ES2264165T3 - Deteccion especifica de metilacion. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PCR, PCR ESPECIFICO DE LA METILACION (MSP), PARA LA IDENTIFICACION RAPIDA DE MODELOS DE METILACION DE ADN EN UN ACIDO NUCLEICO QUE CONTIENE CPG. LA MSP UTILIZA LA REACCION DE PCR MISMA PARA DISTINGUIR ENTRE EL ADN METILADO Y EL ADN NO METILADO, LO QUE AÑADE UNA SENSIBILIDAD MEJORADA DE DETECCION DE LA METILACION.

Description

Detección específica de metilación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a la regulación de la expresión génica, y más específicamente a un procedimiento para determinar el estado de metilación del ADN de los sitios CpG en un locus dado.

Antecedentes de la invención

En los eucariotas superiores el ADN está metilado únicamente en las citosinas ubicadas en 5' con respecto a guanosina en el dinucleótido CpG. Esta modificación tiene importantes efectos reguladores sobre la expresión génica, especialmente cuando implica áreas ricas en CpG, conocidas como islas de CpG, ubicadas en las regiones promotoras de muchos genes. Mientras que prácticamente todas las islas asociadas a genes están protegidas de la metilación en cromosomas autosómicos, una metilación extensiva de las islas de CpG se ha asociado con una inactivación de la transcripción de los genes marcados seleccionados y de los genes del cromosoma inactivo X femenino. La metilación aberrante de islas de CpG normalmente desmetiladas se ha descrito como un evento frecuente en células inmortalizadas y transformadas, y se ha asociado con la inactivación de la transcripción de genes supresores tumorales definidos en cánceres humanos.

Las células cancerosas humanas contienen típicamente genomas alterados somáticamente, caracterizados por una mutación, amplificación o deleción de genes críticos. Además, el ADN molde de las células cancerosas humanas a menudo muestra cambios somáticos en la metilación del ADN (E. R. Fearon, y col., Cell, 61: 759, 1990; P. A. Jones, y col., Cancer Res., 46: 461, 1986; R. Holliday, Science, 238: 163, 1987; A. De Bustros, y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 85: 5693, 1988); P. A. Jones, y col., Adv. Cancer Res., 54: 1, 1990; S. B. Baylin, y col.; Cancer Cells, 3: 383, 1991; M. Makos, y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 89: 1929, 1992; N. Ohtani-Fujita, y col., Oncogene, 8: 1063, 1993). Sin embargo, el papel preciso de una metilación anormal del ADN en la oncogénesis humana no se ha establecido. Las metilasas de ADN transfieren grupos metilo desde el donante universal de metilo S-adenosilmetionina a sitios específicos en el ADN. Se han atribuido varias funciones biológicas a las bases metiladas en el ADN. La función biológica más establecida es la protección del ADN de la digestión por parte de enzimas de restricción análogas. El fenómeno de modificación de la restricción se ha observado, hasta la fecha, únicamente en bacterias. Sin embargo, las células de mamíferos poseen una metilasa diferente que metila exclusivamente residuos de citosina en el ADN que son vecinos en 5' de guanina (CpG). Mediante varias líneas de prueba se ha demostrado que esta metilación juega un papel en la actividad de los genes, la diferenciación celular, la oncogénesis, la inactivación del cromosoma x, el marcado genómico y otros procesos biológicos principales (Razin, A. H. y Riggs, R. D. eds. en DNA Metilación Biochemistry and Biological Significance, Springer-Verlag, Nueva York, 1984).

Recientemente se ha identificado una región rica en CpG, o "isla de CpG", en 17p13.3, que está aberrantemente hipermetilada en múltiples tipos habituales de cánceres humanos (Makos, M., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89: 1929, 1992; Makos, M., y col., Cancer Res., 53: 2715, 1993; Makos, M., y col., Cancer Res. 53: 2719, 1993). Esta hipermetilación coincide con el tiempo y la frecuencia de pérdidas 17p y mutaciones p53 en cánceres de cerebro, colon y riñón. La transcripción de un gen silencioso asociada con la hipermetilación de la normalmente desmetilada región promotora de las islas de CpG se ha implicado como un mecanismo alternativo de mutaciones de regiones codificantes para la inactivación de genes supresores tumorales (Baylin, S. B., y col., Cancer Cells, 3: 383, 1991; Jones, P. A. y Buckley, J. D., Adv. Cancer Res., 58: 1-23, 1990). Este cambio se ha asociado ahora con la pérdida de la expresión del VHL, un gen supresor tumoral del cáncer renal en 3p (J. G. Herman, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 91: 9700-9704, 1994), el gen de receptor de estrógeno en 6q (Ottaviano, Y. L., y col., Cancer Res., 54: 2552, 1994) y el gen H19 en llp (Steenman, M. J. C., y col., Nature Genetics, 7: 433, 1994).

En células eucariotas, la metilación de residuos de citosina que están inmediatamente en 5' de una guanosina, se produce predominantemente en regiones pobres en CG (Bird, A., Nature, 321: 209, 1986). Por el contrario, las regiones aisladas de dinucleótidos CG denominadas islas de CpG permanecen desmetiladas en células normales, excepto durante la inactivación del cromosoma X (Migeon, y col., supra) y el marcado específico parental (Li, y col., Nature, 366: 362, 1993) donde la metilación de las regiones reguladoras en 5' puede dar lugar a una represión de la transcripción. La metilación de novo del gen Rb ha sido demostrada en una pequeña fracción de retinoblastomas (Sakai, y col., Am. J. Hum. Genet., 48: 880, 1991), y recientemente, un análisis más detallado del gen VHL mostró una metilación aberrante en un subconjunto de carcinomas esporádicos de células renales (Herman, y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 91: 9700, 1994). La expresión de un gen supresor tumoral también puede ser abolida mediante la metilación de novo del ADN de una isla de CpG normalmente desmetilada en 5' (Issa, y col., Nature Genet., 7: 536, 1994; Herman, y col., supra; Merlo, y col., Nature Med., 1: 686, 1995; Herman, y col., Cancer Res., 56: 722, 1996; Graff, y col., Cancer Res., 55: 5195, 1995; Herman, y col., Cancer Res., 55: 4525, 1995).

La mayoría de los procedimientos desarrollados hasta la fecha para la detección de citosinas metiladas dependen de la escisión del enlace fosfodiéster junto a residuos de citosina, usando bien enzimas de restricción sensibles a la metilación o bien reactivos químicos tales como la hidracina, que diferencian entre la citosina y su derivado 5-metilo. El uso de enzimas sensibles a la metilación adolece del inconveniente de que no es de una aplicabilidad general, dado que sólo puede ser analizada una proporción limitada de los sitios potencialmente metilados en el genoma. Los protocolos de secuenciación genómica que identifican un residuo 5-MeC en el ADN genómico como un sitio que no es escindido por ninguna de las reacciones de secuenciación de Maxam Gilbert son una mejora sustancial sobre el procedimiento de secuenciación genómica original, pero todavía adolecen de inconvenientes tales como requerir una gran cantidad de ADN genómico y la dificultad para detectar un hueco en una escalera de secuenciación que pudiera contener bandas de intensidad variable.

El cartografiado de regiones metiladas en el ADN se ha basado principalmente en metodologías de hibridación Southern, basada en la incapacidad de las enzimas de restricción sensibles a la metilación de escindir secuencias que contienen uno o más sitios CpG metilados. Este procedimiento proporciona una valoración del estado de metilación global de las islas de CpG, incluyendo algún análisis cuantitativo, pero es relativamente insensible, requiere grandes cantidades de ADN de alto peso molecular y sólo proporciona información sobre aquellos sitios de CpG encontrados en las secuencias reconocidos por las enzimas de restricción sensibles a la metilación. Un procedimiento más sensible para detectar patrones de metilación combina el uso de enzimas sensibles a la metilación y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tras la digestión del ADN con la enzima, la PCR amplificará desde los cebadores que flanquean el sitio de restricción únicamente si la escisión del ADN ha sido evitada mediante metilación. Al igual que las metodologías basadas en Southern, este procedimiento sólo puede monitorizar la metilación de CpG en sitios de restricción sensibles a la metilación. Además, la restricción del ADN desmetilado debe ser completa, dado que cualquier ADN no escindido será amplificado mediante la PCR dando un resultado falso positivo para la metilación. Esta metodología ha sido útil para estudiar muestras en las que están metilados un alto porcentaje de alelos de interés, tales como el estudio de genes marcados y de genes inactivados del cromosoma X. Sin embargo, las dificultades para distinguir entre la restricción incompleta y un bajo número de alelos metilados hacen que esta metodología sea poco fiable para la detección de hipermetilación en genes supresores tumorales en nuestras pequeñas en las que los alelos metilados representan una pequeña fracción de la población.

Otro procedimiento que evita el uso de endonucleasas de restricción utiliza un tratamiento con bisulfito del ADN para convertir todas las citosinas desmetiladas en uracilos. El ADN alterado es amplificado y secuenciado para mostrar el estado de metilación de todos los sitios CpG. Sin embargo, este procedimiento es técnicamente difícil, requiere un trabajo intenso y, sin la clonación de los productos amplificados, es menos sensible que el análisis Southern, requiriendo la metilación de aproximadamente el 10% de los alelos para la detección.

La identificación de los cambios genéticos más tempranos en la oncogénesis es un asunto primordial en la investigación de cáncer molecular. Las metodologías diagnósticas basadas en la identificación de estos cambios permitirán probablemente la implementación de estrategias tempranas de detección y nuevas metodologías terapéuticas dirigidas a estos cambios tempranos podrían dar como resultado un tratamiento más eficaz del cáncer.

Resumen de la invención

El cartografiado preciso de los patrones de metilación del ADN en las islas de CpG ha resultado esencial para comprender diversos procesos biológicos, tales como la regulación de los genes marcados, la inactivación del cromosoma X y el silenciamiento de los genes supresores tumorales, en el cáncer humano. La presente invención proporciona un procedimiento para una rápida valoración del estado de metilación de cualquier grupo de sitios CpG en una isla de CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación. A pesar del conocimiento de los expertos en la materia relativo al uso de la PCR y al uso de la modificación con bisulfito, independientemente, hasta la presente invención, nadie había preparado cebadores que fueran específicos para la reacción de bisulfito, de forma que la propia reacción de PCR se usara para distinguir entre los ADN metilados modificados químicamente y los desmetilados.

El procedimiento de la invención incluye la modificación del ADN mediante bisulfito sódico o un agente comparable que convierte todas las citosinas desmetiladas pero no metiladas en uracilo, y la posterior amplificación con cebadores específicos para los ADN metilados frente a los desmetilados. Este procedimiento de "PCR específica de metilación" o MSP, requiere únicamente pequeñas cantidades de ADN, es sensible al 0,1% de los alelos metilados de un locus dado de una isla de CpG, y puede realizarse sobre, por ejemplo, ADN extraído a partir de muestras incluidas en parafina. La MSP elimina los resultados falsos positivos inherentes a las metodologías previas basadas en PCR que se apoyaban en la escisión diferencial con enzimas de restricción para distinguir entre el ADN metilado y el desmetilado.

En un aspecto particular de la invención, la MSP es útil para identificar cambios por hipermetilación en la región promotora asociados con una inactivación de la transcripción en genes supresores tumorales, por ejemplo, p16, p15, E-cadherina y VHL, en neoplasias humanas. Otros genes de los que se demuestra que están metilados incluyen el receptor de estrógeno, MDGI, GST-pi, calcitonina, HIC-1, receptor de la endotelina B, TIMP-2, 06-MGMT, MLH1, MSH2 y GFAP. De éstos, el receptor de estrógeno, MDGI, GST-pi, calcitonina, HIC-1, el receptor de la endotelina B, TIMP-2, 06-MGMT y MLH1 se demostró mediante MSP que estaban hipermetilados en tejido neoplásico en comparación con tejido normal. Por primera vez, la invención proporciona pruebas de que el TIMP-2, un inhibidor tisular de metaloproteinasas, está hipermetilado en tejido neoplásico en comparación con tejido
normal.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuenciación genómica de p16. La secuencia mostrada tiene la mayoría de la región 5' en la base del gel, comenzando en +175 con respecto al sitio de inicio de la transcripción principal (Hara, y col., Mol. Cell Biol., 16: 859, 1996). Todas las citosinas de la línea celular desmetilada H249 han sido convertidas en timidinas, mientras que todas las C de los dinucleótidos CpG de la célula H157 metilada permanecen como C, indicativo de la metilación. El ] englobaba un sitio BstUI que está a -59 con respecto al sitio de inicio de la traducción en la secuencia del Genbank U12818 (Hussussian, y col., Nat. Genet., 8: 15, 1994), pero que está definido incorrectamente como CGCA en la secuencia X94154 (Hara, y col., supra). Este sitio CGCG representa la ubicación 3' del cebador sentido usado para la MSP de p16.

