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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Beurteilung von TSE unter Verwendung
einer Probe aus einem lebenden Organismus. Die Beurteilung beruht
auf der Verwendung eines RNA-Markermoleküls in einer Vollblutprobe.
Die Erfindung betrifft weiterhin den Nachweis des Markermoleküls mittels
Echtzeit-PCR.
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Allgemeiner Stand der Technik
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Übertragbare
spongiforme Enzephalopathien (TSEs) bestehen aus einer einzigartigen
Gruppe von neurologischen Störungen,
die sowohl beim Menschen als auch beim Tier vorkommen und die stets
einen tödlichen
Ausgang nehmen. TSEs sind durch lange präsymptomatische Inkubationszeiten,
die sich über
Monate oder Jahre erstrecken, gekennzeichnet. Hirnläsionen in
Assoziation mit Ablagerungen von proteaseresistenten Proteinen sind
ein Kennzeichen einer klinisch offenbaren TSE-Krankheit.
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Bei
der Variant Creutzfeldt-Jakob Disease (vCJD) handelt es sich um
eine seltene neurodegenerative Erkrankung des Menschen mit tätlichem
Ausgang. Die klassische Form, also CJD, präsentiert sich als subakute
Demenz, die sich im Verlauf von Wochen bis mehreren Monaten entwickelt
und die von pyramidalen Symptomen, extrapyramidalen Symptomen und
Symptomen des Cerebellums begleitet wird. Das mittlere Todesalter
beträgt
57 Jahre, die Krankheit kann jedoch im späten Teenageralter und Anfang
Zwanzig auftreten. In den späteren
Stadien der Krankheit liegt eine behindernde Demenz vor, die üblicherweise
gemeinsam mit schwerem Myoklonus auftritt. In jüngster Zeit wurde eine Variante
der CJD (vCJD) in Großbritannien
und Frankreich beschrieben, die klare klinische und pathologische
Merkmale aufweist und an der jüngere
Menschen (Durchschnittsalter 29 Jahre im Vergleich zu 65 Jahren)
erkrankt sind.
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Wie
bei CJD wird auch vCJD aufgrund der typischen schwammartigen Degeneration
des Hirns und der Übertragbarkeit
als TSE eingestuft. Der präsumtive
infektiöse
Krankheitserreger von TSE wird häufig
PrPsc oder Prpres,
was die krankheitsspezifische Form des Prionen-Proteins (PrP) bezeichnet,
genannt. Den biologischen Eigenschaften von PrPsc in
vCJD und BSE sind biologische Eigenschaften gemeinsam, so weisen
sie zum Beispiel ähnliche
Inkubationszeiten in verschiedenen Arten von Mäusen und Hamstern auf. TSEs
sind auch bei anderen Tieren bekannt. So wurde zum Beispiel in vielen
Ländern
auf der ganzen Welt mit Schafproduktion in den letzen 250 Jahren
Scrapie, eine Krankheit, an der Schafe und Ziegen erkranken, gefunden.
Die Chronic Wasting Disease (CWD) ist eine ansteckende TSE mit tödlichem
Ausgang bei Cerviden (Vertreter der Familie Hirsche und Elche).
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Die
Hypothese einer Verbindung zwischen vCJD und BSE wurde zum ersten
Mal aufgrund des zeitlichen und örtlichen
Zusammentreffens dieser zwei TSEs aufgestellt. Jüngeres Beweismaterial, das
für eine Verbindung
spricht, darunter die Identifikation von pathologischen Merkmalen
mit Ähnlichkeit
zu vCJD im Hirn von Makaken-Affen, die mit BSE inokuliert worden
waren. Eine Verbindung zwischen vCJD und BSE wird weiterhin durch
den Nachweis gestützt,
daß vCJD
mit einem molekularen Marker assoziiert ist, der diese Krankheit
von anderen Formen von CJD unterscheidet und der einem Marker ähnlich ist,
der bei BSE, das an verschiedene andere Spezies übertragen wurde, beobachtet
wurde. Untersuchungen der Verteilung des Krankheitserregers im Hirn
von Mäusen,
die künstlich
mit Gewebe von Menschen mit vCJD und Kühen mit BSE infiziert worden
waren, zeigten praktisch identische Muster. Das jüngste und
stärkste
Beweismaterial stammt von Untersuchungen, die zeigen, daß die Übertragungscharakteristika
von BSE und vCJD bei Labormäusen beinahe
identisch waren, was ein starkes Anzeichen dafür ist, daß sie von demselben Erreger
verursacht werden. Schlußfolgernd
kann gesagt werden, daß die
wahrscheinlichste Ursache für
vCJD der Kontakt mit dem BSE-Erreger ist, und zwar am wahrscheinlichsten
aufgrund von Kontamination durch Ernährung mit erkranktem Zentralnervensystemgewebe
von Rindern.
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Hieraus
folgt, daß bei
der menschlichen Nahrungskette ein dringender Bedarf an Methoden
zur Beurteilung einer möglichen
TSE-Infektion im lebenden Wirt besteht. Insbesondere besteht der
Wunsch, TSE an lebenden Tieren im vorsymptomatischen Stadium und
bevor die Tiere geschlachtet und verarbeitet werden, um in die menschliche
Nahrungskette einzugehen, zu beurteilen. Eine Art, TSE zu beurteilen,
wird allgemein angewendet, wenn Rinderkarkassen routinemäßig auf
spongiforme Enzephalopathie des Rinds geprüft werden. Einem geschlachteten
Tier wird eine Hirnprobe entnommen, und das Vorliegen von PrPsc in der Probe wird mittels eines immunologischen
Tests, wie eines ELISA-Tests oder eines Western-Blots beurteilt.
Bei einem anderen Ansatz betrachtet man die für die TSE-Krankheit spezifischen
Veränderungen
bei der Genexpression. Eine Neurodegeneration im Hirn scheint eng
mit Veränderungen
innerhalb der Mitglieder des Zellabwehrsystems des Zentralnervensystems
gekoppelt zu sein. Insbesondere wurde gefunden, daß eine erhöhte Expression
von bestimmten Genen, die für
Cathepsie-Enzyme codieren, in dem Mikroglia und/oder Astrozyten mit
spongiformen Enzephalopathien korreliert.
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Sowohl
bei der Mikroglia als auch bei den Astrozyten handelt es sich um
Gliazellen. Gliazellen sind die Bindegewebezellen des Zentralnervensystems
(ZNS), die als tragende Struktur dienen, welche die Neuronen zusammenhält und schützt. Die
Astrozyten binden eine bestimmte Art von Gliazelle. Sie sind relativ
groß,
weisen fadenförmige
(Sternform) Fortsätze
auf, die mit den Neuronen und den kleinen Blutgefäßen (Kapillaren) in
Verbindung stehen. Diese Fortsätze
bilden einen Bestandteil der Blut-Hirn-Schranke. Diese Schranke
verlangsamt oder verhindert das Durchwandern von unerwünschten
Substanzen wie schädlichen
Chemikalien, Krankheitserregern usw. vom Blutstrom ins Hirn. Die
Astrozyten treten auch vermehrt in Regionen auf, wo die Nerven geschädigt worden
sind (Astrozytose), wobei sie diese Regionen abkapseln. Die Mikrogliazellen
machen ungefähr
20% der Gesamtgliapopulation im Zentralnervensystem aus. Sie sind
in der weißen
und grauen Gehirnsubstanz ohne wesentliche lokale Unterschiede vorhanden.
Im Gegensatz zu den Astrozyten decken sie Regionen ab, die sich
nicht überlappen.
Sie gehören
zum mononuklearen Phagozyt-System und bilden die im Hirngewebe,
im Rückenmark
und in der Retina vorliegenden Makrophagen. Ihre Funktion im normalen
Nervenparenchym ist unbekannt. Bei verschiedenen Pathologien bilden
sie jedoch einen äußerst reaktionsfähigen Sensor
für Bedrohungen
des Nervensystems, und wenn sie stimuliert werden, zeigen sie innerhalb
von wenigen Stunden ein Aktivierungsprogramm. Die Mikroglia sind
stark reaktionsfähige,
mobile und multifunktionelle Immunzellen des ZNS, die bei Abwehr
von Gefahren für
das Nervenparenchym eine universelle Rolle spielen können. Aktivierte
Mikrogliazellen werden immunkompetent, und Hirnmakrophagen, die
von Mikroglia stammen, weisen Cathepsin B und L auf, wodurch sie
potentiell zytotoxisch werden (Kreutzberg, G.W., Arzneimittelforschung
45 (1995) 357–360).
