DE69009744T2

DE69009744T2 - Sonden, ausrüstungen und verfahren zum nachweis und zur differenzierung von mycobakterien.

Info

Publication number: DE69009744T2
Application number: DE69009744T
Authority: DE
Inventors: D Catty; Jeremy Dale; R A Mcadam; Zainul Zainuddin
Original assignee: Cogent Ltd
Current assignee: Cogent Ltd
Priority date: 1989-02-22
Filing date: 1990-02-22
Publication date: 1995-01-05
Anticipated expiration: 2010-02-23
Also published as: EP0460041B2; GB9118275D0; DE69009744D1; JP3247371B2; WO1990010085A1; DE69009744T3; ES2057539T5; EP0460041B1; AU5162790A; JP2001136989A; GB2248298A; EP0460041A1; ES2057539T3; AU623236B2; GB2248298B

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Gensonden, Sets und Verfahren zum Nachweis und Differenzierung von Mycobakterien. Im speziellen betrifft die vorliegende Erfindung Gensonden, Sets und Verfahren zur Diagnose von Tuberkulose und/oder für epidemiologische Untersuchungsinstrumente zur Untersuchung des Fortschreitens von durch Mitglieder des M.tuberculosis-Komplexes verursachten Infektionen.

Stand der Technik

In einigen Industriestaaten einschließlich Großbritannien ist Tuberkulose zahlenmäßig eine der häufigsten anzeigepflichtigen Infektionskrankheiten, doch der Pathogenitätsmechanismus von M.tuberculosis wird trotzdem nur schlecht verstanden. In den Entwicklungsländern, d.h. in der "Dritten Welt", ist diese Krankeit ein endemisches Gesundheitsproblem von ungeheuren Ausmaßen, deren Therapie lange Behandlungszeiten mit Antibiotika-Kombinationen vorsieht. Es herrscht Einigkeit darüber, daß eines der Hauptprobleme bei der erfolgreichen Bekämpfung der Tuberkulose der Mangel eines einfachen, zuverlässigen und robusten serodiagnostischen oder Gensonden-Assays ist. Diese sind notwendig, da derzeit angewendete diagnostische Tests, selbst jene, die in den technisch fortschrittlichen reichen Ländern zur Verfügung stehen, nur geringfügig spezifisch und unempfindlich sind, da sie auf einer Kombination relativ ungenauer Symptomatologie und Radiographie und Färbung von säurebeständigen Bazillen und Bakterienkulturen beruhen. Die ersten zwei sind äußerst variable Merkmale, die zwei letzteren notorisch unzuverlässig. Insbesondere sind bei den derzeit zur Verfügung stehenden Tests mehrere Wochen erforderlich, bevor ein definitives Ergebnis vorliegt, und außerdem ist der Nachweis kleiner Mengen an M.tuberculosis Bakterien in stark kontaminierten Proben oft schwierig. Die spezifische Identifizierung von Mycobakterien ist ebenfalls schwierig, insbesondere die Differenzierung zwischen den Mitgliedern des M.tuberculosis Komplexes: M.tuberculosis selbst, der Rinderstämme M.bovis, M.africanum, M.microti und der Impfstoffstamm BCG (der Krankheiten bei immunologisch supressiven Individuen hervorrufen kann). Es wurden viele Versuche unternommen, neue Labortests für Tuberkulose zu entwickeln, doch es mangelte ihnen allen an Spezifizität und/oder Sensitivität. Gensonden für spezifische DNA-Sequenzen des Organismus können kleine Mengen an mycobakteriellem Genom zuverlässig durch Verfahren nachweisen, die keinen verlängerten Kulturschritt oder eine aufwendige Untersuchung der gefärbten Sputumabstriche durch geschultes Personal erfordern. Gensondenanalyse bietet ein sensitives Verfahren zum raschen Nachweis von geringen Mengen an spezifischen Bakterien in Gegenwart anderer Organismen.
Durch Mycobakterien verursachte Infektionen stellen nicht nur ein bedeutsames Gesundheitsproblem beim Menschen, sondern auch bei Rindern, Wild, Schafen und Dachsen dar; die hier vorgesehenen Sonden eignen sich auch für diagnostische/epidemiologische Untersuchungsinstrumente zur Verwendung in bezug auf diese Spezien.
Gensonden zum Identifizieren von Stämmen des M.tuberculosis Komplexes sind im Handel erhältlich, hängen aber vom Nachweis ribosomaler RNA ab und erfordern es, daß Bakterien zuerst kultiviert werden. Obwohl diese Gensonden fähig sind, den M.tuberculosis Komplex zu identifizieren, eignen sie sich nicht zum Nachweis von Bakterien in einer Sputumprobe. Der Kultivierungsschritt erhöht auch die Prüfzeit, was nicht von Vorteil ist.
Hier ist die Isolierung und das Klonen eines Fragments der M.tuberculosis DNA beschrieben, das ein sich wiederholendes Element enthält, das für den M.tuberculosis Komplex spezifisch ist. Dieses Fragment hybridisiert mit multiplen polymorphen Restriktionsfragmenten in verschiedenen Isolaten von M.tuberculosis und ist daher fähig, für Untersuchungen der Übertragung von Tuberkulose den Fingerabdruck von Isolaten zu nehmen. Nur einige wenige Hybridisierungsbänder werden in den Digesten von M.bovis oder BCG DNA nachgewiesen, und die Sonde hat daher die einzigartige Fähigkeit, rasch zwischen diesen verschiedenen Mitgliedern des M.tuberculosis Komplexes zu unterscheiden.
Verschiedene sich wiederholende Elemente wurden von mycobakteriellen Spezien isoliert, einschließlich eines von M.leprae (Clark-Curtiss, J.E. & Walsh, G.P. (1989) "Journal of Bacteriology" 171, 4844-4851; Clark-Curtiss, J.E. & Docherty, M.A. (1989) "Journal of Infectious Diseases" 159, 7-15; und Grosskinsky, C.M.Jacobs, W.R. Clark-Curtiss, J.E. & Bloom, B.R. (1989) "Infection and Immunity" 57, 1535-1541) und die Einfügungssequenz IS900 von M.paratuberculosis (Green, E.P.Tizard, M.L.V. Moss, M.T. Thompson, J,, Winterbourne, D.J., McFadden, J.J. & Hermon-Taylor, J. (1989) "Nucleic Acids Research" 17, 9063-9072). Diese sich wiederholenden Elemente sind jedoch speziesspezifisch und scheinen ein konstantes Hybridisierungsmuster mit Stämmen aus verschiedenen Quellen zu ergeben.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt die Charakterisierung und Sequenzanalyse eines sich wiederholenden Elements, die es als ein Mitglied der IS3 Familie der Einfügungssequenzen identifiziert, von denen zahlreiche Bestandteile bereits aus Spezien der Enterobacteriaceae charakterisiert wurden.
Es stellte sich nun heraus, daß DNA Sonden mit potentiellen Anwendungen für die allgemeine Diagnose von Mycobacterien und für die spezifische Diagnose von Tuberkulose aus Desoxyribonukleotid-Sequenzen abgeleitet sein können, wobei die Sequenzen fähig sind, mit jenen Sequenzen zu hybridisieren, die in einem natürlich vorkommenden Plasmid vorhanden sind.
Als Teil einer Untersuchung der antibiotischen Resistenz wurde das Vorhandensein von Plasmiden in M.tuberculosis durch Hybridisieren der gesamten DNA aus drei klinischen Isolaten mit DNA aus einem natürlich vorkommenden Plasmid erreicht, von dem bekannt ist, daß es in M.fortuitum vorhanden ist (A.Labidi, C.Dauguet, K.S. Goh & H.L. David, 1984. Plasmid profiles of Mycobacterium fortuitum complex isolates. Current Microbiology 11: 235-240). Plasmide sind bislang nicht in M.tuberculosis festgestellt worden, und man hoffte, daß sie durch Verwendung der M.fortuitum Plasmid DNA als Sonde entdeckt werden. überraschenderweise deckte dies nicht das Vorhandensein irgendwelcher Plasmide in M.tuberculosis auf, doch es zeigte sich, daß es M.tuberculosis-Chromosomen DNA-Fragmente gibt, die mit der Plasmid-DNA hybridisieren können. Weiters war in der Gesamt-DNA aus den drei mit den Restriktionsendonukleasen BamHI oder PvuII digerierten klinischen Isolaten die Größe der Hybridisierungsfragmente nicht die gleiche für jeden Stamm.
Gensonden zum Nachweis von mycobakterieller Infektion können variierende Spezifizitätsgrade aufweisen, wobei dies davon abhängt, wie einzigartig die Gensequenzen, die sie in einem bakteriellen Genom entdecken, im Vergleich zu einer bestimmten Familie, Klasse, Spezies oder Stamm sind. Sonden unterschiedlicher Spezifizitäten können sich je nach erforderlicher klinischer Analyse zur Verwendung eignen. Eine Sonde könnte ein Sequenzmuster nachweisen, das in vielen verschiedenen Spezien (z.B. M.tuberculosis und M.bovis) innerhalb einer bestimmten Klasse (z.B. Mycobakterium) festgestellt wird. In anderen Fällen können Gensonden für eine bestimmte Spezies und sogar für verschiedene Stämme dieser Spezies spezifisch sein.
