DE10012540A1

DE10012540A1 - Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorgansimen durch Polymerase-Kettenreaktion

Info

Publication number: DE10012540A1
Application number: DE10012540A
Authority: DE
Inventors: Marion Walcher; Michael Wagner; Jiri Snaidr
Original assignee: Vermicon AG
Current assignee: Vermicon AG
Priority date: 2000-03-15
Filing date: 2000-03-15
Publication date: 2001-09-27
Anticipated expiration: 2020-03-16
Also published as: AU2001262096A1; WO2001068900A2; WO2001068900A3; DE10012540B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von nahe verwandten Mikroorganismen in einer Probe durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Listeria unterhalb der Artebene sowie Primer, die bei diesem Verfahren eingesetzt werden können.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere von nahe verwandten Mikroorganismen, in einer Probe durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR). Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Listeria unterhalb der Artebene sowie Primer, die bei diesem Verfahren eingesetzt werden können.

Durch das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR; Saiki et al., Science, 293 (1988), 487-491) werden enzymatisch in vitro spezifische DNA-Bereiche amplifiziert. Diese Amplifizierung erfolgt durch eine Reihe von unterschiedlichen Temperatur-Zeitzyklen, die die Denaturierung der DNA, das Anlagern des Primers (Annealing), die Elongationsphase durch eine DNA-abhängige DNA-Polymerase und eine abschließende Elongation umfassen. Mittels der PCR können bestimmte Bereiche des mikrobiellen Genoms, die für eine Gruppe oder eine Art von Mikroorganismen spezifisch sind, amplifiziert werden. Der Nachweis dieses Amplifikats zeigt, daß der Mikroorganismus tatsächlich in der untersuchten Probe vorhanden war.

Voraussetzung für den spezifischen Nachweis eines Mikroorganismus durch PCR ist jedoch, daß diese bestimmten Bereiche eines mikrobiellen Genoms einmalig sind und nur in der nachzuweisenden Mikroorganismengruppe oder dem nachzuweisenden Mikroorganismus enthalten sind. Häufig besitzt jedoch ein nahe verwandter Mikroorganismus zu der DNA- Zielsequenz des nachzuweisenden Mikroorganismus nur eine geringe Abweichung in Form von ein oder zwei Basen. Somit ergibt sich häufig das Problem, daß die verwendeten Primer nur schwache Basenfehlpaarungen zu nahe verwandten Nicht-Zielmikroorganismen besitzen und deshalb auch mit diesen Organismen Amplifikate liefern. Üblicherweise wurde bislang versucht, nahe verwandte Mikroorganismen während des Nachweisverfahrens dadurch zu diskriminieren, daß die Bedingungen während der PCR stringenter eingestellt werden, beispielsweise durch eine Temperaturerhöhung. Bei einer erhöhten Temperatur bindet dann nur der spezifische Primer, nicht jedoch der Primer, der ein oder zwei Basen Fehlpaarungen zur Zielregion besitzt. Nachteilig an einer derartigen Temperaturerhöhung ist jedoch, daß auch die Bindung des spezifischen Primers an die Zielregion geschwächt wird und dadurch eventuell eine erfolgreiche PCR-Amplifikation verhindert wird.

Ferner sind schwache Basenfehlpaarungen in der Mitte des zu bindenden Bereichs oder am 5'-Ende des Primers ebenfalls für einen spezifischen Nachweis nachteilig, da bei der Verlängerung des 3'-Endes des Primers ein vollständiges Binden des Primers an die Zielstelle nicht notwendig ist. So kann beispielsweise bei einer Basenfehlpaarung im 5'-Bereich oder im mittleren Bereich des Primers der Primer zwar nur teilweise binden, aber trotzdem am 3'- Ende verlängert werden, da es unerheblich ist, ob das nicht zu verlängernde Ende am 5'-Ende an die Zielregion bindet oder nicht bindet und damit absteht.

Somit ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem auch nahe verwandte Mikroorganismen durch PCR-Reaktion hochspezifisch und schnell nachgewiesen werden können. Ein derartiges Verfahren ist insbesondere zum Nachweis von nahe verwandten Mikroorganismen wünschenswert, bei denen die einzelnen Arten bzw. Stämme unterschiedliche Eigenschaften, wie zum Beispiel eine unterschiedliche Virulenz, aufzeigen.

So werden beispielsweise für einzelne Stämme der Art Listeria monocytogenes bedeutende Unterschiede in der Virulenz postuliert (z. B. Munk et al., Microb. Pathogen., 5 (1988), 49). Die Gattung Listeria besteht nach herkömmlicher Definition aus bei 20°C beweglichen Gram- positiven, Katalase-positiven, Oxidase-negativen Stäbchen. Anhand von 16S-rRNA- Sequenzen wurde gezeigt, daß sie phylogenetisch den Grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt zugeordnet werden können. Listerien zeichnen sich durch eine ubiquitäre Lebensweise aus und können somit zahlreich aus Umweltproben unterschiedlicher Herkunft sowie aus Lebensmitteln isoliert werden (z. B. Geuenich et al., Zbl. Bakt. Hyg., 179 (1984), 266-273).

Bislang sind sechs Arten der Gattung Listeria beschrieben, von denen L. ivanovii nur bei Tieren eine Listeriose hervorruft, während L. monocytogenes humanpathogen ist. Dagegen handelt es sich bei den vier weiteren Vertretern der Gattung, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri und L. grayi um nicht-pathogene Organismen.

Als Vertreter der psychotrophen "Kühlschrankflora" geht von L. monocytogenes ein erhebliches Infektionsrisiko bei gekühlten Lebensmitteln aus (Hofet al., The role of Listeria monocytogenes and other Listeria spp. in foodborne infections, 2^nd world congress on foodborne infections and intoxifications, Berlin, 1986). Infektionserkrankungen, die von Listerien ausgelöst werden, sind deshalb häufig auf kontaminierte Nahrung, vor allem auf infiziertes Geflügel, Milchprodukte und rohes Gemüse, zurückzuführen (z. B. Beckers et al., The occurence of Listeria in Food, In: Foodborne listeriosis, Behr-Verlag, Hamburg, 1989). Weitere Infektionswege sind Kontaminationen mit Listerien in Lebensmittel-verarbeitenden Betrieben (Nesbakken et al., Int. J. Food Microbiol., 31 (1996), 161-171) und infizierte Tiere (Jensen et al., Int. J. Food Microbiol., 32 (1996), 209-216). So wurde ein möglicher Infektionsweg über Kühe beschrieben, die aufgrund einer Listeriose die Symptome einer Mastitis entwickelten, wobei durch diese Infektion indirekt eine Kontamination der Milch hervorgerufen wird.

