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ERFINDUNGSGEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein PCR-basiertes Verfahren zur Identifizierung
unterschiedlicher Spezies der Gattung Eimeria (allgemein als Kokzidien
bekannt). Insbesondere betrifft die Erfindung ein PCR-basiertes
Verfahren, das gattungsspezifisch ist, bei dem neuartige PCR-Primer
Verwendung finden und mit dessen Hilfe man in der Lage ist, auch
Spezies von Eimeria zu identifizieren, die sich nur durch relativ
geringfügige
Sequenzabweichungen unterscheiden.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
bibliographischen Daten der Veröffentlichungen,
auf die hier Bezug genommen wird, sind am Ende der Beschreibung
aufgelistet.
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Der
vorliegende Text enthält
die folgenden allgemein üblichen
Abkürzungen:
ITS ("Internal Transcribed
Spacer"), ITS-1
(erster "Internal
Transcribed Spacer"),
ITS-2 (zweiter "Internal
Transcribed Spacer"),
rDNA (ribosomale DNA), TBE ("Tris-Borat-EDTA"), DPGE ("denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese"), SSCP ("Single-Strand Conformation
Polymorphism", Einzelstrang-Konformationspolymorphismus).
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Kokzidiose
ist eine Krankheit bei Tieren und Vögeln, die durch unter der Bezeichnung
Kokzidien bekannte protozoische Parasiten (Eimeria) verursacht wird.
Diese Krankheit ist weltweit für
die Geflügelindustrie von
erheblicher ökonomischer
Bedeutung.
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Eimeria-Spezies
haben komplizierte Lebenszyklen, deren Einzelheiten gut beschrieben
sind. Kurz gesagt, werden nach Aufnahme einer sporulierten (infektiösen) Kokzidien-Oozyste
Sporozoiten freigesetzt und initiieren asexuelle und sexuelle Zyklen,
die zur Entstehung tausender neuer Oozysten führen, welche dann über den
Kot des Wirts verbreitet werden. In der Umwelt bilden diese Oozysten
innerhalb von Tagen Sporen und sind dann für naive Vögel infektiös. Eine einzige sporulierte
Oozyste kann tausende Nachkommen haben. Eimeria-Spezies verursachen
Verletzungen im Darm durch Zerstörung
der Epithelzellen, in denen sie sich entwickeln und vermehren, und
sie verursachen Schäden
an der Darmwand.
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Zu
den klinischen Symptomen der Kokzidiose gehört Durchfall, der schleimig
oder blutig sein kann, und Dehydrierung. Auf diese Symptome folgen
ein gesträubtes
Federkleid, Anämie,
Apathie, Gewichtsverlust, Einziehen des Kopfes und des Halses, sowie
Schläfrigkeit.
Sei Legehühnern
wird Kokzidiose normalerweise durch eine verminderte Eierproduktion
entdeckt. Infizierte Vögel
zeigen ein nicht zufriedenstellendes Wachstum. Im Falle von hochvirulenten
Stämmen
von Eimeria ist die Sterblichkeit bei Hühnern gewöhnlich hoch.
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Derzeit
sind sieben Eimeria-Spezies als für Hühner infektiös anerkannt.
Diese Spezies unterscheiden sich im Hinblick auf ihre Biologie und
Pathogenität
erheblich (McDougald et al., 1998). Die Möglichkeit der exakten Identifizierung
von Eimeria-Spezies und -"Stämmen" hat erhebliche Auswirkungen auf
die Diagnose und Kontrolle wie auch auf die Erforschung ihrer Epidemiologie
und Populationsbiologie.
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Herkömmlicherweise
werden Eimeria-Spezies mittels einer Anzahl unterschiedlicher Verfahren
identifiziert, beispielsweise anhand morphologischer Merkmale und/oder
der Morphometrie ihrer Oozysten oder Sporozysten (Größe, Form,
Länge und
Breite), ihrer Entwicklungsmuster, der Art der verursachten Läsionen, ihres
bevorzugten Vorkommens im Darm, oder der Sporulationszeiten und
des Reproduktionsindexes. Diese Kriterien können jedoch unzuverlässig sein
(Eckert et al., 1995). Biochemische, immunologische und molekulare
Verfahren (Andrews and Chilton, 1999; Gasser, 1997) können diese
Beschränkungen
zwar überwinden, jedoch
können
sie selbst andere Beschränkungen
aufweisen.
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Auf
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierende Verfahren, bei denen
geeignete Markergene eingesetzt werden, können als alternative verfahren
für die
Identifizierung von Eimeria-Spezies angewendet werden, da man hiermit
in der Lage ist, winzige Mengen parasitären Materials zu amplifizieren
(z.B. Stucki et al., 1993). Allerdings sind die bisher beschriebenen
Verfahren speziesspezifisch und können die Durchführung einer
Reihe unterschiedlicher PCR-Reaktionen
erfordern (unter Verwendung unterschiedlicher Paare speziesspezifischer
Oligonucleotid-Primer), um eine bestimmte Eimeria-Spezies korrekt
zu identifizieren.
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Für die molekulare
Identifizierung und Klassifizierung von Organismen ist die Analyse
kritischer spezifischer Genomregionen erforderlich. Eine solche
Region liegt bei Eukaryo ten innerhalb der ribosomalen DNA (rDNA)
des Kerngenoms. Die rDNA von Eukaryoten ist eine Multigenfamilie,
die aus tandemartig wiederholten Einheiten besteht. Jede Einheit
umfasst einen "external
transcribed Spacer" (ETS),
die die 18S-, 5,8S- und 28S-rRNA kodierenden Gene, getrennt durch "internal transcribed
Spacer"-Regionen
(ITS-1 bzw. ITS-2), und einen intergenischen Spacer (IGS). Innerhalb
dieser Region stellen die Sequenzen von ITS-1 und ITS-2 verlässliche
Markergene für
die Identifizierung von Organismen auf der Artebene zur Verfügung, da
die intraspezifische Variation in diesen Sequenzen normalerweise
niedrig ist, verglichen mit höheren
Niveaus interspezifischer Differenz.
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Es
wurde gezeigt, dass ITS-1 und ITS-2 nützliche Markergene für die Identifizierung
von Eimeria-Spezies (Tsuji et al, 1997; Molloy et al, 1998; Schnitzler
et al, 1999) oder für
die Detektion von Populationsvariationen (Barta et al, 1998) darstellen.
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Es
wurde ein PCR-basierter Test entwickelt, bei dem speziesspezifische
Primer aus der ITS-1-Sequenz zur Typisierung von Proben nach Spezies – auf Basis
der Detektion eines Produktes einer bestimmten Größe auf Agarose-Gelen – verwendet
werden (Schnitzler et al, 1999). Jedoch erlaubt dieser Test nicht
die Analyse von Sequenzvariationen innerhalb eines spezifischen
PCR-Produktes, und es kann ferner von Nachteil sein, dass es sich
um einen speziesspezifischen Test handelt.
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Weiterhin
haben Barta et al 1998 eine Klonierungs/Sequenzierungs-Methode für die Analyse
von Sequenzvariationen so wohl in ITS-1- als auch in ITS-2-Sequenzen
in E. maxima angewendet. Jedoch kann die Anwendung dieser Methode
Beschränkungen
unterliegen, insbesondere dann, wenn eine große Anzahl von Proben analysiert
werden muss, da die Methode arbeitsintensiv, zeitaufwändig und
teuer in der Ausführung
ist. Darüber
hinaus führt
dieses Verfahren nicht notwendigerweise zu einer exakten Aufklärung von
Sequenzvariationen der unterschiedlichen Kopien von rDNA, außerdem ist
es speziespezifisch, und es können
mit diesem Verfahren Artefakte in die Sequenzdaten eingeführt werden
(Gasser, 1997).
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BARTA,
J.R. ("Investigating
phylogenetic relationships within the Apicomplexa using sequence
data: The search for homology",
1997, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 13, 81–88) beschreibt
die Verwendung von "universellen" Polymerase-Kettenreaktion-Primern,
die zu den hochkonservierten Regionen der 18S-, 5,8S- und 28S-rRNA-Gene
komplementär
sind, zur PCR-Amplifikation der 18S- und 5,8S-rRNA-Gene sowie der in höherem Maße variablen
ITS-1- und ITS-2-Regionen. Sequenzdaten der rRNA-Gensequenzen wurden
zur Analyse phylogenetischer Beziehungen zwischen Apicomplexa verwendet.
Bei ITS-1 und ITS-2-Regionen wurde eine ausreichend hohe primäre Sequenzvariation
festgestellt, um für
die Feststellung von Stammvariationen bei fünf Stämmen von Eimeria maxima von
Nutzen zu sein.
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EP-A-0516381
betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einzelner Spezies von
Eimeria mittels PCR-Amplifikation genomischer DNA und nachfolgender
Hybridisierung der PCR-Produkte
mit für
Eimeria-Spezies spezifischen Gensonden aus kleinen rRNA-Untereinheiten
(ssrRNA). Vorzugsweise werden PCR-Primer verwendet, die eine selektive
Amplifizierung jeder dieser ssrRNA-Gen-Einheiten oder Fragmente derselben
ermöglichen.
Ferner sind die Nucleotidsequenzen für die ssrRNA-Gene der verschiedenen
Eimeria-Spezies offenbart.
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Gemäß TURENNE,
C. Y., et al. ("Rapid
identification of fungi by using ITS2 genetic region and an automated
fluorescent capillary electrophoresis system"; 1999, J. Clin. Microbiol., 37, 1846–1851) zeigte
die ITS-2-Region verschiedener Candida-Hefen keine intraspezifische
Variabilität
innerhalb der Spezies, für
die mehr als ein Stamm getestet wurde. Daher kann die interspezifische
Sequenzvariabilität
der ITS-2-Region für die
speziesspezifische Diagnose klinischer Pilz-Isolate genutzt werden.
PCR mit pilzspezifischen Primern, die auf konservierte Sequenzen
der 5,8S- und 28S-rRNA-Gene
abzielen, führt
zu einer Amplifikation der speziesspezifischen ITS-2-Regionen, die
bezüglich
ihrer Amplikonlänge
variabel sind.
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TSUJI,
N. et al. ("Discrimination
of eight chicken Eimeria species using the two-step polymerase chain reaction"; 1997, The Journal
of Parasitology, 83, 966–970)
beschreibt ein Verfahren zur Unterscheidung von 8 Eimeria-Spezies.
In einem ersten Schritt wird das ssrRNA-Gen unter Verwendung konservierter
Sequenzen für
die Apicomplexa-ssrRNA-Gene als Primer amplifiziert. In dem zweiten
Schritt werden die PCR-Produkte einer
zweiten PCR unterzogen, bei der es sich um eine RAPD-PCR ("random amplification
of polymorphic DNA")
handelt und bei der zufällig
ausgewählte
Primer eingesetzt werden. Die Gelanalyse der RAPD-PCR-Produkte ergibt
Banden muster, die zur Identifizierung einzelner Eimeria-Spezies
verwendet werden können.
