DE19806274A1 - Verfahren zum Nachweis von Aspergillus-Nukleinsäuren in einer Körperprobe, Nukleinsäure-Sonden und Diagnosekits zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zum Nachweis von Aspergillus-Nukleinsäuren in einer Körperprobe, Nukleinsäure-Sonden und Diagnosekits zur Durchführung des VerfahrensInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis
von Aspergillus-Nukleinsäuren in einer Körperprobe, wobei man
Nukleinsäuren aus der Körperprobe isoliert und mit Hilfe der
Zwei-Schritt-PCR diejenigen amplifiziert, deren Sequenzen im
wesentlichen homolog zu Teilen des 3'-Endes der 18S-rRNA-Gene
von Aspergillus sind. Des weiteren betrifft die vorliegende
Erfindung bestimmte Nukleinsäure-Sonden und Diagnosekits zur
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Inzidenz lebensbedrohlicher durch Pilze hervorgerufener
Infektionen ist im Vergleich zu bakteriellen Infektionen zwar
niedriger, jedoch wird etwa seit Anfang der 70er Jahre eine
ansteigende Tendenz schwerer systemischer Pilzinfektionen
beobachtet. Diese Infektionen treten vorwiegend dann auf, wenn
schwerwiegende Veränderungen der Infektionsabwehr vorliegen.
Gerade bei hämatologisch-onkologischen Risikopatienten mit lang
andauernder Einschränkung der zellulären Immunabwehr steigt die
Inzidenz invasiver Mykosen mit konsekutiv hoher Sterblichkeit.
Darüber hinaus sind auch zunehmend HIV-infizierte,
organtransplantierte und intensiv therapierte Patienten sowie
Frühgeborene betroffen.
Besonders hoch ist die Sterblichkeit bei systemischen,
invasiven Infektionen mit Schimmelpilzen der Gattung
Aspergillus. Sie kann bis zu 100% bei persistierender oder
längerfristiger, hochgradiger Neutropenie (Reduktion der weißen
Blutkörperchen) betragen. In der Tat sind invasive
Aspergillosen für etwa 41% der Todesfälle bei Patienten mit
akuter Leukämie verantwortlich. An einigen
Knochenmarktransplantationszentren ist die systemische
Aspergillose inzwischen die häufigste, tödlich verlaufende
Infektion. Hämatologisch-onkologische Patienten mit invasiven
Aspergillus-Infektionen haben zudem ein hohes Rezidivrisiko bei
erneuten Neutropenien, trotz adäquater Therapie. Gerade bei
diesen mit hoher Sterblichkeit einhergehenden schweren
Infektionen stehen im Gegensatz zu bakteriellen Infektionen nur
vergleichsweise schlechte therapeutische und prophylaktische
Möglichkeiten zur Verfügung.
Pilze werden herkömmlicherweise mikrobiologisch-kulturell über
ihre Morphologie und Nährstoffansprüche identifiziert.
Problematisch ist, daß die dazu erforderliche Kultivierung bis
zu ca. 2 Wochen in Anspruch nimmt und ein und derselbe
Organismus je nach Wachstumsbedingungen unterschiedliche Formen
annehmen kann. Selbst für ausgesprochene Experten ist die
Identifizierung oft mit großen Schwierigkeiten verbunden.
Serologische Methoden bieten bis heute keine Alternative, da
das Immunsystem betroffener Patienten stark beeinträchtigt ist
und bisher Versuche eines Antigennachweises, beispielsweise
über Radioimmunoassays, Immunoblotting-Assays, Enzym-Immuno
assays oder Latex-Agglutinationstests, wegen schlechter
Sensitivität nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen geführt
haben.
So ist die Frühdiagnose und Verlaufsbeurteilung invasiver
Mykosen sowohl auf klinischer, laborchemisch-serologischer als
auch auf konventionell-radiologischer Seite bislang wenig
spezifisch und in Frühstadien der Erkrankung wenig sensitiv.
Die klinische Diagnose erfolgt häufig erst in Spätstadien der
Mykose. Etwa 30 bis 40% der Pilzinfektionen werden erst bei
der Autopsie diagnostiziert.
Erschwerend kommt hinzu, daß selbst bei frühzeitiger Einleitung
einer systemischen Therapie die Quoten für ein Therapieversagen
mit über 20% sehr hoch sind. Darüber hinaus existieren für die
Dauer und Gesamtdosis einer antimykotischen Therapie keine
einheitlich akzeptierten Richtlinien. Es gibt vor allem wegen
der klinisch-problematischen Diagnostik der Erkrankung weder in
der Initialdiagnostik noch zum Monitoring des Therapie- und
Krankheitsverlaufs einen validierten, gut praktikablen, wenig
mit Nebenwirkungen belasteten Parameter. Dies wäre jedoch
besonders in Anbetracht der ausgeprägten systemischen Toxizität
von Amphotericin B, dem "Goldstandard" der antimykotischen
Therapie systemischer Aspergillosen, wünschenswert.