En la Figura 2, los paneles A-E, muestran geles de poliacrilamida con los productos de la PCR Específica de Metilación de p16. Los conjuntos de cebadores usados para la amplificación se designan como desmetilados (U), metilados (M) o no modificados/naturales (W). El * designa el marcador de peso molecular del digerido molecular pBR322-MspI. El panel A muestra la amplificación del ADN tratado con bisulfito a partir de linfocitos de líneas celulares cancerosas y normales, y ADN no tratado (de la línea celular H249). El panel B muestra la mezcla de varias cantidades de ADN de H157 con 1 \mug de ADN de H249 antes del tratamiento con bisulfito para valorar la sensibilidad de detección de la MSP para los alelos metilados. También se muestra el ADN modificado a partir de una muestra de cáncer de pulmón primario y de un pulmón normal. El panel C muestra la amplificación con los cebadores pl6-U2 (U) y pl6-M2 (M) descritos en la Tabla 1. El panel D muestra los productos de p16 del panel C amplificados restringidos con BstUI (+) o no restringidos (-). El panel E muestra los resultados de la prueba de una metilación regional de islas de CpG con MSP, usando los cebadores sentido p16-U2 (U) y p16-M2 (M), que son específicos de metilación, y un cebador antisentido que no es específico de metilación.

En la Figura 3, los paneles A-E muestran geles de poliacrilamida de los productos de la MSP procedentes del análisis de varios genes. Los conjuntos de cebadores usados para la amplificación no están designados como desmetilados (U), metilados (M) o no modificados/naturales (W). El * designa el marcador de peso molecular del digerido pBR322-MspI y los ** designan el marcador de peso molecular de 123 pb. Todas las muestras de ADN se trataron con bisulfito excepto las designadas como no tratadas. El panel A muestra los resultados de la MSP para p15. El panel B muestra los productos de p15 restringidos con BstUI (+) o no restringidos (-). El panel C muestra los productos de la MSP para VHL. El panel D muestra los productos de VHL restringidos con BstUI (+) o no restringidos (-). El panel E muestra los productos de la MSP para la E-cadherina.

Descripción de las formas de realización preferidas

La presente invención proporciona una PCR específica de metilación (MSP) para la identificación de patrones de metilación en el ADN. La MSP usa la propia reacción de PCR para distinguir entre ADN modificado metilado y desmetilado, lo que aporta una sensibilidad mejorada en la detección de la metilación.

Al contrario que los procedimientos de secuenciación genómica previos para la identificación de la metilación, que utilizan cebadores de amplificación que están diseñados específicamente para evitar las secuencias de CpG, los propios cebadores de la MSP están diseñados específicamente para reconocer los sitios CpG para aprovecharse de las diferencias en la metilación para amplificar productos específicos para ser identificados mediante el ensayo de la invención.

Según se ilustra en los Ejemplos a continuación, la MSP proporciona unas ventajas significativas sobre otras PCR y otros procedimientos anteriores usados para los ensayos de metilación. La MSP es notablemente más sensible que los análisis Southern, facilitando la detección de bajas cifras de alelos metilados del estudio de ADN a partir de muestras pequeñas. La MSP permite el estudio de materiales incluidos en parafina, que no podían ser analizados previamente mediante un análisis Southern. La MSP también permite el examen de todos los sitios CpG, no sólo de aquellos en las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción sensibles a la metilación. Esto aumenta notablemente el número de tales sitios que pueden ser evaluados, y permitirá un rápido y fino cartografiado de los patrones de metilación a lo largo de todas las regiones ricas en CpG. La MSP también elimina los frecuentes resultados falsos positivos debido a la digestión parcial por enzimas sensibles a la metilación, inherentes a previos procedimientos de PCR para detectar la metilación. Adicionalmente con la MSP, la detección simultánea de productos desmetilados y metilados en una única muestra confirma la integridad del ADN como molde para la PCR y permite una valoración semicuantitativa de los tipos de alelo que se correlaciona con los resultados del análisis Southern. Finalmente, la capacidad de validar el producto amplificado mediante patrones de restricción diferencial es una ventaja adicional.

La única técnica que puede proporcionar un análisis más directo que la MSP para la mayoría de los sitios CpG en una región definida es una secuenciación genómica. Sin embargo, la MSP puede proporcionar una información similar y tiene las siguientes ventajas.

En primer lugar, la MSP es mucho más simple y requiere menos que la secuenciación genómica, tardando una PCR y un análisis en gel típico 4-6 horas. Por el contrario, la secuenciación genómica, la amplificación, la clonación y la posterior secuenciación pueden tardar días. La MSP también evita el uso de caros reactivos de secuenciación y el uso de radioactividad. Estos dos factores hacen que la MSP sea más adecuada para el análisis de un gran número de muestras. En tercer lugar, el uso de la PCR como la etapa para distinguir entre ADN metilado y desmetilado en la MSP permite un significativo aumento en la sensibilidad de detección de la metilación. Por ejemplo, si no se usa una clonación antes de la secuenciación genómica del ADN, no puede verse menos del 10% del ADN metilado en un trasfondo de ADN desmetilado (Myohanen, y col., supra). El uso de la PCR y la clonación permite una detección sensible de los patrones de metilación en cantidades muy pequeñas de ADN mediante secuenciación genómica (Frommer, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89: 1827, 1992; Clark, y col., Nucleic Acids Research, 22: 2990, 1994). Sin embargo, esto significa en la práctica que se requeriría un análisis de secuenciación de 10 clones para detectar un 10% de metilación, de 100 para detectar un 1% de metilación, y para alcanzar el nivel de sensibilidad que hemos demostrado con la MSP (1:1000), habría que se secuenciar 1000 clones individuales.

En una primera forma de realización, la invención proporciona un procedimiento para detectar un ácido nucleico que contiene CpG metilado, incluyendo el procedimiento poner en contacto un espécimen que contiene el ácido nucleico con un agente que modifique la citosina desmetilada, amplificar el ácido nucleico que contiene el CpG en el espécimen mediante cebadores oligonucleotídicos específicos del CpG, en el que los cebadores oligonucleotídicos distinguen entre un ácido nucleico modificado metilado y no metilado, y detectar el ácido nucleico metilado. Se entiende que mientras que la etapa de amplificación es opcional, es deseable en el procedimiento preferido de la invención. El procedimiento de la invención se basa en la propia reacción de PCR para distinguir entre ADN modificado (por ejemplo, modificado químicamente) metilado y desmetilado.

El término "modifica" según se usa en este documento significa la conversión de una citosina desmetilada en otro nucleótido que distinguirá a la citosina desmetilada de la metilada. Preferiblemente, el agente modifica la citosina desmetilada en uracilo. Preferiblemente, el agente usado para modificar la citosina desmetilada es bisulfito sódico, sin embargo, también pueden usarse otros agentes que modifiquen de forma similar la citosina desmetilada, pero no la citosina metilada, en el procedimiento de la invención. El bisulfito sódico (NaHSO_{3}) reacciona fácilmente con el doble enlace 5,6 de la citosina, pero débilmente con la citosina metilada. La citosina reacciona con el ión bisulfito para formar un intermedio de reacción de citosina sulfonatada que es susceptible de una desaminación, dando lugar a un uracilo sulfonatado. El grupo sulfonato puede eliminarse en condiciones alcalinas, dando como resultado la formación del uracilo. El uracilo es reconocido como una timina por la polimerasa Taq, y por lo tanto, tras la PCR, el producto resultante contiene citosina únicamente en la posición en la que aparece la 5-metilcitosina en el ADN molde de partida.

Los cebadores usados en la invención para la amplificación del ácido nucleico que contiene el CpG en el espécimen, tras la modificación con bisulfito, distinguen especialmente entre ADN no tratado o no modificado, metilado y no metilado. Los cebadores de la MSP para el ADN no metilado tienen preferiblemente una T en el par CG 3' para distinguirla de la C retenida en el ADN metilado, y el complementario está diseñado para el cebador antisentido. Los cebadores de la MSP habitualmente contienen relativamente pocas C o G en la secuencia dado que las C estarán ausentes en el cebador sentido y las G ausentes en el cebador antisentido (la C se modifica a U (uracilo) que está amplificado como T (timidina) en el producto de amplificación).

Los cebadores de la invención abarcan oligonucleótidos de una longitud suficiente con una secuencia apropiada, de forma que proporcionen una iniciación específica de la polimerización en un número significativo de ácidos nucleicos en el locus polimórfico. Específicamente, el término "cebador" según se usa en este documento, se refiere a una secuencia que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres, y muy preferiblemente más de 8, secuencia que es capaz de iniciar la síntesis de un producto de extensión del cebador, que es sustancialmente complementario de una hebra de un locus polimórfico. Las condiciones ambientales que conducen a la síntesis incluyen la presencia de trifosfatos de nucleósidos y un agente para la polimerización, tal como una polimerasa de ADN, y una temperatura y un pH adecuados. El cebador es preferiblemente monocatenario, para la máxima eficacia de amplificación, pero puede ser bicatenario. Si es bicatenario, el cebador se trata en primer lugar para separar sus hebras antes de ser usado para preparar los productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser lo suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor de la polimerización. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo la temperatura, el tampón y la composición del nucleótido. El cebador oligonucleotídico contiene típicamente 12-20 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.

Los cebadores de la invención están diseñados para ser "sustancialmente" complementarios de la hebra del locus genómico que se va a amplificar, que incluyen los nucleótidos G o C apropiados según se discutió anteriormente. Esto significa que los cebadores deben ser lo suficientemente complementarios como para hibridar con sus respectivas hebras en condiciones que permitan actuar al agente de polimerización. En otras palabras, los cebadores deben ser lo suficientemente complementarios de las secuencias flanqueantes 5' y 3' como para hibridar con ellas y permitir la amplificación del locus genómico. Aunque en las SEQ ID NO: 105-208, se proporcionan algunos ejemplos de cebadores, se entiende que cualquier cebador que hibride con las secuencias objetivos de la SEQ ID NO: 1-104 está incluido en la invención y es útil en el procedimiento de la invención para detectar ácidos nucleicos metilados, según se describe.

Los cebadores oligonucleotídicos de la invención se emplean en el proceso de amplificación, que es una reacción enzimática en cadena que produce cantidades exponenciales del locus objetivo en relación con el número de etapas de reacción indicadas. Típicamente, un cebador es complementario de la hebra negativa (-) del locus y el otro es complementario de la hebra positiva (+). El apareamiento de los cebadores con el ácido nucleico desnaturalizado, seguido de la extensión con una enzima, tal como el fragmento grande de la polimerasa I de ADN (Klenow) y nucleótidos, da como resultado unas hebras + y - recién sintetizadas que contienen la secuencia del locus objetivo. Como estas hebras recién sintetizadas también son moldes, repetidos ciclos de desnaturalización, apareamiento de los cebadores y extensión, dan como resultado una producción exponencial de la región (es decir, la secuencia del locus objetivo) definida por el cebador. El producto de la reacción en cadena es un ácido nucleico dúplex aislado cuyos extremos se corresponden con los extremos de los cebadores específicos empleados.

Los cebadores oligonucleotídicos de la invención pueden prepararse usando cualquier procedimiento adecuado, tal como procedimientos convencionales de fosfotriéster y fosfodiéster o formas de realización automatizadas de los mismos. En una de dichas formas de realización automatizadas se usan las dietilfosforamiditas como materiales de partida y pueden sintetizarse según describen Beaucage, y col. (Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862, 1981). Un procedimiento para sintetizar oligonucleótidos sobre un soporte sólido modificado se describe en la patente de EE.UU. nº 4.458.066.

Cualquier espécimen de ácido nucleico, en una forma purificada o no purificada, puede utilizarse como el ácido o ácidos nucleicos de partida, siempre que contenga, o se sospeche que contenga, la secuencia de ácido nucleico específica que contiene el locus objetivo (por ejemplo, CpG). Por lo tanto, el proceso puede emplear, por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo ARN mensajero, en el que el ADN o el ARN puede ser monocatenario o bicatenario. En el caso de que se use ARN como molde, se utilizarían las enzimas y/o las condiciones óptimas para la transcripción inversa del molde en ADN. Además, puede utilizarse un híbrido de ADN-ARN que contenga una hebra de cada uno. También puede emplearse una mezcla de ácidos nucleicos, o pueden utilizarse los ácidos nucleicos producidos en reacciones de amplificación previas en este documento, usando los mismos cebadores o diferentes. La secuencia específica de ácido nucleico que se va a amplificar, es decir, el locus objetivo, puede ser una fracción de una molécula mayor o puede estar presente inicialmente como una molécula aislada, de forma que la secuencia específica constituye el ácido nucleico completo. No es necesario que la secuencia que se va a amplificar esté presente inicialmente en una forma pura; puede ser una fracción menor de una mezcla compleja, tal como contenida en ADN humano completo.

