KR20230049122A - 비호지킨 림프종의 검출 - Google Patents
비호지킨 림프종의 검출 Download PDFInfo
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Abstract
암 스크리닝을 위한 기술, 특히 비호지킨 림프종(NHL) 및 NHL 하위유형(예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)의 존재를 검출하기 위한 방법, 조성물 및 관련 용도가 본 명세서에 제공되지만 이들로 제한되지 않는다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2020년 8월 19일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/067,592호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
기술 분야
암 스크리닝을 위한 기술, 특히 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma: NHL) 및 NHL 하위유형(예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma: DLBCL), 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)의 존재를 검출하기 위한 방법, 조성물 및 관련 용도가 본 명세서에 제공되지만 이에 한정되지 않는다.
림프종은 남성과 여성의 대략 2.1%가 일생 중 어느 시점에 비호지킨 림프종(NHL) 진단을 받는 중요한 건강 문제이다. 림프종은 남성과 여성 모두에서 여섯 번째로 흔한 암이다. 2009년 내지 2013년에, 미국 전체에서 림프종의 연령 표준화 발병률(age-adjusted incidence)은 연간 19.1건/100,000명이다(문헌[Siegel RL, et al., CA Cancer J Clin. 2016 Jan;66(1):7-30] 참조). 림프종은 22.5/100,000으로 전국적으로 가장 높은 발병률을 보이는 미네소타가 있는 미국 중서부 지역에 특히 중요하다. 아이오와에서도 22.1/100,000으로 유사한 발병률을 보인다(문헌[Siegel RL, et al., CA Cancer J Clin. 2016 Jan;66(1):7-30] 참조). 림프종 연구의 발전으로 지난 20년 동안 림프종으로 인한 사망률이 꾸준히 감소하였지만, 림프종은 여전히 상당한 고통과 사망을 초래한다. 2016년 미국에서 림프종으로 인해 약 20,150명이 사망하였다.
림프종은 호지킨(HL) 및 비호지킨(NHL)으로 광범위하게 분류된다. NHL 내에는 2016년에 발표된 새로 개정된 WHO 분류에 자세히 설명된 여러 하위유형이 있다(문헌[Swerdlow SH, et al., Blood 2016; 127(20): 2375-2390] 참조). 가장 흔한 NHL은 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL)으로 전체 사례의 30%를 차지하며, 여포성 림프종(FL)이 20%, T-세포 림프종이 전체 사례의 15%를 차지한다. 예후는 이러한 다양한 유형에 따라 크게 다르다(문헌[Swerdlow SH, et al., Blood 2016; 127(20): 2375-2390] 참조).
공지된 림프종이 없는 환자에 대한 간단한 스크리닝 테스트는 없으며; 따라서, 대부분의 환자는 질환의 일부 증상 또는 징후 없이 1차 진료 환경에서 CT 또는 PET으로 스크리닝을 받지 않는다. 대부분의 환자는 혹이 발견되거나, 증상(예를 들어, 피로, 체중 감소, 발열)이 발생하거나 또는 다른 의학적 테스트 또는 절차 시에 림파절증(adenopathy)이 발견될 때 림프종이 있는 것으로 발견된다. 간단한 조직-기반 및/또는 혈액-기반 스크리닝 테스트에 대한 충족되지 않은 수요가 있다. 일단 진단되면, 병기는 1기 내지 4기의 전통적인 Ann Arbor 분류를 따른다. 일반적으로, 질환 초기 단계의 환자는 진단 시 질환이 널리 퍼진 환자에 비해 생존율이 더 우수하며(문헌[Carbone PP, et al. Cancer Res. 1971 Nov;31(11):1860-1] 참조), 따라서 병기는 국제 예후 지수(International Prognostic Index)의 핵심 구성요소이다(문헌[The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project. A Predictive Model for Aggressive Non-Hodgkin's Lymphoma. N Engl J Med. 1993 Sep 30;329(14):987-94] 참조). 요법이 완료된 후, 증상이 없이 일상적인 종양 이미징(감시)은 일상적으로 수행되지 않는다.
따라서, 비호지킨 림프종을 검출하기 위한 개선된 방법이 필요하다.
본 발명은 이러한 필요성을 다룬다.
메틸화된 DNA는 대부분의 종양 유형의 조직에서 잠재적인 바이오마커의 클래스로 연구되었다. 많은 경우에, DNA 메틸트랜스퍼레이스는 유전자 발현의 후생적 제어로서 사이토신-포스페이트-구아닌(cytosine-phosphate-guanine: CpG) 섬(island) 부위의 DNA에 메틸기를 부가한다. 생물학적으로 매력적인 메커니즘에서, 종양 억제인자 유전자의 프로모터 영역에서 획득된 메틸화 이벤트는 침묵 발현을 침묵시키고 따라서 종양발생에 기여하는 것으로 생각된다. DNA 메틸화는 RNA 또는 단백질 발현보다 더욱 화학적 및 생물학적으로 안정적인 진단 도구일 수 있다(Laird (2010) Nat Rev Genet 11: 191-203). 또한, 산발적 결장암과 같은 다른 암에서, 메틸화 마커는 우수한 특이성을 제공하며, 개별 DNA 돌연변이보다 더 광범위하게 정보를 제공하며 민감하다(Zou et al (2007) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16: 2686-96).
CpG 섬의 분석은 동물 모델 및 인간 세포주에 적용될 때 중요한 발견을 가져왔다. 예를 들어, Zhang과 동료들은 동일한 CpG 섬의 상이한 부분으로부터의 앰플리콘이 상이한 수준의 메틸화를 가질 수 있음을 발견하였다(Zhang et al. (2009) PLoS Genet 5: e1000438). 또한, 메틸화 수준은 고도로 메틸화된 서열과 메틸화되지 않은 서열 사이에 이원화되게 분포되어, DNA 메틸트랜스퍼레이스 활성의 이원 스위치-유사 패턴(binary switch-like pattern)을 뒷받침한다(Zhang et al. (2009) PLoS Genet 5: e1000438). 생체내 뮤린 조직 및 시험관내 세포주의 분석은 높은 CpG 밀도 프로모터(HCP, 300개의 염기쌍 영역 내에서 7% 초과의 CpG 서열을 갖는 것으로 정의됨)의 약 0.3%만이 메틸화되는 반면, 낮은 CpG 밀도 영역(LCP, 300개의 염기쌍 영역 내에서 5% 미만의 CpG 서열을 갖는 것으로 정의됨)은 동적 조직-특이적 패턴으로 자주 메틸화되는 경향이 있음을 입증하였다(Meissner et al. (2008) Nature 454: 766-70). HCP는 유비쿼터스 하우스키핑 유전자와 고도로 조절된 발달 유전자에 대한 프로모터를 포함한다. 50% 초과의 메틸화된 HCP 부위 중에는 Wnt 2, NDRG2, SFRP2 및 BMP3와 같은 몇 가지 확립된 마커가 있다(Meissner et al. (2008) Nature 454: 766-70).
DNA 메틸트랜스퍼레이스에 의한 사이토신-포스페이트-구아닌(CpG) 섬 부위에서 DNA의 후생적 메틸화는 대부분의 종양 유형의 조직에서 잠재적인 바이오마커의 클래스로 연구되었다. 생물학적으로 매력적인 메커니즘에서, 종양 억제인자 유전자의 프로모터 영역에서 획득된 메틸화 이벤트는 침묵 발현을 침묵시키고 따라서 종양발생에 기여하는 것으로 생각된다. DNA 메틸화는 RNA 또는 단백질 발현보다 더욱 화학적 및 생물학적으로 안정적인 진단 도구일 수 있다. 또한, 산발적 결장암과 같은 다른 암에서, 메틸화 마커는 우수한 특이성을 제공하며, 개별 DNA 돌연변이보다 더 광범위하게 정보를 제공하며 민감하다.
신규한 메틸화 마커를 검색하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. CpG 메틸화의 마이크로-어레이-기반 조사는 합리적이고, 고속 대량 접근법이지만, 이 전략은 알려진 관심 영역, 주로 확립된 종양 억제인자 프로모터 쪽으로 편향되어 있다. DNA 메틸화의 전장 유전체 분석을 위한 대안적인 방법이 지난 10년 동안 개발되었다. 네 가지 기본 접근법이 있다. 첫 번째 접근법은 특정 메틸화된 부위를 인식하는 제한 효소에 의한 DNA의 소화를 사용한 후, 몇 가지 가능한 분석 기법(예컨대, 메틸화-특이적 PCR; MSP)을 통해 효소 인식 부위로 제한된 메틸화 데이터 또는 정량화 단계에서 DNA를 증폭시키는 데 사용되는 프라이머를 제공하는 것이다. 두 번째 접근법은 메틸-사이토신 또는 기타 메틸화-특이적 결합 도메인으로 지시된 항체를 사용하여 게놈 DNA의 메틸화된 분획을 강화시킨 다음, 마이크로어레이 분석 또는 시퀀싱을 통해 단편을 참조 게놈에 매핑하는 것이다. 이 접근법은 단편 내 모든 메틸화된 부위의 단일 뉴클레오타이드 분해능을 제공하지 않는다. 세 번째 접근법은 DNA의 바이설파이트 처리로 시작하여 메틸화되지 않은 모든 사이토신을 우라실로 전환한 다음, 어댑터 리간드에 커플링한 후 제한 효소 소화 및 모든 단편의 완전한 시퀀싱을 수행한다. 제한 효소의 선택은 CpG 밀집 영역에 대한 단편을 풍부하게 하여 분석 중에 여러 유전자 위치에 매핑될 수 있는 불필요한 서열의 수를 줄일 수 있다. 네 번째 접근법은 변형되지 않은 사이토신에 영향을 미치지 않고 5-메틸사이토신 및 5-하이드록시메틸사이토신을 파괴하지 않으며 직접적인 검출을 위한 바이설파이트가 없는 염기-분해능 시퀀싱 방법인 TET-보조 피리딘 보레인 시퀀싱(TET-assisted pyridine borane sequencing: TAPS)을 기술하는 DNA의 바이설파이트가 없는 처리를 포함한다(문헌[Liu et al., 2019, Nat Biotechnol. 37, pp. 424-429] 참조). 일부 실시형태에서, 특정 효소적 전환 접근법에 관계없이, 메틸화된 사이토신만이 전환된다.
감소된 표현 바이설파이트 시퀀싱(Reduced Representation Bisulfite Sequencing: RRBS)은 모든 CpG 섬의 80% 내지 90%의 단일 뉴클레오타이드 분해능에서 CpG 메틸화 상태 데이터를 생성하고, 중간 내지 높은 판독 범위에서 대부분의 종양 억제인자 프로모터를 생성한다. 암 사례 - 대조군 연구에서, 이러한 판독값의 분석으로 인해 차별적으로 메틸화된 영역(differentially methylated region: DMR)이 식별된다. 췌장암 표본에 대한 이전의 RRBS 분석에서는 수백 개의 DMR이 발견되었으며, 이 중 다수는 발암과 관련이 전혀 없었고, 이 중 다수는 주석이 지정되지 않았다. 독립 조직 샘플 세트에 대한 추가 검증 연구는 성능 면에서 100% 민감하고 특이적인 마커 CpG를 확인하였다.
비호지킨 림프종(NHL) 암 스크리닝을 위한 기술, 특히 NHL 및 NHL 하위유형(예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)의 존재를 검출하기 위한 방법, 조성물 및 관련 용도가 본 명세서에 제공되지만 이로 제한되지 않는다.
실제로, 실시예 I에 기재된 바와 같이, 본 발명에 대한 실시형태를 확인하기 위한 과정 동안 수행된 실험은 비신생물 대조군 DNA로부터의 NHL 유래 DNA 및 비신생물 대조군 DNA로부터의 NHL 하위유형 유래 DNA의 암을 구별하기 위한 차별적으로 메틸화된 영역(DMR)의 신규한 세트를 확인하였다.
이러한 실험은 NHL 암 조직을 비신생물 림프샘 조직과 구별하는 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커를 열거하고 설명한다(표 1 내지 표 4, 실시예 I 참조).
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 NHL 조직을 비신생물 림프샘 조직과 구별할 수 있는 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 혈액 샘플(예를 들어, 혈장 샘플, 전혈 샘플, 혈청 샘플)에서 NHL을 검출하기 위한 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 여포성 림프종 조직을 비신생물 림프샘 조직과 구별할 수 있는 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 혈액 샘플(예를 들어, 혈장 샘플, 전혈 샘플, 혈청 샘플)에서 여포성 림프종을 검출하기 위한 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 DLBCL 조직을 비신생물 림프샘 조직과 구별할 수 있는 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 혈액 샘플(예를 들어, 혈장 샘플, 전혈 샘플, 혈청 샘플)에서 DLBCL을 검출하기 위한 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 외투 세포 림프종 조직을 비신생물 림프샘 조직과 구별할 수 있는 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 혈액 샘플(예를 들어, 혈장 샘플, 전혈 샘플, 혈청 샘플)에서 외투 세포 림프종을 검출하기 위한 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 변연부 림프종 조직을 비신생물 림프샘 조직과 구별할 수 있는 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 혈액 샘플(예를 들어, 혈장 샘플, 전혈 샘플, 혈청 샘플)에서 변연부 림프종을 검출하기 위한 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 말초 T-세포 림프종 조직을 비신생물 림프샘 조직과 구별할 수 있는 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 혈액 샘플(예를 들어, 혈장 샘플, 전혈 샘플, 혈청 샘플)에서 말초 T-세포 림프종을 검출하기 위한 다음 마커 및/또는 마커의 패널을 확인하였다:
본 명세서에 기재된 바와 같이, 기술은 비호지킨 림프종(NHL) 전체 및 다양한 유형의 NHL(예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)에 대해 높은 식별력을 갖는 다수의 메틸화된 DNA 마커 및 이의 서브세트(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 25개, 50개, 57개, 75개, 85개, 99개, 100개, 110개, 125개, 150개, 175개, 200개, 220개, 250개, 275개, 283개, 282개, 285개 마커의 세트)를 제공한다. 실험은 후보 마커에 선택 필터를 적용하여 NHL 및 NHL 하위유형 스크리닝 또는 진단 목적을 위해 높은 특이도를 제공하기 위해 높은 신호대 잡음비(signal to noise ratio) 및 낮은 배경 수준을 제공하는 마커를 식별하였다.
일부 실시형태에서, 기술은 생물학적 샘플(예를 들어, 림프샘 조직, 혈장 샘플)에서 본 명세서에서 확인된 마커 중 하나 이상의 존재 및 메틸화 상태를 평가하는 것에 관한 것이다. 이들 마커는 본 명세서에서 논의된 바와 같은, 예를 들어, 표 1 및 표 3에 제공된 바와 같은 하나 이상의 차별적으로 메틸화된 영역(DMR)을 포함한다. 메틸화된 상태는 기술의 실시형태에서 평가된다. 이와 같이, 본 명세서에 제공된 기술은 유전자의 메틸화 상태가 측정되는 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 메틸화 상태는 게놈 스캐닝 방법에 의해 측정된다. 예를 들어, 한 가지 방법은 제한 랜드마크 게놈 스캐닝을 포함하고(Kawai et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 7421-7427), 또 다른 예는 메틸화-민감성 임의로 프라이밍된 PCR을 포함한다(Gonzalgo et al. (1997) Cancer Res. 57: 594-599). 일부 실시형태에서, 특정 CpG 부위에서의 메틸화 패턴의 변화는 메틸화-민감성 제한 효소로 게놈 DNA를 소화시킨 후 관심 영역을 서던 분석(소화-서던 방법)함으로써 모니터링된다. 일부 실시형태에서, 메틸화 패턴의 변화를 분석하는 것은 PCR 증폭 전에 메틸화-민감성 제한 효소 또는 메틸화-의존적 제한 효소로 게놈 DNA를 소화시키는 것을 포함하는 PCR-기반 과정을 포함한다(Singer-Sam et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 687). 또한, 메틸화 분석의 시작점으로서 DNA의 바이설파이트 처리를 이용하는 다른 기법이 보고되었다. 이들은 메틸화-특이적 PCR(methylation-specific PCR: MSP)(Herman et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821-9826) 및 바이설파이트-전환된 DNA로부터 증폭된 PCR 산물의 제한 효소 소화(Sadri and Hornsby (1996) Nucl. Acids Res. 24: 5058-5059; 및 Xiong and Laird (1997) Nucl. Acids Res. 25: 2532-2534)를 포함한다. PCR 기법은 유전자 돌연변이의 검출(Kuppuswamy et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1143-1147) 및 대립유전자-특이적 발현의 정량화(Szabo and Mann (1995) Genes Dev. 9: 3097-3108; 및 Singer-Sam et al. (1992) PCR Methods Appl. 1: 160-163)를 위해 개발되었다. 이러한 기법은 PCR-생성된 주형에 어닐링하고 검정할 단일 뉴클레오타이드의 5'를 즉시 중단하는 내부 프라이머를 사용한다. 미국 특허 제7,037,650호에 기술되어 있는 바와 같은 "정량적 Ms-SNuPE 검정"을 사용하는 방법이 일부 실시형태에서, 사용된다.
메틸화 상태를 평가할 때, 메틸화 상태는 종종 특정 부위(예를 들어, 단일 뉴클레오타이드에서, 특정 영역 또는 유전자좌에서, 더 긴 관심 서열, 예를 들어, 최대 약 100-bp, 200-bp, 500-bp, 1000-bp 이상의 DNA의 하위서열에서)를 포함하는 샘플의 전체 DNA 집단과 비교하여 해당 특정 부위에서 메틸화된 개별 DNA 가닥의 분율(fraction) 또는 백분율로 표현된다. 전통적으로, 메틸화되지 않은 핵산의 양은 교정기(calibrator)를 사용하여 PCR에 의해 결정된다. 그런 다음, 공지된 양의 DNA가 바이설파이트 처리(또는 비-바이설파이트 처리(문헌[Liu et al., 2019, Nat Biotechnol. 37, pp. 424-429] 참조))되고, 실시간 PCR 또는 다른 대수증폭, 예를 들어, QuARTS 검정(예를 들어, 미국 특허 제8,361,720호; 제8,715,937호; 제8,916,344호; 및 제9,212,392호에 제공된 바와 같음)을 사용하여 생성된 메틸화-특이적 서열이 결정된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 방법은 외부 표준을 사용함으로써 메틸화되지 않은 표적에 대한 표준 곡선을 생성하는 단계를 포함한다. 표준 곡선은 적어도 2개의 지점으로부터 구성되며, 메틸화되지 않은 DNA에 대한 실시간 Ct 값을 공지된 정량적 표준과 관련시킨다. 그런 다음, 메틸화된 표적에 대한 제2 표준 곡선이 적어도 2개의 지점과 외부 표준으로부터 구성된다. 이 제2 표준 곡선은 메틸화된 DNA에 대한 Ct를 공지된 정량적 표준과 관련시킨다. 다음으로, 테스트 샘플 Ct 값이 메틸화된 집단 및 메틸화되지 않은 집단에 대해 결정되고, DNA의 게놈 등가물이 처음 두 단계에 의해 생성된 표준 곡선으로부터 계산된다. 관심 부위에서의 메틸화 백분율은 집단의 총 DNA의 양에 대한 메틸화된 DNA의 양으로부터, 예를 들어, (다수의 메틸화된 DNA)/(다수의 메틸화된 DNA + 다수의 메틸화되지 않은 DNA) × 100으로부터 계산된다.
일부 실시형태에서, 복수의 상이한 표적 영역은 참조 표적 영역을 포함하고, 소정의 바람직한 실시형태에서, 참조 표적 영역은 β-액틴 및/또는 ZDHHC1 및/또는 B3GALT6을 포함한다.
또한, 방법을 실시하기 위한 조성물 및 키트가 본 명세서에 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 MDM에 특이적인 시약(예를 들어, 프라이머, 프로브)가 단독으로 또는 세트(예를 들어, 복수의 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍의 세트)로 제공된다. 검출 검정을 수행하기 위한 추가적인 시약(예를 들어, 효소, 완충액, QuARTS, PCR, 시퀀싱을 수행하기 위한 양성 및 음성 대조군, 바이설파이트, 10번-11번 전좌(Ten-Eleven Translocation: TET) 효소(예를 들어, 인간 TET1, 인간 TET2, 인간 TET3, 뮤린 TET1, 뮤린 TET2, 뮤린 TET3, 나에글레리아(Naegleria) TET(NgTET), 코프리놉시스 시네레아(Coprinopsis cinerea)(CcTET)) 또는 이의 변이체), 유기 보레인 또는 기타 검정)이 또한 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 메틸화-특이적 방식(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소, 10번-11번 전좌(TET) 효소(예를 들어, 인간 TET1, 인간 TET2, 인간 TET3, 뮤린 TET1, 뮤린 TET2, 뮤린 TET3, 나에글레리아 TET(NgTET), 코프리놉시스 시네레아(CcTET)) 또는 이들의 변이체), 유기 보레인)으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약 및/또는 본 명세서에 기재된 단백질 마커의 증가된 수준을 검출할 수 있는 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법을 수행하는 데 필요하거나, 충분하거나 또는 유용한 하나 이상의 시약을 포함하는 키트가 제공된다. 또한, 시약을 포함하는 반응 혼합물이 제공된다. 반응 혼합물을 완성하기 위해 서로 및/또는 테스트 샘플에 첨가될 수 있는 복수의 시약을 포함하는 마스터 믹스 시약 세트가 추가로 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 기술은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제공되는 일련의 산술 또는 논리 연산을 수행하도록 설계된 프로그래밍 가능한 기계와 관련이 있다. 예를 들어, 기술의 일부 실시형태는 컴퓨터 소프트웨어 및/또는 컴퓨터 하드웨어(예를 들어, 이들에서의 구현)와 관련이 있다. 일 양태에서, 기술은 메모리 형태, 산술 및 논리 연산을 수행하기 위한 요소 및 데이터를 판독, 조작 및 저장하기 위한 일련의 명령(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 방법)을 실행하기 위한 처리 요소(예를 들어, 마이크로프로세서)를 포함하는 컴퓨터에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 마이크로프로세서는 (예를 들어, 하나 이상의 DMR, 예를 들어, 표 1 및 표 3에 제공된 바와 같은 DMR 1 내지 285의) 메틸화 상태를 결정하고; (예를 들어, 하나 이상의 DMR, 예를 들어, 표 1 및 표 3에 제공된 바와 같은 DMR 1 내지 285의) 메틸화 상태를 비교하고; 표준 곡선을 생성하고; Ct 값을 결정하고; (예를 들어, 하나 이상의 DMR, 예를 들어, 표 1 및 표 3에 제공된 바와 같은 DMR 1 내지 285의) 메틸화의 분율, 빈도 또는 백분율을 계산하고; CpG 섬을 확인하고; 검정 또는 마커의 특이도 및/또는 민감도를 결정하고; ROC 곡선 및 관련 AUC를 계산하고; 서열을 분석하기 위한 시스템의 일부이며; 모두 본 명세서에 기재된 바와 같거나 또는 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 마이크로프로세서 또는 컴퓨터는 암 부위를 예측하기 위해 알고리즘에서 메틸화 상태 데이터를 사용한다.
일부 실시형태에서, 소프트웨어 또는 하드웨어 구성요소는 다중 검정 결과를 수신하고, (예를 들어, 표 1 및 표 3에 제공된 바와 같은, 예를 들어, 다중 DMR의 메틸화 상태를 결정하는) 다중 검정의 결과를 기반으로 암 위험을 나타내는 사용자에게 보고할 단일 값 결과를 결정한다. 관련 실시형태는, 예를 들어, 다중 마커(예를 들어, 표 1 및 표 3에 제공된 바와 같은 다중 DMR)의 메틸화 상태를 결정하는 다중 검정으로부터의 결과의 수치적 조합(예를 들어, 가중 조합, 선형 조합)을 기반으로 위험 인자를 계산한다. 일부 실시형태에서, DMR의 메틸화 상태는 차원을 정의하고, 다차원적 공간에서 값을 가질 수 있으며, 다중 DMR의 메틸화 상태에 의해 정의된 좌표는, 예를 들어, 암 위험과 관련된 사용자에게 보고하기 위한 결과이다.
일부 실시형태는 저장 매체 및 메모리 구성요소를 포함한다. 메모리 구성요소(예를 들어, 휘발성 및/또는 비휘발성 메모리)는 명령(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 과정의 실시형태) 및/또는 데이터(예를 들어, 메틸화 측정값, 서열 및 이와 관련된 통계적 설명과 같은 작업물)를 저장하는 데 사용된다. 일부 실시형태는 또한 CPU, 그래픽 카드 및 사용자 인터페이스(예를 들어, 디스플레이와 같은 출력 장치 및 키보드와 같은 입력 장치 포함) 중 하나 이상을 포함하는 시스템에 관한 것이다.
기술과 관련된 프로그래밍 가능한 기계는 기존의 종래 기술 및 개발 중이거나 또는 아직 개발되지 않은 기술(예를 들어, 양자 컴퓨터, 화학 컴퓨터, DNA 컴퓨터, 광학 컴퓨터, 스핀트로닉스 기반 컴퓨터 등)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 기술은 데이터를 전송하기 위한 유선(예를 들어, 금속 케이블, 광섬유) 또는 무선 전송 매체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태는 네트워크(예를 들어, 근거리 통신망(local area network: LAN), 광역 통신망(wide area network: WAN), 애드혹 네트워크, 인터넷 등)를 통한 데이터 전송에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 프로그래밍 가능한 기계는 피어(peer)와 같이 이러한 네트워크 상에 존재하고, 일부 실시형태에서, 프로그래밍 가능한 기계는 클라이언트/서버 관계를 갖는다.
일부 실시형태에서, 데이터는 하드 디스크, 플래시 메모리, 광학 매체, 플로피 디스크 등과 같은 컴퓨터-판독 가능한 저장 매체에 저장된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 수행하기 위해 협력하여 작동하는 복수의 프로그래밍 가능한 장치와 연관된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 복수의 컴퓨터(예를 들어, 네트워크에 의해 연결됨)는, 예를 들어, 이더넷, 광섬유 또는 무선 네트워크 기술과 같은 종래의 네트워크 인터페이스에 의해 네트워크(사설, 공용 또는 인터넷)에 연결된 클러스터 컴퓨팅 또는 그리드 컴퓨팅 또는 완전한 컴퓨터(온보드 CPU, 저장장치, 전원 공급장치, 네트워크 인터페이스 등 포함)에 의존하는 일부 다른 분산 컴퓨터 구조의 구현에서 데이터를 수집하고 처리하기 위해 병렬로 작동할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시형태는 컴퓨터-판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터를 제공한다. 실시형태는 프로세서에 결합된 랜덤 액세스 메모리(random access memory: RAM)를 포함한다. 프로세서는 메모리에 저장된 컴퓨터-실행 가능한 프로그램 명령을 실행한다. 이러한 프로세서는 마이크로프로세서, ASIC, 상태 기계 또는 기타 프로세서를 포함할 수 있으며, 인텔 코포레이션(Intel Corporation)(캘리포니아주 산타클라라 소재) 및 모토로라 코포레이션(Motorola Corporation)(일리노이주 샴버그 소재)의 프로세서와 같은 컴퓨터 프로세서 중 임의의 것일 수 있다. 이러한 프로세서는 매체, 예를 들어, 프로세서에 의해 실행될 때 프로세서가 본 명세서에 기재된 단계를 수행하게 하는 명령을 저장하는 컴퓨터-판독 가능한 매체를 포함하거나 또는 이와 통신할 수 있다.
컴퓨터-판독 가능한 매체의 실시형태는 프로세서에 컴퓨터-판독 가능한 명령을 제공할 수 있는 전자, 광학, 자기 또는 기타 저장 또는 전송 장치를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 적합한 매체의 다른 예는 플로피 디스크, CD-ROM, DVD, 자성 디스크, 메모리 칩, ROM, RAM, ASIC, 환경 설정된 프로세서(configured processor), 모든 광학 매체, 모든 자기 테이프 또는 다른 자기 매체 또는 컴퓨터 프로세서가 명령을 판독할 수 있는 임의의 다른 매체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 또한, 다양한 다른 형태의 컴퓨터-판독 가능한 매체는 라우터, 개인 또는 공용 네트워크 또는 유선 및 무선 둘 다의 기타 전송 장치 또는 채널을 포함하여 컴퓨터에 명령을 전송 또는 전달할 수 있다. 명령은, 예를 들어, C, C++, C#, Visual Basic, Java, Python, Perl 및 JavaScript를 포함하는 임의의 적합한 컴퓨터-프로그래밍 언어의 코드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 컴퓨터는 네트워크에 연결된다. 컴퓨터는 또한 마우스, CD-ROM, DVD, 키보드, 디스플레이 또는 다른 입력 또는 출력 장치와 같은 여러 외부 또는 내부 장치를 포함할 수 있다. 컴퓨터의 예는 개인용 컴퓨터, 정보 단말기(digital assistant), 개인용 정보 단말기, 휴대폰(cellular phone, mobile phone), 스마트폰, 호출기, 디지털 태블릿, 랩톱 컴퓨터, 인터넷 장비 및 기타 프로세서-기반 장치이다. 일반적으로, 본 명세서에 제공된 기술의 양태와 관련된 컴퓨터는 본 명세서에 제공된 기술을 포함하는 하나 이상의 프로그램을 지원할 수 있는 Microsoft Windows, Linux, UNIX, Mac OS X 등과 같은 임의의 운영 체제에서 작동하는 임의의 유형의 프로세서-기반 플랫폼일 수 있다. 일부 실시형태는 다른 응용 프로그램(예를 들어, 애플리케이션)을 실행하는 개인용 컴퓨터를 포함한다. 애플리케이션은 메모리에 포함될 수 있으며, 예를 들어, 워드 프로세싱 애플리케이션, 스프레드시트 애플리케이션, 이메일 애플리케이션, 인스턴트 메신저 애플리케이션, 프리젠테이션 애플리케이션, 인터넷 브라우저 애플리케이션, 캘린더/오거나이저 애플리케이션 및 클라이언트 장치에서 실행할 수 있는 임의의 다른 애플리케이션을 포함할 수 있다.
해당 기술과 관련하여 본 명세서에 기재된 이러한 모든 구성요소, 컴퓨터 및 시스템은 논리(logical) 또는 가상(virtual)일 수 있다.
따라서, 대상체로부터 얻은 샘플에서 NHL 및/또는 다양한 형태의 NHL(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)을 스크리닝하는 방법과 관련된 기술이 본 명세서에 제공되며, 해당 방법은 대상체로부터 얻은 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)(예를 들어, 혈장 샘플)에서 마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계 및 마커의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 마커의 메틸화 상태와 상이할 때, 대상체가 NHL 및/또는 NHL의 특정 하위유형이 있는 것으로 확인하는 단계를 포함하되, 마커는 표 1 및 표 3에 제공된 바와 같이 DMR 1 내지 285로 이루어진 군으로부터 선택되는 차별적으로 메틸화된 영역(DMR)의 염기를 포함한다.
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 NHL이 있음을 나타낸다: ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503(표 2, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 NHL이 있음을 나타낸다: BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 NHL이 있음을 나타낸다: BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 4, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 NHL이 있음을 나타낸다: BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 여포성 림프종이 있음을 나타낸다: ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6(표 6, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 여포성 림프종이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 여포성 림프종이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503(표 6, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 여포성 림프종이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 여포성 림프종이 있음을 나타낸다: HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1(표 18, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 DLBCL이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 DLBCL이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 DLBCL이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 DLBCL이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 DLBCL이 있음을 나타낸다: MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1(표 18, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 외투 세포 림프종이 있음을 나타낸다: CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C(표 8, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 외투 세포 림프종이 있음을 나타낸다: BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1(표 14, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 외투 세포 림프종이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 8, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 외투 세포 림프종이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C(표 14, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 변연부 림프종이 있음을 나타낸다: CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5(표 9, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 변연부 림프종이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 변연부 림프종이 있음을 나타낸다: BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266(표 9, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 변연부 림프종이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태가 상이한 일부 실시형태에서, 대상체는 변연부 림프종이 있음을 나타낸다: CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5(실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 변연부 림프종이 있음을 나타낸다: CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5(실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 말초 T-세포 림프종이 있음을 나타낸다: CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 말초 T-세포 림프종이 있음을 나타낸다: GABRG3, ITGA5 및 JUP(표 16, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 말초 T-세포 림프종이 있음을 나타낸다: ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 말초 T-세포 림프종이 있음을 나타낸다: BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1(표 16, 실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 림프샘 조직인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 말초 T-세포 림프종이 있음을 나타낸다: CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5(실시예 I 참조).
대상체로부터 얻은 샘플이 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈)인 일부 실시형태에서, 다음 마커 중 하나 이상의 메틸화 상태가 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체에서 검정된 하나 이상의 마커의 메틸화 상태와 상이하면 대상체는 말초 T-세포 림프종이 있음을 나타낸다: CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5(실시예 I 참조).