Diese variierende Spezifizität von Gensonden ist von praktischem Nutzen. Als erstes Diagnoseverfahren ist es manchmal vorteilhafter, eine Sonde zu verwenden, die eine allgemeine mycobakterielle Infektion nachweist und dann im Bedarfsfall Feineinstellungssonden zu verwenden, um zu diagnostizieren, welche Mycobakterien-Spezien beteiligt sind.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt eine Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung mycobakterieller Infektion bereit, die mit genomischer M.tuberculosis DNA hybridisiert, die durch das Screenen einer genomischen M.tuberculosis-Sammlung mit DNA eines Plasmids von M.fortuitum erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung mycobakterieller Infektion bereit, die mit genomischer M.tuberculosis DNA und mit DNA eines M.fortuitum Plasmids hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung mycobakterieller Infektion bereit, welche die in vorliegender Fig.2 dargestellte Nukleotidsequenz oder ihre komplementäre Sequenz umfaßt oder damit hybridisiert, oder die eine Nukleotidsequenz umfaßt oder damit hybridisiert, die durch Hybridisierung mit der in vorliegender Fig.2 dargestellten Nukleotidsequenz aus einer Genomsammlung eines Organismus des M.tuberculosis Komplexes erhältlich ist, und die fähig ist, bakterielle Mitglieder des M.tuberculosis Komplexes entweder voneinander oder von anderen Bakterien, die nicht zum Komplex gehören, zu unterscheiden und zu charakterisieren.
Es ist auch eine Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung mycobakterieller Infektion vorgesehen, worin die Genomsammlung aus M.tuberculosis Stamm 50410 erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung mycobakterieller Infektion bereit, die einen Teil der oder die gesamte entweder in Fig.2 oder in Fig.4 der Zeichnungen gezeigte(n) Nukleotidsequenz oder ihre(r) komplementäre(n) Sequenz umfaßt oder damit hybridisiert.
Die Nukleotidsonde kann einen Teil der oder der gesamten Einfügungselement-Nukleotidsequenz umfassen oder damit hybridisieren, die im Genom von M.tuberculosis Stamm 50410 durch zwei umgekehrte Wiederholungssequenzen gebunden ist und die in Fig.2 der Zeichnungen identifizierte Nukleotidkodiersequenz enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung mycobakterieller Infektion bereit, die eine Flankierungssequenz von Nukleotiden umfaßt oder damit hybridisiert, die im Genom von M.tuberculosis-Stamm 50410 angrenzend an eine Einfügungselementnukleotidsequenz auftreten, die durch zwei umgekehrte Wiederholungssequenzen gebunden ist und die in Fig.2 der Zeichnungen identifizierte Nukleotidkodiersequenz enthält.
Die Nukleotidsonde kann z.B. einen Teil der oder die gesamte Flankierungssequenz von Nukleotiden umfassen oder damit hybridisieren, die stromabwärts vom 3'-Ende der Base 896 in Fig.2 der Zeichnungen auftritt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung mycobakterieller Infektion bereit, die einen Teil der oder die Gesamtheit einer Nukleotidsequenz mit in etwa 1,9 kb umfaßt oder damit hybridisiert, die im Genom von M.tuberculosis-Stamm 50140 unmittelbar stromabwärts vom 3'-Ende der in Fig.2 der Zeichnungen gezeigten Nukleotidsequenz auftritt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung mycobakterieller Infektion bereit, die einen Teil oder die Gesamtheit einer Nukleotidsequenz umfaßt oder stark damit hybridisiert, die im Genom von M.tuberculosis-Stamm 50410 auftritt und durch die in Fig.1 der Zeichnungen dargestellte Restriktionskarte charakterisiert ist.
Die erfindungsgemäße Nukleotidsonde kann zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung von mycobakterieller Infektion verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsonden können fähig sein, zwischen verschiedenen M.tuberculosis-Stämmen zu unterscheiden. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsonden können fähig sein, zwischen M.tuberculosis, M.bovis und BCG zu unterscheiden. Die Nukleotidsonden können keine signifikante Hybridisierung mit M.paratuberculosis, M.intracellulare, M.scrofulaceum, M.phlei, M.fortuitum, M.chelonei, M.kansasii, M.avium, M.malnioense, M.flavescens und M.gordonae zeigen.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsonden können zum Nachweis von Mycobakterien in klinischen Proben durch Verfahren wie Dot-Blot-Analyse, Lösungs-Hybridisierung, Southern-Blot-Analyse oder Polymerasekettenreaktion verwendet werden. Die klinischen Proben umfassen Sputum, Urin, Zerebrospinal-Fluid, Gewebsproben, Blut und andere Körperfluids.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Diagnosesets, die die oben beschriebenen Nukleotidsonden umfassen.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Verfahren zum Nachweisen, Unterscheiden und/oder Charakterisieren von Mycobakterien in klinischen Proben zum Zwecke einer epidemiologischen Untersuchung vor, das die Verwendung der oben beschriebenen Nukleotidsonden umfaßt.
Die vorliegende Erfindung sieht auch Verfahren zur Herstellung genannter Nukleotidsonden vor.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Unterscheiden und Charakterisieren bakterieller Mitglieder des M.tuberculosis-Komplexes sowohl voneinander als auch von anderen Bakterien vor, die nicht zum Komplex gehören, welches Verfahren umfaßt: i) das Digerieren von DNA aus einer Bakterienprobe mit einem bestimmten Restriktionsenzym; und ii) die Durchführung einer Hybridisierungsanalyse unter Verwendung einer der oben beschriebenen Nukleotidsonde.
Die die Gensonde umfassende Nukleotidsequenz muß nicht notwendigerweise eine Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym enthalten.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Um ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung zu erlangen, werden die Ausführungsformen nur als Beispiele und unter Bezugnahme auf die Figuren ausführlicher beschrieben, worin:
Fig.1 eine Restriktionskarte der Sonde 5 zeigt;
Fig.2 die DNA-Sequenz des Fragments 5C aus der Sonde 5 und das Translationsprodukt des großen offenen Leserahmens darstellt;
Fig.3 einen Vergleich einer Primär-DNA-Struktur eines Teiles von 5C mit Einfügungssequenzen IS3 und IS3411 von E.coli darstellt;
Fig.4 den DNA-Sequenz-Überlappungsteil von Fragment 5B und Teil von Fragment 5C von Sonde 5 darstellt, nämlich die Einfügungssequenz (IS986) aus dem 5 kb DNA-Fragment von M.tuberculosis;
Fig.5 die Stelle bestimmter offener Leserahmen darstellt;
Fig.6 die Ausrichtung eines potentiellen translatierten Produkts von IS986 ORFb mit mutmaßlichen Transposasen anderer IS3-ähnlicher Elemente darstellt;
Fig.7 die Ausrichtung potentieller translatierter Produkte von ORFa1 und ORFa2 mit entsprechenden Bereichen anderer IS3-ähnlicher Elemente darstellt;
Fig.8 einen Vergleich der umgekehrten Wiederholungsenden von ISTB und IS3411 darstellt;
Fig.9 die Ausrichtung der potentiellen translatierten Produkte der großen offenen Leserahmen von 5C und IS3411 darstellt;
Fig.10 die Ausrichtung der potentiellen translatierten Produkte der großen offenen Leserahmen von 5C und IS3 darstellt;
Fig.11 die Ausrichtung der potentiellen translatierten Produkte der großen offenen Leserahmen von 5C, IS3411 und IS3 darstellt;
Fig.12 die Ausrichtung der potentiellen translatierten Produkte der großen offenen Leserahmen der Einfügungssequenz (IS986) aus dem 5 kb DNA-Fragment von M.tuberculosis mit jenen von IS3411 und IS3 darstellt;
Fig.13 die Ausrichtung der potentiellen translatierten Produkte der großen offenen Leserahmen der Einfügungssequenz (IS986) aus dem 5 kb DNA-Fragment von M.tuberculosis mit jenen von IS3411 und IS3 zeigt, worin der C-terminale Bereich der IS3411 Sequenz (IS3411') aus dem -1-Rahmen in Bezug auf den Rest der IS3411-Sequenz gelesen wird;
Fig.14 eine Restriktionskarte von Sonde 9 zeigt und
Fig.15 die Beziehung zwischen Sonden 5 und 12J-B mittels eines Diagramms zeigt.

