit methyliertem Cytosin. Cytosin reagiert
mit dem Bisulfition unter Bildung eines sulfonierten Cytosin-Reaktionszwischenprodukts,
welches für
eine Desaminierung empfindlich ist, wobei ein sulfoniertes Uracil
erzeugt wird. Die Sulfonatgruppe kann unter alkalischen Bedingungen
eliminiert werden, woraus die Bildung von Uracil resultiert. Uracil
wird durch die Taq-Polymerase und daher bei der PCR als ein Thymin
erkannt, wobei das erhaltene Produkt nur an der Position, an der
ein 5-Methylcytosin in der DNA-Ausgangsmatrize vorkommt, ein Cytosin
enthält.
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Die
in der Erfindung verwendeten Primer für die Amplifikation der CpG-enthaltenden Nucleinsäure in der
Probe nach der Bisulfitmodifikation unterscheiden spezifisch zwischen
unbehandelter oder unmodifizierter DNA, methylierter und nicht-methylierter DNA.
Die MSP-Primer für
die nicht-methylierte DNA besitzen vorzugsweise ein T in dem 3'-CG-Paar, um dieses
von dem C zu unterscheiden, das in einer methylierten DNA verbleibt,
und das Komplement davon ist als Antisense-Primer gedacht. Die MSP-Primer
enthalten üblicherweise
relativ wenige Cs oder Gs in der Sequenz, da in dem Sense-Primer
keine Cs vorkommen und in dem Antisense-Primer keine Gs vorhanden sind (C wird
zu U (Uracil) modifiziert, welches als T (Thymidin) in dem Amplifikationsprodukt
amplifiziert wird).
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Die
erfindungsgemäßen Primer
umfassen Oligonucleotide mit einer ausreichenden Länge und
geeigneten Sequenz, um die spezifische Initiation der Polymerisation
bei einer wesentlichen Zahl von Nucleinsäuren an dem polymorphen Locus
vorzusehen. Genauer verweist der Begriff "Primer", wie hierin verwendet, auf eine Sequenz,
umfassend zwei oder mehrere Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide,
vorzugsweise mehr als drei und am meisten bevorzugt mehr als acht,
wobei die Sequenz fähig
ist, die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das im Wesentlichen
komplementär
zu einem Strang an dem polymorphen Locus ist, zu initiieren. Die
Umgebungsbedingungen, welche die Synthese begünstigen, schließen das
Vorhandensein von Nucleosidtriphosphaten und eines Mittels für die Polymerisation
wie einer DNA-Polymerase und eine(n) geeignete(n) Temperatur und
pH-Wert ein. Der Primer ist für
eine optimale Wirksamkeit bei der Amplifikation vorzugsweise einzelsträngig, aber
kann auch doppelsträngig
sein. Falls doppelsträngig,
wird der Primer zuerst behandelt, um die Stränge davon zu trennen, bevor
er verwendet wird, um Verlängerungsprodukte
herzustellen. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid.
Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten
in Anwesenheit des induzierenden Agens für die Polymeri sation zu initiieren.
Die genaue Länge
des Primers hängt
von vielen Faktoren einschließlich
Temperatur, Puffer und Nucleotidzusammensetzung ab. Der Oligonucleotidprimer
enthält
typischerweise 12–20
oder mehr Nucleotide, obwohl er auch weniger Nucleotide enthalten
kann.
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Die
Primer der Erfindung sind so konstruiert, dass sie zu jedem Strang
des zu amplifizierenden genomischen Locus "im Wesentlichen" komplementär sind und die geeigneten G-
oder C-Nucleotide, wie vorstehend besprochen, einschließen. Das
bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, damit sie mit ihren jeweiligen
Strängen
unter Bedingungen, welche erlauben, dass das Agens für die Polymerisation
wirksam ist, hybridisieren. Mit anderen Worten sollten die Primer
eine ausreichende Komplementarität mit
den umgebenden 5'-
und 3'-Sequenzen
aufweisen, um damit zu hybridisieren und die Amplifikation des genomischen
Locus zu erlauben. Obwohl beispielhafte Primer in SEQ ID NO: 105–208 bereitgestellt
werden, ist es selbstverständlich,
dass jeder Primer, der mit den Zielsequenzen in SEQ ID NO: 1–104 hybridisiert,
in der Erfindung eingeschlossen ist und in dem Verfahren der Erfindung
zum Nachweis von methylierter Nucleinsäure, wie beschrieben, nützlich ist.
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Die
Oligonucleotidprimer der Erfindung werden in dem Amplifikationsprozess
verwendet, welcher eine enzymatische Kettenreaktion ist, die exponentielle
Mengen des Ziellocus im Verhältnis
zur Anzahl der beteiligten Reaktionsschritte erzeugt. Typischerweise
ist ein Primer zu dem negativen (–) Strang des Locus komplementär und ist
der andere zu dem positiven (+) Strang komplementär. Die Anlagerung
der Primer an eine denaturierte Nucleinsäure, gefolgt durch die Verlängerung
mittels eines Enzyms wie dem großen Fragment der DNA-Polymerase
I (Klenow-Fragment)
und Nucleotiden, resultiert in neu synthetisierten (+)- und (–)-Strängen, welche
die Ziellocus-Sequenz enthalten. Da diese neu synthetisierten Sequenzen
auch Matrizen sind, resultieren wiederholte Zyklen von Denaturierung,
Primeranlagerung und Verlängerung
in einer exponentiellen Herstellung der Region (d.h., der Ziellocus-Sequenz),
welche durch den Primer definiert wird. Das Produkt der Kettenreaktion
ist ein einzelnes Nucleinsäureduplexmolekül mit Termini,
welche den Enden der spezifischen Primer, welche verwendet wurden,
entsprechen.
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Die
Oligonucleotidprimer der Erfindung können mit Hilfe eines geeigneten
Verfahrens wie herkömmlichen
Phosphotriester- und Phosphodiestermethoden oder automatisierten
Ausführungsformen
davon hergestellt werden. In einer solchen automatisierten Ausführungsform
werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterialien verwendet
und können
nach der Beschreibung von Beaucage et al. (Tetrahedron Letters 22 (1981),
1859–1862)
hergestellt werden. Ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden
an einem modifizierten, festen Träger wird in US-Patent Nr. 4,458,066
beschrieben.
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Jede
Nucleinsäureprobe
in gereinigter oder ungereinigter Form kann als die Ausgangsnucleinsäure oder
-säuren
verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie die spezifische Nucleinsäuresequenz,
welche den Ziellocus (z.B. CpG) enthält, umfasst, oder im Verdacht
steht, diese Sequenz zu enthalten. So kann in dem Verfahren zum
Beispiel eine DNA oder RNA einschließlich Boten-RNA, wobei die
DNA oder RNA einzelsträngig
oder doppelsträngig
sein kann, verwendet werden. Falls eine RNA als Matrize verwendet
wird, werden Enzyme und/oder Bedingungen verwendet, welche für die reverse
Transkription der Matrize in DNA optimal sind. Zusätzlich kann
ein DNA-RNA-Hybrid, welches jeweils einen Strang davon enthält, verwendet
werden. Ein Gemisch von Nucleinsäuren
kann ebenfalls verwendet werden, oder es können die Nucleinsäuren, welche
in einer vorherigen Amplifikationsreaktion hierin unter Verwendung
derselben oder unterschiedlicher Primer hergestellt wurden, in gleicher
Weise verwendet werden. Die spezifische Nucleinsäuresequenz, welche amplifiziert werden
soll, d.h. der Ziellocus, kann eine Fraktion eines größeren Moleküls sein
oder kann anfänglich
als ein einzelnes Molekül
vorliegen, so dass die spezifische Sequenz aus der gesamten Nucleinsäure besteht.
Es ist nicht erforderlich, dass die Sequenz, welche amplifiziert
werden soll, anfänglich
in einer reinen Form vorliegt; wobei sie eine kleine Fraktion eines
komplexen Gemisches, wie es in der gesamten menschlichen DNA enthalten
ist, sein kann.
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Die
Nucleinsäure
enthaltende Probe, welche zum Nachweis von methyliertem CpG verwendet
wird, kann aus einer beliebigen Quelle stammen, einschließlich Gehirn-,
Colon-, Urogenital-, hämopoetisches,
Thymus-, Hoden-, Eierstock-, Gebärmutter-,
Prostata-, Brust-, Colon-, Lungen- und Nierengewebe, und kann durch
eine Vielzahl von Techniken, wie die durch Maniatis et al. (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, S. 280, 281,
1982) beschriebenen, extrahiert werden.
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Falls
die extrahierte Probe unrein ist (z.B. Plasma, Serum, Stuhl, Ejakulat,
Sputum, Speichel, Liquor cerebrospinalis oder Blut oder eine in
Paraffin eingebettete Probe), kann sie vor der Amplifikation mit
einer Menge eines Reagens, welches wirksam ist, um die Zellen, Flüssigkeiten,
Gewebe oder tierische Zellmembranen der Probe aufzuschließen und
um den Strang oder die Stränge
der Nucleinsäure(n)
freizulegen und/oder zu trennen, behandelt werden. Durch diesen
Lyse- und Nucleinsäure-Denaturierungsschritt
zur Exposition und Trennung der Stränge wird ermöglicht,
dass die Amplifikation sehr viel schneller abläuft.
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Falls
die Nucleinsäure-Zielsequenz
der Probe zwei Stränge
enthält,
ist es erforderlich, die Stränge
der Nucleinsäure
zu trennen, bevor sie als Matrize verwendet werden kann. Die Strangtrennung
kann entweder als ein separater Schritt oder gleichzeitig mit der
Synthese der Primerverlängerungsprodukte
durchgeführt werden.
Diese Strangtrennung kann unter Verwendung von verschiedenen geeigneten,
denaturierenden Bedingungen, einschließlich physikalischer, chemischer
oder enzymatischer Mittel, herbeigeführt werden, wobei das Wort "denaturierend" alle solche Mittel
einschließt.