Während eine Infektion mit L. monocytogenes in den meisten Fällen asymptomatisch verläuft, oder sich in leichten grippeähnlichen Symptomen wie Fieber oder Erbrechen äußert, können bei Kleinkindern und Säuglingen, schwangeren Frauen oder immunsupprimierten Personen, wie beispielsweise Transplantations-, Krebs- oder HIV-Patienten, aufgrund einer Dissemination der Erreger im Körper schwere Komplikationen auftreten (z. B. Albritton et al., Clin. Invest. Med., 7 (1984)). In diesem Zusammenhang werden oftmals eine Blutvergiftung sowie Infektionen mit der Leber und Milz beobachtet. Da L. monocytogenes sowohl die Blut- Hirn-Schranke als auch die plazentale Barriere überwinden kann, rufen die Erreger außerdem Gehirnerkrankungen wie Meningitis und Encephalitis hervor und führen bei einer transplazentaren Infektion auch zu einer schweren Schädigung des Fötus, dessen unreifes Abwehrsystem die Ausbreitung der Listerien ermöglicht. Die dabei am häufigsten beschriebene Krankheit des ungeborenen Kindes ist die Granulomatosis infantiseptica, die mit verbreiteten Abszessen an Leber, Nieren, Lunge, Milz, Gehirn und der Haut des Embryo in Verbindung gebracht wird (z. B. Southwick et al., N. Eng. J. Med., 334 (1996), 770-776). Bei schwangeren Frauen führt eine Infektion mit L. monocytogenes daher in den ersten Schwangerschaftsmonaten sehr wahrscheinlich zum Abort des Fötus, während es in späteren Phasen der Schwangerschaft zu Totgeburten kommen kann. Bei der Mutter verläuft die Infektion dagegen oft asymptomatisch oder äußert sich allenfalls in leichten grippalen Symptomen. Aus diesem Grund wird die Infektion meist nicht erkannt oder fehlgedeutet. Daher ist die konnatale Listeriose nach der Toxoplasmose die häufigste konnatale Infektion.

Insgesamt liegt die anhand von zahlreichen epidemiologischen Studien in den U.S.A. und in Europa ermittelte Letalität der Listeriosen bei symptomatischem Verlauf trotz Therapie bei 30% (Sizmur et al., Lancet, 1 (1988), 1167).

Der Infektionszyklus von L. monocytogenes wird durch das komplexe Zusammenwirken zahlreicher Virulenzgene reguliert. Nach Adhäsion an die eukaryontische Wirtszelle werden die Bakterien - auch von nicht professionell phagozytischen Zellen (beispielsweise Epithelzellen, Hepatozyten; Gaillard et al., Inf. Imm., 55 (1987), 2822-2829) - aktiv aufgenommen und befinden sich daraufhin innerhalb einer Vakuole in der Wirtszelle. Dieser erste Schritt der Invasion wird von einer Reihe verschiedener Proteine, den Internalinen (ml) und p60, das vom invasion associated protein (iap)-Gen kodiert wird, initialisiert (Gaillard et al., Cell, 65 (1991), 1127-1141). Listeriolysin O (LLO), ein Hämolysin, verursacht durch die Zerstörung der Vakuole, in der sich die Listerien nach der Infektion befinden, eine Freisetzung der Bakterien ins Cytosol der Wirtszelle. Dort findet durch das Enzym ActA eine Polymerisierung von wirtszelleigenen Actin-Monomeren vorwiegend an einem Pol der Bakterienzellen statt, woraus für die Bakterien eine propellerähnliche Wirkung resultiert. Durch diesen "Kometenschweif" bewegen sie sich mit einer Geschwindigkeit von bis zu 1 µm/s durch die Wirtszelle und gelangen so auch an die Zellmembran, wo sie durch die Bildung Pseudopodien-ähnlicher Strukturen in die benachbarten Zellen eindringen. In diesen sind sie dann von einer Doppelmembran umgeben. Der Infektionszyklus wird anschließend von einer Phosphatidylcholin- und einer Phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C (PC-PLC, plcA, PI-PLC, plcB) geschlossen, welche neben dem Listeriolysin O eine Zerstörung der Doppelmembran bewirken.

Bislang sind zur Charakterisierung von L. monocytogenes nur aufwendige Isolierungs prozeduren bekannt, bei der zumeist über verschiedene Anreicherungsmedien Listerien isoliert und anschließend in Reinkultur gebracht werden müssen (Lovett et al., Assoc. Off. Anal. Chem., 71 (1988), 658-660). Für die ebenfalls herkömmlich verwendeten serologischen und biochemischen Verfahren sind ebenfalls Listerien-Reinkulturen notwendig, so daß diese Nachweise einen Zeitaufwand von bis zu 4 Wochen erfordern.

Zur Unterscheidung verschiedener L.-monocytogenes-Stämme wurden in den letzten Jahren u. a. in Studien der WHO zahlreiche weitere Verfahren entwickelt. Von besonderer Bedeutung ist dabei das Verfahren der Serotypisierung (z. B. Seeliger et al., Serotyping of Listeria monocytogenes and Related Species, in: T. Bergen and J. R. Norris (Hrsg.), Methods in Microbiology, Vol. 13, New York: Academic Press, 31-39, 1979; Schönberg et al., International Journal of Food Microbiology, 32 (1996), 279-287). Dieses Verfahren beruht auf der molekularbiologischen Analyse der O- und H-Antigene von L. monocytogenes und wird als Routinenachweis in diagnostischen Labors verwendet.

Allerdings konnten in einer Studie über die Zuverlässigkeit der Serotypisierung einige der untersuchten Stämme nicht immer eindeutig bestimmt werden (Schönberg et al., supra). So können mit diesem Verfahren bislang nur 13 L.-monocytogenes-Subtypen differenziert werden. Da insbesondere der Serotyp 4b von epidemiologischem Interesse ist, diese Gruppe aber sehr inhomogene Ausprägungen aufzuweisen scheint (Rasmussen et al., Microbiol., 141 (1995), 2053-2061; Schönberg et al., supra), ist in diesem Fall eine Kombination mit weiteren Subtypisierungsmethoden zur genaueren Differenzierung des Serovars 4b unumgänglich.