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Die
intrazellulären
Proteinasen wie die Mitglieder der Cathepsinfamilien spielen beim
Vorgang des Nervenzelltods eine Rolle. Dies ist scheinbar auch der
Fall bei neurodegenerativen Krankheiten. Ein Ansteigen von Cathepsin
B, L und D (lysosomale Proteinasen) und Cathepsin E (nichtlysosomale
Asparaginsäureproteinase)
in den Neuronen wurde im Frühstadium
der Neuronendegeneration nachgewiesen. Ein erhöhter Gehalt an solchen Proteinasen
wurde auch in reaktiven Gliazellen gefunden und kann an der Pathogenese
von neurodegenerativen Krankheiten beteiligt sein (Nakanishi, H.
und Yamamoto, K., Japanese Journal of Pharmacology 105 (1995) 1–9 [Zusammenfassung]).
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Bezüglich der
TSE-Neurodegeneration wird von Diedrich, J.F. et al., J. Virol 65
(1991) 4759–4768
berichtet, daß neuropathologische
Veränderungen
bei Scrapie mit einem höheren
Gehalt an Cathepsin D-mRNA assoziiert sind. Die erhöhte Expression
wurde durch Analyse von mRNA-Isolaten aus den Gehirnen von Mäusen, die
experimentell mit Scrapie infiziert worden waren, 16 Wochen nach
der Inokulation nachgewiesen. Weiterhin wurde die Überexpression
der mRNAs den Astrozyten zugeordnet. Unter Verwendung eines experimentellen
Scrapie-Maus-Modells und von cDNA-Expressions-Arrays gemeinsam mit
quantitativer RT-PCR zeigten Brown, A.R. et al., Neuropathology
and Applied Neurobiology 30 (2004) 555–567 eine erhöhte Expression
von Cathepsin D in Hippocampusgewebe. Unter Verwendung von Mikroarray-Analyse der Genexpression
im Maushirn nach Infektion mit zwei unterschiedlichen Scrapie-Stämmen zeigten
Xiang, W. et al., J. Virology 78 (2004) 11051–11060 eine signifikante Hinaufregulation
bei Cathepsin S, H, C, D und Z. In geringerem, möglicherweise unwesentlichem
Ausmaß schien
die Expression von Cathepsin B und L in infizierten Hirnen höher zu sein.
In einem experimentellen Mausmodell für CJD-Expression fand man,
daß das
für Cathepsin
S codierende Gen in den Mikrogliazellen des Hirns signifikant induziert
war (Baker, C.A., et al. J. Virology 73 (1999) 5089–5097).
Zwischen dem 88. und dem 120. Tag nach der Inokulation wurde ein
Ansteigen um ungefähr
das Doppelte gemessen. In einer späteren Untersuchung von Baker,
C.A. et al., J. Virology 76 (2002) 10905–10913 wird berichtet, daß die „Steady-State"-Gehalte an mRNA
für Cathepsin
S in mit CJD infizierten Mikroglia, die aus Maushirnen isoliert
worden waren, ungefähr
um das Zehnfache erhöht
waren. In einer weiteren Untersuchung fanden Baker, C.A. und Manuelidis,
L., PNAS 100 (2003) 675–679
in von mit CJD infizierten Maushirnen isolierten Mikroglia eine
verstärkte
Transkription der für
Cathepsin S, L und H codierenden Gene. In einer anderen Untersuchung
an mit CJD infizierten Maushirnen jedoch fanden Lu, Z.Y., et al.,
J. Cellular Biochemistry 93 (2004) 644-652, daß die Expression von Cathepsin
D und, im Widerspruch zu der obengenannten Darstellung, daß sich das
Cathepsin L im Gesamtverlauf der Infektion nicht veränderte.
Dandoy-Dron, F., J. Biol. Chem. 273 (1998) 7691–7697 beschreiben eine Analyse
von mit Scrapie infizierten Maushirnen mittels mRNA-„Differential
Display". Es wurde
gefunden, daß unter
anderen Iranskripten auch die Cathepsin S-mRNA bevorzugt exprimiert
wurde, um zu einem verstärkten
Auftreten des Transkripts im Vergleich zu den nichtinfizierten Kontrollen
zu führen.
Wurden Mäuse
intrazerebral mit dem BSE verursachenden Erreger inokuliert, so war
auch das Auftreten von Cathepsin S-mRNA im Maushirn verstärkt.
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Bis
jetzt liegen im Stand der Technik nur Daten über die erhöhte Transkription von Cathepsingenen
in Hirnzellen aufgrund von TSE vor. Außerdem beschränken sich
die Untersuchungen des Standes der Technik bezüglich der Markermoleküle auf künstliche
Krankheitsmodelle im experimentellen Umfeld. Insbesondere wird bei
diesen Modellen die Artbarriere überschritten,
so werden zum Beispiel Mäuse
mit dem Scrapie-Erreger aus Schafen oder mit dem vCJD-Erreger aus
dem Menschen infiziert.
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Wenn
die Cathepsingenexpression als Marker für die Beurteilung von TSE dient,
wird diese bei der Analyse einer Hirnprobe ja sogar einer als Probe
gezogenen Unterpopulation von Hirnzellen (Mikroglia) verwendet.
Die Verwendung des ganzen Hirns oder von spezifischen Hirnzellen
als Probenmaterial erfordert jedoch aufwendige Arbeits- und Sicherheitsvorkehrungen
beim Präparieren
des Probenmaterials. So muß zum Beispiel
der Schädel
der Tiere von Hand geöffnet
werden, und alle Objekte, die mit dem Hirnmaterial in Kontakt kommen,
sind der Gefahr, mit ansteckendem Material kontaminiert zu werden,
ausgesetzt.
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Darstellung der Erfindung
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein neues Markermolekül als Mittel
für die
Beurteilung einer TSE-Infektion bereitzustellen, das in einer Probe
untersucht werden kann, bei der es sich nicht um Hirnmaterial handelt.
Vorzugsweise kann die Probe entnommen werden, bevor eine Person,
die im Verdacht steht, an TSE zu leiden, gestorben ist oder, bei
einem Tier, bevor dieses getötet
wird.
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Überraschenderweise
haben die Erfinder entdeckt, daß das
Vorhandensein einer Nukleotidsequenz, die für ein Fragment einer hypothetischen
Cysteinproteinase gemäß SEQ ID
NO:2 codiert, in Vollblut mit TSE-Infektion korreliert ist. Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird das Problem daher durch die Verwendung einer Nukleotidsequenz,
die für
ein Fragment einer hypothetischen Cysteinproteinase gemäß SEQ ID
NO:2 oder für
eine dazu komplementäre
Nukleotidsequenz codiert, als Marker bei der Beurteilung von übertragbarer spongiformer
Enzephalopathie (TSE) bei einem Rind gelöst. Weiterhin stellt die Erfindung
ein Verfahren zur Beurteilung der übertragbaren spongiformen Enzephalopathie
(TSE) bei einem Rind durch Nachweisen einer Ziel-RNA bereit, umfassend
die folgenden nacheinander an einer vom Rind stammenden Probe durchgeführten Schritte:
(a) Präparieren
der RNA aus der Probe, (b) Nachweisen der Ziel-RNA in dem RNA-Präparat von Schritt
(a), (c) Beurteilen von TSE in dem Rind aufgrund des Ergebnisses
von Schritt (b), dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Probe aus
dem Rind um Vollblut handelt und daß die Ziel-RNA für eine Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 oder ein Teilfragment davon mit 6 oder mehr aufeinanderfolgenden
Aminosäuren
codiert. Außerdem
stellt die Erfindung aus Teilen bestehende Kits für die Beurteilung
von TSE bei einem Säugetier
durch Nachweisen einer Ziel-RNA, die für ein Fragment der hypothetischen
Cysteinproteinase nach SEQ ID NO:2 oder ein Teilfragment davon codiert,
gemäß den beigelegten
Ansprüchen
10–13
bereit.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Aufgrund
des Fortschreitens von TSE verändert
sich die Expression von verschiedenen Genen in gewissen Zelltypen.
Der Nachweis von solchen Veränderungen
kann für
die Diagnose von TSE eingesetzt werden, wodurch man eine Alternative
zu Immunassays auf Prionenprotein (PrPsc)
zur Verfügung
stellt. Überraschenderweise
haben die Erfinder beim Rind gefunden, daß das Vorliegen einer RNA-Sequenz
gemäß SEQ ID
NO:1 im Vollblut mit TSE-Infektion korreliert ist.
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Ein
erstes Screening von Gesamtnukleinsäuren aus Blutproben ergab ein
Paar PCR-Primer gemäß SEQ ID
NO:3 und SEQ ID NO:4, die es gestattet haben, eine Zielnukleinsäure mit
einer Größe von ungefähr 400 Bp
zu amplifizieren. Das Fragment wurde nur in Proben von Rindern,
die mit BSE infiziert waren, gefunden, konnte jedoch bei nichtinfizierten
Tieren nicht nachgewiesen werden. Durch Sequenzieren erhielt man
die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, die 369 Bp umfaßte. Die
amplifizierte Zielnukleinsäure
der Bande bei ungefähr
400 Bp erwies sich in allen Proben, wo sie auftauchte, identisch.
Eine computergestützte
Suche nach dem längsten
nichtunterbrochenen Codierungsraster ergab eine Aminosäuresequenz
mit 91 Resten gemäß SEQ ID
NO:2. Eine Homologiesuche ergab, daß es sich bei dieser Sequenz
um ein Fragment einer neuen hypothetischen Cysteinproteinase handelt.