DURCHFÜHRUNGSARTEN DER ERFINDUNG

Als Teil der Untersuchung des möglichen Vorhandenseins von Plasmiden in klinischen M.tuberculosis Isolaten wurde Gesamt-DNA aus drei solchen Isolaten einem Southern-Blot-Verfahren unterworfen und mit einem natürlich auftretenden Plasmid aus M.fortuitum sondiert. Dieses als pUS300 bezeichnete Plasmid wurde aus M.fortuitum-Stamm CIPT 14-041-0003 an der Collection de l'Institut Pasteur, Tuberculose, Paris, Frankreich erhalten (hinterlegt am 21.Februar 1990 bei der National Collection of Type Cultures, Colindale, London, England NW9 5HT unter Zugriffsnummer NCTC 12381). Die Ergebnisse zeigten, daß es in den M.tuberculosis-Stämmen chromosomale DNA-Fragmente gab, die fähig waren, mit diesem M.fortuitum-Plasmid zu hybridisieren, und die Ergebnisse zeigten auch, daß im mit BamHI oder PvuII digeriertem Material die Größe der Hybridisierungsfragmente nicht die gleiche für jeden Stamm war.
Um diese Hybridisierungsfragmente zu isolieren, wurde eine Gesamt-DNA-Sammlung aus einem klinischen M.tuberculosis-Isolat (Stamm 50410, erhalten vom Public Health Laboratory, Dulwich, London, England) durch Ligieren eines partiellen Sau3AI-Digestats der M.tuberculosis DNA mit BamHI-digeriertem EMBL4 im Lambda Phage-Vektor EMBL4 konstruiert. Die Sammlung wurde mit einer DNA-Sonde gescreent, die durch Markieren eines rekombinanten Plasmids pUS301 hergeleitet wurde. Dieses Plasmid wurde durch Ligieren eines EcoRI-Digestats von Plasmid pUS300 mit einem EcoRI-Digestat des E.coli Plasmidvektors pUC19 konstruiert. Positive Plaques wurden durch weitere Plaquescreen-Runden gereinigt. Die nachstehend beschriebenen Sonden werden aus rekombinantem Phage, der als das EMBL4/A-3-Klon (hinterlegt am 21.Februar 1990 bei National Collection of Type Culture, Colindale, London England NW9 5HT unter Zugriffsnummer NCTC 12380) bezeichnet wird, aus einer der durch dieses Verfahren gewonnenen positiven Plaques erhalten.
Die DNA aus diesem rekombinanten Phagen EMBL4/A-3-Klon wurde extrahiert und mit EcoRI digeriert. Agarosegel-Elektrophorese und Southern-Blotverfahren zeigten, daß ECoRI-dig&riertes EMBL4/A-3 eine Fragmentserie enthielt, einschließlich eine mit einer Größe von etwa 9000 Basenpaaren (9 kb) und eine mit einer Größe von etwa 5000 Basenpaaren (5 kb), die mit dem Plasmid pUS300 hybridisierten. Diese Fragmente wurden jeweils aus dem Gel ausgeschnitten und werden als Sonde 9 (das 9 kb-Fragment) bzw. Sonde 5 (das 5 kb-Fragment) bezeichnet. Die Isolierung der Sonde 5 durch Hybridisierung mit M.fortuitum-Plasmid pUS300 ist ausführlicher bei Zainuddin und Dale; "J.Gen.Micro." (1989) 135 S.2347-2355 beschrieben.
Das 5 kb. EcoRI-Fragment aus dem Lambdaklon A3 (Zainuddin, Z.F. & Dale, J.W. (1989) "Journal of General Microbiology" 135, 2347-2355) wurde unter Verwendung des Plasmidvektors pAT153 geklont, um Plasmid pRP5000 zu erzeugen. Das Digerieren des Einfügungsfragmentes von pRP5000 mit PvuII erzeugte drei Fragmente, die als 5A, 5B und 5C bezeichnet werden (Fig.1), die zu stumpfendigen Fragmenten umgewandelt und mit PvuII-digeriertem pAT153 ligiert wurden, wodurch Plasmide pRP5100, pRP5200 bzw. pRP5300 erzeugt wurden.
Spezifische Subfragmente, die unter Verwendung von BamHI, XhoI, HindIII und Sa1I (Fig.1) aus pRP5000, pRP5200 und pRP5300 erzeugt wurden, wurden in M13mp18 und M13mp19 unter Verwendung des M13 Klonsets (New England Biolabs) geklont. Das kleinere EcoRI-BamHI-Fragment aus pRP5000 wurde in Bluescript pKS geklont, und es wurden genestete Löschungen unter Verwendung des Erase-a-Base-Verfahrens (Promega) durchgeführt. Das Sequenzieren erfolgte mit Tag und T7 Polymerasen (Promega) und Sequenase Version 2 (US Biochemicals) unter Verwendung des 370 Automated Sequencers (Applied Biosystems). Fragmente mit Überlappungen von zumindest 50 bp wurden in beide Richtungen sequenziert.
Die Suchen der GenBank, EMBL, NBRF und Swiss Prot Datenbanken erfolgten unter Verwendung des SEQNET-Knotens in der SERC-Einrichtung in Daresbury mittels des UWGCG-Pakets und des WordSearch-Programmes (Devereux, J., Haeberli, P.& Smithies, 0. (1984) "Nucleic Acids Research" 12, 387-395; und Wilbur, W.J. & Lipman, D.J. (1983) "Proceedings of the National Academy of Sciences USA" 80, 726-730) und des NAQ-Programmes aus der Proteinidentifikationsressource. Sequenzanalysen erfolgten mittels des Staden-Plus-Pakets (Amersham) unter Verwendung von DIAGON (Staden, R. (1982) "Nucleic Acids Research" 10, 2951-2961) zu Sequenzvergleichen und sowohl Positional Base Preference (Staden, R. (1984 "Nucleic Acids Research" 12, 551-567) und Shepherd RNY (Shepherd, J.C.W. (1981) "Proceedings of the National Academy of Sciences USA" 78, 1596-1600) Verfahren zur Identifizierung von Leserahmen, ergänzt durch die Verwendung der Codonpräferenz-Analyse (Staden, R. & McLachlan, A.D. (1982) "Nucleic Acids Research" 10, 141-156) auf der Grundlage einer Tabelle der bevorzugten Codonverwendung bei M.tuberculosis (Dale, J.W. und Patki, A. (1990) in "The Molecular Biology of Mycobacteria" (Mcfadden, J.J. Hrsg.) in Druck). Multiple Sequenzausrichtungen wurden mittels der CLUSTAL-Software (Higgins, D.G. & Sharp, P.M. (1988) "Gene" 73, 237-244) sowie händische Einstellung durchgeführt.