Weitere Methoden basieren auf dem Nachweis anderer genetischer oder phänotypischer Merkmale der einzelnen Stämme. Beispiele hierfür sind die Phagentypisierung (beispielsweise Bannerman et al., Int. J. Food Microbiol., 31 (1996), 245-262), RFLP (restriction fragment length polymorphism; z. B. Saito et al., Microbiologica, 21 (1998), 87-92), MEE (multilocus enzyme electrophoresis; Flint et al., Int. J. Food Microbiol., 31 (1996), 349-355), die Interaktion von Listerien mit Lektinen (Facinelli et al., J. Clin. Microbiol., 32 (1994), 2929-2935) oder Nachweise von Produkten bestimmter Virulenzgene, die mit spezifischen Antikörpern detektiert werden (Friedrich et al., Nachweis von L. monocytogenes sowie des Genus Listeria mittels p60-spezifischen Antikörpern, Tagung: 36. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene, Garmisch-Partenkirchen, 26.-29. September 1995, S. 75-80, Offset Köhler KG (Hrsg.)).

Diese zahlreichen Möglichkeiten zur Differenzierung der einzelnen Stämme von L. monocytogenes liefern allerdings nicht immer übereinstimmende und aufgrund ihrer häufig auf instabilen, phänotypischen Ausprägungen basierenden Verfahrensweise häufig schlecht reproduzierbare Ergebnisse. So sind im Stand der Technik bereits eine Reihe von Verfahren beschrieben, die zwischen L.-monocytogenes-Stämmen differenzieren; eine Detektion aller bekannten Isolate dieser Art mit einer Methode ist allerdings nicht möglich.

Mit Hilfe der Phagentypisierung können zwar sehr viele verschiedene Phagentypen determiniert werden; es gibt jedoch zahlreiche Isolate, die mit keinem bislang verwendeten Phagenset hinreichend exakt bzw. überhaupt typisiert werden können. Ferner ist dieses Verfahren zahlreichen Schwankungen aufgrund der hohen Variabilität der Phagen unterworfen und kann nur schlecht reproduziert werden.

Des weiteren sind auf genotypischen Ausprägungen basierende Verfahren bekannt, die allgemein den "phänotypischen" Praktiken in der Reproduzierbarkeit und Detektierbarkeit zahlreicher Stämme überlegen sind. Hier stellt die Pulsed-Field-Gelelektrophorese (PFGE) ein nahezu ideales Mittel zur Stammunterscheidung von L. monocytogenes dar. Allerdings erfordert die PFGE ein relativ hohes Maß an gerätetechnischer Ausstattung und kann daher nicht in jedem Labor durchgeführt werden.

Des weiteren wird bislang in vielen Labors eine Unterscheidung von L. monocytogenes mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen vorgenommen, mittels derer alle Listerien erfaßbar sind.

Allen diesen im Stand der Technik beschriebenen Verfahren ist gemeinsam, daß sie nur auf Listerien-Reinkulturen angewendet werden können und somit mit diesen Verfahren kein Schnellnachweis von Listerien in Umwelt- oder Lebensmittelproben möglich ist. Es ist jedoch insbesondere bei Patienten, die ein auf Listeriose hindeutendes Krankheitsbild erkennen lassen, von entscheidender Bedeutung, die Ursache der Krankheit möglichst schnell aufzuklären. Deshalb ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das einen stammspezifischen Nachweis von Listerien auch aus komplexen Proben erlaubt.

Als zeitsparende molekularbiologische Nachweisverfahren wurden in den letzten Jahren u. a. zahlreiche Variationen der Polymerasekettenreaktion (Vaneechoutte et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 48 (1998), 127-139; Graham et al., Can. J. Microbiol., 42 (1996), 1155-1162; Bubert et al., Appl. Environ. Microbiol., 58 (1992), 2625-2632; u. a.), Hybridisierungen auf Nukleinsäureebene und Proteinnachweise mit Hilfe spezifischer Antikörper sowie unterschiedliche Methoden der Gelelektrophorese, wie beispielsweise die PFGE (z. B. Brosch et al., Int. J. Food Microbiol., 32 (1996), 343-355), entwickelt.

Ferner sind bereits zahlreiche Untersuchungen über PCR-Nachweise zur Unterscheidung von Listerien und zur Identifizierung von L. monocytogenes aus komplexem Material bekannt (z. B. Wang et al., Appl. Environ. Microbiol., 58 (1992), 2872-2931). Von Interesse sind hierbei Methoden wie die rep-PCR (repetitive element sequence based PCR; Jersek et al., Journal of Clinical Microbiology, 37 (1999), 103-109), RAPD (random amplification of polymorphic DNA; Wernars et al., Int. J. Food Microbiol., 32 (1996), 325-341) oder die auf RNA-Ebene durchgeführte NASBA-Technik (Nucleic Acid Sequence Based Amplification; Uyttendaele et al., Int. J. Food Microbiol., 27 (1995), 77-89). Diese Techniken dienen allerdings nur zur Differenzierung der Art L. monocytogenes von den restlichen Arten der Gattung Listeria und können nicht zur Unterscheidung einzelner Stämme innerhalb der Art L. monocytogenes verwendet werden.

Folglich ist es eine weitere wesentliche Aufgabe der Erfindung, reproduzierbare und schnelle PCR-Verfahren zur Unterscheidung einzelner Stämme insbesondere innerhalb der Art L. monocytogenes zu entwickeln, da für diese Stämme bedeutende Unterschiede in der Virulenz postuliert werden (z. B. Munk et al., supra).