Auf dem Aminosäuresequenzniveau
weist das Fragment gemäß SEQ ID
NO:2 eine gewisse Homologie mit der Vorstufe des Maus-Cathepsin O (Swissprot-Accession Q8BM88),
mit der Vorstufe des Human-Cathepsin O (Swissprot-Accession P43234;
Proteindatenbank beim National Center for Biotechnology Information
(NCBI), Accessions-Nr. NP_001325), mit der Vorstufe des Human-Cathepsin
K (Swissprot-Accession P43235) und mit der Vorstufe des Rinder-Cathepsin
K (die von der mRNA gemäß NCBI Nucleotide
Accession BT021052; NCBI Protein Accession AAX09069) auf. Ein Alignment der
Aminosäuresequenzen
ist in 3 dargestellt. Insbesondere
scheint der Cysteinrest, der für
das katalytische Zentrum der Cysteinproteasen typisch ist, konserviert
zu sein, was die Hypothese, daß es
sich bei SEQ ID NO:2 um ein Fragment einer Cysteinproteinase handelt,
stützt.
Nichtsdestotrotz scheint auch die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID
NO:2 bis jetzt einzigartig zu sein.
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Es
scheint, daß die
mRNA, die für
die hypothetische Cysteinproteinase codiert, mit TSE beim Rind korreliert.
Eine erste Ausführungsform
der Erfindung ist daher die Verwendung einer Nukleotidsequenz, die
für ein Fragment
einer hypothetischen Cysteinproteinase gemäß SEQ ID NO:2 oder für eine dazu
komplementäre Nukleotidsequenz
codiert, als Marker bei der Beurteilung von übertragbarer spongiformer Enzephalopathie (TSE)
bei einem Rind.
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Erfindungsgemäß wird bevorzugt,
daß als
Marker für
TSE eine Nukleotidsequenz, die für
ein Teilfragment von SEQ ID NO:2 umfassend 6 oder mehr Aminosäuren codiert,
verwendet wird. Stärker
bevorzugt ist die Verwendung der Nukleotidsequenz nach SEQ ID NO:1
oder einer dazu komplementären
Nukleotidsequenz als Marker bei der Beurteilung von übertragbarer
spongiformer Enzephalopathie (TSE). Noch stärker bevorzugt wird die Nukleotidsequenz
als Marker für
die Beurteilung von TSE bei einem Rind verwendet. Noch stärker bevorzugt
weist die Nukleotidsequenz eine Größe von ungefähr 150–200 Bp
auf.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung ist ein Verfahren zur Beurteilung der übertragbaren
spongiformen Enzephalopathie (TSE) bei einem Rind durch Nachweisen
einer Ziel-RNA, umfassend die folgenden nacheinander an einer vom
Rind stammenden Probe durchgeführten
Schritte: (a) Präparieren
der RNA aus der Probe, (b) Nachweisen der Ziel-RNA in dem RNA-Präparat von
Schritt (a), (c) Beurteilen von TSE in dem Säugetier aufgrund des Ergebnisses
von Schritt (b), dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Probe aus dem
Rind um Vollblut handelt und daß die
Ziel-RNA für
eine Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 oder ein Teilfragment davon mit 6 oder mehr Aminosäuren codiert.
Am stärksten
bevorzugt als das Teilfragment ist die Sequenz SEQ ID NO:17. Wie
in 2 dargestellt ist die Ziel-RNA des Primer-Paars
gemäß SEQ ID
NO:3 und 4 in allen Vollblutproben von TSE-freien, d. h. nichtinfizierten
Organismen nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu ist die Ziel-RNA
in Organismen, bei denen der Verdacht besteht, daß sie an
TSE leiden (TSE-Verdächtigen),
oder bei Organismen, die bereits klare Symptome von TSE zeigen,
nachweisbar. Es wird betont, daß die
erfindungsgemäße Beurteilung
von TSE nicht von Obduktionsproben wie zum Beispiel Hirnproben abhängig ist.
Ganz im Gegenteil stellt die Erfindung das Mittel, TSE unter Verwendung
von Vollblutproben, die leicht von lebenden Organismen entnommen
werden können,
zu beurteilen, bereit.
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Die
vorliegende Erfindung wird äußerst vorteilhaft
für die
Beurteilung von TSE bei Rindern verwendet. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung wird daher die Vollblutprobe von einem lebenden Rind
entnommen. Noch stärker
bevorzugt wird die Vollblutprobe von einem Tier entnommen, das später geschlachtet
und für
die menschliche Nahrungskette verarbeitet werden soll. Diesbezüglich kann
man das erfindungsgemäße Verfahren
auch in Kombination mit einem Immuntest durchführen, bei dem infektiöses Prionenprotein
(PrPsc) oder proteaseresistentes Prionenprotein
(PrPres) nachgewiesen wird.
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Vor
dem Nachweisen der Ziel-RNA wird die Fraktion, die alle Nukleinsäuren (DNA
und RNA) enthält, aus
der Probe, bei der es sich um eine vielfältige Mischung von unterschiedlichen
Bestandteilen handelt, aufgereinigt. Für die ersten Schritte werden
häufig
Verfahren eingesetzt, die eine Anreicherung der Nukleinsäuren ermöglichen.
Um den Zellinhalt freizusetzen können
die Zellen mit Enzymen oder mit Chemikalien zwecks Auflösung, Abbau
oder Denaturierung der Zellwände
behandelt werden. Dieser Vorgang wird üblicherweise als Lyse bezeichnet.
Die erhaltene Lösung,
die dieses lysierte Material enthält, wird als Lysat bezeichnet.
Ein Problem, dem man häufig
bei der Lyse begegnet, ist, daß andere
Enzyme, die den interessierenden Bestandteil abbauen, z. B. Ribonukleasen,
die RNA abbauen, mit dem interessierenden Bestandteil während der
Lyse in Kontakt kommen. Diese abbauenden Enzyme können auch
außerhalb
der Zellen vorliegen oder können
vor der Lyse räumlich
getrennt in unterschiedlichen Zellkompartimenten vorhanden gewesen
sein und kommen nun in Kontakt mit dem interessierenden Bestandteil.
Man verwendet häufig
chaotrope Agentien wie zum Beispiel Guanidiniumthiocyanat oder anionische,
kationische, zwitterionische oder nichtionische Detergentien, wenn
Nukleinsäuren
freigesetzt werden sollen. Es ist auch vorteilhaft, Proteasen zu
verwenden, die diese Enzyme oder unerwünschte Proteine rasch abbauen.
Dies kann jedoch zu einem anderen Problem führen insofern als diese Substanzen
oder Enzyme Reagentien oder Komponenten in Folgeschritten stören können. Proteasen
(siehe Walsh, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company,
San Francisco, Kapitel 3 (1979)), die dem gut bekannt sind, sind
zum Beispiel alkalische Proteasen (
WO
98/04730 ) oder saure Proteasen (
US 5,386,024 ). Die Protease, die im
Stand der Technik für
die Vorbereitung von Proben für
die Isolation von Nukleinsäuren
häufig
eingesetzt wird, ist die Proteinase K aus Tritirachium album (siehe
z. B. Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,
1989), die um den neutralen pH-Wert herum aktiv ist und zu einer
Familie von Proteasen, die als Subtilisine bekannt sind, gehört.
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In
den nächsten
Schritten der Probenvorbereitung, die auf den Lyseschritt folgen,
werden die Nukleinsäuren
weiter angereichert. Es exisitieren mehrere Verfahren für die Extraktion
von Nukleinsäuren:
(A) sequenzabhängige
oder biospezifische Verfahren wie zum Beispiel: Affinitätschromatographie
und Hybridisierung an immobilisierte Sonden; (B) sequenzunabhängige oder
chemisch-physikalische Methoden wie z. B. flüssig-flüssig-Extraktion
(zum Beispiel mit Phenol/Chloroform), Fällung (zum Beispiel mit reinem
Ethanol), Extraktion mit Filterpapier, Extraktion mit mizellenbildenden
Agentien (zum Beispiel Cetyltrimethylammoniumbromid), Bindung an
immobilsierte interkalierende Farbstoffe (zum Beispiel Acridinderivate),
Absorption an Silicagel oder Diatomeenerden, sowie Absorption an
magnetische Glaspartikel (MGP) oder silanorganische Partikel unter
chaotropen Bedingungen. Besonders interessant für Extraktionszwecke ist die
Adsorption von Nukleinsäuren
an eine Glasoberfläche,
obwohl andere Oberflächen
ebenfalls möglich
sind. Viele Vorgehensweisen für
die Isolation von Nukleinsäuren
aus ihrer natürlichen
Umgebung sind in den letzten Jahren durch die Verwendung ihrer Bindungseigenschaft
an Glasoberflächen
vorgeschlagen worden. Dienen nichtmodifizierte Nukleinsäuren als
Ziel, so ist eine direkte Bindung der Nukleinsäuren an ein Material mit einer
Siliciumdioxidoberfläche
oder Glas bevorzugt, da unter anderem die Nukleinsäuren nicht
modifiziert werden müssen
und sogar native Nukleinsäuren
gebunden werden können.