Sonde 9

Sonde 9 wurde unter Verwendung des Multiprime Random Primer Extension-Verfahrens (Amersham) radioaktiv mit ³²P markiert und mit Southern Blots von PvuII-digerierter Gesamt-DNA aus acht klinischen Isolaten von M.tuberculosis (Isolatnummer 50410, 60925, 61066, 61104, 61125, 61267, 61377, 61513) sowie M.bovis (Feldstamm, Central Veterinary Laboratory) und BCG (NCTC 5692) hybridisiert. Nach der Agarosegel-Elektrophorese wurden die DNA-Fragmente zu einem Hybond-N-Filter gebracht und durch einstündiges Backen bei 80ºC fixiert. Der Filter wurde bei 68ºC in einem Hybridisierungspuffer prähybridisiert. Die Hybridisierung mit der Sonde erfolgte im selben Puffer bei 68ºC über Nacht.
Der Hybridisierungspuffer bestand aus 5X Denhardtsche Lösung, 5X SSPE Puffer, 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 100 ug/ml ultraschallbehandelter Lachssperma-DNA. Die Denhardtsche Lösung und der SSPE-Puffer wurden wie folgt als Stammlösungen hergestellt:
50X Denhardtsche Lösung: 0,5 g Ficoll (Marke) (Molekulargewicht 400.000), 0,5 g Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht 40.000), 0,5g Rinder-Serumalbumin wurden in sterilem entionisiertem destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml aufgelöst, das in aliquote Teile verteilt und bei -20ºC gelagert wurde.
20X SSPE-Puffer: 3,6M NaCl, 20mM Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,2M NaH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;, pH-Wert 7,7 wurden in entionisiertem destilliertem Wasser aufgelöst und autoklaviert.
Der Filter wurde dann zweimal mit 2X SSC gewaschen, einmal mit 2X SSC, das 0,1% SDS enthielt und einmal mit 0,1X SSC, das 0,1% SDS enthielt. Alle Waschungen erfolgten bei 68ºC. Das SSC wurde wie folgt als Stammlösung hergestellt:
20X SSC: 3M NaCl, 0,3M Natriumcitrat wurden in destilliertem Wasser aufgelöst und autoklaviert, nachdem der pH-Wert auf 7,0 eingestellt worden war.
Der Filter wurde mit einer Saran-Hülle bedeckt und 16 Stunden lang bei Raumtemperatur einem Röntgenfilm (RX, Fuji) ausgesetzt.
Jeder mit Sonde 9 hybridisierte M.tuberculosis-Stamm wies mehrere Hybridisierungsbänder auf; einige Elemente dieses Musters variierten von Stamm zu Stamm, während andere konstant blieben. M.bovis und BCG hybridisierten auch mit Sonde 9 mit einem Muster, das die konservierten Merkmale des M.tuberculosis-Musters bewahrte.
Die folgenden Mycobakterien-Spezien (jeweils ein Stamm, soferne nicht anders angegeben) hybridisierten mit Sonde 9 in einem keinesfalls signifikanten Ausmaß: M.paratuberculosis, M.intracellulare, M.scrofulaceum, M.phlei, M.fortuitum (drei Stämme), M.kansasii, M.avium, M.malnioense, M.flavescens, M.gordonae und M.chelonei (zwei Stämme).
Sonde 9 war daher für den M.tuberculosis-Komplex spezifisch (er enthält M.bovis und BCG), und es bestand eine gewisse Fähigkeit, zwischen Stämmen zu unterscheiden.
Eine Restriktionskarte von Sonde 9 ist in Fig.14 dargestellt. Die Sonde ist durch zwei EcoRI-Stellen gebunden und durch vier interne PvuII-Stellen in Fragmente von etwa 3,5 kb, 1 kb, 4 kb und 0,5 kb geteilt.