기술은 NHL 및/또는 다양한 형태의 NHL(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)을 확인하고 구별하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태는, 예를 들어, 2개 내지 11개 내지 100개, 또는 120개, 또는 198개 또는 285개의 마커(예를 들어, 1개 내지 4개, 1개 내지 6개, 1개 내지 7개, 1개 내지 8개, 1개 내지 9개, 1개 내지 10개, 1개 내지 11개, 1개 내지 12개, 1개 내지 13개, 1개 내지 14개, 1개 내지 15개, 1개 내지 16개, 1개 내지 17개, 1개 내지 18개, 1개 내지 19개, 1개 내지 20개, 1개 내지 25개, 1개 내지 50개, 1개 내지 75개, 1개 내지 100개, 1개 내지 150개, 1개 내지 198개, 1개 내지 285개)(예를 들어, 2개 내지 4개, 2개 내지 6개, 2개 내지 7개, 2개 내지 8개, 2개 내지 9개, 2개 내지 10개, 2개 내지 11개, 2개 내지 12개, 2개 내지 13개, 2개 내지 14개, 2개 내지 15개, 2개 내지 16개, 2개 내지 17개, 2개 내지 18개, 2개 내지 19개, 2개 내지 20개, 2개 내지 25개, 2개 내지 50개, 2개 내지 75개, 2개 내지 100개, 2개 내지 198개, 2개 내지 285)(예를 들어, 3개 내지 4개, 3개 내지 6개, 3개 내지 7개, 3개 내지 8개, 3개 내지 9개, 3개 내지 10개, 3개 내지 11개, 3개 내지 12개, 3개 내지 13개, 3개 내지 14개, 3개 내지 15개, 3개 내지 16개, 3개 내지 17개, 3개 내지 18개, 3개 내지 19개, 3개 내지 20개, 3개 내지 25개, 3개 내지 50개, 3개 내지 75개, 3개 내지 100개, 3개 내지 198개, 3개 내지 285개)(예를 들어, 4개 내지 5개, 4개 내지 6개, 4개 내지 7개, 4개 내지 8개, 4개 내지 9개, 4개 내지 10개, 4개 내지 11개, 4개 내지 12개, 4개 내지 13개, 4개 내지 14개, 4개 내지 15개, 4개 내지 16개, 4개 내지 17개, 4개 내지 18개, 4개 내지 19개, 4개 내지 20개, 4개 내지 25개, 4개 내지 50개, 4개 내지 75개, 4개 내지 100개, 4개 내지 198개, 4개 내지 285)(예를 들어, 5개 내지 6개, 5개 내지 7개, 5개 내지 8개, 5개 내지 9개, 5개 내지 10개, 5개 내지 11개, 5개 내지 12개, 5개 내지 13개, 5개 내지 14개, 5개 내지 15개, 5개 내지 16개, 5개 내지 17개, 5개 내지 18개, 5개 내지 19개, 5개 내지 20개, 5개 내지 25개, 5개 내지 50개, 5개 내지 75개, 5개 내지 100개, 5개 내지 198개, 5개 내지 285)를 검정하는 단계를 포함하는, 복수의 마커를 검정하는 방법을 제공한다.
기술은 평가된 메틸화 상태에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 샘플에서 마커의 메틸화 상태를 평가하는 것은 하나의 염기의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플에서 마커의 메틸화 상태를 검정하는 것은 복수의 염기에서 메틸화의 정도를 결정하는 것을 포함한다. 또한, 일부 실시형태에서, 마커의 메틸화 상태는 정상 마커의 메틸화 상태에 비해 마커의 증가된 메틸화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 마커의 메틸화 상태는 정상 마커의 메틸화 상태에 비해 마커의 감소된 메틸화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 마커의 메틸화 상태는 정상 마커의 메틸화 상태에 비해 마커의 상이한 패턴의 메틸화를 포함한다.
또한, 일부 실시형태에서, 마커는 100개 이하의 염기 영역이거나, 마커는 500개 이하의 염기 영역이거나, 마커는 1000개 이하의 염기 영역이거나, 마커는 5000개 이하의 염기 영역이거나 또는 일부 실시형태에서, 마커는 하나의 염기이다. 일부 실시형태에서, 마커는 높은 CpG 밀도 프로모터에 있다.
기술은 샘플 유형에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플), 혈액 샘플(예를 들어, 혈장, 혈청, 전혈), 배설물 또는 소변 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 위액 분비물, 췌액, 척수액(CSF) 샘플, 위장 생검 샘플 및/또는 대변으로부터 회수된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 샘플은 림프샘, 유방, 간, 담관, 췌장, 위, 결장, 직장, 식도, 소장, 맹장, 십이지장, 폴립, 담낭, 항문 및/또는 복막으로부터의 세포, 분비물 또는 조직을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 세포액, 복수, 소변, 배설물, 위 분비물, 췌장액, 내시경 검사 동안 얻은 체액, 혈액, 점막 또는 타액을 포함한다.
또한, 기술은 메틸화 상태를 결정하기 위해 사용된 방법에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 검정은 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화 특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 검정은 메틸화 특이적 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 기술은 메틸화 상태를 결정하기 위한 대량 병렬 시퀀싱(예를 들어, 차세대 시퀀싱), 예를 들어, 합성에 의한 시퀀싱, 실시간(예를 들어, 단일-분자) 시퀀싱, 비드 에멀션 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱 등을 사용한다.
기술은 DMR을 검출하기 위한 시약을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서는 서열번호 1 내지 124로 제공된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트가 제공되다(표 5 참조). 일부 실시형태에서, DMR에서 염기를 갖는 염색체 영역에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, DMR의 메틸화 상태에 민감한 올리고뉴클레오타이드가 제공된다.
기술은 NHL을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 2, 실시예 I 참조).
기술은 NHL을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 11, 실시예 I 참조).
기술은 NHL을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 4, 실시예 I 참조).
기술은 NHL을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 11, 실시예 I 참조).
기술은 여포성 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 6, 실시예 I 참조).
기술은 여포성 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 12, 실시예 I 참조).
기술은 여포성 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 6, 실시예 I 참조).
기술은 여포성 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 12, 실시예 I 참조).
기술은 여포성 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 18, 실시예 I 참조).
기술은 DLBCL을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 7, 실시예 I 참조).
기술은 DLBCL을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 13, 실시예 I 참조).
기술은 DLBCL을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 주석을 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 7, 실시예 I 참조).
기술은 DLBCL을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 13, 실시예 I 참조).
기술은 DLBCL을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 18, 실시예 I 참조).
기술은 외투 세포 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 8, 실시예 I 참조).
기술은 외투 세포 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 14, 실시예 I 참조).
기술은 외투 세포 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 8, 실시예 I 참조).
기술은 외투 세포 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 14, 실시예 I 참조).
기술은 변연부 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 9, 실시예 I 참조).
기술은 변연부 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(실시예 I 참조).
기술은 변연부 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 15, 실시예 I 참조).
기술은 변연부 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 9, 실시예 I 참조).
기술은 변연부 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 15, 실시예 I 참조).
기술은 말초 T-세포 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 10, 실시예 I 참조).
기술은 말초 T-세포 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(실시예 I 참조).
기술은 말초 T-세포 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 GABRG3, ITGA5 및 JUP라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 16, 실시예 I 참조).
기술은 말초 T-세포 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 10, 실시예 I 참조).
기술은 말초 T-세포 림프종을 확인하기 위해 사용되는 마커의 다양한 패널을 제공하며, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마커는 BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1이라는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함한다(표 16, 실시예 I 참조).
키트 실시형태가 제공되며, 예를 들어, 키트는 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소, 10번 11번 전좌(TET) 효소(예를 들어, 인간 TET1, 인간 TET2, 인간 TET3, 뮤린 TET1, 뮤린 TET2, 뮤린 TET3, 나에글레리아 TET(NgTET), 코프리놉시스 시네레아(CcTET)) 또는 이들의 변이체), 유기 보레인); 및 DMR 1 내지 285(표 1 및 표 3)로부터의 하나 이상의 서열을 포함하고 암이 없는 대상체와 관련된 메틸화 상태를 갖는 대조군 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이설파이트 시약 및 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소, 10번 11번 전좌(TET) 효소(예를 들어, 인간 TET1, 인간 TET2, 인간 TET3, 뮤린 TET1, 뮤린 TET2, 뮤린 TET3, 나에글레리아 TET(NgTET), 코프리놉시스 시네레아(CcTET)) 또는 이들의 변이체), 유기 보레인); 및 DMR 1 내지 285(표 1 및 표 3)로부터의 하나 이상의 서열을 포함하고 특정 유형의 암이 있는 대상체와 관련된 메틸화 상태를 갖는 대조군 핵산을 포함한다. 일부 키트 실시형태는 대상체로부터의 샘플(예를 들어, 대변 샘플; 조직 샘플; 혈장 샘플, 혈청 샘플, 전혈 샘플)을 얻기 위한 샘플 수집기; 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소, 10번 11번 전좌(TET) 효소(예를 들어, 인간 TET1, 인간 TET2, 인간 TET3, 뮤린 TET1, 뮤린 TET2, 뮤린 TET3, 나에글레리아 TET(NgTET), 코프리놉시스 시네레아(CcTET)) 또는 이들의 변이체), 유기 보레인); 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
기술은 조성물의 실시형태(예를 들어, 반응 혼합물)에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, DMR을 포함하는 핵산과 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소, 10번 11번 전좌(TET) 효소(예를 들어, 인간 TET1, 인간 TET2, 인간 TET3, 뮤린 TET1, 뮤린 TET2, 뮤린 TET3, 나에글레리아 TET(NgTET), 코프리놉시스 시네레아(CcTET)) 또는 이들의 변이체), 유기 보레인)을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태는 DMR을 포함하는 핵산과 본 명세서에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태는 DMR을 포함하는 핵산과 메틸화-민감성 제한 효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태는 DMR을 포함하는 핵산과 폴리머레이스를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가적인 관련된 방법 실시형태가 대상체로부터 얻은 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플; 혈장 샘플; 대변 샘플)에서 NHL 및/또는 다양한 형태의 NHL(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)을 스크리닝하기 위해 제공되며, 예를 들어, 해당 방법은 DMR 1 내지 285(표 1 및 표 3) 중 하나 이상인 DMR의 염기를 포함하는 샘플에서 마커의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 대상체 샘플로부터의 마커의 메틸화 상태를 NHL(예를 들어, NHL 및/또는 다음 NHL 중 한 형태: DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)이 없는 대상체로부터의 정상 대조군 샘플로부터의 마커의 메틸화 상태와 비교하는 단계; 및 대상체 샘플과 정상 대조군 샘플의 메틸화 상태 차이의 신뢰 구간 및/또는 P값을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신뢰 구간은 90%, 95%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 99.99%이고, P값은 0.1, 0.05, 0.025, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001 또는 0.0001이다. 방법의 일부 실시형태는 DMR을 포함하는 핵산과 메틸화-특이적 방식으로 핵산을 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소, 10번 11번 전좌(TET) 효소(예를 들어, 인간 TET1, 인간 TET2, 인간 TET3, 뮤린 TET1, 뮤린 TET2, 뮤린 TET3, 나에글레리아 TET(NgTET), 코프리놉시스 시네레아(CcTET)) 또는 이들의 변이체), 유기 보레인)을 반응시켜, 예를 들어, 메틸화-특이적 방식으로 변형된 핵산을 생산하는 단계; 메틸화-특이적 방식으로 변형된 핵산을 시퀀싱하여 메틸화-특이적 방식으로 변형된 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 단계; 메틸화-특이적 방식으로 변형된 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 특정 유형의 암이 없는 대상체로부터의 DMR을 포함하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 비교하여 두 서열의 차이를 확인하는 단계; 및 차이가 있을 때 대상체가 특정 유형의 암이 있는 것으로 확인하는 단계를 제공한다. 일부 실시형태에서, 암은 NHL(예를 들어, NHL 및/또는 다음 NHL 중 한 형태: DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)이다.
대상체로부터 얻은 샘플에서 NHL 또는 NHL의 하위유형을 스크리닝하기 위한 시스템이 해당 기술에 의해 제공된다. 시스템의 예시적인 실시형태는, 예를 들어, 대상체로부터 얻은 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플; 혈장 샘플; 대변 샘플)에서 NHL 및/또는 NHL의 유형(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)을 스크리닝하기 위한 시스템을 포함하며, 해당 시스템은 샘플의 메틸화 상태를 결정하도록 구성된 분석 구성요소, 샘플의 메틸화 상태를 데이터베이스에 기록된 대조군 샘플 또는 참조 샘플 메틸화 상태와 비교하도록 구성된 소프트웨어 구성요소 및 림프종-관련 메틸화 상태를 사용자에게 경고하도록 구성된 경고 구성요소를 포함한다. 경고는, 일부 실시형태에서, (예를 들어, 표 1 및 표 3에 제공된 바와 같은, 예를 들어, 다중 마커, 예를 들어, DMR의 메틸화 상태를 결정하는) 다중 검정으로부터 결과를 수신하고 여러 결과에 기초하여 보고하기 위한 값 또는 결과를 계산하는 소프트웨어 구성요소에 의해 결정된다. 일부 실시형태는 사용자(예를 들어, 예컨대, 의사, 간호사, 임상의 등)에게 보고하기 위한 값 또는 결과 및/또는 경고를 계산하는 데 사용하기 위해 본 명세서에 제공된 각각의 DMR과 연관된 가중 매개변수의 데이터베이스를 제공한다. 일부 실시형태에서, 다중 검정으로부터의 모든 결과가 보고되고, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 결과는 대상체의 암 위험을 나타내는 다중 검정으로부터의 하나 이상의 결과의 조합에 기초한 점수, 값 또는 결과를 제공하는 데 사용된다.
시스템의 일부 실시형태에서, 샘플은 DMR을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 시스템은 핵산을 단리하기 위한 구성요소, 대변 샘플 및/또는 혈장 샘플을 수집하기 위한 구성요소와 같은 샘플을 수집하기 위한 구성요소를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 시스템은 DMR을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 데이터베이스는 NHL 및/또는 특정 유형의 NHL(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)이 없는 대상체로부터의 핵산 서열을 포함한다. 또한, 핵산, 예를 들어, 핵산 세트가 제공되며, 각 핵산은 DMR을 포함하는 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 핵산 세트는 각 핵산이 NHL 및/또는 특정 유형의 NHL(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)이 없는 대상체로부터의 서열을 갖는다. 관련 시스템 실시형태는 기재된 바와 같은 핵산 세트 및 해당 핵산 세트와 관련된 핵산 서열의 데이터베이스를 포함한다. 일부 실시형태는 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소, 10번 11번 전좌(TET) 효소(예를 들어, 인간 TET1, 인간 TET2, 인간 TET3, 뮤린 TET1, 뮤린 TET2, 뮤린 TET3, 나에글레리아 TET(NgTET), 코프리놉시스 시네레아(CcTET)) 또는 이들의 변이체), 유기 보레인)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태는 핵산 서열 분석기를 추가로 포함한다.
소정의 실시형태에서, 인간 환자로부터의 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플; 혈장 샘플; 전혈 샘플; 혈청 샘플; 대변 샘플)을 특성화하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 실시형태는 인간 환자의 샘플로부터 DNA를 얻는 단계; 표 1 및 표 3으로부터의 DMR 1 내지 285로 이루어진 군으로부터 선택되는 차별적으로 메틸화된 영역(DMR)의 염기를 포함하는 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계; 및 하나 이상의 DNA 메틸화 마커의 검정된 메틸화 상태를 NHL 및/또는 특정 유형의 NHL(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)이 없는 인간 환자에 대한 하나 이상의 DNA 메틸화 마커에 대한 메틸화 참조 수준과 비교하는 단계를 포함한다.
이러한 방법은 인간 환자로부터의 특정 유형의 샘플로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 샘플은 림프샘 조직 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 혈장 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플, 림프샘 조직 샘플, 혈액 샘플(예를 들어, 혈장 샘플, 전혈 샘플, 혈청 샘플) 또는 소변 샘플이다.
일부 실시형태에서, 이러한 방법은 복수의 DNA 메틸화 마커(예를 들어, 1개 내지 4개, 1개 내지 6개, 1개 내지 7개, 1개 내지 8개, 1개 내지 9개, 1개 내지 10개, 1개 내지 11개, 1개 내지 12개, 1개 내지 13개, 1개 내지 14개, 1개 내지 15개, 1개 내지 16개, 1개 내지 17개, 1개 내지 18개, 1개 내지 19개, 1개 내지 20개, 1개 내지 25개, 1개 내지 50개, 1개 내지 75개, 1개 내지 100개, 1개 내지 150개, 1개 내지 198개, 1개 내지 285개)(예를 들어, 2개 내지 4개, 2개 내지 6개, 2개 내지 7개, 2개 내지 8개, 2개 내지 9개, 2개 내지 10개, 2개 내지 11개, 2개 내지 12개, 2개 내지 13개, 2개 내지 14개, 2개 내지 15개, 2개 내지 16개, 2개 내지 17개, 2개 내지 18개, 2개 내지 19개, 2개 내지 20개, 2개 내지 25개, 2개 내지 50개, 2개 내지 75개, 2개 내지 100개, 2개 내지 198개, 2개 내지 285개)(예를 들어, 3개 내지 4개, 3개 내지 6개, 3개 내지 7개, 3개 내지 8개, 3개 내지 9개, 3개 내지 10개, 3개 내지 11개, 3개 내지 12개, 3개 내지 13개, 3개 내지 14개, 3개 내지 15개, 3개 내지 16개, 3개 내지 17개, 3개 내지 18개, 3개 내지 19개, 3개 내지 20개, 3개 내지 25개, 3개 내지 50개, 3개 내지 75개, 3개 내지 100개, 3개 내지 198개, 3개 내지 285개)(예를 들어, 4개 내지 5개, 4개 내지 6개, 4개 내지 7개, 4개 내지 8개, 4개 내지 9개, 4개 내지 10개, 4개 내지 11개, 4개 내지 12개, 4개 내지 13개, 4개 내지 14개, 4개 내지 15개, 4개 내지 16개, 4개 내지 17개, 4개 내지 18개, 4개 내지 19개, 4개 내지 20개, 4개 내지 25개, 4개 내지 50개, 4개 내지 75개, 4개 내지 100개, 4개 내지 198개, 4개 내지 285개)(예를 들어, 5개 내지 6개, 5개 내지 7개, 5개 내지 8개, 5개 내지 9개, 5개 내지 10개, 5개 내지 11개, 5개 내지 12개, 5개 내지 13개, 5개 내지 14개, 5개 내지 15개, 5개 내지 16개, 5개 내지 17개, 5개 내지 18개, 5개 내지 19개, 5개 내지 20개, 5개 내지 25개, 5개 내지 50개, 5개 내지 75개, 5개 내지 100개, 5개 내지 198개, 5개 내지 285개)를 검정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 2개 내지 11개의 DNA 메틸화 마커를 검정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 12개 내지 120개의 DNA 메틸화 마커를 검정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 2개 내지 285개의 DNA 메틸화 마커를 검정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 샘플에서 하나 이상의 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계를 포함하고, 하나의 염기의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 샘플에서 하나 이상의 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계를 포함하고, 복수의 염기에서 메틸화의 정도를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 정방향 가닥의 메틸화 상태를 검정하거나 또는 역방향 가닥의 메틸화 상태를 검정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, DNA 메틸화 마커는 100개 이하의 염기 영역이다. 일부 실시형태에서, DNA 메틸화 마커는 500개 이하의 염기 영역이다. 일부 실시형태에서, DNA 메틸화 마커는 1000개 이하의 염기 영역이다. 일부 실시형태에서, DNA 메틸화 마커는 5000개 이하의 염기 영역이다. 일부 실시형태에서, DNA 메틸화 마커는 하나의 염기이다. 일부 실시형태에서, DNA 메틸화 마커는 높은 CpG 밀도 프로모터에 있다.
일부 실시형태에서, 검정은 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화 특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 검정은 메틸화 특이적 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 메틸화 특이적 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 124(표 5)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503(표 2, 실시예 I 참조)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5(실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 4, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6(표 6, 실시예 I 참조)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503(표 6, 실시예 I 참조)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C(표 8, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1(표 14, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 8, 실시예 I 참조)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C(표 14, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5(표 9, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266(표 9, 실시예 I 참조)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, GABRG3, ITGA5 및 JUP(표 16, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1(표 16, 실시예 I 참조)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역이 DNA 메틸화 마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이러한 방법은 2개의 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 표 1 및/또는 표 3의 행에서 제공되는 DNA 메틸화 마커 쌍의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 기술은 인간 환자로부터 얻은 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플; 혈장 샘플; 전혈 샘플; 혈청 샘플; 대변 샘플)을 특성화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 표 1 및 표 3으로부터의 DMR 1 내지 285로 이루어진 군으로부터 선택되는 DMR의 염기를 포함하는 샘플에서 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 환자 샘플로부터의 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 NHL 암 및/또는 특정 형태의 NHL(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)이 없는 인간 대상체의 정상 대조군 샘플로부터의 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태와 비교하는 단계; 및 인간 환자 및 정상 대조군 샘플의 메틸화 상태 차이의 신뢰 구간 및/또는 P값을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신뢰 구간은 90%, 95%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 99.99%이고, P값은 0.1, 0.05, 0.025, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001 또는 0.0001이다.
소정의 실시형태에서, 기술은 인간 대상체로부터 얻은 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플; 혈장 샘플; 전혈 샘플; 혈청 샘플; 대변 샘플)을 특성화하는 방법을 제공하며, 해당 방법은 DMR을 포함하는 핵산을 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)과 반응시켜 메틸화-특이적 방식으로 변형된 핵산을 생산하는 단계; 메틸화-특이적 방식으로 변형된 핵산을 시퀀싱하여 메틸화-특이적 방식으로 변형된 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 단계; 메틸화-특이적 방식으로 변형된 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체로부터의 DMR을 포함하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 두 서열의 차이를 확인하는 단계를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 기술은 인간 대상체로부터 얻은 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플; 혈장 샘플; 대변 샘플)을 특성화하기 위한 시스템을 제공하며, 시스템은 샘플의 메틸화 상태를 결정하도록 구성된 분석 구성요소, 샘플의 메틸화 상태를 데이터베이스에 기록된 대조군 샘플 또는 참조 샘플 메틸화 상태와 비교하도록 구성된 소프트웨어 구성요소 및 메틸화 상태의 조합에 기초하여 단일 값을 결정하고 사용자에게 NHL-관련 메틸화 상태를 경고하도록 구성된 경고 구성요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 DMR을 포함하는 핵산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 이러한 시스템은 핵산을 단리하기 위한 구성요소를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스템은 샘플을 수집하기 위한 구성요소를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플, 림프샘 조직 샘플, 혈액 샘플(예를 들어, 혈장 샘플, 전혈 샘플, 혈청 샘플) 또는 소변 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 위액 분비물, 췌액, 척수액(CSF) 샘플, 위장 생검 샘플 및/또는 대변으로부터 회수된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 샘플은 림프샘, 유방, 간, 담관, 췌장, 위, 결장, 직장, 식도, 소장, 맹장, 십이지장, 폴립, 담낭, 항문 및/또는 복막으로부터의 세포, 분비물 또는 조직을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 세포액, 복수, 소변, 배설물, 위 분비물, 췌장액, 내시경 검사 동안 얻은 체액, 혈액을 포함한다.
일부 실시형태에서, 데이터베이스는 DMR을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 데이터베이스는 NHL 또는 NHL의 하위유형이 없는 대상체로부터의 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 방법은 얻어진 생물학적 샘플(예를 들어, 대변 샘플, 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직), 기관 분비 샘플, CSF 샘플, 타액 샘플, 혈액 샘플, 혈장 샘플 또는 소변 샘플)내에서 NHL 또는 NHL의 하위유형과 일치하고/하거나 또는 관련된 하나 이상의 유전적 병태의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 더 포함한다. 이러한 방법은 NHL 또는 NHL의 하위유형과 일치하고/하거나 또는 관련된 유전적 병태에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 유전적 병태는 염색체 이수성(aneuploidy)이다. 일부 실시형태에서, 유전적 병태는 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 증폭 돌연변이 또는 유전자 돌연변이 데이터베이스에 등록된 임의의 다른 돌연변이이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 NHL 또는 NHL의 하위유형과 일치하고/하거나 또는 관련된 유전적 병태의 존재 또는 부재의 이러한 추가 검출은 하나 이상의 유형의 암의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 본 명세서에 기재된 마커와 조합하여 사용된다. 일부 실시형태에서, 임의의 유형의 암과 일치하고/하거나 관련된 하나 이상의 유전적 병태의 존재 또는 부재의 이러한 추가 검출은 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 대한 수행 결론을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 임의의 유형의 암과 일치하고/하거나 관련된 하나 이상의 유전적 병태의 존재 또는 부재의 이러한 추가 검출은 본 명세서에 기재된 임의의 방법의 결론을 위한 확인으로서 사용된다.
대상체로부터 얻은 샘플에서 하나 이상의 클래스의 바이오마커의 하나 이상의 구성원(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상의 구성원)의 존재 및/또는 염색체 이수성의 존재를 검출하기 위한 방법 및 물질이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 클래스의 바이오마커의 하나 이상의 구성원의 존재 및/또는 염색체 이수성의 존재는 (예를 들어, 테스트 절차 자체가 시스템의 여러 개별 테스트 방법을 포함할 수 있는 실시형태를 포함하는 하나의 테스트 절차에서) 동시에 테스트된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 클래스의 바이오마커의 하나 이상의 구성원의 존재 및/또는 염색체 이수성의 존재는 (예를 들어, 테스트 절차 자체가 시스템의 여러 개별 테스트 방법을 포함할 수 있는 실시형태를 포함하는 2개 이상의 상이한 시점에서 수행되는 2개 이상의 상이한 테스트 절차에서) 순차적으로 테스트된다. 하나 이상의 클래스의 바이오마커의 하나 이상의 구성원의 존재 및/또는 염색체 이수성의 존재에 대한 동시 및 순차적 테스트 모두의 일부 실시형태에서, 테스트는 단일 샘플에 대해 수행될 수 있거나 또는 2개 이상의 상이한 샘플(예를 들어, 동일한 대상체로부터 얻은 2개 이상의 상이한 샘플)에 대해 수행될 수 있다.
추가적인 실시형태는 본 명세서에 포함된 교시에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다.
도 1: 표 1 및 표 3에 인용된 다양한 메틸화된 DNA 마커에 사용된 마커 염색체 영역 및 관련 프라이머 및 프로브 정보. PCR 표적 영역으로부터의 자연 발생적 서열(WT) 및 바이설파이트-변형된 서열(BST)이 나타나 있다.
정의
본 기술의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 아래에 정의된다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 다음 용어는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 본 명세서에 명시적으로 연관된 의미를 취한다. 본 명세서에서 사용되는 어구 "일 실시형태에서"는 반드시 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니지만 그럴 수도 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 어구 "또 다른 실시형태에서"는 반드시 상이한 실시형태를 지칭하는 것은 아니지만 그럴 수도 있다. 따라서, 아래 기재된 바와 같이, 본 발명의 다양한 실시형태는 본 발명의 범주 또는 사상을 벗어나지 않고 쉽게 조합될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 포괄적인 "또는" 연산자이며, 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 용어 "및/또는"과 동일하다. 용어 "기반으로 하는"은 배타적이지 않으며, 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 기재되지 않은 추가적인 인자를 기반으로 하는 것을 허용한다. 또한, 명세서 전반에 걸쳐, 단수형의 의미는 복수의 참조를 포함한다. "~에(in)"의 의미는 "~에" 및 "~상에(on)"를 포함한다.
본 출원의 청구범위에서 사용되는 접속구 "로 본질적으로 이루어진"은 문헌[In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976)]에 논의된 바와 같이 청구된 발명의 특정 물질 또는 단계 "및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들"로 청구범위를 제한한다. 예를 들어, 인용된 요소로 "본질적으로 이루어진" 조성물은 오염물질이 존재하더라도 순수한 조성물, 즉, 인용된 구성요소"로 이루어진" 조성물과 비교할 때 인용된 조성물의 기능을 변경하지 않는 수준으로 인용되지 않은 오염물질을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "하나 이상"은 1보다 큰 수를 지칭한다. 예를 들어, 용어 "하나 이상"은 다음 중 임의의 것을 포함한다: 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상 또는 이보다 더 많은 수.
용어 "1개 이상 이보다 큰 수 미만", "2개 이상 이보다 큰 수 미만", "3개 이상 이보다 큰 수 미만", "4개 이상 이보다 큰 수 미만", "5개 이상 이보다 큰 수 미만", "6개 이상 이보다 큰 수 미만", "7개 이상 이보다 큰 수 미만", "8개 이상 이보다 큰 수 미만", "9개 이상 이보다 큰 수 미만", "10개 이상 이보다 큰 수 미만", "11개 이상 이보다 큰 수 미만", "12개 이상 이보다 큰 수 미만", "13개 이상 이보다 큰 수 미만", "14개 이상 이보다 큰 수 미만" 또는 "15개 이상 이보다 큰 수 미만"은 더 큰 수에 한정되지 않는다. 예를 들어, 더 큰 수는 10,000, 1,000, 100, 50 등일 수 있다. 예를 들어, 더 큰 수는 대략 50(예를 들어, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 32, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "핵산" 또는 "핵산 분자"는 일반적으로 변형되지 않거나 또는 변형된 DNA 또는 RNA일 수 있는 임의의 리보핵산 또는 데옥시리보핵산을 지칭한다. "핵산"은 제한 없이 단일-가닥 및 이중-가닥 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산"은 또한 하나 이상의 변형된 염기를 포함하는 위에 기재된 바와 같은 DNA를 포함한다. 따라서, 안정성을 위해 또는 다른 이유로 변형된 백본이 있는 DNA는 "핵산"이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산"은, 예를 들어, 단순 세포 및 복합 세포를 포함하는 바이러스 및 세포의 특징인 DNA의 화학적 형태뿐만 아니라 이러한 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 핵산을 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 2개 이상, 바람직하게는 3개 초과, 일반적으로 10개 초과의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 갖는 분자를 지칭한다. 정확한 크기는 올리고뉴클레오타이드의 최종 기능 또는 용도에 따라 달라지는 많은 인자에 따라 달라질 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 화학적 합성, DNA 복제, 역전사 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다. DNA에 대한 전형적인 데옥시리보뉴클레오타이드는 티민, 아데닌, 사이토신 및 구아닌이다. RNA에 대한 전형적인 리보뉴클레오타이드는 우라실, 아데닌, 사이토신 및 구아닌이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 핵산의 "유전자좌" 또는 "영역"은 핵산의 하위영역, 예를 들어, 염색체 상의 유전자, 단일 뉴클레오타이드, CpG 섬 등을 지칭한다.
용어 "상보적인" 및 "상보성"은 염기-페어링 규칙과 관련된 뉴클레오타이드(예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드) 또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 뉴클레오타이드의 서열)를 지칭한다. 예를 들어, 서열 5'-A-G-T-3'는 서열 3'-T-C-A-5'에 대해 상보적이다. 상보성은 염기 페어링 규칙에 따라 핵산의 염기 중 일부만이 일치하는 "부분적"일 수 있다. 또는, 핵산 사이에 "완전한(complete 또는 total)" 상보성이 있을 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율성 및 강도에 영향을 미친다. 이는 증폭 반응 및 핵산 간의 결합에 의존하는 검출 방법에서 특히 중요하다.
용어 "유전자"는 RNA, 또는 폴리펩타이드 또는 이의 전구체의 생산에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열을 지칭한다. 기능적 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 목적하는 활성 또는 기능적 특성(예를 들어, 효소적 활성, 리간드 결합, 신호 전달 등)이 유지되는 한 전장 코딩 서열 또는 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 암호화될 수 있다. 유전자와 관련하여 사용될 때 용어 "일부"는 해당 유전자의 단편을 지칭한다. 단편은 몇 개의 뉴클레오타이드에서 전체 유전자 서열에서 1개의 뉴클레오타이드를 뺀 것까지 다양할 수 있다. 따라서, "유전자의 적어도 일부를 포함하는 뉴클레오타이드"는 유전자의 단편 또는 전체 유전자를 포함할 수 있다.
용어 "유전자"는 또한 구조 유전자의 코딩 영역을 포함하고, 예를 들어, 유전자가 전장 mRNA(예를 들어, 코딩, 조절, 구조 및 기타 서열 포함)의 길이에 상응하도록 양쪽 말단에서 약 1kb의 거리에 대해 5' 말단 및 3' 말단 모두에서 코딩 영역에 인접하여 위치한 서열을 포함한다. 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열은 5' 비번역(non-translated 또는 untranslated) 서열로 지칭된다. 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열은 3' 비번역 서열로 지칭된다. 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태를 모두 포함한다. 일부 유기체(예를 들어, 진핵생물)에서, 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론" 또는 "개재 영역" 또는 "개재 서열"이라고 하는 논코딩 서열로 중단된 코딩 영역을 포함한다. 인트론은 핵 RNA(hnRNA)로 전사되는 유전자의 분절이며; 인트론은 인핸서와 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 인트론은 핵 또는 1차 전사체로부터 제거되거나 또는 "스플라이싱"되며; 따라서, 메신저 RNA(mRNA) 전사체에는 인트론이 없다. mRNA는 초기(nascent) 폴리펩타이드에서 아미노산의 순서(sequence 또는 order)를 지정하기 위해 번역 중에 기능한다.