El espécimen que contiene el ácido nucleico utilizado para la detección del CpG metilado puede proceder de cualquier fuente, incluyendo tejido del cerebro, del colon, urogenital, hematopoyético, del timo, testicular, ovárico, uterino, prostático, de mama, del colon, pulmonar y renal, y puede extraerse mediante una variedad de técnicas, tales como las descritas por Maniatis, y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, págs. 280, 281, 1982).

Si la muestra extraída es impura (por ejemplo, plasma, suero, heces, eyaculado, esputo, saliva, líquido cefalorraquídeo o sangre, o una muestra incluida en parafina), puede ser tratada antes de la amplificación con una cantidad de un reactivo eficaz para abrir las células, fluidos, tejidos o membranas de células animales de la muestra, y para exponer y/o separar la(s) hebra(s) del (los) ácido(s) nucleico(s). Esta etapa de lisado y desnaturalización del ácido nucleico para exponer y separar las hebras permitirá que la amplificación se produzca mucho más fácilmente.

Cuando la secuencia de ácido nucleico objetivo de la muestra contiene dos hebras, es necesario separar las hebras del ácido nucleico antes de que pueda ser usado como molde. La separación de las hebras puede efectuarse bien como una etapa separada o simultáneamente junto con la síntesis de los productos de extensión del cebador. Esta separación de las hebras puede conseguirse usando varias condiciones de desnaturalización adecuadas, incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos, la palabra "desnaturalización" incluye todos estos medios. Un procedimiento físico para separar las hebras del ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que esté desnaturalizado. Una desnaturalización térmica típica puede implicar temperaturas que varían desde aproximadamente 80° hasta 105°C durante unos tiempos que varían desde aproximadamente 1 hasta 10 minutos. La separación de las hebras también puede inducirse mediante una enzima de la clase de enzimas conocidas como helicasas o mediante la enzima RecA, que tiene actividad de helicasa, y en presencia de riboATP, se sabe que desnaturaliza el ADN. Las condiciones de reacción adecuadas para la separación de hebras de ácidos nucleicos con helicasas son descritas por Kuhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative Biology, 43: 63, 1978) y las técnicas para usar la RecA son examinadas en C. Radding (Ann. Rev. Genetics, 16: 405-437, 1982).

Cuando se separan las hebras complementarias del ácido o ácidos nucleicos, independientemente de si el ácido nucleico era originalmente mono o bicatenario, las hebras separadas están listas para ser usadas como molde para la síntesis de hebras de ácido nucleico adicionales. Esta síntesis se realiza en unas condiciones que permiten que se produzca la hibridación de los cebadores con los moldes. Generalmente la síntesis se produce en una disolución acuosa tamponada, preferiblemente a un pH de 7-9, muy preferiblemente de aproximadamente 8. Preferiblemente, se añade un exceso molar (para un ácido nucleico genómico, habitualmente de aproximadamente 106:1 cebador:molde) de los dos cebadores oligonucleotídicos al tampón que contiene las hebras molde separadas. Sin embargo, se entiende que la cantidad de hebra complementaria puede no ser conocida si el proceso de la invención se usa para aplicaciones diagnósticas, de forma que la cantidad de cebador con respecto a la cantidad de hebra complementaria no puede ser determinada con certeza. Como un aspecto práctico, sin embargo, la cantidad de cebadores añadida estará generalmente en un exceso molar sobre la cantidad de hebra complementaria (molde) cuando la secuencia que se va a amplificar está contenida en una mezcla de complicadas hebras de ácidos nucleicos de cadena larga. Se prefiere un gran exceso molar para mejorar la eficacia del proceso.

Los trifosfatos de desoxirribonucleósidos dATP, dCTP, dGTP y dTTP se añaden a la mezcla de síntesis, bien por separado o bien junto con los cebadores, en cantidades adecuadas, y la disolución resultante se calienta hasta aproximadamente 90°-100°C durante aproximadamente entre 1 y 10 minutos, preferiblemente entre 1 y 4 minutos. Después de este período de calentamiento la disolución se deja enfriar hasta la temperatura ambiente, lo que es preferible para la hibridación de los cebadores. A la mezcla enfriada se añade un agente apropiado para efectuar la reacción de extensión de los cebadores (denominado en este documento "agente de polimerización"), y se deja producir la reacción en las condiciones conocidas en la materia. El agente de polimerización también puede añadirse junto con los demás reactivos si es termoestable. Esta reacción de síntesis (o amplificación) puede producirse desde la temperatura ambiente hasta una temperatura por encima de la cual el agente de polimerización ya no actúa. Por lo tanto, por ejemplo, si se usa polimerasa de ADN como agente, la temperatura generalmente no es mayor de aproximadamente 40°C. Muy convenientemente, la reacción se produce a temperatura ambiente.

El agente de polimerización puede ser cualquier compuesto o sistema que funcione para conseguir la síntesis de los productos de extensión del cebador, incluyendo enzimas.

Algunas enzimas adecuadas para este propósito incluyen, por ejemplo, la ADN polimerasa I de E. coli, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli, la ADN polimerasa T4, otras ADN polimerasas disponibles, muteínas de polimerasa, transcriptasa inversa y otras enzimas, incluyendo enzimas termoestables (es decir, aquellas enzimas que realizan la extensión del cebador después de haber sido sometidas a unas temperaturas lo suficientemente elevadas como para provocar la desnaturalización). Las enzimas adecuadas facilitarán la combinación de los nucleótidos de la forma adecuada para formar los productos de extensión del cebador que son complementarios de cada locus de la hebra de ácido nucleico. Generalmente, la síntesis comenzará en el extremo 3' de cada cebador y continuará en la dirección 5' a lo largo de la hebra molde, hasta que la síntesis termine, produciendo moléculas de diferentes longitudes. Sin embargo, puede haber agentes de polimerización que inicien la síntesis en el extremo 5' y continúen en la otra dirección, usando el mismo proceso según se describió anteriormente.

En las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos, las condiciones usadas para conseguir un nivel en particular de rigurosidad variarán dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se están hibridando. Por ejemplo, para seleccionar las condiciones de hibridación pueden considerarse la longitud, el grado de complementariedad, la composición de la secuencia nucleótidos (por ejemplo, contenido en GC con respecto a AT) y tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN con respecto a ADN) de las regiones que hibridan de los ácidos nucleicos. Una consideración adicional es si uno de los ácidos nucleicos está inmovilizado, por ejemplo, sobre un filtro.

Un ejemplo de condiciones progresivamente más rigurosas es como sigue: 2 x SSC/0,1% SDS aproximadamente a temperatura ambiente (condiciones de hibridación); 0,2 x SSC/0,1% SDS aproximadamente a temperatura ambiente (condiciones de baja rigurosidad); 0,2 x SSC/0,1% SDS a aproximadamente 42°C (condiciones de rigurosidad moderada); y 0,1 x SSC a aproximadamente 68°C (condiciones de alta rigurosidad). El lavado puede llevarse a cabo usando sólo una de estas condiciones, por ejemplo, condiciones de alta rigurosidad, o puede usarse cada una de las condiciones, por ejemplo, durante 10-15 minutos cada una, en el orden mencionado anteriormente, repitiendo cualquiera o todas las etapas mencionadas. Sin embargo, según se mencionó anteriormente, las condiciones óptimas variarán dependiendo de la reacción de hibridación en particular implicada, y pueden ser determinadas empíricamente.

Preferiblemente, el procedimiento de amplificación es mediante PCR, según se describe en este documento y es usado habitualmente por los expertos habituales en la materia. Se han descrito procedimientos alternativos de amplificación, y también pueden emplearse siempre que los loci metilados y no metilados amplificados mediante PCR usando los cebadores de la invención sean amplificados de forma similar mediante los medios alternativos.

Los productos amplificados son identificados preferiblemente como metilados o no metilados mediante secuenciación. Las secuencias amplificadas mediante los procedimientos de la invención pueden ser adicionalmente evaluadas, detectadas, clonadas, secuenciadas y similares, bien en disolución o bien después de unirlas a un soporte sólido, mediante cualquier procedimiento aplicado habitualmente para la detección de una secuencia específica de ADN, tal como PCR, restricción de oligómeros (Saiki, y col., Bio/Technology, 3: 1008-1012, 1985), análisis con sondas oligonucleotídicas específicas de alelo (ASO) (Conner, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 80: 278, 1983), ensayos de ligación de oligonucleótidos (OLAs) (Landegren, y col., Science, 241: 1077, 1988), y similares. Se han examinado las técnicas moleculares para el análisis del ADN (Landegren, y col., Science, 242: 229-237, 1988).

Opcionalmente, el patrón de metilación del ácido nucleico puede ser confirmado mediante una digestión con enzimas de restricción y un análisis por inmunotransferencia Southern. Algunos ejemplos de endonucleasas de restricción sensibles a la metilación que pueden usarse para detectar la metilación en 5' de CpG incluyen SmaI, SacII, EagI, MspI, HpaII, BstUI y BssHII, por ejemplo.

La invención proporciona un procedimiento para detectar una célula con una isla de CpG metilado o una célula con una alteración proliferativa asociada con el CpG metilado, en un tejido o un fluido biológico de un sujeto, que comprende poner en contacto un componente celular objetivo sospechoso de expresar un gen con un CpG metilado o con una alteración asociada al CpG, con un agente que se une al componente. El componente de la célula objetivo puede ser un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, o una proteína. Cuando el componente es un ácido nucleico, el reactivo es una sonda de ácido nucleico o un cebador de PCR. Cuando el componente celular es una proteína, el reactivo es una sonda de anticuerpo. Las sondas pueden ser marcadas detectablemente, por ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminescente, un compuesto quimioluminescente o un quelatante de metales o una enzima. Los expertos habituales en la materia conocerán otros marcadores adecuados para que se unan al anticuerpo, o serán capaces de averiguarlos, usando experimentación rutinaria.

Los genes transcritos activamente contienen generalmente menos CGs metilados que el número medio en el ADN. La hipermetilación puede ser detectada mediante un tratamiento con una endonucleasa de restricción y un análisis por inmunotransferencia Southern. Por lo tanto, en un procedimiento de la invención, cuando el componente celular detectado es ADN, es preferible el análisis con una endonucleasa de restricción para detectar la hipermetilación de, por ejemplo, el promotor. Puede utilizarse cualquier endonucleasa de restricción que incluya CG como parte de su sitio de reconocimiento y que esté inhibida cuando la C esté metilada. Preferiblemente, la endonucleasa de restricción sensible a la metilación es BssHII, MspI o HpaII, usadas solas o combinadas. Los expertos en la materia conocerán otras endonucleasas de restricción sensibles a la metilación.

Para el propósito de la invención puede usarse un anticuerpo o una sonda específica de ácido nucleico para un gen o un producto de un gen para detectar la presencia de metilación, detectando bien el nivel de polipéptido (usando el anticuerpo) o bien la metilación del polinucleótido (usando la sonda de ácido nucleico) en fluidos o tejidos biológicos. Para la detección basada en el anticuerpo, se compara el nivel del polipéptido con el nivel de polipéptido encontrado en el correspondiente tejido "normal". Los cebadores oligonucleotídicos basados en cualquier región de la secuencia codificante del promotor de la secuencia del TIMP-2, del receptor de estrógeno, del GST-pi, de la calcitonina, del HIC-1 o del MLH1, por ejemplo, son útiles para amplificar el ADN, por ejemplo, mediante PCR. Estos genes están enumerados únicamente como ejemplos y no deben entenderse como limitantes. Puede usarse cualquier espécimen que contenga una cantidad detectable de polinucleótido o antígeno. Preferiblemente el sujeto es un ser humano.