In Anbetracht der Notwendigkeit eines rasch durchzuführenden,
hoch sensitiven und spezifischen Tests, der zudem mit möglichst
wenig Belastung für den betroffenen Patienten verbunden sein
muß, haben einige Forschungsteams fortschrittliche
molekularbiologische Techniken benutzt, um Verfahren zu
entwickeln, die auf dem Nachweis und der Identifizierung von
DNA-Sequenzen ribosomaler Gene basieren. Es wird davon
ausgegangen, daß die Ribosomen aller zellulärer Organismen
artspezifische rRNA enthalten. In Eukaryoten findet man vier
verschiedene rRNA's, die über ihre Größe bzw. den davon
abhängenden Sedimentationskoeffizienten S als 5S-, 5,8S-, 18S- und
28S-rRNA bezeichnet werden. Da alle Ribosomen die gleiche
für eine Zelle unerläßliche Funktion ausüben, sind die
entsprechenden Gene hoch konserviert. Es gibt allerdings auch
einige hypervariable Bereiche, in denen sich die Sequenzen von
Art zu Art unterscheiden können.
So gelang es bereits, genomische ribosomale DNA (rDNA) mit
Hilfe der Polymerasekettenreaktion (im folgenden kurz als "PCR"
bezeichnet) zu amplifizieren oder ribosoinale RNA (rRNA)
zunächst durch reverse Transkription in cDNA umzuschreiben und
diese anschließend mittels PCR zu amplifizieren.
Beispielsweise konnten geringe Mengen genomischer rDNA von
Aspergillus fumigatus aus bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit
bis in den Bereich von 1 pg nachgewiesen werden. Für die PCR
wurden in diesem Ansatz spezifische Primer aus der Sequenz des
28S-rRNA-Gens benutzt, wodurch ein 401 Basenpaare umfassendes
Fragment amplifiziert werden konnte (Spreadbury et al., J.
Clin. Microbiol. (1993) 31(3) : 615-621).
Eine weitere Forschungsgruppe griff auf die Gene der 18S-rRNA
zurück und erzielte PCR-Amplifikate aus bronchoalveolärer
Lavageflüssigkeit bei immunkompromittierten neutropenen, nicht
aber bei immunkompetenten Patienten. Dieses Verfahren weist
eine gewisse Genusspezifität auf, wogegen eine hinreichende
Sensitivität erst durch die Kopplung der PCR mit einer
anschließenden Southern-Blot-Analyse erreicht wird. Darüber
hinaus ist eine zusätzliche Restriktionsanalyse der
amplifizierten DNA erforderlich, um einer Infektion mit
Paecilomyces variotii zugrundeliegende, falsch positive
Antworten auszuschließen (Melchers et al., J. Clin. Microbiol.
(1994) 32(7) : 1710-1717).
Ein ebenfalls auf der PCR-vermittelten Amplifizierung
bestimmter Fragmente der 18S-rRNA-Gene basierendes Verfahren
zum Nachweis von Candida- und Aspergillus-Arten wurde an
Blutproben immunkompromittierter Patienten getestet. Auch hier
gilt, daß eine Unterscheidung zwischen Aspergillus-Arten
einerseits und Candida-Arten andererseits erst durch eine sich
der PCR anschließende Southern-Blot-Analyse unter Verwendung
einer spezifischen Hybridisierungssonde vorgenommen werden
konnte (Einsele et al., J. Clin. Microbiol. (1997) 35 : 1353-1360).
Kürzlich wurde erstmals die Verwendung einer Zwei-Schritt-PCR
zum Nachweis von Aspergillus-Arten aus Blut
immunkompromittierter Patienten beschrieben. Dazu wurden zwei
Primer-Paare gewählt, wobei sowohl die stromabwärts gelegenen
Primer eines jeden Paares als auch die stromaufwärts gelegenen
Primer eines jeden Paares gemeinsame Sequenzen aufweisen, d. h.
miteinander überlappen und an eine gemeinsame hypervariable
Region des 18S-rRNA-Gens binden. Mit Hilfe dieses Verfahrens
konnten bis zu 50 fg DNA, die aus Aspergillus fumigatus
extrahiert worden war, nachgewiesen werden. Wie allerdings
selbst die Erfinder einräumen, ist dieses Verfahren zur
klinischen Anwendung nicht geeignet (Yainakami et al., J. Clin.
Microbiol. (1996) 34: 2464-2468).
Angesichts der vorstehend geschilderten Situation war es
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein leistungsfähiges und
zuverlässiges Verfahren zum klinischen Nachweis von Aspergillus
bereitzustellen.
Diese Aufgabe wurde überraschenderweise durch ein Verfahren auf
Grundlage der Zwei-Schritt-PCR gelöst, bei der die im ersten
Schritt verwendeten Primer nicht mit den im zweiten Schritt
verwendeten Primern überlappen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren
zum Nachweis von Aspergillus-Nukleinsäuren in einer
Körperprobe, wobei man Nukleinsäuren aus der Körperprobe
isoliert und mit Hilfe der Zwei-Schritt-PCR Nukleinsäuren
amplifiziert, deren Sequenzen im wesentlichen homolog zu Teilen
des 3'-Endes der 18S-rRNA-Gene von Aspergillus sind, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß die im ersten Schritt zur
Amplifizierung verwendeten Primer nicht mit den im zweiten
Schritt verwendeten Primern überlappen.
