WO2006074878A2 - Verfahren und kit zur detektion von mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (map) in proben von kot, körpergewebe oder milch - Google Patents

Verfahren und kit zur detektion von mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (map) in proben von kot, körpergewebe oder milch Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • MAP Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
  • the invention relates to a method and a kit for the detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in samples of faeces, body tissues or milk.
  • MAP Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
  • the invention relates to the study of sample material from ruminants, and in particular to the study of milk or milk products made therefrom.
  • the invention should also include the study of sample material from other animal sources as well as humans.
  • Suitable tissues which can be tested in addition to faeces or milk in the context of MAP detection are e.g. Blood, lymphoid tissue and muscle tissue, to name just a few examples.
  • MAP paratuberculosis
  • ruminants especially cows.
  • MAP can be isolated from milk from clinically and subclinically paratuberculosis patients. It has also been found that MAP has a higher thermoresistance compared to other mycobacteria, so that the usual milk pasteurization may not lead to the destruction of MAP. Finally, it has been shown that MAP also comes from the intestinal tissue as well as the blood of Crohn's disease patients so that a possible causal relationship between MAP and Crohn's disease can not be ruled out.
  • a suitable primer pair represents only a part of a functioning detection system.
  • the samples usually analyzed, such as feces or blood, but in particular also milk samples are generally relatively difficult to assay by means of PCR, since a whole Range of substances that have inhibitory properties.
  • the object of the invention was therefore to provide a method and a kit for detecting MAP possibly contained in samples, in which all steps, or components, are optimally matched to one another.
  • the object is achieved by a method according to claim 1 and a kit according to claim 20.
  • the materials investigated by the method or kit according to the invention may be samples of excrement, body tissue or milk, which may originate in particular from ruminants but also from other animals or from humans.
  • suitable tissues which can be examined in addition to faeces or milk in the context of MAP detection are e.g. Blood, lymph tissue and muscle tissue.
  • a DNA extract is obtained from the sample to be examined, which can be further processed by means of PCR.
  • the milk is centrifuged and the bacteria contained are pelleted.
  • sample materials may need to first Suspension are prepared with subsequent separation of coarse particles, before by centrifugation a bacterial pellet can be obtained.
  • the recovery of the contained bacteria from the different sample materials represents a routine measure for a person skilled in the art.
  • bacterial pellet obtained bacterial pellet under lysis conditions.
  • the conditions are chosen so that mycobacteria lyse and generally agree with samples of different origin.
  • the DNA is then further extracted and purified by means of, in particular, alcoholic precipitation, if appropriate after prior precipitation of the proteins.
  • the milk, or milk product sample was processed using a "high pure template preparation kit Cat No. 1796 828" from Roche Diagnostics in accordance with the prescribed protocol.
  • a "high pure template preparation kit Cat No. 1796 828” from Roche Diagnostics in accordance with the prescribed protocol.
  • an initially enzymatic treatment of the pelleted bacteria was assisted by mechanical treatment of the cells.
  • the lysate was then loaded onto a DNA-binding column and the column subsequently eluted as prescribed in the kit.
  • the eluate was then further processed as a DNA extract in the PCR.
  • the recovered DNA extract is worked up in the presence of MAP specific primers.
  • primers suitable for e.g. recognize the f57 sequence in MAP are particularly preferred.
  • primer pair having the following sequences:
  • SEQ ID NO 2 TTG GAC GAT CCGAAT ATG Tand SEQ ID NO 3: AGT GGGAGG CGTACC A
  • the mentioned primers correspond to sections 126-144 (SEQ ID NO 2) and 365-380 (SEQ ID NO 3) of the MAP f57 sequence. Details of the primers used are summarized in Table Ia.
  • Target sequence primer sequence (5f-3i) position amplicon (oligonucleotides) (bp)
  • MAPf57 MAPfSVpI (SEQ ID TTG GAC GAT CCG AAT ATG T 126-144 254
  • MAPf57p2 (SEQ ID AGT GGG AGG CGT ACC A 365-380
  • milk is a critical sample material because of the PCR inhibitors it contains. Even in the above-described particularly preferred methods for obtaining a DNA extract, it can not be ruled out that substances which inhibit the PCR may still be present in the PCR mixture.
  • the invention therefore further provides that the PCR is carried out in the presence of an internal amplification control.
  • Suitable amplification controls can be any desired target DNA sequences (control DNA) which can be standardized with appropriately designed primers (control primers) and reproducibly amplified under similar conditions as the MAP sequences.