La presente invención proporciona el hallazgo de que el TIMP-2 está metilado en el tejido canceroso en comparación con el tejido normal. Por ejemplo, se encontró que el TIMP-2 estaba metilado en tejido de cáncer de colon pero no en tejido normal de colon. Un procedimiento para detectar una célula que expresa un gen tal como TIMP-2, o una alteración proliferativa de la célula asociada con la metilación del CpG que contiene el TIMP-2, o cualquier gen que incluya los descritos anteriormente, puede utilizarse para la detección de cáncer residual o de otras neoplasias en un sujeto en un estado de remisión clínica. Adicionalmente, el procedimiento para detectar un polipéptido en las células es útil para detectar una alteración proliferativa en la célula midiendo el nivel de polipéptido en células que expresan el polipéptido en un tejido sospechoso en comparación con el polipéptido expresado en células o tejidos normales. Usando el procedimiento de la invención puede identificarse la expresión de cualquier gen, tal como el TIMP-2, en una célula, y puede emplearse el programa apropiado de tratamiento (por ejemplo, terapia con genes sentido o terapia farmacológica). El patrón de expresión del gen, por ejemplo, del TIMP-2, variará según la etapa de malignización de una célula, por lo tanto, una muestra tal como tejido de mama o de colon puede cribarse con un grupo de reactivos específicos para un gen o el producto de un gen (es decir, sondas de ácidos nucleicos o anticuerpos) para detectar la expresión del gen, por ejemplo, del TIMP-2, y diagnosticar la etapa de malignización de la
célula.

Pueden usarse anticuerpos monoclonales en el procedimiento de la invención, por ejemplo, en inmunoensayos en fase líquida, o unidos a un vehículo en fase sólida. Además, en estos inmunoensayos, los anticuerpos monoclonales pueden marcarse detectablemente de varias formas. Algunos ejemplos de tipos de inmunoensayos que pueden utilizar anticuerpos monoclonales de la invención son los inmunoensayos competitivos y no competitivos, tanto en un formato directo como indirecto. Algunos ejemplos de dichos inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA) y el ensayo (inmunométrico) en sándwich. La detección de los antígenos usando los anticuerpos monoclonales de la invención puede realizarse utilizando inmunoensayos que se ejecutan de forma directa, inversa o simultánea, incluyendo ensayos inmunohistoquímicos sobre muestras fisiológicas. Los expertos en la materia conocerán o distinguirán fácilmente otros formatos de inmunoensayo sin una experimentación indebida.

El término "ensayo inmunométrico" o "inmunoensayo en sándwich", incluye inmunoensayos simultáneos en sándwich, directos en sándwich o inversos en sándwich. Estos términos son bien comprendidos por los expertos en la materia. Los expertos en la materia también apreciarán que los anticuerpos según la presente invención serán útiles en otras variaciones y formas de los ensayos que actualmente son conocidas o que puedan ser desarrolladas en el futuro. Éstas pretenden estar incluidas en el ámbito de la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales pueden unirse a muchos vehículos diferentes y usarse para detectar la presencia de TIMP-2. Algunos ejemplos de vehículos conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrina, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble para el propósito de la invención. Los expertos en la materia conocerán otros vehículos adecuados para la unión de anticuerpos monoclonales, o serán capaces de determinarlos usando experimentación rutinaria.

Para el propósito de la invención, el TIMP-2 puede ser detectado por los anticuerpos monoclonales cuando está presente en fluidos y tejidos biológicos. Puede usarse cualquier muestra que contenga una cantidad detectable de TIMP-2. Una muestra puede ser un líquido tal como eyaculado, orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, sangre, suero y similares, o un sólido o semisólido tal como tejidos, heces y similares, o, alternativamente, un tejido sólido tal como los usados habitualmente en el diagnóstico histológico.

Para realizar los ensayos puede ser deseable incluir ciertos "bloqueantes" en el medio de incubación (añadidos habitualmente con el anticuerpo soluble marcado). Los "bloqueantes" se añaden para asegurar que las proteínas no especificas, proteasas o inmunoglobulinas antiheterofílicas contra inmunoglobulinas anti-TIMP-2 presentes en la muestra experimental no se entrecrucen ni destruyan los anticuerpos del soporte en fase sólida, o el anticuerpo indicador radiomarcado, para dar unos resultados falsos positivos o falsos negativos. La selección de los "bloqueantes" puede añadirse por lo tanto sustancialmente a la especificidad de los ensayos descritos en la presente invención.

Para usar anticuerpos monoclonales para la detección in vivo de un antígeno, el anticuerpo monoclonal marcado detectablemente es aportado en una dosis que es diagnósticamente eficaz. El término "diagnósticamente eficaz" significa que la cantidad de anticuerpo monoclonal marcado detectablemente es determinada en una cantidad suficiente para permitir la detección del sitio con el antígeno TIMP-2 para el cual son específicos los anticuerpos monoclonales.

La concentración del anticuerpo monoclonal marcado detectablemente que se administra debería ser suficiente como para que la unión de las células con el TIMP-2 sea detectable en comparación con el trasfondo. Además, es deseable que el anticuerpo monoclonal marcado detectablemente sea eliminado rápidamente del sistema circulatorio con objeto de que proporcione la mejor proporción de la señal entre el objetivo y el trasfondo.

Como norma, la dosificación del anticuerpo monoclonal marcado detectablemente para el diagnóstico in vivo variará dependiendo de factores tales como la edad, el género y el grado de enfermedad del individuo. La dosificación del anticuerpo monoclonal puede variar desde aproximadamente 0,001 mg/m^{2} hasta aproximadamente 500 mg/m^{2}, preferiblemente de 0,1 mg/m^{2} hasta aproximadamente 200 mg/m^{2}, muy preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/m^{2} hasta aproximadamente 10 mg/m^{2}. Dichas dosificaciones suelen variar, por ejemplo, dependiendo de si se administran múltiples inyecciones, de la carga tumoral y de otros factores conocidos por los expertos en la
materia.

Para el diagnóstico in vivo por imagen, el tipo de instrumento de detección disponible es un factor principal para seleccionar un radioisótopo dado. El radioisótopo elegido debe tener un tipo de desintegración que sea detectable para un tipo de instrumento dado. Todavía otro factor importante para seleccionar un radioisótopo para el diagnóstico in vivo es que la semivida del radioisótopo sea lo suficientemente larga como para que sea aún detectable en el momento de la máxima captación por parte del objetivo, pero lo suficientemente corta como para que se minimice la radiación perjudicial con respecto al hospedador. Idealmente, un radioisótopo usado para el diagnóstico por imagen in vivo carecerá de una emisión de partículas, pero producirá un gran número de fotones en el intervalo de 140-250 keV, que será fácilmente detectado por cámaras gamma convencionales.

Un anticuerpo monoclonal útil en el procedimiento de la invención también puede ser marcado con un isótopo paramagnético para el propósito del diagnóstico in vivo, tal como en la resonancia magnética por imagen (magnetic resonance imaging, MRI) o en la resonancia de espín del electrón (electron spin resonance, ESR). En general, puede utilizarse cualquier procedimiento convencional para visualizar las imágenes del diagnóstico. Habitualmente se usan radioisótopos emisores de gamma y positrones para las imágenes de cámara, e isótopos paramagnéticos para MRI. Algunos elementos que son particularmente útiles en dichas técnicas incluyen ^{157}Gd, ^{55}Mf, ^{162}Dy, ^{52}Cr y ^{56}Fe.

Los anticuerpos monoclonales usados en el procedimiento de la invención pueden usarse para monitorizar el transcurso de la mejoría de la alteración proliferativa celular asociada con el TIMP-2. Por lo tanto, midiendo el aumento o el descenso en el número de células que expresan el TIMP-2 o los cambios en el TIMP-2 presente en diversos fluidos corporales, sería posible determinar si un régimen terapéutico en particular destinado a mejorar la alteración específica es eficaz.

El término "modula" engloba la supresión de la metilación del TIMP-2 (por ejemplo, promotor) o el aumento de la expresión del gen de TIMP-2 cuando el TIMP-2 está subexpresado.

Cuando una alteración proliferativa celular está asociada con la expresión del TIMP-2, pueden introducirse en una célula reactivos supresores de la metilación tales como 5-azacitadina. Alternativamente, cuando una alteración proliferativa celular está asociada con la subexpresión del polipéptido TIMP-2, pueden introducirse en la célula una secuencia de polinucleótidos sentido (la hebra codificante de ADN) que codifica para la región promotora o para el promotor unido operativamente al gen estructural, o el polipéptido TIMP-2.

La presente invención también proporciona una terapia génica para el tratamiento de alteraciones proliferativas celulares que están mediadas por el TIMP-2. Dicha terapia conseguiría su efecto terapéutico mediante la introducción del polinucleótido TIMP-2 apropiado que contiene una región promotora del TIMP-2 normal, sola o en combinación con un gen estructural del TIMP-2 (sentido), en células de sujetos con la alteración proliferativa. Alternativamente, el gen estructural del TIMP-2 podría introducirse unido operativamente a un promotor heterólogo. La administración de constructos polinucleotídicos promotores de TIMP-2 sentido puede conseguirse usando un vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal.

Las secuencias polinucleotídicas promotoras usadas en el procedimiento de la invención pueden ser la secuencia natural desmetilada o, alternativamente, pueden ser una secuencia en la que está sustituido en la secuencia un análogo no metilable. Preferiblemente, el análogo es un análogo no metilable de citidina, tal como 5-azacitadina. Los expertos en la materia conocerán otros análogos. Alternativamente, dichos análogos no metilables podrían ser administrados a un sujeto como una terapia farmacológica, individual o simultáneamente con un promotor sentido del TIMP-2 o un promotor sentido unido operativamente con el gen estructural para el correspondiente gen (por ejemplo, el promotor de TIMP-2 con el gen estructural de TIMP-2).

La invención también se refiere a un medicamento o composición farmacéutica que comprende un polinucleótido promotor del TIMP-2 o un polinucleótido promotor del TIMP-2 unido operativamente al gen estructural del TIMP-2, respectivamente, en un excipiente o un medio farmacéuticamente aceptable, en el que el medicamento se usa para la terapia de las alteraciones proliferativas celulares asociadas con el TIMP-2.

La invención también proporciona el uso de la MSP para un análisis de metilación in situ. Por ejemplo, la MSP puede usarse para detectar la metilación del ADN en el núcleo de una célula intacta. Se coloca o se inmoviliza una sección de tejido, una célula o una población de células sobre un soporte sólido (por ejemplo, un portaobjetos) y se usan directamente los cebadores de la MSP sobre la célula para la amplificación de las secuencias apropiadas. Los cebadores están típicamente marcados detectablemente con un medio informador, por ejemplo, un marcador fluorescente. Alternativamente, se usa una sonda que detecta o hibrida con las secuencias amplificadas mediante la MSP, para detectar la amplificación de las secuencias metiladas. El análisis de metilación in situ usando la MSP es útil para detectar, por ejemplo, un ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos mutante asociando a un tumor primario en los bordes quirúrgicos histopatológicos adyacentes y en tejidos más distantes, tales como nódulos linfáticos regionales, que son aparentemente "normales" cuando se examinan mediante técnicas histológicas estándar. Usando la MSP es posible detectar ácidos nucleicos objetivo en células previamente asociadas con un gran número de estados alterados que están presentes en un tejido que parece normal. La MSP in situ puede usarse como complemento de la citopatología, para cribar
poblaciones con un riesgo alto y para monitorizar pacientes con alto riesgo bajo quimioprevención o quimioterapia.

Algunos ejemplos de secuencias polinucleotídicas objetivo con las que hibrida el cebador de la invención tienen una secuencia según se detalla a continuación.

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Algunos ejemplos de pares de cebadores incluidos en la invención que hibridan con las secuencias anteriores incluyen:

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* También están incluidas las modificaciones de las secuencias anteriores, incluyendo la SEQ ID NO: 107 con las secuencias TCAC en el extremo 5' (SEQ ID NO: 214); la SEC. Nº: 107 con la secuencia CC añadida en el extremo 5' (SEQ ID NO: 215); la SEQ ID NO: 107 con la secuencia 5TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3'; SEQ ID NO: 108 con la secuencia 5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'; la SEQ ID NO: 110 con la secuencia TGG añadida en el extremo 5' SEQ ID NO: 216); y la SEQ ID NO: 107 con la secuencia TACC añadida en el extremo 5' (SEQ ID NO: 111). Todos estos cebadores modificados aparean a 65ºC.

