CN112795673B

CN112795673B - 一种食品中克罗诺杆菌属的crispr检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN112795673B
Application number: CN202110181076.9A
Authority: CN
Inventors: 张清平; 张懿翔; 刘洋; 王亮; 张奕南; 曲勤凤; 杨捷琳; 赵磊; 诸佩菊; 王越; 赵国屏
Original assignee: Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research
Current assignee: Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research
Priority date: 2021-02-09
Filing date: 2021-02-09
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2041-02-09
Also published as: CN112795673A

Abstract

本发明公开了一种食品中克罗诺杆菌属的CRISPR检测方法，包括：步骤一、以待测样品的DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；用于PCR扩增的反应体系中含有扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对；步骤二、将PCR扩增产物加入CRISPR反应体系进行CRISPR反应，CRISPR反应体系包括Cas12b蛋白、Cas12b‑tracrRNA、crRNA和探针；步骤三、检测CRISPR反应荧光强度变化，根据曲线判读待检测样品中是否存在克罗诺杆菌属核酸。本发明还公开了一种用于检测食品中克罗诺杆菌属的CRISPR试剂盒及其应用。采用本发明的CRISPR检测方法，可以提高克罗诺杆菌属检测特异性。

Description

一种食品中克罗诺杆菌属的CRISPR检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术CRISPR技术领域，具体地说，是关于一种食品中克罗诺杆菌属的CRISPR检测方法及其试剂盒。

背景技术

食品安全是关乎人民生命健康和社会和谐的重大战略问题。婴幼儿配方食品是部分婴幼儿的唯一食物来源，对婴幼儿健康及生命安全有重要影响。克罗诺杆菌为革兰氏阴性菌，是一种普遍存在于大自然中的条件致病菌。一旦感染该菌,会对婴幼儿的健康造成严重危害,可引发坏死性小肠结肠炎、菌血症和新生儿脑膜炎等疾病,甚至可能留下严重的神经系统后遗症,死亡率高达50％。因此，克罗诺杆菌的生产过程中控制是婴儿配方食品安全控制的关键环节，快速精确检测是质量保证的重要手段。

目前，食品克罗诺杆菌属检测方法有GB 4789.40-2016、SN/T1632.2-2013、SN/T1632.3-2013、DBS13/003-2015等，主要是常规的培养法、荧光PCR法等检测方法。这些技术在灵敏度、特异性、简便性、速度和价格上各有优劣，但仍有容易污染、需要大型扩增设备等缺陷。

传统检测方法如GB 4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》能得到食品样本中克罗诺杆菌的定性和定量测定结果，但都需经富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化鉴定等过程,操作复杂、耗时费力,检测过程至少需要4～7d，而且灵敏度低，容易发生错检和漏检,无法对人工难以培养的致病菌进行检测。为了尽可能从样品中筛选得到克罗诺杆菌，目前国标对于该菌的检测需要称取100g样品进行测定。因此，国标中的传统检测方法已无法满足目前婴儿配方食品中致病菌的快速检测要求。建立一种能够快速、现场检出婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的检测方法具有重要意义。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是大多数细菌及古细菌中抵御病毒入侵的一种获得性免疫方式。CRISPR/Cas系统的发现可以追溯到1987年，Nakata等首次在大肠杆菌的基因组中发现了串联的间隔重复序列，但在当时并未引起学术界的关注。2002年，Jansen等将这一奇特的重复间隔序列正式命名为串联间隔短回文重复序列(CRISPR)。近几年来，CRISPR技术在基因组编辑领域表现出了巨大的应用价值。2017年问世的CRISPR的检测技术被誉为“下一代的分子检测技术”，能做到“快速、灵敏、高特异、简便、低价”的特性，该技术可广泛应用于病原菌检测、癌症突变检测、单核苷酸多态性检测等领域，有巨大的应用潜力。

发明内容

本发明拟基于CRISPR-Cas12蛋白，利用团队原创建立的CRISPR-Cas12检测技术来建立重要食源性致病菌的分子检测方法，采用该CRISPR检测方法，可以对婴幼儿配方食品中致病菌克罗诺杆菌属进行快速定性筛选检测，满足企业在线检测和终产品快速品质检测需要，对提升我国婴幼儿配方食品企业质量控制能力和民众关切的婴幼儿食品安全水平有重要意义。为此，本发明的第一个目的是提供一种食品中克罗诺杆菌属的CRISPR检测方法。本发明的第二个目的是提供一种用于检测食品中克罗诺杆菌属的CRISPR试剂盒。本发明的第三个目的是提供一种用于检测食品中克罗诺杆菌属的CRISPR试剂盒在检测食品中是否含有克罗诺杆菌属中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种食品中克罗诺杆菌属的CRISPR检测方法，包括如下步骤：