  • the internal amplification control is carried out in the same approach in which the detection of the MAP sequence is carried out. In this case, care must be taken that the amplicon of the control DNA and that of the MAP sequence can be distinguished from each other.
  • the control DNA used in the invention preferably PuC 19 plasmid DNA. Details of this plasmid, in particular to the sequence are for example from “Yanisch-Perron et al.” in “Gene 33 (1), 103-119 (1985)". PuC19 can be obtained under No. ATCC 37254 / L09137 or from New England Biolabs (Cat. No. N3041S).
  • Suitable control primers may be e.g. have the following sequences:
  • Target sequence oligonucleotide sequence (5f-3 Q position amplicon (bp)
  • PuC19 plasmid DNA PuC 19fw (SEQ ID CGG AGA CGG TCA CAG CT 49-65 400
  • An advantageous embodiment of the invention therefore provides that the workup of the DNA extract by means of real-time PCR.
  • Real-time PCR methods have been known for some time and essentially differ from conventional PCR methods in that the PCR approach additionally contains probes which generate a changing signal which correlates with the increase of amplified DNA. Furthermore, the PCR apparatus (cycler) used has a measuring device which detects the signals generated during the PCR in the batches, so that directly, i. can still be determined during the measurement, whether an amplification of the target sequence has taken place.
  • Suitable for real-time PCR probe and cycler systems with appropriate measuring devices are offered by different manufacturers known in the art.
  • Sybr-Green is a dye that intercalates into double-stranded DNA and produces a fluorescence signal only in the intercalated state, which can be measured in a suitable cycler. The signal is the stronger, the more double-stranded DNA is present, in which the dye can be stored.
  • a problem with the Sybr-Green system mentioned is that only non-specific detection of double-stranded DNA is possible here.
  • the invention therefore particularly preferably provides that specific probes are used to detect the amplicons generated during the PCR specifically generate a signal only upon amplification of MAP sequences and / or the internal control DNA sequence. It is understood that the signals generated while working up the amplification control in a common approach of the signals generated in amplification of the MAP sequence must be differentiable, which is not a problem by appropriate marker selection.
  • probes typically have a portion of DNA chosen to specifically hybridize to a portion of the target DNA.
  • a marker or a marker system is coupled which generates a different signal upon hybridization than in the non-hybridized state.
  • Suitable probes have become known, for example, in the art by the term "TAQMAN probes".
  • MAP probes having the following sequences have been found to be particularly suitable:
  • SEQ ID NO 8 GCA AGG CGA TTA AGT TGG GTA AC SEQ ID NO 9: CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC
  • the invention further relates to a kit in which the reagents necessary for carrying out the method are contained.
  • the kit according to the invention contains at least reagents for obtaining a DNA extract from mycobacteria cells possibly contained in sample material, in particular in milk or milk products, and reagents for real-time PCR, containing a primer pair specific for a MAP sequence, an internal amplification control and with the MAP sequence and the internal amplification control hybridizing probes, each having different detectable markers.
  • a positive control for the PCR may be included. It may be e.g. the sequence f57 (SEQ ID NO 1) from MAP already mentioned in a suitable vector, which is processed in a separate batch in the PCR to ensure that the conditions chosen for the PCR for the amplification and detection of MAP Sequences are suitable.
  • the sample After addition of 60 ⁇ l Proteinase K, the sample is incubated for 2 hours at 55 0 C and periodically mixed. The incubated sample is then heated followed by the addition of 300 ul buffer (Roche kit), and addition of glass beads in a Ribolyer (Hybaid, Ashford) spent ( ⁇ .Smsec "1 for 45s). The sample is immediately for 10 minutes at 7O 0 C in order to possibly destroying upcoming DNAses. The sample is then cooled at room temperature for 1 minute, 150 ⁇ l of isopropanol (2-propanol, Fluka) are added, centrifuged briefly and loaded onto the DNA binding column of the kit. The DNA templates are then washed out with 100 ⁇ l of the elution buffer (Kit). 5 ⁇ l aliquots are then used in the PCR.
  • Real-time PCR is performed in 20 ⁇ l glass capillaries using Light Cycler 2.0 instrument (Roche Diagnostics).
  • the reaction mixture consists of Ix LightCycler-Faststart DNA master plus TM hybridization probes mix (Roche Diagnostics), 800 nM of each primer (MAPf57pl / SEQ NO ID 2, MAPf57p2 / SEQ ID ID 3, PuC400fw / SEQ ID NO 4 and puC400rv / SEQ NO ID 5), 200 nM of each probe and 2000 copies of PuC19 plasmid DNA used as an internal amplification control.