Típicamente, el ácido nucleico que contiene el CpG está en la región del promotor de un gen estructural. Por ejemplo, se ha identificado que la región promotora de los genes supresores tumorales contiene una isla de CpG metilada. La región promotora de los genes supresores tumorales, incluyendo p16, p15, VHL y E-cadherina, es típicamente la secuencia amplificada mediante PCR en el procedimiento de la invención. Otros genes que mediante MSP se ha demostrado que contienen CpG metilado en tejido neoplásico con respecto a normal incluyen el receptor de estrógeno, MDGI, GST-pi, calcitonina, HIC-l, el receptor de endotelina B, TIMP-2, 06-MGMT y MLH1. Algunos genes que mediante MSP se encontró que estaban metilados también incluyen el receptor de andrógeno (por ejemplo, metilados como una inactivación del cromosoma X), GFAP (metilados en algunas líneas celulares de glioma pero también en tejido normal) y MSH2. Otros genes en los que el cebador de la MSP distinguía entre ADN normal desmetilado y metilado incluyen TGF-\betal, TGF-\beta2, p130, BRCA2, NF1, NF2 y TSG101.

La detección y la identificación de un ácido nucleico que contiene CpG metilado en el espécimen pueden ser indicativas de una alteración proliferativa celular o una neoplasia. Dichas alteraciones incluyen, pero no se limitan a, astrocitoma de grado menor, astrocitoma anaplásico, glioblastoma, meduloblastoma, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer renal, leucemia, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de endometrio y neuroblastoma. La identificación del estado metilado del CpG también es útil para la detección y el diagnóstico de un sellamiento genómico, síndrome del cromosoma X frágil e inactivación del cromosoma X.

Usando el procedimiento de la invención, el gen TIMP-2 se identificó como asociado con o metilado en tejidos neoplásicos frente a normales.

El procedimiento de la invención proporciona ahora la base para un kit útil para la detección de un ácido nucleico que contiene un CpG metilado. El kit incluye un medio vehicular que está compartimentalizado para contener en estrecho confinamiento en el mismo uno más envases. Por ejemplo, un primer envase contiene un reactivo que modifica la citosina desmetilada, tal como bisulfito sódico. Un segundo envase contiene los cebadores para la amplificación del ácido nucleico que contiene el CpG, por ejemplo, los cebadores enumerados anteriormente como SEQ ID NO: 105-208.

La invención también proporciona un kit para la detección de un ácido nucleico que contiene el CpG metilado, en el que el kit incluye: a) un reactivo que modifica nucleótidos de citosina desmetilados; b) un ácido nucleico de control; c) cebadores para la amplificación del ácido nucleico que contiene el CpG desmetilado; d) cebadores para la amplificación del ácido nucleico que contiene el CpG metilado; y e) cebadores para la amplificación del ácido nucleico de control. El kit puede incluir adicionalmente un tampón para la amplificación del ácido nucleico. Preferiblemente, el reactivo que modifica la citosina desmetilada es bisulfito.

El kit de la invención está destinado a proporcionar los reactivos necesarios para realizar una modificación química y una amplificación mediante PCR de muestras de ADN para determinar su estado de metilación. Los conjuntos de cebadores incluidos en el kit incluyen un conjunto que aparea con el ADN desmetilado que ha sufrido una modificación química; un conjunto que aparea con el ADN metilado que ha sufrido una modificación química; y un conjunto de cebadores que sirve como control de la eficacia de la modificación química. El conjunto de cebadores de control debería aparearse con cualquier ADN (desmetilado o metilado) que no haya sufrido una metilación química. En el caso de una modificación química incompleta (de hasta aproximadamente el 50%), todavía puede realizarse una interpretación de los datos.

La descripción anterior describe de forma general la presente invención. Puede obtenerse una comprensión más completa en relación con los siguientes ejemplos específicos, que se proporcionan en este documento con un propósito meramente ilustrativo y no pretenden limitar el ámbito de la invención.

Ejemplo 1

ADN y Líneas Celulares. Se obtuvo ADN genómico a partir de líneas celulares, tumores primarios y tejido normal según se describe (Merlo, y col., Nature Medicine, 1: 686, 1995; Herman, y col., Cancer Research, 56: 722, 1996; Graff, y col., Cancer Research, 55: 5195, 1995). La línea celular de carcinoma renal fue amablemente proporcionada por el Dr. Michael Lehrman del National Cancer Institute, Bethesda, MD.

Modificación con Bisulfito. Se desnaturalizó 1 \mug de ADN en un volumen de 50 \mul mediante NaOH (0,2 M final) durante 10 minutos a 37°C. Para las muestras con cantidades nanográmicas de ADN humano se añadió 1 \mug de ADN de esperma de salmón (Sigma) como vehículo antes de la modificación. Se añadieron 30 \muL de hidroquinona 10 mM (Sigma) y 520 \muL de bisulfito sódico 3 M (Sigma) de pH 5, ambos recién preparados, se mezclaron y las muestras se incubaron bajo aceite mineral a 50°C durante 16 horas. El ADN modificado se purificó usando la resina de purificación de ADN Wizard^{TM} según el fabricante (Promega), y se eluyó en 50 \muL de agua. La modificación se concretó mediante un tratamiento con NaOH (0,3 M final) durante 5 minutos a temperatura ambiente, seguido de una precipitación con etanol.

Secuenciación genómica. La secuenciación genómica del ADN modificado con bisulfito se realizó usando la metodología de secuenciación de ADN en fase sólida (Myohanen, y col., DNA Seq., 5: 1, 1994). Se amplificaron 100 ng del ADN modificado con bisulfito con un cebador específico del gen p16 5'-TTTTTAGAGGATTTGAGGGATAGG-3' (sentido) (SEQ ID NO: 209) y 5'-CTACCTAATTCCAATTCCCCTACA-3' (antisentido) (SEQ ID NO: 210). Las condiciones de la PCR fueron como sigue: 96°C durante 3 minutos, 80°C durante 3 minutos, se añadió 1 U de polimerasa Taq (BRL), seguido de 35 ciclos de 96°C durante 20 segundos, 56°C durante 20 segundos, 72°C durante 90 segundos, seguido de 5 minutos a 72°C. La mezcla de PCR contenía 1X de tampón (BRL) con MgCl_{2} 1,5 mM, 20 pmol de cada cebador y dNTPs 0,2 mM. Para obtener los productos para la secuenciación, se realizó una segunda ronda de PCR con 5 pmol de cebadores internos. En esta reacción, el cebador sentido, 5'-GTTTTCCCAGTCAC GACAGTATTAGGAGGAAGAAAGAGGAG-3' (SEQ ID NO: 211), contiene la secuencia M13-40 (subrayada) introducida como un sitio para iniciar la secuenciación, y el cebador antisentido 5'-TCCAATTCCCCTACAAACTTC-3'' (SEQ ID NO: 212) está biotinilado para facilitar la purificación del producto antes de la secuenciación. La PCR se realizó como anteriormente, durante 32 ciclos con MgCl_{2} 2,5 mM. Todos los cebadores de la secuenciación genómica fueron diseñados para evitar cualquier CpG en la secuencia. Los productos de la PCR biotinilados se purificaron usando microesferas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal AB, Noruega), y las reacciones de secuenciación se realizaron con Sequenase^{TM} y el cebador de secuenciación M13-40 en las condiciones especificadas por el fabricante (USB).

Amplificación mediante PCR. Los pares de cebadores descritos en la Tabla I se adquirieron en Life Technologies. La mezcla de PCR contenía 1X de tampón de PCR (sulfato amónico 16,6 mM, TRIS 67 mM pH 8,8, MgCl_{2} 6,7 mM y \beta-mercaptoetanol 10 mM), dNTPs (cada uno a 1,25 mM), cebadores (300 ng/por reacción cada uno) y ADN modificado con bisulfito (\sim50 ng) o ADN no modificado (50-100 ng) en un volumen final de 50 \muL. La PCR específica para ADN no modificado también incluía dimetilsulfóxido al 5%. Las reacciones se iniciaron en caliente a 95°C durante 5 minutos antes de la adición de 1,25 unidades de polimerasa Taq (BRL). La amplificación se llevó a cabo en un variador de temperatura Hybaid OmniGene durante 35 ciclos (30 segundos a 95°C, 30 segundos a la temperatura de hibridación enumerada en la Tabla 1, y 30 segundos a 72°C), seguido de una extensión final de 4 minutos a 72°C. Se realizaron controles sin ADN para cada conjunto de reacciones de PCR. Se cargaron directamente 10 \muL de cada reacción de PCR sobre geles de poliacrilamida no desnaturalizantes al 6-8%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizan directamente bajo una iluminación UV.

Análisis de Restricción. Se digirieron 10 \muL de los 50 \muL de la reacción de PCR con 10 unidades de BstUI (New England Biolabs) durante 4 horas según las condiciones especificadas por el fabricante. Los digeridos de restricción se precipitaron en etanol antes de su análisis en gel.

Ejemplo 2

Se requirió un estudio inicial para validar la estrategia de la MSP para proporcionar una valoración del estado de metilación de las islas de CpG. El supresor tumoral p16 (Merlo, y col., supra; Herman, y col., Cancer Research, 55: 4525, 1995; Gonzalez-Zulueta, y col., Cancer Res., 55: 4531, 1995, 27) del que se había documentado que tenía una hipermetilación de una isla CpG en 5' está asociado con una pérdida completa de la expresión del gen en muchos tipos de cáncer, se usó como un gen ejemplar para determinar si la densidad de metilación, en las regiones clave que se iban a probar, era lo suficientemente grande como para facilitar el diseño de los cebadores descrito en este documento. Otros distintos para los sitios de CpG ubicados en secuencias de reconocimiento para las enzimas sensibles a la metilación, la densidad de metilación y su correlación con el silenciamiento de la transcripción todavía no se han establecido. Por lo tanto, la técnica de secuenciación genómica se empleó para explorar esta relación.

La Figura 1 muestra la secuenciación genómica de p16. La secuencia mostrada tiene la mayor parte de la región 5' en el fondo del gel, comenzando en +175 con respecto a un sitio de inicio de la transcripción principal (Hara, y col., Mol. Cell Biol., 16: 859, 1996). Todas las citosinas de la línea celular H249 desmetilada se han convertido en timidinas, mientras que todas las C de los dinucleótidos CpG en la célula H157 metilada permanecen como C, lo que indica metilación. El ] englobaba un sitio BstUI que está a -59 con respecto al sitio de inicio de la traducción en la secuencia del Genbank U12818 (Hussussian, y col., Nat. Genet., 8: 15, 1994), pero que está incorrectamente identificado como CGCA en la secuencia X94154 (Hara, y col., supra). Este sitio CGCG representa la ubicación en 3' del cebador sentido usado para la MSP del p16.

Según se ha encontrado para otras islas de CpG examinadas de esta forma (Myohanen, y col., supra; Park, y col., Mol. Cell Biol., 14: 7975, 1994; Reeben, y col., Gene, 157: 325, 1995), la isla de CpG de p16 estaba completamente desmetilada en las líneas celulares y tejidos normales que previamente se encontró que estaban desmetilados mediante un análisis Southern (Fig. 1) (Merlo, y col., supra; Herman, y col., supra). Sin embargo, estaba ampliamente metilada en líneas celulares cancerosas que se demostró que estaban metiladas mediante un análisis Southern (Fig. 1). De hecho, todas las citosinas de los dinucleótidos CpG de esta región estaban completamente metiladas en los cánceres que carecían de la transcripción del p16. Esta notable diferencia en la secuencia tras el tratamiento con bisulfito sugirió que el procedimiento de la invención para la amplificación específica de alelos tanto metilados como desmetilados era útil para la identificación de patrones de metilación en una muestra de ADN.

Los cebadores fueron diseñados para discriminar entre alelos metilados y desmetilados tras el tratamiento con bisulfito, y para discriminar entre ADN modificado mediante bisulfito y el que no había sido modificado. Para conseguir esto, las secuencias de cebadores se eligieron para las regiones que contenían frecuentes citosinas (para distinguir el ADN no modificado del modificado), y los pares de CpG cerca del extremo 3' de los cebadores (para proporcionar una discriminación máxima en la reacción de PCR entre ADN metilado y desmetilado). Dado que las dos hebras del ADN ya no son complementarias después del tratamiento con bisulfito, los cebadores pueden ser diseñados para cualquiera de las hebras modificadas. Por conveniencia, los cebadores se diseñaron para la hebra sentido. El fragmento de ADN que se iba a amplificar era intencionadamente pequeño para permitir la valoración de los patrones de metilación en una región limitada, y para facilitar la aplicación de esta técnica a las muestras, tales como bloques de parafina, en los que la amplificación de fragmentos mayores no es posible. En la Tabla 1 se muestran las secuencias de los cebadores para todos los genes probados, enfatizando las diferencias en la secuencia entre los tres tipos de ADN que son explotados para la especificidad de la MSP. Los múltiples emparejamientos incorrectos en estos cebadores, que son específicos para estos diferentes tipos de ADN, sugieren que cada conjunto de cebadores debería proporcionar sólo la amplificación molde pretendido.