인트론을 포함하는 것 외에도, 유전자의 게놈 형태는 또한 RNA 전사체에 존재하는 서열의 5' 말단 및 3' 말단 모두에 위치한 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 "플랭킹" 서열 또는 영역으로 지칭된다(이러한 플랭킹 서열은 mRNA 전사체 상에 존재하는 비번역 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치함). 5' 플랭킹 영역은 유전자의 전사를 제어하거나 또는 이에 영향을 미치는 프로모터 및 인핸서와 같은 조절 서열을 포함할 수 있다. 3' 플랭킹 영역은 전사의 종결, 전사후 절단 및 폴리아데닐화를 지시하는 서열을 포함할 수 있다.
유전자와 관련하여 만들어진 용어 "야생형"은 자연 발생적 공급원으로부터 단리된 유전자의 특성을 갖는 유전자를 지칭한다. 유전자 산물과 관련하여 만들어진 용어 "야생형"은 자연 발생적 공급원으로부터 단리된 유전자 산물의 특성을 갖는 유전자 산물을 지칭한다. 객체에 적용되는 용어 "자연 발생적"은 객체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 사람의 손에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 자연 발생적이다. 야생형 유전자는 종종 집단에서 가장 자주 관찰되는 유전자 또는 대립유전자이며, 따라서 임의로 유전자의 "정상" 또는 "야생형" 형태로 지정된다. 대조적으로, 유전자 또는 유전자 산물을 언급할 때 용어 "변형된" 또는 "돌연변이체"는 각각 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교할 때 서열 및/또는 기능적 특성(예를 들어, 변경된 특성)의 변형을 나타내는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 자연 발생적 돌연변이체가 단리될 수 있다는 점에 유의하여야 하며; 이들은 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교할 때 변경된 특성을 가지고 있다는 사실에 의해 확인된다.
용어 "대립유전자"는 유전자의 변이를 지칭하며; 변이는 변이체 및 돌연변이체, 다형성 유전자좌 및 단일 뉴클레오타이드 다형성 유전자좌, 프레임쉬프트 및 스플라이스 돌연변이를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 대립유전자는 집단에서 자연 발생할 수 있거나 또는 집단의 임의의 특정 개체의 일생 동안 발생할 수 있다.
따라서, 뉴클레오타이드 서열에 관하여 사용될 때 용어 "변이체" 및 "돌연변이체"는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 또 다른, 일반적으로 관련된, 뉴클레오타이드 산 서열과 다른 핵산 서열을 지칭한다. "변이"는 2개의 상이한 뉴클레오타이드 서열 간의 차이이며; 전형적으로, 하나의 서열은 참조 서열이다.
"증폭"은 주형 특이성을 포함하는 핵산 복제의 특이한 경우이다. 이는 비특이적 주형 복제(예를 들어, 주형-의존적이지만 특정 주형에 의존하지 않는 복제)와 대조된다. 여기서 주형 특이성은 복제 정확도(fidelity)(예를 들어, 적절한 폴리뉴클레오타이드 서열의 합성) 및 뉴클레오타이드(리보- 또는 데옥시리보-) 특이성과 구별된다. 주형 특이성은 "표적" 특이성의 측면에서 자주 기술된다. 표적 서열은 다른 핵산으로부터 분류하고자 하는 의미에서 "표적"이다. 증폭 기법은 주로 이러한 분류를 위해 설계되었다.
핵산과 관련하여 용어 "증폭시키는" 또는 "증폭"은 전형적으로 소량의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 단일 폴리뉴클레오타이드 분자)로부터 시작하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 일부의 다중 카피의 생산을 지칭하며, 여기서 증폭 산물 또는 앰플리콘이 일반적으로 검출 가능하다. 폴리뉴클레오타이드의 증폭은 다양한 화학적 및 효소적 과정을 포함한다. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 라이게이스 연쇄 반응(LCR; 예를 들어, 미국 특허 제5,494,810호 참조; 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨) 동안 표적 또는 주형 DNA 분자의 하나 또는 몇 개의 카피로부터 다중 DNA 카피의 생성이 증폭의 형태이다. 추가적인 유형의 증폭은 대립유전자-특이적 PCR(예를 들어, 미국 특허 제5,639,611호 참조; 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 어셈블리 PCR(예를 들어, 미국 특허 제5,965,408호 참조; 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 헬리케이스-의존적 증폭(예를 들어, 미국 특허 제7,662,594호 참조; 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 핫-스타트 PCR(예를 들어, 미국 특허 제5,773,258 및 5,338,671호 참조; 각각 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 서열간-특이적 PCR, 역 PCR(예를 들어, 문헌[Triglia, et al.(1988) Nucleic Acids Res., 16:8186] 참조; 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 결찰-매개성 PCR(예를 들어, 문헌[Guilfoyle, R. et al., Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997)] 참조; 미국 특허 제5,508,169호; 이들 각각은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 메틸화-특이적 PCR(예를 들어, 문헌[Herman, et al., (1996) PNAS 93(13) 9821-9826] 참조; 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 미니프라이머 PCR, 멀티플렉스 결찰-의존적 프로브 증폭(예를 들어, 문헌[Schouten, et al., (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57] 참조; 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 멀티플렉스 PCR(예를 들어, 문헌[Chamberlain, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(23) 11141-11156; Ballabio, et al., (1990) Human Genetics 84(6) 571-573; Hayden, et al., (2008) BMC Genetics 9:80] 참조; 이들 각각은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 네스티드 PCR, 중첩-연장 PCR(예를 들어, 문헌[Higuchi, et al., (1988) Nucleic Acids Research 16(15) 7351-7367] 참조; 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 실시간 PCR(예를 들어, 문헌[Higuchi, et al., (1992) Biotechnology 10:413-417; Higuchi, et al., (1993) Biotechnology 11:1026-1030] 참조; 이들 각각은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 역전사 PCR(예를 들어, 문헌[Bustin, S.A. (2000) J. Molecular Endocrinology 25:169-193] 참조; 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨), 고체상 PCR, 열적 비대칭 인터레이스 PCR 및 터치다운 PCR(예를 들어, 문헌[Don, et al., Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008; Roux, K. (1994) Biotechniques 16(5) 812-814; Hecker, et al., (1996) Biotechniques 20(3) 478-485] 참조; 이들 각각은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드 증폭은 또한 디지털 PCR을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kalinina, et al., Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997); Vogelstein and Kinzler, Proc Natl Acad Sci USA. 96; 9236-41, (1999)]; 국제 공개 제WO05023091A2호; 미국 공개 제20070202525호 참조; 이들 각각은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있음).
용어 "중합효소 연쇄 반응"("PCR")은 클로닝 또는 정제 없이 게놈 또는 기타 DNA 또는 RNA의 혼합물에서 표적 서열의 분절의 농도를 증가시키는 방법을 기술하고 있는 K.B. Mullis의 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호의 방법을 지칭한다. 표적 서열을 증폭시키기 위한 이러한 과정은 과량의 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 목적하는 표적 서열을 포함하는 DNA 혼합물에 도입한 다음, DNA 폴리머레이스의 존재하에 정확한 순서의 열 순환을 도입하는 것으로 이루어진다. 2개의 프라이머는 이중 가닥 표적 서열의 각 가닥에 대해 상보적이다. 증폭을 수행하기 위해, 혼합물이 변성된 다음, 프라이머가 표적 분자 내의 이의 상보적인 서열에 어닐링된다. 어닐링 후, 프라이머는 새로운 쌍의 상보적인 가닥을 형성하기 위해 폴리머레이스로 확장된다. 변성, 프라이머 어닐링 및 폴리머레이스 연장의 단계를 여러 번 반복하여(즉, 변성, 어닐링 및 연장은 하나의 "주기"를 구성하며; 여러 "주기"가 있을 수 있음) 목적하는 표적 서열의 고종도의 증폭된 분절을 얻을 수 있다. 목적하는 표적 서열의 증폭된 분절의 길이는 서로에 대한 프라이머의 상대적 위치에 의해 결정되므로, 따라서, 이 길이는 제어 가능한 매개변수이다. 과정의 반복적인 양태로 인해, 해당 방법은 "중합효소 연쇄 반응"("PCR")으로 지칭된다. 표적 서열의 목적하는 증폭된 분절이 혼합물에서 (농도의 측면에서) 우세한 서열이 되기 때문에 이들은 "PCR 증폭"이라고 하며, "PCR 산물" 또는 "앰플리콘"이다. 당업자라면 용어 "PCR"이, 예를 들어, 실시간 PCR, 네스티드 PCR, 역전사 PCR(RT-PCR), 단일 프라이머 및 임의로 프라이밍된 PCR 등을 사용하는 원래 기재된 방법의 많은 변형을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
주형 특이성은 효소의 선택에 의해 대부분의 증폭 기법에서 달성된다. 증폭 효소는 그것이 사용되는 조건하에서 이종성 핵산 혼합물에서 특정 핵산 서열만을 처리하는 효소이다. 예를 들어, Q-베타 복제효소의 경우, MDV-1 RNA가 복제효소에 대한 특이적 주형이다(Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:3038 [1972]). 다른 핵산은 이 증폭 효소에 의해 복제되지 않을 것이다. 유사하게는, T7 RNA 폴리머레이스의 경우, 이 증폭 효소는 자체 프로모터에 대해 엄격한 특이성을 갖는다(Chamberlin et al, Nature, 228:227 [1970]). T4 DNA 라이게이스의 경우, 효소는 결찰 접합부에서 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 기질과 주형 사이에 미스매치가 있는 2개의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 결찰하지 않을 것이다(Wu and Wallace (1989) Genomics 4:560). 마지막으로, 고온에서 기능할 수 있는 능력으로 인해 내열성 주형-의존적 DNA 폴리머레이스(예를 들어, Taq 및 Pfu DNA 폴리머레이스)는 제한된(bounded) 서열에 대해 높은 특이성을 나타내므로 프라이머에 의해 정의되며; 고온은 비표적 서열과의 혼성화가 아닌 표적 서열과의 프라이머 혼성화를 선호하는 열역학적 조건을 초래한다(H. A. Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press [1989]).
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 검출 검정"은 관심 핵산의 뉴클레오타이드 조성을 결정하는 임의의 방법을 지칭한다. 핵산 검출 검정은 DNA 시퀀싱 방법, 프로브 혼성화 방법, 구조 특이적 절단 검정(예를 들어, INVADER 검정(홀로직, 인크.(Hologic, Inc.))이고, 예를 들어, 모든 목적을 위해 각각 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제5,846,717호, 제5,985,557호, 제5,994,069호, 제6,001,567호, 제6,090,543호 및 제6,872,816호; 문헌[Lyamichev et al., Nat. Biotech., 17:292 (1999), Hall et al., PNAS, USA, 97:8272 (2000)] 및 미국 특허 제9,096,893호에 기술되어 있음); 효소 미스매치 절단 방법(예를 들어, 바리아제닉스(Variagenics), 미국 특허 제6,110,684호, 제5,958,692호, 제5,851,770호, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨); 위에 기재된 중합효소 연쇄 반응(PCR); 분지형 혼성화 방법(예를 들어, 키론(Chiron), 미국 특허 제5,849,481호, 제5,710,264호, 제5,124,246호 및 제5,624,802호, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨); 롤링 서클 복제(예를 들어, 미국 특허 제6,210,884호, 제6,183,960호 및 제6,235,502호, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨); NASBA(예를 들어, 미국 특허 제5,409,818, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨); 분자 비컨 기술(예를 들어, 미국 특허 제6,150,097호, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨); E-센서 기술(모토롤라(Motorola), 미국 특허 제6,248,229호, 제6,221,583호, 제6,013,170호 및 제6,063,573호, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨); 사이클링 프로브 기술(예를 들어, 미국 특허 제5,403,711호, 제5,011,769호 및 제5,660,988호, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨); 데이드 베링 신호 증폭 방법(예를 들어, 미국 특허 제6,121,001호, 제6,110,677호, 제5,914,230호, 제5,882,867호 및 제5,792,614호, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용됨); 라이게이스 연쇄 반응(예를 들어, 문헌[Baranay Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 189-93 (1991)]); 및 샌드위치 혼성화 방법(예를 들어, 미국 특허 제5,288,609호, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
용어 "증폭 가능한 핵산"은 임의의 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있는 핵산을 지칭한다. "증폭 가능한 핵산"은 일반적으로 "샘플 주형"을 포함할 것으로 상정된다.
용어 "샘플 주형"은 "표적"(아래 정의됨)의 존재에 대해 분석된 샘플로부터 기원하는 핵산을 지칭한다. 대조적으로, "배경 주형"은 샘플에 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있는 샘플 주형 이외의 핵산과 관련하여 사용된다. 배경 주형은 대부분 우연에 의한 것이다. 이는 캐리오버(carryover)의 결과일 수 있거나 또는 샘플로부터 정제하고자 하는 핵산 오염물질의 존재로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 검출되지 않은 유기체로부터의 핵산은 다른 테스트 샘플에서 배경으로 존재할 수 있다.
용어 "프라이머"는, 예를 들어, 제한 소화로부터 핵산 단편으로서 자연적으로 발생하거나 또는 합성적으로 생산되는지에 관계없이 올리고뉴클레오타이드를 지칭하며, 이는 주형 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건에 놓였을 때(예를 들어, 뉴클레오타이드 및 DNA 폴리머레이스와 같은 유도제의 존재하에 적합한 온도 및 pH에서) 합성 개시점으로 작용할 수 있다. 프라이머는 증폭에서 최대 효율을 위해 바람직하게는 단일 가닥이지만, 대안적으로 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥이면, 프라이머는 연장 산물을 제조하는 데 사용되기 전 먼저 그 가닥을 분리하기 위해 처리된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드이다. 프라이머는 유도제의 존재하에 연장 산물의 합성을 프라이밍하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 공급원 및 사용 방법을 포함한 여러 요인에 따라 달라질 것이다.
용어 "프로브"는 정제된 제한 소화에 의해서와 같이 자연적으로 발생하거나 또는 합성적으로, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생산되는지 여부에 관계없이 또 다른 관심 올리고뉴클레오타이드를 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 뉴클레오타이드의 서열)를 지칭한다. 프로브는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 프로브는 특정 유전자 서열(예를 들어, "포획 프로브")의 검출, 확인 및 단리에 유용하다. 본 발명에서 사용되는 임의의 프로브는 일부 실시형태에서, 임의의 "리포터 분자"로 표지될 수 있으므로, 효소(예를 들어, ELISA뿐만 아니라 효소-기반 조직화학적 검정), 형광, 방사성 및 발광 시스템을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 검출 시스템에서 검출 가능한 것으로 상정된다. 본 발명이 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적"은, 예를 들어, 프로브 결합, 증폭, 단리, 포획 등에 의해 다른 핵산으로부터 분류하고자 하는 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응과 관련하여 사용될 때, "표적"은 중합효소 연쇄 반응에 사용되는 프라이머에 의해 결합된 핵산의 영역을 지칭하는 반면, 표적 DNA가 증폭되지 않는 검정에서 사용되는 경우, 예를 들어, 침습성 절단 검정의 일부 실시형태에서, 표적은 표적 핵산의 존재가 검출될 수 있도록 프로브 및 침습성 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, INVADER 올리고뉴클레오타이드)가 결합하여 침습성 절단 구조를 형성하는 부위를 포함한다. "분절"은 표적 서열 내의 핵산 영역으로 정의된다.
따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 예를 들어, DNA와 같은 핵산을 설명하기 위해 사용되는 바와 같은 "비표적"은 반응물에 존재할 수 있지만 반응에 의한 검출 또는 특성화의 대상이 아닌 핵산을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 비표적 핵산은, 예를 들어, 표적 서열을 포함하지 않는 샘플에 존재하는 핵산을 지칭할 수 있는 반면, 일부 실시형태에서, 비표적은 외인성 핵산, 즉, 표적 핵산을 포함하거나 또는 포함하는 것으로 의심되는 샘플로부터 기원하지 않고, 예를 들어, 효소(예를 들어, 폴리머레이스)의 활성을 정상화하여 반응에서 효소의 성능의 변동성을 줄이기 위해 반응에 첨가되는 핵산을 지칭할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "메틸화"는 사이토신의 C5 또는 N4 위치, 아데닌의 N6 위치에서의 사이토신 메틸화 또는 다른 유형의 핵산 메틸화를 지칭한다. 시험관내 증폭된 DNA는 전형적인 시험관내 DNA 증폭 방법이 증폭 주형의 메틸화 패턴을 유지하지 않기 때문에 일반적으로 메틸화되지 않는다. 그러나, "메틸화되지 않은 DNA" 또는 "메틸화된 DNA"는 또한 원래의 주형이 각각 메틸화되지 않았거나 또는 메틸화된 증폭된 DNA를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "증폭 시약"은 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외하고 증폭에 필요한 시약(데옥시리보뉴클레오사이드 트라이포스페이트, 완충액 등)을 지칭한다. 전형적으로, 증폭 시약은 다른 반응 구성요소와 함께 반응 용기에 배치되고 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대조군"은 핵산 검출 또는 분석과 관련하여 사용될 때 실험 표적(예를 들어, 미지의 농도의 핵산)과 비교하여 사용하기 위한 공지된 특징(예를 들어, 공지된 서열, 세포당 공지된 카피수)을 갖는 핵산을 지칭한다. 대조군은 검정에서 테스트 또는 표적 핵산이 정규화될 수 있는 내인성, 바람직하게는 불변 유전자일 수 있다. 예를 들어, 샘플 처리, 검정 효율성 등에서 발생할 수 있는 샘플 간 변동에 대한 이러한 정규화 대조군은 정확한 샘플 간 데이터 비교를 가능하게 한다. 인간 샘플에 대한 핵산 검출 검정을 정규화하기 위해 사용되는 유전자는, 예를 들어, β-액틴, ZDHHC1 및 B3GALT6을 포함한다(예를 들어, 각각 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 출원 제14/966,617호 및 제62/364,082호 참조).
대조군은 또한 외부에 있을 수 있다. 예를 들어, qPCR, QuARTS 등과 같은 정량적 검정에서, "교정기(calibrator)" 또는 "교정 대조군(calibration control)"은, 예를 들어, 실험 표적 핵산의 일부와 동일한 서열 및 공지된 농도 또는 일련의 농도를 갖는 공지된 서열의 핵산(예를 들어, 정량적 PCR에서 곡선화된 교정의 생성을 위한 연속 희석된 대조군 표적)이다. 전형적으로, 교정 대조군은 실험 DNA에서 사용되는 것과 동일한 시약 및 반응 조건을 사용하여 분석된다. 소정의 실시형태에서, 교정기의 측정은 실험 검정과 동시에, 예를 들어, 동일한 열 순환기에서 수행된다. 바람직한 실시형태에서, 상이한 교정기 서열이 등몰량으로 용이하게 제공되도록 다수의 교정기가 단일 플라스미드에 포함될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 플라스미드 교정기는, 예를 들어, 하나 이상의 제한 효소로 소화되어 플라스미드 벡터로부터 교정기 부분을 방출한다. 예를 들어, 참조에 의해 본 명세서에 포함되어 있는 WO 2015/066695 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 "ZDHHC1"은 인간 DNA의 Chr 16(16q22.1)에 위치하며 DHHC 팔미토일트랜스퍼레이스 패밀리에 속하는 아연 핑거, DHHC-유형 함유 1을 특징으로 하는 단백질을 암호화하는 유전자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "메틸화"는 사이토신의 C5 또는 N4 위치, 아데닌의 N6 위치에서의 사이토신 메틸화 또는 다른 유형의 핵산 메틸화를 지칭한다. 시험관내 증폭된 DNA는 전형적인 시험관내 DNA 증폭 방법이 증폭 주형의 메틸화 패턴을 유지하지 않기 때문에 일반적으로 메틸화되지 않는다. 그러나, "메틸화되지 않은 DNA" 또는 "메틸화된 DNA"는 또한 원래의 주형이 각각 메틸화되지 않았거나 또는 메틸화된 증폭된 DNA를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "메틸화"는 사이토신의 C5 또는 N4 위치, 아데닌의 N6 위치에서의 사이토신 메틸화 또는 다른 유형의 핵산 메틸화를 지칭한다. 시험관내 증폭된 DNA는 전형적인 시험관내 DNA 증폭 방법이 증폭 주형의 메틸화 패턴을 유지하지 않기 때문에 일반적으로 메틸화되지 않는다. 그러나, "메틸화되지 않은 DNA" 또는 "메틸화된 DNA"는 또한 원래의 주형이 각각 메틸화되지 않았거나 또는 메틸화된 증폭된 DNA를 지칭할 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 사용되는 "메틸화된 뉴클레오타이드" 또는 "메틸화된 뉴클레오타이드 염기"는 뉴클레오타이드 염기 상의 메틸 모이어티의 존재를 지칭하되, 메틸 모이어티는 인식된 전형적인 뉴클레오타이드 염기에 존재하지 않는다. 예를 들어, 사이토신은 피리미딘 고리에 메틸 모이어티를 포함하지 않지만, 5-메틸사이토신은 피리미딘 고리의 5번 위치에 메틸 모이어티를 포함한다. 따라서, 사이토신은 메틸화된 뉴클레오타이드가 아니며, 5-메틸사이토신은 메틸화된 뉴클레오타이드이다. 또 다른 예에서, 티민은 피리미딘 고리의 5번 위치에 메틸 모이어티를 포함하지만; 본 명세서의 목적을 위해, 티민은 DNA의 전형적인 뉴클레오타이드 염기이기 때문에 DNA에 존재할 때 메틸화된 뉴클레오타이드로 간주되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "메틸화된 핵산 분자"는 하나 이상의 메틸화된 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 핵산 분자의 "메틸화 상태", "메틸화 프로파일" 및 "메틸화 상황"은 핵산 분자에 하나 이상의 메틸화된 뉴클레오타이드 염기가 존재하지 않는 것을 지칭한다. 예를 들어, 메틸화된 사이토신을 포함하는 핵산 분자는 메틸화된 것으로 간주된다(예를 들어, 핵산 분자의 메틸화 상태는 메틸화됨). 임의의 메틸화된 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 핵산 분자는 메틸화되지 않은 것으로 간주된다.
특정 핵산 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 마커 또는 DNA 영역)의 메틸화 상태는 서열 내 모든 염기의 메틸화 상태를 나타낼 수 있거나, 또는 (예를 들어, 하나 이상의 사이토신의) 서열 내 염기의 서브세트의 메틸화 상태를 나타낼 수 있거나 또는 메틸화가 발생하는 서열 내 위치에 대한 정확한 정보를 제공하거나 제공하지 않고 서열 내 국소적 메틸화 밀도에 관한 정보를 나타낼 수 있다.
핵산 분자의 뉴클레오타이드 유전자좌의 메틸화 상태는 핵산 분자의 특정 유전자좌에서 메틸화된 뉴클레오타이드의 존재 또는 부재를 지칭한다. 예를 들어, 핵산 분자의 7번째 뉴클레오타이드에 존재하는 뉴클레오타이드가 5-메틸사이토신일 때, 핵산 분자의 7번째 뉴클레오타이드에서의 사이토신의 메틸화 상태는 메틸화된 것이다. 유사하게는, 핵산 분자의 7번째 뉴클레오타이드에 존재하는 뉴클레오타이드가 사이토신(5-메틸사이토신이 아님)일 때, 핵산 분자의 7번째 뉴클레오타이드에서의 사이토신의 메틸화 상태는 메틸화되지 않은 것이다.
메틸화 상태는 선택적으로 (예를 들어, 메틸화 빈도, 분획, 비, 백분율 등을 나타내는) "메틸화 값"으로 표시되거나 또는 나타낼 수 있다. 메틸화 값은, 예를 들어, 메틸화 의존적 제한 효소로 제한 소화 후 존재하는 온전한 핵산의 양을 정량화하거나, 또는 바이설파이트 반응 후 증폭 프로파일을 비교하거나 또는 바이설파이트-처리된 핵산과 처리되지 않은 핵산의 서열을 비교하거나, 또는 TET-처리된 핵산과 처리되지 않은 핵산을 비교함으로써 생성될 수 있다. 따라서, 값, 예를 들어, 메틸화 값은 메틸화 상태를 나타내며, 따라서 유전자좌의 다중 카피에 걸친 메틸화 상태의 정량적 지표로 사용될 수 있다. 이는 샘플에서 서열의 메틸화 상태를 역치값 또는 참조값과 비교하는 것이 바람직한 경우에 특히 유용하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "메틸화 빈도" 또는 "메틸화 백분율(%)"은 분자 또는 유전자좌가 메틸화되지 않은 경우의 수에 대한 분자 또는 유전자좌가 메틸화되는 경우의 수를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "메틸화 점수"는 관심 특정 신생물이 없는 포유동물의 무작위 집단(예를 들어, 10마리, 20마리, 30마리, 40마리, 50마리, 100마리 또는 500마리의 포유동물의 무작위 집단)으로부터의 마커 또는 마커의 패널에 대한 평균 메틸화 이벤트와 비교하여 마커 또는 마커의 패널에서 검출된 메틸화 이벤트를 나타내는 점수이다. 마커 또는 마커의 패널에서 상승된 메틸화 점수는 점수가 상응하는 참조 점수보다 크다면 임의의 점수일 수 있다. 예를 들어, 마커 또는 마커의 패널에서 상승된 메탈화 점수는 참조 메틸화 점수보다 0.5배, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상 클 수 있다.
이와 같이, 메틸화 상태는 핵산(예를 들어, 게놈 서열)의 메틸화 상태를 설명한다. 또한, 메틸화 상태는 메틸화와 관련이 있는 특정 게놈 유전자좌에서 핵산 분절의 특성을 지칭한다. 이러한 특성은 이 DNA 서열 내의 임의의 사이토신(C) 잔기가 메틸화되었는지 여부, 메틸화된 C 잔기(들)의 위치, 핵산의 임의의 특정 영역 전체에 걸친 메틸화된 C의 빈도 또는 백분율 및, 예를 들어, 대립유전자의 기원의 차이로 인한 메틸화의 대립유전자 차이를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 용어 "메틸화 상태", "메틸화 프로파일" 및 "메틸화 상태"는 또한 생물학적 샘플에서 핵산의 임의의 특정 영역 전체에 걸친 메틸화된 C 또는 메틸화되지 않은 C의 상대 농도, 절대 농도 또는 패턴을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 서열 내의 사이토신(C) 잔기(들)가 메틸화되면 "과메틸화" 또는 "증가된 메틸화"로 지칭될 수 있는 반면, DNA 서열 내의 사이토신(C) 잔기(들)가 메틸화되지 않으면 "저메틸화" 또는 "감소된 메틸화"로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 핵산 서열 내의 사이토신(C) 잔기(들)가 또 다른 핵산 서열(예를 들어, 상이한 영역으로부터 또는 상이한 개체 등으로부터)과 비교하여 메틸화되면, 해당 서열은 다른 핵산 서열과 비교하여 과메틸화되거나 또는 증가된 메틸화를 갖는 것으로 간주된다. 대안적으로, DNA 서열 내의 사이토신(C) 잔기(들)가 또 다른 핵산 서열(예를 들어, 상이한 영역으로부터 또는 상이한 개체 등으로부터)과 비교하여 메틸화되지 않으면, 해당 서열은 다른 핵산 서열과 비교하여 저메틸화되거나 또는 감소된 메틸화를 갖는 것으로 간주된다. 추가적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "메틸화 패턴"은 핵산 영역에 걸친 메틸화된 그리고 메틸화되지 않은 뉴클레오타이드의 집합적 부위를 지칭한다. 메틸화된 그리고 메틸화되지 않은 뉴클레오타이드의 수가 영역 전체에서 동일하거나 또는 유사하지만 메틸화된 그리고 메틸화되지 않은 뉴클레오타이드의 위치가 상이할 때, 2개의 핵산은 동일하거나 또는 유사한 메틸화 빈도 또는 메틸화 백분율을 가질 수 있지만 상이한 메틸화 패턴을 가질 수 있다. 서열은 메틸화의 정도(예를 들어, 하나가 다른 것에 비해 메틸화가 증가되거나 또는 감소됨), 빈도 또는 패턴에 차이가 있을 때 "차별적으로 메틸화"된다고 하거나, 또는 "메틸화 차이"를 갖거나 또는 "상이한 메틸화 상태"를 갖는다고 한다. 용어 "차별적인 메틸화"는 암 음성 샘플에서 핵산 메틸화의 수준 또는 패턴과 비교하여 암 양성 샘플에서 핵산 메틸화의 수준 또는 패턴의 차이를 지칭한다. 이는 또한 수술 후 암이 재발한 환자 대 재발하지 않은 환자 간의 수준 또는 패턴의 차이를 지칭할 수 있다. 차별적인 메틸화 및 DNA 메틸화의 특정 수준 또는 패턴은, 예를 들어, 올바른 컷오프(cut-off) 또는 예측 특성이 정의되면 예후예측성 및 예측성 바이오마커이다.
메틸화 상태 빈도는 개체의 집단 또는 단일 개체로부터의 샘플을 설명하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 50%의 메틸화 상태 빈도를 갖는 뉴클레오타이드 유전자좌는 사례의 50%에서 메틸화되고, 사례의 50%에서는 메틸화되지 않는다. 이러한 빈도는, 예를 들어, 개체의 집단 또는 핵산의 집합체에서 뉴클레오타이드 유전자좌 또는 핵산 영역이 메틸화되는 정도를 설명하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 핵산 분자의 제1 집단 또는 풀에서의 메틸화가 핵산 분자의 제2 집단 또는 풀에서의 메틸화와 다를 때, 제1 집단 또는 풀의 메틸화 상태 빈도는 제2 집단 또는 풀의 메틸화 상태 빈도와 상이할 것이다. 이러한 빈도는 또한, 예를 들어, 단일 개체에서 뉴클레오타이드 유전자좌 또는 핵산 영역이 메틸화되는 정도를 설명하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 빈도는 조직 샘플로부터의 세포 그룹이 뉴클레오타이드 유전자좌 또는 핵산 영역에서 메틸화되거나 또는 메틸화되지 않는 정도를 설명하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "뉴클레오타이드 유전자좌"는 핵산 분자에서 뉴클레오타이드의 위치를 지칭한다. 메틸화된 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 유전자좌는 핵산 분자에서 메틸화된 뉴클레오타이드의 위치를 지칭한다.
전형적으로, 인간 DNA의 메틸화는 사이토신이 구아닌의 5'에 위치하는 인접한 구아닌 및 사이토신을 포함하는 다이뉴클레오타이드 서열(CpG 다이뉴클레오타이드 서열이라고도 함)에서 발생한다. CpG 다이뉴클레오타이드 내의 대부분의 사이토신은 인간 게놈에서 메틸화되지만, 일부는 CpG 섬으로 알려진 특정 CpG 다이뉴클레오타이드가 풍부한 게놈 영역에서 메틸화되지 않은 채로 남아있다(예를 들어, 문헌[Antequera et al. (1990) Cell 62: 503-514] 참조).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "CpG 섬"은 전체 게놈 DNA에 비해 증가된 수의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 게놈 DNA의 G:C-풍부 영역을 지칭한다. CpG 섬은 적어도 100개, 200개 이상의 염기쌍 길이일 수 있되, 해당 영역의 G:C 함량은 적어도 50%이고, 예상되는 빈도에 대한 관찰된 CpG 빈도의 비는 0.6이며; 일부 경우에, CpG 섬은 적어도 500개의 염기쌍 길이일 수 있되, 해당 영역의 G:C 함량은 적어도 55%이고 예상되는 빈도에 대한 관찰된 CpG 빈도의 비는 0.65이다. 예상되는 빈도에 대한 관찰된 CpG 빈도는 문헌[Gardiner-Garden et al (1987) J. Mol. Biol. 196: 261-281]에 제공된 방법에 따라 계산될 수 있다. 예를 들어, 예상되는 빈도에 대한 관찰된 CpG 빈도는 공식 R =(A × B) / (C × D)에 따라 계산될 수 있으며, 여기서 R은 예상되는 빈도에 대한 관찰된 CpG 빈도의 비이고, A는 분석된 서열에서 CpG 다이뉴클레오타이드의 수이며, B는 분석된 서열에서 총 뉴클레오타이드의 수이고, C는 분석된 서열에서 총 C 뉴클레오타이드의 수이며, D는 분석된 서열에서 총 G 뉴클레오타이드의 수이다. 메틸화 상태는 전형적으로, 예를 들어, 프로모터 영역의 CpG 섬으로 결정된다. 인간 게놈의 다른 서열은 CpA 및 CpT와 같은 DNA 메틸화에 취약하다는 것을 알 수 있을 것이다(문헌[Ramsahoye (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5237-5242; Salmon and Kaye (1970) Biochim. Biophys. Acta. 204: 340-351; Grafstrom (1985) Nucleic Acids Res. 13: 2827-2842; Nyce (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4353-4367; Woodcock (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 145: 888-894] 참조).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "메틸화-특이적 시약"은 핵산 분자의 메틸화 상태의 기능으로서 핵산 분자의 뉴클레오타이드를 변형시키는 시약을 지칭하거나 또는 메틸화-특이적 시약은 핵산 분자의 메틸화 상태를 반영하는 방식으로 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 변경할 수 있는 화합물 또는 조성물 또는 기타 작용제를 지칭한다. 이러한 시약으로 핵산 분자를 처리하는 방법은 핵산 분자를 시약과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 원하는 경우, 뉴클레오타이드 서열의 목적하는 변화를 달성하기 위한 추가적인 단계와 결합된다. 이러한 방법은 메틸화되지 않은 뉴클레오타이드(예를 들어, 각각 메틸화되지 않은 사이토신)가 상이한 뉴클레오타이드로 변형되는 방식으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 시약은 데옥시 우라실 잔기를 생성하기 위해 메틸화되지 않은 사이토신 뉴클레오타이드를 탈아미노화할 수 있다. 이러한 시약의 예는 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
메틸화-특이적 시약에 의한 핵산 뉴클레오타이드 서열의 변화는 또한 각각 메틸화된 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드로 변형된 핵산 분자를 생성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "화학선택적 기로 변형된 UDP 글루코스"는 클릭 화학을 통해 친화성 태그와 반응할 수 있는 작용기로 특히 6-하이드록실 위치에서 작용화된 우리딘 다이포스포글루코스 분자를 지칭한다.