Die stammspezifischen Unterschiede in der Virulenz von L. monocytogenes spielen ebenfalls eine wesentliche Rolle bei einem Impfverfahren, bei dem dem zu immunisierenden Patienten mit Hilfe sogenannter DNA-Träger die DNA des Organismus, gegen den er geimpft werden soll, inokuliert wird (Dietrich et al., Nature Biotechnology, 16 (1998), 181-185). Aufgrund der Fähigkeit zur intrazellulären Vermehrung kann L. monocytogenes als DNA-Träger verwendet werden. Bei dieser Methode wird L. monocytogenes mit einem Vektor transformiert, in dem der ausschließlich intrazellulär aktivierte Promotor des actA-Gens vor ein Gen kloniert ist, gegen dessen Genprodukt immunisiert werden soll, so daß das Gen nur innerhalb der Wirtszellen exprimiert werden kann. Ebenfalls unter der Kontrolle des actA- Promotors steht das Gen eines gegen Listerien gerichteten Phagenlysins, das, ebenfalls intrazellulär exprimiert, die Lyse der Bakterien induziert und damit zum einen die Verbreitung der Erreger im Körper verhindert und zum anderen die Freisetzung der gesamten bakteriellen DNA bewirkt. Diese DNA kann in das Genom der Wirtszellen und auch in Antigen-präsentierende Zellen integrieren, woraufhin sie dort exprimiert wird und damit eine Immunreaktion des Körpers auslöst. Da über die Risiken dieser Methode noch nichts genaues bekannt ist, ist es von großer Bedeutung, zumindest das Risiko einer Sekundärinfektion durch die Trägerorganismen ausschließen zu können. Dafür ist eine genaue Kenntnis der Virulenz des verwendeten Stammes von L. monocytogenes wesentlich.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem auch sehr nahe verwandte Mikroorganismen, beispielsweise Mikroorganismen derselben Art, insbesondere von L. monocytogenes, nachzuweisen und dabei ebenfalls die Vorteile der PCR, insbesondere die schnelle Anwendbarkeit auch in komplexen Proben, zu nutzen. Weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.

Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche, insbesondere basierend auf der Verwendung von nachstehend beschriebenen Kompetitor-Primern bei dem Nachweisverfahren durch PCR, gelöst.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Diese Aufgabe wird bei der vorliegenden Erfindung dadurch gelöst, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum spezifischen Nachweis von nahe verwandten Mikroorganismen in einer Probe durch PCR zusätzlich zu den für den Ziel-Mikroorganismus spezifischen Primern (im folgenden als Reaktions-Primer bezeichnet) für Nichtziel- Mikroorganismen spezifische Primer (im folgenden als Kompetitor-Primer bezeichnet) eingesetzt werden. Vorzugsweise werden die Reaktions- und Kompetitor-Primer, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, auf Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen der Mikroorganismen entwickelt, wobei diese Gene sowohl artspezifische Bereiche als auch stammspezifische Bereiche aufweisen.

Die Kompetitor-Primer weisen bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform als wesentliches Merkmal am 3'-Ende ein Didesoxynukleotid an Stelle des Desoxynukleotids auf, wodurch eine Kettenverlängerung durch die Polymerase verhindert wird. Werden diese Kompetitor-Primer mit einer Sequenz, die komplementär zu den Nichtziel-Mikroorganismen ist, dem Reaktionsansatz zugegeben, so binden sie mit einer höheren Spezifität als die Reaktions-Primer an die Nichtziel-Mikroorganismen und verhindern somit deren Anlagerung und Amplifikation.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist der Nachweis auch von sehr nahe verwandten Mikroorganismen, insbesondere von verschiedenen Stämmen derselben Art eines Mikroorganismus, möglich, wobei zur Erhöhung der Stringenz eine Temperaturerhöhung über den Temperaturbereich, der für das Binden des spezifischen Primers an seine Zielregion notwendig ist, nicht erforderlich ist. Dadurch wird verhindert, daß durch eine Temperaturerhöhung die Bindung des spezifischen Primers an die Zielregion geschwächt wird und dadurch eine erfolgreiche PCR-Amplifikation nicht möglich ist. Ferner können durch das erfindungsgemäße Verfahren auch schwache Basenfehlpaarungen diskriminiert werden. Des weiteren können Basenfehlpaarungen, die sich in der Mitte der Zielregion bzw. am 5'-Ende des Primers befinden, diskriminiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren, im folgenden auch als kompetitive PCR bezeichnet, kann insbesondere zum spezifischen Nachweis von Listerien auch unterhalb der Artebene, d. h. auf Stammebene, eingesetzt werden. So gibt es innerhalb der Art L. monocytogenes verschiedene Isolate, die bislang vor allem durch die Methode der Serotypisierung (beispielsweise Schönberg et al., supra) voneinander unterschieden werden konnten, und die wahrscheinlich bedeutende Unterschiede in der Virulenz zeigen.

Ein erster Schritt zur Stammunterscheidung von L. monocytogenes stellt die vergleichende Sequenzanalyse wichtiger Gene oder derer Proteine dar. Die 16S-Untereinheit der ribosomalen RNA, die für phylogenetische Untersuchungen ideale Eigenschaften aufweist (Woese, Microbiol. Rev., 51 (1987), 221-271), ermöglicht in der Regel keine Unterscheidung unterhalb des Artniveaus, da hier meist kaum noch Sequenzunterschiede vorliegen.

Eine Möglichkeit, auch innerhalb der Art L. monocytogenes zu differenzieren, ist die vergleichende Analyse von Struktur- und/oder Funktionsgenen und bei pathogenen Mikroorganismen insbesondere von Virulenzgenen (Rasmussen et al., supra), die eine im Vergleich zur RNA erhöhte Variabilität innerhalb der einzelnen Stämme aufweisen. Geeignete Gene für die Entwicklung von Primern, auf deren Basis ein spezifischen Nachweis von Listeria-Mikroorganismen durch PCR auch unterhalb der Artebene möglich ist, sind das iap-Gen, welches für das Protein p60 codiert, das prfA-Gen, welches ein Regulator der Virulenzgene ist, das plcA-Gen, welches für das Protein PC-PLC (Phosphatidylcholin- spezifische Phospholipase C) codiert, das plcB-Gen, welches für das Protein PI-PLC (Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C) codiert, das actA-Gen, welches für das Protein ActA (Aktin-polymerisierendes Enzym) codiert, sowie das hlyA-Gen, welches für Listeriolysin (Hämolysin) codiert, das die Zerstörung der Vakuole der Wirtszelle bewirkt.

Ein weiterer wesentlicher Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit die vorstehend beschriebenen DNA-Primer, die auf der Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen der Mikroorganismen, insbesondere von Listeria, entwickelt worden sind, wobei die Gene sowohl artspezifische Bereiche als auch stammspezifische Bereiche aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Reaktions- und Kompetitor-Primer zum Nachweis von Listeria- Mikroorganismen unterhalb der Artebene sind insbesondere auf der Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen von Listeria, umfassend iap, prfA, plcA, plcB, actA und hlyA, entwickelt worden.

Für phylogenetische Untersuchungen unterhalb der Artebene wird bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das iap-Gen aus L. monocytogenes zur Entwicklung der erfindungsgemäßen Primer herangezogen, da es aufgrund seiner Struktur, die neben konservierten Regionen auch hochvariable Bereiche aufweist, ein ideales Molekül zur Unterscheidung von Mikroorganismen der Gattung Listeria auch unterhalb des Artniveaus ist.