Ein physikalisches Verfahren zur Trennung von Nucleinsäuresträngen beinhaltet
das Erwärmen
der Nucleinsäure,
bis sie denaturiert ist. Eine typische Wärmedenaturierung kann Temperaturen
im Bereich von etwa 80°C
bis 105°C
für Zeiträume im Bereich
von etwa 1 bis 10 Minuten einschließen. Die Strangtrennung kann
auch durch ein Enzym aus der als Helicasen bekannten Klasse von
Enzymen oder durch das Enzym RecA, welches eine Helicaseaktivität besitzt,
und in Anwesenheit von RiboATP, welches bekanntermaßen DNA
denaturiert, induziert werden. Die für die Strangtrennung von Nucleinsäuren mit
Helicasen geeigneten Reaktionsbedingungen sind bei Kuhn Hoffmann-Berling
(CSH-Quantitative Biology 43 (1978), 63) beschrieben, und Techniken
zur Verwendung von RecA werden bei C. Radding (Ann. Rev. Genetics
16 (1982), 405–437)
besprochen.
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Wenn
komplementäre
Stränge
von Nucleinsäure
oder -säuren
getrennt werden, unabhängig
davon, ob die Nucleinsäure
ursprünglich
doppel- oder einzelsträngig
war, sind die getrennten Stränge
zur Verwendung als eine Matrize für die Synthese von weiteren
Nucleinsäuresträngen einsatzfähig. Diese
Synthese wird unter Bedingungen durchgeführt, welche die Hybridisierung
der Primer mit den Matrizen erlauben. Im Allgemeinen findet die
Synthese in einer gepufferten wässrigen
Lösung
vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7–9, am meisten bevorzugt etwa
8, statt. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuß (für genomische Nucleinsäure üblicherweise
etwa 108:1 Primer:Matrize) der zwei Oligonucleotidprimer
zu dem die getrennten Matrizenstränge enthaltenden Puffer zugegeben.
Es ist jedoch selbstverständlich,
dass die Menge des komplementären
Strangs unbekannt sein kann, falls das Verfahren der Erfindung für diagnostische
Anwendungen verwendet wird, so dass die Menge des Primers im Verhältnis zu
der Menge des komplementären
Strangs nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. Praktischerweise
jedoch umfasst die Menge des zugegebenen Primers im Allgemeinen einen
molaren Überschuß im Vergleich
zu der Menge des komplementären
Strangs (Matrize), wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem
Gemisch von komplexen langkettigen Nucleinsäuresträngen enthalten ist. Ein großer molarer Überschuß wird bevorzugt,
um die Effizienz des Verfahrens zu verbessern.
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Die
Desoxyribonucleosidtriphosphate dATG, dCTG, dGTG und dTTG werden
entweder getrennt oder zusammen mit den Primern in ausreichenden
Mengen zu dem Synthesegemisch zugegeben, und die erhaltene Lösung wird
auf etwa 90–100°C für etwa 1
bis 10 Minuten, vorzugsweise 1 bis 4 Minuten, erwärmt. Nach diesem
Erwärmungszeitraum
läßt man die
Lösung
auf Raumtemperatur, die zur Primerhybridisierung bevorzugt wird,
abkühlen.
Zu dem abgekühlten
Gemisch wird ein geeignetes Agens zum Herbeiführen der Primerverlängerungsreaktion
(hierin bezeichnet als "Agens
für die
Polymerisation")
zugegeben, und man läßt die Reaktion
unter Bedingungen, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, ablaufen.
Das Agens für
die Polymerisation kann auch zusammen mit den anderen Reagenzien
zugegeben werden, falls es hitzestabil ist. Diese Synthesereaktion
(oder Amplifikationsreaktion) kann bei Raumtemperatur bis zu einer
Temperatur, oberhalb welcher das Agens für die Polymerisation nicht
länger
wirksam ist, durchgeführt
werden. So ist zum Beispiel, falls eine DNA-Polymerase für das Agens
verwendet wird, die Temperatur im Allgemeinen nicht höher als
etwa 40°C.
Am geeignetsten erfolgt die Umsetzung bei Raumtemperatur.
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Das
Agens für
die Polymerisation kann eine Verbindung oder ein System sein, welche(s)
wirksam ist, um die Synthese von Primerverlängerungsprodukten zu bewirken,
einschließlich
Enzyme. Geeignete Enzyme für
diesen Zweck schließen
zum Beispiel E. coli-DNA-Polymerase I, das Klenow-Fragment der E.
coli-DNA-Polymerase
I, T4-DNA-Polymerase, andere erhältliche
DNA-Polymerasen, Polyme rase-Muteine, reverse Transkriptase und andere
Enzyme einschließlich
hitzestabiler Enzyme (d.h. solcher Enzyme, welche die Primerverlängerung
bewirken, nachdem sie ausreichend erhöhten Temperaturen unterworfen
werden, um eine Denaturierung hervorzurufen) ein. Geeignete Enzyme
erlauben die Kombination der Nucleotide in der geeigneten Weise,
um die Primerverlängerungsprodukte
zu bilden, die zu jedem Locus-Nucleinsäurestrang komplementär sind.
Im Allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende eines jeden Primers initiiert
und schreitet in der 5'-Richtung entlang
des Matrizenstrangs fort, bis die Synthese abbricht, wobei Moleküle unterschiedlicher
Länge erzeugt werden.
Jedoch können
Agenzien für
die Polymerisation anwesend sein, welche die Synthese mit Hilfe
des gleichen Prozesses, wie vorstehend beschrieben, am 5'-Ende initiieren
und in die andere Richtung voranschreiten.
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Bei
Nucleinsäure-Hybridisierungsreaktionen
variieren die verwendeten Bedingungen, um einen bestimmten Grad
an Stringenz zu erzielen, abhängig
von der Art der Nucleinsäuren,
welche hybridisiert werden. Zum Beispiel können die Länge, der Grad der Komplementarität, die Nucleotidsequenzzusammensetzung (z.B.
GC- vs. AT-Gehalt)
und der Nucleinsäuretyp
(z.B. RNA vs. DNA) der hybridisierenden Regionen der Nucleinsäuren bei
der Auswahl der Hybridisierungsbedingungen berücksichtigt werden. Von weiterer
Bedeutung ist, ob eine der Nucleinsäuren zum Beispiel an einen
Filter immobilisiert ist.
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Ein
Beispiel für
Bedingungen mit einer zunehmend höheren Stringenz ist wie folgt:
2 × SSC/0,1%
SDS bei etwa Raumtemperatur (Hybridisierungsbedingungen); 0,2 × SSC/0,1%
SDS bei etwa Raumtemperatur (Bedingungen niedriger Stringenz); 0,2 × SSC/0,1%
SDS bei etwa 42°C
(Bedingungen mittlerer Stringenz); und 0,1 × SSC bei etwa 68°C (Bedingungen
hoher Stringenz). Das Waschen kann nur unter einer dieser Bedingungen,
z.B. Bedingungen hoher Stringenz, durchgeführt werden, oder jede der Bedingungen
kann in der vorstehend angeführten
Reihenfolge, z.B. für
jeweils 10–15
Minuten, verwendet werden, wobei einer oder alle der aufgeführten Schritte
wiederholt werden. Jedoch, wie vorstehend erwähnt, variieren die optimalen
Bedingungen abhängig
von der einzelnen beteiligten Hybridisierungsreaktion und können empirisch
ermittelt werden.
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Vorzugsweise
wird das Verfahren zur Amplifizierung mit Hilfe der PCR, wie hierin
beschrieben und wie im Allgemeinen durch Fachleute angewendet, durchgeführt. Andere
Verfahren zur Amplifikation sind beschrieben worden und können ebenfalls
angewendet werden, solange die methylierten und nicht-methylierten
Loci, welche mit Hilfe der PCR unter Verwendung der Primer der Erfindung
amplifiziert werden, durch die anderen Mittel in ähnlicher
Weise amplifiziert werden.
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Die
amplifizierten Produkte werden vorzugsweise durch Sequenzierung
als methyliert oder nicht-methyliert identifiziert. Sequenzen, welche
durch die Verfahren der Erfindung amplifiziert werden, können entweder
in Lösung
oder nach Bindung an einen festen Träger durch ein beliebiges Verfahren,
welches üblicherweise
zum Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz angewendet wird, wie
PCR, Oligomer-Restriktion
(Saiki et al., Bio/Technology 3 (1985), 1008–1012), allelspezifische Oligonucleotid
(ASO)-Sondenanalyse (Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80
(1983), 278), Oligonucleotid-Ligierungstests (OLAs) (Landegren et
al., Science 241 (1988), 1077) und dergleichen, weiterhin beurteilt,
identifiziert, cloniert, sequenziert und dergleichen werden. Molekulare
Techniken zur DNA-Analyse sind besprochen worden (Landegren et al.,
Science 242 (1988), 229–237).
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Wahlweise
kann das Methylierungsmuster der Nucleinsäure durch eine Restriktionsenzymspaltung und
Southern-Blot-Analyse bestätigt
werden. Beispiele für
methylierungssensitive Restriktionsendonucleasen, welche zum Nachweis
einer 5'-CpG-Methylierung
verwendet werden können,
schließen
zum Beispiel SmaI, SacII, EagI, MspI, HpaII, BstUI und BssHII ein.
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis einer Zelle, welche
eine methylierte CpG-Insel aufweist, oder einer Zellproliferationsstörung, welche
mit einem methylierten CpG assoziiert ist, in einem Gewebe oder
einer biologischen Flüssigkeit
eines Individuums bereit, welches das Inkontaktbringen einer Zielzellkomponente,
die im Verdacht steht, ein Gen zu exprimieren, das ein methyliertes
CpG besitzt oder eine CpG-assoziierte Störung aufweist, mit einem Agens,
welches an die Komponente bindet, umfasst. Die Zielzellkomponente
kann eine Nucleinsäure
wie DNA oder RNA oder ein Protein sein. Wenn die Komponente eine
Nucleinsäure
ist, ist das Reagens eine Nucleinsäuresonde oder ein PCR-Primer.
Wenn die Zellkomponente ein Protein ist, ist das Reagens eine Antikörpersonde.
Die Sonden können
zum Beispiel mit einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Verbindung,
einer biolumineszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden
Verbindung, einem Metallchelator oder einem Enzym nachweisbar markiert
sein. Den Fachleuten sind andere geeignete Marker zur Bindung an
den Antikörper
bekannt oder sie können
solche mittels Routineversuchen ermitteln.