Sonde 5

Untersuchungen mit Sonde 5 zeigten, daß sie eine Sequenz umfaßt, die für ein Einfügungselement kodiert (als IS986 bezeichnet), das in einer variablen Anzahl an Kopien (bis zu etwa 15) in M.tuberculosis, M.bovis, M. africanum, M.microti und M.bovis BCG des M.tuberculosis-Komplexes vorhanden zu sein scheint. Das Einfügungselement wurde mit dem bereits beschriebenen Einfügungselement IS 3 und IS 3411, das sich in E.coli befindet, verglichen. Das Einfügungselement von Sonde 5 hat eine starke Homologie zu IS 3411, das wahrscheinlich für eine Transposase kodiert.
Eine Restriktionskarte von Sonde 5 ist in Fig.1 dargestellt. Die Sonde kann, wie aus der Figur ersichtlich, an zwei PvuII-Stellen in Fragmente 5A, 5B und 5C geteilt sein.
Die Sequenz von 5C ist in Fig.2 dargestellt. Geeignete Restriktionsstellen sind umrandet, und eine Sequenz mit 29/40-Identität mit der rechten umgekehrten Wiederholung (IR) von IS 3411 und 20/40 mit der umgekehrten Wiederholung von IS 3 ist unterstrichen (Ishiguro & Sato 1988, "J.Bacteriology" 170, 1902-1906; Timmerman & Yu 1985, "Nucl.Acids Res." 13, 2127-2139). Zeilendiagramme, die die primäre DNA-Struktur eines Teiles von 5C mit IS3 und IS 3411 vergleichen, sind in Fig.3 dargestellt.
Fig.4 zeigt eine DNA-Sequenz, die einen Teil des Fragments 5B und einen Teil des Fragments 5C von Sonde 5 überlappt. Wie in Fig.2 sind geeignete Restriktionsstellen umrandet. Die PvuII-Restriktionsstelle definiert die Verbindung zwischen Fragmenten 5B und 5C. Diese DNA-Sequenz umfaßt zwei umgekehrte Wiederholungssequenzen (27/30 Basen-Übereinstimmung), die in Fig.4 unterstrichen dargestellt sind. Die linke umgekehrte Wiederholung CCTGAACCGCCCCGGCATGTCCGGAGACTC befindet sich im Fragment 5B bis zur 5' Seite einer ersten Acc III-Stelle, während sich die rechte umgekehrte Wiederholung GAGTCTCCGGACTCACCGGGGCGGTTCAGG im Fragment 5C bis zur 3' Seite einer zweiten Acc III-Stelle befindet. Die Sequenz zwischen diesen umgekehrten Wiederhölungssequenzen umfaßt das Einfügungselement IS986 (von etwa 1358 bp), das in einer variablen Anzahl an Kopien in Mitgliedern des M.tuberculosis-Komplexes vorhanden ist.
Die Untersuchung des Einfügungselements zeigte einen langen offenen Leserahmen (ORFb: Basen 274 bis 1311) mit einem potentiellen Translations-Startcodon (GUG) an Position 478 und einen weiteren (ORFc) in umgekehrter Richtung (1107 bis 622) (Fig.5). Positionsbasenpräferenz-Analysen zeigten, daß beide potentiell translatierte Bereiche sind, zusammen mit Teilen zweier kürzerer ORFs (6 bis 275 und 164 bis 376). (Aus weiter unten angeführten Gründen werden die zwei letzteren gemeinsam berücksichtigt und als ORFa1 bzw. ORFa2 bezeichnet; die wahrscheinlich zu translatierenden Bereiche sind in Fig.5 dargestellt. Die Codonverwendung von ORFb und zu einem geringeren Ausmaß die von ORFc stimmt mit dem hohen Grad der Codonbias überein, den mycobakterielle Gene normalerweise aufweisen (Dale, J.W. und Patki, A. (1990) in "The Molecular Biology of Mycobacteria" (McFadden, JJ., Hrsg.) in Druck). Dies trifft auch auf die angeführten Bereiche ORFa1 und ORFa2 zu (Fig.5), aber nicht auf den Rest dieser ORFs (siehe unten)).
Die Sequenz des hypothetischen Translationsprodukts von ORFb wurde gegen die NBRF und SwissProt-Datenbanken gescreent. Eine Sequenz wurde mit einer deutlich über dem Hintergrund liegenden Homologie identifiziert, nämlich das mutmaßliche Transposaseprotein in der Einfügungssequenz IS3411 aus E.coli (Ishiguro und Sato; 1988; "J.Bacteriology" 170, 1902-1906); ein geringeres Ausmaß an Ähnlichkeit wurde bei hypothetischen Proteinen festgestellt, die aus den Sequenzen zweier anderer Einfügungssequenzen, IS600 und IS629, translatiert sind, wobei beide aus Shigella sonnei (Matsutani, S., Ohtsubo, H., Maeda, Y. & Ohtsubo, E. (1987) "Journal of Molecular Biology" 196 445-455) stammen. All diese Sequenzen gehören zur IS3-Familie.
Eine multiple Ausrichtung dieser Sequenzen und jene der IS3-Transposase (Timmerman, K.P. & Tu, C-P.D. (1985) "Nucleic Acids Research" 13, 2127-2139) zeigt ein markantes Ausmaß an Ähnlichkeit außer für den C-terminalen Abschnitt des IS3411-Proteins. Die unterschiedliche Struktur dieses IS3411-Bereichs ist auch aus der Ausrichtung der mutmaßlichen Transposasen (Proteine, die es dem DNA-Abschnitt umfassend das durch umgekehrte Wiederholungen gebundene Einfügungselement ermöglichen, bei einem anderen Teil des Genoms auszuschneiden und einzufügen) von IS3 und IS3411 offenkundig, wie durch Ishiguro & Sato 1988 gezeigt wurde. Ein Vergleich der Produkte aller dreier Leserahmen der vollständigen Sequenzen von IS3, IS3411 und IS986 zeigte jedoch eine Homologie des C-terminalen Abschnitts des IS986 ORFb mit dem -1-Rahmen von IS3411. Eine multiple Ausrichtung unter Verwendung eines IS3411-Produkts mit einer hypothetischen Rahmenverschiebung (Fig.6) (die Sequenzen wurden an jenem Punkt geteilt, der der mutmaßlichen Rahmenverschiebung in IS3411 entsprach; die zwei Abschnitte wurden gesondert ausgerichtet und händisch rekombiniert. IS3411' wird aus dem -1-Rahmen hinsichtlich des ersten Teils der Sequenz gelesen) zeigt, daß 27% der Aminosäurereste des 1S986 ORFb-Produkts auch in zumindest zwei der anderen drei zum Vergleich herangezogenen Sequenzen vorhanden sind, wobei etwa die Hälfte von ihnen in allen vier Sequenzen identisch ist. Cluster identischer Reste lassen sich in drei Bereichen feststellen, die die konservierten Motive L/VWV/AADLTYV, IHHT/SDRGSQY und C/SYDNA enthalten. Der Konservierungsgrad dieser Bereiche läßt vermuten, daß sie für die Funktion dieses Proteins wesentlich sind.
Die Sequenz vor dem potentiellen Startcodon in ORFb (GUG&sub4;&sub7;&sub8;) weist nur eine geringe Ähnlichkeit mit einer Konsens-Shine-Dalgarno-Sequenz auf, die wahrscheinlich nicht signifikant ist. Daher wurde die Art des potentiellen Translationsbeginns von ORFb durch Untersuchung des stromaufwärts liegenden Bereichs erforscht. Der Dreirahmen-Vergleich des Translationsprodukts von IS3, IS3411 und IS986 zeigte in diesem Bereich weitere Ähnlichkeiten. Sowohl in IS3 als auch in IS3411 befindet sich vor dem mutmaßlichen Transposasegen (ORFb) ein offener Leserahmen von etwa 300 Basenpaaren mit guten Translationsstartsignalen (Ishiguro, N. & Sato, G. (1988) "Journal of Bacteriology" 170, 1902-1906; und Matsutani, S., Ohtsubo, H., Maeda, Y. & Ohtsubo, E. (1987) "Journal of Molecular Biology" 196, 445-455). Die hypothetischen Produkte der relevanten Bereiche dieser ORFs lassen sich gut mit jenen von ORFa1 und ORFa ausrichten (Fig.7) (die translatierten Produkte von ORFa1 und ORFa2, bis und ab der Position der vorgeschlagenen Rahmenverschiebung, wurden mit den Produkten des entsprechenden Leserahmens der anderen Elemente ausgerichtet. Alle dargestellten Sequenzen außer ORFa2 begannen vom angenommenen AUG-Einleitungscodon), was auf eine mögliche Rahmenverschiebung in der IS986 hinweist. Es gibt auch ein potentielles Startcodon (GUG&sub2;&sub0;&sub0;) fünf Aminosäuren in die in Fig.7 dargestellte Sequenz; es ist also vorstellbar, daß ORFa2 unabhängig translatiert ist. Von den kombinierten ORFa1 und ORFa2-Produkten finden sich 29% der Reste in zwei der anderen drei dargestellten Sequenzen. Paarweise Vergleiche bestätigen die Ausrichtungen; es stimmten z.B. 50% der Reste mit dem IS3411 ORFa-Produkt überein. Die in Fig.7 dargestellte Ausrichtung steht in deutlichem Gegensatz zu den Ergebnissen von Schwartz et al (Schwartz, E., Kroger, M. & Rak, B. (1988) "Nucleic Acids Research" 13, 2127-2139), daß die ORFa-Produkte verschiedener Bestandteile der IS3-Familie eine nur marginale Homologie aufwiesen.