Unter dem Begriff Aspergillus-Nukleinsäuren versteht man RNA,
insbesondere rRNA, DNA, insbesondere genomische rDNA, der
Schimmelpilz-Gattung Aspergillus. Diese Gattung umfaßt eine
Vielzahl verschiedener Arten (Spezies), beispielsweise
Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus
fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans,
Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus,
Aspergillus versicolor, Aspergillus unguis und Aspergillus
ustus. Insbesondere die Arten Aspergillus flavus, Aspergillus
fumigatus, Aspergillus niger und Aspergillus terreus sind oft
für die eingangs geschilderten menschlichen Erkrankungen
verantwortlich. Nicht nur in Nordamerika scheinen die meisten
Aspergillosen auf eine Infektion mit Aspergillus fumigatus
zurückzugehen, so daß dieser Erreger im Rahmen der vorliegenden
Erfindung besonders wichtig ist.
Bezüglich der Wahl der Körperprobe unterliegt das
erfindungsgemäße Verfahren keinen prinzipiellen
Einschränkungen. Es wird vorzugsweise an den Körperproben
angewendet, bei denen in der Regel mit einem Pilzbefall zu
rechnen ist oder die zumindest mit befallenen Stellen in
Kontakt stehen und daher Hinweise auf einen Pilzbefall geben
können. Im Hinblick auf Aspergillosen ist in erster Linie der
respiratorische Trakt zu nennen, dessen direkte Untersuchung
allerdings in der Regel eine Biopsie erforderlich macht.
Weniger invasive aber dennoch etwas belastend ist die
bronchoalveoläre Lavage. Insbesondere bei Patienten mit
schwachem Gesundheitszustand greift man deshalb bevorzugt auf
leicht entnehmbare Körperflüssigkeiten zurück, wie Blut oder
Sputum, die bei der Untersuchung auf systemische Infektionen
besondere Vorteile bieten können.
Erfindungsgemäß steht die Umschreibung "18S-rRNA-Gene von
Aspergillus" für funktionell im wesentlichen gleichwirkende
aber sequenzspezifisch gegebenenfalls voneinander abweichende
Gene verschiedener Aspergillus-Arten, -Rassen, -Varianten,
-Mutanten und dergleichen. Das 3'-Ende eines solchen Gens
kodiert das 3'-Ende der resultierenden rRNA. Daraus folgt
unmittelbar, daß erfindungsgemäß Nukleinsäuren amplifiziert
werden, deren Sequenzen auch im wesentlichen homolog zu Teilen
des 3'-Endes der 18S-rRNA's von Aspergillus sind.
Die vollständige Sequenz des 18S-rRNA-Gens von Aspergillus
fumigatus wurde bei der DDBJ-EMBL-Gen-Bank hinterlegt; es trägt
die Hinterlegungsnummer AB 008401 und ist dort publiziert. Die
Sequenz der Basen +1 bis +1733 ist in Fig. 1 dargestellt.
Teile verwandter Sequenzen von Aspergillus nidulans,
Aspergillus niger, Aspergillus flavus und Aspergillus terreus
sind in Melchers et al., J. Clin. Microbiol. (1994) 32
(7): 1710-1717 beschrieben.
Die in Fig. 1 beschriebene Sequenz kann in konservierte und
hypervariable Bereiche eingeteilt werden. Für die vorliegende
Erfindung sind insbesondere die hypervariablen Bereiche am
3'-Ende von Interesse, die üblicherweise mit V7 (etwa +1306 bis
etwa +1362), V8 (etwa +1436 bis etwa +1513) und V9 (etwa +1632
bis etwa +1700) bezeichnet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist die Sequenz des im ersten PCR-Schritt
amplifizierten Fragments (äußeres Fragment) im wesentlichen
homolog zu einer in Fig. 1 gezeigten Sequenz, die den Bereich
V7 zumindest teilweise, V8 vollständig und V9 zumindest
teilweise überspannt, und das im zweiten Schritt amplifizierte
Fragment (inneres Fragment) im wesentlichen homolog zu einer in
Fig. 1 gezeigten Sequenz, die den Bereich V7 nicht, aber V8
und V9 zumindest teilweise überspannt. Besonders bevorzugt sind
Amplifikate des äußeren Fragmentes, die V7 und V9 vollständig
überspannen sowie Amplifikate des inneren Fragmentes, die V8
vollständig und V9 teilweise überspannen. Funktionelle
Äquivalente dieser Fragmente sind ebenfalls Gegenstand der
bevorzugten Ausführungsform.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform amplifiziert
man im ersten Schritt eine Nukleinsäure mit der in Fig. 1
gezeigten Nukleotidsequenz von Nukleinsäurerest +1296 bis
+1700, oder ein Fragment oder funktionelles Äquivalent davon,
und im zweiten Schritt eine Nukleinsäure mit der in Fig. 1
gezeigten Nukleotidsequenz von Nu)cleinsäurerest +1436 bis
+1671, oder ein Fragment oder funktionelles Äquivalent davon.
Mit funktionellen Äquivalenten seien erfindungsgemäß
funktionell im wesentlichen gleichwirkende aber sequenzspezisch
und/oder basentypisch voneinander abweichende Nukleinsäuren
gemeint. Beispielsweise gehören derivatisierte, wie mit
Markierungen oder Mitteln zur deren Befestigung und/oder
Immobilisierungsmitteln versehene Nukleinsäuren dazu.
