CN105821123A - 基于单增李斯特菌毒力基因的三重实时荧光定量pcr检测用引物、mgb探针及检测方法 - Google Patents

基于单增李斯特菌毒力基因的三重实时荧光定量pcr检测用引物、mgb探针及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于单增李斯特菌毒力基因的三重实时荧光定量PCR检测用引物、MGB探针及检测方法。本发明针对单增李斯特菌hlyA、 inlA和plcB基因科学设计特异性引物，其DNA序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示；同时提供MGB探针，其DNA序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示。基于所述引物和MGB探针，本发明整体优化了实时荧光PCR检测体系和的反应程序条件，成功建立了高通量的单增李斯特菌的TaqMan ‑MGB探针三重实时荧光定量PCR检测方法，操作简单、安全，最低检测细菌浓度为100CFU/mL，整个扩增过程在50min以内，具有更加高的灵敏度、特异性和稳定性，可以很好地满足食品安全中监管中单增李斯特菌的快速检测和鉴定，能快速、准确测定样本中单增李斯特菌的含量，同时可以分析单增李斯特菌菌株的三个毒力基因携带情况，可用于其流行病学溯源和毒力强弱分析。

Description

基于单增李斯特菌毒力基因的三重实时荧光定量PCR检测用引物、MGB探针及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种基于单增李斯特菌特异性毒力基因hlyA、inlA和plcB的三重实时荧光定量PCR检测用引物、TaqMan-MGB探针以及三重实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术
单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一种革兰氏阳性胞内寄生菌，主要引起成人败血症和新生儿脑膜炎等疾病，发病后死亡率可达20-30％。该菌对环境抵抗力较强，在1～4℃可生长繁殖，-20℃可部分存活，并可抵抗反复冷冻，WHO已将其列为4大食源性致病菌之一。单李增斯特菌被世界卫生组织列为重点监测的食源性病原菌之一。中国目前虽然未曾爆发人感染单增李斯特菌病，但多位研究者从各地多种食品中均分离出单增李斯特菌，其风险性不容忽视。不同来源的单增李斯特菌携带的毒力差异较大，准确、快速地检测单增李斯特菌及其毒力基因对预防单增李斯特菌病有重要的意义，也可为食源性单增李斯特菌的溯源和风险评估提供重要技术支持。
单增李斯特菌毒力基因主要集中在两个毒力岛LIPI-1和LIP-2，hlyA基因、plcB属于LIP-1，inlA属于LIP-2。hlyA基因是单增李斯特菌最重要的毒力基因，编码的李斯特菌溶血素O(listeriolysin，LLO)是单增李斯特菌最重要的一种毒力因子，为细菌入侵宿主细胞及帮助细菌逃脱吞噬泡所必需。有研究显示，缺失hlyA序列的单增李斯特菌无法入侵宿主细胞，对宿主无毒性。InlA基因编码内化素，它与细菌的侵袭相关，位于菌体表面,与特异性受体钙黏蛋白(E-cadherin)结合，介导细菌侵袭入细胞并内化至吞噬小体，是建立感染的前提。有研究结果显示，InlA/InlB基因双缺失后，单增李斯特菌菌株的毒力明显减弱。于丰宇等有关小鼠毒力实验的LD50也显示，内化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)的缺失可能是导致菌株毒力降低的原因，目前有关报道表明致病性的LM都含有inlA、inlB。plcB编码磷脂酰胆碱磷脂酶(PC-PLC)，是细菌在宿主细胞间扩散并突破双层膜时需要的关键因子之一，还可帮助单增李斯特菌逃离吞噬小体。
现有的传统培养后生化鉴定的方法周期长，须两次增菌培养后对可疑菌落进行生化鉴定，检测周期长达6～7d，无法满足大量样本的快速、准确检测的需求；普通PCR方法一般是检测一个毒力因子，无法对单增李斯特菌的主要毒力基因进行筛查式检测，无法分析不同来源的单增李斯特菌的毒力强弱，也无法与其血清型别分型、MLST分型等技术所得结果相关联进行综合分析，不利于不同来源的单增李斯特菌的分子溯源。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有单增李斯特菌检测技术的不足，提供一组基于单增李斯特菌的三个特异性毒力基因：hlyA、inlA和plcB的三重实时荧光定性和/或定量PCR检测用的特异性引物。