Das IS986 ORFa1 hat ein potentielles Einleitungscodon (AUG) bei Position 54, vor dem ein purinreicher Bereich mit mehreren möglichen Zuteilungen von Sequenzen liegt, die fünf von sieben Basen zeigen, die mit der Konsens Shine-Dalgarno-Sequenz übereinstimmen. Bei verschiedenen anderen Mitgliedern der IS3-Familie glaubt man, daß die Translation der mutmaßlichen Transposase (ORFb) durch Durchlesen von ORFa auftritt. Sowohl in IS3411 als auch in IS3 überlappt das ORFa beendende Translationsstopsignal das mutmaßliche Startcodon für ORFb mit der Sequenz AUGA. Ein an diesem Punkt terminierendes Ribosom könnte daher am überlappenden AUG-Codon reinitiieren. In IS986 jedoch gibt es im Überlappungsbereich von ORFb kein potentielles Startcodon, obwohl ORFa ORFb überlappt.
Es zeigt sich, daß ribosomale Rahmenverschiebung, die ein Fusionsprotein erzeugt, in IS1 (Sekine, Y. & Ohtsubo, E. (1989) "Proceedings of the National Academy of Sciences USA" 86, 4609-4613) in einem Bereich auftritt, wo zwei ORFs überlappen, wahrscheinlich an der Sequenz UUUAAAAAC. US3411, IS3 und IS600 enthalten alle Läufe von 5-7 A-Resten im Überlappungsbereich zwischen zwei ORFs. Der Überlappungsbereich zwischen ORFa2 und ORFb in IS986 enthält keinen langen Lauf von Adeninen, doch die Sequenz UUUUAAAG (324-331) bietet sich für die Durchführung einer solchen Rahmenverschiebung als Kanditat an. Eine translationale Rahmenverschiebung in der -1 Richtung tritt auch in anderen prokaryotischen Genen auf, die anscheinend keine gemeinsame Sequenz besitzen (Atkins, J.F. Gesteland, R.F., Reid, B.R. & Anderson, C.W. (1979) "Cell" 18, 1119-1131).
Die Bedeutung von ORFc auf dem Umkehrstrang ist unklar. Vor dem ersten potentiellen Startcodon (AUG&sub1;&sub0;&sub0;&sub2;) befindet sich nichts, was einer Shine-Dalgarno-Sequenz ähnelt. Obwohl die Analyse von ORFc auch aufzeigt, daß es sich um eine translatierte Sequenz handelt, stimmt es mit ORFb auf dem anderen Strand überein, und die analytischen Verfahren auf den zwei Strängen sind nicht unabhängig. Schwartz et al (Schwartz, E., Kroger, M. & Rak, B. (1988) "Nucleic Acids Research" 14, 6789-6802) haben ein ähnliches ORF im E.coli-Element IS150 identifiziert, das anscheinend eine Kodierfunktion hat. Das Vorhandensein von ORFs auf dem Umkehrstrang ist ein gemeinsames Merkmal anderer IS-Elemente, und man ist der Ansicht, daß es möglicherweise durch das Erfordernis beider Proteine, sicherzustellen, daß das IS-Element nicht willkürlich durch externe Transkription aktiviert wird, bei der Regulierung der Transposition eine Rolle spielt (Galas, D.J. und Chandler, M. (1989) in "Mobile DNA" (Berg, D.E. und Howe, M.M. Hrsg.), Seiten 109-162, American Society for Microbiology, Washington ) Weitere Forschungsarbeiten sind erforderlich, um die eigentliche Beschaffenheit der in M.tuberculosis wirkenden Translations- (und Transkriptions-)-Steuersignale zu definieren.
Die Basenzusammensetzung von IS986 ist bei 64% G+C typisch für M.tuberculosis. Es ist daher nicht überraschend, daß die Homologie mit den anderen Mitgliedern der IS3-Familie, die auf der Proteinebene so ausgeprägt ist, auf der DNA-Ebene viel weniger auffällig ist (Daten nicht dargestellt). Es besteht jedoch ein markanter Ähnlichkeitsgrad der umgekehrten Wiederholungsenden mit den anderen Mitgliedern der IS3-Familie, insbesondere IS3411 (Fig.8), wo die IR-Enden mit jenen von IS986 zu 78% identisch sind.
Fig.9 zeigt, daß die Translation des großen offenen Leserahmens von 5C eine starke Homologie zu dem großen offenen Leserahmen des Einfügungselements IS3411 von E.coli aufweist. Sie ist auch zu IS3 von E.coli homolog (Fig.10). Die Ausrichtung aller drei Sequenzen ist in Fig.11 dargestellt.
Die Ausrichtung der potentiellen translatierten Produkte der großen offenen Leserahmen der Einfügungssequenz vom M.tuberculosis DNA-Fragment mit 5 kb (IS986) mit jenen von IS3411 und IS3 ist in Fig.12 dargestellt. In Fig.13 wird ein ähnlicher Vergleich angestellt, doch hier wird der C-terminale Bereich der IS3411-Sequenz (IS3411') aus dem -1-Rahmen in bezug auf den Rest der IS3411-Sequenz gelesen.
Sonde 5 wurde durch Hybridisierungsexperimente (entsprechen im wesentlichen den bei Sonde 9 beschriebenen) mit 22 Isolaten von M.tuberculosis sowie M.bovis und BCG geprüft. Die Bedingungen waren die gleichen wie die weiter oben für Sonde 9 beschriebenen, außer daß die Autoradiographie bei Raumtemperatur 6,5 Stunden dauerte.
Jeder M.tuberculosis-Stamm zeigte zwischen fünf und fünfzehn stark hybridisierende Fragmente sowie eine Anzahl schwächerer Bänder. Die Bänderanzahl und die Stärke des Signals sowie die Variation zwischen den Stämmen zeigte das Vorhandensein eines willkürlich eingefügten sich wiederholenden DNA-Elements im Chromosom dieser Stämme an.
M.bovis und BCG zeigten ein einfacheres Muster von zwei bzw. drei Bändern. Diese Organismen konnten daher leicht von M.tuberculosis und voneinander unterschieden werden.
Die folgenden Mycobakterienspezien (jeweils ein Stamm soferne nicht anders angegeben) hybridisierte nicht mit Sonde 5: M.paratuberculosis, M.intracellulare, M.scrofulaceum, M.phlei, M.fortuitum (drei Stämme) M.kansasii, M.avium, M.malnioense, M.flavescens, M.gordonae und M.chelonei (zwei Stämme).
Sonde 5 war daher für den M.tuberculosis-Komplex spezifisch und überdies fähig, zwischen M.tuberculosis, M.bovis und BCG zu unterscheiden und zwischen M.tuberculosis-Stämmen zu unterscheiden.
Fragment 5A auf dem Southern Blot hybridisiert mit DNA aus M.tuberculosis H&sub3;&sub7;Rv und H&sub3;&sub7;Ra und M.bovis BCG in starker und spezifischer Weise, wobei sich in jedem identische Bänder der Größe 2,1 und 0,65 kbp ergeben, obwohl es Bänder dieser Größe nicht notwendigerweise mit jedem M.tuberculosis-Stamm ergibt.