Die Sequenz der Amplifikate hängt wesentlich von der Wahl der
Primer ab, die zu den beiden 3'-Einzelstrangenden des zu
amplifizierenden Nukleinsäure-Fragmentes komplementär sind und
somit dessen Enden bestimmen. Andererseits kann man die
Amplifikation einer bestimmten Nukleinsäure, dessen Sequenz
zumindest in Teilen bekannt sein sollte, durch die Wahl
geeigneter Primer erreichen.
Da das erfindungsgemäße Verfahren auf der Zwei-Schritt-PCR
basiert, wird in einem ersten Schritt eine durch ein erstes
Primer-Paar (äußere Primer) definierte Nukleinsäure (äußeres
Fragment) amplifiziert. Im zweiten Schritt wird dann durch ein
zweites Primer-Paar (innere Primer) definiertes Fragment
(inneres Fragment) der im ersten Schritt amplifizierten
Nukleinsäure (äußeres Fragment) amplifiziert. Die inneren
Primer müssen daher unter den gewählten Reaktionsbedingungen an
das äußere Fragment binden, was voraussetzt, daß die Sequenzen
dieser Primer zu Teilen der Sequenz des äußeren Fragmentes im
wesentlichen komplementär sind. Das erfindungsgemäße Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, daß die im ersten Schritt
verwendeten Primer nicht mit den im zweiten Schritt verwendeten
Primern überlappen. Mit anderen Worten unterscheiden sich
inneres und äußeres Fragment sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende
um wenigstens die Länge der dem jeweiligen Ende zuzuordnenden
äußeren Primer.
In der Regel handelt es sich bei den erfindungsgemäß
verwendeten Primern um Nukleinsäure-Sonden mit einer Länge von
15 bis 25 Basen, die unter Verwendung konventioneller
Synthetisiermaschinen hergestellt werden können.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist die Sequenz des ersten äußeren Primers im
wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der in Fig. 1
gezeigten Sequenz des Bereichs V7 und die Sequenz des anderen
äußeren Primers im wesentlichen homolog zu wenigstens einem
Teil der in Fig. 1 gezeigten Sequenz des Bereichs V9.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die
Sequenz des ersten inneren Primers im wesentlichen homolog zu
wenigstens einem Teil der in Fig. 1 gezeigten Sequenz des
Bereichs V8 und die Sequenz des zweiten inneren Primers im
wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der in Fig. 1
gezeigten Sequenz des Bereichs V9.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform
verwendet man als Primer im ersten Schritt Nukleinsäure-Sonden
mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1 und SEQ ID NO : 2 und im
zweiten Schritt Nukleinsäure-Sonden mit den Nukleotidsequenzen
SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder funktionelle Äquivalente oder
Fragmente davon.
Erfindungsgemäß werden vor der eigentlichen PCR zumindest ein
Teil der in der Körperprobe enthaltenen Nukleinsäuren isoliert.
Unter Isolierung versteht man im vorliegenden Fall zumindest
eine Anreicherung von Nukleinsäuren, eine vollständige
Aufreinigung ist in der Regel nicht erforderlich, um die
anschließende PCR durchführen zu können.
Je nach Art der zu isolierenden Nukleinsäuren sind dem Fachmann
verschiedene allgemeine Vorgehensweisen bekannt. Soll
beispielsweise intakte RNA aus Gewebe und Zellen isoliert
werden, inaktiviert man in der Regel zunächst RNasen,
beispielsweise durch Guanidinisothiocyanat, entfernt dann ggf.
Proteine, Zelltrümmer, DNA und kleine RNAs und isoliert
anschließend Poly(A)⁺RNA, beispielsweise über die bekannte
Oligo(dT)-Zellulose-Chromatographie. Die so gewonnene
Poly(A)⁺RNA wird dann mittels reverser Transkription in cDNA
umgeschrieben. Dieser cDNA-Mix kann schließlich als Vorlage für
die sich anschließende PCR verwendet werden. Die Kombination
von reverser Transkription und PCR wird häufig auch kurz als
RT-PCR bezeichnet.
Zur Isolierung von DNA aus Zellen, insbesondere genomischer
DNA, werden die Zellen und Zellkerne in der Regel zunächst
lysiert, die DNA protoniert und hochmolekulare DNA ggf. nach
Entfernung löslicher Proteine ausgefällt. Nach der Lyse kann
die DNA auch extrahiert werden. Die so gewonnene DNA kann dann
direkt der PCR zugeführt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Isolierung von DNA
bevorzugt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird ein in an sich bekannter Weise aus der
Körperprobe isoliertes Leukozytenpellet zunächst mit einem
Zellwand degradierenden Enzym inkubiert, dann ein Tensid und
Proteinase K zugegeben und schließlich DNA in an sich bekannter
Weise extrahiert. Bei dem zellwanddegradierenden Enzym handelt
es sich vorzugsweise um Lyticase (Synonym: Yeast Lytic Enzyme),
oder ein funktionelles Äquivalent davon, d. h. ein Enzym mit
β-1,3-Glucanase-Aktivität. Lyticase ist im Handel erhältlich
oder kann aus verschiedenen Mikroorganismen, wie Achromobacter,
Arthrobacter oder Rhizoctonia, aufgereinigt werden oder über
rekombinante Methoden hergestellt werden.
Bei dem zur Freisetzung der Zellkerne verwendeten Tensid
handelt es sich vorzugsweise um SDS. Die Extraktion der DNA
erfolgt bevorzugt durch eine Phenolextraktion.