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Aktiv
transkribierte Gene enthalten im Allgemeinen weniger methylierte
CGs als die durchschnittliche Anzahl in der DNA. Eine Hypermethylierung
kann mit Hilfe einer Restriktionsendonuclease-Behandlung und einer
Southern-Blot-Analyse nachgewiesen werden. Daher wird in einem Verfahren
der Erfindung, falls die nachgewiesene Zellkomponente eine DNA ist,
eine Restriktionsendonuclease-Analyse bevorzugt, um zum Beispiel
eine Hypermethylierung des Promotors nachzuweisen. Jede Restriktionsendonuclease,
welche CG als Teil ihrer Erkennungsstelle umfasst und welche inhibiert
wird, wenn das C methyliert ist, kann verwendet werden. Vorzugsweise
ist die methylierungssensitive Restriktionsendonuclease BssHII,
MspI oder HpaII, welche allein oder in Kombination miteinander verwendet
werden. Andere methylierungssensitive Restriktionsendonucleasen
sind den Fachleuten bekannt.
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Für die Zwecke
der Erfindung kann ein Antikörper
oder eine Nucleinsäuresonde,
welche für
ein Gen oder Genprodukt spezifisch sind, zum Nachweis der Anwesenheit
einer Methylierung, entweder durch den Nachweis der Menge des Polypeptids
(unter Verwendung eines Antikörpers)
oder der Methylierung des Polynucleotids (unter Verwendung einer
Nucleinsäuresonde)
in biologischen Flüssigkeiten
oder Geweben, verwendet werden. Für den Nachweis auf Antikörper-Basis
wird die Menge des Polypeptids mit der Menge des Polypeptids, welche
in einem entsprechenden "normalen" Gewebe vorhanden
ist, verglichen. Oligonucleotidprimer, welche zum Beispiel auf einer
codierenden Sequenzregion des Promotors in der TIMP-2-, Östrogenrezeptor-, GST-pi-,
Calcitonin-, HIC-1- oder MLH1-Sequenz basieren, sind zur Amplifikation
einer DNA, zum Beispiel mit Hilfe der PCR, geeignet. Diese Gene
werden lediglich als Beispiele angeführt und sollen keine Begrenzung darstellen.
Jede Probe, die eine nachweisbare Menge eines Polynucleotids oder
Antigens enthält,
kann verwendet werden. Vorzugsweise ist das Individuum ein Mensch.
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Die
vorliegende Erfindung stellt das Ergebnis vor, dass TIMP-2 in Krebsgewebe
im Vergleich zu normalem Gewebe methyliert ist. Zum Beispiel wurde
festgestellt, dass TIMP-2 in Colonkrebsgewebe, aber nicht in normalem
Colongewebe methyliert ist. Das Verfahren zum Nachweis einer Zelle,
welche ein Gen wie TIMP-2 exprimiert, oder einer Zellproliferationsstörung, welche
mit der Methylierung von CpG-enthaltendem TIMP-2 assoziiert ist,
oder eines Gens, einschließlich
der vorstehend beschriebenen, kann zum Nachweis einer residualen
Krebserkrankung oder anderer Malignitäten in einem Individuum in
einem Zustand der klinischen Remission angewendet werden. Außerdem ist
das Verfahren zum Nachweis eines Polypeptids in Zellen zum Nachweis
einer Zellproliferationsstörung
durch Messen der Menge des Polypeptids in Zellen, welche das Polypeptid
exprimieren, in einem verdächtigen
Gewebe im Vergleich zu dem Polypeptid, das in normalen Zellen oder
Geweben exprimiert wird, nützlich.
Unter Anwendung des Verfahrens der Erfindung kann die Expression eines
Gens wie TIMP-2 in einer Zelle identifiziert werden, und der geeignete
Behandlungsverlauf kann ermittelt werden (z.B. eine Sense-Gentherapie
oder Arzneistofftherapie). Das Expressionsmuster des Gens, z.B. TIMP-2,
kann mit dem Status der Malignität
einer Zelle variieren, daher kann eine Probe wie Brust- oder Colongewebe
mit einer Reihe von Gen- oder Genprodukt-spezifischen Reagenzien
(d.h. Nucleinsäuresonden oder
Antikörpern)
abgesucht werden, um eine Genexpression, z.B. TIMP-2, nachzuweisen
und den Status der Malignität
der Zelle zu diagnostizieren.
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Monoclonale
Antikörper
können
in dem Verfahren der Erfindung zum Beispiel in Immuntests in einer flüssigen Phase
oder gebunden an einen Festphasenträger verwendet werden. Außerdem können die
monoclonalen Antikörper
in diesen Immuntests in unterschiedlicher Weise nachweisbar markiert
sein. Beispiele für Typen
von Immuntests, in denen erfindungsgemäße monoclonale Antikörper verwendet
werden können,
sind kompetitive und nicht-kompetitive Immuntests in entweder einer
direkten oder indirekten Anordnung. Beispiele solcher Immuntests
sind der Radioimmuntest (RIA) und der Sandwich (immunometrische)-Test.
Der Nachweis der Antigene unter Verwendung der erfindungsgemäßen monoclonalen
Antikörper
kann mit Hilfe von Immuntests, welche in entweder einem Vorwärts-, umgekehrten
oder gleichzeitigen Modus durchgeführt werden, einschließlich immunhistochemischer
Tests mit physiologischen Proben, erfolgen. Den Fachleuten sind
andere Immuntestanordnungen bekannt oder sie können solche ohne übermäßiges Experimentieren
leicht ermitteln.
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Der
Begriff "immunometrischer
Test" oder "Sandwich-Immuntest" schließt gleichzeitige
Sandwich-, Vorwärts-Sandwich-
und umgekehrte Sandwich-Immuntests ein. Diese Begriffe sind den
Fachleuten hinreichend bekannt. Den Fachleuten ist auch bewußt, dass
die erfindungsgemäßen Antikörper in
anderen Abwandlungen und Formen von Tests, welche gegenwärtig bekannt
sind oder welche in Zukunft entwickelt werden, nützlich sind. Diese sollen im
Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein.
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Monoclonale
Antikörper
können
an viele verschiedene Träger
gebunden und zum Nachweis der Anwesenheit von TIMP-2 verwendet werden.
Beispiele für
hinreichend bekannte Träger
schließen
Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen,
natürliche
und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit
ein. Die Art des Trägers
kann für
die Zwecke der Erfindung entweder löslich oder unlöslich sein.
Den Fachleuten sind andere geeignete Träger zur Bindung von monoclonalen
Antikörpern
bekannt oder sie können
solche mittels Routineversuchen ermitteln.
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Für die Zwecke
der Erfindung kann TIMP-2, falls in biologischen Flüssigkeiten
und Geweben vorhanden, durch die monoclonalen Antikörper nachgewiesen
werden. Jede Probe, welche eine nachweisbare Menge an TIMP-2 enthält, kann
verwendet werden. Eine Probe kann eine Flüssigkeit wie Ejakulat, Urin,
Speichel, Liquor cerebrospinalis, Blut, Serum und dergleichen oder
ein Feststoff oder Halbfeststoff wie Gewebe, Fäkalien und dergleichen oder
alternativ ein Gewebe von fester Beschaffenheit, wie solche, welche
gewöhnlich
bei der histologischen Diagnose verwendet werden, sein.
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Bei
der Durchführung
der Tests kann es wünschenswert
sein, bestimmte "Blocker" in das Inkubationsmedium
einzuschließen
(üblicherweise
zugegeben zusammen mit dem markierten löslichen Antikörper). Die "Blocker" werden zugegeben,
um sicherzustellen, dass unspezifische Proteine, Proteasen oder
anti-heterophile Immunglobuline gegen anti-TIMP-2-Immunglobuline,
welche in der Versuchsprobe vorhanden sind, die Antikörper auf
dem Festphasenträger
oder den radioaktiv markierten Indikatorantikörper nicht vernetzen oder zerstören, wodurch
falsch positive oder falsch negative Ergebnisse erhalten werden.
Die Wahl von "Blockern" kann daher wesentlich
zur Spezifität
der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Tests beitragen.
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Bei
der Verwendung eines monoclonalen Antikörpers für den in-vivo-Nachweis eines
Antigens wird der nachweisbar markierte monoclonale Antikörper in
einer diagnostisch wirksamen Dosis verabreicht. Der Begriff "diagnostisch wirksam" bedeutet, dass die
Menge des nachweisbar markierten monoclonalen Antikörpers in einer
ausreichenden Quantität
verabreicht wird, um den Nachweis der Stelle mit dem TIMP-2-Antigen,
für das die
monoclonalen Antikörper
spezifisch sind, zu ermöglichen.
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Die
Konzentration des nachweisbar markierten monoclonalen Antikörpers, welche
verabreicht wird, sollte ausreichend sein, so dass die Bindung an
solche Zellen, welche TIMP-2 aufweisen, im Vergleich zu dem Hintergrund
nachweisbar ist. Ferner ist es wünschenswert,
dass der nachweisbar markierte monoclonale Antikörper schnell aus dem Blutkreislauf
ausgeschieden wird, um ein optimales Ziel-zu-Hintergrund-Signalverhältnis zu
erhalten.
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In
der Regel variiert die Dosierung des nachweisbar markierten monoclonalen
Antikörpers
für die
in-vivo-Diagnose abhängig
von solchen Faktoren wie dem Alter, dem Geschlecht und dem Ausmaß der Erkrankung des
Individuums. Die Dosierung des monoclonalen Antikörpers kann
von etwa 0,001 mg/m2 bis etwa 500 mg/m2, vorzugsweise 0,1 mg/m2 bis
etwa 200 mg/m2, am meisten bevorzugt etwa
0,1 mg/m2 bis etwa 10 mg/m2,
variieren. Solche Dosierungen können
zum Beispiel abhängig
davon, ob mehrere Injektionen verabreicht werden, der Tumorbelastung
und anderen Faktoren, welche den Fachleuten bekannt sind, variieren.
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Für die in-vivo-Diagnoseabbildung
ist der Typ des verfügbaren
Nachweisinstruments ein wichtiger Faktor bei der Auswahl eines bestimmten
Radioisotops. Das gewählte
Radioisotop muss einen Zerfallstyp aufweisen, welcher für einen
bestimmten Instrumententyp nachweisbar ist. Ein noch anderer wichtiger
Faktor bei der Auswahl eines Radioisotops für die in-vivo-Diagnose ist,
dass die Halbwertszeit des Radioisotops ausreichend lang ist, so
dass es noch zum Zeitpunkt der maximalen Aufnahme durch das Zielobjekt
nachweisbar ist, aber ausreichend kurz ist, so dass die schädliche Strahlung
im Hinblick auf den Wirt auf ein Minimum verringert wird. Idealerweise
zeigt ein Radioisotop, welches für
die in-vivo-Abbildung verwendet wird, keine Partikelemission, aber
erzeugt eine große
Zahl von Photonen im Bereich von 140–250 keV, welcher durch herkömmliche Gammakameras
ohne weiteres nachgewiesen werden kann.