  • the amplification starts with an initial pre-incubation at 95 0 C for 10 minutes, followed by 45 cycles (95 0 C for 5 1os 56 ° C for 20s and 72 0 C for 18s).
  • the DNA was extracted from MAP artificially contaminated milk samples and purified and the respective DNA extracts were processed by means of real-time PCR.

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Abstract

Verfahren zur Detektion von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in Proben von Kot, Körpergewebe oder Milch, bei dem ein DNA-Extrakt aus den Proben gewonnen wird, der DNA-Extrakt in Gegenwart von MAP- spezifischen Primern (MAP-Primer) mittels PCR aufgearbeitet wird, und geprüft wird, ob während der PCR MAP-spezifische Gensequenzen amplifiziert wurden, sowie ein Kit zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Verfahren und Kit zur Detektion von Mycobacterium avium subsp. paratubercu- losis (MAP) in Proben von Kot, Körpergewebe oder Milch
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und einen Kit zur Detektion von Mycobakterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in Proben von Kot, Körpergewebe oder Milch. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Untersuchung von Probematerial von Wiederkäuern und dort insbesondere auf die Untersuchung von Milch oder daraus hergestellten Milchprodukten. Die Erfindung soll aber auch die Untersuchung von Probematerial aus anderen tierischen Quellen sowie vom Menschen umfassen. Geeignete Gewebe, die neben Kot oder Milch im Rahmen der MAP-Detektion untersucht werden können, sind z.B. Blut, Lymphgewebe sowie Muskelgewebe, um nur einige Beispiele zu nennen.
MAP gelten als Erreger der Paratuberkulose, einer weltweit verbreiteten chronischen Darmentzündung bei Wiederkäuern, insbesondere Kühen.
Es hat sich gezeigt, dass aus Milch von klinisch und subklinisch an Paratuberkulose erkrankten Tieren MAP isoliert werden können. Es hat sich außerdem herausgestellt, dass MAP verglichen mit anderen Mycobakterien eine höhere Ther- moresistenz aufweisen, so dass möglicherweise die übliche Milchpasteurisation nicht zur Vernichtung von MAP führt. Schließlich hat sich gezeigt, dass sich MAP auch aus dem Darmgewebe sowie dem Blut von Morbus Crohn-Patienten isolieren ließen, so dass ein möglicher kausaler Zusammenhang zwischen MAP und Morbus Crohn nicht ausgeschlossen werden kann.
Eine möglichst frühzeitige und effektive Untersuchung und Aussonderung von erkrankten Tieren aus dem Produktionskreislauf ist insbesondere aus milchhygienischer Hinsicht dringend geboten.
Es bietet sich z.B. an, Milch direkt mit geeigneten diagnostischen Methoden zu untersuchen. Bislang bekannt ist z.B. ein Verfahren, bei dem eine mit IS900 bezeichnete in MAP enthaltene DNA-Insertionssequenz mittels PCR nachgewiesen wird. Problematisch ist, dass offensichtlich auch andere Mycobakterien IS900 Elemente enthalten, so dass bei dieser Nachweismethode die Gefahr besteht, dass nicht mit MAP kontaminierte Proben falsch positive Ergebnisse liefern.
Es wurden daher in jüngster Zeit verstärkt weitere Genabschnitte von MAP in Bezug auf ihre selektive Verwendbarkeit in PCR-Nachweissystemen evaluiert. In diesem Zusammenhang wurde von "Vansnick et al." in "Vet Micro- biol.2004; 100; 197-204" die Verwendung von Primern beschrieben, die an eine spezifische mit f57 bezeichnete (und in der Veröffentlichung näher beschriebene) MAP-Sequenz binden. Bezüglich Einzelheiten zu der Sequenz wird auf Fig. 1 und SEQ ID NO 1 verwiesen, die den Bereich 1-620 des f57 Gens wiedergeben.
Allerdings stellt ein geeignetes Primerpaar nur einen Teil eines funktionierenden Nachweis sy stemes dar. Ein weiteres Problem besteht darin, dass die üblicherweise analysierten Proben, wie z.B. Kot oder Blut, insbesondere aber auch Milchproben sich generell nur relativ schwierig mittels PCR untersuchen lassen, da eine ganze Reihe von Stoffen enthalten sind, die inhibierende Eigenschaften haben. Aufgabe der Erfindung war daher, ein Verfahren und einen Kit zur Detektion eventuell in Proben enthaltener MAP zu schaffen, bei dem alle Schritte, beziehungsweise Komponenten, optimal aufeinander abgestimmt sind.