步骤一、以待测样品的DNA为模板，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对；

步骤二、将步骤一的PCR扩增产物加入CRISPR反应体系进行CRISPR反应，CRISPR反应体系包括Cas12b蛋白、Cas12b-tracrRNA、crRNA和探针；

步骤三、检测CRISPR反应荧光强度变化，根据曲线判读待检测样品中是否存在克罗诺杆菌属核酸。

根据本发明，扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

根据本发明，PCR扩增的反应体系为25μL，包括:PCR反应混合液12.5μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，余量为双蒸水。

根据本发明，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃20s，60℃20s，72℃15s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

根据本发明，CRISPR反应体系为20μL，包括：10×NEBuffer 3.1 2μL，5μM的Cas12b蛋白1μL，40U/μL的RNA酶抑制剂0.25μL，10μM的crRNA 1μL，10μM的tracrRNA 1μL和10μM探针1μL，PCR扩增产物2μL，余量为灭菌水。

进一步的，所述Cas12b-tracrRNA、crRNA和探针的序列分别如SEQ ID NO.9、SEQID NO.10、SEQ ID NO.14所示。

作为本发明的第二个方面，一种用于检测食品中克罗诺杆菌属的CRISPR试剂盒，包括扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对、Cas12b-tracrRNA、crRNA、探针和Cas12b蛋白。

进一步的，扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，所述Cas12b-tracrRNA、crRNA、探针和Cas12b蛋白的序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14所示。

作为本发明的第三个方面，一种用于检测食品中克罗诺杆菌属的CRISPR试剂盒在检测食品中是否含有克罗诺杆菌属中的应用。

本发明的食品中克罗诺杆菌属的CRISPR检测方法，其有益效果是：

1、可以提高克罗诺杆菌属检测特异性，PCR扩增后，再结合CRISPR基于特征序列的高特异性检测，极大地增强了克罗诺杆菌属分子检测方法的特异性。

2、操作时间短，PCR扩增后无需电泳，可以节省制胶时间和跑胶时间。

3、荧光仪直接读取荧光信号及数据，CRISPR检测过程在15min以内完成。

4、本发明是CRISPR检测技术在国际食品安全领域方面的创新性技术开拓和应用探索，是首次将该技术在食品安全领域进行的创新性研究及应用，将对我国食品安全检测能力提升产生深远影响，提高我国在食品安全检测领域的国际话语权，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为primer3-1的特异性验证。

图2为primer4-1的特异性验证。

图3为primer6-1的特异性验证。

图4为primer7-1的特异性验证。

图5为实施例2的CRISPR检测克罗诺杆菌属引物筛选与特异性验证。

图6为实施例3的CRISPR方法针对克罗诺杆菌属靶标的检测灵敏度。

图7为实施例4的CRISPR方法对人工污染样品的检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。

本发明的实施例的检测过程：乳粉中克罗诺杆菌属通过增菌富集，然后取增菌液提取DNA，以克罗诺杆菌属基因组为阳性对照，以其它细菌DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照，使用特异性引物进行PCR扩增，然后进行CRISPR反应并检测荧光。参考方法选用GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属检验》。主要开展包容性和排他性、相对准确度、灵敏度和特异性参数测试评价。

本发明的Cas12b蛋白购自Tolo Biotech.公司。

实施例1

(1)引物和探针的设计

本实施例通过基因组比较和候选靶点选择，以16S rRNA基因保守序列、克罗诺杆菌菌株特异性关键基因序列、编码致病性相关基因序列及其他文献报导可区分菌株的特异性序列候选区域，针对每个区域设计2-3对扩增引物和向导RNA靶向序列进行生物信息学测试，挑选效率最高和特异性最好的组合，通过NCBI在线工具进行序列分析和比对，利用Prime Express软件V3.0(ABI,Foster City,CA,USA)设计出4对引物和向导RNA组合，经过特异性及灵敏度测试，结果见图1-图4。最终筛选出一对primer3和crRNA-pcr3-1，序列见表1。CRISPR反应的报告探针为12个随机序列的单链DNA序列，在探针的5’端标记FAM，3’端标记Eclipse。所有引物/探针均由上海生工生物有限公司合成，并采用CRISPR检测方法对设计合成的引物探针进行初步筛选，进一步验证上述引物、tracrRNA和crRNA的有效性和特异性。所有RNA引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 引物和探针序列