本发明另一要解决的技术问题是提供适用于单增李斯特菌的三个特异性毒力基因三重实时荧光定性和/或定量PCR检测用的MGB探针，具有分辨率高和特异性强的优点。
本发明还一要解决的技术问题是提供基于单增李斯特菌毒力基因的三重实时荧光定性和/定量PCR检测方法，是一种特异性强、灵敏度高和具良好稳定性的高通量检测方法，并同时可以检测单增李斯特菌携带hlyA、inlA和plcB三个特异毒力基因的情况，方便单增李斯特菌菌株毒力的强弱及溯源分析。
本发明提供的毒力基因三重实时荧光PCR检测方法，适用于大量不同来源样本的单增李斯特菌毒力基因分布情况的快速检测及流行病学调查，可与血清型别分型、MLST分型等技术所得结果进行综合分析，便于不同来源的单增李斯特菌的分子溯源；三重实时荧光PCR的毒力基因检测结果可为分析单增李斯特菌菌株毒力强弱提供参考依据，对控制单增李斯特菌引发的疾病的传播和治疗有积极意义。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一组基于单增李斯特菌的三个特异性毒力基因：hlyA、inlA和plcB的三重实时荧光定性和/或定量PCR检测用的特异性引物，其序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。
SEQIDNO.1：hlyA-F：5’-CCTCGGAGACTTACGAGATATTTTG-3’。
SEQIDNO.2：hlyA-R：5’-GCAATGGGAACTCCTGGTGTT-3’。
SEQIDNO.3：inlA-F：5’-TAACAGACACGGTCTCGCAAA-3’。
SEQIDNO.4：inlA-R：5’-TCCCTAATCTATCCGCCTGAAG-3’。
SEQIDNO.5：plcB-F：5’-CCAGCAGCTCCGCATGA-3’。
SEQIDNO.6：plcB-R：5’-TCCGCGGACCAACTAAGTTTA-3’。
本发明同时提供一种单增李斯特菌的TaqMan-MGB三重实时荧光PCR检测用MGB探针，序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示：
SEQIDNO.7：
hlyA-MGB-probe：5’-FAM-AGGTGCTACTTTTAACC-MGB-3’
SEQIDNO.8：
inlA-MGB-probe：5’-VIC-ATCTAGACCAAGTTACAAC-MGB-3’
SEQIDNO.9：
plcB-MGB-probe：5’-NED-ATCGACAGCAAATTA-MGB-3’
基于所述特异性引物组和探针，本发明提供一种单增李斯特菌的TaqMan-MGB三重实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
S1.吸取菌液，提取DNA，得反应的DNA模板；
S2.采用本发明设计的引物和探针，进行三重实时荧光PCR扩增，对单增李斯特菌进行定性和/或定量检测；
其中，步骤S2所述三重实时荧光PCR检测的扩增体系中引物和探针配比优选为：
hlyA:SEQIDNO.1:SEQIDNO.2:SEQIDNO.7＝500nM:500nM:500nM；
inlA:SEQIDNO.3:SEQIDNO.4:SEQIDNO.8＝600nM:600nM:600nM；
plcB:SEQIDNO.5:SEQIDNO.6:SEQIDNO.9＝500nM:500nM:500nM；
步骤S2所述三重实时荧光PCR检测的反应程序为：Stage1：预变性95℃30s；Stage2：95℃5s，58℃34s，40个循环，并于FAM、VIC、NED三个通道收集荧光信号；
步骤S3所述定性检测的方法为：待测基因出现扩增曲线，且Ct值<36，则判断为阳性，如果36<Ct<40，判断为可疑，可加大模板量重复实验，如果有典型扩增曲线，判为阳性，否则为阴性，无Ct值或Ct等于40为阴性；
步骤S3所述定量检测的方法为：采用不同稀释度的单增李斯特菌菌液1mL按步骤S1提取基因组DNA，并按步骤S2进行三重实时荧光定量PCR扩增，以Y轴为Ct值，X轴为log10(CFU)分别绘制hlyA、inlA和plcB标准曲线及得到标准曲线的公式。根据三条标准曲线的公式代入待测样品扩增得到的Ct值，即可计算出对应样品中单增李斯特菌的含量。