Um die Partikel von verunreinigenden Substanzen abzutrennen, können die
Partikel entweder zentrifugiert werden oder es werden Flüssigkeiten
durch Glasfaserfilter gegeben. Dies ist jedoch ein limitierender
Schritt, der verhindert, daß das
Verfahren dazu eingesetzt wird, große Probenmengen zu verarbeiten.
Die Verwendung von magnetischen Partikeln, um Nukleinsäuren nach
der Fällung
durch Versetzen mit Salz und Ethanol zu immobilisieren, ist vorteilhafter
und wird zum Beispiel bei Alderton, R.P., et al., Anal. Biochem.
201 (1992) 166–169
und
WO 91/12079 beschrieben.
Bei dieser Vorgehensweise werden die Nukleinsäuren gemeinsam mit den magnetischen
Partikeln agglutiniert. Das Agglutinat wird von dem ursprünglichen
Lösungsmittel
dadurch getrennt, daß man
ein magnetisches Feld anlegt und Waschschritte durchführt. Nach
diesen Waschschritten werden die Nukleinsäuren in einem Tris-Puffer gelöst. Magnetisierbare
teilchenförmige
Adsorbentien haben sich als sehr wirksam und geeignet für die automatische
Probenvorbereitung erwiesen. Für
diesen Zweck werden ferrimagnetische und ferromagnetische, aber
auch superparamagnetische Pigmente eingesetzt. Die am stärksten bevorzugten
magnetischen Glaspartikel und Verfahren zu ihrer Verwendung sind
in
WO 01/37291 beschrieben.
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Nach
der Aufreinigung oder Isolation der Nukleinsäuren, darunter auch der Zielnukleinsäure, von
ihren natürlichen
Umgebungen können
die Zielnukleinsäuren
nachgewiesen werden. Vor dem Nachweis werden die Nukleinsäuren jedoch
in einem zusätzlichen
Schritt mit RNase freier DNase inkubiert, was gestattet, die RNAs, die
sich in der Probe befunden haben, spezifisch aufzureinigen. Beispiel
2 beschreibt ein bevorzugtes Verfahren zur Probenvorbereitung unter
Verwendung des MagNA Pure® LC-Geräts sowie
ein Kit für
die Isolation von RNA (Roche Diagnostics GmBH, Mannheim, Deutschland).
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Es
ist besonders vorteilhaft, die Ziel-RNA mittels spezifischer Amplifikation
unter Verwendung von RT-PCR (RT = reverse Transkriptase; PCR = polymerase
Kettenreaktion) nachzuweisen. Die Ziel-RNA wird erst revers transkribiert,
wodurch eine komplementäre
einzelsträngige
cDNA gebildet wird. Die cDNA wiederum dient als Matrize für die DNA-Amplifikation
mit geeigneten Primern. Das Amplifikationsprodukt wird auch als „Zielnukleinsäure" bezeichnet.
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Eine
sehr stark bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist daher ein Verfahren umfassend folgende an einer
vom Rind stammenden Vollblutprobe durchgeführten Schritte: (a) Präparieren
von RNA aus der Probe, (b) Bereitstellen eines Primer-Paars, das
einen ersten und einen zweiten Primer umfaßt, wobei der erste Primer
aus 12 oder mehr unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer
Nukleinsäure-sequenz,
die für
die Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 codiert, besteht und wobei der zweite Primer aus 12 oder mehr
unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz,
die zu der Nukleinsäuresequenz,
die für
die Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 codiert, komplementär
ist, besteht; (c) Amplifizieren einer Zielnukleinsäure aus
dem RNA-Präparat
von Schritt (a) mit den Primern von Schritt (b); (d) Nachweisen
der Zielnukleinsäure
von Schritt (c); (e) anschließendes
Beurteilen von TSE bei dem Rind aufgrund des Ergebnisses des Nachweises
von Schritt (d). Noch stärker
bevorzugt wird, daß die
Zielnukleinsäure
mittels Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird. Sehr vorteilhaft
erfolgt daher der erfindungsgemäße Nachweis
der Ziel-RNA mittels RT-PCR. Dieses Verfahren zur Amplifikation
einer Zielnukleinsäure
ist dem Fachmann auch gut bekannt. Während der RT-PCR wird der Ziel-RNA-Strang „revers" zu seinem DNA-Komplement
transkribiert, woran sich eine Amplifikation der entstandenen DNA
mittles PCR anschließt.
Die Transkription eines RNA-Strangs zu seinem DNA-Komplement wird reverse
Transkription (RT) genannt, und man führt sie durch Verwendung einer
RNA-abhängigen
DNA-Polymerase (reverse Transkriptase) durch. Danach wird ein zweiter DNA-Strang
durch Verwendung eines Desoxyoligonukleotid-Primers und einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase
synthetisiert. Die komplementäre
DNA und ihr Antisense-Gegenstück
werden dann exponentiell amplifiziert. Die exponentielle Amplifikation
mittels RT-PCR gestattet ein hochempfindliches Verfahren, bei dem RNAs
in sehr niedriger Kopienzahl nachgewiesen werden können.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung weist die Zielnukleinsäure die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO:1 auf oder ist ein Fragment davon. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird ein Primer-Paar verwendet, das aus einem ersten „forward"-Primer und einem
zweiten „reverse"-Primer besteht,
um SEQ ID NO:1 oder ein Fragment davon sowie von Varianten dieser
Nukleotidsequenz oder von Fragmenten davon zu amplifizieren. Der
erste und der zweite Primer sind Oligonukleotide mit einer bevorzugten
Länge von zwischen
12 und 30 Nukleotiden, stärker
bevorzugt zwischen 15 und 25 Nukleotiden. Vorzugsweise ist die Sequenz
des ersten Primers eine fortlaufende Teilsequenz der Nukleotidsequenz
gemäß SEQ ID
NO:1. Ebenfalls bevorzugt ist die Sequenz des zweiten Primers eine
fortlaufende Teilsequenz des Komplements der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO:1. Obwohl zahlreiche Möglichkeiten,
solche Primer zu entwickeln, existieren, gibt es erfindungsgemäß bevorzugte
Primer-Sequenzen und Kombinationen von Primern. Für die Amplifikation
stammt der erste Primer vorzugsweise aus der Gruppe SEQ ID NO:3,
SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 und SEQ ID NO:13;
der zweite Primer stammt vorzugsweise aus der Gruppe SEQ ID NO:4,
SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14,
SEQ ID NO:15 und SEQ ID NO:16. Am meisten bevorzugt wird, daß es sich
bei dem ersten Primer um die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO:5 und bei dem zweiten Primer um die Nukleotidsequenz gemäß der Nukleotidsequenz
SEQ ID NO:6 handelt.
-
Es
wird betont, daß die
Begriffe „Oligonukleotid" sowie „Polynukleotid" im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung nicht nur (Desoxy)-Oligo-Ribonukleotide
umfaßt,
sondern alle fachbekannten DNA- oder RNA-Derivate, wie zum Beispiel Methylphosphonate,
Phosphothioate, 2'-O–Alkylderivate
sowie Peptidnukleinsäuren,
und Analoga, die modifizierte Basen wie 7-Desazapurine umfassen.
Es ist weiterhin zu bemerken, daß ein Primer-Oligo- oder -Polynukleotid
dahingehend zu verstehen ist, daß es fähig ist, als Substrat für matrizenabhängige DNA-
oder RNA-Polymerasen
zu dienen. Aufgrund der Polymeraseaktivität kann ein Primer durch Zugabe
von Nukleosidphosphaten oder Analoga davon verlängert werden. In dem Amplifikationsansatz beträgt die bevorzugte
Anfangskonzentration jedes Primers vorzugsweise 0,5 μM.