Das vom iap-Gen kodierte Protein p60 ist in allen Arten der Gattung Listeria vorhanden und liegt in Listerienkulturen in großen Mengen extrazellulär vor. In geringen Mengen ist es auch an die Zellmembran gebunden (Ruhland et ab, J. Gener. Microbiol., 139 (1993), 609-616). Die anhand von SDS-Polyacrylamid-gelelektrophoretischer Auftrennung ermittelte Größe liegt bei 60 kDa, während die theoretisch bestimmte Größe des prozessierten Proteins mit 47,5 kDa bedeutend kleiner ist (Köhler et al., Inf. Imm., 58 (1990), 1943-1950). Diese Beobachtung ist auf die veränderte Wanderungsgeschwindigkeit von p60 im elektrischen Feld aufgrund des hohen isoelektrischen Punkts von etwa 9,5 zurückzuführen (Köhler et al., supra). Die Ursache des hohen isoelektrischen Punkts ist die große Anzahl positiv geladener Aminosäuren, insbesondere von Lysin und Arginin.

Die Bedeutung von p60 im Infektionszyklus der Bakterien liegt - zusammen mit den Internalinen - in der Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle. Aufgrund seiner zusätzlichen Aktivität als essentielle Mureinhydrolase ist p60 auch an späteren Schritten der Zellteilung beteiligt und ist damit als housekeeping-Gen von zusätzlicher Bedeutung (Wuenscher et al., J. Bacteriol., 175 (1993), 3491-3501). Im iap-Gen mutierte Listerien, sog. Down-Mutanten, exprimieren nur noch eine geringe Menge an p60 und zeigen als filamentöse Formen, die nur durch Septen voneinander getrennt sind, eine deutlich veränderte Morphologie. Solche Mutanten, sog. R-Mutanten aufgrund ihrer veränderten Koloniemorphologie, sind avirulent (Köhler et al., supra; Bubert et al., supra) und können im Zellkulturmodell in verschiedene Zelllinien, wie z. B. nicht-phagozytische 3T6-Mausfibroblasten nicht eindringen.

In diesen vorstehend genannten Studien wurden anhand von Sequenzanalysen einzelne Bereiche des iap-Gens mit charakteristischen Merkmalen beschrieben (siehe Abb. 1). So sind innerhalb dieses Gens bei den Arten L. monocytogenes und L. innocua hochvariable Bereiche zu finden, die eine immer wiederkehrende Folge von Threonin-Asparagin (TN)- Einheiten, getrennt durch ein PSK(Pro-Ser-Lys)-Motiv, aufweisen. Die variablen Bereiche unterscheiden sich in der Anzahl der TN-Einheiten und erlauben somit eine Stammunterscheidung der Art L. monocytogenes aufgrund von Längenpolymorphismen des iap-Gens. Das N-terminale Signalpeptid sowie weitere Bereiche am N-Terminus und am C- Terminus sind dagegen hochkonserviert und können somit zur Unterschiedung innerhalb der Gattung Listeria herangezogen werden. Die zentrale Domäne des iap-Gens der vier weiteren Arten der Gattung, L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii und L. grayi, umfaßt an Stelle der repetitiven TN-Einheiten eine 54 Aminosäuren lange Insertion (Bubert et al., supra).

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden am Beispiel des Nachweises von Listeria-Mikroorganismen veranschaulicht; es ist jedoch für sämtliche Arten von Mikroorganismen für den Fachmann ohne weiteres entsprechend durchführbar.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde das iap-Gen von 34 verschiedenen L.- monocytogenes-Stämmen analysiert. Auf der Basis der gewonnenen Daten wurde eine Datenbank erstellt, in die neben den iap-Sequenzen von 34 L.-monocytogenes-Stämmen auf die vollständigen iap-Sequenzen von L. grayi, L. welshimeri, L. innocua, L. ivanovii und von vier Stämmen der Art L. seeligeri aufgenommen wurden (siehe Abb. 1). Dabei konnte mit dem iap-Gen als "phylogenetischem" Marker eine eindeutige und stabile Zuordnung der L.- monocytogenes-Stämme zu drei distinkten Gruppen vorgenommen werden. Diese Gruppen werden im folgenden als Cluster oder Genovare bezeichnet (siehe Abb. 2).

Alle bislang bekannten L.-monocytogenes-Stämme konnten einem der drei identifizierten Genovare zugeordnet werden, wobei hochvirulente Stämme bislang nur dem Cluster II zugeordnet werden konnten. Eine Abschätzung der Virulenz hinsichtlich der Cluster I und III kann noch nicht getroffen werden.

Die im Stand der Technik bekannten PCR-gestützten Nachweise für L. monocytogenes (z. B. Bubert et al., supra; Deneer et al., Appl. Environ. Microbiol., 57 (1991), 606-609; Graham et al., supra) können nur auf artspezifischer Ebene angewendet werden und erlauben keine exaktere Differenzierung von L.-monocytogenes-Stämmen. Auf der Basis der iap-Sequenzen der jeweiligen Stämme konnten nun überraschenderweise stammspezifische Primer entwickelt werden, mit deren Hilfe eine spezifische Detektion der drei L.-monocytogenes- Cluster ermöglicht wurde. Damit ist durch die erfindungsgemäßen Primer eine Differenzierung nahe verwandter Stämme durch eine stammspezifische PCR möglich.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zum spezifischen Nachweis von nahe verwandten Mikroorganismen in einer Probe konnten verschiedene L.-monocytogenes-Stämme auch in einem DNA-Gemisch identifiziert werden. Da die Clustereinteilung der L.-monocytogenes- Stämme sehr wahrscheinlich mit einer veränderten Virulenz zusammenhängt, können mit der erfindungsgemäßen kompetitiven PCR auf schnellstem Wege zum einen Listerien nachgewiesen werden und zum anderen die Virulenz des die Symptome eines Patienten verursachenden Keims abgeschätzt werden. Dies führt zu einer bedeutenden Erleichterung der Diagnose und Therapierung entsprechender Krankheiten.

Somit können die erfindungsgemäßen Primer bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung zur Diagnose und Therapie von bakteriellen Infektionen, insbesondere von Listeria-Infektionen, verwendet werden.