용어 "산화된 5-메틸사이토신"은 5-위치에서 산화된 5-메틸사이토신 잔기를 지칭한다. 따라서, 산화된 5-메틸사이토신 잔기는 5-하이드록시메틸사이토신, 5-폼일사이토신 및 5-카복시메틸사이토신을 포함한다. 본 발명의 실시형태에 따라 유기 보레인과 반응하는 산화된 5-메틸사이토신 잔기는 5-폼일사이토신 및 5-카복시메틸사이토신이다.
용어 "메틸화 검정"은 핵산 서열 내에서 하나 이상의 CpG 다이뉴클레오타이드 서열의 메틸화 상태를 결정하기 위한 임의의 검정을 지칭한다.
용어 "MS AP-PCR"(메틸화-민감성 임의로-프라이밍된 중합효소 연쇄 반응)은 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함할 가능성이 가장 높은 영역에 초점을 맞추기 위해 CG-풍부 프라이머를 사용하여 게놈의 글로벌 스캔을 가능하게 하는 당업계에서 인정된 기술을 지칭하며, 문헌[Gonzalgo et al. (1997) Cancer Research 57: 594-599]에 기술되어 있다.
용어 "MethyLight™"는 문헌[Eads et al. (1999) Cancer Res. 59: 2302-2306]에 기술되어 있는 당업계에서 인정된 형광성-기반 실시간 PCR 기법을 지칭한다.
용어 "HeavyMethyl™"은 증폭 프라이머 사이의 CpG 위치를 덮거나 또는 증폭 프라이머 의해 덮이는 메틸화 특이적 차단 프로브(본 명세서에서 차단제로도 지칭됨)가 핵산 샘플의 메틸화-특이적 선택적 증폭을 가능하게 하는 검정을 지칭한다.
용어 "HeavyMethyl™ MethyLight™" 검정은 MethyLight™ 검정의 변형인 HeavyMethyl™ MethyLight™ 검정을 지칭하되, MethyLight™ 검정은 증폭 프라이머 사이의 CpG 위치를 덮는 메틸화 특이적 차단 프로브와 조합된다.
용어 "Ms-SNuPE"(메틸화-민감성 단일 뉴클레오타이드 프라이머 연장)는 문헌[Gonzalgo & Jones (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531]에 기술되어 있는 당업계에서 인정된 검정을 지칭한다.
용어 "MSP"(메틸화-특이적 PCR)는 문헌[Herman et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821-9826] 및 미국 특허 제5,786,146호에 기술되어 있는 당업계에서 인정된 메틸화 검정을 지칭한다.
용어 "COBRA"(조합된 바이설파이트 제한 분석)는 문헌[Xiong & Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534]에 기술되어 있는 당업계에서 인정된 메틸화 검정을 지칭한다.
용어 "MCA"(메틸화된 CpG 섬 증폭)는 문헌[Toyota et al. (1999) Cancer Res. 59: 2307-12] 및 WO 00/26401A1에 기술되어 있는 메틸화 검정을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "선택된 뉴클레오타이드"는 핵산 분자(DNA의 경우 C, G, T 및 A 및 RNA의 경우 C, G, U 및 A)에서 전형적으로 발생하는 4개의 뉴클레오타이드 중 하나의 뉴클레오타이드를 지칭하며, 이는 전형적으로 발생하는 뉴클레오타이드의 메틸화된 유도체를 포함하는 반면(예를 들어, C가 선택된 뉴클레오타이드인 경우, 메틸화된 C 및 메틸화되지 않은 C는 모두 선택된 뉴클레오타이드의 의미 내에 포함됨), 메틸화된 선택된 뉴클레오타이드는 구체적으로 메틸화된 전형적으로 발생하는 뉴클레오타이드를 지칭하고, 메틸화되지 않은 선택된 뉴클레오타이드는 구체적으로 메틸화되지 않은 전형적으로 발생하는 뉴클레오타이드를 지칭한다.
용어 "메틸화-특이적 제한 효소"는 인식 부위의 메틸화 상태에 따라 핵산을 선택적으로 소화하는 제한 효소를 지칭한다. 인식 부위가 메틸화되지 않았거나 또는 반-메틸화된 경우 특이적으로 절단하는 제한 효소(메틸화-민감성 효소)의 경우, 절단은 인식 부위가 한 가닥 또는 두 가닥 모두에서 메틸화되면 일어나지 않을 것이다(또는 효율성이 크게 감소될 것이다). 인식 부위가 메틸화된 경우에만 특이적으로 절단하는 제한 효소(메틸화-의존적 효소)의 경우, 절단은 인식 부위가 메틸화되지 않으면 일어나지 않을 것이다(또는 효율성이 크게 감소될 것이다). CG 다이뉴클레오타이드를 포함하는 인식 서열(예를 들어, CGCG 또는 CCCGGG와 같은 인식 서열)인 메틸화-특이적 제한 효소가 바람직하다. 일부 실시형태에 대해 이 다이뉴클레오타이드의 사이토신이 탄소 원자 C5에서 메틸화되는 경우 절단하지 않는 제한 효소가 추가로 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "상이한 뉴클레오타이드"는 전형적으로 상이한 뉴클레오타이드가 선택된 뉴클레오타이드와 다른 왓슨-크릭 염기-페어링 특성을 가짐으로써 선택된 뉴클레오타이드에 대해 상보적인 전형적으로 발생하는 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드에 상보적인 전형적으로 발생하는 뉴클레오타이드와 동일하지 않도록 선택된 뉴클레오타이드와 화학적으로 상이한 뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, C가 선택된 뉴클레오타이드일 때, U 또는 T는 상이한 뉴클레오타이드일 수 있으며, 이는 G에 대한 C의 상보성 및 A에 대한 U 또는 T의 상보성으로 예시된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 선택된 뉴클레오타이드에 상보적이거나 또는 상이한 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드는, 높은 엄격성 조건하에서, 선택된 뉴클레오타이드 또는 4개의 전형적으로 발생하는 뉴클레오타이드 중 3개의 뉴클레오타이드와 상보적인 뉴클레오타이드의 염기-페어링보다 더 높은 친화성을 갖는 상이한 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 상보성의 예는 DNA(예를 들어, A-T 및 C-G) 및 RNA(예를 들어, A-U 및 C-G)의 왓슨-크릭 염기 페어링이다. 따라서, 예를 들어, 높은 엄격성 조건하에 G 염기쌍은 G, A 또는 T에 대한 G 염기쌍보다 C에 대한 친화성이 더 높으므로, C가 선택된 뉴클레오타이드일 때, G가 선택된 뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 주어진 마커(또는 함께 사용되는 마커 세트)의 "민감도"는 신생물과 비신생물 샘플을 구별하는 역치값 이상의 DNA 메틸화 값을 알려주는 샘플의 백분율을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 양성은 역치값 이상의 DNA 메틸화 값(예를 들어, 질환과 관련된 범위)을 알려주는 조직학적으로 확인된 신생물로 정의되고, 위음성은 역치값 미만의 DNA 메틸화 값(예를 들어, 질환과 관련되지 않은 범위)을 알려주는 조직학적으로 확인된 신생물로 정의된다. 따라서, 민감도의 값은 공지된 질환 샘플로부터 얻은 주어진 마커에 대한 DNA 메틸화 측정값이 질환-관련 측정값의 범위에 있을 확률을 반영한다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 계산된 민감도 값의 임상적 관련성은 주어진 마커가 해당 병태가 있는 대상체에게 적용될 때 임상적 병태의 존재를 검출할 확률의 추정치를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 주어진 마커(또는 함께 사용되는 마커 세트)의 "특이도"는 신생물과 비신생물 샘플을 구별하는 역치값 미만의 DNA 메틸화 값을 알려주는 비신생물의 백분율을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 음성은 역치값 미만의 DNA 메틸화 값(예를 들어, 질환과 관련되지 않은 범위)을 알려주는 조직학적으로 확인된 비신생물 샘플로 정의되고, 위양성은 역치값 이상의 DNA 메틸화 값(예를 들어, 질환과 관련된 범위)을 알려주는 조직학적으로 확인된 비신생물 샘플로 정의된다. 따라서, 특이도의 값은 공지된 비신생물 샘플로부터 얻은 주어진 마커에 대한 DNA 메틸화 측정값이 비질환 관련 측정값의 범위에 있을 확률을 반영한다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 계산된 특이도 값의 임상적 관련성은 주어진 마커가 해당 병태가 없는 환자에게 적용될 때 임상적 병태의 부재를 검출할 확률의 추정치를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "AUC(area under a curve)"는 "곡선 아래 면적"에 대한 약어이다. 특히, 이는 수신자 조작 특성(Receiver Operating Characteristic: ROC) 곡선 아래 면적을 지칭한다. ROC 곡선은 진단 테스트의 다양한 가능한 컷 포인트(cut point)에 대한 위양성률에 대한 진양성률의 플롯이다. 이는 선택된 컷 포인트에 따른 민감도와 특이도 사이의 균형(trade-off)을 보여준다(민감도의 임의의 증가는 특이도의 감소를 동반할 것이다). ROC 곡선 아래 면적(AUC)은 진단 테스트의 정확도에 대한 척도이다(면적이 클수록 우수하고; 최적값은 1이며; 무작위 테스트는 ROC 곡선이 0.5의 면적을 갖는 대각선에 놓여있음; 문헌[J. P. Egan. (1975) Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York] 참조).
본 명세서에서 사용되는 용어 "신생물"은 조직의 임의의 새롭고 비정상적인 성장을 지칭한다. 따라서, 신생물은 전암성 신생물 또는 악성 신생물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "신생물-특이적 마커"는 신생물의 존재를 나타내기 위해 사용될 수 있는 임의의 생물학적 물질 또는 요소를 지칭한다. 생물학적 물질의 예는 제한 없이 핵산, 폴리펩타이드, 탄수화물, 지방산, 세포 성분(예를 들어, 세포막 및 미토콘드리아) 및 전체 세포를 포함한다. 일부 경우에, 마커는 특정 핵산 영역(예를 들어, 유전자, 유전자 내 영역, 특정 유전자좌 등)이다. 마커인 핵산의 영역은, 예를 들어, "마커 유전자", "마커 영역", "마커 서열", "마커 유전자좌" 등으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "선종"은 선(glandular) 기원의 양성 종양을 지칭한다. 이러한 성장은 양성이지만, 시간이 지남에 따라 악성으로 진행될 수 있다.
용어 "전암성" 또는 "전신생물성" 및 이의 등가어는 악성 변형을 겪고 있는 임의의 세포 증식성 장애를 지칭한다.
신생물, 선종, 암 등의 "부위"는 신생물, 선종, 암 등이 위치한 대상체의 신체의 조직, 기관, 세포 유형, 해부학적 영역, 신체 부위 등이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "진단" 테스트 적용은 대상체의 질환 상태 또는 병태의 검출 또는 확인, 대상체가 주어진 질환 또는 병태에 걸릴 가능성의 결정, 질환 또는 병태가 있는 대상체가 요법에 반응할 가능성의 결정, 질환 또는 병태가 있는 대상체의 예후예측(또는 이의 진행 또는 퇴행 가능성)의 결정 및 질환 또는 병태가 있는 대상체에 대한 치료 효과의 결정을 포함한다. 예를 들어, 진단은 대상체에 신생물이 존재하거나 또는 이에 걸릴 가능성 또는 이러한 대상체가 화합물(예를 들어, 약제, 예를 들어, 약물) 또는 다른 치료에 유리하게 반응할 가능성을 검출하는 데 사용될 수 있다.
용어 "단리된"은 "단리된 올리고뉴클레오타이드"에서와 같이 핵산과 관련하여 사용될 때 일반적으로 천연 공급원에 회합된 적어도 하나의 오염 핵산으로부터 확인되고 분리되는 핵산 서열을 지칭한다. 단리된 핵산은 자연에서 발견되는 것과 상이한 형태 또는 환경으로 존재한다. 반면에, DNA 및 RNA와 같은 단리되지 않은 핵산은 자연에 존재하는 상태로 발견된다. 단리되지 않은 핵산의 예는 다음을 포함한다: 이웃 유전자에 근접한 숙주 세포 염색체에서 발견되는 주어진 DNA 서열(예를 들어, 유전자); 다수의 단백질을 암호화하는 수많은 다른 mRNA와의 혼합물로서 세포에서 발견되는 특정 단백질을 암호화하는 특정 mRNA 서열과 같은 RNA 서열. 그러나, 특정 단백질을 암호화하는 단리된 핵산은 예로서 단백질을 발현하는 세포에서 이러한 핵산을 포함하며, 여기서 핵산은 천연 세포와 다른 염색체 위치에 있거나 또는 그렇지 않으면 자연에서 발견되는 것과 다른 핵산 서열 측면에 있다. 단리된 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드가 단백질 발현에 이용될 경우, 올리고뉴클레오타이드는 최소한의 센스 가닥 또는 코딩 가닥을 포함할 것이지만(즉, 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥일 수 있음), 센스 가닥 및 안티-센스 가닥 둘 다를 포함할 수 있다(즉, 올리고뉴클레오타이드는 이중-가닥일 수 있다). 단리된 핵산은 이의 자연 또는 전형적인 환경으로부터 단리된 후 다른 핵산 또는 분자와 결합될 수 있다. 예를 들어, 단리된 핵산은, 예를 들어, 이종성 발현을 위해 배치된 숙주에 존재할 수 있다.
용어 "정제된"은 자연 환경으로부터 제거되거나, 단리되거나 또는 분리된 핵산 또는 아미노산 서열인 분자를 지칭한다. 따라서, "단리된 핵산 서열"은 정제된 핵산 서열일 수 있다. "실질적으로 정제된" 분자는 자연적으로 회합된 다른 성분이 적어도 60% 없고, 바람직하게는 적어도 75% 없으며, 보다 바람직하게는 적어도 90% 없다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "정제된" 또는 "정제하기 위한"은 또한 샘플로부터 오염물질을 제거하는 것을 지칭한다. 오염 단백질을 제거하면 샘플에서 관심 폴리펩타이드 또는 핵산의 비율이 증가한다. 또 다른 예에서, 재조합 폴리펩타이드는 식물, 세균, 효모 또는 포유동물 숙주 세포에서 발현되고, 폴리펩타이드는 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 정제되며; 이에 의해 재조합 폴리펩타이드의 비율이 샘플에서 증가한다.
주어진 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드를 "포함하는 조성물"이라는 용어는 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드를 포함하는 임의의 조성물을 광범위하게 지칭한다. 조성물은 염(예를 들어, NaCl), 세제(예를 들어, SDS) 및 기타 성분(예를 들어, 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 분유, 연어 정자 DNA 등)을 포함하는 수용액을 포함할 수 있다.
용어 "샘플"은 가장 넓은 의미로 사용된다. 어떤 의미에서는 동물 세포 또는 조직을 지칭할 수 있다. 또 다른 의미에서는 임의의 공급원으로부터 얻은 표본 또는 배양물뿐만 아니라 생물학적 및 환경적 샘플을 지칭한다. 생물학적 샘플은 식물 또는 동물(인간 포함)로부터 얻을 수 있으며, 유체, 고체, 조직 및 기체를 포함한다. 환경적 샘플은 표면 물질, 토양, 물 및 산업 샘플과 같은 환경 물질을 포함한다. 이들 예는 본 발명에 적용 가능한 샘플 유형을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 일부 맥락에서 사용되는 "원격 샘플"은 샘플의 세포, 조직 또는 기관 공급원이 아닌 부위로부터 수집된 샘플과 관련된다. 예를 들어, 췌장으로부터 유래하는 샘플 물질이 대변 샘플에서 평가되는 경우(예를 들어, 림프샘으로부터 직접 채취된 샘플이 아님), 샘플은 원격 샘플이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "환자" 또는 "대상체"는 기술에 의해 제공되는 다양한 테스트의 대상이 되는 유기체를 지칭한다. 용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는 인간을 포함한 포유동물을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 영장류이다. 훨씬 더 바람직한 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 추가로 진단 방법과 관련하여, 바람직한 대상체는 척추동물 대상체이다. 바람직한 척추동물은 온혈동물이며; 바람직한 온혈 척추동물은 포유동물이다. 바람직한 포유동물은 가장 바람직하게는 인간이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 인간 및 동물 대상체를 모두 포함한다. 따라서, 수의학적 치료 용도가 본 명세서에 제공된다. 이와 같이, 본 기술은 인간과 같은 포유동물뿐만 아니라 시베리아 호랑이와 같이 멸종 위기에 처해 있기 때문에 중요한 포유동물; 인간이 소비하기 위해 농장에서 기르는 동물과 같이 경제적으로 중요한 동물; 및/또는 반려 동물 또는 동물원 동물과 같이 인간에게 사회적으로 중요한 동물의 진단을 제공한다. 이러한 동물의 예는 고양이 및 개와 같은 육식 동물; 돼지, 거세한 수퇘지 및 멧돼지를 포함하는 돼지; 소, 황소, 양, 기린, 사슴, 염소, 들소 및 낙타와 같은 반추류 및/또는 유제류; 기각류; 및 말을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 사육 돼지, 반추류, 유제류, 말(경주마 포함) 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 가축의 진단 및 치료가 또한 제공된다. 현재 개시된 특허 대상은 대상체에서 NHL 및/또는 NHL의 하위유형을 진단하기 위한 시스템을 더 포함한다. 시스템은, 예를 들어, NHL 및/또는 NHL의 하위유형의 위험을 스크리닝하거나 또는 생물학적 샘플이 수집되는 대상체에서 NHL 및/또는 NHL의 하위유형을 진단하는 데 사용될 수 있는 상업용 키트로서 제공될 수 있다. 본 기술에 따라 제공되는 예시적인 시스템은 본 명세서에 기재된 마커의 메틸화 상태를 평가하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "키트"는 물질을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 지칭한다. 반응 검정의 맥락에서, 이러한 전달 시스템은 반응 시약(예를 들어, 적절한 용기에 담긴 올리고뉴클레오타이드, 효소 등) 및/또는 지원 물질(예를 들어, 완충액, 검정 등을 수행하기 위한 서면 지침서)을 한 위치에서 또 다른 위치로 보관, 수송 또는 전달하는 시스템을 포함한다. 예를 들어, 키트는 관련 반응 시약 및/또는 지원 물질을 포함하는 하나 이상의 동봉물(예를 들어, 상자)을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "세분화 키트(fragmented kit)"는 전체 키트 구성요소의 하위부분을 각각 포함하는 2개 이상의 별도 용기를 포함하는 전달 시스템을 지칭한다. 용기는 대상 수령인에게 함께 또는 별도로 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 용기는 검정에 사용하기 위한 효소를 포함할 수 있는 반면, 제2 용기는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 용어 "세분화 키트"는 연방 식품, 의약품 및 화장품법(Federal Food, Drug, 및 Cosmetic Act)의 섹션 520(e)에 의해 규제되는 분석 특이 시약(Analyte specific reagent; ASR)을 포함하는 키트를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 실제로, 전체 키트 구성요소의 하위부분을 각각 포함하는 2개 이상의 별도 용기를 포함하는 임의의 전달 시스템은 용어 "세분화 키트"에 포함된다. 대조적으로, "조합 키트(combined kit)"는 단일 용기에(예를 들어, 목적하는 각 구성요소를 수용하는 단일 상자에) 반응 검정을 위한 모든 구성요소를 포함하는 전달 시스템을 지칭한다. 용어 "키트"는 세분화 키트 및 조합 키트를 모두 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "림프종"은 림프계에서의 B 세포 또는 T 세포의 악성 성장을 지칭한다. "림프종"은 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종을 비롯한 수많은 유형의 악성 성장을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비호지킨 림프종" 또는 "NHL"은 호지킨 림프종(예를 들어, 암성 부위에서의 리드-슈테른베르크 세포(Reed-Sternberg cell)의 존재를 특징으로 함)이 아닌 림프계에서의 B 세포 또는 T 세포의 악성 성장을 지칭한다. 비호지킨 림프종은 29가지가 넘는 유형의 림프종(예를 들어, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)을 포함하며, 유형의 암세포의 유형에 따라 구별된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "정보"는 사실 또는 데이터의 임의의 수집을 지칭한다. 인터넷을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 컴퓨터 시스템(들)을 사용하여 저장되거나 또는 처리되는 정보와 관련하여, 용어는 임의의 형식(예를 들어, 아날로그, 디지털, 광학 등)으로 저장된 임의의 데이터를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체와 관련된 정보"는 대상체(예를 들어, 인간, 식물 또는 동물)에 관한 사실 또는 데이터를 지칭한다. 용어 "게놈 정보"는 핵산 서열, 유전자, 메틸화 백분율, 대립유전자 빈도, RNA 발현 수준, 단백질 발현, 유전자형과 관련된 표현형 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 게놈에 관한 정보를 지칭한다. "대립유전자 빈도 정보"는 대립유전자 정체, 대립유전자의 정체와 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 특성 사이의 통계적 상관관계, 개체 또는 집단에서 대립유전자의 존재 또는 부재, 대립유전자가 하나 이상의 특정 특성을 갖는 개체에 존재할 가능성의 백분율 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 대립유전자 빈도에 관한 사실 또는 데이터를 지칭한다.
상세한 설명
다양한 실시형태의 이러한 상세한 설명에서, 설명을 목적으로 개시된 실시형태의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 당업자라면 이러한 다양한 실시형태가 이러한 특정 세부사항의 여부와 관계없이 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 다른 경우에는, 구조 및 장치가 블록 다이어그램 형식으로 표시된다. 또한, 당업자는 방법이 제시되고 수행되는 특정 순서가 예시적이라는 것을 쉽게 이해할 수 있으며, 순서는 변경될 수 있고 여전히 본 명세서에 개시된 다양한 실시형태의 사상 및 범주 내에서 유지된다는 것이 상정된다.
림프종 스크리닝을 위한 기술, 특히, 전적인 것은 아니지만, NHL 및/또는 특정 형태의 NHL(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)의 존재를 검출하기 위한 방법, 조성물 및 관련 용도가 본 명세서에 제공된다. 기술은 본 명세서에 기재되어 있으므로, 사용된 부문 제목은 구성적 목적만을 위한 것이며, 어떠한 식으로든 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실제로, 실시예 I에 기재된 바와 같이, 본 발명에 대한 실시형태를 확인하기 위한 과정 동안 수행된 실험은 비신생물 대조군 DNA로부터의 림프샘 유래 DNA의 암을 구별하기 위한 285개의 차별적으로 메틸화된 영역(DMR)의 신규한 세트를 확인하였다. 이러한 285개의 신규한 DNA 메틸화 마커로부터, 추가 실험을 통해 정상 림프샘 조직과 다른 유형의 림프종을 구별할 수 있는 마커를 확인하였다. 예를 들어, 1) 정상 림프샘 조직으로부터의 NHL 조직, 2) 정상 림프샘 조직으로부터의 여포성 림프종 조직, 3) 정상 림프샘 조직으로부터의 DLBCL 조직, 4) 정상 림프샘 조직으로부터의 외투 세포 림프종 조직, 5) 정상 림프샘 조직으로부터의 변연부 림프종 조직 및 6) 정상 림프샘 조직으로부터의 말초 T-세포 림프종 조직을 구별할 수 있는 별도의 DMR 세트가 확인되었다. 또한, NHL 및 NHL의 하위유형이 있는 대상체로부터의 혈장과 NHL 및 NHL의 하위유형이 없는 대상체로부터의 혈장을 식별할 수 있는 DMR이 확인되었다.
본 명세서의 개시내용은 소정의 예시된 실시형태를 언급하지만, 이들 실시형태는 예로서 제시되며 제한하기 위한 것이 아님을 이해하여야 한다.
특정 양태에서, 본 기술은 NHL과 같은 암을 확인, 결정 및/또는 분류하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 방법은 대상체로부터 단리된 생물학적 샘플(예를 들어, 대변 샘플, 림프샘 조직 샘플, 혈장 샘플)에서 적어도 하나의 메틸화 마커의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함하되, 마커의 메틸화 상태의 변화는 NHL 또는 NHL의 하위유형의 존재, 클래스 또는 부위를 나타낸다. 특정 실시형태는 NHL 및 다양한 유형의 NHL(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)의 진단(예를 들어, 스크리닝)에 사용되는 차별적으로 메틸화된 영역(DMR, 예를 들어, DMR 1 내지 285, 표 1 및 표 3 참조)을 포함하는 마커에 관한 것이다.
본 명세서에 제공되고 표 1 및 표 3에 열거된 DMR(예를 들어, DMR, 예를 들어, DMR 1 내지 285)을 포함하는 적어도 하나의 마커, 마커의 영역 또는 마커의 염기의 메틸화 분석이 분석된 실시형태에 더하여, 기술은 또한 암, 특히 림프종 및 림프종의 하위유형의 검출에 유용한 DMR을 포함하는 적어도 하나의 마커, 마커의 영역 또는 마커의 염기를 포함하는 마커의 패널을 제공한다.
기술의 일부 실시형태는 DMR을 포함하는 적어도 하나의 마커, 마커의 영역 또는 마커의 염기의 CpG 메틸화 상태의 분석에 기초한다.
일부 실시형태에서, 본 기술은 DMR(예를 들어, DMR 1 내지 285, 표 1 및 표 3 참조)을 포함하는 적어도 하나의 마커 내에서 CpG 다이뉴클레오타이드 서열의 메틸화 상태를 결정하기 위해 하나 이상의 메틸화 검정과 조합하여 메틸화-특이적 방식(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)으로 DNA를 변형시키는 시약의 용도를 제공한다. 게놈 CpG 다이뉴클레오타이드는 메틸화되거나 또는 메틸화되지 않을 수 있다(대안적으로, 각각 상향(up) 및 하향(down) 메틸화로 알려져 있음). 그러나 본 발명의 방법은 이질적인 특성의 생물학적 샘플, 예를 들어, 원격 샘플(예를 들어, 혈액, 기관 유출물 또는 대변)의 배역 내에서 저농도의 종양 세포 또는 이로부터의 생물학적 물질의 분석에 적합하다. 따라서, 이러한 샘플 내의 CpG 위치의 메틸화 상태를 분석할 때, 특정 CpG 위치에서 메틸화의 수준(예를 들어, 백분율, 분율, 비, 비율 또는 정도)을 결정하기 위한 정량적 검정을 사용할 수 있다.
본 기술에 따르면, DMR을 포함하는 마커에서 CpG 다이뉴클레오타이드 서열의 메틸화 상태의 결정은 NHL 및/또는 특정 형태의 NHL(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)과 같은 암의 진단 및 특성화 모두에 유용하다.
일부 실시형태에서, 기술은 표 1 및 표 3으로부터의 DMR(예를 들어, DMR 번호 1 내지 285)을 포함하는 마커의 조합의 메틸화 상태를 평가하는 것에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 마커의 메틸화 상태를 평가하는 것은 대상체에서 신생물(예를 들어, 림프종 및 림프종의 하위유형)을 확인하기 위한 스크리닝 또는 진단의 특이도 및/또는 민감도를 증가시킨다.
소정의 실시형태에서, 5-메틸사이토신의 존재에 대해 핵산을 분석하는 방법은 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시키는 시약으로 DNA를 처리하는 단계를 포함한다. 이러한 시약의 예는 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
5-메틸사이토신의 존재에 대해 핵산을 분석하기 위해 자주 사용되는 방법은 DNA에서 5-메틸사이토신의 검출에 대해 Frommer 등이 기술한 바이설파이트 방법(모든 목적을 위해 전체가 참조에 의해 본 명세서에 명시적으로 원용되어 있는 문헌[Frommer et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827-31]) 또는 이의 변형을 기반으로 한다. 5-메틸사이토신을 매핑하는 바이설파이트 방법은 5-메틸사이토신이 아닌 사이토신이 하이드로겐 설파이트 이온(바이설파이트로도 알려져 있음)과 반응한다는 관찰을 기반으로 한다. 반응은 일반적으로 다음 단계에 따라 수행된다: 첫째, 사이토신은 하이드로겐 설파이트와 반응하여 설폰화된 사이토신을 형성한다. 다음으로, 설폰화된 반응 중간체의 자발적 탈아미노화는 설폰화된 우라실을 생성한다. 마지막으로, 설폰화된 우라실은 알칼리성 조건하에 탈설폰화되어 우라실을 형성한다. 우라실 염기는 아데닌과 쌍을 이루는 반면(따라서 티민처럼 거동함), 5-메틸사이토신은 구아닌과 쌍을 이루어(따라서 사이토신처럼 거동함) 검출이 가능하다. 이는, 예를 들어, 바이설파이트 게놈 시퀀싱(Grigg G, & Clark S, Bioessays (1994) 16: 431-36; Grigg G, DNA Seq. (1996) 6: 189-98), 예를 들어, 미국 특허 제5,786,146호에 기재된 바와 같은 메틸화-특이적 PCR(MSP)에 의해 또는 서열-특이적 프로브 절단을 포함하는 검정, 예를 들어, QuARTS 플랩 엔도뉴클레이스 검정(예를 들어, 문헌[Zou et al. (2010) "Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology" Clin Chem 56: A199]; 및 미국 특허 제8,361,720호; 제8,715,937호; 제8,916,344호; 및 제9,212,392호 참조)을 사용하여 메틸화된 사이토신과 메틸화되지 않은 사이토신의 구별을 가능하게 한다.
일부 종래의 기술은 분석될 DNA를 아가로스 매트릭스에 밀봉하여 DNA의 확산 및 재생을 방지하는 단계(바이설파이트는 단일-가닥 DNA와만 반응함) 및 빠른 투석으로 침전 및 정제 단계를 대체하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다(Olek A, et al. (1996) "A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis" Nucleic Acids Res. 24: 5064-6). 따라서, 메틸화 상태에 대한 개별 세포를 분석하여 방법의 유용성 및 민감도를 설명할 수 있다. 5-메틸사이토신을 검출하기 위한 종래의 방법에 대한 개요는 문헌[Rein, T., et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26: 2255]에 제공되어 있다.
바이설파이트 기법은 전형적으로 바이설파이트 처리 후 공지된 핵산의 짧은 특정 단편을 증폭시킨 다음, 시퀀싱(Olek & Walter (1997) Nat. Genet. 17: 275-6) 또는 프라이머 연장 반응(Gonzalgo & Jones (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2529-31; WO 95/00669; 미국 특허 제6,251,594호)에 의해 산물을 검정하여 개별 사이토신 위치를 분석하는 것을 포함한다. 일부 방법은 효소적 소화를 사용한다(Xiong & Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-4). 또한, 혼성화에 의한 검출이 당업계에 기술되어 있다(Olek et al., WO 99/28498). 추가적으로, 개별 유전자에 대한 메틸화 검출을 위한 바이설파이트 기법의 사용이 기술되어 있다(Grigg & Clark (1994) Bioessays 16: 431-6,; Zeschnigk et al. (1997) Hum Mol Genet. 6: 387-95; Feil et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 695; Martin et al. (1995) Gene 157: 261-4; WO 9746705; WO 9515373).
다양한 메틸화 검정 절차가 본 기술에 따른 바이설파이트 처리와 함께 사용될 수 있다. 이러한 검정은 핵산 서열 내에서 하나 또는 복수의 CpG 다이뉴클레오타이드(예를 들어, CpG 섬)의 메틸화 상태를 결정할 수 있게 한다. 이러한 검정은 다른 기법 중에서도, 바이설파이트-처리된 핵산의 시퀀싱, PCR(서열-특이적 증폭용), 서던 블롯 분석 및 메틸화-특이적 제한 효소, 예를 들어, 메틸화-민감성 또는 메틸화-의존적 효소의 사용을 포함한다.
예를 들어, 바이설파이트 처리를 사용함으로써 메틸화 패턴 및 5-메틸사이토신 분포의 분석을 위한 게놈 시퀀싱이 단순화되었다(Frommer et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827-1831). 추가적으로, 바이설파이트-전환된 DNA로부터 증폭된 PCR 산물의 제한 효소 소화는, 예를 들어, 문헌[Sadri & Hornsby (1997) Nucl. Acids Res. 24: 5058-5059]에 기술된 바와 같이 또는 COBRA(Combined Bisulfite Restriction Analysis: 조합된 바이설파이트 제한 분석)으로 알려진 방법(Xiong & Laird (1997) Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534)에서 구현된 바와 같이 메틸화 상태를 평가하는 데 사용된다.