(2)基因组DNA提取与核酸蛋白分析仪测定

利用BPW缓冲蛋白胨水对克罗诺杆菌属的过夜培养菌悬液进行10倍梯度稀释。取各稀释度菌液2mL采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，提取步骤按照试剂盒说明书进行，最终将核酸溶解在50μL TE缓冲液中。对提取的核酸用超微量分光光度计进行浓度和纯度的测定，确保提取核酸的A260/A280在1.8～2.0之间。

(3)PCR检测

PCR扩增的反应体系和反应条件分别见表2和表3。

表2 PCR反应体系

试剂	用量
		PCR反应混合液	12.5μL
正向引物(10μmol/L)	1μL
		反向引物(10μmol/L)	1μL
DNA模板(5ng/μL)	1μL
		灭菌ddH<sub>2</sub>O	补足至25μL

表3 反应程序

(4)CRISPR反应

采用CRISPR方法检测PCR扩增产物荧光。于ABI7500荧光PCR仪(美国，ABI公司)上进行荧光检测，设置48℃程序，每1分钟检测一次FAM荧光，持续15min。反应体系见表4。

表4 CRISPR反应体系

试剂	用量
		NEBuffer 3.1(10×)	2μL
Cas12b蛋白(5μM)	1μL
		crRNA-pcr3-1(10μM)	1μL
Cas12b-tracrRNA(10μM)	1μL
		探针(10μM)	1μL
RNA酶抑制剂(40U/μL)	0.25μL
		PCR产物	2μL
灭菌ddH<sub>2</sub>O	补足至20μL

(5)本发明的平板计数方法

对10倍梯度稀释的纯菌液进行平板计数，吸取1mL各稀释度菌悬液分别加于2个无菌平皿内。及时将15～20mL冷却至46℃的营养琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，36℃倒置培养24h±2h。选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，每个稀释度菌落数应取两个平板计数结果的平均数。

(6)本发明的CRISPR结果判定

计算公式：判定值N＝(10分钟样品荧光值/10分钟对照荧光值)/(2分钟样品荧光值/2分钟对照荧光值)，对照荧光值为水的荧光值。

根据公式计算统计阳性样品的判定值N得出：

N值≥1.40时，则判定样品CRISPR检测阳性；

N值≤1.20时，则判定样品CRISPR检测阴性；

N值在1.2-1.4之间，则重复实验一次，重复实验的比值＞1.20，则判定为CRISPR检测阳性；≤1.20，则判定为CRISPR检测阴性。

实施例2特异性、包容性和排他性检测

(1)特异性

首先利用PCR对克罗诺杆菌属(ATCC25944)基因组DNA进行检测，发现表1的所有引物(primer3-F/R、primer4-F/R、primer6-F/R和primer7-F/R)和探针均能有效扩增出靶基因。为保证扩增反应的特异性，对表5、表6中所列克罗诺杆菌属标准菌株以及其他常见弧菌和食源性致病菌DNA进行检测。结果发现只有primer3-F/R这对引物所有克罗诺杆菌属出现阳性扩增信号，而其他常见弧菌及食源性致病菌检测均没有明显扩增信号(见图1-图5)。

结果表明：primer3-F/R引物探针组具有良好的特异性。且随反应循环数增加荧光强度也在增加，表明CRISPR探针可与扩增产物特异性匹配。

(2)包容性

包容性是指确定某一检测方法从众多菌中检测到目标菌的能力。采用8株克罗诺杆菌属参比菌株和31株实验室分离株，用克罗诺杆菌属CRISPR法进行检测，结果均为阳性，表明克罗诺杆菌属CRISPR法的包容性良好。具体结果见表5。

表5 包容性实验结果

(3)排他性

排他性是指某一检测方法对可能引起交叉反应的相关非目标菌株的抗干扰能力。选择30株非克罗诺杆菌属的纯化标准菌株，用CRISPR方法进行测试，结果如表5所示。30株非克罗诺杆菌属的纯化标准菌株的CRISPR检测结果均为阴性，表明该方法在排他性上表现良好。