Gelöst wird die Aufgabe mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie einem Kit gemäß Anspruch 20.
Bevorzugte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Wie oben bereits gesagt, kann es sich bei den mit dem erfindungsgemäßen Verfahren oder Kit untersuchten Materialien um Proben von Kot, Körpergewebe oder Milch handeln, die insbesondere aus Wiederkäuern aber auch aus anderen Tieren bzw. vom Menschen stammen können. Grundsätzlich geeignete Gewebe, die neben Kot oder Milch im Rahmen der MAP-Detektion untersucht werden können, sind z.B. Blut, Lymphgewebe sowie Muskelgewebe.
Im wesentlichen stellen alle genannten Probematerialien ähnliche Probleme bei der Aufarbeitung dar. Um Wiederholungen zu vermeiden soll die Erfindung im folgenden exemplarisch für die Untersuchung von Milch aus Wiederkäuern beschrieben werden. Es versteht sich, dass die beschriebenen Schritte sich mit ggf. geringfügigen Anpassungen auch auf die Untersuchung anderer Materialien übertragen lassen und dort ebenfalls den gewünschten Nachweis ermöglichen.
In einem ersten Schritt des erfmdungsgemäßen Verfahrens wird aus der zu untersuchenden Probe, ein DNA-Extrakt gewonnen, der mittels PCR weiter aufgearbeitet werden kann.
Üblicherweise wird dazu die Milch zentrifugiert, und die enthaltenen Bakterien werden pelletiert. Bei anderen Probematerialien muss eventuell zunächst eine Suspension hergestellt werden mit nachfolgender Abtrennung von groben Partikeln, bevor mittels Zentrifugation ein Bakterienpellet gewonnen werden kann. Die Gewinnung der enthaltenen Bakterien aus den unterschiedlichen Probematerialien stellt für einen Fachmann eine Routinmaßnahme dar.
In einem nächsten Schritt wird dann das z.B. aus der hier exemplarisch beschriebenen Milchprobe gewonnene Bakterienpellet unter Lysisbedingungen aufgeschlossen. Die Bedingungen sind so gewählt, dass Mycobakterien lysieren und stimmen grundsätzlich für Proben unterschiedlicher Herkunft überein.
In einer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass dann mittels insbesondere alkoholischer Fällung die DNA weiter extrahiert und aufgereinigt wird, ggf. nach vorheriger Ausfällung der Proteine.
Als besonders geeignet hat sich in diesem Zusammenhang ein Kit und das entsprechende dazugehörige Aufarbeitungsprotokoll der Firma GEN-IAL (All-tissue DNA-extraction Kit Cat. No. D0502000) gezeigt.
Gemäß einer zweiten Ausgestaltung wurde die Milch, beziehungsweise Milchproduktprobe, mit einem "High pure template preparation Kit Cat. No. 1796 828" der Firma Roche Diagnostics entsprechend dem vorgeschriebenen Protokoll aufgearbeitet. Auch hier folgte nach der Zentrifugation eine zunächst enzymatische Behandlung der pelletierten Bakterien. Zusätzlich zum im Kitprotokoll vorgeschriebenen Vorgehen wurde die Lyse der Bakterien durch eine mechanische Behandlung der Zellen unterstützt. Das Lysat wurde dann auf eine DNA-bindende Säule gegeben und die Säule anschließend wie in dem Kit vorgeschrieben eluiert. Das Eluat wurde dann als DNA-Extrakt in der PCR weiter verarbeitet. Bezüglich der Details der bevorzugt eingesetzten Methoden wird auf die entsprechenden dem Fachmann zugänglichen Protokolle der erwähnten Kits verwiesen.
In dem nächsten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der gewonnene DNA-Extrakt in Gegenwart von MAP spezifischen Primern aufgearbeitet. Dazu eignen sich insbesondere Primer, die z.B. die f57 Sequenz in MAP erkennen.
Besonders bevorzugt ist ein Primerpaar mit folgenden Sequenzen:
SEQ ID NO 2:TTG GAC GAT CCGAAT ATG Tund SEQ ID NO 3: AGT GGGAGG CGTACC A
Die erwähnten Primer entsprechen den Abschnitten 126-144 (SEQ ID NO 2) und 365-380 (SEQ ID NO 3) der MAP f57-Sequenz. Einzelheiten der eingesetzten Primer sind in der Tabelle Ia zusammengefasst.