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Aufgrund
der ökonomischen
Bedeutung der Kokzidiose beispielsweise für die Geflügelindustrie ist es wichtig,
dass eine Identifikation von Eimeria-Spezies problemlos möglich ist,
damit eine schnelle Diagnose der Krankheit und deren Behandlung
schnell erfolgen können.
Weiterhin ist für
die Untersuchung der Epidemiologie der Krankheiten und für die Kontrolle
der Reinheit von Laborlinien von Eimeria eine empfindliche und zuverlässige Identifizierung
von Eimeria wünschenswert.
Demgemäß besteht
ein Bedarf an der Entwicklung eines Tests für die schnelle Identifizierung
von Eimeria-Spezies, der die Beschränkungen der vorstehend beschriebenen
Tests nicht aufweist.
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Insbesondere
bestand die mit der vorliegenden Erfindung zu lösende Aufgabe in der Bereitstellung von
Primern, die für
die gattungsspezifische PCR-Amplifikation von spezifischen Regionen
der rDNA von Eimeria geeignet sind, sowie in der Bereitstellung
von Verfahren zur Detektion und Unterscheidung von Eimeria-Spezies
auf der Basis der PCR-Amplifikation dieser Regionen der rDNA. Diese
Aufgabe wird mit der vorliegenden Erfindung wie folgt gelöst:
Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Oligonucleotid, das wenigstens
15 aufeinander folgende Basen der als SEQ ID NO: 25 bezeichneten
DNA-Sequenz umfasst, oder ein anlagerndes Äquivalent davon, wobei das
Oligonucleotid unter den Bedingungen einer PCR zur spezifischen
Hybridisierung an eine zu den wenigstens 15 aufeinander folgenden
Basen komplementäre
Zielsequenz in der Lage ist und wobei das Oligonucleotid so gestaltet
ist, dass es die Verlängerung
der DNA während
der PCR initiiert.
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Vorzugsweise
umfasst das Oligonucleotid die als SEQ ID NO: 25 bezeichnete Sequenz.
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Alternativ
hierzu ist das Oligonucleotid aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID
NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 15 ausgewählt.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Oligonucleotid
bereitgestellt, dass wenigstens 15 aufeinander folgende Basen der
als SEQ ID NO: 26 bezeichneten DNA-Sequenz umfasst, oder ein anlagerndes Äquivalent
davon, wobei das Oligonucleotid unter den Bedingungen einer PCR
zur spezifischen Hybridisierung an eine zu den wenigstens 15 aufeinander
folgenden Basen komplementäre
Zielsequenz in der Lage ist und wobei das Oligonucleotid so gestaltet
ist, dass es die Verlängerung
der DNA während
der PCR initiiert.
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Vorzugsweise
umfasst das Oligonucleotid die als SEQ ID NO: 26 bezeichnete Sequenz.
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Alternativ
hierzu ist das Oligonucleotid aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID
NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 16 ausgewählt.
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Gemäß einem
dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Oligonucleotid
bereitgestellt, das wenigstens 15 aufeinander folgende Basen der
als SEQ ID NO: 27 bezeichneten DNA-Sequenz umfasst, oder ein anlagerndes Äquivalent
davon, wobei das Oligonucleotid unter den Bedingungen einer PCR zur
spezifischen Hybridisierung an eine zu den wenigstens 15 aufeinander
folgenden Basen komplementäre
Zielsequenz in der Lage ist und wobei das Oligonucleotid so gestaltet
ist, dass es die Verlängerung
der DNA während
der PCR initiiert.
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Vorzugsweise
umfasst das Oligonucleotid die als SEQ ID NO: 27 bezeichnete Sequenz.
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Alternativ
hierzu ist das Oligonucleotid aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID
NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 und SEQ ID NO: 23 ausgewählt.
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Gemäß einem
vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Oligonucleotid
bereitgestellt, das wenigstens 15 aufeinander folgende Basen der
als SEQ ID NO: 28 bezeichneten DNA-Sequenz umfasst, oder ein anlagerndes Äquivalent
davon, wobei das Oligonucleotid unter den Bedingungen einer PCR
zur spezifischen Hybridisierung an eine zu den wenigstens 15 aufeinander
folgenden Basen komplementäre
Zielsequenz in der Lage ist und wobei das Oligonucleotid so gestaltet
ist, dass es die Verlängerung
der DNA während
der PCR initiiert.
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Vorzugsweise
umfasst das Oligonucleotid die als SEQ ID NO: 28 bezeichnete Sequenz.
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Alternativ
hierzu ist das Oligonucleotid aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID
NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 und SEQ ID NO: 24 ausgewählt.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein PCR-Primer-Paar
bereitgestellt, wobei es sich bei einem der Primer um einen Primer
handelt, der wenigstens 15 aufeinander folgende Basen der als SEQ
ID NO: 25 bezeichneten DNA-Sequenz umfasst, oder um ein anlagerndes Äquivalent
davon, und wobei es sich bei dem zweiten Primer um einen Primer
handelt, der wenigstens 15 aufeinander folgende Basen der als SEQ
ID NO: 26 bezeichneten DNA-Sequenz umfasst, oder um ein anlagerndes Äquivalent
davon.
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Vorzugsweise
umfasst das PCR-Primer-Paar einen Primer, der die als SEQ ID NO:
25 bezeichnete DNA-Sequenz umfasst, sowie einen zweiten Primer,
der die als SEQ ID NO: 26 bezeichnete DNA-Sequenz umfasst. Alternativ
hierzu umfasst das PCR-Primer-Paar eine der Sequenzen SEQ ID NO:
9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15, und eine der
Sequenzen SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID
NO: 16.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein PCR-Primer-Paar
bereitgestellt, wobei es sich bei einem der Primer um einen Primer
handelt, der wenigstens 15 aufeinander folgende Basen der als SEQ
ID NO: 27 bezeichneten DNA-Sequenz umfasst, oder um ein anlagerndes Äquivalent
davon, und wobei es sich bei dem zweiten Primer um einen Primer
handelt, der wenigstens 15 aufeinander folgende Basen der als SEQ
ID NO: 28 bezeichneten DNA-Sequenz umfasst, oder um ein anlagerndes Äquivalent
davon.
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Vorzugsweise
umfasst dieses PCT-Primer-Paar einen Primer, der die als SEQ ID
NO: 27 bezeichnete DNA-Sequenz umfasst, und einen Primer, der die
als SEQ ID NO: 28 bezeichnete DNA-Sequenz umfasst. Alternativ hierzu
umfasst das PCR-Primer-Paar
eine der Sequenzen SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 oder
SEQ ID NO: 23, und eine der Sequen zen SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:
20, SEQ ID NO: 22 oder SEQ ID NO: 24.
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Vorzugsweise
sind die hier beschriebenen PCR-Primer-Paare für die gattungsspezifische Amplifikation
spezifischer Regionen der rDNA von Eimeria ausgelegt.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Identifizierung von Eimeria in einer Probe bereitgestellt, wobei
das Verfahren folgende Schritte umfasst:
Bereitstellen einer
Probe, welche die zu testende genomische Original-DNA umfasst;
Bereitstellen
genomischer DNA eines oder mehrerer Standards bekannter Identität;
Bereitstellen
eines PCR-Primer-Paares, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus
- (i) Primern, die wenigstens 15 aufeinander
folgende Basen der als SEQ ID NO: 25 und SEQ ID NO: 26 bezeichneten
DNA-Sequenz umfassen, oder anlagernden Äquivalenten davon; oder
- (ii) Primern, die wenigstens 15 aufeinander folgende Basen der
als SEQ ID NO: 27 und SEQ ID NO: 28 bezeichneten DNA-Sequenzen umfassen,
oder anlagernden Äquivalenten
davon;
Amplifizieren eines Abschnitts originaler DNA mittels
PCR unter Verwendung des Primer-Paares, um ein PCR-Produkt oder
mehrere PCR-Produkte aus der Probe und aus dem besagten einen Standard
oder den besagten mehreren Standards bekannter Identität zu erzeugen;
Vergleichen
des besagten einen, aus der Probe gewonnenen PCR-Produktes oder
der besagten mehreren, aus der Probe gewonnenen PCR-Produkte mit
einem oder mehreren PCR-Produkten
des besagten einen Standards oder der besagten mehreren Standards
bekannter Identität;
und
Identifizieren der in der Probe vorliegenden Eimeria-Spezies.
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Vorzugsweise
umfasst das PCR-Primer-Paar Primer, welche die als SEQ ID NO: 25
und SEQ ID NO: 26 bezeichneten Sequenzen umfassen. Alternativ dazu
umfasst das PCR-Primer-Paar eine der Sequenzen SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 15, und eine der Sequenzen
SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 oder SEQ ID NO: 16.
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Alternativ
dazu umfasst das PCR-Primer-Paar die Primer, welche die als SEQ
ID NO: 27 und SEQ ID NO: 28 bezeichneten Sequenzen umfassen. Alternativ
umfasst das PCR-Primer-Paar eine der Sequenzen SEQ ID NO: 17, SEQ
ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 oder SEQ ID NO: 23, und eine der Sequenzen
SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 oder SEQ ID NO: 24.
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Vorzugsweise
werden pro zu testender Probe zwei PCR durchgeführt und wobei für jede PCR
ein anderes Primer-Paar verwendet wird.
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Alternativ
dazu wird pro zu testender Probe eine PCR durchgeführt und
beide Primer-Paare innerhalb dieser einen PCR bereitgestellt.
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Vorzugsweise
werden das PCR-Produkt oder die PCR-Produkte, das/die aus der Probe
gewonnen wurden, mit dem PCR-Produkt oder den PCR-Produkten des
Standards oder der Standards bekannter Identität mittels Gel-Elektrophorese
verglichen.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei der Gel-Elektrophorese um DPGE. Als Alternative
handelt es sich bei der Gel-Elektrophorese
um SSCP. Eine weitere Alternative besteht darin, sowohl DPGE als
auch SSCP einzusetzen.
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Vorzugsweise
wird die Gel-Elektrophorese in einem automatisierten System durchgeführt.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines
der hier beschriebenen Oligonucleotide, oder eines der anlagernden Äquivalente
davon, zur Identifizierung von Eimeria-Spezies bereitgestellt.
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ZEICHNUNGEN
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Diese
sowie weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung, die in allen ihren
neuen Aspekten erwogen werden sollte, werden anhand der nachfolgenden
Beschreibung ersichtlich, welche hier lediglich beispielhaft aufgeführt ist
und in der auf die beiliegenden Zeichnungen Bezug genommen wird;
diese Zeichnungen zeigen:
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1:
E. tenella ITS-1-Sequenz (SEQ ID NO:1), amplifiziert mit dem Primer-Paar
WW1 und WW3r (in Kursivschrift); die unterstrichene Sequenz stellt
ITS-1 und die Sequenz in normaler Schrift das 3'-Ende der 18S-rDNA und das 5'-Ende der 5,8S-rDNA dar.