COBRA™ 분석은 소량의 게놈 DNA에서 특정 유전자좌의 DNA 메틸화 수준을 결정하는 데 유용한 정량적 메틸화 검정이다(Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). 간략하게는, 제한 효소 소화가 소듐 바이설파이트-처리된 DNA의 PCR 산물에서 메틸화-의존적 서열 차이를 밝히기 위해 사용된다. Frommer 등에 의해 기술된 절차에 따른 표준 바이설파이트 처리에 의해 메틸화-의존적 서열 차이가 먼저 게놈 DNA에 도입된다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). 그런 다음, 바이설파이트 전환된 DNA의 PCR 증폭이 관심 CpG 섬에 특이적인 프라이머를 사용하여 수행된 후, 제한 엔도뉴클레이스 소화, 겔 전기영동 및 특정 표지된 혼성화 프로브를 사용한 검출이 수행된다. 원래의 DNA 샘플의 메틸화 수준은 광범위한 DNA 메틸화 수준 대해 선형 정량적 방식으로 소화된 그리고 소화되지 않은 PCR 산물의 상대적인 양으로 표시된다. 또한, 이 기법은 미세 해부된 파라핀-포매된 조직 샘플로부터 얻은 DNA에 안정적으로 적용될 수 있다.
COBRA™ 분석을 위한 전형적인 시약(예를 들어, 전형적인 COBRA™ 기반 키트에서 찾을 수 있음)은 다음을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다: 특정 유전자좌(예를 들어, 특정 유전자, 마커, DMR, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬 등)에 대한 PCR 프라이머; 제한 효소 및 적절한 완충액; 유전자-혼성화 올리고뉴클레오타이드; 대조군 혼성화 올리고뉴클레오타이드; 올리고뉴클레오타이드 프로브용 카이네이스 표지 키트; 및 표지된 뉴클레오타이드. 추가적으로, 바이설파이트 전환 시약은 다음을 포함할 수 있다: DNA 변성 완충액; 설폰화 완충액; DNA 회수 시약 또는 키트(예를 들어, 침전, 한외여과, 친화도 칼럼); 탈설폰화 완충액; 및 DNA 회수 성분.
"MethyLight™"(형광성-기반 실시간 PCR 기법)(Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999), Ms-SNuPE™(메틸화-민감성 단일 뉴클레오타이드 프라이머 연장) 반응(Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997), 메틸화-특이적 PCR("MSP"; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; 미국 특허 제5,786,146호) 및 메틸화된 CpG 섬 증폭("MCA"; Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999)과 같은 검정이 단독으로 또는 이들 방법 중 하나 이상과 조합하여 사용된다.
"HeavyMethyl™" 검정, 기법은 바이설파이트-처리된 DNA의 메틸화-특이적 증폭을 기반으로 메틸화 차이를 평가하기 위한 정량적 방법이다. 증폭 프라이머 사이의 CpG 위치를 덮거나 또는 증폭 프라이머에 의해 덮이는 메틸화-특이적 차단 프로브("차단제")는 핵산 샘플의 메틸화-특이적 선택적 증폭을 가능하게 한다.
용어 "HeavyMethyl™ MethyLight™" 검정은 MethyLight™ 검정의 변형인 HeavyMethyl™ MethyLight™ 검정을 지칭하되, MethyLight™ 검정은 증폭 프라이머 사이의 CpG 위치를 덮는 메틸화 특이적 차단 프로브와 조합된다. HeavyMethyl™ 검정은 또한 메틸화 특이적 증폭 프라이머와 조합하여 사용될 수 있다.
HeavyMethyl™ 분석을 위한 전형적인 시약(예를 들어, 전형적인 MethyLight™ 기반 키트에서 찾을 수 있음)은 다음을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다: 특정 유전자좌(예를 들어, 특정 유전자, 마커, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬 또는 바이설파이트 처리된 DNA 서열 또는 CpG 섬 등)에 대한 PCR 프라이머; 차단 올리고뉴클레오타이드; 최적화된 PCR 완충액 및 데옥시뉴클레오타이드; 및 Taq 폴리머레이스.
MSP(메틸화-특이적 PCR)는 메틸화-민감성 제한 효소의 사용과 관계없이 CpG 섬 내의 거의 모든 CpG 부위의 그룹의 메틸화 상태를 평가할 수 있다(Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; 미국 특허 제5,786,146호). 간략하게는, DNA는 비메틸화된(메틸화되지 않은) 사이토신을 우라실로 전환시키는 소듐 바이설파이트에 의해 변형되며, 생성물은 후속적으로 메틸화된 대 메틸화되지 않은 DNA에 특이적인 프라이머로 증폭된다. MSP는 소량의 DNA만을 필요로 하고, 주어진 CpG 섬 유전자좌의 0.1% 메틸화된 대립유전자에 민감하며, 파라핀-포매된 샘플로부터 추출된 DNA에서 수행될 수 있다. MSP 분석을 위한 전형적인 시약(예를 들어, 전형적인 MSP-기반 키트에서 찾을 수 있음)은 다음을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다: 특정 유전자좌(예를 들어, 특정 유전자, 마커, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬 등)에 대한 메틸화된 그리고 메틸화되지 않은 PCR 프라이머; 최적화된 PCR 완충액 및 데옥시뉴클레오타이드 및 특정 프로브.
MethyLight™ 검정은 PCR 단계 후 추가 조작이 필요하지 않은 형광-기반 실시간 PCR(예를 들어, TaqMan®)을 이용하는 고속 대량 정량적 메틸화 검정이다(Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). 간략하게는, MethyLight™ 과정은 표준 절차에 따라 소듐 바이설파이트 반응에서 메틸화-의존적 서열 차이의 혼합된 풀로 전환되는 게놈 DNA의 혼합된 샘플로 시작한다(바이설파이트 과정은 메틸화되지 않은 사이토신 잔기를 우라실로 전환함). 그런 다음, 형광성-기반 PCR은, 예를 들어, 공지된 CpG 다이뉴클레오타이드와 중첩되는 PCR 프라이머를 사용하여 "편향된(biased)" 반응으로 수행된다. 서열 식별은 증폭 과정의 수준 및 형광 검출 과정의 수준 모두에서 발생한다.
MethyLight™ 검정은 핵산, 예를 들어, 게놈 DNA 샘플의 메틸화 패턴에 대한 정량적 테스트로 사용되되, 서열 식별은 프로브 혼성화의 수준에서 발생한다. 정량적 버전에서, PCR 반응은 특정 추정상의 메틸화 부위와 중첩되는 형광 프로브의 존재하에 메틸화 특이적 증폭을 제공한다. 입력 DNA의 양에 대한 편향되지 않은 대조군은 프라이머나 프로브가 임의의 CpG 다이뉴클레오타이드 위에 놓이지 않는 반응에 의해 제공된다. 대안적으로, 게놈 메틸화에 대한 정성적 테스트는 공지된 메틸화 부위를 덮지 않는 대조군 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, HeavyMethyl™ 및 MSP 기법의 형광성-기반 버전) 또는 잠재적인 메틸화 부위를 덮는 올리고뉴클레오타이드로 편향된 PCR 풀을 조사함으로써 달성된다.
MethyLight™ 과정은 임의의 적합한 프로브(예를 들어, "TaqMan®" 프로브, Lightcycler® 프로브 등)와 함께 사용된다. 예를 들어, 일부 적용에서, 이중-가닥 게놈 DNA는 소듐 바이설파이트로 처리되고, TaqMan® 프로브, 예를 들어, MSP 프라이머 및/또는 HeavyMethyl 차단제 올리고뉴클레오타이드와 TaqMan® 프로브를 사용하여 두 세트의 PCR 반응 중 하나에 적용된다. TaqMan® 프로브는 형광 "리포터" 및 "소광제" 분자로 이중-표지되며, 정방향 또는 역방향 프라이머보다 PCR 주기에서 약 10℃ 더 높은 온도에서 녹도록 상대적으로 높은 GC 함량 영역에 특이적이도록 설계되었다. 이는 TaqMan® 프로브가 PCR 어닐링/연장 단계 동안 완전히 혼성화된 상태를 유지할 수 있게 한다. Taq 폴리머레이스는 PCR 동안 새로운 가닥을 효소적으로 합성하므로, 이는 결국 어닐링된 TaqMan® 프로브에 도달할 것이다. 그런 다음, Taq 폴리머레이스 5'에서 3' 엔도뉴클레이스 활성은 실시간 형광 검출 시스템을 사용하여 현재 소광되지 않은 신호의 정량적 검출을 위해 형광 리포터 분자를 방출하기 위해 TaqMan® 프로브를 소화시킴으로써 이를 대체할 것이다.
MethyLight™ 분석을 위한 전형적인 시약(예를 들어, 전형적인 MethyLight™ 기반 키트에서 찾을 수 있음)은 다음을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다: 특정 유전자좌(예를 들어, 특정 유전자, 마커, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬 등)에 대한 PCR 프라이머; TaqMan® 또는 Lightcycler® 프로브; 최적화된 PCR 완충액 및 데옥시뉴클레오타이드; 및 Taq 폴리머레이스.
QM™(정량적 메틸화) 검정은 게놈 DNA 샘플의 메틸화 패턴에 대한 대안적인 정량적 테스트이되, 서열 식별은 프로브 혼성화의 수준에서 발생한다. 이 정량적 버전에서, PCR 반응은 특정 추정상의 메틸화 부위와 중첩되는 형광 프로브의 존재하에 편향되지 않은 증폭을 제공한다. 입력 DNA의 양에 대한 편향되지 않은 대조군은 프라이머나 프로브가 임의의 CpG 다이뉴클레오타이드의 위에 놓이지 않는 반응에 의해 제공된다. 대안적으로, 게놈 메틸화에 대한 정성적 테스트는 공지된 메틸화 부위를 덮지 않는 대조군 올리고뉴클레오타이드(HeavyMethyl™ 및 MSP 기법의 형광성-기반 버전) 또는 잠재적인 메틸화 부위를 덮는 올리고뉴클레오타이드로 편향된 PCR 풀을 조사함으로써 달성된다.
QM™ 과정은 증폭 과정에서 임의의 적합한 프로브, 예를 들어, "TaqMan®" 프로브, Lightcycler® 프로브와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 이중-가닥 게놈 DNA는 소듐 바이설파이트로 처리되고, 편향되지 않은 프라이머 및 TaqMan® 프로브에 적용된다. TaqMan® 프로브는 형광 "리포터" 및 "소광제" 분자로 이중-표지되고, 정방향 또는 역방향 프라이머보다 PCR 주기에서 약 10℃ 더 높은 온도에서 녹도록 상대적으로 높은 GC 함량 영역에 특이적이도록 설계되었다. 이는 TaqMan® 프로브가 PCR 어닐링/연장 단계 동안 완전히 혼성화된 상태를 유지할 수 있게 한다. Taq 폴리머레이스는 PCR 동안 새로운 가닥을 효소적으로 합성하므로, 이는 결국 어닐링된 TaqMan® 프로브에 도달할 것이다. 그런 다음, Taq 폴리머레이스 5'에서 3' 엔도뉴클레이스 활성은 실시간 형광 검출 시스템을 사용하여 현재 소광되지 않은 신호의 정량적 검출을 위해 형광 리포터 분자를 방출하기 위해 TaqMan® 프로브를 소화시킴으로써 이를 대체할 것이다. QM™ 분석을 위한 전형적인 시약(예를 들어, 전형적인 QM™-기반 키트에서 찾을 수 있음)은 다음을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다: 특정 유전자좌(예를 들어, 특정 유전자, 마커, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬 등)에 대한 PCR 프라이머; TaqMan® 또는 Lightcycler® 프로브; 최적화된 PCR 완충액 및 데옥시뉴클레오타이드; 및 Taq 폴리머레이스.
Ms-SNuPE™ 기법은 DNA의 바이설파이트 처리 후 단일-뉴클레오타이드 프라이머 연장을 기반으로 특정 CpG 부위에서의 메틸화 차이를 평가하기 위한 정량적 방법이다(Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). 간략하게는, 게놈 DNA는 소듐 바이설파이트와 반응하여 메틸화되지 않은 사이토신을 우라실로 전환하고, 5-메틸사이토신은 변화되지 않은 상태로 둔다. 그런 다음, 바이설파이트-전환된 DNA에 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여 목적하는 표적 서열의 증폭을 수행하고, 생성된 생성물을 단리하여 CpG 관심 부위의 메틸화 분석을 위한 주형으로 사용하였다. 소량의 DNA가 분석될 수 있으며(예를 들어, 미세해부된 병리학적 절편), 이는 CpG 부위에서 메틸화 상태를 결정하기 위한 제한 효소의 이용을 방지한다.
Ms-SNuPE™ 분석을 위한 전형적인 시약(예를 들어, 전형적인 Ms-SNuPE™ 기반 키트에서 찾을 수 있음)은 다음을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다: 특정 유전자좌(예를 들어, 특정 유전자, 마커, 유전자의 영역, 마커의 영역, 바이설파이트 처리된 DNA 서열, CpG 섬 등)에 대한 PCR 프라이머; 최적화된 PCR 완충액 및 데옥시뉴클레오타이드; 겔 추출 키트; 양성 대조군 프라이머; 특정 유전자좌에 대한 Ms-SNuPE™ 프라이머; 반응 완충액(Ms-SNuPE 반응용); 및 표지된 뉴클레오타이드. 추가적으로, 바이설파이트 전환 시약은 다음을 포함할 수 있다: DNA 변성 완충액; 설폰화 완충액; DNA 회수 시약 또는 키트(예를 들어, 침전, 한외여과, 친화도 칼럼); 탈설폰화 완충액; 및 DNA 회수 성분.
감소된 표현 바이설파이트 시퀀싱(RRBS)은 메틸화되지 않은 모든 사이토신을 우라실로 전환하기 위해 핵산을 바이설파이트 처리하는 것으로 시작하여, 어댑터 리간드에 대한 커플링 후 제한 효소 소화(예를 들어, MspI와 같은 CG 서열을 포함하는 부위를 인식하는 효소에 의해) 및 단편의 완전한 시퀀싱이 뒤따른다. 제한 효소의 선택은 CpG 밀집 영역에 대한 단편을 풍부하게 하여 분석 중에 여러 유전자 위치에 매핑될 수 있는 불필요한 서열의 수를 줄일 수 있다. 이와 같이, RRBS는 시퀀싱을 위한 제한 단편의 서브세트를 선택함으로써(예를 들어, 분취 겔 전기영동을 사용한 크기 선택에 의해) 핵산 샘플의 복잡성을 줄인다. 전체-게놈 바이설파이트 시퀀싱과 달리, 제한 효소 소화에 의해 생성된 모든 단편은 적어도 하나의 CpG 다이뉴클레오타이드에 대한 DNA 메틸화 정보를 포함한다. 이와 같이, RRBS는 프로모터, CpG 섬 및 이러한 영역에서 높은 빈도의 제한 효소 절단 부위를 갖는 기타 게놈 특징에 대한 샘플을 풍부하게 하고, 따라서 하나 이상의 게놈 유전자좌의 메틸화 상태를 평가하기 위한 검정을 제공한다.
RRBS에 대한 전형적인 프로토콜은 MspI와 같은 제한 효소로 핵산 샘플을 소화시키는 단계, 오버행 및 A-꼬리를 채우는(filling) 단계, 어댑터를 결찰시키는 단계, 바이설파이트 전환 단계 및 PCR 단계를 포함한다. 예를 들어, 문헌[et al. (2005) "Genome-scale DNA methylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution" Nat Methods 7: 133-6; Meissner et al. (2005) "Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis" Nucleic Acids Res. 33: 5868-77] 참조.
일부 실시형태에서, 정량적 대립유전자-특이적 실시간 표적 및 신호 증폭(QuARTS) 검정은 메틸화 상태를 평가하는 데 사용된다. 1차 반응에 증폭(반응 1) 및 표적 프로브 절단(반응 2); 및 2차 반응에 FRET 절단 및 형광 신호 생성(반응 3)을 포함하는 각 QuARTS 검정에서 세 가지 반응은 순차적으로 발생한다. 표적 핵산이 특정 프라이머로 증폭되면, 플랩 서열이 있는 특정 검출 프로브는 앰플리콘에 느슨하게 결합한다. 표적 결합 부위에서 특정 침습성 올리고뉴클레오타이드의 존재는 5' 뉴클레이스, 예를 들어, FEN-1 엔도뉴클레이스가 검출 프로브와 플랩 서열 사이를 절단함으로써 플랩 서열을 방출하게 한다. 플랩 서열은 상응하는 FRET 카세트의 비헤어핀 부분에 상보적이다. 따라서, 플랩 서열 FRET 카세트에서 침습성 올리고뉴클레오타이드로서 기능하고, FRET 카세트 형광단과 소광제 사이의 절단을 일으켜 형광 신호를 생성한다. 절단 반응은 표적당 여러 프로브를 절단할 수 있으므로, 플랩당 여러 형광단을 방출하여 기하급수적 신호 증폭을 제공한다. QuARTS는 상이한 염료와 함께 FRET 카세트를 사용함으로써 단일 반응 웰에서 여러 표적을 검출할 수 있다. 예를 들어, 모든 목적을 위해 각각 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Zou et al. (2010) "Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology" Clin Chem 56: A199] 및 미국 특허 제8,361,720호; 제8,715,937호; 제8,916,344호; 및 제9,212,392호를 참조한다.
용어 "바이설파이트 시약"은 메틸화된 그리고 메틸화되지 않은 CpG 다이뉴클레오타이드 서열을 구별하기 위해 본 명세서에 개시된 바와 같이 유용한 바이설파이트, 다이설파이트, 하이드로겐 설파이트 또는 이들의 조합을 포함하는 시약을 지칭한다. 상기 처리 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, PCT/EP2004/011715 및 WO 2013/116375, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 원용됨). 일부 실시형태에서, 바이설파이트 처리는 n-알킬렌글리콜 또는 다이에틸렌 글리콜 다이메틸 에터(DME)와 같지만 이들로 제한되지 않는 변성 용매의 존재하에 또는 다이옥세인 또는 다이옥세인 유도체의 존재하에 수행된다. 일부 실시형태에서, 변성 용매는 1% 내지 35%(v/v)의 농도로 사용된다. 일부 실시형태에서, 바이설파이트 반응은 크로메인 유도체, 예를 들어, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로메인 2-카복실산 또는 트라이하이드록시벤조산 및 이의 유도체, 예를 들어, 갈산과 같지만 이들로 제한되지 않는 스캐빈저의 존재하에 수행된다(전체가 참조에 의해 원용되어 있는 PCT/EP2004/011715 참조). 소정의 바람직한 실시형태에서, 바이설파이트 반응은, 예를 들어, WO 2013/116375에 기술되어 있는 바와 같이 암모늄 하이드로겐 설파이트로 처리하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 처리된 DNA의 단편은 본 발명에 따른 프라이머 올리고뉴클레오타이드 세트(예를 들어, 표 5 참조) 및 증폭 효소를 사용하여 증폭된다. 여러 DNA 분절의 증폭은 하나의 동일한 반응 용기에서 동시에 수행될 수 있다. 전형적으로, 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 수행된다. 앰플리콘은 전형적으로 100개 내지 2000개의 염기쌍 길이이다.
방법의 또 다른 실시형태에서, DMR(예를 들어, DMR 1 내지 285, 표 1 및 표 3)을 포함하는 마커 내 또는 근처의 CpG 위치의 메틸화 상태는 메틸화-특이적 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 사용에 의해 검출될 수 있다. 이러한 기법(MSP)은 Herman의 미국 특허 제6,265,171호에 기술되어 있다. 바이설파이트 처리된 DNA의 증폭을 위해 메틸화 상태 특이적 프라이머를 사용하면 메틸화된 핵산과 메틸화되지 않은 핵산 사이의 구별이 가능하다. MSP 프라이머 쌍은 바이설파이트 처리된 CpG 다이뉴클레오타이드에 혼성화하는 적어도 하나의 프라이머를 포함한다. 따라서, 상기 프라이머의 서열은 적어도 하나의 CpG 다이뉴클레오타이드를 포함한다. 메틸화되지 않은 DNA에 특이적인 MSP 프라이머는 CpG의 C 위치에 "T"를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 무세포 DNA에서 산화된 5-메틸사이토신 잔기를 다이하이드로우라실 잔기로 전환시키는 방법을 제공한다(문헌[Liu et al., 2019, Nat Biotechnol. 37, pp. 424-429]; 미국 공개 제202000370114호 참조). 방법은 5-폼일사이토신(5fC), 5-카복시메틸사이토신(5caC) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 산화된 5mC 잔기와 유기 보레인의 반응을 포함한다. 산화된 5mC 잔기는 자연적으로 발생하거나, 보다 전형적으로 5mC 또는 5hmC 잔기의 사전 산화, 예를 들어, TET 패밀리 효소(예를 들어, TET1, TET2 또는 TET3)를 사용한 5mC 또는 5hmC의 산화 또는, 예를 들어, 과산화텅스텐산염(예를 들어, 문헌[Okamoto et al. (2011) Chem. Commun. 47:11231-33] 참조) 및 구리(II) 과염소산염/2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실(TEMPO) 조합(문헌[Matsushita et al. (2017) Chem. Commun. 53:5756-59] 참조)과 같은 포타슘 퍼루테네이트(KRuO4) 또는 무기 과산화 화합물 또는 조성물을 사용한 5mC 또는 5hmC의 화학적 산화의 결과일 수 있다.
유기 보레인은 보레인과 질소 헤테로사이클 및 3차 아민으로부터 선택되는 질소-함유 화합물의 복합체로 특징지어질 수 있다. 질소 헤테로사이클은 단환식, 이환식 또는 다환식일 수 있지만, 전형적으로 질소 헤테로원자 및 선택적으로 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 헤테로원자를 포함하는 5-원 또는 6-원 고리 형태의 단환식이다. 질소 헤테로사이클은 방향족 또는 지환족일 수 있다. 본 명세서에서 바람직한 질소 헤테로사이클은 2-피롤린, 2H-피롤, 1H-피롤, 피라졸리딘, 이미다졸리딘, 2-피라졸린, 2-이미다졸린, 피라졸, 이미다졸, 1,2,4-트라이아졸, 1,2,4-트라이아졸, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 1,2,4-트라이아진 및 1,3,5-트라이아진을 포함하며, 이들 중 임의의 것은 치환되지 않거나 또는 하나 이상의 비수소 치환기로 치환될 수 있다. 전형적인 비수소 치환기는 알킬기, 특히 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, 아이소뷰틸, t-뷰틸 등과 같은 저급 알킬기이다. 예시적인 화합물은 피리딘 보레인, 2-메틸피리딘 보레인(2-피콜린 보레인으로도 지칭됨) 및 5-에틸-2-피리딘을 포함한다.
유기 보레인과 무세포 DNA의 산화된 5mC 잔기의 반응은 무독성 시약 및 온화한 반응 조건이 사용될 수 있는 한 유리하며; 임의의 바이설파이트나 또는 임의의 다른 잠재적으로 DNA를 분해하는 시약은 필요하지 않다. 또한, 유기 보레인으로 산화된 5mC 잔기를 다이하이드로우라실로 전환하는 것은 "원-포트(one-pot)" 또는 "원-튜브(one-튜브)" 반응에서 임의의 중간체를 단리할 필요 없이 수행될 수 있다. 이는 전환이 여러 단계, 즉, (1) 산화된 5mC에서 C-4와 C-5를 연결하는 알켄 결합의 환원, (2) 탈아미노화 및(3) 산화된 5mC가 5caC인 경우 탈카복실화 또는 산화된 5mC가 5fC인 경우 탈폼일화를 포함하기 때문에 상당히 중요하다.
무세포 DNA의 산화된 5-메틸사이토신 잔기를 다이하이드로우라실 잔기로 전환시키는 방법에 더하여, 본 발명은 또한 전술한 방법과 관련된 반응 혼합물을 제공한다. 반응 혼합물은 5caC, 5fC 및 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 산화된 5-메틸사이토신 잔기를 포함하는 무세포 DNA의 샘플 및 적어도 하나의 산화된 5-메틸사이토신 잔기를 감소, 탈아미노화 및 탈카복실화 또는 탈폼일화하는 데 효과적인 유기 보레인을 포함한다. 유기 보레인은 보레인 및 위에서 설명된 바와 같이 질소 헤테로사이클 및 3차 아민으로부터 선택되는 질소-함유 화합물의 복합체이다. 바람직한 실시형태에서, 반응 혼합물은 바이설파이트가 실질적으로 없으며, 이는 바이설파이트 이온 및 바이설파이트염이 실질적으로 없음을 의미한다. 이상적으로, 반응 혼합물은 바이설파이트를 포함하지 않는다.
본 발명의 관련 양태에서, 무세포 DNA의 5mC 잔기를 다이하이드로우라실 잔기로 전환시키기 위한 키트가 제공되되, 키트는 5hmC 잔기를 차단하기 위한 시약, 5mC 잔기를 하이드록시메틸화 이상으로 산화시켜 산화된 5mC 잔기를 제공하기 위한 시약 및 산화된 5mC 잔기를 환원, 탈아미노화 및 탈카복실화 또는 탈폼일화하는데 효과적인 유기 보레인을 포함한다. 키트는 또한 위에 기재된 방법을 수행하기 위해 구성요소를 사용하기 위한 지침서를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 위에 기재된 산화 반응을 사용하는 방법이 제공된다. 방법은 무세포 DNA에서 5-메틸사이토신 잔기의 존재 및 위치를 검출할 수 있게 하며, 다음 단계를 포함한다:
(a) 단편화된 어댑터-결찰 무세포 DNA의 5hmC 잔기를 변형시켜 그 위에 친화성 태그를 제공하는 단계로서, 친화성 태그는 무세포 DNA로부터의 변형된 5hmC-함유 DNA의 제거를 가능하게 하는, 상기 친화성 태그를 제공하는 단계;
(b) 무세포 DNA로부터 변형된 5hmC-함유 DNA를 제거하여 변형되지 않은 5mC 잔기를 포함하는 DNA를 남기는 단계;
(c) 변형되지 않은 5mC 잔기를 산화시켜 5caC, 5fC 및 이들의 조합으로부터 선택되는 산화된 5mC 잔기를 포함하는 DNA를 수득하는 단계;
(d) 산화된 5mC 잔기를 포함하는 DNA를 산화된 5mC 잔기를 환원, 탈아미노화 및 탈카복실화 또는 탈폼일화하는 데 효과적인 유기 보레인과 접촉시켜 산화된 5mC 잔기 대신 다이하이드로우라실 잔기를 포함하는 DNA를 제공하는 단계;
(e) 다이하이드로우라실 잔기를 포함하는 DNA를 증폭 및 시퀀싱하는 단계;
(f) (e)의 시퀀싱 결과로부터 5-메틸화 패턴을 결정하는 단계.
무세포 DNA는 대상체로부터의 신체 샘플로부터 추출되며, 신체 샘플은 전형적으로는 전혈, 혈장 또는 혈청, 가장 전형적으로는 혈장이지만, 샘플은 또한 소변, 타액, 점막 배설물, 가래, 대변 또는 눈물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 무세포 DNA는 종양으로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 무세포 DNA는 질환 또는 기타 병원성 병태가 있는 환자로부터 유래한다. 무세포 DNA는 종양으로부터 유래할 수 있거나 또는 유래하지 않을 수 있다. (a) 단계에서, 5hmC 잔기가 변형되는 무세포 DNA는 정제되고 단편화된 형태이며, 어댑터-결찰되어 있다는 점에 유의하여야 한다. 이러한 맥락에서 DNA 정제는 당업자에게 공지되고/되거나 관련 문헌에 기술되어 있는 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 무세포 DNA 자체는 고도로 단편화될 수 있지만, 예를 들어, 미국 공개 제2017/0253924호에 기술되어 있는 바와 같이 추가 단편화가 때때로 바람직할 수 있다. 무세포 DNA 단편은 일반적으로 약 20개의 뉴클레오타이드 내지 약 500개의 뉴클레오타이드의 크기 범위, 보다 전형적으로 약 20개의 뉴클레오타이드 내지 약 250개의 뉴클레오타이드의 크기 범위이다. (a) 단계에서 변형된 정제된 무세포 DNA 단편은 단편이 각각 3' 말단 및 5' 말단에 평활 말단을 갖도록 종래의 수단(예를 들어, 제한 효소)을 사용하여 말단 복구되었다. 바람직한 방법에서, WO 2017/176630에 기술되어 있는 바와 같이, 평활 단편은 또한 Taq 폴리머레이스와 같은 폴리머레이스를 사용하여 단일 아데닌 잔기를 포함하는 3' 오버행을 갖추었다. 이는 선택된 범용 어댑터, 즉, 무세포 DNA 단편의 양 말단에 결찰되고 적어도 하나의 분자 바코드를 포함하는 Y-어댑터 또는 헤어핀 어댑터와 같은 어댑터의 후속 결찰을 용이하게 한다. 어댑터의 사용은 또한 어댑터-결찰된 DNA 단편의 선택적 PCR 농축을 가능하게 한다.
그런 다음, (a) 단계에서, "정제되고 단편화된 무세포 DNA"는 어댑터-결찰된 DNA 단편을 포함한다. (a) 단계에서 명시된 바와 같이 친화성 태그를 갖는 이러한 무세포 DNA 단편에서 5hmC 잔기의 변형은 무세포 DNA로부터의 변형된 5hmC-함유 DNA의 후속 제거를 가능하게 하기 위해 수행된다. 일 실시형태에서, 친화성 태그는 바이오틴, 데스티오바이오틴, 옥시바이오틴, 2-이미노바이오틴, 다이아미노바이오틴, 바이오틴 설폭사이드, 바이오사이틴 등과 같은 바이오틴 모이어티를 포함한다. 친화성 태그로서 바이오틴 모이어티를 사용하면 스트렙타비딘, 예를 들어, 스트렙타비딘 비드, 자성 스트렙타비딘 비드 등으로 쉽게 제거할 수 있다.
바이오틴 모이어티 또는 다른 친화성 태그로 5hmC 잔기를 태깅하는 것은 DNA 단편의 5hmC 잔기에 대한 화학선택적 기의 공유적 부착에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 화학선택적 기는 친화성 태그를 5hmC 잔기에 연결하기 위해 작용화된 친화성 태그와 반응할 수 있다. 일 실시형태에서, 화학선택적 기는 UDP 글루코스-6-아지드이며, 이는 문헌[Robertson et al. (2011) Biochem. Biophys. Res. Comm. 411(1):40-3], 미국 특허 제8,741,567호 및 WO 2017/176630에 기술되어 있는 바와 같이 알킨-작용화된 바이오틴 모이어티와 자발적인 1,3-고리첨가 반응을 겪는다. 따라서, 알킨-작용화된 바이오틴-모이어티를 첨가하면 각 5hmC 잔기에 바이오틴 모이어티가 공유 부착된다.
그런 다음, 친화성 태그가 부착된 DNA 단편은 일 실시형태에서, 스트렙타비딘 비드, 자성 스트렙타비딘 비드 등의 형태로 스트렙타비딘을 사용하여 (b) 단계에서 풀 다운될 수 있고, 원하는 경우 나중 분석을 위해 따로 보관될 수 있다. 친화성 태그가 부착된 단편의 제거 후 남아있는 상청액은 변형되지 않은 5mC 잔기는 포함하지만 5hmC 잔기는 없는 DNA를 포함한다.
(c) 단계에서, 변형되지 않은 5mC 잔기는 임의의 적합한 수단을 사용하여 산화되어 5caC 잔기 및/또는 5fC 잔기를 제공한다. 산화제는 하이드록시메틸화 이상으로 5mC 잔기를 산화시키도록, 즉, 5caC 및/또는 5fC 잔기를 제공하도록 선택된다. 산화는 촉매적으로 활성인 TET 패밀리 효소를 사용하여 효소적으로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "TET 패밀리 효소" 또는 "TET 효소"는 개시내용이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 특허 제9,115,386호에 정의된 바와 같은 촉매적으로 활성인 "TET 패밀리 단백질" 또는 "TET 촉매적으로 활성인 단편"을 지칭한다. 이러한 맥락에서 바람직한 TET 효소는 TET2이며; 문헌[Ito et al. (2011) Science 333(6047):1300-1303]을 참조한다. 산화는 또한 이전 부문에 기술된 바와 같이 화학적 산화제를 사용하여 화학적으로 수행될 수 있다. 적합한 산화제의 예는 제한 없이 금속 퍼루테네이트 예컨대, 포타슘 퍼루테네이트(KRuO4), 테트라알킬암모늄 퍼루테네이트, 예컨대, 테트라프로필암모늄 퍼루테네이트(TPAP) 및 테트라뷰틸암모늄 퍼루테네이트(TBAP) 및 중합체 지지된 퍼루테네이트(PSP); 및 무기 과산화 화합물 및 조성물, 예컨대, 과산화텅스텐산염 또는 구리(II) 과염소산염/TEMPO 조합을 포함하는 무기 또는 유기 퍼루테네이트염 형태의 퍼루테네이트 음이온을 포함한다. 과정의 다음 단계에서 (e) 단계가 5fC 잔기 및 5caC 잔기 모두를 다이하이드로우라실(DHU)로 전환하는 한, 이 시점에서 5fC-함유 단편을 5caC-함유 단편으로 분리하는 것을 불필요하다.