Tabelle Ia:
Zielsequenz Primer Sequenz (5f- 3i) Position Amplikon (Oligonucleotide) (bp)
MAPf57 MAPfSVpI (SEQ ID TTG GAC GAT CCG AAT ATG T 126-144 254
(accession: X70277) ?.
MAPf57p2 (SEQ ID AGT GGG AGG CGT ACC A 365-380
NO 3)
Es konnte gezeigt werden, dass das beschriebene, von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung neu designte Primerpaar hoch spezifisch ausschließlich MAP und keine weiteren Mycobakterienstämme erkennt. Das Primerpaar wurde in PCR-Ansätzen mit MAP und weiteren Mycobakterienstämmen getestet, wobei die Spezifität der entwickelten Primer für MAP und die Eignung von f57 als spezifisches Target zum Nachweis von MAP bestätigt werden konnte (Tasara et al. Int. J. Food Microbiol. eingereicht). Falsch positive Ergebnisse können durch Verwendung der genannten Primer also mit großer Sicherheit ausgeschlossen werden.
Ein weiteres Problem stellt sich jedoch mit eventuellen falsch negativen Ergebnissen.
Wie oben erwähnt, ist Milch, aber auch die anderen genannten Probematerialien, wegen der darin enthaltenen PCR-Inhibitoren ein kritisches Probenmaterial. Auch bei den oben beschriebenen besonders bevorzugt eingesetzten Verfahren zur Gewinnung eines DNA-Extrakts kann nicht ausgeschlossen werden, dass in dem PCR-Ansatz doch eventuell noch Substanzen enthalten sind, die die PCR hemmen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung sieht die Erfindung daher weiterhin vor, dass die PCR in Gegenwart einer internen Amplifikationskontrolle durchgeführt wird.
Geeignete Amplifikationskontrollen können dabei beliebige Target-DNA- Sequenzen sein (Kontroll-DNA), die sich mit entsprechend designten Primern (Kontroll-Primern) standardisiert und reproduzierbar unter ähnlichen Bedingungen wie die MAP-Sequenzen amplifizieren lassen.
Besonders bevorzugt wird die interne Amplifikationskontrolle in demselben Ansatz durchgeführt, in dem auch der Nachweis der MAP-Sequenz erfolgt. In diesem Fall muß Sorge getragen werden, dass die Amplifikate der Kontroll-DNA und die der MAP-Sequenz voneinander unterschieden werden können.
Als Kontroll-DNA wird im Rahmen der Erfindung bevorzugt PuC 19 Plasmid- DNA eingesetzt. Einzelheiten zu diesem Plasmid, insbesondere zu der Sequenz sind z.B. von "Yanisch-Perron et al." in "Gene 33(1), 103-119 (1985)" veröffentlicht worden. PuC19 kann unter der Nr. ATCC 37254/L09137 oder bei New England Biolabs (Kat. Nr. N3041S) bezogen werden.
Geeignete Kontroll-Primer können z.B. die folgende Sequenzen aufweisen:
SEQ ID NO 4: CGG AGA CGG TCA CAG CT SEQ BD NO 5: TTG CAT GCC TGC AGG T
Die genannten Primer hybridisieren mit den Abschnitten 49 -65 (SEQ ID NO 4) beziehungsweise 433-448 (SEQ ID NO 5) der genannten PuC19Plasmid-DNA. Einzelheiten der eingesetzten Primer sind in der folgenden Tabelle Ib zusam- mengefasst:
Tabelle Ib:
Zielsequenz Oligonucleotide Sequenz (5f- 3 Q Position Amplikon (bp)
PuC19 plasmid DNA PuC 19fw (SEQ ID CGG AGA CGG TCA CAG CT 49-65 400
(accession: L09137) NQ 4)
PuC19rv (SEQ ID TTG CAT GCC TGC AGG T 433-448
NO 5)
Mit den bislang beschriebenen bevorzugten Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich mit großer Sicherheit auch geringste Mengen von MAP in z.B. Milch nachweisen. Untersuchungen der Anmelderin haben gezeigt, dass ein Nachweis ab 10 MAP-Zellen per ml Milch möglich ist.
Ein weiteres Problem ist der Zeitfaktor. Üblicherweise müssen die Ergebnisse von Untersuchungen von Milchproben aus logistischen Gründen relativ rasch vorliegen. Mittels konventioneller PCR und anschließender Auswertung im Gel vergehen jedoch zwischen Probenahme und Ergebnis 4-6 Stunden, was in der Regel zu lang ist.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht daher vor, dass die Aufarbeitung des DNA-Extrakts mittels Realtime PCR erfolgt.