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2:
E. tenella ITS-2-Sequenz (SEQ ID NO: 2), amplifiziert mit dem Primer-Paar
WW2 und WW4r (dargestellt in Kursivschrift), die unterstrichene
Sequenz stellt ITS-2 und die Sequenz in normaler Schrift das 3'-Ende der 5,8S-rDNA
und das 5'-Ende
der 28S-rDNA dar;
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3:
Agarose-Gel, das ITS-1- oder ITS-2-PCR-Produkte zeigt, die für E. acervulina,
E. brunetti, E. maxima, E. necatrix; E. tenella (A, B, M, N bzw.
T) stehen. Kontrollen mit Hühner-DNA
und ohne DNA (C bzw. -);
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4:
DPGE-Analyse von ITS-1- oder ITS-2-PCR-Produkten, amplifiziert aus
mehreren Oozystenisolaten, wobei die Produkte fünf Eimeria-Spezies aus Hühnern repräsentieren,
und zwar in folgender Reihenfolge: E. acervulina (Isolate A7, A2,
A12 und A3), E. brunetti (Isolate B1 und B5), E. maxima (Isolate
M1 und M2), E. necatrix (Isolate N1, N5 und N10) und E. tenella
(Isolate T6, T5, T7, T3 und T4) (vgl. Tabelle 1);
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5:
SSCP-Analyse von ITS-1- oder ITS-2-PCR-Produkten, amplifiziert aus
mehreren Oozystenisolaten, wobei die Produkte fünf Eimeria-Spezies aus Hühnern repräsentieren,
und zwar in folgender Reihenfolge: E. acervulina (Isolate A7, A2,
A12 und A3), E. brunetti (Isolate B1 and B5), E. maxima (Isolate
M1 and M2), E. necatrix (Isolate N1, N5 und N10) und E. tenella
(Isolate T6, T5, T7, T3 und T4) (siehe Tabelle 1);
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6 Fähigkeit
des DPGE-Verfahrens zur spezifischen Detektion mehrerer Eimeria-Spezies
in Proben. Darstellung A zeigt die Detektion von Eimeria maxima
in Gegenwart eines Überschusses
an E. acervulina (DNA der Isolate A7 bis M1, gemischt im Verhältnis 1:10–1,
1:10–2,
1:10–3 und
1:10–4)
. Darstellung B zeigt die Detektion einer bestimmten Spezies (zweites
Isolat) in Gegenwart (+) von 100facher Überschuss an DNA einer heterologen
Spezies (erstes Isolat), für
alle möglichen
Kombinationen der dargestellten Spezies E. acervulina, E. brunetti,
E. maxima, E. necatrix und E. tenella, repräsentiert durch die Isolate
A7, B1, M1, N1 bzw. T6 (siehe Table 1);
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7:
Agarose-Gel (oben) und DPGE-Gel (unten), das ITS-2-PCR-Produkte zeigt, die aus Oozystenisolaten
amplifiziert sind und sieben verschiedene Spezies von Eimeria aus
Hühnern
repräsentieren.
Spuren: E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix,
E. praecox and E. tenella (A, B, M, μ, N, P bzw. T) (vgl. 3 and 4).
Die dargestellten Isolate sind A7, B1, M1, μ2, N1, P4 and T6 (vgl. Tabelle
1);
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8:
Chromatogramme, die fluoreszenzmarkierte ITS-2-PCR-Produkte zeigen, die aus sieben
Eimeria- Spezies
aus Hühnern
(Spuren A, B, M, μ,
N, P und T stehen für
E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E.
praecox bzw. E.tenella) sowie aus drei australischen Isolaten aus
Farmhühnern,
welche eine Mischung von Eimeria-Spezies enthielten (Spuren X9,
X15 und X7, vgl. Tabelle 2), amplifiziert wurden. Die Produkte wurden
auf einem DPGE-Gel in einem automatisierten 377-DNA-Sequenzierer
(Applied Biosystems, USA) getrennt, und die Chromatogramme mit der
GeneScan® 3.1-Software
erzeugt. Bei E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. necatrix
and E. tenella wurde kein merklicher Unterschied in der Anzahl und
der Position der Peaks in den Chromatogrammprofilen zwischen/bei
den Proben festgestellt (nicht dargestellt), allerdings wurde eine
gewisse Variation in der relativen Peak-Intensität zwischen einigen Proben,
die eine Spezies repräsentieren,
festgestellt. Sowohl bei E. mitis and E. praecox wurden einige Unterschiede
in den Positionen kleinerer Peaks, die eine Populationsvariation
anzeigen, detektiert (vgl. 9). Zwar
gab es eine gewisse Überlappung
in den Profilen von E. brunetti, E. mitis und E. praecox, doch konnten
speziesspezifische Chromatographie-Peaks für jede der sieben Eimeria-Spezies
(Asteriske) definiert werden, wodurch die Identifizierung der in
den "Farm-Isolaten" vorhandenen Spezies
erleichtert wurde (Markierungen A, B, M, μ, P und T machen die Peaks kenntlich,
die E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. praecox
bzw. E. tenella repräsentieren,
vgl. Tabelle 2). Die dargestellten monospezifischen Isolate sind
A7, B1, M1, μ2,
N1, P4 und T6 (vgl. Tabelle 1); und
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9:
Chromatogramme, die fluoreszenzmarkierte ITS-2-PCR-Produkte zeigen, welche amplifiziert sind
aus unterschiedlichen Abstammungslinien von E. mitis und E. praecox.
Die Produkte wurden auf einem DPGE-Gel in einem automatisierten
377-DNA-Sequenzierer
(Applied Biosystems, USA) getrennt und die Chromatogramme mit der
GeneScan®-3.1-Software generiert.
Sowohl bei E. mitis als auch bei E. praecox wurde eine Variation
in den Positionen kleinerer Peaks, die eine Populationsvariation
anzeigt, festgestellt (vertikale Linien). Die dargestellten E. mitis-Abstammungslinien
sind: Beerwah, Jorgensen, Kelly and Radlands (Isolate μ3, μ4, μ2 und μ5, vgl. Tabelle
1), und die E. praecox-Abstammungslinien sind: MCK, und ARI (Isolate
P2 und P4, vgl. Tabelle 1).
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BEVORZUGTE
AUSFÜHRUNGSFORM
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Das
Folgende ist eine allgemein formulierte Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung bezüglich
der Anwendung der hier beschriebenen neuen Oligonucleotide auf ein
Verfahren zur Identifizierung von Eimeria-Spezies. Die Erfindung
wird weiterhin anhand der weiter unten unter der Unterüberschrift "Experimentelle Basis
der Erfindung" aufgeführten Offenbarung
erläutert,
in der Beispiele für die
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung genannt sind.
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Zwar
betrifft die hier beschriebene Erfindung in erster Linie die Verwendung
der neuen Oligonucleotide als Primer in gattungsspezifischen PCR,
doch ist ersichtlich, dass jedes der hier beschriebenen Oligonucleotide
auch in anderer Weise zur Identifizierung von Eimeria-Spezies eingesetzt
werden kann.
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In
der vorliegenden Beschreibung ist, soweit der Kontext nichts anderes
erfordert, das Wort "umfassen", sowie Varianten
wie "umfasst" und "umfassend", durchweg so zu
verstehen, dass sie eine angegebene Einheit oder einen angegebenen
Schritt, oder eine Gruppe von Einheiten oder Schritten, umfasst,
wobei aber eine andere Einheit oder ein anderer Schritt, oder eine
andere Gruppe von Einheiten oder Schritten, nicht ausgeschlossen
sind.
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Der
Begriff "Gattung", wie hier verwendet,
bezeichnet einen hohen Rang in der taxonomischen Hierarchie und
liegt unter der Familie und über
der Spezies; "Spezies" bezieht sich hier
auf einen niedrigen Rang in der taxonomischen Hierarchie, der unter
der Gattungsebene liegt und die Grenze bei Organismen angibt, innerhalb
der sich Organismen miteinander fortpflanzen können; und "Stamm" bezeichnet hier eine taxonomische Ebene
unterhalb der Spezies-Ebene und kann eine Populationsvariation innerhalb
einer Spezies anzeigen. Demgemäß handelt
es sich bei den als "speziesspezifisch" bezeichneten PCR
um PCR, die nur für
die Amplifikation vorbestimmter DNA-Regionen einer einzigen Spezies
ausgelegt sind. PCR, die als "gattungsspezifisch" bezeichnet werden,
sind für
die Amplifikation vorbestimmter DNA-Regionen einer Mehrzahl von
Spezies, innerhalb einer bestimmten Gattung, ausgelegt.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Fäkalproben von Hühnern so
behandelt, dass die genomische DNA jedes in der Probe vorliegenden
parasitären
Elementes isoliert wird. Es versteht sich, dass jedes für die Isolierung
genomischer DNA von Eimeria geeignete Verfahren angewandt werden
kann, jedoch ist ein bevorzugtes verfahren unter der Überschrift "Experimentelle Basis
der Erfindung; 1 Parasiten und Isolierung genomischer DNA" beschrieben.
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Hauptsächlich wird
die wie oben erwähnt
isolierte DNA gemäß der Erfindung
anschließend
als eine Matrize (das sog. "Template") in einer PCR unter
Verwendung eines der neuen erfindungsgemäßen PCR-Primer-Paare eingesetzt;
WW1 (SEQ ID NO: 25) und WW3r (SEQ ID NO: 26) oder WW2 (SEQ ID NO:
27) und WW4r (SEQ ID NO: 28). Die Sequenzen jedes dieser Primer
sind unter der Unterüberschrift "Experimentelle Basis
der Erfindung; 2 Enzymatische Amplifikation von rDNA" angegeben, und die
Position jedes Primers in Bezug auf die ITS-1 und ITS-2 der Eimeria
rDNA ist in den 1 bzw. 2 wiedergegeben.
Die Primer-Paare der vorliegenden Erfindung ermöglichen die gattungsspezifische
PCR-Amplifikation von Eimeria-ITS-DNA, so dass jedes Paar auf jede
beliebige Probe mit vermuteten Kokzidien anwendbar ist, sowie die
Identifizierung einer beliebigen Anzahl verschiedener Spezies innerhalb
der Gattung Eimeria.
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Erfindungsgemäß ist ein
PCR-Primer (oder Oligonucleotid-Primer)
ein Oligonucleotid, dass unter bestimmten PCR-Bedingungen zur spezifischen Hybridisierung
an eine Region der Template-DNA in der Lage ist, wobei die Region
eine Sequenz aufweist, die im Wesentlichen zu der Primer-Sequenz
komplementär
und so gestaltet ist, dass sie die Verlängerung der DNA während der
PCR initiiert. Es versteht sich, dass eine komplementäre Sequenz
in der Lage ist, zusammen mit ihrem Komplement Watson-Crick-Bindungen
zu bilden, wobei Paare aus Adenin mit Thymin oder aus Guanin mit
Cytosin gebildet werden. Jeder Primer wird typischerweise als ein
Teil eines Primer-Paares verwendet, das einen vorgelagerten 5'-Primer, der mit
dem 5'-Ende des zu
amplifizierenden DNA-Templates
hybridisiert, und einen nachgelagerten 3'-Primer, der mit dem Komplement des
3'-Endes der zu
amplifizierenden Template-DNA hybridisiert, aufweist.