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Ein
monoclonaler Antikörper,
der in dem Verfahren der Erfindung nützlich ist, kann für die Zwecke
der in-vivo-Diagnose auch mit einem paramagnetischen Isotop markiert
werden, wie bei der Magnetresonanzabbildung (MRI) oder Elektronenspinresonanz
(ESR). Im Allgemeinen kann irgendein geeignetes Verfahren zum Sichtbarmachen
einer Diagnoseabbildung angewendet werden. Für die Kameraabbildung werden
herkömmliche
Gammastrahlen und Positronen emittierende Radioisotope verwendet,
und für
die MRI werden paramagnetische Isotope verwendet. Elemente, welche
bei solchen Techniken besonders nützlich sind, schließen 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr und 56Fe ein.
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Monoclonale
Antikörper,
welche in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, können benutzt werden,
um den Verlauf der Besserung einer TIMP-2-assoziierten Zellproliferationsstörung zu überwachen. Demnach
wäre es
möglich,
durch Messung der Zunahme oder Abnahme der Zahl der Zellen, welche
TIMP-2 exprimieren, oder von vorhandenen Veränderungen im Hinblick auf TIMP-2
in verschiedenen Körperflüssigkeiten
zu bestimmen, ob ein bestimmtes Therapieschema, welches das Ziel
hat, die Störung
zu bessern, wirksam ist.
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Der
Begriff "modulieren" umfasst die Suppression
der Methylierung von TIMP-2 (z.B. des Promotors) oder die Erhöhung der
TIMP-2-Genexpression, wenn TIMP-2 unterexprimiert wird. Wenn eine
Zellproliferationsstörung
mit der TIMP-2-Expression
assoziiert ist, können
solche die Methylierung unterdrückenden
Reagenzien wie 5-Azacytadin in eine Zelle eingebracht werden. Alternativ,
falls eine Zellproliferationsstörung
mit der Unterexpression des TIMP-2-Polypeptids assoziiert ist, kann
eine Sense-Polynucleotidsequenz (der DNA codierende Strang), welche
die Promotorregion oder den Promotor, funktionell verbunden mit
dem Strukturgen, oder das TIMP-2-Polypeptid codiert, in die Zelle
eingebracht werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine Gentherapie zur Behandlung
von Zellproliferationsstörungen,
welche durch TIMP-2 vermittelt werden, bereit. Bei einer solchen
Therapie würde
die therapeutische Wirkung davon durch das Einbringen des geeigneten
TIMP-2-Polynucleotids, welches entweder eine normale TIMP-2-Promotorregion
allein oder in Kombination mit einem TIMP-2-Strukturgen (Sinnstrang)
enthält,
in Zellen von Individuen, welche an der Zellproliferationsstörung leiden,
erreicht werden. Alternativ könnte
das TIMP-2-Strukturgen, mit einem heterologen Promotor funktionell
verbunden, eingeführt
werden. Die Abgabe von Sinnstrang-TIMP-2-Promotor-Polynucleotid-Konstrukten
kann unter Verwendung eines rekombi nanten Expressionsvektors wie
eines chimären
Virus oder eines kolloidalen Dispersionssystems erreicht werden.
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Die
Promotor-Polynucleotid-Sequenzen, welche in dem Verfahren der Erfindung
verwendet werden, können
native unmethylierte Sequenzen sein oder können alternativ eine Sequenz
einschließen,
in welcher ein nicht-methylierbares Analogon innerhalb der Sequenz
substituiert ist. Vorzugsweise ist das Analogon ein nicht-methylierbares Analogon
von Cytidin wie 5-Azacytadin. Andere Analoga sind den Fachleuten
bekannt. Alternativ können
solche nicht-methylierbaren Analoga allein oder gleichzeitig mit
einem Sinnstrang-Promotor für
TIMP-2 oder einem Sinnstrang-Promotor,
welcher mit dem Strukturgen für
das entsprechende Gen funktionell verbunden ist (z.B. der TIMP-2-Promotor
mit dem TIMP-2-Strukturgen), als Arzneistofftherapie an ein Individuum
verabreicht werden.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Medikament oder ein Arzneimittel, umfassend
ein TIMP-2-Promotor-Polynucleotid bzw. ein TIMP-2-Promotor-Polynucleotid,
das mit dem TIMP-2-Strukturgen funktionell verbunden ist, in einem
pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder Medium, wobei das Medikament zur Therapie von TIMP-2-assoziierten Zellproliferationsstörungen verwendet
wird.
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Die
Erfindung stellt auch die Verwendung der MSP zur in-situ-Methylierungsanalyse
bereit. Zum Beispiel kann die MSP angewendet werden, um eine Methylierung
der DNA im Kern einer intakten Zelle nachzuweisen. Ein Gewebeschnitt,
eine Zelle oder eine Population von Zellen wird auf einen festen
Träger
(z.B. einen Objektträger)
aufgebracht oder darauf immobilisiert, und die MSP-Primer werden
direkt auf der Zelle zur Amplifizierung der geeigneten Sequenzen
verwendet. Die Primer sind typischerweise mit einem Reporter, z.B.
einem fluoreszierenden Marker, nachweisbar markiert. Alternativ
wird eine Sonde, welche die mit Hilfe der MSP amplifizierten Sequenzen
nachweist oder damit hybridisiert, zum Nachweis der Amplifikation
von methylierten Sequenzen verwendet. Die in-situ-Methylierungsanalyse
mit Hilfe der MSP ist zum Beispiel beim Nachweis einer Nucleinsäure mit
einer mutierten Nucleotidsequenz in Assoziation mit einem Primärtumor in
den benachbarten histopathologischen Operationsrändern und weiter entfernten
Geweben wie den regionalen Lymphknoten, welche bei der Untersuchung
durch herkömmliche
histologische Techniken anscheinend "normal" sind, nützlich. Mit Hilfe der MSP ist
es möglich,
Zielnucleinsäuren,
welche bereits mit einer großen
Zahl von Krankheitszuständen
assoziiert wurden, von Zellen, welche in einem Gewebe vorhanden
sind, das normal erscheint, nachzuweisen. Eine MSP in situ kann
als ein Hilfsmittel zur Cytophathologie verwendet werden, um Hochrisikopopulationen
zu durchmustern und um Hochrisikopatienten, welche sich einer Chemoprävention
oder Chemotherapie unterziehen, zu überwachen.
-
Beispielhafte
Zielpolynucleotidsequenzen, mit welchen der Primer der Erfindung
hybridisiert, weisen die nachstehend aufgeführten Sequenzen auf:
-
-
-
-
-
-
In
der Erfindung eingeschlossene beispielhafte Primerpaare, welche
mit den vorstehenden Sequenzen hybridisieren, schließen ein:
- *
Ebenfalls eingeschlossen sind Modifikationen der vorstehenden Sequenzen,
einschließlich
SEQ ID NO: 107 mit der Sequenz TCAC am 5'-Ende (SEQ ID NO: 214); SEQ ID NO: 107
mit der am 5'-Ende
angehängten
Sequenz CC (SEQ ID NO: 215); SEQ ID NO: 107 mit der Sequenz 5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3'; SEQ ID NO: 108
mit der Sequenz 5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'; SEQ ID NO: 110
mit der am 5'-Ende angehängten Sequenz
TGG (SEQ ID NO: 216); und SEQ ID NO: 107 mit der am 5'-Ende angehängten Sequenz
TACC (SEQ ID NO: 111). Alle diese modifizierten Primer hybridisieren
bei 65 DEG C.
-
Typischerweise
liegt die CpG-enthaltende Nucleinsäure innerhalb der Region des
Promotors eines Strukturgens. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass
die Promotorregion von Tumorsuppressorgenen eine methylierte CpG-Insel
enthält.
Die Promotorregion von Tumorsuppressorgenen, einschließlich p16,
p15, VHL und E-Cadherin, ist typischerweise die Sequenz, welche
in dem Verfahren der Erfindung mit Hilfe der PCR amplifiziert wird.
Andere Gene, für
welche mit Hilfe der MSP gezeigt worden ist, dass sie methyliertes
CpG in neoplastischem vs. normalem Gewebe enthalten, schließen den Östrogenrezeptor,
MDGI, GST-pi, Calcitonin, HIC-1, Endothelin-B-Rezeptor, TIMP-2,
06-MGMT und MLH1 ein. Gene, für
welche mit Hilfe der MSP festgestellt wurde, dass sie methyliert
sind, schließen
auch den Androgenrezeptor (z.B. methyliert als X-Chromosomen-Inaktivierung),
GFAP (methyliert in einigen Gliablastomzelllinien, aber auch in
normalem Gewebe) und MSH2 ein.
-
Andere
Gene, für
welche gezeigt wurde, dass ein MSP-Primer zwischen normaler unmethylierter
und methylierter DNA unterscheidet, schließen TGF-β1, TGF-β2, p130, BRCA2, NF1, NF2 und
TSG101 ein.
-
Der
Nachweis und die Identifizierung einer methyliertes CpG enthaltenden
Nucleinsäure
in der Probe kann auf eine Zellproliferationsstörung oder Neoplasie hindeuten.
Solche Störungen
schließen,
aber sind nicht begrenzt auf, Astrocytom geringen Grades, anaplastisches
Astrocytom, Glioblastom, Medulloblastom, Colonkrebs, Lungenkrebs,
Nierenkrebs, Leukämie,
Brustkrebs, Prostatakrebs, Endometriumkarzinom und Neuroblastom
ein. Die Feststellung des methylierten CpG-Status ist auch für den Nachweis
und die Diagnose einer Genprägung,
des fragilen-X-Syndroms
und einer X-Chromosomen-Inaktivierung nützlich.
-
Mit
Hilfe des Verfahrens der Erfindung wurde gezeigt, dass das TIMP-2-Gen mit neoplastischen
vs. normalen Geweben assoziiert oder darin methyliert ist.
-
Das
Verfahren der Erfindung bildet nun die Grundlage für einen
Kit, welcher zum Nachweis einer methyliertes CpG enthaltenden Nucleinsäure nützlich ist.