Realtime-PCR- Verfahren sind seit längerem bekannt und unterscheiden sich im wesentlichen von konventionellen PCR- Verfahren dadurch, dass in dem PCR- Ansatz zusätzlich Sonden enthalten sind, die ein mit der Zunahme von amplifi- zierter DNA korreliertes sich veränderndes Signal erzeugen. Weiterhin weist die eingesetzte PCR-Apparatur (Cycler) eine Messeinrichtung auf, die die erzeugten Signale während der PCR in den Ansätzen erfasst, so dass unmittelbar, d.h. noch während der Messung festgestellt werden kann, ob eine Amplifikation der Target-Sequenz stattgefunden hat.
Für Realtime-PCR geeignete Sonden- und Cyclersysteme mit entsprechenden Messeinrichtungen werden von unterschiedlichen dem Fachmann bekannten Herstellern angeboten.
Ein bekanntes System ist z.B. das Sybr-Green-System. Bei Sybr-Green handelt es sich um einen Farbstoff, der in Doppelstrang-DNA interkaliert und nur im inter- kalierten Zustand ein Fluoreszenzsignal erzeugt, das in einem geeigneten Cycler gemessen werden kann. Das Signal wird um so stärker, je mehr Doppelstrang- DNA vorliegt, in die der Farbstoff sich einlagern kann. Ein Problem bei dem genannten Sybr-Green-System ist, das hier nur ein unspezifischer Nachweis von Doppelstrang-DNA möglich ist.
Besonders bevorzugt sieht die Erfindung daher vor, dass zum Nachweis der während der PCR erzeugten Amplifikate spezifische Sonden eingesetzt werden, die gezielt ein Signal nur bei Amplifikation von MAP- Sequenzen und/oder der internen Kontroll-DNA-Sequenz erzeugen. Es versteht sich, dass die erzeugten Signale bei gleichzeitiger Aufarbeitung der Amplifikationskontrolle in einem gemeinsamen Ansatz von den bei Amplifikation der MAP-Sequenz erzeugten Signalen differenzierbar sein müssen, was durch entsprechende Markerwahl kein Problem darstellt.
Spezifische Sonden weisen in der Regel einen DNA-Abschnitt auf, der so gewählt ist, das er spezifisch mit einem Abschnitt der Target-DNA hybridisieren kann. An dem DNA-Abschnitt ist ein Marker oder ein Markersystem gekoppelt, der bei Hybridisierung ein anderes Signal erzeugt als im nichthybridisierten Zustand. Geeignete Sonden sind z.B in der Fachwelt unter dem Begriff "TAQMAN- Sonden" bekannt geworden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird besonders bevorzugt ein anderes, das sogenannte "Light-Cycler System" von "Roche-Diagnostics" eingesetzt. Dieses System arbeitet mit 2 Sonden pro Target, die beide mit benachbarten Bereichen der Target-Sequenz hybridisieren. Die eine Sonde ist mit Fluorescin markiert, die andere mit einem Fluoreszenzfarbstoff, z.B. LC-Red-705 oder LC-Red-640 (Roche-Diagnostics). Bei räumlicher Nähe, die sich nach Hybridisierung der beiden Sonden an der Target-DNA einstellt, kann das Fluorescin die Fluoreszenzfarbstoffe aktivieren, die dann ein Signal mit den jeweils angegebenen Wellenlängen 705 nm oder 640 nm erzeugen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren haben sich MAP-Sonden mit den folgenden Sequenzen als besonders geeignet gezeigt:
SEQ ID NO 6: CAC GCA GGC ATT CCA AGT und SEQ ID NO 7: TGA CCA CCC TTC CCG TCG Für die interne Amplifikationskontrolle wurden Sonden mit folgenden Sequenzen als besonders bevorzugt ermittelt:
SEQ ID NO 8: GCA AGG CGA TTA AGT TGG GTA AC SEQ ID NO 9: CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC
Einzelheiten der erwähnten Sonden sind in Tabelle Ic zusammengefasst:
Tabelle Ic:
Zielsequeπz Sonden Oligonucleoti- Sequenz (Si- 3i) Position de
MAPf57 MAPf57-3iFluo (SEQ CAC GCA GGC ATT CCA AGT 250-267
(accession: X70277) ID NQ 6)
MAPf57-5fRed705 TGA CCA CCC TTC CCG TCG 270-287
(SEQ ID NO 7)
PuC19 plasmid DNA PuC19-3iFluo GCA AGG CGA TTA AGT TGG GTA AC 330-350
(accession: L09137) (SEQ ID NQ 8)
PuC 19-51Red640 CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 355-375
(SEQ ID NO 9)
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kit, in dem die zur Durchführung des Verfahrens erforderlichen Reagenzien enthalten sind.