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Für den Durchschnittsfachmann
auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung ist ersichtlich, dass
der Begriff "im
Wesentlichen komplementär", wie hier verwendet,
bedeutet, dass der Primer möglicherweise
nicht 100%ig komplementär
zu seiner Ziel-Template-Sequenz und trotzdem noch in der Lage ist,
sich an letztere, unter geeigneten PCR-Anlagerungsbedingungen, in
einer spezifischen Art und Weise anzulagern.
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Die
Primer gemäß der vorliegenden
Erfindung können
durch eine beliebige Anzahl herkömmlicher DNA-Syntheseverfahren
hergestellt werden. Im vorliegenden Fall wurden die Primer von dem
Hersteller GeneWorks Pty Ltd., PO Box 11, Rundle Mall, Adelaide,
SA 5000, Australien käuflich
erworben.
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Gemäß der bevorzugten
Ausführungsform
wurden optimale Ergebnisse durch Verwendung von Primern erzielt,
die in ihrer Länge
und Sequenz mit den oben erwähnten
Primern WW1 und WW3r und/oder WW2 und WW4r identisch waren. Wie
für den
Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet klar ersichtlich, können jedoch Änderungen
an den Primern vorgenommen werden, ohne die Gattungsspezifität der PCR-Amplifikation
und die Effizienz des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens zu vermindern.
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Zum
einen kann die Länge
der verwendeten Primer variiert werden. Beispielsweise wird in der
vorliegenden Erfindung berücksichtigt,
dass kürzere
Primer, die wenigstens 15 aufeinander folgende Basen der Nucleotidsequenzen
dieser Primer enthalten, geeignet sein können. In ähnlicher Weise können die
Primer auch verlängert
werden. Hierbei ist die genaue Obergrenze der Länger der Primer nicht entscheidend.
Jedoch enthalten die Primer typischerweise etwa 30 Basen oder weniger,
und vorzugsweise 26 Basen oder weniger. Beispielsweise wird berücksichtigt,
dass der Primer WW1 um bis zu 10 Nucleotide an seinem 3'-Ende (TCT AAA GGA
T), (SEQ ID NO: 3) verlängert
werden kann, WW2 um bis zu 4 Nucleotide an seinem 5'-Ende (CAGC), (SEQ
ID NO: 4), WW3r um bis zu 5 Nucleotide an seinem 3'-Ende (GTT TT), (SEQ
ID NO: 5) oder um bis zu 10 Nucleotide an seinem 5'-Ende (ATG CGT GAG
C), (SEQ ID NO:6) und WW4r um bis zu 10 Nucleotide an beiden Enden
(3'-Ende, ACT GAT
TTC A, (SEQ ID NO: 7) und 5'-Ende,
TGA TAT GCT T, (SEQ ID NO: 8)). Zusätzlich können auch nichtkomplementäre Nucleotidfragmente
an dem 5'-Ende der
Primer angefügt
werden, wodurch deren Länge
effektiv vergrößert wird.
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Zum
anderen werden in der vorliegenden Erfindung kleinere Änderungen
(bzw. zurückhaltende Änderungen)
an der Sequenz der Primer berücksichtigt,
welche die Fähigkeit
zur Anlagerung an deren spezifische Ziel-DNA sowie zur anschließenden Initiierung
der Verlängerung
während
der PCR nicht wesentlich beeinträchtigen.
Beispielsweise kann jedes beliebige einzelne Nucleotid, oder eine
Mehrzahl von Nucleotiden, eines Primers durch alternative Nucleotide
ersetzt werden, die an der betreffenden Stelle der Änderung
bei der Anlagerung des Primers an die Template-DNA während der
PCR keine Watson-Crick-Basenpaarung erlauben, aber trotzdem die
Fähigkeit
des Primers zur Initiierung der Verlängerung während der PCR nicht wesentlich beeinträchtigen.
Solche alternativen Primer können
als "anlagernde Äquivalente" der hier beschriebenen
Primer WW1, WW3r, WW2 oder WW4r und deren Varianten bezeichnet werden.
Derartige anlagernde Äquivalente
enthalten mindestens 15 Nucleotide und sind so gestaltet, dass sie
sich an eine Zielsequenz unter geeigneten PCR-Anlagerungsbedingungen
anlagern. Im Allgemeinen umfassen für solche anlagernden Äquivalente
geeignete PCR-Anlagerungsbedingungen
die Verwendung einer PCR-Reaktionsmischung oder Puffers mit 3–7 mM MgCl2. Es wird erachtet, dass Anlagerungstemperaturen
zwischen 45 °C
und 52 °C
für die
meisten anlagernden Äquivalente
geeignet sein können.
Zur weiteren Verdeutlichung sei erwähnt, dass bei Änderung von
5 Nucleotiden innerhalb einer bestimmten Primersequenz in einer
in diesem Abschnitt beschriebenen Weise und einer zentralen Verteilung
dieser Änderungen
entlang der Primersequenz, so sinkt die bevorzugte Anlagarungstemperatur
dieses Primers wahrscheinlich um etwa 5 °C. Der Begriff "Zielsequenz", wie in diesem Abschnitt
verwendet, bezeichnet eine Sequenz, die zu mindestens 15 aufeinander
folgenden Basen der Sequenz eines der Primer WW1, WW3r, WW2 oder
WW4r komplementär
ist.
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Es
ist ersichtlich, dass die Nützlichkeit
von alternativen Sätzen
von Primern gemäß der vorliegenden Erfindung,
welche um die erfindungsgemäßen Primer
WW1 und WW3r, und/oder WW2 und WW4r entworfen wurden, zumindest
theoretisch, mittels geeigneter Software und der DNA-Sequenz-Information
bezüglich
der ITS-1- und ITS-2- und flankierender Regionen bewertet werden
kann. Zu derartigen Software-Paketen zählen z.B. PC Oligo5 (National
Bioscience Inc) oder Amplify (University of Wisconsin).
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Beispiele
für Variationen
der Primer WW1, WW3r, WW2 und WW4r, die für die vorliegende Erfindung geeignet
sein können,
sind:
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-
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Zwar
wurden die hier offenbarten neuen Oligonucleotide oder Primer und
deren Varianten entwickelt, um die gattungsspezifische PCR-Amplifikation
von ITS-1- und ITS-2-Regionen zu ermöglichen, doch ist ersichtlich,
dass sie ebenfalls, entweder einzeln oder kombiniert, für verschiedene
andere Anwendungen geeignet sind. So können sie beispielsweise als
molekulare Sonden oder Primer für
andere Diagnoseverfahren (wie z.B. LCR, Ligase-Kettenreaktion, oder
quantitative PCR) eingesetzt werden. Für den Fachmann auf dem Gebiet
ist es leicht ersichtlich, mit welchen Mitteln solche Anwendungen
unter Verwendung von Standardverfahren des Standes der Technik realisiert
werden können.
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Im
Allgemeinen ist lediglich eine PCR, unter Verwendung eines einzigen
Primer-Satzes, erforderlich, um die in einer Probe vorliegenden
Eimeria-Spezies zu identifizieren. Jedoch ist ersichtlich, dass
gegebenenfalls eine parallele PCR unter Verwendung des zweiten Primer-Satzes,
durchgeführt
werden kann, um eine weitere Klärung
der Identität
einer in einer Probe vorliegenden Spezies zu erreichen. In ähnlicher
Weise können
bei einer Optimierung der PCR- Bedingungen
beide neuen Primer-Sätze
in einer einzigen PCR verwendet werden.
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Zur
anschließenden
Detektion der PCR-Produkte werden die Primer vorzugsweise mit [γ-33P]ATP endmarkiert. Alternativ hierzu können andere
Mittel zur Markierung der PCR-Produkte eingesetzt werden; beispielsweise
die Einfügung
von [α-32P]dNTP
während
der PCR-Amplifikation. Mit größerem Vorzug
können nichtradioaktive
Markierungssysteme, unter Verwendung von Digoxygenin, Biotin und
dergleichen, verwendet werden. Derartige nichtradioaktive Markierungssysteme
sind im Stand der Technik wohlbekannt und können dementsprechend von einem
Durchschnittsfachmann ohne Schwierigkeiten angewendet werden. Ein
Beispiel hierfür
ist jedoch unter der Überschrift "Experimentelle Basis
der Erfindung – 7
Beispiel für
die Verwendung einer fluoreszenzbasierten Elektrophorese-Detektion" aufgeführt. Es
ist ersichtlich, dass die nichtradioaktive Markierung zur Endmarkierung
eines bestimmten Primers verwendet oder dass sie in den Primer und/oder
das PCR-Produkt eingearbeitet werden kann.
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Jede
PCR wird mit wenigstens einer monospezifischen Kontrollprobe oder
einem Standard bekannter Speziesidentität durchgeführt. Wie ersichtlich, können Kontrollproben,
die mehr als eine bekannte Spezies enthalten, verwendet werden.
Negativ-Kontrollen, die keine Eimeria-Template-DNA enthalten, werden
ebenfalls mit den Proben verglichen. Es ist ersichtlich, dass andere
Standardkontrollen, welche routinemäßig im Stand der Technik eingesetzt
werden, ebenfalls mit den Proben verglichen werden können.
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Die
genomische Eimeria-DNA der Kontrolle oder der Standards mit bekannten
Eimeria-Arten kann in ähnlicher
weise wie die genomische DNA unbekannter Proben gereinigt werden.
Zu diesem Zweck können beispielsweise
die von Medichick Laboratories (Australien) oder Animal Research
Institute des Queensland Department of Primery Industries (Australien)
erhältlichen
Laborlinien von Eimeria-Spezies bekannter Identität Verwendung
finden.