优选地，步骤S1所述菌液的获得方法是将菌株用脑心浸萃液增菌培养所得，培养条件为：在培养温度为36℃条件下培养24h。
优选地，步骤S1提取DNA具体方法为：取1mL菌液在12000r/min条件下离心处理去上清，采用商品化细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA作为反应的模板。
优选地，步骤S2所述三重实时荧光PCR检测的反应体系为30μL：PremixExTaqTM(2×)15μL，hlyA、plcB引物、探针(20μM)分别为0.5μL,、inlA引物、探针(20μM)分别为0.6μL，ROX0.3μL，去离子水7.9μL，步骤S1所述DNA模板为2μL。
优选地，步骤S3所述的稀释度为6个：1×107CFU/mL、1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL、1×102CFU/mL。
所述单增李斯特菌的TaqMan-MGB三重实时荧光定量PCR检测方法可以很好地应用于单增李斯特菌的快速批量检测中，或应用于对单增李斯特菌株毒力基因hlyA、inlA和plcB的携带情况进行检测方面以及应用于检测分析单增李斯特菌毒力强弱方面。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明首先通过对单增李斯特菌的携带毒力基因的针对性分析，科学选择了三个重要的毒力基因：hlyA、inlA和plcB，基于GenBank中hlyA、inlA和plcB基因序列(分别为GenBank:KC770796.1，GenBank:JF712529.1，GenBank:EF445938.1)，科学设计了一组共六条特异性引物及三条探针序列，进行比对分析后进行筛选，最大程度减少引物和探针间二级结构的影响，PCR扩增时六条引物及三条探针之间互不干扰，扩增效率都符合定量检测的要求。基于所述特异性引物，成功建立一种快速、准确、高通量的单增李斯特菌三重实时荧光PCR检测方法，填补现有技术的空白。
2.本发明对探针的设计进行了优化，采用了3’端带MGB修饰的探针(其3′端修饰了基团-二氢环化吲哚卟啉-三肽(DPI3)，应用更加短的探针序列(hlyA、inlA和plcB基因探针长度分别为：18bp，19bp，15bp)达到多重实时荧光PCR所要求的Tm值，短的序列减少了引物、探针之间二级结构干扰的概率。获得了具有更加高的灵敏度和特异性的探针。此外由于MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不发荧光，可以大大降低本底信号的值，提高了多重荧光PCR检测的灵敏度。
3.在实时荧光PCR检测实践中，上下游引物间扩增的片段长度一般在200bp以内，太长会影响其扩增效率，进而无法准确实现定量检测。定量要求的扩增效率一般在80％～120％之间，本发明的hlyA、inlA和plcB目标扩增片段设计为72bp、66bp、69bp，可很好的满足三重实时荧光PCR定量检测的要求，扩增效率及标准曲线的相关系数均满足要求，见图1。
4.除了特异性引物和优越的探针设计以外，本发明对整体检测方法和体系进行了优化设计，本发明所建立的扩增体系引物和探针配比优选为：
hlyA:SEQIDNO.1:SEQIDNO.2:SEQIDNO.7＝500nM:500nM:500nM
inlA:SEQIDNO.3:SEQIDNO.4:SEQIDNO.8＝600nM:600nM:600nM
plcB:SEQIDNO.5:SEQIDNO.6:SEQIDNO.9＝500nM:500nM:500nM
退火延伸温度是PCR扩增中关键的参数，本发明根据多重实时荧光PCR实际扩增情况，扩增参数优选在以下条件下进行：Stage1：预变性95℃30s；Stage2：95℃5s，58℃34s，40个循环，并于FAM、VIC、NED三个通道收集荧光信号；
在此基础上，如何确定扩增体系各组分的用量或体积，可根据经验并视实际扩增的情况进行调配。
本发明利用TaqManMGB探针技术建立的单增李斯特菌三重实时荧光PCR快速检测方法，5′采用不同的荧光报告基团(FAM、VIC和NED)标记，信号之间互不干扰，3′端修饰MGB)探针，提高了探针结合的严谨度，最高可识别一个碱基的差异，增加了检测的分辨率。同时，发挥TaqMan-MGB探针的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团、本身不会产生荧光的优势，降低了单增李斯特菌实时荧光PCR反应的荧光本底信号的强度，进一步提高整体方案的灵敏度。