Erfindungsgemäß wird ein in-vitro-Verfahren zur DNA-Amplifikation bereitgestellt, das sich von den bisher bekannten PCR-Verfahren durch die Möglichkeit der Unterscheidung von Mikroorganismen auch unterhalb der Artebene unterscheidet. Die Entwicklung Genovar- spezifischer Primer für die Spezies L. monocytogenes, mittels derer auch unterhalb der Artebenen noch eine Differenzierung möglich ist, basiert auf der Erstellung einer umfangreichen iap-Datenbank. Damit lassen sich erfindungsgemäß L.-monocytogenes-Isolate einem der drei vorstehend beschriebenen Genovare zuordnen.

Aufgrund der umfangreichen iap-Sequenzanalyse verschiedener L.-monocytogenes-Isolate wurden bei der vorliegenden Erfindung vier Stellen innerhalb des iap-Gens bestimmt, die für die Entwicklung spezifischer Primer für jede Entwicklungslinie geeignet sind. In der folgenden Tabelle 1 sind die anhand des Alignments entwickelten erfindungsgemäßen PCR- Reaktionsprimer aufgeführt:

Tabelle 1

Auch von der Erfindung umfaßt sind solche Primer, die sich von den in Tabelle 1 aufgeführten Primern in bis zu drei Basen unterscheiden, aber dennoch eine spezifische Hybridisierung und Amplifizierung gewährleisten.

Aufgrund der hohen Ähnlichkeit der iap-Sequenzen zwischen den drei ermittelten L.- monocytogenes-Entwicklungslinien weisen die Primer oft nur wenige und schwache Basenfehlpaarungen zu den Binderegionen der jeweiligen Nicht-Zielcluster auf und führen deshalb zur Bildung unspezifischer PCR-Produkte mit den entsprechenden Stämmen. Um diesem Problem zu begegnen, wurden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Kompetitor- Primer eingesetzt, die keine Basenfehlpaarung zu den Binderegionen der Nicht- Zielorganismen aufweisen. Ein wesentliches Merkmal dieser Kompetitoren ist ein Didesoxynukleotid an ihrem 3'-Ende. Binden nun die Kompetitoren an ihre Zielregion, wird die Bindungsstelle blockiert, und die PCR-Reaktionsprimer mit ihren schwachen Basenfehlpaarungen können nicht mehr unspezifisch binden. Damit wird eine Kettenverlängerung und folglich die Bildung eines PCR-Produkts durch die fehlende 3'- hydroxylgruppe des Didesoxynukleotids verhindert. Die Sequenzen der erfindungsgemäßen Kompetitor-Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt, wobei K für G oder T, Y für C oder T, W für A oder T, und M für A oder C steht und die mit * markierten Basen Didesoxynucleotide sind. Bei den Kompetitor-Bezeichnungen bestimmt die römische Zahl vor dd (dd: Didesoxy) die Cluster, die mit Hilfe dieser Kompetitoren detektiert werden sollen, während die römische Zahl hinter dd für die Cluster steht, an welche die Kompetitoren binden sollen.

Tabelle 2

Auch von der Erfindung umfaßt sind solche Primer, die sich von den in Tabelle 2 aufgeführten Primern in bis zu drei Basen unterscheiden, aber dennoch eine spezifische Hybridisierung und Amplifizierung gewährleisten.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne diese in irgendeiner Weise einzuschränken.

Beispiel 1 Nachweis der drei Genovare der Listeria-monocytogenes-Stämme a) Enzymatische Markierung von Oligonukleotiden am 3'-Ende mittels terminaler Transferase

Für die Durchführung der kompetitiven PCR wurden als Kompetitor-Primer Oligonukleotide eingesetzt, die an ihrem 3'-Ende an Stelle des Desoxynukleotides ein Didesoxynukleotid enthalten, wodurch eine Kettenverlängerung an Stellen, an denen diese kompetitiven Primer gebunden haben, verhindert wird. Da eine chemische Synthese eines Oligonukleotids, welches am 3'-Ende durch ein Didesoxynukleotid abgeschlossen wird, nicht möglich ist, wurden die erfindungsgemäßen Kompetitor-Primer auf biochemischem Wege durch enzymatische Markierung hergestellt. Dabei wurden durch Digoxygenin markierte oder unmarkierte ddNTPs mittels terminaler Transferase an das 3'-Ende des Oligonukleotids addiert. Dazu wurden die folgenden Lösungen verwendet:

- Terminale Transferase-Kit (Boehringer, Mannheim),
- Stoplösung:
0,2 M EDTA-Lösung (200 µl),
Glykogen (Sigma, Deisenhofen) (1 µl),
- Lithiumchlorid-Lösung (4 M LiCl).

Alle weiteren verwendeten Lösungen (CoCl₂, Tailing Buffer) sind im Terminale Transferase- Kit enthalten.

Der Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung:

Oligonukleotid	100 pmol
Tailing Buffer	4 µl
CoCl₂	4 µl
ddNTP (Boehringer, Mannheim)	1 µl
Terminale Transferase	1 µl (25 Einheiten)
H₂O_reinst	ad 20 µl

Der Reaktionsansatz wurde vorsichtig gemischt, für 15 min bei 37°C inkubiert und danach sofort auf Eis abgekühlt. Zum Beenden der Reaktion wurde anschließend 2 µl Stoplösung und 2,5 µl 4 M LiCl zugegeben. Zum Ausfällen der Produkte wurden 75 µl Ethanol zugegeben und diese für mindestens 2,5 Stunden oder über Nacht bei -20°C gefällt. Anschließend wurden die Oligonukleotide für 30 min bei 14000 rpm und 4°C zentrifugiert und mit 150 µl 70% Ethanol gewaschen. Die gefällten und gewaschenen Kompetitoren wurden im Vakuum (SpeedVac, Bachofer, Reutlingen) getrocknet, in 100 µl H₂O_reinst aufgenommen und bei -20°C gelagert.

b) Durchführung der kompetitiven PCR

Die Effizienz der PCR ist u. a. von der Konzentration der eingesetzten Menge an Template abhängig. Zur Bestimmung der optimalen Konzentration wurden die PCR-Reaktionen mit variierenden DNA-Konzentrationen von 10 bis 1000 ng/µl (10, 20, 50, 100, 500 und 1000 ng/µl) und mit unverdünnter DNA durchgeführt. Dabei erwies sich eine DNA-Konzentration von 50 ng/µl zum Nachweis aller drei Cluster als optimal.