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Die
Amplifikation wird gemäß Verfahrensabläufen durchgeführt, welche
herkömmlicher
Weise auf dem technischen Gebiet, auf das sich diese Erfindung bezieht,
verwendet werden; Beispiele hierfür sind in dem US-Patent 4,683,202
beschrieben. Vorzugsweise enthalten Standard-PCR gemäß der vorliegenden
Erfindung 0,1 μM–1 μM jedes Primers,
200 μM jedes
dNTP, 3–7
mM MgCl2 und 1 U Taq-DNA-Polymerase (Promega). Typischerweise
ist jede PCR mit einem Mineralöl
oder dergleichen bedeckt, um ein Verdampfen der Reaktionsmischung
während
des Zyklierens zu verhindern. Die PCR-Zyklen laufen vorzugsweise
unter den folgenden Bedingungen ab: Denaturierung bei einer Temperatur
von 94 °C
für etwa
15 bis 30 Sekunden, Anlagern ("Annealing") bei einer Temperatur
von 45 °C
bis 60 °C
für 15
bis 30 Sekunden und Verlängerung
("Extension") bei einer Temperatur
von 72 °C
für 15
bis 30 Sekunden. Vorzugsweise werden 30 bis 35 Zyklen durchgeführt. Insbesondere
können
die folgenden PCR-Bedingungen für
die bevorzugten Primerpaare, WW1 und WW3r, sowie WW2 und WW4r, der
Erfindung geeignet sein:
-
-
Wie
für den
Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet ersichtlich, sind die hierin
genannten PCR-Bedingungen lediglich als Beispiele aufgeführt und
können
variiert werden, um die Bedingungen beispielsweise für solche
Fälle,
in denen alternative PCR-Zyklierer oder DNA-Polymerasen eingesetzt
werden, die Template-DNA in einer anderen Qualität vorliegt oder in denen Primer-Varianten,
die hier nicht spezifisch aufgeführt sind,
verwendet werden, zu optimieren, ohne dabei den Schutzumfang der
vorliegenden Erfindung zu verlassen. Die PCR-Bedingungen können beispielsweise
durch Änderung
der Konzentration der verschiedenen Komponenten in der Reaktion
und/oder durch Änderung
der Komponenten der Reaktion, Ändern
der Anzahl der Amplifikationszyklen, der Denaturierungs-, Anlagerungs-
oder Verlängerungszeiten
oder -temperaturen oder der Menge der Template-DNA verändert oder optimiert werden.
Für den
Fachmann ist ersichtlich, dass es auch eine Reihe von anderen Möglichkeiten
gibt, um die PCR-Bedingungen zu optimieren und somit die Variabilität zwischen
den Reaktionen zu überwinden.
Die PCR-Bedingungen können
durch eine Routine-Analyse auf der Basis der oben genannten Faktoren,
welche im Stand der Technik wohl bekannt sind, optimiert werden.
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Wie
ersichtlich können
geeignete PCR-Anlagerungstemperaturen für einen jeglichen Primer, der
im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegt, falls in dieser
Beschreibung nicht im Einzelnen aufgeführt, aus der berechneten Schmelztemperatur
des betreffenden Primers hergeleitet werden. Solche Schmelztemperaturen
können
unter Anwendung von Standardformeln, wie die in Sambrook, 1989,
beschriebene, berechnet werden. Es versteht sich für den Durchschnittsfachmann
auf dem Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht,
dass die Anlagerungstemperaturen über oder unter den Schmelztemperaturen
liegen können, jedoch
ist im Allgemeinen eine Anlagerungstemperatur, die etwa 5 °C über der
errechneten Schmelztemperatur des Primers liegt, geeignet.
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PCR-Produkte,
die durch Amplifikation von ITS-1- und ITS-2-Regionen sowohl von unbekannten Proben
als auch von relevanten Kontrollproben oder Standards bekannter
Identität
erhalten wurden, können
mittels elektrophoretischer Trennung detektiert werden. Elektrophorese-Verfahren,
die für
geringfügige
Unterschiede in der Größe von PCR-Produkten
und/oder in deren Sequenz empfindlich sind, sind bevorzugt. Besonders
geeignet sind bei optimierten Bedingungen beispielsweise die Yerfahren
der SSCP ("single-strand conformation
polymorphism") und/oder
DPGE ("denaturing
polyacrylamide gel electrophoresis"), da man mit ihnen in der Lage ist,
zwischen den untersuchten Proben Unterschiede bezüglich einer
einzelnen Base in der Sequenz oder die Veränderung der Länge durch
ein einziges Nucleotid zu detektieren. Außerdem sind diese Verfahren
gut für
das Screening von großen
Probenzahlen geeignet.
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Die
SSCP-Analyse ist bereits beschrieben worden (Orita et al, 1989).
Im Allgemeinen kann jedes PCR-Produkt als Einzelstrang-Moleküle durch
Elektrophorese in einem nicht denaturierenden Polyacrylamidgel getrennt
werden. Die Technik basiert auf der Tatsache, dass sich ein Einzelstrang-DNA-Molekül anders
faltet als ein anderes Einzelstrang-DNA-Molekül, wenn sich seine Sequenz
in einer einzelnen Base oder in mehreren Basen unterscheidet; Unterschiede
in der Tertiärstruktur
führen
zu Unterschieden in der Mobilität
während
der Elektrophorese.
-
Für den Durchschnittsfachmann
auf dem Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht,
versteht sich, dass sich die Tertiärstruktur einer Einzelstrang-DNA
unter unterschiedlichen physikalischen Bedingungen, z.B. Temperatur
und Ionenumgebung, verändert.
Folglich hängt
die Empfindlichkeit der SSCP von diesen wie auch von vielen anderen
Bedingungen ab, wie etwa der Länge
des PCR-Produktes. Im Falle der vorliegenden Erfindung hat sich
herausgestellt, dass die folgenden Bedingungen bevorzugt sind, allerdings versteht
sich, dass diese Bedingungen geändert
werden können,
um unterschiedliche Laborbedingungen und -ausrüstung zu berücksichtigen:
0,4 bis 0,6× MDE
("mutation detection
enhancement"; FMC
BioProducts), enthaltend 0,5 bis 1,5× TBE, und Elektrophorese bei
7 bis 40 W für
etwa 17 h bei 15 °C.
Insbesondere können die
folgenden Bedingungen mit der Erfindung angewendet werden:
-
-
DPGE
ist bereits beschrieben worden und auf dem Gebiet, auf das sich
die vorliegende Erfindung bezieht, wohlbekannt. Bei der DPGE wird
jeder Strang eines DNA-Moleküls
von seinem komplementären
Strang getrennt und unter denaturierenden Bedingungen auf einem
Polyacrylamidgel laufen gelassen. Unter solchen Bedingungen werden
die beiden Stränge
eines beliebigen DNA-Moleküls
daran gehindert, während
der Elektrophorese wieder miteinander zu hybridisieren, so dass
die einzelnen Stränge
getrennt voneinander innerhalb des Gels wandern. DPGE ist ein empfindliches
System, das in der Lage ist, Unterschiede in der Länge von zwei
beliebigen DNA-Molekülen zu identifizieren,
bis hin zu einem Unterschied von einem einzigen Nucleotid.
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Für die DPGE
ist die folgende Bandbreite von Bedingungen bevorzugt, allerdings
können
diese, wie im Falle der SSCP, geändert
werden, um eine Vielzahl anderer Laborvariablen zu berücksichtigen,
ohne dabei den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zu verlassen:
0,4 mm dickes Gel aus 4 bis 6 Polyacrylamid, das 42 % Harnstoff
und 1×TBE
enthält
und einer Elektrophorese bei 20 bis 50 W für etwa 4 h bei 40 °C unterzogen wird.
Insbesondere können
die folgenden Bedingungen in der vorliegenden Erfindung zum Einsatz
kommen:
-
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Es
ist zu beachten, dass DPGE für
die Identifizierung von Spezies bevorzugt ist, während SSCP für die Detektion
von Populationsvariationen innerhalb einer Spezies bevorzugt wird,
obwohl beide Verfahren für die
Identifizierung von Spezies geeignet sind. Es versteht sich daher,
dass entweder SSCP oder DPGE alleine angewendet werden können, um
Eimeria-Spezies zu identifizieren oder diagnostizieren. Jedoch umfasst
die vorliegende Erfindung auch die parallele Anwendung beider Techniken,
um zu einem besseren Verständnis der
Identität
der in einer bestimmten Probe enthaltenen Eimeria-Spezies zu gelangen.
In ähnlicher
Weise umfasst die vorliegende Erfindung die Anwendung anderer komplementärer Verfahren
wie beispielsweise die Agarosegelelektrophorese und die DNA-Sequenzierung.
-
Nach
der Trennung der PCR-Produkte mittels Elektrophorese können die
Gele gemäß Standardverfahren
(z.B. im Falle von Polyacrylamidgelen Trocknen auf Filter- oder
Löschpapier)
behandelt und über
einen Zeitraum der ausreicht, um die Position der PCR-Produkt-Banden
auf einem Gel zeigen zu können,
einer Autoradiographie unterzogen werden.
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Die
Methodik der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise auf ein automatisiertes
(fluoreszenzbasiertes) elektrophoretisches System ausgerichtet;
beispielsweise ein automatisierter Sequenzierer der Fa. Applied Biosystems
(ABI), verbunden mit einer geeigneten Computerhardware und -software.
Auf diese Weise können spezifische "Fingerabdrücke" einzelner Eimeria-Spezies
aufgenommen, gespeichert (für
Protokolle und Berichte) und mit Standardproben mit bekanntem Spezies-Status
verglichen werden. Solche elektrophoretischen Verfahren sind Standardverfahren,
die vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet üblicher Weise angewendet und
verstanden werden. Ein spezifisches Beispiel für ein solches System ist jedoch
in dieser Beschreibung unter der Überschrift "Experimentelle Basis der Erfindung – 7 Beispiel
für die
Anwendung der fluoreszenzbasierten Elektrophorese-Detektion".
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Es
ist ersichtlich, dass falls mit der vorliegenden Erfindung ein automatisiertes
System eingesetzt wird, die Standardbedingungen, die im Allgemeinen
für die,
manuelle SSCP und DPGE, wie sie in dieser Beschreibung beschrieben
und erläutert
sind, gelten, möglicherweise
geändert
werden müssen,
um dem verwendeten automatisierten System Rechnung zu tragen. Die
geeigneten Bedingungen können
leicht anhand der Anleitung des Herstellers und dementsprechenden üblichen
Optimierungstests, wie sie gewöhnlich
im Stand der Technik Anwendung finden, bestimmt werden.
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Experimentelle
Basis der Erfindung
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1 Parasiten und Isolierung
genomischer DNA
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Australische
Isolate von Eimeria (die monospezifische Linien repräsentieren;
Tabelle 1) wurden in Hühnern,
die frei von spezifischen Pathogenen (SPF) waren, passiert; die
Hühner
wurden in speziell angefertigten Isolatoren unter stringenten Bedingungen
gehalten, um eine Kreuzkontamination zu verhindern. Die Identifikation
der in den Isolaten vorhandenen Spezies erfolgte auf der Basis der
Morphometrie sporulierter Oozysten, der Präpatentperiode und der Lage
großer
Läsionen
im Darm/den Därmen.
Um putative Kontamination von Isolaten mit einer oder mehreren heterologen
Spezies auszuschließen,
wurde das 18S-rRNA-Gen, das ebenfalls eine Identifizierung auf Spezies-Ebene
erlaubt (Barta et al., 1997), aus PCR-Produkten, die aus ausgewählten Oozysten
hergeleitet wurden (siehe 4 unten), sequenziert. Die für einzelne
Spezies bestimmten 18S-Sequenzen waren zu 99–100 % mit den jüngst von
anderen Wissenschaftlern (Barta et al., 1997) veröffentlichten
Sequenzen identisch.