本发明建立的TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法的特异性试验表明仅对单增李斯特菌的检测结果为阳性；灵敏度试验表明最低检测细菌浓度为100CFU/mL。，本发明操作简便，通过荧光信号的积累实现对整个PCR过程进行监测，通过扩增曲线可直观的进行定性判定，无须电泳等后续步骤；快速，扩增时间不超过50min；高通量，一次(管)可检测三个毒力基因，可显著节约检测成本；本发明可利用Ct值来对未知模板进行定量的分析，可以很好地满足单增李斯特菌的快速检测和鉴定及三个毒力基因的携带情况分析。
本发明适用于大量样本的单增李斯特菌毒力基因分布情况的快速检测，提供分析单增李斯特菌毒力强弱的参考依据，可结合血清学家系分型和MLST分子分型数据，为单增李斯特菌的流行病学溯源提供极大方便，对控制单增李斯特菌引发的疾病的传播和治疗有积极意义。
附图说明
图1是TaqMan-MGB三重实时荧光PCR检测的特异性结果示意图。
图2是TaqMan-MGB三重实时荧光PCR检测的灵敏度结果示意图。
图3是TaqMan-MGB三重实时荧光PCR检测的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的生物材料、试剂原料为常规市购或商业途径获得的生物材料和试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1：建立单增李斯特菌三重实时荧光PCR检测体系
1.设计引物和探针：
通过对单增李斯特菌的携带毒力基因的针对性分析，选择三个重要的毒力基因：hlyA、inlA和plcB，然后根据GenBank上公布的单增李斯特菌hlyA、inlA和plcB基因序列，进行比对(用DNAStar)和分析，在序列的保守区域采用PrimerExpress3.0设计得到具有以下序列的引物：
SEQIDNO.1：hlyA-F：5’-CCTCGGAGACTTACGAGATATTTTG-3’。
SEQIDNO.2：hlyA-R：5’-GCAATGGGAACTCCTGGTGTT-3’。
SEQIDNO.3：inlA-F：5’-TAACAGACACGGTCTCGCAAA-3’。
SEQIDNO.4：inlA-R：5’-TCCCTAATCTATCCGCCTGAAG-3’。
SEQIDNO.5：plcB-F：5’-CCAGCAGCTCCGCATGA-3’。
SEQIDNO.6：plcB-R：5’-TCCGCGGACCAACTAAGTTTA-3’。
设计MGB探针，其序列为：
SEQIDNO.7：
hlyA-MGB-probe：5’-FAM-AGGTGCTACTTTTAACC-MGB-3’
SEQIDNO.8：
inlA-MGB-probe：5’-VIC-ATCTAGACCAAGTTACAAC-MGB-3’
SEQIDNO.9：
plcB-MGB-probe：5’-NED-ATCGACAGCAAATTA-MGB-3’
所述引物和探针也可以采用本领域常规方法合成。本实施例应用的引物和探针均委托英潍捷基公司合成。
2.本实施例基于上述引物和探针，建立一种单增李斯特菌的三重实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
S1.吸取菌液，提取DNA，得反应的DNA模板；
S2.采用本发明设计的引物和探针，进行三重实时荧光PCR扩增，对单增李斯特菌进行定性和/或定量检测；
其中，步骤S2所述三重实时荧光PCR检测的反应体系为30μL：PremixExTaqTM(2×)15μL，hlyA、plcB引物探针(20μM)分别为0.5μL，inlA引物探针(20μM)分别为0.6μL，ROX0.3μL，去离子水8.2μL，步骤S1所述DNA模板为2μL；
步骤S2所述三重实时荧光PCR检测的反应程序为：Stage1：预变性95℃30s；Stage2：95℃5s，58℃34s，40个循环，并于FAM、VIC、NED三个通道收集荧光信号；
步骤S3所述定性检测的方法为：待测基因出现扩增曲线，且Ct值<36，则判断为阳性，如果36<Ct<40，判断为可疑，可加大模板量重复实验，如果有典型扩增曲线，判为阳性，否则为阴性，无Ct值或Ct等于40为阴性；