Die Spezifität der Reaktionen ist ferner im Falle der kompetitiven PCR durch die Konzentration der eingesetzten Kompetitoren in Abhängigkeit zur eingesetzten Reaktionsprimerkonzentration bedingt. Für eine spezifische Reaktion waren unter den gewählten Bedingungen mindestens 3 µmol jedes einzelnen Kompetitors für 50 µl Reaktionsansatz und 15 µmol PCR-Primer notwendig.

Da neben der Annealingtemperatur auch die Konzentration an zweiwertigen Ionen, insbesondere von Mg²⁺-Ionen von Bedeutung für die Bildung spezifischer PCR-Produkte ist, wurden in diesem Rahmen auch Versuchsreihen zur Bestimmung der jeweils optimalen MgCl₂-Konzentration im Reaktionsansatz durchgeführt. Eine mit 40 mM sehr hohe MgCl₂- Konzentration ergab nach einem Vergleich der PCR-Banden aus einer MgCl₂-Reihe mit 15, 20, 25, 30, 35 und 40 mM MgCl₂ optimale Ergebnisse für die Cluster I und II. Ein spezifischer Nachweis des Clusters III war dagegen erst bei einer MgCl₂-Konzentration von 25 mM möglich.

Für das Annealing erwiesen sich Temperaturen von 60 bzw. 57°C für Mikroorganismen der Cluster I und II und von 52°C für Mikroorganismen des Clusters III als optimal.

Die ebenfalls in mehreren PCR-Experimenten optimierten Elongationszeiten variierten von 15 Sekunden für Cluster II bis 40 Sekunden für Cluster III. Die genannten Annealingtemperaturen und Elongationszeiten beziehen sich auf die Verwendung eines Kapillar-PCR-Gerätes (Rapid Cycler Idaho Technologies, Idaho Falls, U.S.A.).

Die Reaktionsbedingungen sind in der folgenden Tabelle 3 dargestellt:

Tabelle 3

c) Eignung der Kompetitoren zur Inhibierung unspezifscher PCR-Produkte

Ohne die Verwendung der erfindungsgemäßen Kompetitoren (siehe Tabelle 2) trat bei den PCR-Reaktionen, mittels derer die Cluster I und II selektieren werden sollten, unabhängig von der Wahl des PCR-Programms unspezifische Produkte auf. Deren Bildung konnte durch die vorstehend erwähnten Kompetitoren verhindert werden.

In Abb. 3 ist beispielhaft eine PCR-Reaktion für den Cluster I sowohl mit als auch ohne den erfindungsgemäßen Kompetitoren abgebildet, die dieses Problem aufzeigt. Dabei ist ohne den Einsatz von erfindungsgemäßen Kompetitoren eine schwache unspezifische Bande mit Nicht-Zielorganismen erkennbar (Spur 10). Bei der Verwendung von Kompetitoren (siehe Tabelle 2) konnte die Entstehung dieses PCR-Produkts unterdrückt werden (Spur 5). Eine Erhöhung der Annealingtemperatur allein brachte nicht den gewünschten Erfolg, da bei zu hohen Temperaturen auch die Bildung spezifischer Produkte inhibiert wurde (nicht in Abb. 3 dargestellt).

Dabei wurde der folgende Ansatz mit einem Kapillar-PCR-Gerät (Rapid Cycler Idaho Technologies) durchgeführt. Alle Reagentien, außer den Primern, die verwendeten Desoxynukleotidtriphosphate und die DNA-Polymerase wurden von Rapid Cycler Idaho Technologies bezogen; die Nukleotide waren von Pharmacia (Uppsala, Schweden).

Standardansatz für eine Reaktion ohne Kompetitoren

Standardansatz für eine Reaktion mit Kompetitoren

Programmierung des Thermocyclers

Primerpaar iap-412-I-V/iap-1047-I-R (spezifischer PCR für Cluster I)

Primerpaar iap-820-II-V/iap-1047-II-R (spezifischer PCR für Cluster II)

Primerpaar iap-217-III-V/iap-1047-III-R (spezifische PCR für Cluster III)

Die erhaltenen PCR-Produkte wurden für die Verwendung als Template zur Sequenzierreaktion mit Hilfe des PCR-Purification-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) von den weiteren Bestandteilen der PCR-Reaktion wie Primer, Polymerase und Puffersystem abgetrennt. Diese Reinigung beruht auf einer säulenchromatographischen Auftrennung. Alle Puffer und Reagenzien waren im Kit enthalten und wurden entsprechend dem beigelegten Handbuch eingesetzt.

Zur quantitativen Konzentrationsbestimmung der Nukleinsäurelösungen (Clark und Swika, 1977) wurde ein geeignetes Aliquot der Nukleinsäurelösung mit H₂O_reinst verdünnt und in einem Spektralphotometer (Beckmann DU 650, München) vermessen.

Zur qualitativen Analyse der einzelnen Nukleinsäurepräparationen wurde eine horizontale Agarosegelelektrophorese durchgeführt (Elektrophoreseapparatur: Gel Electrophoresis GNA- 100, Pharmacia, Uppsala, Schweden; Gelwanne: Typ H3 Elektrophoresewanne 11 × 14 cm für 100 ml Gelvolumen, Gibco-BRL, Eggenstein). Die Nukleinsäuren wurden in einem elektrischen Feld innerhalb einer Agarosematrix aufgetrennt. Dabei wurden im einzelnen folgende Lösungen verwendet:

- Auftragspuffer:
25% (w/v) Ficoll (Sigma, Deisenhofen),
50 mM EDTA,
0,5% (w/v) Bromphenolblau,
0,5% (w/v) Xylencyanol.
- TAE-Puffer (100 × konzentriert):
4 M Tris,
1 m Natriumacetat,
0,1 M EDTA,
pH 8,0 mit Eisessig eingestellt.
Die Gebrauchslösung (Laufpuffer und Puffer für die Gelbereitung: 1 × TAE-Puffer) wurde aus der Stammlösung durch Verdünnung mit H₂O_dest hergestellt.
- Agarosegel:
1-2 g Agarose (electrophoresis grade, Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) wurden mit 100 ml 1 × TAE-Puffer versetzt und in einem Mikrowellenofen aufgeschmolzen. Nach Abkühlen der Agaroselösung auf ca. 50-60°C wurde diese zum Auspolymerisieren in die vorbereitete Gelwanne mit eingesetztem Kamm gegossen.
- Längenstandard:
75 bp-12,2 kb DNA-Leiter (KBL; Boehringer, Mannheim).
- Ethidiumbromid-Stammlösung:
10 mg EtBr/ml H₂O_dest.