Der erfindungsgemäße Kit enthält mindestens Reagenzien zur Gewinnung eines DNA-Extrakts aus in Probematerial, insbesondere in Milch oder Milchprodukten, eventuell enthaltenen Mycobakterienzellen, und Reagenzien zur Durchführung einer Real-Time PCR, enthaltend ein für eine MAP-Sequenz spezifisches Primerpaar, eine interne Amplifikationskontrolle sowie mit der MAP-Sequenz und der internen Amplifikationskontrolle hybridisierende Sonden, die jeweils unterschiedliche detektierbare Marker aufweisen.
Weiterhin kann eine Positivkontrolle für die PCR enthalten sein. Es kann sich dabei z.B. um die in einen geeigneten Vektor Moniert bereits erwähnte Sequenz f57 (SEQ ID NO 1) aus MAP handeln, die in einem separaten Ansatz bei der PCR aufgearbeitet wird, um sicherzustellen, dass die für die PCR gewählten Bedingungen für die Amplifikation und den Nachweis von MAP-Sequenzen geeignet sind.
Im folgenden soll die Erfindung anhand einiger Beispiele im Detail erläutert werden.
Beispiel 1
Probenbehandlung und DNA-Extraktion mittels High pure template preparation Kit:
10 ml Milch werden mit 100 μl Triton X-IOO (Calbiochem) versetzt und während 30 min bei 4500 rpm zentrifugiert. Das entstandene Pellet wird anschliessend in 0.5ml des Überstandes noch einmal resuspensiert und in ein Eppendorf Tube verbracht. Es erfolgt eine zweite Zentrifugation für 10 min. bei 14000rpm. Der Überstand wird dann verworfen. Die entstandenen Pellets werden anschliessend in 240 μl MAP Lysispuffer (20 mM Tris-HCL (pH8.0), 400 mM NaCl, 0.6% SDS, 2mMEDTA) resuspensiert. Nach Zugabe von 60μl Proteinase K wird die Probe bei 550C 2 Stunden bebrütet und periodisch gemischt. Die bebrütete Probe wird anschliessend nach Zugabe von 300μl Puffer (Roche Kit) und Zugabe der Glasbeads in einen Ribolyer (Hybaid, Ashford) verbracht (ό.Smsec"1 für 45s). Die Probe wird dann sofort für 10 Minuten bei 7O0C erhitzt, um möglicherweise vor- kommende DNAsen zu zerstören. Anschliessend wird die Probe für 1 Minute bei Zimmertemperatur abgekühlt, 150μl Isopropanol (2-propanol, Fluka) zugegeben, kurz zentrifugiert und auf die DNA bindende Säule des Kit geladen. Die DNA Templates werden dann mit lOOμl des Elutionspuffers (Kit) ausgewaschen. 5μl Aliquots werden anschliessend in die PCR eingesetzt.
Beispiel 2
PCR Konditionen:
Die Realtime PCR wird in 20 μl Glaskapillaren mittels Light Cycler 2.0 instru- ment (Roche Diagnostics) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch besteht aus Ix LightCycler-Faststart DNA master plus™ hybridization probes mix (Roche Diagnostics), 800 nM von jedem Primer (MAPf57pl/SEQ NO ID 2, MAPf57p2/SEQ NO ID 3, PuC400fw/SEQ NO ID 4 and puC400rv/SEQ NO ID 5), 200 nM von jeder Sonde und 2000 Kopien als interne Amplifikationskontrolle eingesetzten PuC19-Plasmid DNA. Die Amplifikation startet mit einer initialen Vorinkubation bei 950C für 10 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen (950C für 1Os5 56°C für 20s und 720C für 18s).