步骤S3所述定量检测的方法为：分别采用1×107CFU/mL、1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL、1×102CFU/mL6个稀释度的单增李斯特菌菌液1mL按步骤S1提取基因组DNA，并按步骤S2进行三重实时荧光定量PCR扩增，以Y轴为Ct值，X轴为log10(CFU)分别绘制hlyA、inlA和plcB标准曲线，根据三条标准曲线的公式代入待测样品扩增得到的Ct值，即可计算出样品中单增李斯特菌的含量。
单增李斯特菌多重实时荧光定量PCR扩增的标准曲线建立方法为：采用本发明建立的TaqMan-MGB三重实时荧光PCR检测方法，采用1×107CFU/mL、1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL、1×102CFU/mL6个浓度的单增李斯特菌1mL提取DNA进行三重实时荧光定量PCR实验，分别绘制hlyA、inlA和plcB标准曲线，见附图1所示。得到标准曲线的方程分别为：hlyA:y＝-3.1798x+46.962、inlA:y＝-3.1114x+47.312和plcB:y＝-3.0648x+45.814；标准曲线的相关系数分别为0.99、0.99和0.98，扩增效率分别为106％、112％和110％，表明检测体系的三个基因扩增效率和线性相关系数良好，可以满足三重实时荧光定量PCR检测的要求。
单增李斯特菌的定量检测和计算方法为：根据样品荧光PCR得到的Ct值，根据hlyA、inlA和plcB标准曲线方程：hlyA:y＝-3.1798x+46.962、inlA:y＝-3.1114x+47.312和plcB:y＝-3.0648x+45.814；y为hlyA、inla、plcB中任一种基因检出的Ct值，代入相应的方程中，可以计算出单增李斯特菌菌液的浓度log10(CFU)值，从而可计算出1mL菌液中单增李斯特菌的含量，实现单增李斯特菌的定量检测。
步骤S1所述菌液的获得方法是将菌株用脑心浸萃液增菌培养所得，培养条件为：在培养温度为36℃条件下培养24h，本实施例所述菌株购置于陆桥生物公司。
步骤S1提取DNA具体方法为：取1mL菌液在12000r/min条件下离心处理去上清，采用商品化细菌基因组DNA提取试剂盒(promega公司WizardGenomicDNAPurificationKit)提取DNA作为反应的模板。
本发明实施例所述实时荧光PCR检测使用的仪器为荧光定量PCR仪ABI7500。
实施例2：本发明方法的特异性、灵敏度试验和重复性试验
(1)检测特异性分析
本发明采用大量菌株，分别用本发明建立的检测方法进行TaqMan-MGB三重实时荧光PCR扩增，观察实验菌株有典型扩增曲线产生。表1中列举了部分本实施例采用的菌株，表1中所述的菌株均购置于陆桥生物公司。实验发现，有且只有单增李斯特菌有指数扩增，其他菌均无典型扩增曲线产生，表明本发明建立的针对单增李斯特菌毒力基因hlyA、inlA、plcB检测的TaqMan-MGB三重实时荧光PCR方法特异性良好，实验结果见附图2所示。附图2中，1为单增李斯特菌；2～9分别为：英诺克李斯特菌、伊氏李斯特菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、非01霍乱弧菌、副溶血性弧菌、弗氏柠檬酸杆菌。
表1实验用部分菌株列表
序号 菌株名称 编号
1 单增李斯特氏菌 ATCC15313
2 英诺克李斯特菌 ATCC33090
3 伊氏李斯特菌 ATCC19119
4 表皮葡萄球菌 CMCC26069
5 金黄色葡萄球菌 ATCC6538
6 鼠伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50115
7 非01霍乱弧菌 VB0
8 副溶血性弧菌 ATCC17802
9 弗氏柠檬酸杆菌 ATCC43864
(2)检测灵敏度分析
单增李斯特菌初始菌液浓度1×107CFU/mL经10倍梯度稀释成1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL、1×102CFU/mL和1×101CFU/mL菌液提取DNA进行三重实时荧光PCR检测。实验结果，本发明最低检测细菌浓度为100CFU/mL，扩增结果见附图3所示。附图3中，1～7分别为1～7分别为：1×107CFU/mL，1×106CFU/mL，1×105CFU/mL，1×104CFU/mL，1×103CFU/mL，1×102CFU/mL，1×101CFU/mL的单增李斯特菌。