-
Der
Nachweis der amplifizierten Zielnukleinsäure kann auf verschiedene Art
und Weise erfolgen. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird die amplifizierte Zielnukleinsäure mit einem Fluoreszenzsignal
nachgewiesen. Es sind verschiedene Nachweisformate auf Basis von
zielnukleinsäureabhängigen Fluoreszenzsignalen
beschrieben worden, die ein kontinuierliches Verfolgen der Erzeugung
von Amplifikationsprodukten ermöglichen
(siehe Übersichtsartikel
bei Wittwer et al., Biotechniques, 22, (1997) 130–138). Diese
Nachweisformate beinhalten (1) bis (4), sind jedoch nicht darauf
beschränkt:
- (1) Verwendung von fluoreszierenden Verbindungen,
die Doppelstrang-DNA erkennen: Da die Menge an doppelsträngigem Amplifikationsprodukt üblicherweise
die ursprünglich
in der zu analysierenden Probe vorhandene Nukleinsäuremenge übersteigt,
können
für Doppelstrang-DNA
spezifische Farbstoffe eingesetzt werden, die bei Erregung mit einer
geeigneten Wellenlänge
eine erhöhte
Fluoreszenz nur dann zeigen, wenn sie an Doppelstrang-DNA gebunden
sind. Vorzugsweise können
nur solche Farbstoffe eingesetzt werden, die, wie zum Beispiel SYBR® Green
I (Molecular Probes) die Leistungsfähigkeit der PCR-Reaktion nicht
negativ beeinflussen. In einer sehr stark bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird die Zielnukleinsäure durch Echtzeit-Verfolgung
der Amplifikation und Bestimmen der Amplifikationsproduktmenge nach
jedem Zyklus nachgewiesen. Das von dem eingebauten Farbstoff erzeugte
Fluoreszenzsignal kann quantitativ bestimmt werden. Die Stärke des
Signals korreliert mit der gebildeten Menge an PCR-Produkt und ermöglicht daher
die quantitative Bestimmung der Zielnukleinsäure nach jedem Zyklus. In einer noch
stärker
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird daher die Zielnukleinsäure durch Echtzeit-Verfolgung
der Amplifikation und Bestimmen der Amplifikationsproduktmenge nach
jedem Zyklus nachgewiesen.
- (2) Verstärkter
Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) bei Hybridisierung: Für dieses
Nachweisformat werden zwei Oligonukleotid-Hybridisierungssonden,
die jeweils mit einem fluoreszierenden Molekülteil markiert sind, eingesetzt,
die fähig
sind, mit nebeneinander liegenden, jedoch nicht überlappenden, Regionen eines
Strangs des Amplifikationsprodukts zu hybridisieren. Vorzugsweise
ist ein Oligonukleotid am 5'-Ende
markiert und das zweite Oligonukleotid ist am 3'-Ende markiert. Wenn die beiden Fluoreszenzmarker
an die Ziel-DNA hybridisiert haben, stehen sie in engem Kontakt
miteinander, so daß ein
Fluoreszenzresonanzenergietransfer zwischen den beiden fluoreszierenden
Molekülteilen
stattfinden kann. Aufgrund dessen kann die Hybridisierung über die
Anregung des Donatormolekülteils
und anschließende
Messung der Fluoreszenzemission des zweiten Akzeptormolekülteils verfolgt
werden. In einer ähnlichen
Ausführungsform
wird nur eine fluoreszenzmarkierte Sonde verwendet, die gemeinsam
mit einem entsprechend markierten Primer auch als spezifisches FREI-Paar
dienen kann (Bernard et al., Anal. Biochem. 255 (1998) 101–107). In
einer sehr stark bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
die Zielnukleinsäure
mit FRET-Hybridisierungssonden nachgewiesen. Unabhängig von
dem Nachweisformat oder dem Fluoreszenzmarker sind Hybridisierungssonden
immer Polynukleotide mit Sequenzen, die mit der Sequenz der Zielnukleinsäure völlig identisch
bzw. dazu genau komplementär
sind. Unter den Erfindungsumfang fällt jedoch auch, daß die Sonden
eine oder mehrere Fehlpaarungen enthalten, solange sie fähig sind,
mit dem Amplifikationsprodukt unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen
zu hybridisieren. Es hat sich jedenfalls als besonders vorteilhaft
erwiesen, wenn die Sequenzidentität oder -komplementarität über einen
Bereich von mindestens 10 aufeinanderfolgenden Resten 100% ist.
Angesichts der Länge
der amplifizierten Fragmente bei dem erfindungsgemäßen Verfahren überschreitet
die Länge
der Sonde nicht 40 Nukleotide, vorzugsweise nicht mehr als 30 Nukleotide.
Hybridisierungssonden können
jedoch 5'- oder
3'-Überhänge aufweisen, die nicht mit
der Zielnukleinsäure
hybridisieren.
- (3) Hydrolysesonden, die in TaqMan®-Geräten verwendet
werden. Um das Amplifikationsprodukt nachzuweisen, verwendet man
eine einzelsträngige
Hybridisierungssonde, die mit einem Fluoreszenzteil markiert ist,
dessen Fluoreszenzemission durch einen zweiten Marker auf derselben
Sonde, der als Quencher-Verbindung
dienen kann, gequencht wird. Während
des Annealing-Schritts der PCR-Reaktion hybridisiert die Sonde an
ihre Zielsequenz, und während
der Verlängerung
des Primers hydrolysiert anschließend die DNA-Polymerase mit 5'-3'-Exonukleaseaktivität die Hybridisierungssonde,
so daß das
Fluoreszenzteil von der Quencher-Verbindung getrennt wird. Nach
entsprechender Anregung kann die Fluoreszenzemission als Indikator
für eine
Akkumulation des Amplifikationsprodukts verfolgt werden.
- (4) „Molecular
Beacons": Ähnlich wie
bei Hydrolysesonden wird ein Molecular-Beacon-Oligonukleotid mit einer fluoreszierenden
Verbindung und einer Quencher-Verbindung, die aufgrund der Sekundärstruktur
des Moleküls
in enger Nähe
zueinander vorliegen, markiert. Bei Bindung an die Ziel-DNA wird
die intramolekulare Wasserstoffbrückenbindung zerstört, und
die fluoreszierende Verbindung, die an einem Ende der Sonde vorliegt,
wird von der Quencher-Verbindung, die am gegenüberliegenden Ende der Sonde
vorliegt, getrennt (Lizardi et al., US
5,118,801 ).
-
Für den Nachweis
können
Hybridisierungssonden wie Hydrolysesonden oder Molecular Beacons
verwendet werden. Am stärksten
bevorzugt werden jedoch FRET-Hybridisierungssonden,
d. h. ein Paar nebeneinander hybridisierender Sonden, bei denen
bei Hybridisierung die zwei fluoreszierenden Molekülteile in
enge Nähe
zueinander gebracht werden, so daß ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer
(FRET) stattfinden kann. Der Begriff „FRET-Hybridisierungssonden" wird daher definiert
als ein Paar Hybridisierungssonden, wobei jede Sonde eine fluoreszierende
Verbindung trägt,
die gemeinsam als FRET-Paar agieren können und so den Nachweis einer
Nukleinsäure
ermöglichen,
wenn beide Sonden nebeneinander an ein Zielmolekül hybridisiert sind.
-
Sehr
vorteilhaft kann der erfindungsgemäße Assay auf einem LightCycler®-Gerät (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) durchgeführt werden,
und zwar unter Einsatz eines Paars FRET-Hybridisierungssonden, die
am 3'-Ende der ersten
Hybridisierungssonde mit Fluorescein markiert sind und am 5'-Ende der zweiten
Hybridisierungssonde mit LightCycler® Red
640 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) markiert sind.
-
Der
Fachmann ist mit der Entwicklung von Hybridisierungssonden für den Nachweis
einer Zielnukleinsäure
während
Echtzeit-PCR vertraut. Es existieren auch zahlreiche Hilfsmittel
für diesen
Zweck, wie Computersoftware. Ein Beispiel hierfür ist Roche LightCycler® Probe
Design Software 2.0 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim; Katalog Nr.
04 342 054 001) für
die Entwicklung der Hybridisierungssonden HybProbe® und SimpleProbe®.
-
Im
Prinzip können
beliebige Arten von quantitativen Auswertungsmethoden eingesetzt
werden; es hat sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, wenn Methoden,
bei denen ein externer Standard verwendet wird, eingesetzt werden.
Der externe Standard selbst kann ein Plasmid oder eine linearisierte
Matrize mit einer oder mehreren zu amplifizierenden Zielsequenzen
sein.
-
Bei
der quantitativen Bestimmung einer Nukleinsäure unter Verwendung von externen
Standards muß eine
Eichkurve erstellt werden. Für
diese Eichkurve werden bekannte Mengen der Zielnukleinsäure amplifiziert,
und die Intensität
des Fluoreszenzsignals wird als Funktion der Zykluszahl bestimmt.