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Für jedes
Isolat wurde Kot von Gruppen von Hühnern gesammelt, und man ließ die Eimeria-Oozysten unter
ständiger
Belüftung
bei 30 °C
für mindestens
48 h sporulieren. Die Oozysten wurden mit gesättigter NaCl-Lösung (Shirley
et al, 1995) isoliert, ausgiebig in 50 ml Volumina H2O
gewaschen und es wurde letztendlich eine wässrige Suspension (10 ml, enthaltend
5 × 106 Oozysten) hergestellt. Die Oozysten wurden
sodann unter Verwendung eines Sucrose-Gradienten-Zentrifugationsverfahrens (Gasser et
al, 1987) gereinigt, wodurch PCR-inhibierende Fäzes-Bestandteile beseitigt
wurden, gewaschen (wie oben angegeben) und dann in 1 ml H2O resuspendiert. DNA wurde aus den Oozysten
unter Verwendung eines Wizard® Genomic DNA Purification
Kit (Promega, WI, USA) isoliert. Kurz gesagt, wurde jede wässrige Suspension
von Oozysten in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen übertragen, bei 13000 g 5 min
lang zentrifugiert und in 300 μl
Nuclei Lysis Solution (Promega, WI, USA) resuspendiert. Das gleiche
Volumen Glasperlen (2 mm Durchmesser) wurde hinzugefügt und das
Röhrchen
3–5 min
lang stark gevortext, bis > 90
der Oozysten aufgebrochen waren (ermittelt durch lichtmikroskopische
Untersuchung winzig kleiner Subaliquote bei 400facher Vergrößerung).
Die Sporozysten enthaltende Suspension wurde dann in neue Eppendorf-Röhrchen transferiert,
die Glaskügelchen
entfernt, Proteinase K (150 μg
ml–1)
und Natriumdodecylsulfat (5 % Gew./Vol.) hinzugegeben, anschließend wurde
bei 37 °C
inkubiert, bis > 90
% der Sporozysten aufgebrochen waren (~4 h). Dieses Lysat wurde
dann bei 13000 g 5 min lang zentrifugiert, um die Oozysten- und
Sporozystenwände
zu pelletieren, und der Überstand
in ein frisches Röhrchen
transferiert. Die DMA wurde aus dem Überstand gemäß "yeast DNA protocol" (Promega) herausgereinigt
und in 50 μl
H2O eluiert. Die einzelne Proben wurden
auf mit Ethidiumbromid eingefärbten 2%igen
Agarose-Tris-Borat-EDTA-Gelen
(TBE = 65 mM Tris-HCl, 27 mM Borsäure, 1 mM EDTA, pH 9; Bio-Rad,
Richmond, CA, USA) geprüft,
und zwar unter Verwendung spezifischer Verdünnungen von γ-Phage-DNA
(Promega, WI, US) als Längenstandard,
die auch zur annä hernden
Bestimmung der DNA-Konzentrationen verwendet wurden. Die Mengen
der genomischen DNA, die aus den einzelnen Isolaten (+ 5 × 106 Oozysten) isoliert wurden, wurden auf 1–2,5 μg geschätzt.
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Tabelle
1. Isolate, die unterschiedliche Eimeria-Spezies repräsentieren. Alle Isolate wurden
von Hühnerherden in
Australien gewonnen und wurden als monospezifische Linien gehalten.
Die MCK-Linien wurden von Medichick Laboratories (Australien) gestellt;
die anderen wurden vom Animal Research Institute des Queensland Department
of Primery Industries (Australien) erhalten.
-
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2 Enzymatische Amplifikation
von rDNA
-
Oligonucleotid-Primer
wurden entsprechend den Bereichen der 18S-, 5,8S- und 28S-rRNA-Gensequenzen,
die als für
die Gattung Eimeria spezifisch erachtet werden, entworfen. Die ITS-1
(plus die flankierende Sequenz) wurde durch PCR unter Verwendung
der Primer WW1 (vorwärts:
5'-AAG TTG CGT AAA
TAG AGC CC-3') und
WW3r (rückwärts: 5'-CAA GAC ATC CAT
TGC TGA AA-3') amplifiziert,
während
ITS-2 unter Verwendung der Primer WW2 (vorwärts: 5'-ACG TCT GTT TCA GTG TCT-3') und WW4r (rückwärts: 5'-AAA TTC AGC GGG
TAA CCT CG-3') amplifiziert
wurde. Das 18S-Gen wurde unter Verwendung der Primer WW5 (5'-ACC TGG TTG ATC
CTG CCA G-3'), (SEQ
ID NO: 29), und WW6r (5'-CTT
CCG CAG GTT CAC CTA CGG-3'),
(SEQ ID NO: 30) amplifiziert. Die für die Amplifikation von ITS-1
oder ITS-2 verwendeten
Primer wurden endmarkiert mit [γ-33P]ATP (NEN Life Science Products), und
zwar unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase
gemäß dem Protokoll
des Herstellers (Promega, WI, USA). PCR-Reaktionen erfolgten in
30 μl-Volumina unter Verwendung
von ~50 ng Template-DNA, 50 pmol Primer, jeweils 200 μM dNTP, 7
mM MgCl2 (für ITS-1) oder 3 mM MgCl2 (für
ITS-2) und 1 U Taq-DNA-Polymerase (Promega, WI, USA) unter den folgenden Thermocyclierungsbedingungen:
94 °C, 30
s (Denaturierung); 55 °C,
30 s (Anlagerung); 72 °C,
30 s (Verlängerung)
für 30
Zyklen in einem DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer, USA). Kontrollproben
ohne DNA liefen in jedem PCR-Durchlauf mit. Außerdem wurde die Spezifität der PCR
für beide
Primer-Sätze
getestet, wobei DNA (~100 ng) von Hühnermuskulatur und -Kot (von
denen bekannt war, dass sie keine Eimeria enthielten) verwendet
wurden, und nach 24stündiger
Autoradiographie von DPGE-Gelen wurden in keiner dieser Kontrollproben
PCR-Produkte detektiert.
-
Die
einzelnen PCR-Produkte wurden mit einem gleich großen Volumen
Auftragspuffer (10 mM NaOH, 95 % Formamid, 0,05 % Bromophenolblau
und 0,05 % Xylencyanol) gemischt und ihre Intensität wurde
auf mit Ethidiumbromid gefärbten
2,5 % Agarose-TBE-Gelen, unter Verwendung einer 100 bp-Leiter (Promega,
WI, USA) als Größen-Marker,
verifiziert. Die kleinste Menge Eimeria-DNA, welche für eine effiziente
Amplifikation (für
beide Primer-Sätze)
und für
die visuelle Detektion auf Agarose-Gelen erforderlich war, betrug
~5 pg (dies entsprach ~5–50
Oozysten), was mit früheren
Studien (Stucki et al, 1993; Schnitzler et al, 1998; Molloy et al, 1998)
vergleichbar ist.
-
3 Hochauflösende Elektrophorese
-
PCR-Produkte
wurden bei 95 °C
5 min lang denaturiert und auf einem Gefrierblock (–20 °C) 2 min
lang abgeschreckt, bevor sie auf die Gele aufgetragen wurden. Für die DPGE
wurden 5 μl
jeder Probe in die Löcher eines
0,4 mm-dicken 5%igen Polyacrylamidgels eingetragen, das 42 % Harnstoff
und 1 × TBE
enthielt, und bei 40 W für
4 h bei 40 °C
einer Elektrophorese unterzogen. Für den Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP)
wurden 3μl
jeder Probe in die Löcher
eines 0,4 mm-dicken nichtdenaturierenden Gels (0,6 × MDETM, mutation detection enhancement; FMC BioProducts,
Rockland, ME, USA), das 0,6 × TBE
enthielt, eingetragen, und die Elektrophorese wurde bei 7 W für 17 h bei
15 °C durchgeführt. Die
Optimierung erfolgte wie zuvor beschrieben (Zhu und Gasser, 1998).
Beide elektrophoretischen Verfahren wurden in einer herkömmlichen
Sequenziervorrichtung (BaseRunner; IBI, New Haven, CT, USA) durchgeführt. Die
Gele wurden auf Löschpapier getrocknet
und unter Verwendung von RP1-Film (Agfa) einer Autoradiographie
unterzogen.
-
4 DNA-Sequenzierung
-
Die
PCR-Produkte wurden über
Wizard® PCR
Preps-Säulen
(Promega, WI, USA) gereinigt und in 40 μl H2O
eluiert. Zur Sequenzierung des 18S-rRNA-Gens wurde ein Aliquot (1 μl) unmittelbar
der Zyklus-Sequenzierung mit dem fmol® DNA
Cycle Sequencing System (Promega, WI, USA) unterzogen, und zwar
unter Verwendung der gleichen Primer wie für die PCR und einer Anlagerungstemperatur
von 55 °C.
Zur Sequenzierung von ITS-1, wurde ein Aliquot eines säulengereinigten
PCR-Produktes (100
ng) in den pGEM®-T-Plasmid-Vektor
(Promega, WI, USA) geklont, und 12 Klone (pro PCR-Produkt) wurden
für die
Zyklus-Sequenzierung isoliert.
-
5 Ergebnisse
-
Auf
den Agarose-Gelen (3) variierten die Größen der
ITS-1-PCR-Produkte von ~450–770
bp, während
die Größen der
ITS-2-Produkte ~370–620
bp betrug (Tabelle 2). Sowohl für ITS-1
als auch ITS-2 hatte jede Spezies eine eigene Bandengröße/eigene
Bandengrößen, da
zwischen oder bei der Mehrzahl an Isolaten keine intraspezifische
Variation in den Bandenprofilen detektiert wurde. Für die ITS-I-PCR-Produkte
wurde eine Bande für
E. acervulina und E. tenella detektiert, während 2–3 Banden für die übrigen 3 Spezies (Tabelle 2)
aufgelöst
wurden (Tabelle 2). Für
die ITS-2-PCR-Produkte
wurde eine Bande für
E. tenella detektiert, während
2 Banden für
alle anderen Spezies erschienen (Tabelle 2). Die Auflösung von
mehreren ITS-Banden auf Agarose-Gelen für einige Spezies wies auf die
Existenz unterschiedlicher Sequenztypen innerhalb eines PCR-Produktes
hin. Dies wurde bestätigt
durch Sequenzierung (durch Klonieren) der ITS-1-PCR-Produkte für ausgewählte Proben, welche jede der
Spezies (A7, B1, M1, N1 und T6, Tabelle 1) repräsentierten, sowie durch den
Vergleich mit zuvor veröffentlichten
Sequenzen (Schnitzler et al, 1998; Schnitzler et al, 1999; Barta
et al, 1998). Die Sequenzierung (von 12 Klonen pro Spezies) zeigte,
dass einzelne ITS-I-PCR-Produkte die richtigen Spezies repräsentierten,
obwohl neue ITS-1-Sequenztypen
(nicht dargestellt) für
E. brunetti, E. maxima und E. necatrix detektiert wurden.
-
DPGE
und SSCP wurden dann bezüglich
ihrer Fähigkeit
zur Anzeige von Größen- oder
Sequenzvariationen bei denaturierten PCR-Produkten evaluiert. Beide
Techniken erlaubten die unzweideutige Identifizierung aller Eimeria-Spezies
unter Verwendung von ITS-1- und/oder ITS-2-PCR-Produkten (4 und 5). Für DPGE (4)
waren die Bandenprofile relativ einfach – jedes bestand aus 2–5 Einzelstrangbanden,
wobei keine Unterschiede in der Anzahl oder der Größe/den Größen der
Banden zwischen der Mehrzahl an Isolaten derselben Spezies entdeckt
wurden. Wie aufgrund der Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophorese
erwartet (Tabelle 2), wurden keine Banden, die eine bestimmte Spezies
repräsentierten,
mit den heterologen Spezies geteilt. Zwar waren die ITS-1-Bandenprofile
für E.
acervulina und E. brunetti einander ähnlich, doch konnten diese
beiden Spezies leichter voneinander unterschieden werden, wenn ITS-2
verwendet wurde. Umgekehrt konnten E. necatrix und E. tenella leichter
unterschieden werden, wenn das ITS-1- anstelle des ITS-2-Profils verwendet
wurde. Für
SSCP (5) waren die Bandenprofile relativ komplex, wobei
jede Bande aus ~6–15 Einzelstrangbanden
(abhängig
von der ITS-Region und der Spezies) bestand. Die komplexen Profile
sind das Ergebnis der Bildung mehrerer konformativer Typen eines
Einzelstrangmoleküls
oder von Einzelstrangmolekülen.