Das Vorgehen zur Isolierung des Leukozytenpellets hängt im
wesentlichen von der Art der Körperprobe ab. Aus
bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BAL) kann das
Leukozytenpellet nach Zentrifugation der Probe als
sedimentiertes Zellmaterial erhalten werden. Verwendet man
Blut, werden zunächst die Erythrozyten in an sich bekannter
Weise lysiert, wonach das Leukozytenpellet durch Zentrifugation
als sedimentiertes Zellmaterial gewonnen werden kann. Es sind
die üblichen Vorsichtsmaßnahmen zur Vermeidung von Porphyrin-
oder Heparinbestandteilen zu beachten, da diese zur Hemmung der
PCR führen können.
Vorteile der erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform zur
Isolierung von Nukleinsäuren sind die rasche Durchführbarkeit
und die Vermeidung von Kontaminationen mit Fremd-DNA,
insbesondere durch ubiquitär vorhandene Pilzsporen. Zudem ist
die Methode standardisierbar und auch automatisierbar.
Die isolierten Nukleinsäuren, d. h. die DNA oder der cDNA-Mix
werden dann der eigentlichen PCR zugeführt, indem man sie mit
einer geeigneten thermostabilen Polymerase, dNTP'S, Primer,
Mg2+-haltigem Puffer und entsprechende Mengen an Wasser
zusammengibt. Ein solcher Ansatz wird dann mehreren
Temperaturzyklen unterworfen, was bevorzugt in einem der
handelsüblichen Thermocycler vorgenommen werden kann. In der
Regel wird mit einer anfänglichen Denaturierung der isolierten
Nukleinsäure begonnen. Es schließen sich mehrere Zyklen an, die
jeweils einen Denaturierungs-, Anlagerungs-, und
Elongationsschritt beinhalten. In der Regel werden 20 bis 40
solcher Zyklen durchgeführt. Abschließend erfolgt eine letzte
Elongation, an die sich Maßnahmen zur Erkennung der Amplifikate
anschließen können. Jeder der vorstehend beschriebenen Schritte
ist durch eine bestimmte Temperatur und die Zeit, während der
diese Temperatur beibehalten wird, gekennzeichnet. Zur
optimalen Ausgestaltung einer PCR können diese Parameter in
einer dem Fachmann bekannten Art und Weise variiert werden. Die
Wahl der thermostabilen Polymerase, beispielsweise Taq-DNA-Po
lymerase, Tth-DNA-Polymerase oder Pwo-DNA-Polymerase, die
Mg2+-Konzentration und pH-Wert des PCR-Ansatzes stellen weitere
Parameter zur Beeinflussung des PCR-Ergebnisses dar.
Weiterhin besteht auch die Möglichkeit, die sogenannte "hot
start"-Technik zu nutzen, um eine nichtspezifische Anlagerung
des Primers und eine Primerelongation vor dem ersten
Denaturierungsschritt zu vermeiden. Dazu wird wenigstens eine
essentielle Reaktionskomponente von den übrigen
Reaktionskomponenten durch ein Septum, in der Regel ein Wachs,
getrennt. Mit dem ersten Erhitzungsschritt schmilzt dieses
Septum, die Reaktionskomponenten mischen miteinander und die
PCR beginnt.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Zwei-Schritt-PCR werden in
einem ersten Schritt die isolierten Nukleinsäuren mit den
erfindungsgemäßen äußeren Primern und allen weiteren
Reaktionskomponenten zusammengemischt und die Reaktion wie oben
beschrieben durchgeführt, was ein erstes PCR-Produkt ergibt.
Dann wird ein Aliquot dieses ersten PCR-Produktes mit den
erfindungsgemäßen inneren Primern und allen weiteren
Reaktionskomponenten zusammengemischt und die Reaktion von
neuem - wie oben beschrieben - durchgeführt, was das endgültige
PCR-Produkt der erfindungsgemäßen Zwei-Schritt-PCR ergibt.
Weitere Ausgestaltungen der PCR-Technik basieren auf
fachmännischem Wissen.
Zum Nachweis PCR-amplifizierter Nukleinsäuren stehen dem
Fachmann eine Reihe bekannter Techniken zur Verfügung.
Die einfachste Methode besteht in einer direkten Anfärbung des
Amplifikats. Als übliches Reagenz wird beispielsweise
Ethidiumbromid verwendet, das unter UV-Licht ein
fluoreszierendes Signal abgibt. Diese Methode ist allerdings
unspezisch, was in der Regel eine vorausgehende Auftrennung,
beispielsweise eine Gelelektrophorese, der in der PCR-Re
aktionslösung vorhandenen Nukleinsäuren erforderlich macht.
Ferner können Markierungen oder Mittel zur Befestigung einer
Markierung sowie Immobilisierungsmittel in einen oder mehrere
der verwendeten Primer und/oder auch während der Elongation
durch eine der in der PCR herkömmlicherweise verwendeten
thermostabilen Polymerasen eingeführt werden. Bei den
Immobilisierungsmitteln und Markierungen kann es sich
beispielsweise um Haptene, wie Biotin, Digoxigenin, Fluorescein
oder Tetramethylrhodamin, handeln. Derartige Haptene können
beispielsweise in kovalent an ein Nukleotid gebundener Form
eingeführt werden. Vorzugsweise handelt es sich dabei um UTP-De
rivate. Die Markierung durch Radionukleotide ist natürlich
auch möglich. Bei den Mitteln zur Befestigung eines Signals
oder einer Markierung greift man vorzugsweise auf 5'-nicht
hybridisierende DNA-Sequenzen zurück, die
Immobilisierungsmittel tragen, an einen festen Träger befestigt
sind und/oder eine Markierung tragen.