Der Kit beinhaltet ein Trägermittel,
das in Kompartimente aufgeteilt ist, um auf engem Raum einen oder
mehrere Behälter
darin aufzunehmen. Zum Beispiel enthält ein erster Behälter ein
Reagens, das unmethyliertes Cytosin modifiziert, wie Natriumbisulfit.
Ein zweiter Behälter
enthält
Primer für
die Amplifikation der CpG-enthaltenden Nucleinsäure, zum Beispiel die vorstehend
als SEQ ID NO: 105–208
aufgeführten
Primer.
-
Die
Erfindung stellt auch einen Kit für den Nachweis einer methyliertes
CpG enthaltenden Nucleinsäure
bereit, wobei der Kit beinhaltet: a) ein Reagens, welches unmethylierte
Cytosinnucleotide modifiziert; b) eine Kontrollnucleinsäure; c)
Primer für
die Amplifikation einer unmethyliertes CpG enthaltenden Nucleinsäure; d) Primer
für die
Amplifikation einer methyliertes CpG enthaltenden Nucleinsäure; und
e) Primer für
die Amplifikation der Kontrollnucleinsäure. Der Kit kann ferner einen
Nucleinsäure-Amplifikationspuffer
einschließen.
Vorzugsweise ist das Reagens, welches unmethyliertes Cytosin modifiziert,
Bisulfit.
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Der
Kit der Erfindung soll die Reagenzien bereitstellen, welche erforderlich
sind, um die chemische Modifikation und die PCR-Amplifikation von
DNA-Proben zur Bestimmung ihres Methylierungsstatus durchzuführen. Die
in dem Kit eingeschlossenen Primersätze schließen einen Satz, welcher mit
unmethylierter DNA, die einer chemischen Modifikation unterworfen
war, hybridisiert; einen Satz, welcher mit methylierter DNA, die einer
chemischen Modifikation unterworfen war, hybridisiert; und einen
Primersatz, welcher als eine Kontrolle für die Wirksamkeit der chemischen
Modifikation dient, ein. Der Kontroll-Primersatz sollte mit jeder
DNA (unmethyliert oder methyliert) hybridisieren, welche einer chemischen
Methylierung unterworfen war. Im Falle einer unvollständigen chemischen
Modifikation (bis zu etwa 50%) kann die Dateninterpretation noch
Fortschritte machen.
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Die
vorstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein.
Unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele, welche
hierin lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt werden
und den Schutzumfang der Erfindung nicht begrenzen sollen, kann
ein besseres Verständnis
erreicht werden.
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Beispiel 1
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DNA und Zelllinien
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Die
genomische DNA wurde, wie beschrieben (Merlo et al., Nature Medicine
1 (1995), 686; Herman et al., Cancer Research 56 (1996), 722; Graff
et al., Cancer Research 55 (1995), 5195), von Zellinien, Primärtumoren
und normalem Gewebe erhalten. Die Nierenkarzinomzelllinie wurde
freundlicherweise von Dr. Michael Lehrman vom National Cancer Institute,
Bethesda, MD, bereitgestellt.
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Bisulfitmodifikation
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1 μg DNA in
einem Volumen von 50 μl
wurde durch NaOH (Endkonzentration 0,2 M) für 10 Minuten bei 37°C denaturiert.
Für Proben
mit Mengen von menschlicher DNA im Nanogrammbereich wurde 1 μg Lachssperma-DNA
(Sigma) als Träger
vor der Modifikation zugegeben. 30 μl von 10 mM Hydrochinon (Sigma) und
520 μl von
3 M Natriumbisulfit (Sigma), pH 5, beides frisch hergestellt, wurden
zugegeben und eingemischt, und die Proben wurden unter Mineralöl bei 50°C für 16 Stunden
inkubiert. Die modifizierte DNA wurde unter Verwendung des WizardTM-DNA-Reinigungsharzes
gemäß dem Hersteller
(Promega) aufgereinigt und in 50 μl
Wasser eluiert. Die Modifikation wurde durch eine NaOH-Behandlung
(Endkonzentration 0,3 M) für
5 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt durch eine Ethanolfällung, beendet.
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Genomische
Sequenzierung
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Die
genomische Sequenzierung der Bisulfit-modifizierten DNA wurde nach
dem Festphasen-DNA-Sequenzierungsansatz (Myohanen et al., DNA Seq.
5 (1994), 1) durchgeführt.
100 ng der Bisulfit-modifizierten DNA wurden mit dem p16-Genspezifischen
Primer 5'-TTTTTAGAGGATTTGAGGGATAGG-3' (Sense) (SEQ ID NO:
209) und 5'-CTACCTAATTCCAATTCCCCTACA-3' (Antisense) (SEQ
ID NO: 210) amplifiziert. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 96°C für 3 Minuten,
80°C für 3 Minuten,
Zugabe von 1 E Taq-Polymerase (BRL), gefolgt von 35 Zyklen bei 96°C für 20 Sekunden,
56°C für 20 Sekunden,
72°C für 90 Sekunden,
gefolgt von 5 Minuten bei 72°C.
Das PCR-Gemisch enthielt 1 × Puffer
(BRL) mit 1,5 mM MgCl
2, 20 pMol jedes Primers und
0,2 mM dNTPs. Um Produkte für
die Sequenzierung zu erhalten, wurde ein zweite PCR-Runde mit 5
pMol ineinandergeschachtelter Primer durchgeführt. Bei dieser Reaktion enthält der Sense-Primer,
die M13-40-Sequenz (unterstrichen),
welche als eine Stelle eingeführt
wurde, um die Sequenzierung zu initiieren, und ist der Antisense-Primer
biotinyliert, um die Reinigung
des Produkts vor der Sequenzierung zu erleichtern. Die PCR wurde
wie vorstehend über
32 Zyklen mit 2,5 mM MgCl
2 durchgeführt. Alle
Primer für
die genomische Sequenzierung wurden so konstruiert, dass irgendwelche
CpGs in der Sequenz vermieden wurden. Die biotinylierten PCR-Produkte wurden
unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen
(Dynal AB, Norwegen) gereinigt, und die Sequenzierungsreaktionen
wurden mit Sequenase
TM und dem M13-40-Sequenzierungsprimer
unter den durch den Hersteller (USB) angegebenen Bedingungen durchgeführt.
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PCR-Amplifikation
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Die
in Tabelle 1 beschriebenen Primerpaare wurden von Life Technologies
bezogen. Das PCR-Gemisch enthielt 1 × PCR-Puffer (16,6 mM Ammoniumsulfat,
67 mM Tris, pH 8,8, 6,7 mM MgCl2 und 10
mM β-Mercaptoethanol),
dNTPs (jeweils zu 1,25 mM), Primer (jeweils 300 ng/Reaktion) und
Bisulfit-modifizierte DNA (~50 ng) oder unmodifizierte DNA (50–100 ng)
in einem Endvolumen von 50 μl.
Die für unmodifizierte DNA
spezifische PCR umfasste auch 5% Dimethylsulfoxid. Die Reaktionen
wurden bei 95°C
für 5 Minuten
heiß gestartet,
bevor 1,25 Einheiten Taq-Polymerase (BRL) zugegeben wurden. Die
Amplifikation wurde mit einer Hybaid OmniGene-Temperature-Cyclervorrichtung
für 35
Zyklen (30 Sekunden bei 95°C,
30 Sekunden bei der in Tabelle 1 angegebenen Anlagerungstemperatur
und 30 Sekunden bei 72°C),
gefolgt durch eine abschließende
Verlängerung
von 4 Minuten bei 72°C,
ausgeführt.
Für jeden
Satz der PCR-Reaktionen wurden Kontrollen ohne DNA durchgeführt. 10 μl jeder PCR-Reaktion
wurden direkt auf nicht-denaturierende 6–8%ige Polyacrylamidgele aufgetragen,
mit Ethidiumbromid gefärbt,
und mittels UV-Belichtung
direkt sichtbar gemacht.
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Restriktionsanalyse
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10 μl der 50 μl-PCR-Reaktion
wurden mit 10 Einheiten BstUI (New England Biolabs) für 4 Stunden
unter den durch den Hersteller angegebenen Bedingungen gespalten.
Die Restriktionsspaltprodukte wurden vor einer Gelanalyse mit Ethanol
gefällt.
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Beispiel 2
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Eine
erste Studie war erforderlich, um die Strategie für die MSP
zur Ermöglichung
einer Einschätzung des
Methylierungsstatus von CpG-Inseln zu überprüfen. Der p16-Tumorsuppressor
(Merlo et al., vorstehend; Herman et al., Cancer Research 55 (1995),
4525; Gonzalez-Zulueta et al., Cancer Res. 55 (1995), 4531, 27), für den offenbart
worden ist, dass er eine Hypermethylierung einer 5'-CpG-Insel aufweist,
welche mit dem vollständigen
Verlust der Genexpression bei vielen Krebsarten assoziiert ist,
wurde als ein beispielhaftes Gen verwendet, um zu bestimmen, ob
die Methylierungsdichte in den zu testenden Schlüsselregionen ausreichend hoch
war, um die hierin offenbarte Primerkonstruktion zu ermöglichen.
Mit Ausnahme von CpG-Stellen, welche innerhalb der Erkennungssequenzen
für methylierungssensitive
Enzyme liegen, sind die Methylierungsdichte und deren Korrelation
mit der Abschaltung der Transkription bisher noch nicht festgelegt
worden. Daher wurde die Technik der genomischen Sequenzierung angewendet,
um diese Beziehung zu untersuchen.
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1 zeigt
die genomische Sequenzierung von p16. Die gezeigte Sequenz besitzt
am unteren Ende des Gels den größten Teil
der 5'-Region, beginnend bei
+175 in Bezug auf den Haupttranskriptionsstartpunkt (Hara et al.,
Mol. Cell Biol. 16 (1996), 859). Alle Cytosine in der unmethylierten
Zelllinie H249 sind zu Thymidin umgewandelt worden, während alle
Cs in den CpG-Dinucleotiden in der methylierten Zelllinie H157 als
C verbleiben, was auf eine Methylierung hindeutet.] schließt eine
BstUI-Stelle ein, die bei -59 in Bezug auf den Transnationalstartpunkt
in der Genbank-Sequenz U12818 angeordnet ist (Hussussian et al.,
Nat. Genet. 8 (1994), 15), welche aber unrichtigerweise als CGCA
in der Sequenz X94154 identifiziert ist (Hara et al., vorstehend).