Nach Wertung der Kinetik mittels mathematischer Anpassung wird das
erste oder zweite Maximum der Ableitung berechnet. Dies gestattet
eine Korrelation zwischen der ursprünglichen Zielkonzentration
und der Fraktionszykluszahl eines bestimmten Maximums. Anschließend kann
die Bestimmung von unbekannten Analytenkonzentrationen erfolgen.
-
Um
Fehler bei der quantitativen Bestimmung, die auf unterschiedlichen
Nachweisempfindlichkeiten beruhen, auszuschalten, hat es sich als
besonders vorteilhaft erwiesen, wenn dieselbe Charge Hybridisierungssonde(n)
für die
zu analysierende Probe und für
die Kalibrierungsproben verwendet wird.
-
Weiterhin
werden aus Teilen bestehende Kits zur Erleichterung der Durchführung der
Erfindung betrachtet. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist
daher ein aus Teilen bestehendes Kit für die Beurteilung von TSE bei
einem Säugetier
durch Nachweisen einer Ziel-RNA, umfassend (i) zwei Oligonukleotid-Primer
für die
Amplifikation einer Zielnukleinsäure
wie im beigelegten Anspruch 10 definiert, sowie (ii) einen interkalierenden
Farbstoff. Sehr stark bevorzugt wird ein SYBR® Green-Farbstoff.
Eine weitere Ausführungsform der
Erfindung wiederum ist ein aus Teilen bestehendes Kit für die Beurteilung
von TSE bei einem Säugetier durch
Nachweisen einer Ziel-RNA,
umfassend (i) zwei Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation einer Zielnukleinsäure wie
im beigelegten Anspruch 11 definiert, sowie (ii) eine erste und
eine zweite Oligonukleotidhybridisierungssonde, die mit einer ersten
bzw. einer zweiten Fluoreszenzgruppe markiert ist, wobei die beiden Oligonukleotidhybridisierungssonden
zu nebeneinander liegenden, jedoch nicht überlappenden, Regionen eines
Strangs der Zielnukleinsäure
komplementär
sind, wobei die erste Oligonukleotidhybridisierungssonde am 5'-Ende und die zweite
Oligonukleotidhybridisierungssonde am 3'-Ende markiert ist, und wobei die ersten
Fluoreszenzmarker fähig
sind, einen Fluoreszenzresonanzenergietransfer durchzuführen. Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung ist ein aus Teilen bestehendes Kit für die Beurteilung
von TSE bei einem Säugetier durch
Nachweisen einer Ziel-RNA, umfassend (i) zwei Oligonukleotid-Primer
für die
Amplifikation einer Zielnukleinsäure
wie im beigelegten Anspruch 12 definiert, sowie (ii) eine einzelsträngige Hybridisierungssonde,
die mit einem Fluoreszenzteil markiert ist, dessen Fluoreszenzemission
durch einen zweiten Marker an derselben Sonde gequencht wird, wobei
die einzelsträngige
Hybridisierungssonde zu einer Region eines Strangs der Zielnukleinsäure komplementär ist. Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung wiederum ist ein aus Teilen bestehendes Kit für die Beurteilung
von TSE bei einem Säugetier
durch Nachweisen einer Ziel-RNA, umfassend (i) zwei Oligonukleotid-Primer
für die
Amplifikation einer Zielnukleinsäure
wie im beigelegten Anspruch 13 definiert, sowie (ii) ein Molecular-Beacon-Oligonukleotid, das
zu einer Region eines Strangs der Zielnukleinsäure komplementär ist, wobei
das Molecular-Beacon-Oligonukleotid
an entgegengesetzten Enden mit einer fluoreszierenden Verbindung
und einer Quencher-Verbindung,
die aufgrund der Sekundärstruktur
des Molekular-Beacon-Oligonukleotids eng benachbart sind, markiert
ist.
-
Die
erfindungsgemäßen Kits
umfassen vorzugsweise weiterhin ein Polymerase-Enzym mit der Aktivität einer
RNA-abhängigen
DNA-Polymerase (reverse Transkriptase), ein Polymerase-Enzym mit
der Aktivität einer
DNA-abhängigen DNA-Polymerase,
Nukleotidtriphosphate, Puffer, ein Primer-Paar, umfassend einen ersten
und einen zweiten Primer, wobei der erste Primer aus 12 oder mehr
aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz, die für die Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 codiert, besteht und wobei der zweite Primer aus 12 oder mehr
aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz, die zu der für die Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 codierenden Nukleinsäuresequenz
komplementär
ist, besteht, eine Nachweissonde oder ein sequenzunspezifisches
Nachweismittel (interkalierender Farbstoff, z. B. SYBR Green) und
eine positive Kontrollnukleinsäure.
Der erste Primer stammt aus der Gruppe SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7,
SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 und SEQ ID NO:13; der zweite Primer stammt
vorzugsweise aus der Gruppe SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10,
SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 und SEQ ID NO:16. Am stärksten bevorzugt
ist, daß es
sich bei dem ersten Primer um die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO:5 handelt und daß es
sich bei dem zweiten Primer um die Nukleotidsequenz gemäß der Nukleotidsequenz
von SEQ ID NO:6 handelt.
-
Die
folgenden Beispiele, Sequenzbeschreibungen und Figuren dienen dem
leichteren Verständnis
der vorliegenden Erfindung, deren wahrer Umfang in den beigelegten
Ansprüchen
angegeben ist. Es ist klar, daß bei
den angegebenen Vorgehensweisen Abänderungen vorgenommen werden
können
ohne von der Erfindung abzuweichen.
-
Beschreibung der Figuren
-
1A Bahn
1 und 21: Größenmarker,
die Fragmentgrößen sind
links als Basenpaare angegeben. Bahn 2 bis 19 und 22 bis 35: Gesamtnukleinsäuren, die
aus Vollblutproben von Rindern mit BSE isoliert wurden. Jede Bahn
repräsentiert
eine Probe von einem Einzeltier. Im oberen Teil jeder Bahn sieht
man genomische DNA, die zwei deutlichen unteren Banden entsprechen
28S- und 18S-ribosomalen
RNAs. Bahn 20 und 36: Isolat aus HeLa-Zellen (Kontrolle). Das Gel
wurde mit SYBR Green Gel Stain (Molecular Probes) gefärbt.
-
1B Bahn
1 und 21: Größenmarker,
die Fragmentgrößen sind
links als Basenpaare angegeben. Bahn 2 bis 13: Gesamtnukleinsäuren, die
aus Tieren isoliert wurden, bei denen Verdacht auf BSE bestand,
die jedoch postmortem negativ testeten. Bahn 14 bis 34: Gesamtnukleinsäuren, die
aus Vollblutproben von BSE-negativen Rindern isoliert wurden. Jede
Bahn repräsentiert
eine Probe von einem Einzeltier. Im oberen Teil jeder Bahn sieht
man genomische DNA, die zwei deutlichen unteren Banden entsprechen
28S- und 18S-ribosomalen
RNAs. Das Gel wurde mit SYBR® Green
Gel Stain (Molecular Probes) gefärbt.
-
1C Bahn
1 und 21: Größenmarker,
die Fragmentgrößen sind
links als Basenpaare angegeben. Bahn 2 bis 19 und 22 bis 35: Gesamt-RNA,
die aus Vollblutproben von Rindern mit BSE isoliert wurden. Jede Bahn
repräsentiert
eine Probe von einem Einzeltier. Die deutlichen Banden entsprechen
28S- und 18S-ribosomalen RNAs. Bahn 20 und 36: Isolat aus HeLa-Zellen (Kontrolle).
Das Gel wurde mit SYBR Green Gel Stain (Molecular Probes) gefärbt.
-
1D Bahn
1 und 21: Größenmarker,
die Fragmentgrößen sind
links als Basenpaare angegeben. Bahn 2 bis 13: Gesamt-RNA, die aus
Tieren isoliert wurden, bei denen Verdacht auf BSE bestand, die
jedoch postmortem negativ testeten. Bahn 14 bis 34: Gesamt-RNA,
die aus Vollblutproben von BSE-negativen Rindern isoliert wurden.
Jede Bahn repräsentiert
eine Probe von einem Einzeltier. Die deutlichen Banden entsprechen
28S- und 18S-ribosomalen RNAs. Das Gel wurde mit SYBR Green Gel
Stain (Molecular Probes) gefärbt.
-
2 Agarosegel,
das die Ergebnisse einer RT-PCR
von Vollblutproben aus einem Satz von 16 mit BSE infizierten oder
für PrPsc positiven Rindern und 10 Rindern mit einem
negativen (PrPsc-negativen) Ergebnis eines
post-mortem-Tests an Hirnstammgewebe zeigt. Die weißen Pfeile
bedeuten PCR-Fragmente, die sequenziert wurden.
-
Eine
weitere Beschreibung der Proben findet sich in Beispiel 1.