Bei den festen Trägern für die Immobilisierung kann es sich
beispielsweise um Microtiterkammern, Tauchstäbe, Fasern und
Partikel handeln, die einen Bindungspartner für die
Immobilisierungsmittel tragen, beispielsweise Streptavidin (für
Biotin) oder einen Anti-Hapten-Antikörper (für andere Haptene).
Magnetische Partikel stellen eine weitere vorteilhafte Variante
dar.
Derartige Markierungen können auf herkömmliche Weise erkannt
werden. Radioaktive und fluoreszierende Markierungen können mit
Hilfe entsprechender technischer Ausrüstung direkt nachgewiesen
werden, während andere Haptene, wie Biotin oder Digoxigenin,
unter Zuhilfenahme spezifischer Antikörper und einer daran
gekoppelten Nachweisreaktion sichtbar gemacht werden können.
Im Vergleich zur einfachen Ethidiumbromid-Färbung eines zur
Auftrennung des PCR-Produktes verwendeten Agarose-Gels kann die
Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens durch die
Verwendung der vorstehend geschilderten Immobilisierungs- und
Markierungssystem erheblich, d. h. um 1 bis 2 Größenordnungen,
gesteigert werden. Eine chromatographische Auftrennung ist in
der Regel nicht erforderlich.
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt eine hohe diagnostische
Wertigkeit für die Frühdiagnose und Verlaufskontrolle von
Aspergillosen, insbesondere von invasiven Aspergillosen bei
hämatologischen Risikopatienten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die
Nukleinsäure-Sonden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1, SEQ
ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder funktionelle
Äquivalente oder Fragmente davon. Werden derartige
Nukleinsäure-Sonden als Primer verwendet, versteht man unter
funktionellen Äquivalenten im wesentlichen gleichwirkende, d. h.
zur korrekten Basenpaarung befähigte und als Primer wirkende
Nukleinsäure-Sonden. Diese können in geeigneter Weise
derivatisiert, z. B. mit Markierungen und/oder Mitteln zur
Markierung oder Immobilisierung versehen sein. Eine derartige
Derivatisierung kann sowohl den Basen- als auch den Zucker- und/oder
Phosphatteil eines Nukleotids betreffen.
Diesbezügliche Ausgestaltungen beruhen ebenfalls auf
fachmännischem Wissen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind
Diagnosekits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Bevorzugt werden Diagnosekits, die wenigstens einen der Primer
mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID
NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder funktionelle Äquivalente oder
Fragmente davon enthalten. Besonders bevorzugt sind Diagnose
kits, die wenigstens ein Primer-Paar mit den Nukleotidsequenzen
SEQ ID NO : 1 und SEQ ID NO : 2 bzw. SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4,
oder funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon enthalten.
Ganz besonders bevorzugt werden Diagnosekits, die als äußere
Primer Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1
und SEQ ID NO : 2 und als innere Primer Oligonukleotide mit den
Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder
funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon enthalten.
Die erfindungsgemäßen Diagnosekits bestehen aus mehreren
Kompartimenten, die in der Regel die einzelnen
Reaktionskomponenten getrennt voneinander enthalten.
Essentieller Bestandteil erfindungsgemäßer Kits sind wenigstens
zwei Kompartimente für die beiden Primer-Paare, vorzugsweise
vier Kompartimente zur getrennten Aufbewahrung jedes einzelnen
Primers, sowie weitere Kompartimente, die Polymerase, dNTP's
und Mg2+-haltigen Puffer enthalten. Darüber hinaus kann der
erfindungsgemäße Diagnosekit weitere Elemente zur Markierung
und/oder Immobilisierung der PCR-Produkte, beispielsweise
markierte Nukleotide, Mittel zur Isolierung der Nukleinsäuren
aus der Körperprobe, beispielsweise bestimmte Lyse- und/oder
Extraktionspuffer, sowie Mittel zur Erkennung markierter oder
nichtmarkierter PCR-Produkte, wie spezifische
Hybridisierungssonden oder Antikörper zur Durchführung
bekannter Immunabsorptionsverfahren, wie ELISA's, enthalten.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung
verdeutlichen, ohne sie zu beschränken.
Circa 3-5 ml peripheres Blut werden mit dem 5-fachen Volumen an
RCLB (Red Cell Lysis Buffer; 1,55 M NH4Cl, 0,1 M NH4HCO3, 1 mM
EDTA pH 7,4) gemischt und ca. 10 min bei 4°C inkubiert. Nach
der Lyse der Erythrozyten wird die Probe 10 min bei 2000 rpm in
einer Hettich-Zentrifuge (Ausschwingrotor) abzentrifugiert. Der
Überstand wird verworfen, die sedimentierten Leukozyten werden
einmal mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung; 80 g NaCl,
2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, pH 7,2, auf 1 l) gewaschen
und erneut abzentrifugiert.
Das Leukozytenpellet wird in 300 µl PBS resuspendiert und 30
min bei 37°C mit ca. 100-125 U Lyticase (Sigma) inkubiert.