일부 실시형태에서, 5-하이드록시메틸사이토신 잔기는 β-글루코실트랜스퍼레이스(β3GT)로 차단되는 반면, 5-메틸사이토신 잔기는 5-폼일사이토신과 5-카복시메틸사이토신의 혼합물을 제공하기에 효과적인 TET 효소로 산화된다. 이들 산화된 종 둘 다를 포함하는 혼합물은 2-피콜린 보레인 또는 또 다른 유기 보레인과 반응하여 다이하이드로우라실을 생성할 수 있다. 이러한 실시형태의 변형에서, 5hmC-함유 단편은 (b) 단계에서 제거되지 않는다. 오히려, "TET-보조 피콜린 보레인 시퀀싱(TAPS)"에서, 5mC-함유 단편 및 5hmC-함유 단편은 함께 효소적으로 산화되어 5fC-함유 및 5caC-함유 단편을 제공한다. 2-피콜린 보레인과의 반응은 5mC 및 5hmC 잔기가 원래 존재했던 모든 곳에서 DHU 잔기를 생성한다. "화학 보조 피콜린 보레인 시퀀싱(Chemical Assisted Picoline Borane Sequencing: CAPS)"은 5hmC-함유 단편을 포타슘 퍼루테네이트로 선택적으로 산화시켜 5mC 잔기를 변화시키지 않고 그대로 두는 것을 포함한다.
이 실시형태의 방법에는 많은 이점이 있다: 바이설파이트가 불필요하고, 무독성 시약 및 반응물이 사용되며; 과정은 온화한 조건하에서 진행된다. 또한, 전체 과정은 임의의 중간체를 단리할 필요 없이 단일 튜브에서 수행될 수 있다.
관련 실시형태에서, 위의 방법은 다음 추가 단계를 포함한다: (g) (b) 단계에서 무세포 DNA로부터 제거된 5hmC-함유 DNA에서 하이드록시메틸화 패턴을 확인하는 단계. 이는 WO 2017/176630에 상세히 기술되어 있는 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 과정은 원-튜브 방법으로 중간체의 제거 또는 단리 없이 수행될 수 있다. 예를 들어, 초기에, 무세포 DNA 단편, 바람직하게는 어댑터-결찰된 DNA 단편은 βGT-촉매된 우리딘 다이포스포글루코스 6-아지드로 작용화되고, 이어서 화학선택적 아지드기를 통해 바이오티닐화된다. 이 절차는 결과 각 5hmC 부위에 공유적으로 부착된 바이오틴을 생성한다. 다음 단계에서, 바이오티닐화된 가닥 및 변형되지 않은(천연) 5mC를 포함하는 가닥은 추가 처리를 위해 동시에 풀 다운된다. 천연 5mC-함유 가닥은 당업계에 공지된 바와 같이 항-5mC 항체 또는 메틸-CpG-결합 도메인(MBD) 단백질을 사용하여 풀 다운된다. 그런 다음, 5hmC 잔기가 차단된 상태에서, 변형되지 않은 5mC 잔기는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 5mC를 5fC 및/또는 5caC로 전환하기 위한 임의의 적합한 기법을 사용하여 선택적으로 산화된다.
증폭을 통해 얻은 단편은 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 보유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표지는 형광 표지, 방사성핵종 또는 질량 분석기에서 검출할 수 있는 전형적인 질량을 갖는 분리 가능한(detachable) 분자 단편이다. 상기 표지가 질량 표지인 경우, 일부 실시형태는 표지된 앰플리콘이 단일 양의 순 전하(net charge) 또는 음의 순 전하를 가짐으로써 질량 분석기에서 더 나은 감지 가능성(delectability)을 가지게 한다. 검출은, 예를 들어, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석법(matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: MALDI) 또는 using 전자 분무 질량 분석법(electron spray mass spectrometry: ESI)에 의해 수행되고 시각화될 수 있다.
이들 검정 기술에 적합한 DNA를 단리하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 특히, 일부 실시형태는 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 미국 출원 제13/470,251호("Isolation of Nucleic Acids")에 기술되어 있는 바와 같은 핵산의 단리를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 마커는 대변 샘플에 대해 수행되는 QUARTS 검정에서 사용된다. 일부 실시형태에서, DNA 샘플을 생산하는 방법, 특히, 소량(예를 들어, 100 마이크로리터 미만, 60 마이크로리터 미만)의 고도로 정제된 낮은 존재비(존재비가 낮은e)의 핵산을 포함하며 DNA 샘플을 테스트하는 데 사용되는 검정(예를 들어, PCR, INVADER, QuARTS 검정 등)을 저해하는 물질이 실질적으로 및/또는 효과적으로 없는 DNA 샘플을 생산하는 방법이 제공된다. 이러한 DNA 샘플은 환자로부터 채취된 샘플에 존재하는 유전자, 유전자 변이체(예를 들어, 대립유전자) 또는 유전자 변형(예를 들어, 메틸화)의 존재를 정성적으로 검출하거나 또는 이들의 활성, 발현 또는 양을 정량적으로 측정하는 진단 검정에서 사용된다. 예를 들어, 일부 암은 특정 돌연변이체 대립유전자 또는 특정 메틸화 상태의 존재와 상관관계가 있으며, 따라서 이러한 돌연변이체 대립유전자 또는 메틸화 상태를 검출 및/또는 정량화하는 것은 암의 진단 및 치료에 예측 가치가 있다.
많은 귀중한 유전적 마커가 샘플에 극히 적은 양으로 존재하며, 이러한 마커를 생산하는 많은 이벤트는 드물다. 결과적으로, PCR과 같은 민감한 검출 방법조차도 검정의 검출 역치를 충족하거나 또는 대체하기에 충분한 존재비가 낮은 표적을 제공하기 위해 많은 양의 DNA가 필요하다. 더욱이, 심지어 적은 양의 저해성 물질의 존재는 이러한 적은 양의 표적을 검출하기 위한 이들 검정의 정확도 및 정밀도를 손상시킨다. 따라서, 이러한 DNA 샘플을 생산하기 위해 부피 및 농도의 필수 관리를 제공하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 샘플은 조직(예를 들어, 림프샘 조직), 혈액, 혈청, 혈장 또는 타액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 이러한 샘플은 당업자에게 명백한 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 수의 수단에 의해 얻을 수 있다. 무세포 또는 실질적으로 무세포인 샘플은 원심분리 및 여과를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업자에게 공지된 다양한 기법을 샘플에 적용함으로써 얻을 수 있다. 일반적으로 샘플을 얻기 위해 침습적 기법은 사용하지 않는 것이 바람직하지만, 조직 균질물, 조직 절편 및 생검 표본과 같은 샘플을 얻는 것이 여전히 바람직할 수 있다. 기술은 샘플을 준비하고 테스트를 위한 핵산을 제공하는 데 사용되는 방법에 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, DNA는, 예를 들어, 미국 특허 제8,808,990호 및 제9,169,511호 및 WO 2012/155072에 상세히 설명된 바와 같이 또는 관련 방법에 의해 직접 유전자 포획을 사용하여 대변 샘플 또는 혈액 또는 혈장 샘플로부터 단리된다.
마커의 분석은 하나의 테스트 샘플 내에서 추가적인 마커를 개별적으로 또는 동시에 수행할 수 있다. 예를 들어, 여러 샘플의 효율적인 처리 및 잠재적으로 더 큰 진단 및/또는 예후예측 정확도를 제공하기 위해 여러 마커가 하나의 테스트에서 조합될 수 있다. 또한, 당업자라면 동일한 대상체로부터의 여러 샘플을 (예를 들어, 연속적인 시점에서) 테스트하는 것의 가치를 인식할 것이다. 이러한 일련의 샘플 테스트를 통해 시간 경과에 따른 마커 메틸화 상태의 변화를 확인할 수 있다. 메틸화 상태의 변화뿐만 아니라 메틸화 상태의 변화의 부재는 이벤트 발생으로부터 대략적인 시간의 확인, 구제 가능한 조직의 존재 및 양, 약물 요법의 적절성, 다양한 요법의 유효성 및 미래 이벤트의 위험을 포함한 대상체의 결과의 확인을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 질환 상태에 대해 유용한 정보를 제공할 수 있다.
바이오마커의 분석은 다양한 물리적 형식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세역가 플레이트 또는 자동화의 사용은 많은 수의 테스트 샘플의 처리를 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 외래 수송 또는 응급실 환경에서 적시에 즉각적인 치료 및 진단을 용이하게 하기 위해 단일 샘플 형식이 개발될 수 있다.
기술의 실시형태는 키트의 형태로 제공되는 것으로 상정된다. 키트는 본 명세서에 기재된 조성물, 장치, 기구 등의 실시형태 및 키트 사용을 위한 지침서를 포함한다. 이러한 지침서는 샘플로부터 분석물을 준비하기 위한, 예를 들어, 샘플을 수집하고 샘플로부터 핵산을 준비하기 위한 적절한 방법을 설명한다. 키트의 개별 구성요소는 적절한 용기 및 패키징(예를 들어, 바이알, 박스, 블리스터 팩, 앰풀, 병, 보틀, 튜브 등)에 패키징되고, 구성요소는 키트 사용자의 편리한 보관, 배송 및/또는 사용을 위해 적절한 용기(예를 들어, 박스 또는 박스들)에 함께 패키징된다. 액체 성분(예를 들어, 완충액)은 동결건조된 형태로 제공되어 사용자에 의해 재구성될 수 있음이 이해된다. 키트는 키트의 성능을 평가, 검증 및/또는 보장하기 위한 대조군 또는 참조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플에 존재하는 핵산의 양을 검정하기 위한 키트는 비교를 위해 동일한 또는 또 다른 핵산의 알려진 농도를 포함하는 대조군, 일부 실시형태에서는 대조군 핵산에 특이적인 검출 시약(예를 들어, 프라이머)을 포함할 수 있다. 키트는 임상 환경에서 사용하기에 적절하며, 일부 실시형태에서는 사용자의 집에서 사용하기에 적절하다. 일부 실시형태에서, 키트의 구성요소는 샘플로부터 핵산 용액을 준비하기 위한 시스템의 기능을 제공한다. 일부 실시형태에서, 시스템의 소정의 구성요소는 사용자에 의해 제공된다.
다양한 암은, 예를 들어, 예측의 특이도 및 민감도와 관련된 통계적 기법에 의해 확인되는 바와 같이 다양한 마커의 조합에 의해 예측된다. 기술은 일부 암에 대한 예측 조합 및 검증된 예측 조합을 확인하는 방법을 제공한다.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 DMR(예를 들어, DMR 1 내지 285, 예를 들어, 표 1 및 표 3에서 제공된 것)을 포함하는 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계 및
2) NHL 또는 NHL 하위유형을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) NHL을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) NHL을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) NHL을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) NHL을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 여포성 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 여포성 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 여포성 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 여포성 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 여포성 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) DLBCL을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) DLBCL을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) DLBCL을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) DLBCL을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) DLBCL을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 외투 세포 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 외투 세포 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 외투 세포 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 외투 세포 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 변연부 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 변연부 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 변연부 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266으로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 변연부 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 변연부 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 말초 T-세포 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 말초 T-세포 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 GABRG3, ITGA5 및 JUP로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 말초 T-세포 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 말초 T-세포 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 대상체로부터 얻은 핵산(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)을 BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역으로부터 선택된 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약과 접촉시키는 단계, 및
2) 말초 T-세포 림프종을 검출(예를 들어, 80% 이상의 민감도와 80% 이상의 특이도로 제공됨)하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시키는 시약(예를 들어, 시약은 바이설파이트 시약, 메틸화-민감성 제한 효소 또는 메틸화-의존적 제한 효소임)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503;
(ii) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(iv) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화-특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 및 표적 포획에 의해 하나 이상의 유전자의 메틸화 수준을 결정하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시키는 시약(예를 들어, 시약은 바이설파이트 시약, 메틸화-민감성 제한 효소 또는 메틸화-의존적 제한 효소임)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(v) HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화-특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 및 표적 포획에 의해 하나 이상의 유전자의 메틸화 수준을 결정하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시키는 시약(예를 들어, 시약은 바이설파이트 시약, 메틸화-민감성 제한 효소 또는 메틸화-의존적 제한 효소임)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503; 및
(v) MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화-특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 및 표적 포획에 의해 하나 이상의 유전자의 메틸화 수준을 결정하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시키는 시약(예를 들어, 시약은 바이설파이트 시약, 메틸화-민감성 제한 효소 또는 메틸화-의존적 제한 효소임)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C;
(ii) BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503; 및
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화-특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 및 표적 포획에 의해 하나 이상의 유전자의 메틸화 수준을 결정하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시키는 시약(예를 들어, 시약은 바이설파이트 시약, 메틸화-민감성 제한 효소 또는 메틸화-의존적 제한 효소임)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화-특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 및 표적 포획에 의해 하나 이상의 유전자의 메틸화 수준을 결정하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시키는 시약(예를 들어, 시약은 바이설파이트 시약, 메틸화-민감성 제한 효소 또는 메틸화-의존적 제한 효소임)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(ii) GABRG3, ITGA5 및 JUP;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(iv) BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화-특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 및 표적 포획에 의해 하나 이상의 유전자의 메틸화 수준을 결정하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플로부터의 DNA(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503;
(ii) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(iv) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B;
2) DNA에서 적어도 하나의 참조 마커의 양을 측정하는 단계; 및
3) DNA에서 측정된 참조 마커 유전자의 양의 백분율로서 DNA에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양에 대한 값을 계산하는 단계로서, 값은 샘플에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 DNA의 양을 나타내는, 상기 계산하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플로부터의 DNA(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(v) HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1;
2) DNA에서 적어도 하나의 참조 마커의 양을 측정하는 단계; 및
3) DNA에서 측정된 참조 마커 유전자의 양의 백분율로서 DNA에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양에 대한 값을 계산하는 단계로서, 값은 샘플에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 DNA의 양을 나타내는, 상기 계산하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플로부터의 DNA(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503; 및
(v) MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1;
2) DNA에서 적어도 하나의 참조 마커의 양을 측정하는 단계; 및
3) DNA에서 측정된 참조 마커 유전자의 양의 백분율로서 DNA에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양에 대한 값을 계산하는 단계로서, 값은 샘플에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 DNA의 양을 나타내는, 상기 계산하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플로부터의 DNA(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C;
(ii) BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503; 및
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C;
2) DNA에서 적어도 하나의 참조 마커의 양을 측정하는 단계; 및
3) DNA에서 측정된 참조 마커 유전자의 양의 백분율로서 DNA에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양에 대한 값을 계산하는 단계로서, 값은 샘플에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 DNA의 양을 나타내는, 상기 계산하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플로부터의 DNA(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5;
2) DNA에서 적어도 하나의 참조 마커의 양을 측정하는 단계; 및
3) DNA에서 측정된 참조 마커 유전자의 양의 백분율로서 DNA에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양에 대한 값을 계산하는 단계로서, 값은 샘플에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 DNA의 양을 나타내는, 상기 계산하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다:
1) 생물학적 샘플로부터의 DNA(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양을 측정하는 단계로서, 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
(i) CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(ii) GABRG3, ITGA5 및 JUP;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(iv) BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5;
2) DNA에서 적어도 하나의 참조 마커의 양을 측정하는 단계; 및
3) DNA에서 측정된 참조 마커 유전자의 양의 백분율로서 DNA에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양에 대한 값을 계산하는 단계로서, 값은 샘플에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 DNA의 양을 나타내는, 상기 계산하는 단계.
기술의 일부 실시형태에서,
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 변형된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 포함하는 방법이 제공되되,
하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택된다:
(i) ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503;
(ii) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(iv) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B.
기술의 일부 실시형태에서,
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 변형된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 포함하는 방법이 제공되되,
하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택된다:
(i) ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(v) HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1.
기술의 일부 실시형태에서,
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 변형된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 포함하는 방법이 제공되되,
하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택된다:
(i) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503; 및
(v) MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1.
기술의 일부 실시형태에서,
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 변형된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 포함하는 방법이 제공되되,
하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택된다:
(i) CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C;
(ii) BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503; 및
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C.
기술의 일부 실시형태에서,
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 변형된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 포함하는 방법이 제공되되,
하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택된다:
(i) CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5.
기술의 일부 실시형태에서,
1) 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시킬 수 있는 시약(예를 들어, 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약)으로 처리함으로써 인간 개체의 생물학적 샘플(예를 들어, 게놈 DNA, 예를 들어, 혈액 또는 혈장과 같은 체액 또는 림프샘 조직으로부터 단리된 것)에서 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계;
2) 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 변형된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
3) 메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 포함하는 방법이 제공되되,
하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택된다:
(i) CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(ii) GABRG3, ITGA5 및 JUP;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(iv) BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5.
바람직하게는, 이러한 방법에 대한 민감도는 약 70% 내지 약 100%, 또는 약 80% 내지 약 90% 또는 약 80% 내지 약 85%이다. 바람직하게는, 특이도는 약 70% 내지 약 100%, 또는 약 80% 내지 약 90% 또는 약 80% 내지 약 85%이다.
게놈 DNA는 상업적으로 이용 가능한 키트의 사용을 포함하여 임의의 수단에 의해 단리될 수 있다. 간략하게는, 관심 DNA가 세포막에 캡슐화되어 있는 경우, 생물학적 샘플은 효소적, 화학적 또는 기계적 수단에 의해 파괴되고 용해되어야 한다. 그런 다음, DNA 용액은, 예를 들어, 프로테이네이스 K를 사용한 소화에 의해 단백질 및 기타 오염물질이 제거될 수 있다. 그런 다음, 게놈 DNA가 용액으로부터 회수된다. 이는 염석, 유기 추출 또는 고체상 지지체로의 DNA의 결합을 포함한 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 방법의 선택은 시간, 비용 및 필요한 DNA의 양을 포함하는 여러 요인에 의해 영향을 받을 것이다. 신생물성 물질 또는 전신생물성 물질을 포함하는 모든 임상적 샘플 유형, 예를 들어, 세포주, 조직학적 슬라이드, 생검, 파라핀-포매된 조직, 체액, 대변, 림프샘 조직, 결장 유출물, 소변, 혈액 혈장, 혈액 혈청, 전혈, 단리된 혈액 세포, 혈액으로부터 단리된 세포 및 이들의 조합이 본 방법에 사용하기에 적합하다.
기술은 샘플을 준비하고 테스트를 위한 핵산을 제공하는 데 사용되는 방법에 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, DNA는, 예를 들어, 미국 출원 제61/485386호에 상세히 설명된 바와 같이 또는 관련 방법에 의해 직접 유전자 포획을 사용하여 대변 샘플 또는 혈액 또는 혈장 샘플로부터 단리된다.
그런 다음, 게놈 DNA 샘플은 DMR(예를 들어, DMR 1 내지 285, 예를 들어, 표 1 및 표 3에서 제공된 것)을 포함하는 적어도 하나의 마커 내의 메틸화 및 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 구별하는 적어도 하나의 시약 또는 일련의 시약으로 처리된다.
일부 실시형태에서, 시약은 5'-위치에서 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 우라실, 티민 또는 혼성화 거동의 측면에서 사이토신과 같지 않은 다른 염기로 전환한다. 그러나, 일부 실시형태에서, 시약은 메틸화 민감성 제한 효소일 수 있다.
일부 실시형태에서, 게놈 DNA 샘플은 5'-위치에서 메틸화되지 않은 사이토신 염기가 우라실, 티민 또는 혼성화 거동의 측면에서 사이토신과 같지 않은 또 다른 염기로 전환하는 방식으로 처리된다. 일부 실시형태에서, 이러한 처리는 바이설파이트(하이드로겐 설파이트, 다이설파이트)를 이용한 후 알칼리성 가수분해로 수행된다.
그런 다음, 처리된 핵산은 표적 유전자 서열(DMR, 예를 들어, DMR 1 내지 285, 예를 들어, 표 1 및 표 3에 제공된 것으로부터 선택된 적어도 하나의 DMR을 포함하는 마커로부터의 적어도 하나의 유전자, 게놈 서열 또는 뉴클레오타이드)의 메틸화 상태를 결정하기 위해 분석된다. 분석 방법은 본 명세서에 열거된 것들, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 QuARTS 및 MSP를 포함하여 당업계에 공지된 것들로부터 선택될 수 있다.
비정상적인 메틸화, 보다 구체적으로 DMR(예를 들어, DMR 1 내지 285, 예를 들어, 표 1 및 표 3에서 제공된 것)을 포함하는 마커의 과메틸화는 림프종 또는 림프종의 하위유형과 관련이 있다.
기술은 림프종 또는 림프종의 하위유형과 관련이 있는 임의의 샘플의 분석에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 샘플은 환자로부터 얻은 조직 및/또는 생물학적 유체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 분비물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 위액 분비물, 췌액, 위장 생검 샘플, 림프샘 생검으로부터 미세해부된 세포 및/또는 대변으로부터 회수된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 림프샘 조직을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 샘플은 세포, 림프샘으로부터의 분비물 또는 조직, 유방, 간, 담관, 췌장, 위, 결장, 직장, 식도, 소장, 맹장, 십이지장, 폴립, 담낭, 항문 및/또는 복막을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 세포액, 복수, 소변, 배설물, 췌장액, 내시경 검사 동안 얻은 체액, 혈액, 점막 또는 타액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 대변 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 림프샘 조직 샘플이다.
이러한 샘플은 당업자에게 명백한 바와 같이 당업계에 임의의 수의 공지된 수단에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 소변 및 대변 샘플은 쉽게 얻을 수 있는 반면, 혈액, 복수, 혈청 또는 췌장액 샘플은, 예를 들어, 바늘 및 주사기를 사용하여 비경구적으로 얻을 수 있다. 무세포 또는 실질적으로 무세포인 샘플은 원심분리 및 여과를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업자에게 공지된 다양한 기법을 샘플에 적용함으로써 얻을 수 있다. 일반적으로 샘플을 얻기 위해 침습적 기법은 사용하지 않는 것이 바람직하지만, 조직 균질물, 조직 절편 및 생검 표본과 같은 샘플을 얻는 것이 여전히 바람직할 수 있다.
일부 실시형태에서, 기술은 환자(예를 들어, 림프종 또는 림프종의 하위유형(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종 중 하나 이상이 있는 환자)이 있는 환자)를 치료하는 방법에 관한 것이며, 해당 방법은 본 명세서에 제공된 바와 같은 하나 이상의 DMR의 메틸화 상태를 결정하는 단계 및 메틸화 상태를 결정한 결과에 기초하여 환자에게 치료를 투여하는 단계를 포함한다. 치료는 약제 화합물, 백신의 투여, 수술의 수행, 환자의 이미징, 또 다른 테스트의 수행일 수 있다. 바람직하게는, 상기 용도는 임상적 스크리닝 방법, 예후예측 평가 방법, 요법의 결과의 모니터링 방법, 특정 치료적 치료에 반응할 가능성이 높은 환자의 확인 방법, 환자 또는 대상체의 이미징 방법, 및 약물 스크리닝 및 개발 방법에 있다.
기술의 일부 실시형태에서, 대상체에서 림프종 또는 림프종의 하위유형을 진단하는 방법이 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "진단하는" 및 "진단"은 당업자가 대상체가 주어진 질환 또는 병태를 앓고 있는지 또는 주어진 질환 또는 병태가 미래에 발생할 수 있는지를 추정하고 심지어 결정할 수 있는 방법을 지칭한다. 당업자는 종종, 예를 들어, 바이오마커(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 DMR)와 같은 하나 이상의 진단 지표에 기초하여 진단을 내리며, 이의 메틸화 상태는 병태의 존재, 중증도 또는 부재를 나타낸다.
진단과 함께, 임상적 암 예후예측은 암의 공격성과 종양 재발의 가능성을 결정하여 가장 효과적인 요법을 계획하는 것과 관련이 있다. 보다 정확한 예후예측을 할 수 있거나 또는 심지어 암 발생의 잠재적인 위험이 평가될 수 있다면, 환자에 대해 적절한 요법 및 일부 경우에는 덜 심각한 요법이 선택될 수 있다. 암 바이오마커의 평가(예를 들어, 메틸화 상태의 결정)는 예후예측이 양호하고/하거나 요법이 필요하지 않거나 또는 제한된 요법이 필요한 암 발병 위험이 낮은 대상체를 보다 집중적인 치료로부터 혜택을 받을 수 있는 암 발생 가능성이 더 높거나 또는 암이 재발된 대상체와 구분하는 데 유용하다.
이와 같이, 본 명세서에서 사용되는 "진단을 내리는" 또는 "진단하는"은 임상적 결과(의학적 치료 유무에 관계없이)의 예측, 적절한 치료(또는 치료가 효과적인지 여부)의 선택 또는 현재 치료의 모니터링, 본 명세서에 개시된 진단 바이오마커(예를 들어, DMR)의 측정에 기초한 잠재적인 치료의 변경을 제공할 수 있는 암의 발병 위험의 결정 또는 예후예측의 결정을 추가로 포함한다. 또한, 지금 개시되는 특허 대상의 일부 실시형태에서, 시간 경과에 따른 바이오마커의 다중 결정은 진단 및/또는 예후예측을 용이하게 할 수 있다. 바이오마커의 시간적 변화는 임상적 결과를 예측하고, 림프종 또는 림프종의 하위유형의 진행을 모니터링하고/하거나 암에 대한 적절한 요법의 효능을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 예를 들어, 효과적인 요법의 과정 동안 시간 경과에 따라 생물학적 샘플에서 본 명세서에 개시된 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, DMR)(및 모니터링되는 경우, 잠재적으로 하나 이상의 추가적인 바이오마커(들))의 메틸화 상태의 변화를 볼 것으로 예상할 수 있다.
현재 개시된 대상 특허는 추가로 일부 실시형태에서 대상체에서 암의 예방 또는 치료를 개시할지 또는 계속할지 여부를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체로부터 일정 기간에 걸쳐 일련의 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 일련의 생물학적 샘플을 분석하여 각각의 생물학적 샘플에서 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 바이오마커의 메틸화 상태를 결정하는 단계; 및 각각의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 메틸화 상태의 임의의 측정 가능한 변화를 비교하는 단계를 포함한다. 일정 기간 동안 바이오마커의 메틸화 상태의 임의의 변화는 암 발병의 위험을 예측하고, 임상적 결과를 예측하고, 암의 예방 또는 요법을 개시할지 또는 계속할지, 현재 요법이 암을 효과적으로 치료하고 있는지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 시점은 치료 개시 전에 선택될 수 있고, 제2 시점은 치료 개시 후 어느 시점에서 선택될 수 있다. 메틸화 상태는 상이한 시점에서 채취된 각각의 샘플에서 측정될 수 있으며, 정성적 및/또는 정량적 차이가 기록된다. 상이한 샘플로부터의 바이오마커 수준의 메틸화 상태는 대상체에서 NHL 또는 NHL 하위유형 위험, 예후예측, 치료 효능의 결정 및/또는 암의 진행과 상관관계가 있을 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 초기, 예를 들어, 질환의 증상이 나타나기 전 질환의 치료 또는 진단을 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 임상 단계의 질환의 치료 또는 진단을 위한 것이다.
언급된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 진단 또는 예후예측적 바이오마커의 다중 결정이 이루어질 수 있으며, 마커의 시간적 변화가 진단 또는 예후예측을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 진단 마커는 제1 시점에서 결정될 수 있고, 제2 시점에서 다시 결정될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 제1 시점에서 제2 시점까지 마커의 증가는 암의 특정 유형 또는 중증도 또는 주어진 예후를 진단할 수 있다. 마찬가지로, 제1 시점에서 제2 시점까지 마커의 감소는 암의 특정 유형 또는 중증도 또는 주어진 예후를 나타낼 수 있다. 또한, 하나 이상의 마커의 변화 정도는 암의 중증도 및 향후 부작용과 관련될 수 있다. 당업자라면 소정의 실시형태에서, 다수의 시점에서 동일한 바이오마커의 비교 측정이 이루어질 수 있지만, 또한 한 시점에서 주어진 바이오마커를 측정할 수 있고 제2 시점에서 제2 바이오마커를 측정할 수 있으며, 이들 마커의 비교가 진단 정보를 제공할 수 있다는 점을 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 어구 "예후를 결정하는 것"은 대상체의 병태의 경과 또는 결과를 예측할 수 있는 방법을 지칭한다. 용어 "예후예측"은 100%의 정확도로 병태의 경과 또는 결과를 예측하는 능력을 지칭하거나 또는 심지어 주어진 경과 또는 결과가 바이오마커의 메틸화 상태(예를 들어, DMR)에 따라 발생할 가능성이 다소 높거나 또는 낮음을 지칭하지 않는다. 대신, 당업자라면 용어 "예후예측"이 소정의 경과 또는 결과가 발생할 확률이 증가함을 지칭하며; 즉, 주어진 병태를 나타내지 않는 개체와 비교할 때 해당 병태를 나타내는 대상체에서 경과 또는 결과가 발생할 가능성이 더 크다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 병태를 나타내지 않는 개체(예를 들어, 하나 이상의 DMR의 정상 메틸화 상태를 가짐)에서, 주어진 결과(예를 들어, 림프종 또는 림프종 하위유형으로 고통받음)의 확률은 매우 낮을 수 있다.
일부 실시형태에서, 통계적 분석은 예후예측적 지표를 불리한 결과에 대한 소인과 연관시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 암에 걸리지 않은 환자로부터 얻은 정상 대조군 샘플과 상이한 메틸화 상태는 통계적 유의 수준에 의해 결정된 바와 같이 대조군 샘플에서의 메틸화 상태와 더 유사한 수준을 가진 대상체보다 암에 걸릴 가능성이 더 높다는 신호를 보낼 수 있다. 추가적으로, 기준선(예를 들어, "정상") 수준으로부터의 메틸화 상태의 변화는 대상체의 예후를 반영할 수 있으며, 메틸화 상태의 변화 정도는 불리한 이벤트의 중증도와 관련될 수 있다. 통계적 유의성은 종종 두 집단 이상을 비교하고, 신뢰 구간 및/또는 P값을 결정함으로써 결정된다. 예를 들어, 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983]을 참조한다. 본 대상 특허의 예시적인 신뢰 구간은 90%, 95%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 및 99.99%인 반면, 예시적인 P값은 0.1, 0.05, 0.025, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001 및 0.0001이다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 예후예측 또는 진단 바이오마커(예를 들어, DMR)의 메틸화 상태 변화의 역치 정도는 확립될 수 있고, 생물학적 샘플에서 바이오마커의 메틸화 상태 변화의 정도는 메틸화 상태 변화의 역치 정도와 간단히 비교된다. 본 명세서에 제공된 바이오마커에 대한 메틸화 상태의 바람직한 역치 변화는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 100% 및 약 150%이다. 또 다른 실시형태에서, 예후예측 또는 진단 지표(바이오마커 또는 바이오마커의 조합)의 메틸화 상태가 주어진 결과에 대한 관련 성향과 직접적으로 관련되는 "노모그램(nomogram)"이 확립될 수 있다. 당업자는 집단 평균이 아니라 개별 샘플 측정값이 참조되기 때문에 이러한 측정의 불확실성이 마커 농도의 불확실성과 동일하다는 이해와 함께 2개의 수치 값을 관련시키는 이러한 노모그램의 사용에 익숙하다.
일부 실시형태에서, 대조군 샘플은 생물학적 샘플로부터 얻은 결과가 대조군 샘플로부터 얻은 결과와 비교될 수 있도록 생물학적 샘플과 동시에 분석된다. 추가적으로, 생물학적 샘플에 대한 검정 결과가 비교될 수 있는 표준 곡선이 제공될 수 있음이 상정된다. 이러한 표준 곡선은 형광 표지가 사용되는 경우 검정 단위, 예를 들어, 형광 신호 세기의 함수로서 바이오마커의 메틸화 상태를 나타낸다. 여러 공여자로부터 채취한 샘플을 사용하여, 정상 조직에서의 하나 이상의 바이오마커의 대조군 메틸화 상태에 대한 표준 곡선뿐만 아니라 이형성이 있는 공여자 또는 림프종 또는 림프종 하위유형이 있는 공여자로부터 채취된 조직에서의 하나 이상의 바이오마커의 "위험" 수준에 대한 표준 곡선이 제공될 수 있다. 방법의 소정의 실시형태에서, 생물학적 대상체로부터 얻은 샘플에서 본 명세서에 제공된 하나 이상의 DMR의 비정상적인 메틸화 상태를 확인할 때, 대상체는 이형성이 있는 것으로 확인된다. 방법의 다른 실시형태에서, 생물학적 대상체로부터 얻은 샘플에서 이러한 바이오마커 중 하나 이상의 비정상적인 메틸화 상태의 검출은 대상체가 암에 걸린 것으로 확인시켜준다.
마커의 분석은 하나의 테스트 샘플 내에서 추가적인 마커를 개별적으로 또는 동시에 수행할 수 있다. 예를 들어, 여러 샘플의 효율적인 처리 및 잠재적으로 더 큰 진단 및/또는 예후예측 정확도를 제공하기 위해 여러 마커가 하나의 테스트에서 조합될 수 있다. 또한, 당업자라면 동일한 대상체로부터의 여러 샘플을 (예를 들어, 연속적인 시점에서) 테스트하는 것의 가치를 인식할 것이다. 이러한 일련의 샘플 테스트를 통해 시간 경과에 따른 마커 메틸화 상태의 변화를 확인할 수 있다. 메틸화 상태의 변화뿐만 아니라 메틸화 상태의 변화의 부재는 이벤트 발생으로부터 대략적인 시간의 확인, 구제 가능한 조직의 존재 및 양, 약물 요법의 적절성, 다양한 요법의 유효성 및 미래 이벤트의 위험을 포함한 대상체의 결과의 확인을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 질환 상태에 대해 유용한 정보를 제공할 수 있다.