Diese CGCG-Stelle kennzeichnet die 3'-Stelle des Sense-Primers, welcher für die p16-MSP verwendet wurde.
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Wie
für andere
CpG-Inseln gezeigt worden ist, welche auf diese Weise untersucht
wurden (Myohanen et al., vorstehend; Park et al., Mol. Cell Biol.
14 (1994), 7975; Reeben et al., Gene 157 (1995), 325), war die CpG-Insel
von p16 in solchen Zelllinien und in normalen Geweben, für die vorher
durch eine Southern-Analyse gezeigt
wurde, dass sie unmethyliert sind, vollständig unmethyliert (1)
(Merlo et al., vorstehend; Herman et al., vorstehend). Jedoch war
sie in Krebszelllinien, für
die die durch eine Southern-Analyse gezeigt wurde, dass sie methyliert
sind, weitgehend methyliert (1). In
der Tat waren alle Cytosine innerhalb der CpG-Dinucleotide in dieser
Region in den Krebsarten, welche keine Transkription von 16 zeigen,
vollständig
methyliert. Dieser merkliche Unterschied zwischen den Sequenzen
nach der Bisulfitbehandlung legt nahe, dass das Verfahren der Erfindung
zur spezifischen Amplifikation von entweder methylierten oder unmethylierten
Allelen zur Identifizierung von Methylierungsmustern in einer DNA-Probe
nützlich
war.
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Die
Primer wurden so konstruiert, dass sie zwischen methylierten und
unmethylierten Allelen nach der Bisulfitbehandlung und zwischen
einer durch Bisulfit modifizierten DNA und derjenigen, die nicht
modifiziert worden ist, unterscheiden. Um dieses Ziel zu erreichen,
wurden Primersequenzen für
Regionen ausgewählt, welche
häufig
Cytosine (um eine unmodifizierte DNA von einer modifizierten DNA
zu unterscheiden) sowie CpG-Paare nahe dem 3'-Ende der Primer (um eine maximale Unterscheidung
zwischen methylierter und unmethylierter DNA in der PCR-Reaktion
vorzusehen) enthalten. Da die zwei DNA-Stränge nach der Bisulfitbehandlung
nicht länger
komplementär
sind, können
Primer für
jeden modifizierten Strang konstruiert werden. Der Einfachheit halber
wurden Primer für
den Sinnstrang konstruiert. Das zu amplifizierende DNA-Fragment war
absichtlich klein, um die Einschätzung
der Methy lierungsmuster in einer begrenzten Region zu erlauben und
die Verwendung dieser Techniken für Proben wie Paraffinblöcke, bei
denen die Amplifikation von größeren Fragmenten
nicht möglich
ist, zu ermöglichen.
In Tabelle 1 sind die Primersequenzen für alle getesteten Gene gezeigt,
wobei die Sequenzunterschiede zwischen den drei DNA-Typen, welche
der Spezifität
der MSP wegen verwendet wurden, hervorgehoben sind. Die zahlreichen
Fehlpaarungen in diesen Primern, welche für diese unterschiedlichen DNA-Typen
spezifisch sind, legen nahe, dass jeder Primersatz lediglich die
Amplifikation der gewünschten
Matrize vorsehen sollte.
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Die
für p16
konstruierten Primer wurden mit DNA von Krebszelllinien und normalen
Geweben, für
die vorher der Methylierungsstatus durch eine Southern-Analyse ermittelt
worden ist, getestet (Merlo et al., vorstehend; Herman et al., vorstehend).
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2,
Tafel A–D,
zeigt Polyacrylamidgele mit den methylierungsspezifischen PCR-Produkten
von p16. Die für
die Amplifikation verwendeten Primersätze sind bezeichnet als unmethyliert
(U), methyliert (M) oder unmodifiziert/Wildtyp (W). * kennzeichnet
das MspI-Spaltprodukt des Molekulargewichtsmarkers pBR322. Tafel
A zeigt die Amplifikation einer bisulfitbehandelten DNA aus Krebszelllinien
und normalen Lymphocyten und einer unbehandelten DNA (aus der Zelllinie
H249). Tafel B zeigt die Vermischung einer unterschiedlichen Menge
von H157-DNA mit 1 μg
H249-DNA vor der Bisulfitbehandlung zur Abschätzung der Nachweisempfindlichkeit
der MSP für
methylierte Allele. Die modifizierte DNA einer Probe eines primären Lungenkarzinoms
und einer normalen Lunge sind ebenfalls gezeigt. Tafel C zeigt die
Amplifikation mit den in Tabelle 1 beschriebenen Primern p16-U2
(U) und p16-M2 (M). Tafel D zeigt die amplifizierten p16-Produkte
von Tafel C, geschnitten mit BstUI (+) oder nicht geschnitten (–).
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In
allen Fällen
bestätigte
der verwendete Primersatz den durch die Southern-Analyse ermittelten
Methylierungsstatus. Zum Beispiel amplifizierten die Lungenkrebszelllinien
U1752 und H157 sowie andere bei p16 methylierte Zelllinien nur mit
den methylierten Primern (2, Tafel
A). Die DNA aus normalen Geweben (Lymphocyten, Lunge, Niere, Brust
und Colon) und den unmethylierten Lungenkrebszelllinien H209 und
H249 amplifizierte nur mit unmethylierten Primern (Beispiele in 2,
Tafel A). Die PCR mit diesen Primern konnte mit oder ohne 5% DMSO
durchgeführt
werden. Nicht mit Bisulfit behandelte DNA (unmodifiziert) amplifizierte weder
mit einem Satz von methylierten noch unmethylierten spezifischen
Primern, aber amplifizierte ohne weiteres mit Primern, welche vor
der Modifikation für
die Sequenz spezifisch waren (2, Tafel
A). Die DNA aus der Zelllinie H157 rief nach der Bisulfitbehandlung
ebenfalls eine schwächere
Amplifikation mit unmodifizierten Primern hervor, was auf eine unvollständige Bisulfitreaktion
hindeutet. Jedoch wird diese unmodifizierte DNA im Gegensatz zu
einer teilweise gespaltenen DNA in vorhergehenden PCR-Tests basierend
auf methylierungssensitiven Enzymen durch die Primer, welche für methylierte
DNA spezifisch sind, nicht erkannt. Auf diese Weise wird kein falsch
positives Ergebnis erhalten oder die Fähigkeit, zwischen methylierten
und unmethylierten Allelen zu unterscheiden, beeinträchtigt.
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Die
Empfindlichkeit der MSP für
den Nachweis von methylierten p16-Allelen wurde abgeschätzt. Die DNA
aus methylierten Zelllinien wurde vor der Bisulfitbehandlung mit
unmethylierter DNA vermischt. 0,1% methylierte DNA (etwa 50 pg)
wurden in einer sonst unmethylierten Probe durchgängig nachgewiesen
(2, Tafel B). Für
die Empfindlichkeitsgrenze der Menge der eingesetzten DNA, welche
mit Hilfe der MSP nachweisbar ist, wurde ein Wert von so wenig wie
1 ng menschliche DNA, gemischt mit Lachssperma-DNA als Träger, ermittelt.
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Frische
menschliche Tumorproben enthalten häufig normales Gewebe und Tumorgewebe,
wodurch der Nachweis von Veränderungen,
welche für
den Tumor spezifisch sind, erschwert wird. Jedoch deutet die Empfindlichkeit
der MSP darauf hin, dass sie auch für Primärtumore nützlich sein könnte, wodurch
der Nachweis von anomal methylierten Allelen ermöglicht wird, selbst wenn sie
einen relativ kleinen Teil der gesamten DNA in einer Probe ausmachen.
Obwohl normale Gewebe vollständig
unmethyliert waren, enthielten Tumore, für die durch eine Southern-Analyse
gezeigt wurde, dass sie bei p16 methyliert sind, in jedem Fall auch
methylierte DNA, welche mit Hilfe der MSP nachgewiesen wurde, zusätzlich zu
einigen unmethylierten Allelen (Beispiele in 2, Tafel
B). Die DNA von in Paraffin eingebetteten Tumoren wurde ebenfalls
verwendet und erlaubte den Nachweis von methylierten und unmethylierten
Allelen in diesen Proben (2, Tafel
B). Um zu bestätigen,
dass diese Ergebnisse für
diesen Primersatz nicht einmalig waren, wurde ein zweiter Stromabwärtsprimer
für p16
verwendet, welcher ein etwas größeres Fragment
amplifiziert würde
(Tabelle 1). Dieser zweite Satz von Primern reproduzierte die vorstehend
beschriebenen Ergebnisse (2, Tafel
C), wodurch der Methylierungsstatus, welcher durch eine Southern-Blot-Analyse
definiert wurde, bestätigt
wurde.
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Um
die Spezifität
der Primer für
die methylierten Allelen weiter zu bestätigen und um spezifische Cytosine
auf eine Methylierung innerhalb der amplifizierten Region zu überprüfen, wurden
die Sequenzunterschiede zwischen der methylierten/modifizierten
DNA und unmethylierten/modifizierten DNA ausgenutzt. Insbesondere
behält
die BstUI-Erkennungsstelle, CGCG, die Sequenz CGCG bei, wenn beide
Cs nach der Bisulfitbehandlung und der Amplifikation methyliert
sind, aber wird zu TGTG modifiziert, falls sie unmethyliert sind. Die
Spaltung der amplifizierten Produkte mit BstUI unterscheidet zwischen
diesen zwei Produkten. Die Restriktion von p16-amplifizierten Produkten veranschaulicht
dies. Lediglich unmodifizierte Produkte und methylierte/modifizierte
Produkte, die beide die CGCG-Stelle beibehalten, wurden durch BstUI
gespalten, während
Produkte, welche mit unmethylierten/modifizierten Primern amplifiziert
wurden, nicht gespalten wurden (2, Tafel
D).
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Die
vorstehend besprochenen Primersätze
wurden konstruiert, um stark methylierte CpG-Inseln von unmethylierten
Allelen zu unterscheiden. Um dieses Ziel zu erreichen, enthielten
sowohl die oberen (Sense) als auch die unteren (Antisense) Primer
CpG-Stellen, die methylierungsabhängige Sequenzunterschiede nach der
Bisulfitbehandlung hervorrufen können.