Anschließend erfolgt die Zugabe von SDS ad 0,5% (w/v) (15 ml
einer 10%igen SDS-Lösung) und von 500-1000 µg Proteinase K (10
mg/ml, Boehringer Mannheim). Die Probe wird 1 Stunde bei 55°C
inkubiert, anschließend 100 µl APEX (Aspergillus-Extraktions
puffer; 400 mM Tris/Cl, 1 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% SDS)
zugegeben, verbliebene Zellklumpen mit Hilfe einer Pipetten
spitze homogenisiert und der Ansatz 30 min bei 65°C erhitzt.
Die Extraktion der Pilz- und Patienten-DNA erfolgt durch eine
Phenolextraktion. Hierbei wird der Probe ein Volumen an Tris
gesättigtem Phenol zugegeben, kräftig gemischt, und 2-3 min in
einer Tischzentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit
zentrifugiert. Verbliebenes Phenol wird durch eine
anschließende Chloroformextraktion entfernt. Zu der wäßrigen
Phase der Probe werden 1/10 3 M Na-Acetat (pH 7,5) und 0,75%
(v/v) 100%iges Isopropanol gegeben. Die Probe wird bei 20°C
30 min inkubiert, die ausgefallene DNA mittels Zentrifugation
(13.000 rpm, 10 min) sedimentiert, einmal in 70%igem Ethanol
gewaschen und getrocknet. Die anschließende
Konzentrationsbestimmung der DNA erfolgt mittels
Spektralphotometrie bei 260 nm und 280 nm.
Eine Probe bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BAL) wird in
ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und 5 min in einer
Tischzentrifuge bei 13.000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand
wird verworfen und das sedimentierte Zellmaterial gewonnen.
Dieses Leukozytenpellet wird wie in Beispiel 1 beschrieben
weiter verarbeitet.
- a) 1. Schritt
Circa 50 ng der in Beispiel 1 oder Beispiel 2 gewonnenen DNA werden in ein Reaktionsgefäß gegeben. Dann werden 0,5-1 U Taq-DNA-Polymerase, 6,25 nmol dNTP's und 10 pmol des Primers mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO : 1 sowie 10 pmol des Primers mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO : 2 hinzugegeben. Das Gesamtvolumen der Probe wird mit Mg2+-haltigem Puffer auf 25 µl aufgefüllt. Diese Reaktionslösung wird gut durchmischt und sodann in einen Thermocycler gesetzt. Folgende Zyklusbedingungen kommen zur Anwendung:
Nach der abschließenden Elongation wird das Reaktionsgefäß
bei 4°C gehalten.
- b) 2. Schritt
1-2 µl des im 1. Schritt erhaltenen PCR-Produktes werden in ein weiteres Reaktionsgefäß gegeben. Dann werden die unter a) beschriebenen Reaktionskomponenten zugesetzt, gut durchmischt und das Reaktionsgefäß in den Thermocycler gesetzt. Folgende Zyklusbedingungen kommen zur Anwendung.
Nach der abschließenden Elongation wird die
Reaktionsmischung auf 4°C abgekühlt.
Das PCR-Produkt wird durch Agarosegelelektrophorese
aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht
sichtbar gemacht.
DNA aus Aspergillus fumigatus wird analog zu dem in Beispiel 1
beschriebenen Verfahren isoliert. Aliquots von 1 pg, 100 fg, 10
fg und 1 fg dieser DNA werden in der in Beispiel 3
beschriebenen Zwei-Schritt-PCR eingesetzt. Das PCR-Produkt wird
durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, mit Ethidiumbromid
gefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Der 10 fg DNA
enthaltende Ansatz ergibt ein noch gut erkennbares Signal,
während dem 1 fg DNA enthaltenden Ansatz kein eindeutiges
Signal zugeordnet werden kann. Die Nachweisgrenze für DNA von
Aspergillus fumigatus durch die in Beispiel 3 beschriebene
Zwei-Schritt-PCR liegt daher bei 10 fg.
DNA aus verschiedenen Aspergillus-Stämmen sowie einer Reihe von
ubiquitär vorkommenden humanpathogenen Pilzen und Bakterien
wird analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren
isoliert.
Jeweils 50 ng an isolierter DNA werden in der in Beispiel 3
beschriebenen Zwei-Schritt-PCR eingesetzt. Das PCR-Produkt wird
durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, mit Ethidiumbromid
gefärbt und unter UV-Licht gehalten. Ein fluoreszierendes
Signal zeigt das Vorliegen doppelsträngiger DNA (PCR-Am
plifikat) an. Als Kontrolle dient das PCR-Amplifikat von
Aspergillus fumigatus (Beispiel 4). Die resultierenden
Agarosegele sind in Fig. 2 abgebildet und deren Auswertung in
der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt:
Aus etwa 350 Blutproben von 100 Risikopatienten mit Fieber,
Neutropenie sowie vorhandenen oder im Röntgenthorax nicht
nachweisbaren Lungeninfiltrationen wurde DNA gemäß Beispiel 1
isoliert, die dann mit der in Beispiel 3 beschriebenen Zwei-Schritt-PCR
untersucht wurde.
Ferner wurden 50 dieser Patienten bronchoskopiert und BAL
gewonnen. Aus der BAL wurde gemäß Beispiel 2 DNA isoliert, die
dann mit der in Beispiel 3 beschriebenen Zwei-Schritt-PCR
untersucht wurde.