- Bahn
1: DNA-Molekulargewichtsmarker XIII (50–750 Bp), Roche Diagnostics
(Katalog Nr. 1 721 925). Mischung von Restriktionsfragmenten eines
Plasmids; die Fragmentgrößen betragen
50, 100, 150, 200, 250, 500, 750 (schwarzer Pfeil), 2642 Bp (schwarzer
Pfeil).
- Bahn 2: Kontrollplasmid, es existieren drei Banden (Amplifikationsprodukte)
im Gel aufgrund der hohen Konzentration von Plasmid-DNA im PCR-Ansatz.
- Bahn 3: Wasserkontrolle (negative Kontrolle)
- Bahn 4 bis Bahn 13: A1-Proben
- Bahn 14: A2-g
- Bahn 15: A2-h
- Bahn 16: A2-a
- Bahn 17: A2-b
- Bahn 18: A2-c
- Bahn 19: A2-d
- Bahn 20: C1-a
- Bahn 21: DNA-Molekulargewichtsmarker XIII (50–750 Bp),
Roche Diagnostics (Katalog Nr. 1 721 925). Mischung von Restriktionsfragmenten
eines Plasmids; die Fragmentgrößen betragen
50, 100, 150, 200, 250, 500, 750 (schwarzer Pfeil), 2642 Bp (schwarzer
Pfeil).
- Bahn 22: C1-b
- Bahn 23: C1-c
- Bahn 24: C1-d
- Bahn 25: C1-e
- Bahn 26: C1-f
- Bahn 27 und
- Bahn 28: B2
- Bahn 29 und
- Bahn 30: B1
- Bahn 31: Mit Kontrollplasmid versetzte A1-Probe (Verdünnung 106)
- Bahn 32: Mit Kontrollplasmid versetzte A1-Probe (Verdünnung 109)
- Bahn 33: Mit Kontrollplasmid versetzte C1-Probe (Verdünnung 106)
- Bahn 34: Mit Kontrollplasmid versetzte C1-Probe (Verdünnung 109)
-
3 Alignment von Aminosäuresequenzen der Vorstufe von
Human-Cathepsin K (AAX09069 (SEQ ID NO:18), P43235 (SEQ ID NO:20)),
der Vorstufe von Rinder-Cathepsin K (BT021052, SEQ ID NO:19), der Vorstufe
von Human-Cathepsin O (P43234 (SEQ ID NO:22), NP_001325 (SEQ ID
NO:21)), der Vorstufe von Rinder-Cathepsin K (BT021052), der Vorstufe
von Maus- Cathepsin
O (Q8BM88, SEQ ID NO:23), SEQ ID NO:2 und dem Konzept des katalytischen
Zentrums der hypothetischen Cysteinprotease (Cysmotif, SEQ ID NO:24).
Das Sternchen bezeichnet die Position des Cysteinrests, die für das katalytische
Zentrum in Cysteinproteasen typisch ist.
-
4 Nukleotidsequenz-Alignment,
in dem die Nukleotidsequenz, die für das Cys-motif codiert (SEQ ID
NO:26), mit der entsprechenden Sequenz, die die Vorstufe des Rinder-Cathepsin
K (BT021052) (SEQ ID NO:27) codiert, verglichen wird. Die Codierstränge der
beiden Sequenzen wurden als Alignment mit dem Basentriplet, das
für den
charakteristischen Cysteinrest im Aktivitätszentrum von Cysteinproteasen
codiert, dargestellt. Die Linie ganz oben in dem Sequenz-Alignment
wird als SEQ ID NO:25 beschrieben.
-
5 Ergebnisse
der Echtzeit-RT-PCR von Gesamt-RNA von Vollblutproben von Rindern
unter Verwendung eines LightCycler®-Geräts und des
Versuchsaufbaus gemäß Beispiel
4. Die durchgezogenen Linien zeigen einzelne PCR-Versuche mit Proben
von mit BSE infizierten Tieren an, während die gepunkteten Linien BSE-freie
Tiere angeben. Die Figur zeigt weiterhin die in Tabelle 2 angegebenen
Crossing Point Daten. Die x-Achse zeigt die mit dem LightCycler®-Gerät bestimmten
Fluoreszenzwerte (F2/Back-F1) an, während die y-Achse die Anzahl
der Zyklen angibt. Die Wasserkontrolle ist mit „H2O" bezeichnet.
-
Beispiel 1
-
Blutproben (Rinder)
-
Ein
erster Satz Proben von Rindern mit der Bezeichnung „A1" umfaßt 10 Einzeltiere,
die an einer natürlichen
Infektion mit dem BSE-induzierenden Erreger litten (Feldmaterial).
Durch immunologischen Nachweis von PrPsc in
Hirnstamm-(obex)-Gewebe mit einem offiziell anerkannten post-mortem-Test
wurde für
jedes A1-Tier ein positives Testergebnis erhalten.
-
Ein
weiterer Satz Blutproben mit der Bezeichnung A2 stammte von experimentell
inokulierten Tieren. Diese Tiere wurden dadurch infiziert, daß man ihnen
Hirnhomogenisat (100 g oder 1 g) von Rindern, die natürlich mit
BSE infiziert waren, fütterte.
Zwei Proben („A2-g” und „A2-h") stammten von inokulierten
Tieren ohne irgendwelche BSE-Symptome. Zwei Proben („A2-a” und „A2-b") stammten von Tieren,
die eindeutige BSE-Symptome zeigten. Drei Proben („A2-c” und „A2-d") stammten von Tieren,
die mögliche
BSE-Symptome zeigten.
-
Zwei
gesunde Tiere der negativen (d. h. nichtinfizierten) Kontrollgruppe
(mit der Bezeichnung „B2") wurden in der Analyse
mitgeführt.
-
Ein
weiterer Satz Proben (mit der Bezeichnung „B1") stammte von gesunden Tieren (Fleischrindern) vor
der Schlachtung. Alle B1-Tiere wurden mittels immunologischem Nachweis
von PrPsc im Gehirnstamm mit einem offiziell
anerkannten post-mortem-Test auf BSE getestet.
-
Ein
weiterer Satz Blutproben stammte von Rindern, bei denen der Verdacht
bestand, daß sie
mit BSE infiziert waren (Gruppe mit der Bezeichnung „C1"). Alle C1-Tiere wurden
mittels immunologischem Nachweis von PrPsc im
Gehirnstamm mit einem offiziell anerkannten post-mortem-Test auf BSE getestet. Bezüglich der klinischen
BSE-Symptome war man bei einem Tier ohne schlüssiges Ergebnis, ein weiteres
Tier („C1-d") zeigte eindeutige
BSE-Symptome. Vier weitere C1-Proben kamen von Tieren ohne klinische
BSE-Symptome.
-
Beispiel 2
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Nukleinsäurepräparation
-
Die
Extraktion von RNA aus Vollblutproben erfolgte mit dem MagNA Pure® LC-Gerät und entweder
(a) dem MagNA Pure® LC mRNA-Isolationskit
1 für Blut
und Blutzellen (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Applied Science
Katalog-Nr. 03 004 015), (b) dem MagNA Pure® LC
RNA-Isolationskit „High Performance" (Roche Diagnostics
GmbH, Mannheim, Applied Science Katalog-Nr. 03 542 394), (c) dem
MagNA Pure® LC
Gesamt-NA-Isolationskit- für große Volumina
(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Applied Science Katalog-Nr. 03
264 793) oder (d) MagNA Pure® Gesamt-NA-Isolationskit
(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Applied Science Katalog-Nr. 03
038 505). RNA und Gesamt-NA wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers
isoliert.
-
Nach
der Aufreinigung wurde ein aliquoter Teil von 5 μl von jedem Präparat (entsprechend
5% des jeweiligen Gesamtpräparats)
in einer Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel laufengelassen
und mit SYBR Green® I gefärbt. Die 1A,
B, C und D zeigen Beispiele für
Agaroseelektrophoresegele.
-
Beispiel 3
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Vorduchmusterung auf BSE-spezifische Marker-RNAs
und Analyse von mutmaßlichen
Markersequenzen
-
Eine
LightCycler® RT-PCR
wurde mit dem LC Fast Start DNA MasterPlus SYBR
Green® I
Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Applied Science Katalog-Nr.
03 515 869) und einem LightCycler® 1.2-Gerät nach den
Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
-
In
einer ersten Durchmusterungsrunde versuchte man, BSE-spezifische
RNA-Sequenzen in Vollblutproben von mit BSE infizierten Rindern
und von nichtinfizierten Rindern nachzuweisen. Die amplifizierten
Sequenzen wurden charakterisiert, und es wurden optimierte Primer
entwickelt und geprüft.
Unter einer größeren Gruppe
von geprüften
Primer-Paaren wurden die zwei Oligonukleotide LTR895for und LTR895rev
gemäß SEQ ID
NOs:3 und 4 in ersten RT-PCR-Versuchen charakterisiert.