Die MSP kann verwendet werden, um regionalere Aspekte einer CpG-Insel-Methylierung
zu untersuchen. Um diese zu überprüfen, wurden
methylierungsabhängige
Unterschiede in der Sequenz von nur einem Primer untersucht, um
zu bestimmen, ob er immer noch eine Unterscheidung zwischen unmethylierten
und methylierten p16-Allelen erlauben würde. Der für die genomische Sequenzierung
verwendete Antisense-Primer, 5'-CTACCTAATTCCAATTCCCCTACA-3' (SEQ ID NO: 123),
wurde ebenfalls als Antisense-Primer verwendet, da die Region, die
durch den Primer erkannt wird, keine CpG-Stellen enthielt und mit
entweder einem methylierten oder unmethylierten Sense-Primer gepaart
wurde (Tabelle 1). Die Amplifikation des 313 bp großen PCR-Produkts
erfolgte nur mit dem unmethylierten Sense-Primer bei H209 und H249
(unmethyliert nach Southern) und dem methylierten Sense-Primer bei
H157 und U1752 (methyliert nach Southern), was zeigt, dass die Methylierung
von CpG-Stellen innerhalb einer definierten Region durch spezifische
Primer erkannt werden kann, wobei zwischen methylierten und unmethylierten Allelen
unterschieden werden kann (2, Tafel
E). Tafel E zeigt die Ergebnisse einer Überprüfung der regionalen Methylierung
von CpG-Inseln mit Hilfe der MSP unter Verwendung der Sense-Primer
p16-U2 (U) und p16-M2 (M), welche methylierungsspezifisch sind,
und eines Antisense-Primers, welcher nicht methylierungsspezifisch
ist.
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Beispiel 3
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Die
vorstehenden Experimente mit p16 wurden auf drei weitere Gene ausgedehnt,
deren Transkription in menschlichen Krebsarten durch eine anomale
Hypermethylierung von 5'-CpG-Inseln
abgeschaltet ist.
-
3,
Tafel A–E,
zeigt Polyacrylamidgele von MSP-Produkten einer Analyse von mehreren
Genen. Die für
die Amplifikation verwendeten Primersätze sind nicht als unmethyliert
(U), methyliert (M) oder unmodifiziert/Wildtyp (W) bezeichnet. *
kennzeichnet das MspI-Spaltprodukt des Molekulargewichtsmarkers
pBR322, und ** kennzeichnet den 123 bp-Molekulargewichtsmarker.
Alle DNA-Proben wurden mit Bisulfit behandelt, ausgenommen diejenigen,
welche als unbehandelt gekennzeichnet sind. Tafel A zeigt die Ergebnisse
einer MSP für
p15. Tafel B zeigt die p15-Produkte,
geschnitten mit BstUI (+) oder nicht geschnitten (–). Tafel
C zeigt die MSP-Produkte
für VHL.
Tafel D zeigt die VHL-Produkte, geschnitten mit BstUI (+) oder nicht
geschnitten (–).
Tafel E zeigt die MSP-Produkte für
E-Cadherin.
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Der
Cyclin-abhängige
Kinaseinhibitor p15 ist in vielen Leukämiezelllinien und primären Leukämien anomal
methyliert (Herman et al., vorstehend). Wiederum wurde mit Hilfe
der MSP der durch eine Southern-Analyse ermittelte Methylierungsstatus
für p15
bestätigt.
So amplifizierten normale Lymphocyten und die Krebszelllinien SW48
und U1752, die alle nach einer Southern-Analyse unmethyliert sind
(Herman et al., vorstehend), nur mit dem unmethylierten Satz von
Primern, während
die Lungenkrebszelllinie H1618 und die Leukämiezelllinie KG1A nur mit dem
methylierten Satz von Primern amplifizierten (3,
Tafel A), was mit den vorherigen Ergebnissen durch eine Southern-Analyse übereinstimmt
(Herman et al., vorstehend). Die Zelllinie Raji erzeugte ein starkes
PCR-Produkt mit methylierten Primern und ein schwächere Bande
mit unmethylierten Primern. Dies war das gleiche Ergebnis für die Methylierung,
welches vorher durch eine Southern-Analyse erhalten wurde (Herman
et al., vorstehend). Nichtkultivierte Leukämieproben zeigten ähnlich wie
die auf p16 untersuchten Primärtumore
eine Amplifikation mit dem methylierten Primersatz sowie dem unmethylierten Satz.
Diese Heterogenität
stimmte ebenfalls mit der Southern-Analyse überein (Herman et al., vorstehend). Wiederum
wurde wie für
p16 die unterschiedliche Modifikation von BstUI-Restriktionsstellen
in dem amplifizierten Produkt von p15 verwendet, um die spezifische
Amplifikation mit Hilfe der MSP zu bestätigen (3, Tafel B).
Die amplifizierten Produkte, welche unter Verwendung der methylierten
Primersätze
von den Zelllinien H1618 und Raij oder der unmethylierten Primersätzen erhalten
wurden, wurden durch BstUI vollständig gespalten, während unmethylierte
amplifizierte Produkte nicht gespalten wurden. Primäre AML-Proben,
welche wiederum nur eine Spaltung des methylierten Produkts zeigten,
zeigten eine geringere Gesamtspaltung. Dies deutet auf eine Heterogenität in der
Methylierung hin, welche daraus resultiert, dass in einigen Allelen
viele CpG-Stellen
innerhalb des Bereiches der Primersequenzen ausreichend methyliert
sind, um zu ermöglichen, dass
die methylierungsspezifischen Primer diese Region amplifizieren,
während
andere CpG-Stellen nicht vollständig
methyliert sind.
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Eine
anomale Methylierung der CpG-Insel-Promotorregion ist in etwa 20%
der eindeutigen Nierenkarzinome mit einer Inaktivierung des VHL-Tumorsuppressorgens
assoziiert (Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994),
9700). Dieses Ereignis ist ähnlich
wie Mutationen von VHL (Gnarra et al., Nature Genetics 7 (1994),
85) auf eindeutige Nierenkarzinome begrenzt (Herman et al., vorstehend).
Primer, welche für
die VHL-Sequenz konstruiert wurden, wurden verwendet, um die DNA
der Nierenkrebszelllinie RFX393, welche nach einer Southern-Analyse
bei VHL methyliert ist, und der Lungenkrebszelllinie U1752, welche
an diesem Locus unmethyliert ist (Herman et al., vorstehend), zu
untersuchen. In jedem Fall wurde mit Hilfe der MSP der durch eine
Southern-Analyse ermittelte Methylierungsstatus von VHL bestätigt (3,
Tafel C), und die BstUI-Restriktionsstellen-Analyse bestätigte die
PCR-Produkt-Spezifität
(3, Tafel D).
-
Die
Expression des Invasions/Metastasierungs-Suppressorgens E-Cadherin
ist durch eine anomale Methylierung des 5'-Promotors in Brust-, Prostata- und
vielen anderen Karzinomen häufig
abgeschaltet (Graff et al., vorstehend; Yoshira et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92 (1995), 7416). Es wurden Primer für die E-Cadherin-Promotorregion konstruiert,
um den Nutzen einer MSP für
dieses Gen zu untersuchen. In jedem Fall stimmte die MSP-Analyse
mit der Southern-Blot-Analyse im Hinblick auf den Methylierungsstatus
des Gens überein
(Graff et al., vorstehend). Die Brustkrebszelllinien MDA-MB-231
und HS578t sowie die Prostatakrebszelllinien DuPro und TSUPrI, welche
alle nach Southern stark methyliert sind, zeigten eine deutliche
Methylierung. MCF7, T47D, PC-3 und LNCaP, welche alle nach Southern
unmethyliert sind, zeigten in dem empfindlichen MSP-Test keinen
Hinweis auf eine Methylierung (
3, Tafel
E). Die MSP-Analyse zeigte die Anwesenheit von unmethylierten Allelen
in Hs578t, TSUPrI und DuPro auf, was mit einem geringen Prozentsatz
an unmethylierten Allelen in diesen Zelllinien übereinstimmt, der vorher durch
eine Southern-Analyse nachgewiesen wurde (Graff et al., vorstehend).
Die BstUI-Restriktionsanalyse bestätigte wiederum die Spezifität der PCR-Amplifikation.
- *
Sequenzunterschiede zwischen modifizierten Primern und unmodifizierter
DNA sind fett gedruckt hervorgehoben, und Unterschiede zwischen
methyliert/modifiziert und unmethyliert/modifiziert sind unterstrichen.
- ✝
- Die Primer wurden
nahe des Transkriptionsstartpunkts platziert. Die genomische Position
entspricht der Lage des 5'-Nucleotids
des Sense-Primers in Bezug auf den Haupttranskriptionsstartpunkt,
welcher in den folgenden Referenzen und Genbank-Hinterlegungsnummern definiert ist:
p16 (die äußerste 3'-Stelle) X94154 (Hara
E. et al., Mol. Cell Biol. 16 (1996), 859); p15 S79756 (Jo J., Cancer
Res. 54 (1994), 6353); VHL U19763 (Kuzmin I. et al., Oncogene 10
(1995), 2185); und E-Cadherin L34545 (Bussemakers M. J. et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 203 (1994), 1284).
- ✝W
- bedeutet unmodifizierte
oder Wildtyp-Primer; M bedeutet methylierungsspezifische Primer;
und U bedeutet unmethyliert-spezifische Primer (SEQ ID NO: 105–128).
-
-
-
-
Beispiel 4
-
Indirekte in-situ-p16-Methylierung
-
Indirekte
in-situ-PCR (indirekte-IS-PCR) beschreibt eine Technik, wodurch
das Amplicon durch einen zyklischen Temperaturwechsel ohne Einbau
eines Markers hergestellt wird. Am Ende der zyklischen Reaktion wird
das amplifizierte Produkt durch eine herkömmliche in-situ-Hybridisierung
unter Verwendung einer markierten Sonde nachgewiesen.
-
Probenherstellung
und Vorbehandlung
-
Paraffineingebettete,
formalinfixierte HN12-Zellen wurden für 5 Minuten in Xylol deparaffiniert,
gefolgt durch zweimaliges Spülen
für 5 Minuten
in 100% Ethanol. Die Objektträger
wurden luftgetrocknet und dann mit Proteinase K (10 μg/ml in 50
mM Tris) für
30 Minuten bei 37°C
unter einem Deckglas behandelt. Die Objektträger wurden in destilliertem
Wasser gespült
und für
10 Minuten bei 37°C
in 0,2 N NaOH gelegt und anschließend in 3 M Natriumbisulfit,
enthaltend Hydroxychinon, eingebracht. Die Lösung wurde mit Mineralöl überschichtet
und bei 50°C
für 16
Stunden stehen gelassen. Das Öl
wurde entfernt, und die Objektträger
wurden in Wasser gespült
und für
5 Minuten bei Raumtemperatur in 0,3 M NaOH gelegt. Die Objektträger wurden dann
in 70%, 80% und 100% Ethanol dehydratisiert und an der Luft getrocknet.