Bei mehreren Isolaten, welche dieselbe Laborlinie für jede der
fünf Spezies
repräsentierten,
wurde keine Variation der ITS-1- oder der ITS-2-Profile nachgewiesen
(vgl. Tabelle 1). In ähnlicher
Weise wurden keine Unterschiede bei mehreren verschiedenen Laborlinien
sowohl für
E. necatrix wie auch für
E. tenella detektiert. Im Gegensatz dazu wurde ein signifikanter
Unterschied bei den ITS-1- und ITS-2-Profilen zwischen den Isolaten festgestellt,
die die RA- und MCK-Linien von E. acervulina repräsentierten;
dieser Unterschied blieb bei der DPGE (1; Spuren
A7 und A2 versus Spuren A12 und A3) unentdeckt. Dieser Unterschied
bezog sich auf den Polymorphismus (oder ~1 %-Unterschied) bei den
ITS-1- als auch den ITS-2-Sequenzen
zwischen diesen Laborlinien (nicht veröffentlicht).
-
Die
in 7 dargestellten Ergebnisse verdeutlichen die Wirksamkeit
der Anwendung eines DPGE-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.
-
Tabelle 2. Anzahl und
ungefähre
Größen von
ITS-1- und ITS-2-PCR-Produkten von Eimeria-Spezies
-
Die
Größen wurden
in 2,5%iger Agarose in 0,5 × TBE
durch Vergleich mit bekannten Größenstandards
bestimmt. Die PCR-Produkt-Größen wurden
unter Verwendung einer Formel interpoliert, die durch lineare Regression
von Molekulargewichtsstandards, verglichen mit dem log ihrer Laufstrecken,
hergeleitet wurde.
-
-
-
6 Spezifität des Tests – mehrere
Eimeria-Spezies pro Probe
-
Da
Hühner,
die mit Eimeria auf natürliche
Weise in Kontakt kommen, gleichzeitig mehr als eine Spezies von
Eimeria (McDougald et al, 1997) beherbergen können, ist es wichtig, die Fähigkeit
des Verfahrens zur spezifischen Detektion von DNA in Proben, die
mehr als eine Spezies enthalten, zu ermitteln. Dies wurde unter Verwendung
von ITS-2 als Beispiel untersucht. 20 ng der genomischen DNA jeder
Spezies wurden versetzt mit: 2 ng, 200 pg, 20 pg oder 2 pg der DNA
einer heterologen Spezies (in Verhältnissen von 1:10–1,
1:10–2, 1:10–3 oder
1:10–4).
Die Mischungen der Template-DNA wurden dann einer PCR unterzogen,
die PCR-Produkte wurden mittels DPGE analysiert und ein Autoradiographiefilm
mit den Gelen belichtet (96 h). Als Beispiel sind die Ergebnisse
für E.
acervulina in Mischung, in unterschiedlichen Verhältnissen,
mit E. maxima in 6A dargestellt. Bei
einem Template-Verhältnis von
1:10–4 wurde
eine Bande, welche die erste Spezies repräsentiert, detektiert, während bei
Verwendung eines Template-Verhältnisses
von 1:10–3 bei
den meisten Proben schwache Banden festgestellt wurden, die die
zweite Spezies repräsentierten
(nicht alle Ergebnisse dargestellt). Bei einem Verdünriungsverhältnis von
1:10–2 wurde
die bei der unteren Konzentration der genomischen DNA vorliegende
Spezies bei allen Kombinationen (6B)
detektiert. Diese Ergebnisse zeigten, dass die DNA einer bestimmten
Spezies durch PCR detektiert werden konnte, und zwar auch bei Vorliegen
eines Überschusses
(das 100–1000fache
der Menge) an Template-DNA einer heterologen Spezies. Außerdem wurde
die DPGE von ITS-2 (in einem Blind-Test) zur korrekten Identifizierung
aller Spezies, die in gemischten Oozysten-Isolaten vorlagen, verwendet,
wodurch gezeigt wurde, dass dieses Verfahren für den Nachweis von Infektionen
mit mehreren Spezies bei Hühnern
nützlich
ist.
-
7. Beispiel für die Verwendung
von fluoreszenzbasierter elektrophoretischer Detektion
-
Man
ließ Eimeria-Oozysten
in Kotproben unter konstanter Belüftung bei 30 °C mindestens
48 h sporulieren. Anschließend
wurden sie mit gesättigter
NaCl (Shirley, 1995) isoliert, ausgiebig in 50 ml-Volumina H2O gewaschen, und letztendlich wurde eine
wässrige
Suspension (10 ml, enthaltend 5 × 106 Oozysten)
hergestellt. Die Oozysten wurden dann über einem Sucrose-Gradienten
(Gasser et al., 1978) auf gereinigt, wodurch PCR-inhibierende Kotbestandteile
entfernt wurden, gewaschen und dann in 0,5 ml H2O
resuspendiert. Das gleiche Volumen an Glasperlen (2 mm Durchmesser)
wurde hinzugegeben und die Mischung kräftig für 3–5 min gemischt, bis > 90 der Oozysten aufgebrochen
waren (ermittelt durch lichtmikroskopische Untersuchung bei 400facher
Vergrößerung).
Die Sporozysten enthaltende Suspension wurde dann in ein neues Eppendorf-Röhrchen transferiert,
Proteinase K (150 μg
ml–1)
und Natriumdodecylsulfat (5 % Gew./Vol.) hinzugegeben, und dann
bei 37 °C über Nacht
inkubiert. Festes Material wurde durch Zentrifugieren bei 13000
g 5 min lang pelletiert und die DNA aus dem Überstand unter Verwendung eines
Wizard® DNA
Clean-Up Kit (Promega, WI, USA) isoliert.
-
Die
ITS-2-Region (plus flankierende Sequenz) wurde aus einzelnen Proben
genomischer DNA mittels PCR amplifiziert – unter Verwendung der Primer
WW2 und WW4r. Der Primer WW2 wurde am 5'-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff,
FAM (Fluo rescein) markiert. Die PCR-Reaktionen erfolgten in 25 μl-Volumina, welche normalerweise
1–20 ng
genomischer Template-DNA, 50 pmol Primer, 200 μM jedes dNTP, 3 mM MgCl2 und 1 U Taq-DNA-Polymerase (Promega, WI,
USA) enthielten, unter den folgenden Thermozyklierungsbedingungen:
94 °C, 15
s (Denaturierung); 60 °C,
15 s (Anlagerung); 72 °C,
30 s (Verlängerung)
für 30
Zyklen in einem DNA-Thermal Cycler 2400 (Perkin Elmer). Proben ohne
DNA (keine DNA) oder mit Hühner-DNA
(gereinigt wie bei Eimeria-DNA) wurden als Kontroll-Reaktionen verwendet.
Die kleinste Menge an genomischer Template-DNA, aus der sich die
ITS-2-Sequenz effektiv amplifizieren ließ und die auf einem Agarosegel
detektierbar war, wurde auf 100 bis 1000 pg (= X Oozysten-Äquivalente)
geschätzt,
sogar bei Vorliegen eines 1000fachen DNA-Überschusses einer heterologen
Spezies oder des Wirtes (d.h. Muskel- oder Fäzes-DNA).
-
Amplikone
wurden untersucht und ihre Intensität auf mit Ethidiumbromid gefärbten 2,5%igen
Agarosegelen, unter Verwendung von 65 mM Tris-HCl, 27 mM Borsäure, 1 mM
EDTA, pH 9 (TBE) als Puffer und einer 100 bp-Leiter (Promega, WI,
USA) als Größenmarker,
verifiziert. Danach wurde jede Probe 1:4 mit H2O verdünnt, und
1,5 μl davon
wurden mit 2 μl
4,1 mM EDTA, 88,25 % Formamid, 15 mg/ml Dextranblau (Promega) und
0,6 μl des
GeneScan®-2500[TAMRA]-Größenstandards
(Applied Biosystems) gemischt. Die Proben wurden bei 95 °C 2 min lang
denaturiert, auf ein 5%iges LongRanger®-Gel
(FMC) in einem ABI PrismTM 377 DNA Sequencer
(Applied Biosystems) aufgetragen (2 μl) und dann einer Elektrophorese
bei 200 W (3000 V und 60 mA) für
3,5 h unterzogen. Das erhaltene Gelbild, dass alle Proben repräsentierte,
wurde festgehalten und die Chromatogramme analysiert und unter Verwendung
von GeneScan® 3.1-Software
(Applied Biosystems) verglichen. Jeder einzelne Peak repräsentierte
die Position des Sinnstrangs eines denaturierten Amplikons. Die
Intensitätsskala
(Ordinate) der Chromatogramme wurde so eingestellt, dass die Hintergrundfluoreszenz
dargestellt wurde, somit blieben keine Peaks unentdeckt.