(3)三重实时荧光定量PCR可重复性试验
选取1×107CFU/mL,1×106CFU/mL，1×105CFU/mL，1×104CFU/mL，1×103CFU/mL和1×102CFU/mL的单增李斯特菌菌液提取模板进行三重实时荧光PCR检测，每个稀释度做3个平行，结果表明三种毒力基因的Ct值变异系数均在2％以下，说明本文建立的三重实时荧光PCR检测方法重复性好，稳定可靠。TaqMan-MGB三重实时荧光PCR重复性试验结果见表2所示。
表2三重实时荧光PCR检测单增李斯特菌的可重复性测试
实施例3：不同来源的单增李斯特菌分离株的三重实时荧光PCR检测及与MLST分型聚类、血清学谱系分类信息
1～72号共72株单增李斯特菌根据MLST分型并获得相应的STs，并聚类分成三个群组，与血清型谱系lineageI、lineageII和lineageIII相一致。序号1～42共42株单增李斯特菌相对应于血清型分类的lineageII，hlyA、inlA、plcB三个基因均为阳性；序号43～72共30株单增李斯特菌属于相对应于血清型分类的lineageI，)，其hlyA、plcB均为阳性，但inlA基因阴性率较高(共20株，占67％)。说明三个主要的毒力基因的检出情况可为单增李斯特菌分离菌株的毒力强弱分析及流行病学溯源提供一定的分析依据。见表3所示。
表372株单增李斯特菌毒力基因三重实时荧光PCR毒力基因检测结果及分布
*n1～n24为新发现的STs，尚待提交MLST(多位点序列分型，Multilocussequencetyping，MLST)网站后分配相应的编号。
SEQUENCELISTING
<110>
<120>基于单增李斯特菌毒力基因的三重实时荧光定量PCR检测用引物、MGB探针及
检测方法
<130>
<160>9
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>引物hlyA-F人工序列
<400>1
cctcggagacttacgagatattttg25
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>引物hlyA-R人工序列
<400>2
gcaatgggaactcctggtgtt21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>引物inlA-F人工序列
<400>3
taacagacacggtctcgcaaa21
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>引物inlA-R人工序列
<400>4
tccctaatctatccgcctgaag22
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>引物plcB-F人工序列
<400>5
ccagcagctccgcatga17
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>引物plcB-R人工序列
<400>6
tccgcggaccaactaagttta21
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>探针hlyA-MGB-probe人工序列
<400>7
aggtgctacttttaacc17
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>探针inlA-MGB-probe人工序列
<400>8
atctagaccaagttacaac19
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>探针plcB-MGB-probe人工序列
<400>9
atcgacagcaaatta15

Claims (9)

1.一组基于单增李斯特菌的特异性毒力基因的三重实时荧光定性和/或定量PCR检测用的特异性引物，其特征在于，所述特异性毒力基因为hlyA、inlA和plcB，所述的引物的序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。