-
Um
Positivkontrollen bereitzustellen wurden die Zielsequenzen für die zwei
Primer in einem Plasmidvektor („Kontrollplasmid") kloniert, und zwar
in einer solchen Anordnung, daß eine
PCR des Kontrollplasmids zu einem amplifizierten Fragment des Plasmids
mit einer Größe von 350
Bp führte.
In Kontrollversuchen wurde eine Lösung mit einer bestimmten Menge
von isolierter Kontrollplasmid-DNA (Tabelle 1) verwendet. Tabelle 1 Kontrollplasmid für LTR895-Primer, Reinheit und
Konzentration in wäßriger Lösung
| 260
nm | 280
nm | 320
nm | Verhältnis260/280 | Konzentration
in μg/ml |
| 0,062 | 0,034 | 0,001 | 1,823 | 61 |
-
Die
Extinktionen bei den angegebenen Wellenlängen wurden mit einem NanoDrop
ND 1000 UV/Vis-Spektrophotometer
bestimmt. Die PCR-Bedingungen wurden mit dem Kontrollplasmid eingestellt,
um die Primer-Konzentration
und die Annealing-Temperatur zu optimieren. Zusätzlich wurde die Amplifikation
bei unterschiedlichen Kontrollplasmidkonzentrationen geprüft.
-
Mit
Vollblut-RNA-Präparaten
von einem Satz von 16 mit BSE infizierten und 10 nichtinfizierten
Rindern wurde dann eine RT-PCR-Analyse unter Verwendung des LTR895-Primer-Paars durchgeführt. Mit
den erhaltenen amplifizierten DNA-Fragmenten wurden Elektrophoresen
in Agarosegelen durchgeführt,
und ausgewählte
Banden des Elektrophoresebandenmusters wurden analysiert. 2 zeigt
ein Bandenmuster, das aus der Prüfung
von 16 mit BSE infizierten und 10 nichtinfizierten Rindern zusammen
mit Positiv- und Negativkontrollen erhalten wurde.
-
Es
wurden vier PCR-Fragmente, die bei ungefähr 400 Bp wanderten, isoliert
und sequenziert. Jedes ergab die in SEQ ID NO:1 angegebene Nukleotidsequenz.
Die Beobachtung, daß dieses
Fragment in drei infizierten Fällen
und einem Fall mit Verdacht auf klinische BSE (post-mortem BSE-negativ)
auftauchte, führte zu
weiterer Versuchstätigkeit,
um das diagnostische Potential der Ziel-RNA-Sequenz auszuwerten.
-
Beispiel 4
-
Validierung
-
Um
das Potential des 369 Bp großen
RNA-Fragments gemäß SEQ ID
NO:1, zwischen BSE-positiven (post-mortem) und gesunden Rindern
zu unterscheiden, zu bestätigen,
wurden Primer innerhalb der SEQ ID NO:1 für die Amplifikation von Teilfragmenten
entwickelt. Die bevorzugten Forward-Primer waren die Primer gemäß SEQ ID
NO:5, 7, 9, 11 und 13. Die bevorzugten Reverse-Primer waren die Primer gemäß SEQ ID
NO:6, 8, 10, 12, 14, 15 und 16. Die Entwicklung der Primer führt zu PCR-Produkten, die kürzer als
die SEQ ID NO:1 sind.
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Die
PCR wurde als RT-PCR in einem LightCycler® 1.2-Gerät durchgeführt, und
zwar unter Verwendung von Gesamt-RNA, die aus Vollblutproben isoliert
worden war, und des LC Fast Start DNA MasterPlus SYBR
Green® I
Kits (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Applied Science Katalog-Nr.
03 515 869).
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Für die jeweiligen
PCR-Versuche wurden besonders bevorzugt die Primer LTR895(typeI)-1.for
und LTR895(typeI)-1.rev gemäß SEQ ID
NO:5 und SEQ ID NO:6 verwendet. Eine Echtzeit-PCR-Analyse mit dem Roche
LightCycler® 1.2
Gerät ergab
eine Unterscheidung zwischen (i) erkrankten mit BSE infizierten
und (ii) gesunden Tieren: BSE-Tiere, die post mortem positiv testeten,
zeigten einen Crossing Point von 33,2 (Mittelwert) im Vergleich
zu einem Crossing Point von 34,9 (Mittelwert), der für gesunde
Tiere erhalten wurde (Tabelle 2).
-
In
einer PCR-Amplifikationsreaktion bezeichnet man den Zyklus, bei
dem die Fluoreszenz, d. h. im vorliegenden Fall die Fluoreszenz
des Komplexes der SYBR® Green und die amplifizierte
DNA umfaßt, über die Hintergrundfluoreszenz
hinausgeht, den „Crossing
Point" der Probe.
Der Crossing Point einer Probe erscheint als steil ansteigende Kurve
auf dem Fluoreszenzdiagramm des Versuchs. Der Crossing Point ist
derjenige Punkt, an dem das amplifizierte Produkt zum ersten Mal
bei den Meßwerten
erscheint. Der Crossing Point einer Probe hängt von der anfänglichen
Konzentration der Zielnukleinsäure
in der Probe ab.
-
Eine
Probe mit einer niedrigen Anfangskonzentration der Zielnukleinsäure erfordert
mehr Amplifikationszyklen, um den Crossing Point zu erreichen. Zu
diesem Ende wurde vor der PCR-Analyse eine Standardisierung der
Nukleinsäuren
durchgeführt,
um gleiche RNA-Mengen in jedem PCR-Ansatz zu gewährleisten. Für die Standardisierung
der Nukleinsäuren
wurde die Nukleinsäureausbeute
von allen Proben, die in einer Echtzeit-PCR verglichen werden sollten,
dadurch bestimmt, daß man
die OD260nm bestimmte. Je nach der erhaltenen
Nukleinsäureausbeute
wurden alle Proben verdünnt,
um zu identischen Nukleinsäurekonzentrationen
zu gelangen. Durch die Standardisierung werden die Ergebnisse der
Echtzeit-PCR von unterschiedlichen Proben vergleichbar.
-
Die
für die
einzelnen Proben bestimmten Crossing Points sind in Tabelle 2 dargestellt.
Das Fluoreszenzdiagramm der RT-PCT-Versuche ist als
5 angegeben. Tabelle 2: Crossing Points, die bei Echtzeit-PCR-Versuchen
mit dem LightCycler
®-Gerät bestimmt wurden
| Probe | Zustand | Crossing
Point |
| H2O | durchgeführte Negativkontrolle | > 41,00 |
| 1 | infiziert,
klinische BSE-Symptome, bestätigt
durch post-mortem-Test | 32,49 |
| 2 | infiziert,
klinische BSE-Symptome, bestätigt
durch post-mortem-Test | 32,93 |
| 3 | infiziert,
klinische BSE-Symptome, bestätigt
durch post-mortem-Test | 33,94 |
| 4 | infiziert,
klinische BSE-Symptome, bestätigt
durch post-mortem-Test | 33,53 |
| 5 | infiziert,
klinische BSE-Symptome, bestätigt
durch post-mortem-Test | 33,94 |
| 6 | infiziert,
klinische BSE-Symptome, bestätigt
durch post-mortem-Test | 33,76 |
| 7 | infiziert,
klinische BSE-Symptome, bestätigt
durch post-mortem-Test | 31,91 |
| 8 | infiziert,
klinische BSE-Symptome, bestätigt
durch post-mortem-Test | 33,04 |
| 9 | infiziert,
klinische BSE-Symptome, bestätigt
durch post-mortem-Test | 33,12 |
| 10 | infiziert,
klinische BSE-Symptome, bestätigt
durch post-mortem-Test | 33,78 |
| BSE, durchschnittlich | 33,2 |
| 11 | gesund,
nicht infiziert, negativ in post-mortem-Test | 35,46 |
| 12 | gesund,
nicht infiziert, negativ in post-mortem-Test | 35,52 |
| 13 | gesund,
nicht infiziert, negativ in post-mortem-Test | 34,07 |
| 14 | gesund,
nicht infiziert, negativ in post-mortem-Test | 34,06 |
| 15 | gesund,
nicht infiziert, negativ in post-mortem-Test | 36,50 |
| 16 | gesund,
nicht infiziert, negativ in post-mortem-Test | 34,04 |
| 17 | gesund,
nicht infiziert, negativ in post-mortem-Test | 35,50 |
| 18 | gesund,
nicht infiziert, negativ in post-mortem-Test | 34,19 |
| gesund,
durchschnittlich | 34,9 |
SEQUENZBESCHREIBUNG
-
Schlüssel zu Figuren
-
- 1–10 → 1–10
- 5: decimal points → decimal commas