Das Agarosegel wurde mit der Elektrophoresewanne in die waagrecht justierte Apparatur mit 1 × TAE-Puffer eingelegt. Die zu untersuchenden Proben wurden mit Auftragspuffer versetzt und in die Taschen des Agarosegels eingebracht, die Apparatur zusammengebaut und an eine Stromquelle angeschlossen. Die Auftrennung der Nukleinsäuren erfolgte bei einer Stromstärke von etwa 130 mA und bei maximal 150 V Spannung für etwa 1 bis 2 Stunden. Nach Beendigung des Laufs wurde das Gel in eine Färbewanne mit 500 ml H₂O_dest und 50 µl EtBr-Stammlösung überführt. Nach einer Färbezeit von etwa 20 min wurde das Gel in eine Wanne mit H₂O_dest überführt und für etwa 10 min gewässert. Die Dokumentation der aufgetrennten Nukleinsäuren erfolgt mit einem Videodokumentationssystem (Cybertech CS-1 Image Documentation System) unter UV-Durchstrahlung (302 nm, Bachofer Transilluminator, Reutlingen) und dem dazugehörigen Image Capture Computer (ICC/4).

Für die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde ein Reinigungskit verwendet (DNA-Gel Extraktions Kit, Boehringer, Mannheim, Deutschland). Das Prinzip der Abtrennung beruht bei diesem Kit auf einer vorübergehenden selektiven Bindung der DNA an eine Silicamatrix. Diese wird zusammen mit der DNA durch Zentrifugation von störenden Bestandteilen, wie Proteinen und Salzen, abgetrennt.

Die DNA wurde in einem 0,8%-igen Agarosegel mit EtBr-Lösung kurz angefärbt. Anschließend wurden die DNA-enthaltenden Gelstücke unter UV-Bestrahlung (Wellenlänge 302 nm, Bachofer Transilluminator) mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Die Extraktion der DNA aus den Agarose-Gelstücken erfolgte nach den Angaben des Herstellers.

Alle Puffer und Lösungen waren bereits gebrauchsfertig im Isolierungskit vorhanden bzw. wurden nach den Herstellangaben bereitet.

Abbildungen

Abb. 1: Schematischer Aufbau des iap-Gens; gesamte Länge: 1454 bp bei L. monocytogenes EGD.

Abb. 2: Nach dem Neighbour Joining-Verfahren (Woese, supra) anhand des iap-Gens entwickeltes, auf Nukleinsäuresequenzen basierendes Dendrogram aller Listeria-Arten, davon 34 L.-monocytogenes-Stämme; ohne Verwendung eines Filters.

Abb. 3: Spezifische PCR für Cluster I; Spuren 1, 6 und 11: Längenstandard; Spuren 2 und 7: Negativkontrolle ohne DNA; Spuren 3 und 8: Positivkontrolle mit L. monocytogenes sv 4ab; Spuren 4 und 9: Nachweis von L. monocytogenes sv 4ab aus einem Gemisch mit 5 weiteren Stämmen anderer Cluster; Spuren 5 und 10: Spezifitätskontrolle mit der DNA zweier Stämme aus Cluster II und III; Spuren 2 bis 5: PCR mit Kompetitoren; Spuren 7 bis 10: PCR ohne Kompetitoren.

Claims

1. Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zu den für den Ziel-Mikroorganismus spezifischen Primern (Reaktions-Primern) für Nichtziel- Mikroorganismen spezifische Primer (Kompetitor-Primer) eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktions- und Kompetitorprimer auf Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen der Mikroorganismen entwickelt werden, wobei die Gene sowohl artspezifische Bereiche als auch stammspezifische Bereiche aufweisen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktions- und Kompetitorprimer auf Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen von Listeria entwickelt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktions- und Kompetitorprimer auf Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus iap, prfA, plcA, plcB, actA und hlyA, entwickelt werden.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kompetitor-Primer am 3'-Ende ein Didesoxynukleotid aufweisen.

6. DNA-Primer, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf der Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen der Mikroorganismen entwickelt sind, wobei die Gene sowohl artspezifische Bereiche als auch stammspezifische Bereiche aufweisen.

7. Primer nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf der Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen von Listeria entwickelt sind.

8. Primer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus iap, prfA, plcA, plcB, actA und hlyA, entwickelt sind.

9. Primer nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch für Genovare der Art Listeria monocytogenes sind.

10. Primerpaare mit den Sequenzen:

a) 5'-TAC TTA ACT GAC AAA GCA GT-3' und
5'-ATT CGT ATT AGT ATT TGA GTT TG-3'.
b) 5'-ACT AAC ACT AAC ACA AAT GC-3' und
5'-GGA GTT TGT ATT AGT ATT GGT A-3'.
c) 5'-AAT GAG GTC GCT AAA ACA GA-3' und
5'-TGT GTT CGT GTT TGT ATT TGT G-3'

oder umfassend diese Sequenzen oder Sequenzen, die sich von diesen um bis zu 3 Basen unterscheiden.

11. DNA-Primer nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Didesoxynukleotid am 3'-Ende aufweisen.

12. Primer nach einem der Ansprüche 6 bis 9 mit den Sequenzen:

a) 5'-TAC TTA ACT GAC AAA GTA G*-3'.
b) 5'-ATT CGT ATT GGA GTT TGT ATT-A*-3'.
c) 5'-AGC-ATT-TGT-GTT-CGT-GTT-T*-3'.
d) 5'-ACK-AAY-ACA-AAT-ACW-GCT-M*-3'.
e) 5'-AGT-ATT-TGA-GTT-TGT-ATT-AGT-AT*-3'.
f) 5'-TGT-GTT-CGT-GTT-TGT-ATT-TGT*-3'.
g) 5'-GAG-GTK-GCT-GCT-GCT-G*-3'.
h) 5'-GGA-GTT-TGT-ATT-AGT-ATT-GGT*-3'

oder umfassend diese Sequenzen oder Sequenzen, die sich von diesen um bis zu 3 Basen unterscheiden,
wobei K für G oder T, Y für C oder T, W für A oder T und M für A oder C steht und die mit * markierten Basen Didesoxynucleotide sind.

13. Verwendung der Primer nach einem der Ansprüche 6 bis 12 in einem Verfahren zum spezifischen Nachweis von nahe verwandten Mikroorganismen in einer Probe durch Polymerase-Kettenreaktion.

14. Verwendung der Primer nach einem der Ansprüche 6 bis 12 zur Diagnose und Therapie von bakteriellen Infektionen, insbesondere von Listeria-Infektionen.