INDUSTRIELLE BZW. GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT

Ein Teil oder alle der identifizierten Sequenzen, die einen Teil oder die Gesamtheit der Sonde 5 umfassen, können als Gensonden verwendet werden. Insbesondere können ein Teil oder alle der in 5C und 5B identifizierten Sequenzen, die das Einfügungselement aufbauen, als Gensonden verwendet werden. Wenn solche Sonden in Hybridisierungsuntersuchungen an gespaltener genomischer DNA aus bakteriellen Proben des M.tuberculosis-Komplexes verwendet werden, werden charakteristische Bändermuster erzeugt, weshalb sich solche Sonden als diagnostische oder epidemiologische Instrumente eignen. Nicht nur verschiedene Spezien, sondern auch verschiedene Stämme innerhalb einer Spezies erzeugen charakteristische Bändermuster. Dies ist besonders beim Unterscheiden von M.bovis und M.bovis BCG von anderen Spezien und in der Tat beim Unterscheiden von M.bovis von M.bovis BCG hilfreich. Sonde 5A könnte als generische Sonde zum Nachweis aller Mitglieder des M.tuberculosis-Komplexes verwendet werden.
Die Nützlichkeit von Sonde 5 oder eines Fragments davon als diagnostisches Instrument ist vorwiegend auf die folgenden Merkmale zurückzuführen.
a) Das Einfügungselement ist nur bei Mitgliedern des M.tuberculosis-Komplexes (M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum und M.microti) und nicht in nichtpathogenen Umwelt-Mycobakterien oder M.leprae festgestellt worden.
b) Durch die Verwendung der Southern Blot-Analyse mit Sonde 5 (oder einem Teil des Einfügungselements in 5) als Sonde läßt sich bei jedem getesteten M.tuberculosis-Isolat (bislang 22) ein unterschiedliches Bandenmuster feststellen. Dies wäre bei epidemiologischen Untersuchungen zur Erforschung der Tuberkuloseübertragung ein wirkungsvolles Instrument.
c) Es handelt sich um eine der ersten Sonden, die Unterschiede zwischen M.tuberculosis und M.bovis und, was vielleicht noch wichtiger ist, zwischen M.bovis und M.bovis BCG zeigt.
d) Die Verwendung des Einfügungselements als Sonde zur Unterscheidung von M.bovis BCG von M.bovis und M.tuberculosis ist bei Patienten mit disseminierter BCG-Infektion im Anschluß an eine Impfung oder Immunosuppression nützlich.
e) Einfügungselemente (flankiert von zwei Einfügungssequenzen) sind nützliche genetische Instrumente zum Charakterisieren unbekannter Gene.
Die vorliegende Erfindung stellt demnach eine Anzahl an Verfahren zum Unterscheiden und Charakterisieren bakterieller Mitglieder des M.tuberculosis-Komplexes sowohl voneinander als auch von anderen, nicht zum Komplex gehörenden Bakterien bereit.
DNA aus einer Bakterienprobe kann z.B. mit einem bestimmten Restriktionsenzym digeriert und eine Hybridisierungsanalyse (gemäß herkömmlicher Verfahren) unter Verwendung eines Fragments der hier offenbarten DNA als Sonde durchgeführt werden, welches Fragment keine Restriktionsstelle zum Spalten der Proben-DNA enthält. Es wurde z.B. ein BamHI zu Xho I-Fragment (oder ein Teil davon) der Sonde 5/5C (siehe Fig.1 und Basen 420 bis 810 von Fig.2), das sich im Einfügungselement befindet und keine PvuII-Stellen enthält, zum Sondieren eines PvuII-Digestats von M.bovis BCG DNA verwendet. Dabei wurde eine starke Hybridisierung mit einer einzigen Bande beobachtet, was anzeigte, daß das Einfügungselement im untersuchten M.bovis BCG-Stamm in einer einzigen Kopie vorhanden ist.
Der Einsatz einer Sonde, welche die zum Spalten der Proben-DNA verwendete Restriktionsstelle enthält, führt zu einer Vielfachband-Hybridisierung, die auch auftritt, wenn die Proben-DNA Vielfachkopien z.B. des Einfügungselements enthält; dies scheint für die meisten Mitglieder des M.tuberculosis-Komplexes der Fall zu sein. Nichtsdestoweniger können die Bändungshybridisierungsmuster verwendet werden, um zwischen verschiedenen Stämmen derselben Spezies und zwischen verschiedenen Spezien des M.tuberculosis-Komplexes zu unterscheiden. Eine generische Sonde zum Nachweis aller Mitglieder des M.tuberculosis-Komplexes muß keine DNA aus der Einfügungssequenz enthalten, sondern könnte ausschließlich aus der flankierenden DNA stammen, wie z.B. das oben besprochene PvuII-EcoRI-Fragment 5A.
Das Vorhandensein einer Einfügungssequenz in M.tuberculosis, die mit den charakterisierten IS-Elementen aus den Enterobacteriaceae so nahe verwandt ist, ist in vielfacher Hinsicht von erheblicher Bedeutung. Die nachgewiesenen Vielfachrestriktionsfragment-Längenpolymorphismen (Zainuddin, Z.F. & Dale, J.W. (1989) "Journal of General Microbiology" 135, 2347-2355) zeigen, daß eine Anzahl von IS986-Kopien an unterschiedlichen Stellen in verschiedenen M.tuberculosis Isolaten eingefügt sind. In dieser Hinsicht unterscheiden sie sich von anderen kürzlich beschriebenen Wiederholungselementen aus Mycobakterien (Clark- Curtiss, J.E. & Walsh, G.P. (1989) "Journal of Bacteriology", 171, 4844-4851; Clark-Curtiss, J.E. & Docherty, M.A. (1989) "Journal of Infectious Diseases" 159, 7-15; und Green, E.P., Tizard, M.L. V., Moss, M.T., Thompson, J., Winterbourne, D.J., McFadden, J.J. & Hermon-Taylor, J. (1989) "Nucleic Acids Research" 17, 9063-9072), die mit verschiedenen Isolaten identische Southern Blot-Muster ergeben. Dies läßt vermuten, daß IS986 ein funktionales transponierbares Element in Mycobakterien ist, das für die Transposon-Mutagenese mycobakterieller Spezien von beträchtlichem Wert sein würde. Die Transponierbarkeit von IS986 könnte durch ribosomale Rahmenverschiebung im Überlappungsbereich zwischen ORFa und ORFb reguliert werden, wie es bereits für IS1 festgesetzt wurde (Sekine, Y. & Ohtsubo, E. (1989) "Proceedings of the National Academy of Sciences USA"86, 4609-4613).
Das Vorhandensein von IS986 in klinisch isolierten M.tuberculosis-Stämmen aus einer breiten Vielfalt an Quellen (Zainuddin, Z.F. & Dale, J.W. (1989) "Journal of General Microbiology" 135, 2347-2355) und die Beziehung mit den IS-Elementen von E.coli und Sh.sonnei lassen die Möglichkeit eines Transfers genetischen Materials unter den M.tuberculosis-Stämmen sowie den Erwerb aus gram-negativen Bakterien vermuten. Es ist vorgeschlagen worden (Zainuddin, Z.F. & Dale, J.W. (1990) "Tubercle" 71, in Druck), daß zumindest einige klinische M.tuberculosis-Stämme Plasmide tragen, die bei der Disseminierung solcher Elemente eine Rolle spielen könnten; die Fähigkeit einiger E.coli-Plasmide, sich in Mycobakterien zu replizieren (Zainuddin, Z., Kunze, Z. & Dale, J.W. (1989) "Molecular Microbiology", 29-34) kann es den Einfügungssequenzen ermöglicht haben, sich von E.coli zu M.tuberculosis auszubreiten. Eine Konjugation ist jedoch in M.tuberculosis noch nie in schlüssiger Weise gezeigt worden, und der Organismus führt abgesehen von zufälligen Zusammentreffen mit anderen Organismen, z.B. im Darm, normalerweise eine abgeschiedene Existenz. Die Übertragung von Einfügungssequenzen tragenden Plasmiden wäre wahrscheinlich ein seltenes Ereignis. Die hohe G+C-Zusammensetzung des IS-Elements zeigt, daß sein Erwerb durch M.tuberculosis kein kürzliches Ereignis ist. Diese Fragen könnten durch eine Untersuchung des Verhaltens dieser Einfügungssequenz in Laborstämmen und klinischen Isolaten beantwortet werden.
In allen Spezien des M.tuberculosis-Komplexes ist IS986 vorhanden, obwohl die Kopieanzahl variiert; es befindet sich nicht in anderen Mycobakterienspezien (Zainuddin, Z.F. & Dale, J.W. (1989) "Journal of General Microbiology" 135, 2347-2355). Daher sind auf IS986 basierende Sonden für pathogene Mycobakterien sehr spezifisch. Gepaart mit der Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) stellt dies ein äußerst empfindliches System zum Nachweis und Einteilen in Spezien von M.tuberculosis in klinischen Proben dar. Der ausgedehnte Polymorphismus von M.tuberculosis-Isolaten, die mit dieser Sonde getestet werden (Zainuddin, Z.F. & Dale, J.W. (1989) "Journal of General Microbiology" 135, 2347-2355) ermöglicht äußerst genaue epidemiologische Untersuchungen, die durchzuführen sind, indem der Fingerabdruck klinischer Isolate abgenommen wird. Mit diesem System ergeben alle mit Ausnahme der nächsten verwandten Isolate unterschiedliche Hybridisierungsrestriktionsfragmentmuster, und es ist demnach möglich, die Ausbreitung verschiedener M.tuberculosis-Stämme durch eine Gemeinschaft zu verfolgen.