바이오마커의 분석은 다양한 물리적 형식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세역가 플레이트 또는 자동화의 사용은 많은 수의 테스트 샘플의 처리를 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 외래 수송 또는 응급실 환경에서 적시에 즉각적인 치료 및 진단을 용이하게 하기 위해 단일 샘플 형식이 개발될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대조군 메틸화 상태와 비교할 때 샘플에서 적어도 하나의 바이오마커의 메틸화 상태에 측정 가능한 차이가 있는 경우, 대상체는 림프종 또는 림프종의 하위유형이 있는 것으로 진단된다. 반대로, 생물학적 샘플에서 메틸화 상태의 변화가 확인되지 않는 경우, 대상체는 림프종 또는 림프종 하위유형이 없거나, 암의 위험이 없거나 또는 암의 위험이 낮은 것으로 확인될 수 있다. 이와 관련하여, 암 또는 이의 위험이 있는 대상체는 암 또는 이의 위험이 낮거나 실질적으로 없는 대상체와 구별될 수 있다. NHL 또는 NHL 하위유형 위험이 발생할 위험이 있는 이러한 대상체는 내시경 감시를 포함하여 보다 집중적이고/이거나 정기적인 스크리닝 스케줄에 배치될 수 있다. 반면에, 위험이 낮거나 실질적으로 없는 대상체는 향후 스크리닝, 예를 들어, 본 기술에 따라 수행되는 스크리닝이 NHL 또는 NHL 하위유형 위험의 위험이 대상체에게 나타났음을 나타낼 때까지 NHL 또는 NHL 하위유형 위험에 대한 추가적인 테스트(예를 들어, 침습성 시술)를 받는 것을 피할 수 있다.
위에 언급한 바와 같이, 본 기술의 방법의 실시형태에 따르면, 하나 이상의 바이오마커의 메틸화 상태의 변화를 검출하는 것은 정성적 결정일 수 있거나 또는 정량적 결정일 수 있다. 이와 같이, 대상체가 림프종 또는 림프종의 하위유형이 있거나 또는 이의 위험이 있는 것으로 진단하는 단계는 소정의 역치 측정이 이루어짐을 나타내며, 예를 들어, 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 메틸화 상태가 미리 결정된 대조군 메틸화 상태와 다름을 나타낸다. 방법의 일부 실시형태에서, 대조군 메틸화 상태는 임의의 검출 가능한 바이오마커의 메틸화 상태이다. 대조군 샘플이 생물학적 샘플과 동시에 테스트되는 방법의 다른 실시형태에서, 미리 결정된 메틸화 상태는 대조군 샘플의 메틸화 상태이다. 방법의 다른 실시형태에서, 미리 결정된 메틸화 상태는 표준 곡선에 기초하고/하거나 이에 의해 확인된다. 방법의 다른 실시형태에서, 미리 결정된 메틸화 상태는 특정 병태 또는 병태의 범위이다. 이와 같이, 미리 결정된 메틸화 상태는 실시되는 방법의 실시형태 및 목적하는 특이성 등에 부분적으로 기초하여 당업자에게 명백할 허용 가능한 한계 내에서 선택될 수 있다.
또한 진단 방법과 관련하여, 바람직한 대상체는 척추동물 대상체이다. 바람직한 척추동물은 온혈동물이고; 바람직한 온혈 척추동물은 포유동물이다. 바람직한 포유동물은 가장 바람직하게는 인간이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 인간 및 동물 대상체를 모두 포함한다. 따라서, 수의학적 치료 용도가 본 명세서에 제공된다. 이와 같이, 본 기술은 인간과 같은 포유동물뿐만 아니라 시베리아 호랑이와 같이 멸종 위기에 처해 있기 때문에 중요한 포유동물; 인간이 소비하기 위해 농장에서 기르는 동물과 같이 경제적으로 중요한 동물; 및/또는 반려 동물 또는 동물원 동물과 같이 인간에게 사회적으로 중요한 동물의 진단을 제공한다. 이러한 동물의 예는 고양이 및 개와 같은 육식 동물; 돼지, 거세한 수퇘지 및 멧돼지를 포함하는 돼지; 소, 황소, 양, 기린, 사슴, 염소, 들소 및 낙타와 같은 반추류 및/또는 유제류; 기각류; 및 말을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 따라서, 사육 돼지, 반추류, 유제류, 말(경주마 포함) 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 가축의 진단 및 치료가 또한 제공된다.
현재 개시된 특허 대상은 대상체에서 림프종 및/또는 특정 형태의 림프종(예를 들어, DLBCL, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 말초 T-세포 림프종)을 진단하기 위한 시스템을 더 포함한다. 시스템은, 예를 들어, NHL 및/또는 NHL의 하위유형의 위험을 스크리닝하거나 또는 생물학적 샘플이 수집되는 대상체에서 NHL 및/또는 NHL의 하위유형을 진단하는 데 사용될 수 있는 상업용 키트로서 제공될 수 있다. 본 기술에 따라 제공되는 예시적인 시스템은 표 1 및 표 3에 제공된 바와 같은 DMR의 메틸화 상태를 평가하는 것을 포함한다.
실시예
실시예 I.
이 실시예는 비호지킨 림프종(NHL) 및 NHL 하위유형 특정 마커의 발견 및 조직 검증에 대해 설명한다.
조직, 세포 현탁액, 세포주 및 혈액 샘플을 메이오 클리닉(Mayo Clinic) 생물표본 저장소에서 얻었다. 대상체 연구 승인 및 포함/제외 기준을 엄격하게 준수하여 샘플을 선택하였다.
사례는 27개의 림프종 세포주, 18개의 미만성 거대 B-세포 림프종, 12개의 여포성 림프종, 20개의 외투 세포 림프종, 15개의 변연부 림프종, 7개의 의심스러운 림프종 및 8개의 말초 T-세포 림프종으로 구성되었다. 대조군에는 암이 없는 환자로부터의 11개의 비신생물 림프샘 조직 및 30개의 버피 코트 샘플을 포함하였다. 24개의 호지킨 림프종도 또한 포함하였다. 조직을 미세해부하고, 전문 병리학자가 조직을 검토하였다. 샘플은 연령 일치, 무작위 및 맹검이었다. QIAamp DNA 조직 미니 키트 및 QIAamp DNA 혈액 미니 키트(퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 DNA를 정제하였다. AMPure XP 비드(벡크만-쿨터(Beckman-Coulter), 캘리포니아주 브레아 소재)로 DNA를 재정제하고, PicoGreen(써모-피셔(Thermo-Fisher), 매사추세츠주 월섬 소재)으로 정량화하였다. DNA 온전성은 qPCR을 사용하여 평가하였다.
RRBS 시퀀싱 라이브러리를 수정된 Meissner 프로토콜(Gu et al. Nature Protocols 2011)에 따라 준비하였다. 샘플을 4-플렉스 형식으로 합하고, 메이요 게놈 시설의 일루미나 HiSeq 2500 기기(일루미나(Illumina), 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 시퀀싱하였다. 판독값은 이미지 분석 및 염기 호출(base calling)을 위해 일루미나 파이프라인 모듈로 처리하였다. 2차 분석은 Mayo가 개발한 생물정보학 제품군인 SAAP-RRBS를 사용하여 수행하였다. 간략하게는, Trim-Galore를 사용하여 판독값을 정리하고, BSMAP를 사용하여 GRCh37/hg19 참조 게놈 빌드에 정렬하였다. 적용범위(적용범위)가 10X 이상이고 염기 품질 점수가 20 이상인 CpG에 대해 C/(C+T)를 계산하거나 또는 반대로 역방향 가닥에 대한 판독값 매핑의 경우 G/(G+A)를 계산함으로써 메틸화 비를 결정하였다.
사례/대조군 비교는 모든 NHL 샘플, B-세포/T-세포 및 하위유형의 수준에서 이루어졌다. 과메틸화 비, 즉, 해당 부위에서의 총 사이토신 수에 대한 주어진 유전자좌의 메틸화된 사이토신의 수로 개별 CpG의 순위를 매겼다. 사례들에 대해, 비는 0.20(20%) 이상; 조직 대조군의 경우, 0.04(5%) 이하의 조직 대 조직 분석; 0.20(20%) 이상의 조직 대 버피 코트; 버피 코트 대조군의 경우, 0.02(1%) 이하일 필요가 있었다. 이러한 기준을 충족하지 않는 CpG는 폐기하였다. 그 후, 후보 CpG를 영역당 최소한 컷오프가 5개의 CpG인 대략 40bp 내지 220bp 범위의 DMR(차별적으로 메틸화된 영역)로 게놈 위치에 따라 비닝하였다. CpG 밀도가 지나치게 높은(30% 초과) DMR은 검증 단계에서 GC-관련 증폭 문제를 피하기 위해 제외하였다. 각 후보 영역에 대해, 사례 및 대조군 모두에 대해 개별 CpG를 샘플 대 샘플 방식으로 비교하는 2-D 매트릭스를 생성하였다. 그런 다음, 이러한 CpG 매트릭스를 참조 서열과 다시 비교하여 게놈에 인접한 메틸화 부위가 초기 필터링 동안 폐기되었는지 여부를 평가하였다. 이러한 영역의 서브세트에서, 최종 선택에는 샘플 수준당 DMR 서열 전반에 걸쳐 개별 CpG의 조정되고 연속적인 과메틸화(경우에 따라)가 필요하였다. 반대로, 대조군 샘플은 사례보다 메틸화가 적어도 5배 적어야 하고, CpG 패턴은 더 무작위적이고 덜 조정되어야 한다. 암 샘플의 적어도 10%는 DMR 내의 모든 CpG 부위에 대해 적어도 50%의 과메틸화 비를 가져야 하였다.
별도의 분석에서, 독점적 DMR 확인 파이프라인 및 회귀분석 패키지를 사용하여 CpG의 평균 메틸화 값을 기반으로 DMR을 도출하였다. 평균 메틸화 백분율의 차이를 비호지킨 림프종, 조직 대조군 및 버피 코트 대조군의 상이한 범주 간에 비교하고; 각각 매핑된 CpG의 100개의 염기쌍 내의 타일링된 리딩 프레임(tiled reading frame)을 사용하여 대조군 메틸화가 5% 미만(조직) 및 0.1% 미만(WBC)인 DMR을 확인하고; 적용범위의 총 깊이가 평균적으로 대상체당 10개의 판독값이고 하위그룹 간의 분산이 0 초과인 경우에만 DMR을 분석하였다. 생물학적으로 관련된 교차비(odds ratio)의 증가가 3x 초과이고 적용범위 깊이가 10개의 판독값이라고 가정하면, 그룹당 18개 이상의 샘플이 5%의 유의 수준에서 양측 검정으로 80%의 검정력을 달성하고 이항 분산 팽창 계수(binomial variance inflation factor)를 1로 가정할 필요가 있었다. 회귀분석 후, p-값, 수신자 조작 특성 곡선 아래 면적(AUC) 및 사례와 모든 대조군 간의 배수-변화 차이로 DMR의 순위를 매겼다. 독립 검증이 사전에 계획되었기 때문에 이 단계에서는 잘못된 발견에 대한 조정이 이루어지지 않았다.
추가 개발을 위해 DMR의 서브세트를 선택하였다. 기준은 주로 영역의 판별 가능성에 대한 성능 평가를 제공하는 ROC 곡선 메트릭 아래 로지스틱-파생 면적이었다. 다른 강력하거나 또는 필요한 양성 특징을 갖는 마커를 제외하고 0.85의 AUC를 대략적인 컷오프로 선택하였다. 또한, 메틸화 배수-변화 비(평균 암 과메틸화 비/평균 대조군 과메틸화 비)를 계산하고, 조직 대 조직 비교를 위해 5의 하한을 사용하고 조직 대 버피 코트 비교를 위해 10의 하한을 사용하였다. P값은 미만 0.01 미만이어야 하였다. DMR은 평균 및 개별 CpG 선택 과정 모두에서 나타나야 하였다. DMR 내의 모든 개별 CpG는 대부분의 암 샘플에서 완전히 메틸화되어야 하였다. 정량적 메틸화 특이적 PCR(qMSP) 프라이머는 MethPrimer(Li LC and Dahiya R. Bioinformatics 2002 Nov;18(11):1427-31)를 사용하여 후보 영역에 대해 설계하였으며, 20ng(6250당량)의 양성 및 음성 게놈 메틸화 대조군에 대해 QC를 체크하였다. 최적의 식별력을 위해 다중 어닐링 온도를 테스트하였다. 검증은 2단계의 qMSP로 수행하였다. 첫 번째는 시퀀싱된 DNA 샘플을 다시 테스트하는 것으로 구성하였다. 이는 DMR이 매우 큰 차세대 데이터 세트를 과도하게 피팅한 결과가 아니라 진정으로 식별력이 있는지 확인하기 위해 수행하였다. 두 번째는 더 많은 독립 샘플 세트를 사용하였다.
전문적인 임상 및 병리학적 검토를 통해 조직을 이전과 같이 확인하였다. 퀴아젠 QIAmp FFPE 조직 키트를 사용하여 DNA 정제를 수행하였다. 바이설파이트 전환 단계를 위해 EZ-96 DNA 메틸화 키트(자이모 리서치(Zymo Research), 캘리포니아 주 어바인 소재)를 사용하였다. 로슈 480 LightCyclers(로슈, 스위스 바젤 소재)에서 SYBR Green 검출을 사용하여 10ng의 전환된 DNA(마커당)를 증폭시켰다. 연속 희석된 범용 메틸화된 게놈 DNA(자이모 리서치)를 정량 표준으로 사용하였다. CpG 애그노스틱 ACTB(β-액틴) 검정을 입력 참조 및 정규화 대조군으로서 사용하였다. 결과는 ACTB의 메틸화된 카피(특정 마커)/카피로 나타내었다.
결과를 개별 MDM(메틸화된 DNA 마커) 성능에 대해 논리적으로 분석하였다. 마커의 조합에 대해, 원본 데이터(트레이닝을 위한 데이터의 대략 2/3)의 부트 스트랩 샘플에 맞는 500개의 개별 모델을 생성하고, 전체 MDM 패널의 교차 검증 오류(테스트를 위한 데이터의 1/3)를 추정하는 데 사용되며, 실제 교차 검증 메트릭을 과소평가 또는 과대평가하는 허위 분할(spurious split)을 피하기 위해 500회 반복되는 무작위 포레스트 회귀(random forest regression: rForest) 방법을 사용하였다. 그런 다음, 결과를 500회 반복에 대해 평균을 내었다.
림프종 조직 샘플 대 비신생물 림프샘 조직의 메틸화를 비교하여, NHL 특정 영역 및 NHL 하위유형 특정 영역을 포함하는 102개의 DMR을 확인하였다(표 1)(표 1에 나타낸 영역에 대한 게놈 좌표는 Human Feb. 2009(GRCh37/hg19) 어셈블리를 기반으로 함). 표 2는 1) 림프종 조직(예를 들어, NHL 및 NHL 하위유형)을 비신생물 림프샘 조직과 구별하는 확인된 메틸화된 영역에 대한 곡선 아래 면적, 2) 림프종 조직(예를 들어, NHL 및 NHL 하위유형) 대 비신생물 림프샘 조직에 대한 배수 변화(Fold Change: FC) 및 3) 림프종 조직(예를 들어, NHL 및 NHL 하위유형) 대 비신생물 림프샘 조직의 p-값을 보여준다.
림프종 조직(예를 들어, NHL 및 NHL 하위유형) 대 백혈구(버피 코트) 분석은 NHL 특정 영역 및 NHL 하위유형 특정 영역을 포함하는 WBC에서 노이즈가 1% 미만인 183개의 조직 DMR을 생성하였다(표 3)(표 3에 나타낸 영역에 대한 게놈 좌표는 Human Feb. 2009(GRCh37/hg19) 어셈블리를 기반으로 함). 표 4는 1) 림프종 조직(예를 들어, NHL 및 NHL 하위유형)을 백혈구(버피 코트)와 구별하는 확인된 메틸화된 영역에 대한 곡선 아래 면적, 2)림프종 조직(예를 들어, NHL 및 NHL 하위유형) 대 백혈구(버피 코트)에 대한 배수 변화(FC) 및 3) 림프종 조직(예를 들어, NHL 및 NHL 하위유형) 대 백혈구(버피 코트)의 p-값을 보여준다.
조직 및 버피 마커 그룹으로부터, 30개의 후보 마커(예를 들어, ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503; see 표 1 및 2)(예를 들어, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 표 3 및 표 4 참조)를 추가적인 연구를 위해 선택하였다. 메틸화-특이적 PCR 검정을 개발하고, 2라운드의 조직 샘플에 대한 테스트를 수행하였다: 시퀀싱된 것(동결된 세포 현탁액, 세포주) 및 더 큰 독립 코호트(FFPE, 세포 현탁액). DMR에서 가장 구별되는 CpG를 표적으로 하도록 짧은 앰플리콘 프라이머(120bp 미만)를 설계하였으며, 완전히 메틸화된 단편이 강력하고 선형적인 방식으로 증폭되고; 메틸화되지 않고/않거나 전환되지 않은 단편이 증폭되지 않도록 하기 위해 대조군에 대해 테스트하였다. 60개의 프라이머 서열 및 어닐링 온도는 표 5에 열거되어 있다(여기서, "-F"는 정방향 프라이머 5'-3' 서열을 나타내고, "-R"은 역방향 프라이머 5'-3' 서열을 나타냄).
1단계 검증으로부터의 결과를 논리적으로 분석하여 AUC 및 배수 변화를 결정하였다. 조직 및 버피 코트 대조군에 대한 분석은 별도로 실행하였다. 결과는 여포성 림프종에 대해서는 표 6, DLBCL에 대해서는 표 7, 외투 세포 림프종에 대해서는 표 8, 변연부 림프종에 대해서는 표 9 및 말초 T 세포 림프종에 대해서는 표 10에 강조되어 있다. 파란색 음영의 정도는 마커 검정 식별력 강도를 나타낸다. 다수의 검정은 정상 버피 코트와 비교하여 100% 식별하였고, 몇몇은 대조군 조직과 비교하여 100%였다.
그런 다음, 다음에 따라 독립적인 샘플에서 마커를 테스트하였다:
이전 단계에서와 같이, 전체 샘플 및 마커 세트를 다음에 하나의 배취(batch)로 실행하였다. 약 10ng의 샘플-유래 DNA를 마커당 실행하였다 - 총 300. 개별 MDM의 예측 정확도(림프종 대 정상)를 평가하기 위해 해당 95% 신뢰 구간(CI)이 있는 수신자 조작 특성 곡선 아래 면적(AUC)을 추정하였다.
30회의 실행 중 상위 10개의 MDM(림프종 대 정상)에 대한 단변량 AUC가 표 11에 열거되어 있다.
여포성 림프종 조직 대 조직 및 버피 코트에 대한 개별 MDM에 대한 AUC 결과는 표 12에 제시되어 있고, DLBCL 조직 대 조직 및 버피 코트에 대한 AUC 결과는 표 13에 제시되어 있고, 외투 세포 림프종 조직 대 조직 및 버피 코트에 대한 AUC 결과는 표 14에 제시되어 있고, 변연부 림프종 조직 대 조직 및 버피 코트에 대한 AUC 결과는 표 15에 제시되어 있고, 말초 T 세포 림프종 조직 대 조직 및 버피 코트에 대한 AUC 결과는 표 16에 제시되어 있다. 개별 마커 후보의 수신지 조작 특성 분석, 암 대 대조군 조직 비교에 대한 곡선 아래 면적(AUC)은 0.35 내지 1의 범위였다. 여포성, 거대 B-세포, 외투세포, 변연부 및 T-세포 하위유형에 대한 AUC 중앙값은 각각 0.91, 0.88, 0.73, 0.72 및 0.57이었다. 데이터세트의 500개의 부트스트랩 샘플에 걸쳐 예측을 평균화하는 무작위 포레스트 회귀를 사용하여 30개의 모든 후보 MDM을 기반으로 림프종의 다변량 예측 모델을 구축하였다(표 17 참조). 리브 원 아웃(Leave-one-out) 교차 검증을 사용하여 모델 성능을 추정하였다. 림프종 전체뿐만 아니라 하위유형을 검출하기 위한 민감도는 정상 대조군에서 적절한 백분위수로 정의된 바와 같은 미리 결정된 특이도 수준(즉 90번째 백분위수, 95번째 백분위수)에서 측정하였다. 아웃 오브 백(Out of Bag) 오차율 7.89%(림프종: 4.7%, 정상: 23.0%) 전체 AUC = 0.986. 암 대 버피 코트 비교의 경우, AUC는 0.39 내지 1의 범위였다. 여포성, 거대 B-세포, 외투 세포, 변연부 및 T-세포 하위유형에 대한 AUC 중앙값은 각각 0.95, 0.93, 0.83, 0.85 및 0.74였다. 표 18은 혈액 샘플 내에서 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종 및 다양한 하위유형의 비호지킨 림프종을 검출하기 위한 95% 특이도의 민감도를 보여준다.
표 12는 여포성 림프종 조직을 버피 코트(정상) 및 비신생물 림프샘 조직과 구별하는 확인된 메틸화된 영역에 대한 곡선 아래 면적을 보여준다.
표 13은 DLBCL 조직을 버피 코트(정상) 및 비신생물 림프샘 조직과 구별하는 확인된 메틸화된 영역에 대한 곡선 아래 면적을 보여준다.
표 14는 외투세포 림프종 조직을 버피 코트(정상) 및 비신생물 림프샘 조직과 구별하는 확인된 메틸화된 영역에 대한 곡선 아래 면적을 보여준다.
표 15는 변연부 림프종 조직을 버피 코트(정상) 및 비신생물 림프샘 조직과 구별하는 확인된 메틸화된 영역에 대한 곡선 아래 면적을 보여준다.
표 16은 1) 말초 T 세포 림프종을 버피 코트(정상) 및 비신생물 림프샘 조직과 구별하는 확인된 메틸화된 영역에 대한 곡선 아래 면적을 보여준다.
표 18은 혈액 샘플 내에서 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종의 다양한 하위유형을 검출하기 위한 95% 특이도의 민감도를 보여준다.
도 1은 메틸화 마커 및 관련 프라이머와 프로브 정보에 사용되는 마커 염색체 영역을 추가로 제공한다.
결론적으로, 전체 메틸옴 시퀀싱, 엄격한 필터링 기준 및 생물학적 검증을 통해 비호지킨 림프종에 대한 뛰어난 후보 MDM을 산출하였다. 10개의 신규한 MDM의 패널은 사례와 양성 대조군 샘플 간에 매우 높은 식별력을 달성하였다.
참조에 의한 원용
본 명세서에 언급된 각각의 특허 문서 및 과학 논문의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조에 의해 원용된다.
기술에 대해 기재된 조성물, 방법 및 용도의 다양한 수정 및 변형은 기재된 바와 같은 기술의 범주 및 사상을 벗어나지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 기술이 특정 예시적인 실시형태와 관련하여 설명되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명이 이러한 특정 실시형태로 부당하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해하여야 한다. 실제로, 약리학, 생화학, 의학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 다음 청구범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Mayo Foundation for Medical Education and Research
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<120> DETECTING NON-HODGKIN LYMPHOMA
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<223> synthetic
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 21
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
<400> 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<223> synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<211> 19
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<223> synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<223> synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 60
000
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<223> synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<223> synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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<223> synthetic
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<223> synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 100
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<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 101
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 104
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 105
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 106
cgcgccgagg cgtttgtgta ggggcg 26
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 107
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 108
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 109
aggccacgga cgcgcggtgc gttgaag 27
<210> 110
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 110
ttttacgagc gcgagggtc 19
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 111
caaccctaac aacgcgaaac g 21
<210> 112
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 112
cgcgccgagg cgtttttatt gtcgtcggga 30
<210> 113
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 113
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<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 114
accgccgaat attcacgatc g 21
<210> 115
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 115
aggccacgga cgcgcgtttt gggttcgt 28
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 116
tttcgttttt ttcgttttgc gcg 23
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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ccctaacaac gcctccgaaa c 21
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 118
cgcgccgagg aaattttttt tcgtcgggat cg 32
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 119
acgaaactat cctccgaaaa ccgtc 25
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 120
cgagatcgag tagggtgagc 20
<210> 121
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 121
aggccacgga cgcgttacgg aattgcgttt t 31
<210> 122
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 122
gacgtttttg gttttacgga gttttc 26
<210> 123
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 123
cctataacta atcgactaaa actatactaa aaccg 35
<210> 124
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 124
cgcgccgagg cgttttttta gttttcgatt ttagttttag 40
<210> 125
<211> 129
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 125
gcccggccgc cgcccattgg ccggaggaat ccccaggaat gcgagcgccc ctttaaaagc 60
gcgcggctcc tccgccttgc cagccgctgc gcccgagctg gcctgcgagt tcagggctcc 120
tgtcgctct 129
<210> 126
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 126
gttcggtcgt cgtttattgg tcggaggaat ttttaggaat gcgagcgttt ttttaaaagc 60
gcgcggtttt ttcgttttgt tagtcgttgc gttcgagttg gtttgcgagt ttagggtttt 120
tgtcgtttt 129
<210> 127
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 127
aggccacgga cgcgcggttt tttcgttttg 30
<210> 128
<211> 216
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 128
aggcgcgcgc ggtgatctcg gctctccgcc gctgcccgga gcgtcatcca cgttcggttc 60
cctcccacat tagacaagaa atctgaggtc aggagagcta agtaacttgc ccaaagtcgc 120
tcacaaggca gtgacgaagc aaactcacat ccgcggctcc ttttttctcc ttgaacgccg 180
ggctctgcgg aggctcaggc cctgcaggaa tcgccc 216
<210> 129
<211> 216
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 129
aggcgcgcgc ggtgatttcg gtttttcgtc gttgttcgga gcgttattta cgttcggttt 60
ttttttatat tagataagaa atttgaggtt aggagagtta agtaatttgt ttaaagtcgt 120
ttataaggta gtgacgaagt aaatttatat tcgcggtttt tttttttttt ttgaacgtcg 180
ggttttgcgg aggtttaggt tttgtaggaa tcgttt 216
<210> 130
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 130
cgcgccgagg cgaacaacga cgaaaaacc 29
<210> 131
<211> 276
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 131
ggctgaagtc ggggtgctcg gccagcgtcg ccgcctgccg gggaggctgg cccagggtcc 60
ccggcgcata gcggccaacg ctcagctcat ccgcggcgtc ggcgcccagc aggaacgagt 120
ccacgtagta gttgcccagg gccccagtgg tggccatcac cgtgcccagc gcctggcccg 180
cccggcccga cccacggaaa ttatgaaact gcagatttca tgtaacaact tggtggcacc 240
gggggggaag tacagtcacc taataagttg ccggcg 276
<210> 132
<211> 276
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 132
ggttgaagtc ggggtgttcg gttagcgtcg tcgtttgtcg gggaggttgg tttagggttt 60
tcggcgtata gcggttaacg tttagtttat tcgcggcgtc ggcgtttagt aggaacgagt 120
ttacgtagta gttgtttagg gttttagtgg tggttattat cgtgtttagc gtttggttcg 180
ttcggttcga tttacggaaa ttatgaaatt gtagatttta tgtaataatt tggtggtatc 240
gggggggaag tatagttatt taataagttg tcggcg 276
<210> 133
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 133
aggccacgga cgcgccgcga ataaactaaa c 31
<210> 134
<211> 204
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 134
gcagcctcgc gcctgccttc cctccactgt cctcagccaa ggtgtagtaa agcgtctccg 60
aacgcggcgc gaccctcgcc cacgcccgct cgcgggggga ccgcaccgcc ccaggggtcc 120
tcgctagggg ttcccggaga aggggtggga gatgggggtg cgggggggca caggagcgcg 180
ggccagcacc cagacctgct cggt 204
<210> 135
<211> 204
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 135
gtagtttcgc gtttgttttt tttttattgt ttttagttaa ggtgtagtaa agcgttttcg 60
aacgcggcgc gattttcgtt tacgttcgtt cgcgggggga tcgtatcgtt ttaggggttt 120
tcgttagggg ttttcggaga aggggtggga gatgggggtg cgggggggta taggagcgcg 180
ggttagtatt tagatttgtt cggt 204
<210> 136
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 136
cgcgccgagg cgtttacgtt cgttcgcg 28
<210> 137
<211> 258
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 137
cgggccccac tgcgcctttt cctagccctc cgctgtcacg cagcagcaag cttaatcccg 60
cataaaaaac gcatgcgccg agagcgtgcc cgcagcaggg cccacggaac gatgacagca 120
ggcacctcct atctgccccc gcccccggcg tcacgtgact agctgcgctg gtgcacgcag 180
ccgggagggg cgggctcctt cccctggcaa gccggaagct ccgcacctgt aagtagaggt 240
tcaggcttcg accacgcg 258
<210> 138
<211> 258
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 138
cgggttttat tgcgtttttt tttagttttt cgttgttacg tagtagtaag tttaatttcg 60
tataaaaaac gtatgcgtcg agagcgtgtt cgtagtaggg tttacggaac gatgatagta 120
ggtatttttt atttgttttc gttttcggcg ttacgtgatt agttgcgttg gtgtacgtag 180
tcgggagggg cgggtttttt tttttggtaa gtcggaagtt tcgtatttgt aagtagaggt 240
ttaggtttcg attacgcg 258
<210> 139
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 139
aggccacgga cgcgtaacgc cgaaaacga 29
<210> 140
<211> 142
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 140
cgggactgtt aagggagctc gaagtcgggg gccgggggct tcccgtcccg gcgcttccca 60
tgcaaacccc tgaaggaagc ggcaggcgca gccgcgggct ccgcagccca ggcccacttc 120
ctgtcactcc aggaaaacct cg 142
<210> 141
<211> 142
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 141
cgggattgtt aagggagttc gaagtcgggg gtcgggggtt tttcgtttcg gcgtttttta 60
tgtaaatttt tgaaggaagc ggtaggcgta gtcgcgggtt tcgtagttta ggtttatttt 120
ttgttatttt aggaaaattt cg 142
<210> 142
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 142
cgcgccgagg cgggggtttt tcgtttcg 28
<210> 143
<211> 129
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 143
gctctaattt cctcagattc cgcggcggag aaaccagaag ctagatgggc agtcgcagcg 60
gcggcggctc aacaccgcga ggagcgctgg gctctccgcc cttcccggcc acgtgacgcc 120
cggggacgc 129
<210> 144
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 144
gttttaattt ttttagattt cgcggcggag aaattagaag ttagatgggt agtcgtagcg 60
gcggcggttt aatatcgcga ggagcgttgg gtttttcgtt tttttcggtt acgtgacgtt 120
cggggacgt 129
<210> 145
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 145
aggccacgga cgcggcggtt taatatcgcg 30
<210> 146
<211> 267
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 146
ccaggaggcg tcggagcctg gcgtggtagg gctgtgctgc gcggtccttc ccattcaccc 60
tagtctggcg ctcgccggcg tgggcgggcc ggaccttcgc cgcttccagg aagggccaca 120
acggccgtcg gaccacggcg cggcgggtaa ggtcgtcagc gtcttcctgt cagcggtcgg 180
cagagcctcg gcgggcgggc ggcgcgtggg gcagccggtg tcgcactggg agggctgcgt 240
gggcgcggag ggcctgggcg ctcccca 267
<210> 147
<211> 267
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 147
ttaggaggcg tcggagtttg gcgtggtagg gttgtgttgc gcggtttttt ttatttattt 60
tagtttggcg ttcgtcggcg tgggcgggtc ggattttcgt cgtttttagg aagggttata 120
acggtcgtcg gattacggcg cggcgggtaa ggtcgttagc gtttttttgt tagcggtcgg 180
tagagtttcg gcgggcgggc ggcgcgtggg gtagtcggtg tcgtattggg agggttgcgt 240
gggcgcggag ggtttgggcg tttttta 267
<210> 148
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 148
cgcgccgagg cggattacgg cgcg 24
<210> 149
<211> 114
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 149
gaggaaggtg accgaacccg tagcagcttc cgagagcgta cccgtttgca aattgctgca 60
ggaagagcga ggcgggcctt gcgcttttta atccggaacg ggaagcactg ggga 114
<210> 150
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 150
gaggaaggtg atcgaattcg tagtagtttt cgagagcgta ttcgtttgta aattgttgta 60
ggaagagcga ggcgggtttt gcgtttttta attcggaacg ggaagtattg ggga 114
<210> 151
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 151
aggccacgga cgcgagagcg tattcgtttg t 31
<210> 152
<211> 147
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 152
ggtcggcgcc acacaccccc agccggcgac cgcgcccagg gacctaattc aatcgccccc 60
agcctaatga atagccgcgc gctaatcgga tctccgcgcg cttcggggat ttacgcttcc 120
cggctctccc cctcgtgccc cgcggcc 147
<210> 153
<211> 147
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 153
ggtcggcgtt atatattttt agtcggcgat cgcgtttagg gatttaattt aatcgttttt 60
agtttaatga atagtcgcgc gttaatcgga ttttcgcgcg tttcggggat ttacgttttt 120
cggttttttt tttcgtgttt cgcggtt 147
<210> 154
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 154
cgcgccgagg cgatcgcgtt tagggattta a 31
<210> 155
<211> 135
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 155
atgagccttt ctgttttaaa gccggaaccc agccgggccg cgccgcgagg aggctcccct 60
gaggctggca ggagagacct gcagaaactc gtgcgcgccg agcgaggcgg gcgccctggg 120
gctggggcac gcggc 135
<210> 156
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 156
atgagttttt ttgttttaaa gtcggaattt agtcgggtcg cgtcgcgagg aggttttttt 60
gaggttggta ggagagattt gtagaaattc gtgcgcgtcg agcgaggcgg gcgttttggg 120
gttggggtac gcggt 135
<210> 157
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 157
aggccacgga cgcgcgtcgc gaggag 26
<210> 158
<211> 189
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 158
tagcgctggt actcctgggc tgggtctcct cgtcttctcc cacctcctcg gcatcctcct 60
tctcctcctc ggcgccgttc ctggcttccg ccgtgtccgc ccagcccccg ctgccggacc 120
agtgccccgc gctgtgcgag tgctccgagg cagcgcgcac agtcaagtgc gttaaccgca 180
atctgaccg 189
<210> 159
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 159
tagcgttggt atttttgggt tgggtttttt cgtttttttt tattttttcg gtattttttt 60
tttttttttc ggcgtcgttt ttggttttcg tcgtgttcgt ttagttttcg ttgtcggatt 120
agtgtttcgc gttgtgcgag tgtttcgagg tagcgcgtat agttaagtgc gttaatcgta 180
atttgatcg 189
<210> 160
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 160
cgcgccgagg cgcgttgtgc gagtg 25
<210> 161
<211> 189
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 161
agacgccgca gctgcgcgcc agggtccagc ccggcgggga tcgggctcgg gactcacccg 60
ctccggcgag ctcgactcag ctcgggctcc cgcctcggct aggcagccgc ctggggctgc 120
gtcccgcgca gggtcagcgc ggatcgggca ggaggcgccc tcttggcaaa gtcggctaga 180
ggcgccagc 189
<210> 162
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 162
agacgtcgta gttgcgcgtt agggtttagt tcggcgggga tcgggttcgg gatttattcg 60
tttcggcgag ttcgatttag ttcgggtttt cgtttcggtt aggtagtcgt ttggggttgc 120
gtttcgcgta gggttagcgc ggatcgggta ggaggcgttt ttttggtaaa gtcggttaga 180
ggcgttagt 189
<210> 163
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 163
aggccacgga cgcgtttcgg cgagttcg 28
<210> 164
<211> 113
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 164
cgtcacctgc cggaaacacc cgaatgttca tcccgcgcgc agtttctgag atgctgggtg 60
aaggcgaccc gcagataggt ctgtgacaga cgcctaaagc gccgaaccat ccc 113
<210> 165
<211> 113
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 165
cgttatttgt cggaaatatt cgaatgttta tttcgcgcgt agtttttgag atgttgggtg 60
aaggcgattc gtagataggt ttgtgataga cgtttaaagc gtcgaattat ttt 113
<210> 166
<211> 247
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 166
ggggacgcgg ctgcctgctg ggggtgtgag cgagaggctg agcgctgccc gctcggcgca 60
tccattccgc accgccccct ccctgcgggc ctcggaggaa gccccccgcg ctgtgcggag 120
gcgcctcggc tgccgggctg cggagccccg gcccagcaag aggtgagtgc cgccgccggc 180
tccctagctt acccgcgcgc gcgctctctt ttcttcttcc ctcggtcctc gcttctctct 240
agggtgt 247
<210> 167
<211> 247
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 167
ggggacgcgg ttgtttgttg ggggtgtgag cgagaggttg agcgttgttc gttcggcgta 60
tttatttcgt atcgtttttt ttttgcgggt ttcggaggaa gtttttcgcg ttgtgcggag 120
gcgtttcggt tgtcgggttg cggagtttcg gtttagtaag aggtgagtgt cgtcgtcggt 180
tttttagttt attcgcgcgc gcgttttttt tttttttttt ttcggttttc gttttttttt 240
agggtgt 247
<210> 168
<211> 79
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 168
ggtgcacggc gcggggcggg agcctggcgc agccggcaga ccgccagcag atggaggcgc 60
tcactcggta cctgcgcgc 79
<210> 169
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 169
ggtgtacggc gcggggcggg agtttggcgt agtcggtaga tcgttagtag atggaggcgt 60
ttattcggta tttgcgcgt 79
<210> 170
<211> 108
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 170
tccggcgccg cgttttctag agaaccgggt ctcagcgatg ctcatttcag ccccgtctta 60
atgcaacaaa cgaaacccca cacgaacgaa aaggaacatg tctgcgct 108
<210> 171
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 171
ttcggcgtcg cgttttttag agaatcgggt tttagcgatg tttattttag tttcgtttta 60
atgtaataaa cgaaatttta tacgaacgaa aaggaatatg tttgcgtt 108
<210> 172
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 172
cgcaaacata ttccttttcg ttcg 24
<210> 173
<211> 102
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 173
accctggcca aggaggccgc cgcctccaac accaacacgc tcaacaggaa aaccacgcct 60
gtgtaggggc gcggcggggg agccgagggg cgtgtccggg gc 102
<210> 174
<211> 102
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 174
attttggtta aggaggtcgt cgtttttaat attaatacgt ttaataggaa aattacgttt 60
gtgtaggggc gcggcggggg agtcgagggg cgtgttcggg gt 102
<210> 175
<211> 189
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 175
cggtgccctt tgcgttcctt cccgctcctc tcccggaccc cctccccctt ggccctcagc 60
ggcgtccctc ttcctcccgc cctctccccc gagtctctcg gtcactcgct ggtgcccttg 120
ggcgcgcggt gcgttgaagg cgtgagtccc gggtcttcgg gatcccggct ttggccgcca 180
gagagcagc 189
<210> 176
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 176
cggtgttttt tgcgtttttt ttcgtttttt tttcggattt tttttttttt ggtttttagc 60
ggcgtttttt tttttttcgt tttttttttc gagtttttcg gttattcgtt ggtgtttttg 120
ggcgcgcggt gcgttgaagg cgtgagtttc gggttttcgg gatttcggtt ttggtcgtta 180
gagagtagt 189
<210> 177
<211> 179
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 177
gtcccgcccg caccctttgc tttcagccca ctcggttccc tctcctaggt ttccacgagc 60
gcgagggccg cccctactgc cgccgggact tcctgcagct gttcgccccg cgctgccagg 120
gctgccaggg ccccatcctg gataactaca tctcggcgct cagcgcgctc tggcacccg 179
<210> 178
<211> 179
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 178
gtttcgttcg tattttttgt ttttagttta ttcggttttt ttttttaggt ttttacgagc 60
gcgagggtcg tttttattgt cgtcgggatt ttttgtagtt gttcgtttcg cgttgttagg 120
gttgttaggg ttttattttg gataattata tttcggcgtt tagcgcgttt tggtattcg 179
<210> 179
<211> 314
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 179
ggggcggggt gtacgagggg cgtgtacact ggctcaggga cacgcgctct cggccacagc 60
aactggctcc aagttccctc cctcactctc cggcgaagcc tgcctgagcc ctcccactcg 120
gtgcagaccg aaccatcgcg gccgccgcca gccgggccct tcgcggccgc gcgtcctggg 180
cccgttccgc cagccccgtc tgctctctac ccgcggcccc gcggcggcga ccgtgaacac 240
tcggcggccc ctacagcccg ctctcggccc ttcgtccctc gcgggccccg actctccctc 300
cttgcagtcc cccg 314
<210> 180
<211> 314
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 180
ggggcggggt gtacgagggg cgtgtatatt ggtttaggga tacgcgtttt cggttatagt 60
aattggtttt aagttttttt ttttattttt cggcgaagtt tgtttgagtt tttttattcg 120
gtgtagatcg aattatcgcg gtcgtcgtta gtcgggtttt tcgcggtcgc gcgttttggg 180
ttcgtttcgt tagtttcgtt tgttttttat tcgcggtttc gcggcggcga tcgtgaatat 240
tcggcggttt ttatagttcg ttttcggttt ttcgtttttc gcgggtttcg attttttttt 300
tttgtagttt ttcg 314
<210> 181
<211> 168
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 181
ccccctcgga gctccgcccc cttcctggcc tcaaactccg agtccattca aacctcgcct 60
tcctcgccct gcgcgttgtc aggcgtgtaa ttggggaaac tcctccccgc cgggaccgcc 120
tcggaggcgc tgccagggga cagccgccca gctgccccca cctcccag 168
<210> 182
<211> 168
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 182
ttttttcgga gtttcgtttt ttttttggtt ttaaatttcg agtttattta aatttcgttt 60
ttttcgtttt gcgcgttgtt aggcgtgtaa ttggggaaat tttttttcgt cgggatcgtt 120
tcggaggcgt tgttagggga tagtcgttta gttgttttta ttttttag 168
<210> 183
<211> 165
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 183
cctggcggcc cgcgccatca tccgcgactt cgagcagctg gcggagcgcg agggcgagat 60