Los cebadores diseñados para p16 se probaron con ADN procedente de líneas celulares cancerosas y de tejidos normales para los cuales se había definido previamente el estado de metilación mediante un análisis Southern (Merlo, y col., supra; Herman, y col., supra).

La Figura 2, paneles A-D, muestra geles de poliacrilamida con los productos de metilación específicos de la PCR de p16. Los conjuntos de cebadores usados para la amplificación están designados como desmetilado (U), metilado (M) o no modificados/naturales (W). El * designa el marcador de peso molecular del digerido molecular pBR322-MspI. El panel A muestra la amplificación del ADN tratado con bisulfito a partir de linfocitos de líneas celulares cancerosas y normales, y ADN no tratado (de la línea celular H249). El panel B muestra la mezcla de varias cantidades de ADN de H157 con 1 \mug de ADN de H249 antes del tratamiento con bisulfito para valorar la sensibilidad de detección de la MSP para los alelos metilados. También se muestra el ADN modificado a partir de una muestra de cáncer de pulmón primario y de un pulmón normal. El panel C muestra la amplificación con los cebadores pl6-U2 (U) y pl6-M2 (M) descritos en la Tabla 1. El panel D muestra los productos de p16 amplificados del panel C restringidos con BstUI (+) o no restringidos (-).

En todos los casos, el conjunto de cebadores usado confirmó el estado de metilación determinado mediante análisis Southern. Por ejemplo, las líneas celulares de cáncer de pulmón U1752 y H157, así como otras líneas celulares metiladas en el p16, sólo se amplificaron con los cebadores metilados (Fig. 2, panel A). El ADN de los tejidos normales (linfocitos, pulmón, riñón, mama y colon) y de las líneas celulares de cáncer de pulmón desmetilados H209 y H249, sólo se amplificaron con los cebadores desmetilados (ejemplos en la Fig. 2, panel A). La PCR con estos cebadores pudo realizarse con o sin DMSO al 5%. El ADN no tratado con bisulfito (no modificado) no pudo ser amplificado con ningún conjunto de cebadores específicos metilados o desmetilados, pero se amplificó fácilmente con cebadores específicos para la secuencia antes de la modificación (Fig. 2, panel A). El ADN de la línea celular H157 también produjo, tras el tratamiento con bisulfito, una amplificación más débil con los cebadores no modificados, lo que sugiere una reacción con el bisulfito incompleta. Sin embargo, este ADN no modificado, al contrario que el ADN parcialmente restringido en ensayos previos de PCR basados en enzimas de restricción sensibles a la metilación, no es reconocido por los cebadores específicos para ADN metilado. Por lo tanto, no proporciona un resultado falso positivo ni interfiere con la capacidad para distinguir entre alelos metilados y desmetilados.

Se valoró la sensibilidad de la MSP para la detección de alelos de p16 metilados. Se mezcló el ADN de líneas celulares metiladas con ADN desmetilado antes del tratamiento con bisulfito. Se detectó coherentemente un 0,1% de ADN metilado (aproximadamente 50 pg) en una muestra por lo demás desmetilada (Fig. 2, panel B). Se determinó que en límite de sensibilidad para la cantidad de ADN introducido era tan pequeño como 1 ng de ADN humano, mezclado con ADN de esperma de salmón como vehículo detectable mediante MSP.

Las muestras de tumores humanos recientes contienen a menudo tejido normal y tumoral, haciendo que la detección de cambios específicos en el tumor sea difícil. Sin embargo, la sensibilidad de la MSP sugiere que sería útil también para los tumores primarios, permitiendo la detección de alelos metilados aberrantemente incluso si contribuyen relativamente poco al ADN global de una muestra. En cada caso, mientras que los tejidos normales estaban completamente desmetilados, mediante un análisis Southern se determinó que los tumores que estaban metilados en el p16 también contenían ADN metilado detectado mediante MSP, además de algunos alelos desmetilados (ejemplos en la Fig. 2, panel B). También se usó el ADN de tumores inclusos en parafina, y permitió la detección de alelos metilados y desmetilados en estas muestras (Fig. 2, panel B). Para confirmar que estos resultados no eran únicos para este conjunto de cebadores se usó un segundo cebadores secuencia abajo para el p16 que amplificaría un fragmento ligeramente mayor a (Tabla 1). Este segundo conjunto de cebadores reprodujo los resultados descritos anteriormente (Fig. 2, panel C), confirmando el estado de metilación definido mediante el análisis de inmunotransferencia Southern.

Para verificar adicionalmente la especificidad de los cebadores para los alelos metilados y comprobar la metilación de citosinas específicas en la región amplificada, se utilizaron las diferencias de secuencia entre el ADN metilado/modificado y el ADN desmetilado/modificado. Específicamente, el sitio de reconocimiento BstUI, CGCG, permanecerá como CGCG si ambas C están metiladas tras el tratamiento con bisulfito y la amplificación, pero cambiará a TGTG si están desmetiladas. La digestión de los productos amplificados con BstUI distingue estos dos productos. La restricción de los productos amplificados de p16 ilustra esto. Sólo los productos no modificados y los productos metilados/modificados, que conservaban ambos el sitio CGCG, fueron escindidos mediante BstUI, mientras que los productos amplificados con cebadores desmetilados/modificados no pudieron ser escindidos (Fig. 2, panel D).

Los conjuntos de cebadores discutidos anteriormente fueron diseñados para discriminar islas de CpG altamente metiladas de alelos desmetilados. Para hacer esto, ambos cebadores superior (sentido) e inferior (antisentido) contenían sitios CpG que podrían producir diferencias en la secuencia dependientes de la metilación tras el tratamiento con bisulfito. La MSP puede ser empleada para examinar más aspectos regionales de la metilación de la isla de CpG. Para examinar esto se probaron las diferencias dependientes de metilación sólo en la secuencia de un cebador, para determinar todavía permitiría la discriminación entre los alelos de p16 desmetilados y metilados. El cebador antisentido usado para la secuenciación genómica, 5'-CTACCTAATTCCAATTCCCCTACA-3' (SEQ ID NO: 213), también se usó como cebador antisentido, ya que la región reconocida por el cebador no contiene sitios CpG, irse apareó con un cebador sentido metilado o desmetilado (Tabla1). La amplificación del producto de la PCR de 313 pb sólo se produjo con el cebador sentido desmetilado en H209 y H249 (desmetilado mediante Southern) y el cebadores sentido metilado en H157 y U1752 (metilado mediante Southern), lo que indica que la metilación de los sitios CpG en una región definida puede ser reconocida por cebadores específicos y distinguir entre alelos metilados y desmetilados (Fig. 2, panel E). El panel E muestra los resultados de la prueba de una metilación regional de islas de CpG con MSP, usando los cebadores sentido p16-U2 (U) y p16-M2 (M), que son específicos de metilación, y un cebador antisentido que no es específico de metilación.

Ejemplo 3

Los anteriores experimentos con p16 se extendieron para incluir otros 3 genes silenciados transcripcionalmente en cánceres humanos mediante una hipermetilación aberrante de islas de CpG en 5'.

En la Figura 3, los paneles A-E muestran geles de poliacrilamida de los productos de la MSP procedentes del análisis de varios genes. Los conjuntos de cebadores usados para la amplificación no están designados como desmetilados (U), metilados (M) o no modificados/naturales (W). El * designa el marcador de peso molecular del digerido pBR322-MspI y los ** designan el marcador de peso molecular de 123 pb. Todas las muestras de ADN se trataron con bisulfito excepto las designadas como no tratadas. El panel A muestra los resultados de la MSP para p15. El panel B muestra los productos de p15 restringidos con BstUI (+) o no restringidos (-). El panel C muestra los productos de la MSP para VHL. El panel D muestra los productos de VHL restringidos con BstUI (+) o no restringidos (-). El panel E muestra los productos de la MSP para la E-cadherina.

El inhibidor p15 de cinasa dependiente de ciclina está metilado aberrantemente en muchas líneas celulares leucémicas y leucemias primarias (Herman, y col., supra). Para el p15, la MSP verificó de nuevo el estado de metilación determinado mediante análisis Southern. Por lo tanto, los linfocitos normales y las líneas de células cancerosas SW48 y U1752, todos desmetilados mediante análisis Southern (Herman, y col., supra), sólo se amplificaron con el conjunto de cebadores desmetilados, mientras que la línea celular de cáncer de pulmón H1618 y la línea celular de leucemia KG1A se amplificaron sólo con el conjunto de cebadores metilados (Fig. 3, panel A), lo que es coherente con previos resultados de análisis Southern (Herman, y col., supra). La línea celular Raji produjo un fuerte producto de PCR con los cebadores metilados y una banda más débil con los cebadores desmetilados. Este fue el mismo resultado que la metilación obtenida previamente mediante análisis Southern (Herman, y col., supra). Las muestras de leucemia no cultivadas, al igual que los tumores primarios estudiados para p16, tuvieron amplificación con el conjunto de cebadores metilados así como con el conjunto de cebadores desmetilados. Esta heterogeneidad también concordaba con el análisis Southern (Herman, y col., supra). De nuevo, como para p16, se usó una modificación diferencial de los sitios de restricción BstUI en el producto amplificado de p15 para verificar la amplificación específica mediante MSP (Fig. 3, panel B). Los productos amplificados usando conjuntos de cebadores metilados de las líneas celulares H1618 y Raji o conjuntos de cebadores no modificados, fueron completamente escindidos por BstUI, mientras que los productos amplificados desmetilados no se escindieron. Las muestras de AML primarias, que de nuevo sólo mostraron una escisión en el producto metilado, tuvieron una escisión menos completa. Esto sugiere una heterogeneidad en la metilación, que surge porque en algunos alelos, muchos sitios CpG en el área de las secuencias del cebador están lo suficientemente metilados como para permitir que cebadores específicos de metilación amplifiquen esta región, mientras que otros sitios CpG no están completamente metilados.

La metilación aberrante de la región promotora de la isla de CpG está asociada con una inactivación del gen supresor tumoral VHL en aproximadamente el 20% de los carcinomas renales de células claras (Herman, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 91: 9700, 1994). Este evento, al igual que las mutaciones del VHL (Gnarra, y col., Nature Genetics, 7: 85, 1994), está restringido a cánceres renales de células claras (Herman, y col., supra). Los cebadores diseñados para las secuencias de VHL se usaron para estudiar el ADN de la línea de cáncer celular renal RFX393 que está metilado en el VHL mediante análisis Southern, y la línea celular de cáncer de pulmón U1752 se están desmetilado en este locus (Herman, y col., supra). En cada caso, el estado de metilación de VHL determinado mediante MSP confirmó lo averiguado mediante análisis Southern (Fig. 3, panel C), y el análisis del sitio de restricción BstUI válido la especificidad del producto de la PCR (Fig. 3, panel D).

La expresión del gen supresor de invasión/metástasis, E-cadherina, está a menudo silenciada por una metilación aberrante del promotor 5' en carcinomas de mama, de próstata y otros muchos (Graff, y col., supra; Yoshira, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 92: 7416, 1995). Los cebadores fueron diseñados para la región promotora de la E-cadherina para probar el uso de la MSP para este gen. En cada caso, el análisis por MSP o paralelo al análisis mediante inmunotransferencia Southern para el estado de metilación del gen (Graff, y col., supra). Las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231, HS578t, y las líneas celulares de cáncer de próstata DuPro y TSUPrI, todas altamente metiladas mediante Southern, mostraron una prominente metilación. MCF7, T47D, PC-3 y LNCaP, todas desmetiladas mediante Southern, no mostraron ningún signo de metilación en el ensayo de MSP sensible (Fig. 3, panel E). El análisis por MSP reveló la presencia de alelos desmetilados en Hs578t, TSUPrI y DuPro, coherente con el bajo porcentaje de alelos desmetilados en estas líneas celulares detectado previamente mediante análisis Southern (Graff, y col., supra). El análisis de restricción con BstUI confirmó de nuevo la especificidad para la amplificación por PCR.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 4

Metilación indirecta in situ de p16. La PCR indirecta in situ (IS-PCR indirecta) describe una técnica mediante la cual el amplicón es producido mediante ciclación térmica sin la incorporación de marcaje. Al final de la reacción de ciclación, el producto amplificado es detectado mediante una hibridación in situ estándar usando una sonda marcada.