-
Indirekte-IS-PCR-Protokoll
-
Das
PCR-Gemisch enthielt 1 × PCR-Puffer
(16,6 mM Ammoniumsulfat/67 mM Tris, pH 8,8/6,7 mM MgCl2/10
mM 2-Mercaptoethanol), dNTPs (2,5 lambda eines 25 mM Gemisches),
300 ng jedes Primers und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase pro 50 μl-Reaktion.
Dieses Gemisch wurde bei 95°C
für 5 Minuten "heiß gestartet", dann direkt auf
die Objektträger
aufgebracht, welche mit einer GeneComb-Vorrichtung vor Ort auf 80°C vorgewärmt wurden.
Die PCR wurde mit einer Hybaid OmniGene-Cyclervorrichtung mit einem
in-situ-Modul durchgeführt.
30 Zyklen von 90°C
für 30
Sekunden, 58°C
für 45
Sekunden und 70°C
für 45
Sekunden wurden mit einer Kalibrierungszahl von 50 durchgeführt. Nach
der PCR wurden die Objektträger
sofort einmal in destilliertem Wasser gespült, gefolgt durch eine Dehydratisierung
in 70%, 80% und 100% Ethanol, und an der Luft getrocknet.
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Indirekte-IS-PCR-in-situ-Hybridisierung
und Fluoreszenznachweis
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Im
Anschluß an
die PCR wurde die Probe kurz fixiert, um die Stelle des PCR-Produkts
beizubehalten. Dies erfolgte durch Fixieren der Schnitte in 100%
Ethanol für
15 Minuten und dann Trocknenlassen davon an der Luft, bevor die
Sonde aufgebracht wurde. Ein methyliertes p16-PCR-Produkt wurde
hergestellt und mit Digoxigenin markiert und als eine markierte
Sonde für
die in-situ-Hybridisierung verwendet. Die Digoxigenin-markierte
Sonde wurde in einem Hybridisierungspuffer, enthaltend 2 × SSC/10%
Dextransulfat/50% Formamid, bis zu einer Endkonzentration von 10
ng/μl suspendiert.
10,0 μl
des Hybridisierungsgemisches (100,0 ng der Sonde) wurden auf jede
Probe aufgebracht, mit einem Deckglas bedeckt und mit Gummilösung abgedichtet.
Die Zellpräparationen
wurden dann bei 95° für 5 Minuten
inkubiert und bei 37°C über Nacht
in einer feuchten Kammer hybridisiert.
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Nach
der Hybridisierung wurden die HN12-Proben noch einmal in 2 × SSC (Natriumcitratsalz)
bei Raumtemperatur für
5 Minuten gewaschen und in 1 × PBD
(phosphatgepuffertes Detergens) bei Raumtemperatur gelegt, bevor
die Immunnachweise durchgeführt
wurden.
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Alle
hybridisierten HN12-Zellproben wurden immuncytochemisch mit Fluorescein-markiertem
Avidin (Vector Laboratories, CA) gefärbt. 60 μl Nachweisreagens, bestehend
aus Fluorescein-markiertem Avidin (10 μg/ml), 1 × PBS, 5% Trockenmilchpulver
und 0,02% Natriumazid, wurden auf den Objektträger unter einem Plastikdeckplättchen aufgebracht
und bei 37°C
für 5 Minuten
in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Objektträger wurden in 1 × PBD mehrmals
gewaschen und mit Propidiumjodid (0,3 μg/ml) in Antifade-Lösung gegengefärbt.
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Für die Fluoreszenzmikroskopie
wurde ein Zeiss-Axiophot 20-Epifluoreszenz-Mikroskop (Zeiss, Westdeutschland),
ausgerüstet
mit einer 100 Watt-Quecksilberdampflampe, einem 100 × Plan-Neofluar-Ölimmersion-Objektiv
(Zeiss, Westdeutschland), einer Zeiss-MC-100-Kamera (Zeiss, Westdeutschland)
und den geeigneten Filtersätzen
für Fluorescein
(FITC)/PI-Fluoreszenz (Chroma, VT), verwendet. Die Bildanalyse und
die Aufnahmespeicherung erfolgte unter Verwendung eines OIS (Oncor
Instrument Systems) 3CCD Cooled Camera System und der OIS 2.01 Image
Analysis Software.
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Die
HN12-Zellprobe für
die negative PCR-Kontrolle wurde durch eine erste Bisulfitreaktion
behandelt, um die DNA zu modifizieren, gefolgt durch eine PCR- Amplifikation unter
Verwendung von Primern, welche für die
methylierte DNA der Promotorregionen des p16-Gens spezifisch sind,
und einer in-situ-Hybridisierung. Die negative Kontrolle zeigte,
wie erwartet, kein sichtbares Signal, da die PCR-Reaktion unvollständig war.
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p16-methylierte
HN12-Zellen wurden der Bisulfitmodifikation, der PCR-Amplifikation unter
Verwendung von Primern, welche für
die methylierte DNA der Promotorregionen des p16-Gens spezifisch
sind, und der in-situ-Hybridisierung unter Verwendung der markierten
Sonde unterworfen. In den Zellen waren Fluoreszenzsignale erkennbar,
welche für
das amplifizierte, lokalisierte Produkt der methylierten p16-Promotorregionen
spezifisch waren.
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p16-methylierte
HN12-Zellen wurden der Bisulfitmodifikation, der PCR-Amplifikation unter
Verwendung von Primern, welche für
die unmethylierte DNA der Promotorregionen des p16-Gens spezifisch
sind, und der in-situ-Hybridisierung unter Verwendung der markierten
Sonde unterworfen. In den Zellen waren keine Fluoreszenzsignale
erkennbar.
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Beispiel 5
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Untersuchung
des Nutzens der MSP für
Methylierungsveränderungen
in Sputumproben
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Die
MSP ist auf den Nachweis von Methylierungsveränderungen in der DNA von Sputumproben
untersucht worden. Die getesteten Proben schlossen die Primer für p16 (Tabelle
1; SEQ ID NO: 105–110)
und die aus Sputumproben extrahierte DNA von zwei Patienten mit
einer nachgewiesenen Lungenkrebserkrankung ein. Die unmethylierten
Allele für
p16 wurden nachgewiesen, jedoch wurden keine methylierten Allele nachgewiesen.
Es scheint, da die MSP im Hinblick auf die nicht-methylierten Allele
wirksam war, dass die Tumore der Patienten kein methyliertes p16
aufwiesen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde eine Sputumprobe
mit Zellen der etablierten Lungenkrebszelllinie Calu3, welche ein
hypermethyliertes p16-Gen aufweist, versetzt. Diese methylierten
p16-Allele wurden ohne weiteres in diesem DNA-Gemisch nachgewiesen.
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Beispiel 6
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Verwendung der MSP zum
Nachweis einer hMLH1- und hMSH2-Hypermethylierung
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Die
hMLH1- und hMSH2-Gene codieren Fehlpaarungs-Reparaturproteine, und
Mutationen in jedem der Gene können
vererbte Formen von Colonkrebs, welche durch eine Mikrosatelliteninstabilität gekennzeichnet
sind, hervorrufen. Etwa 20% der Patienten mit einer nicht-vererbten
Colonkrebserkrankung weisen auch Tumore mit dem Mikrosatelliteninstabilitäts-Phänotyp auf.
Der genaue Mechanismus, durch den diese letzteren Tumore hervorgerufen
werden, ist unklar. Kane et al. (Cancer Research 57 (1997), 808)
haben in einer kleinen Schriftenreihe berichtet, dass Tumore von
Patienten mit der sporadischen Form von Colonkrebserkrankungen mit
einer Mikrosatelliteninstabilität
eine Hypermethylierung des Promotors des hMLH1-Gens aufweisen. Eine MSP unter Verwendung
des Primersatzes und der Bedingungen für hMSH2 und hMLH1 (Tabelle
2; SEQ ID NO: 161–172)
wurde dazu verwendet, diese Beobachtung in einer größeren Reihe
von Tumoren zu verfolgen. Von 14 Patienten mit solchen Tumoren zeigten
85% eine Hypermethylierung von hMLH1, während nur 5% von 21 Colontumoren
ohne eine Mikrosatelliteninstabilität diese Veränderung zeigten. In beiden
Gruppen wurde keine Hypermethylierung von hMSH2 beobachtet. Die
Daten zeigen, dass etwa 15% aller Patienten mit Colonkrebs, welche
bekanntermaßen
Tumore mit einer Mikrosatelliteninstabilität aufweisen, eine Hypermethylierung
des hMLH1-Gens in der Tumor-DNA aufweisen und dass die mit dieser
Veränderung
assoziierte Abschaltung der Transkription in dieser Situation die
Ursache der genetischen Instabilität ist.
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Beispiel 7
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MSP-Untersuchungen des
Gewebeinhibitors des Metalloproteinase II (TIMP-2)-Gens
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TIMP-2
ist ein Mitglied der Familie der Metalloproteinase-Inhibitoren,
welche notwendig sind, um das invasive Potenzial mehrerer Zelltypen
einzuschränken.
Unter Verwendung der MSP-Primer und der Bedingungen für dieses
Gen (Tabelle 2; SEQ ID NO: 157–160)
wurde eine Hypermethylierung des TIMP-2-Promotors in etwa 50% der
primären
Colonkrebsarten nachgewiesen. Diese Veränderung und der damit verbundene
Verlust der Expression dieses Gens könnten ein Schlüsselfaktor
bei der Erhöhung
des invasiven Potenzials für die
involvierten Colonkrebsarten sein.
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Beispiel 8
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MSP-Untersuchungen der
TGF-beta-Rezeptor-I- und -II-Gene
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Die
vorstehend angegebenen MSP-Primer und Bedingungen (Tabelle 2; SEQ
ID NO: 177–184)
sind erfolgreich auf die TGF-beta-Rezeptor-I- und -II-Gene angewendet
worden, und bis heute ist kein Hinweis auf eine Promotor-Hypermethylierung
in Tumoren gefunden worden.
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Dementsprechend
wird die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche begrenzt.
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