Sonde 12

"Sonde 12" ist ein Eco RI-Fragment von etwa 25,2 Kb aus M.tuberculosis NCTC 7416 H&sub3;&sub7;Rv, das durch Screenen einer Sammlung von EcoRI-digeriertem H&sub3;&sub7;Rv unter strengen Bedingungen mit H&sub3;&sub7;Rv-DNA und durch Isolieren eines stark hybridisierenden Klons erhältlich ist.
Das 25,2 kb EcoRI-Fragment wird durch PvuII in Fragmente einer Größe von etwa 8,9 kb, 3,8 kb, 3,5 kb, 3,0 kb (Fragment 12J), 1,8 kb (Fragment 12B), 1,6 kb, 1,4 kb und 1,2 kb (Fragment 12A) digeriert. Das 1,2 kb 12A-Fragment ist M.tuberculosis-Komplex-spezifisch und nicht mit den Sonden 5 oder 9 verwandt. Fig.15 zeigt die Anordnung der Fragmente 12J und 12B in bezug auf Sonde 5. Die die Einfügungssequenz flankierende DNA ist durch eine Wellenlinie dargestellt, da sie aufgrund der Tatsache, daß sich das Einfügungselement an vielen Stellen im Genom einfügt, nicht mit der flankierenden DNA in Sonde 5 identisch ist. Die flankierende DNA von Sonde 12J hybridisiert mit vielen verschiedenen Mycobakterienspezien. Fragment 12J könnte einen Wert als diagnostische Sonde zum Nachweisen eines weiten Bereiches an Mycobakterien haben.

Sonde 8

Diese beschreibt ein Eco RV-Fragment von etwa 16,1 kb, das durch Hybridisierungsscreenen einer Eco RV-Sammlung von H&sub3;&sub7;Rv isoliert ist.
Bei Verwendung als Sonde auf einem Southern Blot mit M.tuberculosis-DNA bindet sie sich an viele Fragmente. Bei PvuII-Digerierung ergibt sie Fragmente einer Größe von etwa 5,6 kb, 4,8 kb, 2,1 kb, 2,0 kb, 0,9 kb und 0,7 kb. Sie scheint mit den Sonden 5 und 12 nicht verwandt zu sein.

Claims

1. Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung mycobakterieller Infektion, die mit genomischer Mycobacterium tuberculosis-DNA hybridisiert, die durch das Screenen einer genomischen Mycobacterium tuberculosis-Sammlung mit DNA eines Plasmids pUS300 von Mycobacterium fortuitum erhältlich ist, welche Nukleotidsonde beim Hybridisierungsassay fähig ist, bakterielle Bestandteile des Mycobacterium-Komplexes entweder voneinander oder von anderen Bakterien, die nicht zum Komplex gehören, zu unterscheiden und zu charakterisieren, und worin die Sonde nicht gleich dem genannten Plasmid ist.

2. Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung mycobakterieller Infektion, die mit genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis und mit einem Plasmid pUS300 von Mycobacterium fortuitum hybridisiert, welche Nukleotidsonde beim Hybridisierungsassay fähig ist, bakterielle Bestandteile des Mycobacterium-Komplexes entweder voneinander oder von anderen Bakterien, die nicht zum Komplex gehören, zu unterscheiden und zu charakterisieren, und worin die Sonde nicht gleich dem genannten Plasmid ist.

3. Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung von mycobakterieller Infektion, welche die in vorliegender Fig. 2 dargestellte Nukleotidsequenz oder ihre komplementäre Sequenz umfaßt oder damit hybridisiert, oder die eine Nukleotidsequenz umfaßt oder damit hybridisiert, die durch Hybridisierung mit der in vorliegender Fig. 2 dargestellten Nukleotidsequenz aus einer genomischen Sammlung eines Organismus des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes erhältlich ist, welche Nukleotidsonde beim Hybridisierungsassay fähig ist, bakterielle Bestandteile des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes entweder voneinander oder von anderen Bakterien, die nicht zum Komplex gehören, zu unterscheiden und zu charakterisieren.

4. Nukleotidsonde nach Anspruch 1, worin die genomische Sammlung von Mycobacterium tuberculosis-Stamm 50410 erhalten wird.

5. Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung von mycobakterieller Infektion, die einen Teil der oder die gesamte entweder in Fig. 2 oder in Fig. 4 der Zeichnungen gezeigte(n) Nukleotidsequenz oder ihre(r) komplementäre(n) Sequenz umfaßt oder damit hybridisiert.

6. Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung von mycobakterieller Infektion, die umfaßt oder hybridisiert mit: (i) einen Teil der oder die gesamte Einfügungselementnukleotidsequenz, die im Genom von Mycobacterium tuberculosis-Stamm 50410 durch zwei umgekehrte Wiederholungssequenzen gebunden ist; (ii) einen Teil der oder die gesamte in Fig. 2 der Zeichnungen identifizierte(n) Nukleotidkodierungssequenz.

7. Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung von mycobakterieller Infektion, die einen Teil der oder die gesamte Flankierungssequenz von Nukleotiden umfaßt oder damit hybridisiert, die im Genom von Mycobacterium tuberculosis-Stamm 50410 angrenzend an eine Einfügungselementnukleotidsequenz auftreten, die stromaufwärts vom 5'-Ende der Base 896 in Fig. 2 der Zeichnungen auftritt.

8. Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung von mycobakterieller Infektion, die einen Teil der oder die gesamte in Fig. 4 der Zeichnungen identifizierte(n) Einfügungselementnukleotidsequenz umfaßt oder damit hybridisiert.

9. Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung von mycobakterieller Infektion die einen Teil der oder die gesamte Flankierungssequenz von Nukleotiden umfaßt oder damit hybridisiert, die stromabwärts des 3'-Endes von Base 896 in Fig. 2 der Zeichnungen auftritt.

10. Nukleotidsonde zur Diagnose und/oder epidemiologischen Untersuchung von mycobakterieller Infektion, welche einen Teil der oder die Gesamtheit einer Nukleotidsequenz mit in etwa 1,9 kb umfaßt oder damit hybridisiert, die im Genom von Mycobacterium tuberculosis-Stamm 50410 unmittelbar stromabwärts vom 3'-Ende der in Fig. 2 der Zeichnungen gezeigten Nukleotidsequenz auftritt.

11. Nukleotidsonde nach einem der Ansprüche 1 bis 8, die zwischen Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis und BCG unterscheiden kann.

12. Nukleotidsonde nach einem der Ansprüche 1 bis 8, die zwischen verschiedenen Stämmen oder Isolaten von Mycobacterium tuberculosis unterscheiden kann.

13. Nukleotidsonde nach einem der Ansprüche 1 bis 8, die keine wesentliche Hybridisierung mit Nukleinsäuren von Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium phlei, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium avium, Mycobacterium malnioense, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium gordonae und Mycobacterium cheloni zeigt.

14. Set, das eine Nukleotidsonde nach einem der Ansprüche 1 bis 13 umfaßt.

15. Verfahren zum Nachweisen, Unterscheiden und/oder Charakterisieren von Mycobacteria in klinischen Proben zum Zweck epidemiologischer Untersuchung, welches die Verwendung einer Nukleotidsonde nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfaßt.

16. Verfahren, um bakterielle Bestandteile des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes entweder voneinander oder von anderen Bakterien, die nicht zum Komplex gehören, zu unterscheiden und zu charakterisieren, welches umfaßt:

das Digerieren von DNA von einer Bakterienprobe mit einem bestimmten Restriktionsenzym; und

die Durchführung von Hybridisierungsanalyse unter Verwendung einer Nukleotidsonde nach einem der Ansprüche 1 bis 8.