Preparación de la muestra y pretratamiento. Las células HN12 incluidas en parafina y fijadas con formalina se desparafinizaron con xileno durante 5 minutos, seguido de dos aclarados de 5 minutos con etanol al 100%. Los portaobjetos se secaron al aire y después se trataron con Proteinasa K (10 \mug/ml en Tris 50 mM) durante 30 minutos a 37°C bajo un cubreobjetos. Los portaobjetos se aclararon con agua destilada y se colocaron en NaOH 0,2 N durante 10 minutos a 37°C, y después se colocaron en ni bisulfito sódico 3 M que contenía hidroxiquinona. La disolución se estratificó con aceite mineral y se dejó a 50°C durante 16 horas. Se retiró el aceite y los portaobjetos se aclararon con agua y se colocaron en NaOH 0,3 M durante 5 minutos a temperatura ambiente. Entonces los portaobjetos se deshidrataran con etanol al 70%, al 80% y al 100% y se secaron al aire.

Protocolo de la IS-PCR indirecta. La mezcla de PCR contenía tampón de PCR 1x (sulfato amónico 16,6 mM/Tris 67 mM, pH 8,8/MgCl_{2} 6,7 mM/2-mercaptoetanol 10 mM), dNTP (2,5 lambda de mezcla 25 mM), 300 ng de cada cebador y 2,5 unidades de Polimerasa Taq por 50 ml de reacción. Esta mezcla se "inició en caliente" a 95°C durante 5 minutos, y después se añadió directamente a los portaobjetos, que estaban precalentados a 80°C con un GeneComb en el sitio. La PCR se realizó en un ciclador Hybaid Omnigene con un módulo in situ. Se realizaron treinta ciclos de 90°C durante 30 segundos, 58°C durante 45 segundos y 70°C durante 45 segundos con un número de calibración de 50. Después de la PCR, los portaobjetos se aclararon inmediatamente una vez con agua destilada, seguido de una deshidratación con etanol al 70%, al 80% y al 100% y de un secado al aire.

Hibridación IS-PCR indirecta in situ y detección por fluorescencia. Después de la PCR, el espécimen se fijó brevemente para mantener la localización del producto de PCR. Esto se consiguió fijando las secciones con etanol al 100% durante 15 minutos, y dejándolas secar después al aire antes de la aplicación de la sonda. Se produjo un producto de la PCR p16 metilado y se marcó con digoxigenina, y se usó como sonda marcada para la hibridación in situ.

La sonda marcada con digoxigenina se suspendió en un tampón de hibridación que contenía SSC 2x/sulfato de dextrano al 10%/formamida al 50% para una concentración final de 10 ng/ul. Se colocaron 10,0 \mul (100,0 ng de sonda) de la mezcla de hibridación en cada muestra, se cubrió con un cubreobjetos de vidrio y se precintó con cemento de caucho. Entonces las preparaciones celulares se incubaron a 95°C durante 5 minutos y se hibridaron a 37°C hasta el día siguiente en una cámara humidificada.

Después de la hibridación, las muestras de HN12 se post-lavaron con SSC 2x (sal de citrato sódico) a temperatura ambiente durante cinco minutos y se colocaron en PBD 1x (detergente tamponado con fosfato) a temperatura ambiente antes de las detecciones inmunológicas.

Todas las muestras de células HN12 hibridadas se tiñeron inmunocitoquímicamente con avidina marcada con fluoresceína (Vector Laboratories, CA). Se aplicaron sesenta microlitros de reactivo de detección, consistente en avidina marcada con fluoresceína (10 ug/ml), PBS 1X, leche seca en polvo al 5% y azida sódica al 0,02% al portaobjetos bajo un cubreobjetos de plástico y se incubó a 37°C durante cinco minutos en una cámara humidificada. Los portaobjetos se lavaron varias veces con PBD 1X y se contratiñeron con yoduro de propidio (0,3 ug/ml) en una disolución antifade.

Para la microscopia de fluorescencia se utilizaron un microscopio de epifluorescencia Zeiss Axiophot 20 microscope (Zeiss, Alemania occidental) equipado con una lámpara de arco de mercurio de 100 W, un objetivo de inmersión en aceite 100 X Plan-Neofluar (Zeiss, Alemania occidental), una cámara Zeiss MC-100 (Zeiss, Alemania occidental) y los apropiados conjuntos de filtros para fluoresceína (FITC)/fluorescencia PI (Chroma, VT). El análisis de imagen y la conservación del registro se realizaron usando un sistema de cámara refrigerado 3CCD OIS (Oncor Instrument Systems) y un programa informático de análisis de imagen OIS 2.01.

La muestra negativa de células HN12 de control de la PCR se procesó usando una reacción inicial con bisulfito para modificar el ADN, seguida de una amplificación mediante PCR usando cebadores específicos para el ADN metilado de las regiones promotoras del gen p16, y una hibridación in situ. El control negativo no mostró una señal visible como se esperaba, dado que la reacción de PCR era incompleta.

Las células HN12 metiladas en el P16 se sometieron a la modificación con bisulfito, una amplificación mediante PCR usando cebadores específicos para el ADN metilado de las regiones promotoras del gen p16, y una hibridación in situ usando la sonda marcada. Las señales fluorescentes específicas del producto amplificado localizado de las regiones promotoras del p16 metilado eran visibles en las células.

Las células HN12 metiladas en el P16 se sometieron a la modificación con bisulfito, una amplificación mediante PCR usando cebadores específicos para el ADN desmetilado de las regiones promotoras del gen p16, y una hibridación in situ usando la sonda marcada. No era visible ninguna señal fluorescente en las células.

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Ejemplo 5

Probando el uso de la MSP para los cambios en la metilación en muestras de esputo. Se ha probado la MSP para detectar los cambios en la metilación en el ADN procedente de muestras de esputo. Las muestras probadas incluían los cebadores para p16 (Tabla 1; SEQ ID NO: 105-110) y el ADN extraído de muestras de esputo de los pacientes de los que se sabía que tenía cáncer de pulmón. Los alelos desmetilados para p16 fueron detectados, sin embargo, los alelos metilados no fueron detectados. Parece que como la MSP trabajó con los alelos no metilados, los tumores de los pacientes no tenían el p16 metilado. Para probar esta hipótesis, a una muestra de esputo se le añadieron células de la línea celular de cáncer de pulmón establecida Calu 3, que tiene un gen p16 hipermetilado. Estos alelos p16 metilados fueron detectados fácilmente en este ADN mixto.

Ejemplo 6

MSP para la detección de hipermetilación de hMLH1 y hMSH2. Los genes hMLH1 y hMSH2 codifican para proteínas de reparación de emparejamientos incorrectos, y las mutaciones en cualquiera de ellos pueden provocar formas heredadas de cáncer de colon marcadas por una inestabilidad del microsatélite. Cerca del 20% de los pacientes con cáncer de colon no heredado también tienen tumores con el fenotipo de inestabilidad del microsatélite. El mecanismo concreto que causan estos últimos tumores no está claro. Kane y col. (Cancer Research, 57: 808, 1997) han informado en pequeñas series, de que los tumores de pacientes con la forma esporádica de cánceres de colon con inestabilidad del microsatélite tienen una hipermetilación del promotor del gen hMLH1. La MSP, que emplea el conjunto de cebadores y las condiciones para hMSH2 y hMLH1 (Tabla 2; SEQ ID NO: 161-172), se usó para hacer un seguimiento de esta observación en series de tumores más grandes. En algunos de los 14 pacientes con dichos tumores, el 85% tienen una hipermetilación del hMLH1, mientras que sólo el 5% de los 21 tumores de colon sin inestabilidad del microsatélite mostraban este cambio. No se ha observado una hipermetilación del hMSH2 en ningún otro grupo. Los datos indican que más o menos el 15% de todos los pacientes con cáncer de colon de los que se sabe que tienen tumores con una inestabilidad del microsatélite tienen una hipermetilación del gen hMLH1 en ADN tumoral, y que el silenciamiento de la transcripción asociado con este cambio es la causa de la inestabilidad genética en este escenario.

Ejemplo 7

Estudios mediante MSP del gen del Inhibidor Tisular de la Metaloproteinasa II (TIMP 2). El TIMP2 es un miembro de una familia de inhibidores de metaloproteinasas que son necesarios para limitar el potencial invasivo de múltiples tipos celulares. Usando los cebadores y las condiciones de la MSP con este gen (Tabla 2; SEQ ID NO: 157-160), se encontró una hipermetilación del promotor de TIMP2 en aproximadamente el 50% de los cánceres de colon primarios. Este cambio, y la asociada pérdida de expresión de este gen, podría ser un factor clave en el aumento del potencial de los cánceres de colon implicados.

Ejemplo 8

Estudios mediante MSP de los genes del Receptor del TGF-\beta I y II. Los cebadores y las condiciones de la MSP proporcionados previamente (Tabla 2; SEQ ID NO: 177-184) se han empleado con éxito con los genes del receptor del TGF-\beta I y II, y hasta la fecha no se han encontrado signos de una hipermetilación del promotor en los tumores.

Consecuentemente, la invención sólo está limitada por las siguientes reivindicaciones.

<110> THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY

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HERMAN, James G.

\hskip1cm

BAYLIN, Stephen B.

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<120> DETECCIÓN ESPECÍFICA DE METILACIÓN

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<130> JHU1360-2EP

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<140> EP 97927933.8

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<141> 1997-06-03

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<150> PCT/US 97/09533

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<151> 1997-06-03

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<150> US 08/835.728

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<151> 1997-04-11

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<150> US 08/656.716

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<151> 1996-06-03

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<160> 216

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia objetivo

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcggtccgcc ccaccctctg

\hfill

20

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<210> 2

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<211> 16

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia objetivo

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccacggccgc ggcccg

\hfill

16

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<210> 3

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia objetivo

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcgatccgcc ccaccctcta ataa

\hfill

24

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<210> 4

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia objetivo

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttacggtcgc ggttcggggt c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaatccacc ccaccctcta ataa

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttatggttgt ggtttggggt tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgatccgcc ccaccctcta ataa

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtcggagg tcgatttagg tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaatccacc ccaccctcta ataa

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggttggagg ttgatttagg tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctggccgca gggtgcg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggccgctc ggccact

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaccgcaaaa tacgaacgc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcggtcgttc ggttattgta cg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaccacaaaa tacaaacaca tcaca

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggttgttt ggttattgta tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgtacgcaa aaaaatcctc ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcgcggcgt tcggttc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acatacacaa aaaaatcctc caac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttgtggtgt ttggtttggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgcgataac cctctaacct as

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcggtaggt gaatttttag tta

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaataaccc tctaacctaa aatta

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgttgttg attggttgtg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgacctcta aatacctaaa accc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtagaggtt ttataggtta tttgga

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaacctcta aatacctaaa accc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtagaggtt ttataggtta tttggt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgaactta ctactatcca aatacac

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttacggtta gatcggtttt ttttacg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaaactta ctactatcca aatacacc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggttagatt ggtttttttt atgg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccccgact cccgaaataa a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcgtcgga gtttttgtac gtt

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acccccaact cccaaaataa aaaa

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttgttgga gtttttgtat gttt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgaccgct acaccccgaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcgtgatt ttagtattgg ggc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaaccact acaccccaaa catc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttgtgatt ttagtattgg ggtgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccaacgact actcttattc ccg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcgtcgtt tttatagggt tttg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accaacaact actcttattc ccacc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttgttgtt tttatagggt tttgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgcacaac cgactacgac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggcgttagg gcgggtatc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacacacaac caactacaac cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtgttagg gtgggtattg tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgtaaccaa aaaaaataaa taatatac

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgttggtg agttatga

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acataaccaa aaaaaataaa taatatacaa

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgttggtg agttatgagt gttaag

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaccgcgcta ccttctacga atat

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgggaggg gttcgtt

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaccacacta ccttctacaa atatatttac ta

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgggaggg gtttgttttg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaccctaa taaaacgtct acgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgggtagt tacgatgagg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaaccctaa taaaacatct acatcaaaa

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgggtagt tatgatgagg tggt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaacgacatt ttaacgccaa aaa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggcggggga agttattta

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaacaacatt ttaacaccaa aaaaacc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtggggga agttatttag tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaacgacgtc cgaccacga

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtgtagtc gaaggagacg ttg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaacaacatc caaccacaac aacc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtgtagtt gaaggagatg ttgtagttg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatacccgaa tacccctaac aac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcgttttt acgttttttt aggg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatacccaaa tacccctaac aaca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttgttttt atgttttttt agggga