cgagcagggt gagcgccacg gaactgcgcc cctcccgcgg acggcctccg gaggacagcc 120
ccgctccaca gccgctcccc cttccccacc cgcccccggt gatcc 165
<210> 184
<211> 165
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 184
tttggcggtt cgcgttatta ttcgcgattt cgagtagttg gcggagcgcg agggcgagat 60
cgagtagggt gagcgttacg gaattgcgtt tttttcgcgg acggttttcg gaggatagtt 120
tcgttttata gtcgtttttt tttttttatt cgttttcggt gattt 165
<210> 185
<211> 183
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 185
gctgagttgg gaataaggat cctcctttga gatttccagg gtcctgagtc cttcattctg 60
acgttcttgg ccccacggag cccccgtctc cccagcttcc gaccccagcc ccagaagtcc 120
cggtctcagc acagctccag ccgaccagct acaggaaacc agcttttctc ttcctcccaa 180
gag 183
<210> 186
<211> 183
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 186
gttgagttgg gaataaggat ttttttttga gatttttagg gttttgagtt ttttattttg 60
acgtttttgg ttttacggag ttttcgtttt tttagttttc gattttagtt ttagaagttt 120
cggttttagt atagttttag tcgattagtt ataggaaatt agtttttttt ttttttttaa 180
gag 183
Claims (148)
- 생물학적 샘플을 특성화하는 방법으로서,
(a) 인간 개체의 생물학적 샘플에서
(i) ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503;
(ii) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(iv) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 상기 측정하는 단계;
(b) 상기 메틸화 수준을 림프종이 없는 대조군 샘플에서의 상응하는 유전자 세트의 메틸화 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 유전자에서 측정된 메틸화 수준이 각각의 대조군 샘플에서 측정된 메틸화 수준보다 더 높은 경우, 상기 개체는 비호지킨 림프종이 있는 것으로 결정하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 나타낸 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 생물학적 샘플이 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플)이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(i) ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503; 또는
(ii) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B
를 포함하거나, 또는
상기 생물학적 샘플이 혈장 샘플이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 또는
(iv) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B
를 포함하는, 방법. - 생물학적 샘플을 특성화하는 방법으로서,
(a) 인간 개체의 생물학적 샘플에서
(i) ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(v) HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 상기 측정하는 단계;
(b) 상기 메틸화 수준을 림프종이 없는 대조군 샘플에서의 상응하는 유전자 세트의 메틸화 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 유전자에서 측정된 메틸화 수준이 각각의 대조군 샘플에서 측정된 메틸화 수준보다 더 높은 경우, 상기 개체는 여포성 림프종이 있는 것으로 결정하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제8항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 나타낸 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 생물학적 샘플이 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플)이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(i) ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6; 또는
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C
를 포함하거나, 또는
상기 생물학적 샘플이 혈장 샘플이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 또는
(v) HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1
을 포함하는, 방법. - 생물학적 샘플을 특성화하는 방법으로서,
(a) 인간 개체의 생물학적 샘플에서
(i) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(v) MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 상기 측정하는 단계;
(b) 상기 메틸화 수준을 림프종이 없는 대조군 샘플에서의 상응하는 유전자 세트의 메틸화 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 유전자에서 측정된 메틸화 수준이 각각의 대조군 샘플에서 측정된 메틸화 수준보다 더 높은 경우, 상기 개체는 DLBCL 암이 있는 것으로 결정하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제15항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 나타낸 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 제15항에 있어서,
상기 생물학적 샘플이 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플)이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(i) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503; 또는
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503
을 포함하거나, 또는
상기 생물학적 샘플이 혈장 샘플이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503; 또는
(v) MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1
을 포함하는, 방법. - 생물학적 샘플을 특성화하는 방법으로서,
(a) 인간 개체의 생물학적 샘플에서
(i) CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C;
(ii) BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503; 및
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 상기 측정하는 단계;
(b) 상기 메틸화 수준을 림프종이 없는 대조군 샘플에서의 상응하는 유전자 세트의 메틸화 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 유전자에서 측정된 메틸화 수준이 각각의 대조군 샘플에서 측정된 메틸화 수준보다 더 높은 경우, 상기 개체는 외투 세포 림프종이 있는 것으로 결정하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제22항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 나타낸 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서,
상기 생물학적 샘플이 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플)이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(i) CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C; 또는
(ii) BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1
을 포함하거나, 또는
상기 생물학적 샘플이 혈장 샘플이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503; 또는
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C
를 포함하는, 방법. - 생물학적 샘플을 특성화하는 방법으로서,
(a) 인간 개체의 림프샘 샘플에서
(i) CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 상기 측정하는 단계;
(b) 상기 메틸화 수준을 림프종이 없는 대조군 샘플에서의 상응하는 유전자 세트의 메틸화 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 유전자에서 측정된 메틸화 수준이 각각의 대조군 샘플에서 측정된 메틸화 수준보다 더 높은 경우, 상기 개체는 변연부 림프종이 있는 것으로 결정하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제29항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 나타낸 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 제29항에 있어서,
상기 생물학적 샘플이 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플)이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(i) CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5; 또는
(ii) ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1; 또는
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5
를 포함하고; 그리고
상기 생물학적 샘플이 혈장 샘플이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266; 또는
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1; 또는
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5
를 포함하는, 방법. - 생물학적 샘플을 특성화하는 방법으로서,
(a) 인간 개체의 생물학적 샘플에서
(i) CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(ii) GABRG3, ITGA5 및 JUP;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(iv) BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 상기 측정하는 단계;
(b) 상기 메틸화 수준을 림프종이 없는 대조군 샘플에서의 상응하는 유전자 세트의 메틸화 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 유전자에서 측정된 메틸화 수준이 각각의 대조군 샘플에서 측정된 메틸화 수준보다 더 높은 경우, 상기 개체는 말초 T-세포 림프종이 있는 것으로 결정하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제36항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 나타낸 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 제36항에 있어서,
상기 생물학적 샘플이 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직 샘플)이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(i) CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1; 또는
(ii) GABRG3, ITGA5 및 JUP, 또는
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5
를 포함하고;
상기 생물학적 샘플이 혈장 샘플이면, 상기 하나 이상의 유전자는
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1; 또는
(iv) BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1; 또는
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5
를 포함하는, 방법. - 방법으로서,
(a) 인간 개체의 생물학적 샘플에서
(i) ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503;
(ii) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(iv) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하되, 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 방법. - 제43항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 인용되어 있는, 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 방법으로서,
(a) 인간 개체의 생물학적 샘플에서
(i) ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(v) HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하되; 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 방법. - 제49항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 인용되어 있는, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 방법으로서,
(a) 인간 개체의 생물학적 샘플에서
(i) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503; 및
(v) MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하되, 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 방법. - 제55항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 인용되어 있는, 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 방법으로서,
(a) 인간 개체의 생물학적 샘플에서
(i) CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C;
(ii) BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503; 및
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하되, 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 방법. - 제61항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 인용되어 있는, 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 방법으로서,
(a) 인간 개체의 생물학적 샘플에서
(i) CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하되, 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 방법. - 제67항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 인용되어 있는, 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 방법으로서,
(a) 인간 개체의 생물학적 샘플에서
(i) CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(ii) GABRG3, ITGA5 및 JUP;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(iv) BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5
로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하되, 해당 단계는
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통한, 방법. - 제73항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 인용되어 있는, 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직)인, 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 게놈 좌표에 의해 기술되는, 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 제73항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는 상기 CpG 부위의 메틸화 점수를 결정하는 단계 및 상기 CpG 부위의 메틸화 빈도를 결정하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 결정을 포함하는, 방법.
- 대상체로부터 얻은 샘플에서 림프종을 스크리닝하는 방법으로서,
1) 하기 그룹 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계
(i) ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503;
(ii) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(iv) BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B, 및
2) 상기 마커의 메틸화 상태가 림프종이 없는 대상체에서 검정된 마커의 메틸화 상태와 상이한 경우, 상기 대상체를 림프종이 있는 것으로 확인하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제79항에 있어서, 복수의 마커를 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 마커는 높은 CpG 밀도 프로모터에 있는, 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플, 림프샘 조직 샘플, 혈장 샘플 또는 소변 샘플, 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화 특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함하는, 방법.
- 대상체로부터 얻은 샘플에서 여포성 림프종을 스크리닝하는 방법으로서,
1) 하기 그룹 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계
(i) ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C; 및
(v) HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1;
2) 상기 마커의 메틸화 상태가 림프종이 없는 대상체에서 검정된 마커의 메틸화 상태와 상이한 경우, 상기 대상체를 여포성 림프종이 있는 것으로 확인하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제85항에 있어서, 복수의 마커를 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제85항에 있어서, 상기 마커는 높은 CpG 밀도 프로모터에 있는, 방법.
- 제85항에 있어서, 상기 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플, 림프샘 조직 샘플, 혈장 샘플 또는 소변 샘플, 방법.
- 제85항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화 특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제85항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함하는, 방법.
- 대상체로부터 얻은 샘플에서 DLBCL을 스크리닝하는 방법으로서,
1) 하기 그룹 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계
(i) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503, 및
(v) MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1;
2) 상기 마커의 메틸화 상태가 림프종이 없는 대상체에서 검정된 마커의 메틸화 상태와 상이한 경우, 상기 대상체를 DLBCL이 있는 것으로 확인하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제91항에 있어서, 복수의 마커를 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제91항에 있어서, 상기 마커는 높은 CpG 밀도 프로모터에 있는, 방법.
- 제91항에 있어서, 상기 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플, 림프샘 조직 샘플, 혈장 샘플 또는 소변 샘플, 방법.
- 제91항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화 특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제91항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함하는, 방법.
- 대상체로부터 얻은 샘플에서 외투 세포 림프종을 스크리닝하는 방법으로서,
1) 하기 그룹 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계
(i) CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C;
(ii) BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503; 및
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C, 및
2) 상기 마커의 메틸화 상태가 림프종이 없는 대상체에서 검정된 마커의 메틸화 상태와 상이한 경우, 상기 대상체를 외투 세포 림프종이 있는 것으로 확인하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제97항에 있어서, 복수의 마커를 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제97항에 있어서, 상기 마커는 높은 CpG 밀도 프로모터에 있는, 방법.
- 제97항에 있어서, 상기 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플, 림프샘 조직 샘플, 혈장 샘플 또는 소변 샘플, 방법.
- 제97항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화 특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제96항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함하는, 방법.
- 대상체로부터 얻은 샘플에서 변연부 림프종을 스크리닝하는 방법으로서,
1) 하기 그룹 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계
(i) CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5;
(ii) ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1;
(iii) BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266;
(iv) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5
2) 상기 마커의 메틸화 상태가 림프종이 없는 대상체에서 검정된 마커의 메틸화 상태와 상이한 경우, 상기 대상체를 변연부 림프종이 있는 것으로 확인하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제103항에 있어서, 복수의 마커를 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제103항에 있어서, 상기 마커는 높은 CpG 밀도 프로모터에 있는, 방법.
- 제103항에 있어서, 상기 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플, 림프샘 조직 샘플, 혈장 샘플 또는 소변 샘플, 방법.
- 제103항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화 특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제103항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함하는, 방법.
- 대상체로부터 얻은 샘플에서 말초 T-세포 림프종을 스크리닝하는 방법으로서,
1) 하기 그룹 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는 DNA 메틸화 마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계
(i) CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(ii) GABRG3, ITGA5 및 JUP;
(iii) ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1;
(iv) BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1; 및
(v) CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5
2) 상기 마커의 메틸화 상태가 림프종이 없는 대상체에서 검정된 마커의 메틸화 상태와 상이한 경우, 상기 대상체를 말초 T-세포 림프종이 있는 것으로 확인하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제109항에 있어서, 복수의 마커를 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제109항에 있어서, 상기 마커는 높은 CpG 밀도 프로모터에 있는, 방법.
- 제109항에 있어서, 상기 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플, 림프샘 조직 샘플, 혈장 샘플 또는 소변 샘플, 방법.
- 제109항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화 특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 또는 표적 포획을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제109항에 있어서, 상기 검정은 메틸화 특이적 올리고뉴클레오타이드의 사용을 포함하는, 방법.
- 키트로서,
1) 바이설파이트 시약; 및
2) 표 1 및/또는 표 3의 DMR 1 내지 285로 이루어진 군으로부터 선택되는 DMR로부터의 서열을 포함하며 림프종이 없는 대상체와 관련된 메틸화 상태를 갖는 대조군 핵산
을 포함하는, 키트. - 키트로서, 바이설파이트 시약 및 서열번호 1 내지 124에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.
- 키트로서, 대상체로부터 샘플을 얻기 위한 샘플 수집기; 상기 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 시약; 바이설파이트 시약; 및 서열번호 1 내지 124에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.
- 제117항에 있어서, 상기 샘플은 대변 샘플, 조직 샘플, 림프샘 조직 샘플, 혈장 샘플 또는 소변 샘플인, 키트.
- 조성물로서, DMR을 포함하는 핵산 및 바이설파이트 시약을 포함하는, 조성물.
- 조성물로서, DMR을 포함하는 핵산 및 서열번호 1 내지 124에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물.
- 조성물로서, DMR을 포함하는 핵산 및 메틸화-민감성 제한 효소를 포함하는, 조성물.
- 조성물로서, DMR을 포함하는 핵산 및 폴리머레이스를 포함하는, 조성물.
- 방법으로서,
메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시키는 시약으로 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계; 및
중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화-특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 및 표적 포획에 의해 상기 하나 이상의 유전자의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통해 인간 개체의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하되;
상기 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는 주석을 갖는 염색체 영역을 포함하는, 방법:
ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503(표 2, 실시예 I 참조);
BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조);
BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 4, 실시예 I 참조);
BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조);
ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6(표 6, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503(표 6, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조);
HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1(표 18, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조);
MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1(표 18, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C(표 8, 실시예 I 참조);
BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1(표 14, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 8, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C(표 14, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5(표 9, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조)
BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266(표 9, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조);
GABRG3, ITGA5 및 JUP(표 16, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5(실시예 I 참조); 및
BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1(표 16, 실시예 I 참조).
- 제123항에 있어서, 상기 DNA는 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시키는 시약으로 처리되는, 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 시약은 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제125항에 있어서, 상기 DNA는 바이설파이트 시약으로 처리되어 바이설파이트-처리된 DNA를 생성하는, 방법.
- 제125항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 멀티플렉스 증폭을 포함하는, 방법.
- 제123항에 있어서, 상기 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양을 측정하는 단계는 메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-특이적 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱, 플랩 엔도뉴클레이스 검정, PCR-플랩 검정 및 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제123항에 있어서, 상기 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직) 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제123항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 상기 프라이머 세트는 표 5에 인용되어 있는, 방법.
- 샘플을 특성화하는 방법으로서,
a) 상기 샘플로부터 추출된 DNA에서 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양을 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되는, 상기 측정하는 단계:
ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503(표 2, 실시예 I 참조);
BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조);
BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 4, 실시예 I 참조);
BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조);
ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6(표 6, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503(표 6, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조);
HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1(표 18, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조);
MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1(표 18, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5(실시예 I 참조);
CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C(표 8, 실시예 I 참조);
BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1(표 14, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 8, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C(표 14, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5(표 9, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조);
BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266(표 9, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조);
GABRG3, ITGA5 및 JUP(표 16, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조); 및
BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1(표 16, 실시예 I 참조);
b) 상기 DNA에서 적어도 하나의 참조 마커의 양을 측정하는 단계; 및
c) 상기 DNA에서 측정된 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양에 대한 값을 상기 DNA에서 측정된 참조 마커 유전자의 양의 백분율로 계산하는 단계로서, 상기 값은 상기 샘플에서 측정된 상기 적어도 하나의 메틸화된 마커 DNA의 양을 나타내는, 상기 계산하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제131항에 있어서, 상기 적어도 하나의 참조 마커는 B3GALT6 DNA, ZDHHC1 DNA, β-액틴 DNA 및 비암성 DNA로부터 선택되는 하나 이상의 참조 마커를 포함하는, 방법.
- 제131항에 있어서, 상기 샘플은 혈장 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플(예를 들어, 림프샘 조직) 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제131항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 표 1 및 표 3의 DMR 1 내지 285로 이루어진 군으로부터 선택되는 차별적으로 메틸화된 영역(DMR)의 염기를 포함하는, 방법.
- 제131항에 있어서, 상기 DNA는 메틸화-특이적 방식으로 DNA를 변형시키는 시약으로 처리되는, 방법.
- 제135항에 있어서, 상기 시약은 메틸화-민감성 제한 효소, 메틸화-의존적 제한 효소 및 바이설파이트 시약 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제136항에 있어서, 상기 DNA는 바이설파이트 시약으로 처리되어 바이설파이트-처리된 DNA를 생성하는, 방법.
- 제135항에 있어서, 상기 변형된 DNA는 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트를 사용하여 증폭되는, 방법.
- 제138항에 있어서, 상기 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 프라이머 세트는 표 5에 인용되어 있는, 방법.
- 제131항에 있어서, 메틸화된 마커 유전자의 양을 측정하는 단계는 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱, 질량 분석법, 메틸화-특이적 뉴클레이스, 질량-기반 분리 및 표적 포획 중 하나 이상을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제140항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 멀티플렉스 증폭을 포함하는, 방법.
- 제140항에 있어서, 상기 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양을 측정하는 단계는 메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-특이적 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱, 플랩 엔도뉴클레이스 검정, PCR-플랩 검정 및 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
- 생물학적 샘플을 특성화하는 방법으로서,
상기 생물학적 샘플로부터 추출된 DNA에서 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자의 양을 측정하는 단계를 포함하되, 상기 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되고:
ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503(표 2, 실시예 I 참조);
BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조);
BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 4, 실시예 I 참조);
BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조);
ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6(표 6, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503(표 6, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5(실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조);
HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1(표 18, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조);
MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1(표 18, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C(표 8, 실시예 I 참조);
BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1(표 14, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 8, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C(표 14, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5(표 9, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조)
BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266(표 9, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조);
GABRG3, ITGA5 및 JUP(표 16, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조); 및
BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1(표 16, 실시예 I 참조);
바이설파이트로 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
각각의 마커 유전자에 대한 CpG 부위에 특이적인 프라이머를 사용하여 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계로서, 상기 각각의 마커 유전자에 특이적인 프라이머는 표 5에 인용된 마커 유전자에 대한 프라이머 서열에 의해 결합된 앰플리콘에 결합할 수 있고, 상기 표 5에 인용된 마커 유전자에 대한 프라이머 서열에 의해 결합된 앰플리콘은 표 1 및/또는 표 3에 인용된 마커 유전자에 대한 유전자 영역의 적어도 일부인, 상기 증폭시키는 단계;
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 하나 이상의 유전자에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제143항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플 또는 조직 샘플인, 방법.
- 제144항에 있어서, 상기 조직은 림프샘 조직인, 방법.
- 제143항에 있어서, 상기 CpG 부위는 코딩 영역 또는 조절 영역에 존재하는, 방법.
- 생물학적 샘플로부터 추출된 DNA에서 적어도 하나의 메틸화된 마커 유전자에서 하나 이상의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 유전자는 다음 그룹 중 하나로부터 선택되고:
ADRA1D, DNAH14_A, FAM110B, FAM221A, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644047-184644181, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805123-19805338, MNX1, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, VWA5B1 및 ZNF503(표 2, 실시예 I 참조);
BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조);
BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FOXP4, ITGA5, JUP, MAX.chr1.61508719-61508998, MAX.chr3.44038141-44038266, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 4, 실시예 I 참조);
BNC1_B, ADRA1D, HOXA9, GABRG3, MAX.chr17:79367190-79367336, FAM110B, TPBG_C, SYT6, MAX.chr6.19805123-19805338 및 CACNG8_B(표 11, 실시예 I 참조);
ADRA1D, CACNG_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4 및 SYT6(표 6, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, HOXA9, ITGA5, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, TPBG_C, VWA5B1 및 ZNF503(표 6, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CDK20_A, DNAH14_A, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1 및 TPBG_C(표 12, 실시예 I 참조);
HOXA9, CDK20_B, BNC1_B, DNAH14_B, NRN1_B, SYT2 및 CALN1(표 18, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, ADRA1D, TGFB1I1, FAM110B_A, GABRG3, VWA5B1 및 ITGA5(실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, EBF3_B, FAM110B, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, DNAH14_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, GATA6, HOXA9, ITGA5, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 7, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, EBF3_B, FAM110B, FLRT2, GABRG3, GATA6, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr5:74349626-74349841, MAX.chr6.19805195-19805266, NRN1_A, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1, THBS1, TPBG_C 및 ZNF503(표 13, 실시예 I 참조);
MAX.chr5:74349626-74349841, HOXA9, BNC1_B, NRN1_B, TPBG_D, SYT2 및 CALN1(표 18, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, FAM110B, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr4.184644069-184644158 및 TPBG_C(표 8, 실시예 I 참조);
BNC1_B, FAM110B, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158 및 MNX1(표 14, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FAM110B, GABRG3, HOXA9, MAX.chr1:61508832-61508969, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MAX.chr6.19805195-19805266, MNX1, NRN1_A, SYT6, TPBG_C 및 ZNF503(표 8, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, FOXP4, HOXA9, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr4.184644069-184644158, MNX1, NRN1_A 및 TPBG_C(표 14, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, FAM110B, GABRG3 및 ITGA5(표 9, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조)
BNC1_B, CACNG8_B, FAM110B, GABRG3, HOXA9, ITGA5 및 MAX.chr6.19805195-19805266(표 9, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, CDK20_A, FOXP4, GABRG3, HOXA9, MAX.chr5:74349626-74349841, NRN1_A, SH3BP4 및 THBS1(표 15, 실시예 I 참조);
CACNG8_B, FOXP4, GABRG3, ITGA5, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조);
GABRG3, ITGA5 및 JUP(표 16, 실시예 I 참조);
ADRA1D, BNC1_B, CACNG8_B, FLRT2, FOXP4, GABRG3, HOXA9, ITGA5, JUP, MAX.chr17:79367190-79367336, MAX.chr6.19805195-19805266, SH3BP4, SYT6, TGFB1I1 및 VWA5B1(표 10, 실시예 I 참조); 및
BNC1_B, FOXP4, ITGA5, SH3BP4, SYT6 및 TGFB1I1(표 16, 실시예 I 참조);
a) 신생물이 있거나 또는 있는 것으로 의심되는 인간 개체의 생물학적 샘플로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계로서, 상기 신생물은 NHL 또는 NHL의 하위유형인, 상기 추출하는 단계;
b) 바이설파이트로 상기 추출된 게놈 DNA를 처리하는 단계,
c) 하나 이상의 유전자에 특이적인 프라이머로 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계로서, 상기 하나 이상의 유전자에 특이적인 프라이머는 표 1 및/또는 표 3에 인용된 마커에 대한 염색체 영역에 대한 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA의 적어도 일부에 결합할 수 있는, 상기 증폭시키는 단계; 및
d) 메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화 민감한 DNA 제한 효소 분석 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 상기 하나 이상의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계
를 포함하는, 방법. - 생물학적 샘플을 특성화하는 방법으로서,
바이설파이트로 상기 생물학적 샘플 내의 게놈 DNA를 처리하는 단계;
표 1 및/또는 표 3에 나타낸 하나 이상의 마커에 특이적인 프라이머를 사용하여 상기 바이설파이트-처리된 게놈 DNA를 증폭시키는 단계, 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 각각의 마커에 대해 특이적인 상기 프라이머는 표 5에 나타낸 각각의 프라이머 쌍 서열에 의해 결합된 앰플리콘에 결합할 수 있고, 상기 표 5에 나타낸 각각의 프라이머 쌍 서열에 의해 결합된 앰플리콘은 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 각각의 염색체 좌표를 포함하는 유전자 영역의 적어도 일부인, 상기 증폭시키는 단계;
메틸화-특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR, 메틸화-민감성 DNA 제한 효소 분석, 정량적 바이설파이트 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 PCR에 의해 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 마커에 대해 상기 CpG 부위의 메틸화 수준을 결정하는 단계
를 통해, 인간 개체의 생물학적 샘플에서 표 1 및/또는 표 3에 나타낸 마커 중 하나 이상에 대한 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
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