表6 排他性实验结果

实施例3纯菌液检测限

10倍梯度稀释克罗诺杆菌属(ATCC 25944)纯菌液，分别吸取2mL提取DNA进行检测，结果发现可稳定检测到10³(图6，表7)。

表7 CRISPR方法针对克罗诺杆菌属靶标的检测灵敏度

菌浓度	重复1	重复2	重复3	重复4	重复5
						10<sup>7</sup>	+	+	+	+	+
10<sup>6</sup>	+	+	+	+	+
						10<sup>5</sup>	+	+	+	+	+
10<sup>4</sup>	+	+	+	+	+
						10<sup>3</sup>	+	+	+	+	+

实施例4人工污染样品的检测

选择经传统方法和CRISPR方法验证的克罗诺杆菌属的奶粉样品作为添加基质。

取克罗诺杆菌属(ATCC 25944)的过夜培养菌悬液分别进行10倍梯度稀释并平板计数。根据添加菌液的平板计数结果，估计污染样品中克罗诺杆菌属含量为<10～10⁴CFU/100g。

同时取10～10⁴稀释度菌液各1mL分别添加到盛有100g奶粉样品的均质袋中，各添加浓度分别设5个样品重复，另取1份100g奶粉样品不添加菌液作为空白对照，上述样品中加入900mLBPW缓冲蛋白胨水，用拍击式均质器拍击2min，制成系列含有不同浓度的人工污染样品。本试验将克罗诺杆菌的增菌富集时间缩短至12h。

经过12h的增菌，取各样品匀液2mL分别利用试剂盒法提取细菌基因组DNA，最终将核酸溶解在50μL TE缓冲液中，进行CRISPR检测。结果见图7和表8。

表8 CRISPR对人工污染样品的检测结果

结果显示：4个不同污染水平的奶粉样品均呈阳性扩增。检出限达到<10CFU/100g。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海市质量监督检验技术研究院

<120> 一种食品中克罗诺杆菌属的CRISPR检测方法及其试剂盒

<130> 211022

<141> 2021-02-09

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacacgcttt ctaacgttga taagg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttttgtcgt aagagcagag gtgag 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccagagcca cacaaattgc tgtac 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcatctcaa acgacgcata atcag 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgactttttt gggctaccga cacc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgacagagtg ggttagtggt tcc 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgtcttgtac ggttgctaat gc 22

<210> 9

<211> 78

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gucuagagga cagaauuuuu caacgggugu gccaauggcc acuuuccagg uggcaaagcc 60

cguugagcuu cucaaaaa 78

<210> 10

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgagcgaucu gagaaguggc acauaaggcc aauaauaaug 40

<210> 11

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgagcgaucu gagaaguggc accuguacgu cguaacgaag 40

<210> 12

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgagcgaucu gagaaguggc acggcuaccg acaccggcgu 40

<210> 13

<211> 40

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgagcgaucu gagaaguggc accauaaauc agaucugggc 40

<210> 14

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

nnnnnnnnnn nn 12

Claims

1.一种食品中克罗诺杆菌属的CRISPR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤三、检测CRISPR反应荧光强度变化，根据曲线判读待检测样品中是否存在克罗诺杆菌属核酸；

扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；

所述Cas12b-tracrRNA、crRNA和探针的序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQID NO.14所示。

2.如权利要求1所述的CRISPR检测方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为25μL，包括:PCR反应混合液12.5μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，余量为双蒸水。

3.如权利要求1所述的CRISPR检测方法，其特征在于，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃20s，60℃20s，72℃15s，35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

4.如权利要求1所述的CRISPR检测方法，其特征在于，CRISPR反应体系为20μL，包括：10×NEBuffer 3.1 2μL，5μM的Cas12b蛋白1μL，40U/μL的RNA酶抑制剂0.25μL，10μM的crRNA 1μL，10μM的Cas12b-tracrRNA 1μL和10μM探针1μL，PCR扩增产物2μL，余量为灭菌水。

5.一种用于检测食品中克罗诺杆菌属的CRISPR试剂盒，其特征在于，包括扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对、Cas12b-tracrRNA、crRNA、探针和Cas12b蛋白；

扩增克罗诺杆菌属成分的特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，所述Cas12b-tracrRNA、crRNA、探针和Cas12b蛋白的序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.14所示。

6.一种如权利要求5所述的用于检测食品中克罗诺杆菌属的CRISPR试剂盒在检测食品中是否含有克罗诺杆菌属中的应用。