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaactacc aaacgaaccc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggcggtt agggagg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaaactacc aaacaaaccc aacc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtggtggtt agggaggtgg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgaaaat atcgtcg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgtttcgt cggttt

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acacaaaaat atcatcactc catac

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgttttgt tggtttttag gt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgctaacc gcctacaaac a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtcgttta ggggtgcgt

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacactaacc acctacaaac accca

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggttgttta ggggtgtgtt atgtt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactccgcct ctaccgc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtttttgt tagtttattt cg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactccacct ctaccaccta at

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtttttgt tagtttattt tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgaaaac gaaaccga

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcgtttcgg atatgttggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acacaaaaac aaaaccaaaa cac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgttttgg atatgttggg a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaacgtccct caacgccgta a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtatgcgcg gtaggtcgtt t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaacatccct caacaccata aaactc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtatgtgtg gtaggttgtt ttttttttt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaaactca aacccgaaac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtttatcgt gaggatcgtt attat

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaaaactca aacccaaaac cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtttattgt gaggattgtt attatgg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctactaaac taccccaaac cgtc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtcgttat ggcggtgtc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actactaaac taccccaaac catcc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia objetivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggttgttat ggtggtgttg gag

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagagggtgg ggcggaccgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggccgcgg ccgtgg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttattagagg gtggggcgga tcgc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaccccgaac cgcgaccgta a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttattagagg gtggggtgga ttgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaccccaaa ccacaaccat as

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taccttatta gagggtgggg cggatcgc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacctaaat cgacctccga ccg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttattagagg gtggggtgga ttgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacctaaat caacctccaa cca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcaccctgc ggccaga

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtggccgag cggccgg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgttcgtat tttgcggtt

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtacaataa ccgaacgacc ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgatgtgt ttgtattttg tggtt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatacaata accaaacaac caa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggaggattt ttttgcgtac gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaccgaacg ccgcgaa

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttggaggat ttttttgtgt atgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccaaaccaa acaccacaaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttaggttaga gggttatcgc gt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taactaaaaa ttcacctacc gac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taattttagg ttagagggtt attgt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaaccaat caacaacaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggttttagg tatttagagg tcgc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accaaataac ctataaaacc tctacg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggttttagg tatttagagg ttgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accaaataac ctataaaacc tctaca

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgtatttgg atagtagtaa gttcgtc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtaaaaaaa accgatctaa ccgtaaa

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgtatttg gatagtagta agtttgtt

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccataaaaaa apccaatcta acca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttatttcgg gagtcggggg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacgtacaaa aactccgacg acg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttttattt tgggagttgg gggt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaacatacaa aaactccaac aaca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcggggtgt agcggtcgtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccccaatac taaaatcacg acg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgtttggg gtgtagtggt tgtt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaccccaat actaaaatca caaca

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggaataag agtagtcgtt ggc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaaacccta taaaaacgac gacg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgggaata agagtagttg ttggt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaaaaccct ataaaaacaa caaca

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcgtagtcg gttgtgcgtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatacccgec ctaacgccg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggttgtagt tggttgtgtg tt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaataccc accctaacac ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtatattatt tatttttttt ggttacgc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcataactcg ccaacgcg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgtatatta tttatttttt ttggttatgt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttaacactc ataactcacc aacaca

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atattcgtag aaggtagcgc ggtc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacgaacccc tcccgcg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagtaaatat atttgtagaa ggtagtgtgg tt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaaacaaac ccctcccaca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgtagacgt tttattaggg tcgc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcatcgta actacccgcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttgatgta gatgttttat tagggttgt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accacctcat cataactacc caca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttggcgt taaaatgtcg ttc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaataactt cccccgccg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtttttttg gtgttaaaat gttgttt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccactaaata acttccccca cca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgtggtcgg acgtcgttc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caacgtctcc ttcgactaca ccg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttgttgtg gttggatgtt gttt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caactacaac atctccttca actacacca

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgttaggg gtattcgggt atc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctaaaaaa acgtaaaaac gacg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttgttagg ggtatttggg tatt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcccctaaaa aaacataaaa acaaca

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggttcgtt tggtagttcg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctccctaac cgccgcg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttgggttt gtttggtagt ttgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccacctccc taaccaccac a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgacgatatt ttcgcgc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaccgacga aacgcg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtatggagtg atgatatttt tgtgt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acctaaaaac caacaaaaca ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtttgtagg cggttagcgt c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgcacccct aaacgaccg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggtgtttg taggtggtta gtgtt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacataacac acccctaaac aacca

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggtagagg cggagtc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaaataaac taacaaaaac cg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attaggtggt agaggtggag tt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaaaataaa ctaacaaaaa cca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcggtttcgt tttcgcgc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccaacatat ccgaaacgcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgttttggt tttgtttttg tgt

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcccaacata tccaaaacac a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttacggcgtt gagggacgtt c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaacgaccta ccgcgcatac g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagttttatg gtgttgaggg atgttt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaaaaaaaa acaacctacc acacataca

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtttcgggtt tgagtttcgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataataacga tcctcacgat aaacg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggttttggg tttgagtttt gt

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccataataac aatcctcaca ataaaca

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacggtttgg ggtagtttag tagc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacaccgcca taacgaccg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatggtttg gggtagttta gtagt

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccaacacc accataacaa cca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttagagg atttgaggga tagg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacctaatt ccaattcccc taca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttcccag tcacgacagt attaggagga agaaagagga g

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccaattccc ctacaaactt c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacctaatt ccaattcccc taca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcactagagg gtggggcgga tcgc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttattaga gggtggggcg gatcgc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de amplificación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggcaacccc aaaccacaac cataa

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (24)

1. Un procedimiento para detectar un ácido nucleico que contiene CpG metilado que comprende:

(a) poner en contacto un espécimen que contiene un ácido nucleico con un agente que modifique una citosina desmetilada,

(b) amplificar el ácido nucleico que contiene el CpG en el espécimen mediante cebadores oligonucleotídicos específicos, que están diseñados para reconocer específicamente los sitios de CpG, en el que los cebadores oligonucleotídicos distinguen entre un ácido nucleico modificado metilado y no metilado, y

(c) detectar el ácido nucleico metilado.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que el agente de modificación es bisulfito.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la citosina es modificada a uracilo.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además poner en contacto el ácido nucleico con una endonucleasa de restricción sensible a la metilación.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la endonucleasa de restricción se elige del grupo formado por MspI, HpaII, BssHII, BstUI y NotI.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ácido nucleico que contiene el CpG está en una región promotora.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el promotor es un promotor de un gen supresor tumoral.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el gen supresor tumoral se elige del grupo formado por p16, p15, E-cadherina y VHL.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ácido nucleico que contiene el CpG codifica una proteína elegida del grupo formado por receptor de andrógeno, receptor de estrógeno, TGF-\betal, TGF-\beta2, p130, BRCA2, NF1, NF2, TSG101, MDGI, GST-pi, calcitonina, HIC-1, receptor de endotelina B, TIMP-2, 06-MGMT, MLH1, MSH2 y GFAP.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el espécimen se elige del grupo formado por tejido del cerebro, del colon, urogenital, pulmonar, renal, hematopoyético, de mama, del timo, testicular, ovárico y uterino, o suero, orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, esputo, eyaculado, sangre y heces.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la presencia de un ácido nucleico que contiene CpG metilado en el espécimen es indicativa de una alteración proliferativa de la célula.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la alteración se elige del grupo formado por astrocitoma de grado menor, astrocitoma anaplásico, glioblastoma, meduloblastoma, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer renal, leucemia, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de endometrio y neuroblastoma.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el cebador hibrida con una secuencia polinucleotídica objetivo, habiendo elegido la secuencia del grupo formado por las SEQ ID NO: 1-103 y la SEQ ID NO: 104.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que los cebadores se eligen del grupo formado por las SEQ ID NO: 105-207 y la SEQ ID NO: 208.

16. Un kit para la detección de un ácido nucleico que contiene CpG metilado a partir de una muestra que comprende:

(a) un reactivo que modifica nucleótidos de citosina desmetilados;

(b) un ácido nucleico de control;

(c) cebadores oligonucleotídicos que están diseñados para reconocer específicamente sitios de CpG, en el que los cebadores oligonucleotídicos distinguen entre un ácido nucleico metilado y desmetilado, y amplificar el ácido nucleico desmetilado;

(d) cebadores oligonucleotídicos que están diseñados para reconocer específicamente sitios de CpG, en el que los cebadores oligonucleotídicos distinguen entre un ácido nucleico metilado y desmetilado, y amplificar el ácido nucleico metilado; y

(e) cebadores para la amplificación del ácido nucleico de control.

17. El kit de la reivindicación 16, en el que la citosina es modificada a uracilo.

18. El kit de la reivindicación 16 ó 17, que comprende además un tampón de amplificación de ácido nucleico.

19. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que el reactivo que modifica la citosina desmetilada es bisulfito.

20. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que los cebadores hibridan con una secuencia polinucleotídica objetivo, habiendo elegido la secuencia del grupo formado por las SEQ ID NO: 1-103 y la SEQ ID NO: 104.

21. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que los cebadores se eligen del grupo formado por las SEQ ID NO: 105-207 y la SEQ ID NO: 208.

22. Pares de cebadores oligonucleotídicos para la detección de un ácido nucleico que contiene CpG metilado, en el que cada cebador del par de cebadores hibrida con una secuencia polinucleotídica objetivo, habiendo elegido la secuencia del grupo formado por las SEQ ID NO: 1-104; en el que la secuencia objetivo ha sido tratada previamente según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;

y en el que el par de cebadores distingue entre un ácido nucleico metilado y no metilado en presencia o ausencia de un producto de amplificación producido usando el par de cebadores; y en el que

(a) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 3 y 4, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 107 y 108;

(b) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 5 y 6, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 109 y 110;

(c) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 7 y 8, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 111 y 112;

(d) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 9 y 10, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 113 y 114;

(e) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 13 y 14, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 117 y 118;

(f) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 15 y 16, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 119 y 120;

(g) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 17 y 18, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 121 y 122;

(h) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 19 y 20, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 123 y 124;

(i) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 21 y 22, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 125 y 126;

(j) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 23 y 24, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 127 y 128;

(l) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 25 y 26, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 129 y 130;

(m) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 27 y 28, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 131 y 132;

(n) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 29 y 30, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 133 y 134;

(o) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 31 y 32, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 135 y 136;

(p) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 33 y 34, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 137 y 138;

(q) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 35 y 36, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 139 y 140;

(r) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 37 y 38, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 141 y 142;

(s) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 39 y 40, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 143 y 144;

(t) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 41 y 42, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 145 y 146;

(u) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 43 y 44, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 147 y 148;

(v) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 45 y 46, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 149 y 150;

(w) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 47 y 48, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 151 y 152;

(x) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 49 y 50, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 153 y 154;

(y) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 51 y 52, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 155 y 156;

(z) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 53 y 54, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 157 y 158;

(aa) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 55 y 56, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 159 y 160;

(bb) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 57 y 58, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 161 y 162;

(cc) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 59 y 60, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 163 y 164;

(dd) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 61 y 62, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 165 y 166;

(ee) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 63 y 64, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 167 y 168;

(ff) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 65 y 66, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 169 y 170;

(gg) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 67 y 68, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 171 y 172;

(hh) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 69 y 70, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 173 y 174;

(ii) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 71 y 72, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 175 y 176;

(jj) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 73 y 74, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 177 y 178;

(kk) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 75 y 76, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 179 y 180;

(ll) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 77 y 78, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 181 y 182;

(mm) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 79 y 80, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 183 y 184;

(nn) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 81 y 82, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 185 y 186;

(oo) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 83 y 84, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 187 y 188;

(pp) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 85 y 86, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 189 y 190;

(qq) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 87 y 88, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 191 y 192;

(rr) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 89 y 90, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 193 y 194;

(ss) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 91 y 92, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 195 y 196;

(tt) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 93 y 94, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 197 y 198;

(uu) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 95 y 96, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 199 y 200;

(vv) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 97 y 98, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 201 y 202;

(ww) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 99 y 100, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 203 y 204;

(xx) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 101 y 102, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 205 y 206; y

(yy) cuando la secuencia objetivo es las SEQ ID NO: 103 y 104, el par de cebadores es las SEQ ID NO: 207 y 208.

23. El par de cebadores de la reivindicación 22, en el que el par de cebadores son las SEQ ID NO: 105-207 y la SEQ ID NO: 208, en pares secuenciales.

24. Uso de un kit de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 en un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.