Beispiel 3
Gemäß obiger Beispiele wurde die DNA aus mit MAP künstlich kontaminierten Milchproben extrahiert und aufgereinigt und die jeweiligen DNA-Extrakte mittels Real-Time PCR aufgearbeitet. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 wiedergegeben, in der die gemessene Fluoreszenz bei 705nm (y-Achse) gegen die Zyklenzahl (x- Achse) aufgetragen ist, und die in Fig. 2 verwendeten Symbole folgenden MAP- Ausgangskonzentrationen entsprechen: A = 104 MAP-Zellen/ml Milch x = 103 MAP-Zellen/ml Milch
Φ = 102MAP-Zellen/ml Milch
▼ = 101 MAP-Zellen/ml Milch
» = 10° MAP-Zellen/ml Milch
* = Negativ-Kontrolle (nicht künstlich kontaminierte Milchprobe)
Man erkennt in Fig. 2 ab ca. dem 20.-30. Cyclus deutlich die Abhängigkeit der Fluoreszenzzunahme von der Zellausgangskonzentration. Ausserdem ist zu erkennen, dass selbst bei Ausgangskonzentrationen von 10 MAP-Zellen/ml Milch noch eine deutlich detektierbare Signalzunahme messbar ist.

Claims

03948pctUniversität ZürichVerfahren und Kit zur Detektion von Mycobacterium avium subsp. paratubercu- losis (MAP) in Proben von Kot, Körpergewebe oder MilchPatentansprüche:
1. Verfahren zur Detektion von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in Proben von Kot, Körpergewebe oder Milch, bei dem ein DNA-Extrakt aus den Proben gewonnen wird, der DNA-Extrakt in Gegenwart von MAP-spezifischen Primern (MAP-
Primer) mittels PCR aufgearbeitet wird, und geprüft wird, ob während der PCR MAP-spezifische Gensequenzen ampli- fiziert wurden.
2. Verfahren nach einem der Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die untersuchte Probe von Wiederkäuern stammt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der untersuchten Probe um Milch oder ein daraus hergestelltes Milchprodukt handelt.
4. Verfahren nach Anspruch einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Gewinnung des DNA-Extrakts die in der Probe enthaltenen Bakterien isoliert werden, die isolierten Bakterien unter Lysisbedingungen inku- biert werden und dann die in dem Lysat enthaltene DNA extrahiert und aufgereinigt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion der DNA mittels alkoholischer Fällung erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion der DNA mittels einer DNA-bindenden Säule erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die bei der PCR eingesetzten MAP -Primer spezifisch für das f57- Gen von MAP sind.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer- Sequenzen SEQ ID NO 2 und SEQ ID NO 3 entsprechen.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR in Gegenwart einer internen Amplifikationskontrolle durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als interne Amplifikationskontrolle eine definierte Kontroll-DNA- Sequenz und Kontroll- Primer eingesetzt werden, die die Kontroll-DNA- Sequenz erkennen.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Kontroll- DNA PuC 19 Plasmid-DNA eingesetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontroll- Primer Sequenzen gemäß SEQ ID NO 4 und SEQ ID NO 5 aufweisen.
13. Verfahren nach Ansprch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der DNA- Extrakt und die interne Amplifikationskontrolle in demselben PCR-Ansatz aufgearbeitet werden.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR in Gegenwart von Sonden durchgeführt wird, die Signale mit von der Menge an amplifizierter DNA abhängiger Stärke erzeugen, und die erzeugten Signale kontinuierlich oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der PCR gemessen werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Sonden eingesetzt werden, die einen mit MAP-spezifischen Gensequenzen (MAP-Sonden) und/oder Kontroll-DNA-Gensequenzen (Kontroll- Sonden) hybridisierenden DNA-Abschnitt aufweisen und einen mit dem DNA-Abschnitt gekoppelten Marker, der im hybridisierten Zustand des DNA-Abschnitts ein anderes Signal abgibt als im nicht hybridisierten Zustand.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA- Abschnitte von MAP-Sonden Sequenzen gemäß SEQ ID NO 6 und SEQ ID NO
7 aufweisen.
17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA- Abschnitte von Kontroll-Sonden Sequenzen gemäß SEQ ID NO 8 und SEQ ID NO 9 aufweisen.
18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die mit den
DNA-Abschnitten gekoppelten Marker von MAP-Sonden und die von Kontroll- Sonden voneinander differenzierbare Signale erzeugen.
19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die mit den
DNA-Abschnitten gekoppelten Marker Fluoreszenzfarbstoffe sind.
20. Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, mit
Reagenzien zur Gewinnung eines DNA-Extrakts aus in Proben eventuell enthaltenen Mycobakterienzellen, und
Reagenzien zur Durchführung einer Real-Time PCR, enthaltend ein für eine MAP-Sequenz spezifisches Primerpaar, eine interne Amplifikations- kontrolle sowie mit der MAP-Sequenz und der internen Amplifikations- kontrolle hybridisierende Sonden, die jeweils unterschiedliche detektierba- re Marker aufweisen.
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