-
8 Ergebnisse der Beispielstudie über die
Verwendung der fluoreszenzbasierten elektrophoretischen Detektion
-
Achtzehn
DNA-Referenzproben, die monospezifische Eimeria-Oozysten repräsentierten, wurden hergestellt
(Tabelle 1). Die agarosegel-elektrophoretische Analyse der ITS-2-PCR-Produkte, die (einzeln)
aus allen monospezifischen Proben amplifiziert wurden, führte zur
Detektion einer Sande für
E. tenella, während zwei
Banden für
alle anderen Spezies (nicht dargestell) angezeigt wurden. Die Auflösung mehrerer
Banden auf Agarosegelen bei einigen Spezies wies auf die Existenz
verschiedener Sequenztypen innerhalb eines Amplikons hin, was mit
früheren
Erkenntnissen (Woods et al., 2000a,b) übereinstimmt. Dies wurde bestätigt durch die
Sequenzierung geklonter ITS-2-Amplikone (3 Klöne wurden sequenziert) von
ausgewählten
Proben (A7, B1, M1, N1 und T6), die jede Spezies repräsentierten
(siehe Tabelle 1). Ferner zeigten die ITS-2-Sequenzen, die für die Isolate
M1 (E. maxima) und T6 (E. tenella) (Tabelle 1) bestimmt wurden,
Konkordanz zu den Sequenzen, die in der GenBankTM (Accession
numbers AF027722, AF027723, AF027724, AF027725, AF027726 und AF026388)
hinterlegt sind. Einige neue ITS-2-Sequenztypen wurden für E. mitis
und praecox detektiert, was nicht unerwartet war, da es bisher keine
Studie gibt, die die Sequenzvariabilität in der ITS-2-Region innerhalb
einer Spezies oder eines Isolats gründlich untersucht hat.
-
Die
aus allen monospezifischen Eimeria-DNA-Proben (Tabelle 1) gewonnenen
Amplikone wurden anschließend
in dem automatischen Sequenzierer analysiert. Repräsentative
Chromatogramme sind in 8 wiedergegeben. Für E. acervulina,
E. brunetti, E. maxima, E. necatrix und E. tenella waren keine merklichen Unterschiede
in der Anzahl und der Position der Peaks der Chromatogrammprofile
zwischen den Proben (dargestellt sind ausgewählte Proben) festgestellt worden,
allerdings wurden einige Unterschiede in der relativen Peak-Intensität zwischen
einigen Proben festgestellt, die eine Spezies repräsentierten
(8). Sowohl für
E. mitis als auch E. praecox wurden einige Unterschiede in der Position/den
Positionen kleinerer Peaks festgestellt, die eine Populationsvariation
anzeigen (9). Unabhängig von einer solchen intraspezifischen
Variabilität
in den Chromatogrammprofilen blieb die Position der höchsten/Haupt-Peaks
(mit Pfeilen gekennzeichnet) bei allen Proben für jede Spezies gleich. Zwar
gab es eine gewisse Überlappung
in den Profilen von E. brunetti, E. mitis und E. praecox, doch konnten
speziesspezifische chromatographische Peaks für jede der sieben Eimeria-Spezies
definiert werden (Sternchen in 8).
-
Da
auf natürliche
weise infizierte Hühner
gleichzeitig mehr als eine Spezies von Eimeria beherbergen können, wurde
die Fähigkeit
des automatisierten, fluoreszenzbasierten elektrophoretischen Verfahrens
zur spezifischen Detektion von DNA in Proben, die mehr als eine
Spezies enthalten, ermittelt. Dreizehn unbekannte "Feld"-Proben, alle von
Gruppen aus mehreren Hühnern
gewonnen, wurden getestet (Tabelle 3). Im Vergleich zu Referenzproben
(A6, B1 M1, μ2,
N1, P4 und T6) konnte die Spezies-Zusammensetzung innerhalb einzelner
Proben leicht bestimmt werden (Tabelle 3 und 8), auch
bei Proben, die E. brunetti, E. mitis und E. praecox enthielten
und deren Profile erhebliche Überlappungen
aufwiesen. Die meisten Kotproben enthielten mehrere Spezies, einschließlich E.
praecox und E. mitis (n = 1), E. acervulina und E. mitis (n = 1),
E. acervulina und E. praecox (n = 2), E. acervulina, E. mitis and
E. praecox (n = 1), E. acervulina, E. maxima, E. mitis, E. praecox
und E. tenella (n = 1), E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E.
mitis und E. praecox (n = 1), E. acervulina, E. maxima und E. mitis
(n = 1), allerdings enthielten mehrere Proben nur E. praecox (n
= 4) oder nur E. mitis (n = 1). Anschließend wurde die Reproduzierbarkeit
des Verfahrens hinsichtlich der korrekten Identifizierung aller
Spezies, die in gemischten Oozysten-Isolaten wie auch in Proben mit absichtlich
gemischter DNA vorliegen, in einem Blind-Test evaluiert. Es wurde
keine signifikante Variation der Chromatogrammprofile bei verschiedenen
Läufen
an verschiedenen Tagen festgestellt, und die Spezieszusammensetzung
der gemischten Proben war erwartungsgemäß. Diese Ergebnisse belegen,
dass dieses verfahren für
die Detektierung von Infektionen mit einzelnen und mit einer Mischung
von Spezies bei Hühnern
von Nutzen ist.
-
Tabelle
3. Proben von Eimeria, gewonnen aus australischen Geflügelfarmen.
Die Spezies-Zusammensetzung wurde durch DPGE-Analyse von fluoreszierend
markierten ITS-2-Produkten
bestimmt (vgl. Figur 8).
-
VORTEILE UND INDUSTRIELLE
ANWENDBARKEIT
-
Wie
sich aus der obigen Beschreibung ergibt, weist der Test gemäß der vorliegenden
Erfindung eine Reihe von Vorteilen gegenüber bisher bekannten, zur Identifizierung
von Eimeria-Spezies eingesetzten Verfahren auf. So erfordert der
vorliegende Test beispielsweise nicht die Verwendung mehrerer Primer-Sätze, die für jede der
Eimeria-Spezies, die detektiert werden sollen, spezifisch sind,
vielmehr kann ein einziger gattungsspezifischer Primer-Satz verwendet
werden. Folglich kann eine Mehrzahl an Spezies gemeinsam aus einer einzigen
Test-Probe amplifiziert werden und in einer einzigen Spur auf einem
geeigneten Elektrophoresegel laufen.
-
Die
elektrophoretischen Gelsysteme (SSCP und/oder DFGE), die erfindungsgemäß zur Visualisierung der
Amplifikationsprodukte eingesetzt werden, und damit zur Identifizierung
der in einer Probe vorliegenden Spezies dienen, sind extrem empfindlich
und in der Lage, zwischen Spezies zu unterscheiden, die sich hinsichtlich
ihrer Länge
nur aufgrund eines einzigen Nucleotids unterscheiden oder die sich
durch geringfügige Sequenzvariationen
voneinander unterscheiden.
-
Das
hier beschriebene fluoreszenzbasierte elektrophoretische Detektionsverfahren
bietet außerdem große Vorteile
gegenüber
früheren,
zur Identifizierung von Eimeria eingesetzten Verfahren, insbesondere
in Kombination mit den neuen Primern der vorliegenden Erfindung.
Mit der Anwendung dieses Detektionssystems wird die Notwendigkeit
der Verwendung von radioaktiven Nucleotiden beseitigt, somit ist
die Durchführung
dieses Verfahrens für
den Ausführenden
sicherer Außerdem
erfolgt das Auslesen der Elektrophoresegele automatisch, unter Einsatz
eines bildgebenden Computer-Systems,
wodurch die Notwendigkeit der Handhabung und der Belichtung der
Gele beseitigt und der Zeitaufwand erheblich reduziert wird. Darüber hinaus
können
die die verschiedenen Proben repräsentierenden Chromatogramme
(die auf verschiedenen Gelen an verschiedenen Tagen laufen) elektronisch
aufgenommen und gespeichert werden und sind jederzeit für vergleichende
Analysen abrufbar. Somit ist dieses automatisierte Elektrophorese-Verfahren
zeitsparend. und kostengünstig,
außerdem
gut geeignet für
die Typisierung von großen Mengen
von Oozysten-Proben und kann ein nützliches epidemiologisches
Instrument für
Prävalenz-Studien
wie auch für
die Überwachung
von Kokzidiose-Ausbrüchen
darstellen.
-
Des
Weiteren bietet die hier beschriebene Erfindung bedeutende Vorteile
gegenüber
der RAPD-PCR (Johnston et al, 1995; Greif et al, 1996; Shirley et
al, 1994 (Parasitol Res); Shirley et al, 1994 (Res Vet Sci)), insofern
als sie wohldefinierte Primer auf eine spezifische Region der rDNA
für die
PCR mit einer relativ hohen Stringenz anwendet, wodurch Probleme
mit der Amplifikation von kontaminierender Wirts-DNA sowie die durch
die Nichtspezifität
der Primer und die niedrige Annealing-Temperatur bei der PCR verursachten
Probleme mit der Reproduzierbarkeit (Ellsworth et al, 1993; MacPherson
et al, 1993) auf ein Minimum reduziert werden.
-
Zusammengenommen
ermöglichen
die oben genannten Merkmale ein schnelles, hochauflösendes, qualitatives
Screening einer großen
Anzahl von Proben nach jeder beliebigen Spezies der Gattung Eimeria. Weiterhin
beseitigt die Erfindung die Notwendigkeit der Durchführung von
DNA-Sequenzanalysen (in erster Linie), wodurch Zeit- und Arbeitsaufwand
sowie Kosten reduziert werden.
-
Die
vorliegende Erfindung kann experimentell oder in gewerblichem Maßstab als
ein Mittel zur Routine-Diagnose und zur Überwachung von Kokzidien, insbesondere
von Vogelkokzidien, Anwendung finden. Alternativ hierzu kann die
Erfindung in der Qualitätskontrolle
des Spezies-Status monospezifischer Laborlinien von Eimeria verwendet
werden. Weiter hin kann die Erfindung als ein ergänzendes Werkzeug bei der Entwicklung
zukünftiger
kommerzieller Impfstoffe und Diagnosetests nützlich sein.
-
Bei
Eimeria-Spezies gibt es eine intraspezifische und interspezifische
DNA-Sequenzvariation. Folglich wurden bei früheren Verfahren zur Detektion
von Eimeria-Spezies ausschließlich
speziesspezifische PCR angewendet, um die Notwendigkeit einer extensiven
Sequenzierung und Charakterisierung der erhaltenen PCR-Produkte
für die
Identifizierung von Isolaten, zumindest auf der Artebene, zu umgehen.
Im Gegensatz hierzu besteht ein Aspekt der vorliegenden Erfindung
in der Anwendung genusspezifischer PCR, welche spezifisch auf die
Variation von Sequenzen sowohl innerhalb einer Spezies von Eimeria
als auch zwischen den Eimeria-Spezies
abzielt.
-
Die
Erfindung wurde mit Bezug auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen
beschrieben, um es dem Leser zu ermöglichen, die Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren
auszuüben.
Jedoch ist es für den
durchschnittlichen Fachmann auf diesem Gebiet leicht ersichtlich,
dass viele der Komponenten und Parameter bis zu einem gewissen Grade
verändert
oder modifiziert werden können,
ohne den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen. Weiterhin dienen
die hier verwendeten Titel, Überschriften
u. ä. dem
besseren Verständnis
des Lesers und sollten nicht als den Schutzumfang der vorliegenden
Erfindung beschränkend
interpretiert werden.
-
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