Blutproben von gesunden Probanden sowie BAL-Proben von
immunkompetenten Patienten mit Lungeninfiltraten und mit bzw.
ohne Fieber wurden ebenfalls getestet.
Alle Proben von Patienten mit einer gesicherten oder
wahrscheinlichen Aspergillose testeten positiv; die
Sensitivität betrug also 100%.
In 2% aller Blutproben und 6,2% aller BAL-Proben fanden sich
Signale, die bei retrospektiver Betrachtung des klinischen
Krankheitsverlaufs nicht mit einer Aspergillus-Infektion des
Patienten in Verbindung gebracht werden konnten; die Spezifität
betrug daher etwa 80%.
Claims (9)
1. Verfahren zum Nachweis von Aspergillus-Nukleinsäuren in
einer Körperprobe, wobei man Nukleinsäuren aus der Körper
probe isoliert und mit Hilfe der Zwei-Schritt-PCR diejeni
gen Nukleinsäuren amplifiziert, deren Sequenzen im wesent
lichen homolog zu Teilen des 3'-Endes der 18S-rRNA-Gene
von Aspergillus sind, dadurch gekennzeichnet, daß die im
ersten Schritt zur Amplifizierung verwendeten Primer nicht
mit den im zweiten Schritt verwendeten Primern überlappen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
im ersten Schritt eine Nukleinsäure mit der in Fig. 1
gezeigten Nukleotidsequenz von Nukleinsäurerest +1296 bis
+1700, oder ein Fragment oder funktionelles Äquivalent
davon, und im zweiten Schritt eine Nukleinsäure mit der in
Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz von Nukleinsäurerest
+1436 bis +1671, oder ein Fragment oder funktionelles
Äquivalent davon, amplifiziert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Primer im ersten Schritt Nukleinsäure-Sonden
mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1 und SEQ ID NO : 2 und
im zweiten Schritt Nukleinsäure-Sonden mit den
Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder
funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon, verwendet.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Körperprobe Blut oder
bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß ein in an sich bekannter Weise aus der
Körperprobe isoliertes Leukozytenpellet zunächst mit einem
zellwanddegradierenden Enzym, insbesondere der Lyticase,
inkubiert wird, dann ein Tensid, vorzugsweise SDS, und
Proteinase K zugegeben werden und schließlich DNA in an
sich bekannter Weise durch Phenolextraktion isoliert wird.
6. Nukleinsäure-Sonden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID
NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder
funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon.
7. Diagnosekit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem
der vorhergehenden Ansprüche.
8. Diagnosekit nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch
Nukleinsäue-Sonden nach Anspruch 6.
9. Diagnosekit nach Anspruch 7 oder 8 mit Kompartimenten, die
Taq-DNA Polymerase, dNTP's, Primer und Mg2+-haltigen
Puffer enthalten, wobei die Primer für den ersten PCR-Schritt
in einem ersten Kompartiment und die Primer für
den zweiten PCR-Schritt in einem zweiten Kompartiment
enthalten sind.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19806274A DE19806274A1 (de) | 1998-02-16 | 1998-02-16 | Verfahren zum Nachweis von Aspergillus-Nukleinsäuren in einer Körperprobe, Nukleinsäure-Sonden und Diagnosekits zur Durchführung des Verfahrens |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19806274A DE19806274A1 (de) | 1998-02-16 | 1998-02-16 | Verfahren zum Nachweis von Aspergillus-Nukleinsäuren in einer Körperprobe, Nukleinsäure-Sonden und Diagnosekits zur Durchführung des Verfahrens |
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ID=7857847
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19806274A Withdrawn DE19806274A1 (de) | 1998-02-16 | 1998-02-16 | Verfahren zum Nachweis von Aspergillus-Nukleinsäuren in einer Körperprobe, Nukleinsäure-Sonden und Diagnosekits zur Durchführung des Verfahrens |
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Country | Link |
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DE (1) | DE19806274A1 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002027021A2 (de) * | 2000-09-26 | 2002-04-04 | Cytonet Gmbh & Co. Kg | Verfahren zum nachweis von pilzinfektionen |
CN108070675A (zh) * | 2018-02-10 | 2018-05-25 | 杭州缔蓝生物技术有限公司 | 一种同时检测三种曲霉的引物探针组合和荧光定量pcr试剂盒 |
-
1998
- 1998-02-16 DE DE19806274A patent/DE19806274A1/de not_active Withdrawn
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002027021A2 (de) * | 2000-09-26 | 2002-04-04 | Cytonet Gmbh & Co. Kg | Verfahren zum nachweis von pilzinfektionen |
WO2002027021A3 (de) * | 2000-09-26 | 2003-07-17 | Cytonet Gmbh & Co Kg | Verfahren zum nachweis von pilzinfektionen |
CN108070675A (zh) * | 2018-02-10 | 2018-05-25 | 杭州缔蓝生物技术有限公司 | 一种同时检测三种曲霉的引物探针组合和荧光定量pcr试剂盒 |
CN108070675B (zh) * | 2018-02-10 | 2020-04-21 | 杭州缔蓝生物技术有限公司 | 一种同时检测三种曲霉的引物探针组合和荧光定量pcr试剂盒 |
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