2.一种单增李斯特菌的TaqMan-MGB三重实时荧光PCR检测用MGB探针，其特征在于，所述探针的序列分别如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示，探针5’端所述荧光报告基团分别为FAM、VIC和NED，3’端基团为MGB。
3.一种单增李斯特菌的TaqMan-MGB三重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.吸取菌液，提取DNA，得反应的DNA模板；
S2.采用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针，进行三重实时荧光PCR扩增，对单增李斯特菌进行定性和/或定量检测；
其中，步骤S2所述三重实时荧光PCR检测的扩增体系中引物和探针配比优选为：
hlyA:SEQIDNO.1:SEQIDNO.2:SEQIDNO.7＝500nM:500nM:500nM；
inlA:SEQIDNO.3:SEQIDNO.4:SEQIDNO.8＝600nM:600nM:600nM；
plcB:SEQIDNO.5:SEQIDNO.6:SEQIDNO.9＝500nM:500nM:500nM；
步骤S2所述三重实时荧光PCR检测的反应程序为：Stage1：预变性95℃30s；Stage2：95℃5s，58℃34s，40个循环，并于FAM、VIC、NED三个通道收集荧光信号；
步骤S3所述定性检测的方法为：待测基因出现扩增曲线，且Ct值<36，则判断为阳性，如果36<Ct<40，判断为可疑，可加大模板量重复实验，如果有典型扩增曲线，判为阳性，否则为阴性，无Ct值或Ct等于40为阴性；
步骤S3所述定量检测的方法为：采用不同稀释度的单增李斯特菌菌液1mL按步骤S1提取基因组DNA，并按步骤S2进行三重实时荧光定量PCR扩增，以Y轴为Ct值，X轴为log10(CFU)分别绘制hlyA、inlA和plcB标准曲线，根据三条标准曲线的公式代入待测样品扩增得到的Ct值，即可计算出样品中单增李斯特菌的含量。
4.根据权利要求3所述单增李斯特菌的TaqMan-MGB三重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤S1所述菌液的获得方法是将菌株用脑心浸萃液增菌培养所得。
5.根据权利要求4所述单增李斯特菌的TaqMan-MGB三重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述培养的条件为：在培养温度为36℃条件下培养24h。
6.根据权利要求3所述单增李斯特菌的TaqMan-MGB三重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤S2所述三重实时荧光PCR检测的反应体系为30μL：PremixExTaqTM(2×)15μL，hlyA、plcB引物探针(20μM)分别为0.5μL，inlA引物探针(20μM)分别为0.6μ，LROX0.3μL，去离子水7.9μL，步骤S1所述DNA模板为2μL。
7.根据权利要求3所述单增李斯特菌的TaqMan-MGB三重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤S1提取DNA具体方法为：取1mL菌液在12000r/min条件下离心处理去上清，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA作为反应的模板。
8.根据权利要求3所述单增李斯特菌的TaqMan-MGB三重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤S3所述的稀释度为6个：1×107CFU/mL、1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL、1×102CFU/mL。
9.权利要求3至8任一项所述单增李斯特菌的TaqMan-MGB三重实时荧光定量PCR检测方法的应用，其特征在于，应用于单增李斯特菌的快速批量检测中或应用于对单增李斯特菌株毒力基因hlyA、inlA和plcB的携带情况进行检测方面以及应用于检测分析单增李斯特菌毒力强弱及单增李斯特菌分子溯源方面。
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